Protoplasma 103, 115--129 (1980)

�9 by Springer-Verlag 1980

Zur Kompartimentierung der Synthese von Mono- und Sesqui- Terpenen des ~itherischen Ols bei Pondrus trifoliata

G. HEINRICH ':', W. SCHULTZE ':'* und RENATE WEGENER

Institut fiir Allgemeine Botanik, Universit~it Hamburg, Institut ftlr Botanik und Pharmazeutische Biologie, Universitiit Wiirzburg

Received December 11, 1979 Accepted in revised form February 1, 1980

Summary C o m p a r t m e n t a t i o n of M o n o - and S e s q u i - T e r p e n e B i o s y n t h e s i s of the E s s e n t i a l Oi l in Poncirus triJoliata

The fruit of Poncirus trifoliata shows glandular cell complexes in the exocarp, which produce a volatile oil rich in monoterpenes but poor in sesquiterpenes and oxigenated compounds. The juice vesicles of the endocarp possess similar cell complexes mainly containing sesquiter- penes and oxigenated compounds, whereas monoterpenes only occur in small amounts. By the use of combined gas chromatography-mass spectrometry 19 components of the rind oil and 15 compounds of the endocarp oil could be identified. As demonstrated by electron microscopy the terpenes most probably are synthesized pre- dominantly, if not exclusively in plastids. As shown by gasradiochromatography radioactive precursors (14CO 2 and 14C-leucine) are incorporated into mono- and sesqui-terpenes to a different extent. This is due to two gland types producing essential oils of different composition with regard to their mono- and sesqui-terpene percentage. In fruit development the exocarp glands dif- ferentiate earlier than the endocarp glands do. The activity of exogenously applied ~4CO2 first reaches the peripheral glands and later on appears in the interior glands. Depending upon the growth season, labelled leucine transported by the conducting tissues from lower plant parts leads to a high specific activity of the sesqui-terpenes and oxigenated compounds. It could be argued that in this instance the glands of the pulp are better provided with pre- cursors than the exocarp glands. The successive maxima of essential oil production in both glandular complexes, and the changes in the concentration of individual oil constituents during the ontogeny of the fruit also contribute to different incorporation ratios of radio- active precursors into mono- and sesqui-terpenes.

Keywords: Compartmentation; Poncirus trifoliata; Terpene biosynthesis.

* Korrespondenz und Sonderdruckanforderungen: Institut fiir Allgemeine Botanik, Jungius- strat~e 6, D-2000 Hamburg 36, Bundesrepublik Deutschland. **Institut fiir Botanik und Pharmazeutische Biologie, Mittlerer Dallenbergweg 64, D-8700 Wiirzburg, Bundesrepublik Deutschland.

0033-183X/80/0103/0115/$ 03.00

116 G. I-IEINRICH, W. SCHI3LTZE und RENATE ~rEGENER

Zusammenfassung In der Frucht yon Poncirus trifoliata Iiegen in der Aui~enschale Driisenzellkompiexe, die ein monoterpenreiches ~itherisches ~ l mit geringem Anteil an Sesquiterpenen und O-haltlgen Substanzen produzieren. Ahnlich aussehende Exkretzellkomplexe aus den SaftschI~iuchen ent- halten haupts~ichlich Sesquiterpenkohlenwasserstoffe (STKW) und O-haltige Komponenten und sehr wenig Monoterpenkohlenwasserstoffe (MTKW). Im Schalen~l konnten nach gas- chromatographischer Trennung mit Hilfe der Massenspektrometrie 19 Komponenten identifi- ziert werden, im Saftschlauch~l 25. Elektronenmikroskopische Aufnahmen der jiingsten Driisenzellen beider Drfisenkomplexe lassen erkennen, dag beide Terpenklassen wahrscheinlich haupts~chlieh bzw. ausschlief~lich plastid~tr entstehen. Exogen angebotenes ~4CO~ wird zun~ichst fiberwiegend in die MTKW eingebaut, erst sp~iter nimmt die Markierung der STKW und O-haltigen Komponenten stark zu. l~ber den Fern- transportweg angebotenes ~4C-Leucin ftihrt anfangs zu einer starken Marklerung der STKW und O-haltigen Komponenten, erst sp~iter verschiebt sich der Einbau etwas mehr in Richtung MTKW. Als Hauptursache ftir den differenten Einbau wird das Vorhandensein zweier Typen yon Drtisenzellkomplexen mit unterschiedlichen Syntheseleistungen angesehen. Die aus dem 14CO~ in der Au~enrinde gebildeten Assimilate werden zuerst in das MTKW- reiche tJ1 der Schalenexkretbeh~ilter eiilgebaut. Die iiberwiegend STKW erzeugenden Saft- schlauchbeh~ilter werden erst sp~iter beliefert. Beim Leucinangebot fiber die Fruchtstiele scheint es gerade umgekehrt zu verlaufen. Die aufeinanderfolgenden Maxima der ~Ipro- duktlon in den beiden Driisenzellkomplex-Typen und die Anderung des Komponentenspektrums ihres ~itherischen Ols im Verlauf der Vegetationsperiode tragen ebenfalls zu einem je nach Jahreszeit unterschiedlichen Einbau in die MTKW und STKW bei.

1. Einleitung

Die Biosynthese isoprenoider Substanzen finder bei hSheren Pflanzen an zwei verschiedenen Stellen start, in den Plastiden und im Grundplasma (TREHARNE et al. 1964, ROGZRS et al. 1966 a, b, KIRK und T~LNEY-BAssETT 1967, H~FEN- DEVIL 1969, S~A~ und ROGERS 1969, TSCmSMADIA 1975, SCHULTZ et al. 1976, SCHOTTE 1976). Ftir diese beiden Kompartirnente wurde das Vorhandensein yon Isoenzymen nachgewiesen (ROGERS et al. 1966 a, b). Angaben tiber extra- plastid~ire Entstehung liegen fiir Phytosterole vor, ftir die Seitenkette des Ubichinons (KIRII und TILNEY-BAss~TT 1967, ftir Squalen und andere Tri- terpene (CRoTEAU und Loo~Is 1973). Die sogenannten ,,photosynthetischen" Terpenoide, wie Carotinoide (MooRE und SHEWARD 1977), die Seitenkette der Plastochinone und die des Phyllochinons (TscmSMADIA 1975, BICKEL und ScHULTZ 1976) und die Phytolseitenkette des Chlorophylls (MOORE und SH~VHARD 1977) sollen plastid~ir entstehen. Gegen die Annahme, daf~ die Synthese yon Tocopherol in Chloroplasten lokalisiert ist (GRIFFITHS et al. 1968), sprechen Befunde yon SCHULTZ et al. (1976). Voneinander getrennte Syntheser~iume werden auf Grund yon Fiitterungsversuchen mit radioaktiv markierten Substraten auch ftir die Biosynthese der Mono- und Sesqui- Terpene postuliert (CI~OTEAU und LOOMIS 1972, CI~OTEAIS, BtmBOTT und Loo~Is 1972 a, b). CO.~ und Glucose erweisen sich als die besten Monoterpen- precursoren bei Mentha piperita (CROTEAU e t al. 1972 b), w~ihrend Mevalonat

Zur Kompartimentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 117

am meisten in die Sesquiterpene dieser Pflanze eingebaut wird (CROT~AV und LOOMIS 1972). Markierungsversuche mit 1~CO2 und J4C-Leucin sollen zeigen, ob auch bei Poncirus ein unterschiedlich starker Einbau in MTKW und STKW gegeben ist. Da bei Poncirus die MTKW haupts~ichlich in den Driisenzellkomplexen der Schale gebildet werden, die STKW dagegen in denen der Saftschl~iuche, kann elektronenoptisch iiberpri]ft werden, ob die Mono- bzw. Sesquiterpene im Plasma oder in den Plastiden gebildet werden.

2. Mater ia l und Methoden

Versuchsobjekt ist die Frucht yon Poncirus trifoliata (L.) Raf. aus dem Botanischen Garten Hamburg. Elektronenmikroskopie: Stiicke aus dem Flavedo der Fruchtschale und solche aus dem Albedo mit ansitzenden Saftschl~iuchen bzw. isolierte Saftschl~iuche wurden 2 bis 6 Stunden lang mit 2,5o/0 Glutaraldehyd (Glut.) bei 4 ~ anschliel~end bei Zimmertemperatur 2 bis 6 Stunden mit l~ OsO4 fixiert. Beide Fixantien wurden mit Kakodylatpuffer auf pH 7 eingestellt. Die Entw~isserung erfolgte in _~thanol und Propylenoxyd, die Einbettung in Epon. Der Nachweis der Fliichtigkeit der in den Driisenzellen befindlichen Substanzen wurde nach 20minfitiger Glut. Stabilisierung, die eine brauchbare Strukturerhaltung gew~ihrleistet, durch 100sti]ndige Gefriertrocknung mit Hilfe einer WKF-L 05-Apparatur erbracht. Die gefrier- getrockneten St;.icke wurden 2 Stunden im Vakuum mit 2,5~ Glut. infiltriert, 1 Stunde osmiert, und anschliel%nd in Epon eingebettet.

Wasserdampfdestillation: Zur Gewinnung der ~itherischen Ule diente ein Umlaufwasserdampf- destillierapparat. Das zerkleinerte Pflanzenmaterial wurde in einem 1-1-Rundkolben mit 400 ml dest. Wasser 4 Stunden bei Heizstufe 1 einer Pilzheizhaube (Fa. Heraeus) gegen 2 ml n-Penten als Vorlage destilliert.

Gaschromatographie: Die jahreszeitliche _~nderung der Ulzusammensetzung registrierten wit mit Hilfe eines Varian-Aerograph-2740-Doppels~iulenger:ites mit Temperaturprogrammierung und Flammenionisationsdetektor (F.I.D.). Zur Aufzeichnung der Peaks diente ein Servogor- schreiber (Fa. Metrawatt). Zur Trennung w~ihlten wir eine 4 m lange 1/8"-Edelstahls~iule, gepackt mit Chromosorb W-AW-DMCS, 80--100 mesh als Tr~iger und 10~ Carbowax 20 M als stadon~re Phase und N.~ als Tr~igergas. Die S~iule wurde yon 80 ~ mit 4 ~ auf 200 ~ aufgeheizt.

Radiogaschromatographie: Das Monoterpenfeld trennten wit 14 Minuten isotherm bei 70 ~ anschlief~end wurde mit 4 ~ bis auf 200 ~ aufgeheizt. Das Elektrometer war auf 16 • 10 -11 eingestellt. Ein Splitter leitete 1/10 der eingespritzten Probe zum F.I.D., ~ iiber einen beheizten I~bergang zum Reaktorofen, in dem die markierten Substanzen mit Hilfe eines Katalysatorgemisches fiir hydrierende Crackung gespalten wurden. Nach Zuleitung von inaktivem Methan wurde die Radioaktivit~it mit Hilfe eines 80-ml-Proportional-Gas- durchfluf~z~ihlrohrs im Durchfluf~reaktor RGC170 der Fa. Perkin-Elmer gemessen. Die Temperatur des ~berganges betrug 220 ~ die des Ziihlrohrs 25 ~ die des Reaktorofens 550 ~ Der WasserstoffdurchfluB wurde auf 30 ml/min gehalten, der Methandurchflut~ auf 15 ml/min. Die SignaIe aus dem F.LD. und dem Ratemeter-Ingegrator LB 241 K registrierte ein Servogor- Zweikanalschreiber. Na214CO3, spez. Aktivit~t 59 mCi/mmol und L-Leucin-14C (U), (330 Ci/mmol) bezogen wir vom Radiochemical Centre Amersham (Buchler). Die Massen- spektren wurden mit einer GC/MS-Kopplung (Mod. 3200) der Fa. Finnigan (Miinchen) auf- genommen.

118 G. HrlNRrCrt, W. ScHul:rz~s und RENATE WEGEI',rEe.

Als Trenns~.ule diente eine gepackte 4-m-Stahls~.ule (Einzelheiten siehe Gaschromatographie), die iiber einen ,,Single-stage" Jet-Separator aus Glas (Temperatur: 210 ~ mit dem Analysator verbunden war. Als Tr~igergas diente Helium (Durchlaufgeschwindigkeit: 25 ml/min). Als 2. Trenns~iule wurde eine 50-m-Glas-Diinnfilm-KapiIlare (Carbowax 20 M, lIP, Fa. Chrom- pack, Berlin) verwendet, die direkt ~iber eine desaktivierte Platinkapillare in die Ionenquelle des Massenspektrometers fiihrte. Der Grobinjektor (200 ~ besafl ein Split yon 1:14, als Tr~igergas diente Helium (2 ml/min). Die Trenns~iule wurde 15 Minuten lang bei 65 ~ be- lassen, anschliei~end mit einer Heizrate yon 4 ~ auf 117 ~ aufgeheizt, dann mit 2~ auf 210 ~ Die Temperatur der Platinkapillare betrug 205 ~ die der Ionenquelle 110 ~ Die Ionisierungsenergie war auf 70 eV eingestellt. Die Spektrenregistrierung erfolgte tiber einen integrierten Lichtpunktschreiber, die Scangeschwindigkeit betrug 1 Sekunde.

Identifizierung der Olkomponenten: Diese erfolgte durch den Vergleich ihrer Massenspektren mit den unter identischen apparativen Bedingungen aufgenommenen Spektren authentischer Reinsubstanzen bzw. ~lkomponenten. Die in den aufgefiihrten Literaturquellen (RYNHACE and SYDOXV 1963, S~CDOW 1963, BUDZnII~WlCZ et aI. 1968, B~YNON et al. 1968, BENZ 1969, MOSHANAS and LUND 1970) abgebildeten Spektren wurden ebenfalls zur weiteren Absicherung herangezogen. 2,6,6-Trimethyl-2-vinyltetrahydropyran und trans-Ocimenol wurden nut an Hand von Literaturspektren (S~I~L 1974) bestimmt. Mit Ausnahme dieser beiden Verbindun- gen, sowie n-Hexylacetat, n-Butylcapronat, n-Butylbutyrat und Athylcapronat wurde die Iden- titbit aller iibrigen iDlkomponenten auch gaschromatographisch dutch Co-Injektion yon Test- substanzen abgesichert.

Quantitative Chromatogrammauswertung: Die Quantifizierung der einzelnen ~lkomponenten erfolgte nach der N~iherungsmethode PeakhShe real Peakbreite in halber Peakh6he. Der prozentuelle Anteil der jeweiligen Komponente am Gesamt~51 wurde auf die mit 100% ge- setzte Summe aller Peakfl{ichen bezogen. Die Angabe erfolgte in unkorrigierten Fi~iehen- prozenten.

3. Ergebnisse

3.1. Zusammensetzung des iitherischen Ols der Fruchtschale

Die Poncirus-Frucht besitzt Dr~isenzellkomplexe in der Fruchtschale und in den Saftschl~uchen (Abb. 1). Das ~therische iD1 der Fruchtschale, dessen Kom- ponenten nach gaschromatographischer Trennung massenspektrometrisch iden- tifiziert wurden (Abb. 2), ist MTKW-reich mit einem geringen STKW-Anteil. Die Hauptkomponenten sind die MTKW Myrcen, Limonen und ~3-Phellan- dren. Die Haupt-STKW sind [3-Caryophyllen, trans-[3-Farnesen, Germacren D und ~-Farnesen.

3.2. Das Komponentenspektrum des Saftschlauch~5ls

Der prozentuelle Anteil an STKW und O-haltigen Komponenten ist im Saft- schlauch/51 wesentlich h~Sher als im Schalen~Sl. Ein Gaschromatogramm des Saftschlauch~51s (Abb. 3) unterscheidet sich nicht nur quantitativ bez~glich des MTKW-STKW-Verh{iltnisses vom Schalen~51, sondern weist auch betr{icht- liche qualitative Unterschiede auf. Die in der Schale vorkommenden Kompo- nenten a- und j3-Pinen, Sabinen, p-Cymol, n-Hexylacetat, und Terpinen-4-ol sind im Saftschlauch/S1 entweder nur in sehr geringer Konzentration vorhanden oder fehlen ~iberhaupt. Dieses ist wiederum durdx mehrere Komponenten, wie

Zur Kompartimentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 119

Abb. 1. Photographischer L~ings- und schematischer Querschnitt durch die Poncirus-Frucht

mit Driisenzellkomplexen (D) im Flavedo des Perikarps und in den Saftschl~iuchen (S) der Pulpa. Die Samenanlagen bzw. Samen (SA) sind schraffiert, das Albedo ist punktiert hervor-- gehoben. Se Septum, C Columella. Vergr." 2,8 •

7 SCHALE

10 16 11 x4 ,+1 /

. i n : 5? 4'0 - - 3'0 - - 2'0

6

(B

I

1'0 0

Abb. 2. Gaschromatogramm des Fruchtschalen~51s. Die auf Grund ihrer Retentionsdaten und mit Hilfe yon Massenspektren identifizierten Komponenten sind aufgefiihrt. 1 a-Pinen, 2 {3-Pinen, 3 Sabinen, 4 Myrcen, 5 a-Phellandren, 6 Limonen, 7 [3-Phellandren, 8 cis- Ocimen t, 9 trans-Ocimen, 10 n-Hexylacetat 2, 11 p-Cymol, 12 n-Butylcapronat 2, 13 Linalool, 14 sek. oder tert. MT-Alkohol, 15 Terpinen-4-ol, 16 13-Caryophyllen, 17 O-Farnesen, 18 a-

Terpineol, 19 Germacren D, 20 ~x-Farnesen

t Nur GC-Identifizierung. e Nur MS-Identifizierung.

2,6,6-Trimethyl-2-vinyl-tetrahydropyran, n-Butylbutyrat, Terpinolen, Athyl- caprylat, trans-Ocimenol, Humulen und Geraniol ausgezeichnet, die im SchalenSl nicht oder nur in Spuren vorkommen. Beim Vergleich der Kompo- nenten des hier beschriebenen Poncirus-'Ots mit denen aus verschiedenen kalifornischen Poncirus-Sorten (ScoRA et al. 1966, SCORA und BITTERS 1967)

120 G. HEINRICH, W. SCHULTZE und I~ENATE WEGENER

f~illt auf, dai~ nur 7 Komponenten tibereinstimmen. Es ist allerdings anzuneh- men, daft nach erneuter Unrersuchung der kalis ~le die Zahl der identischen Komponenten zunimmt, dies gilt wahrscheinlich besonders fiir den Bereich der STKW und O-haltigen Kornponenten.

27 SAFTSCHLAUCHE 8 x2

' d6 x2

29 ~ . ~ .~ ~ 10

M i n. 5'0 4'0 30 2'0 1'0 0 Abb. 3. Komponentenspektrum des Saftschl~uch6ls. 1 2,6,6-Trimethyl-2-vinyl-tetrahydro- pyran 2, 2 Myrcen, 3 a-Phellandren I, 4 Limonen, 5 n-Butylbutyrat ~, 6 [3-Phellandren, 7 cis-Ocimen, 8 trans-Ocimen, 9 Terpinolen, 10 n-Butylcapronat "2, 11 -~thylcaprylat 2, 12 unbe- kannt, 13 n-Octylacetat, 14 STKW, 15 Linalool, 16 terti~irer Alkohol mit R 1 = R 2 = CH~, 17 n-Butylcaprylat, 18 [3-Caryophyllen, 19 trans-Ocimenol ~, 20 ~-Farnesen, 2l (x-Terpineol, 22 Humulen, 23 Germacren D, 24 (~-Farnesen, 25 STKW, 26 Geraniol, 27 STKW, 28 STKW, 29 STKW

1 Nut GC-Identifizierung. ~ Nur MS-Identifizierung, sonst beides.

3.3. ~dnderung der Otzusammensetzung im Verlauf der Vegetationsperiode Bei mehreren bisher untersuchten h/Sheren Pflanzen und Pilzen ~nderte sich die Zusammensetzung der ~itherischen Ole im Verlauf der Vegetationsperiode bzw. mit steigendem Alter der Kultur (KUBECZKA 1967, YON Sc~ANTZ und HUHTIKANGAS 1971, STAHL 1975, POsT 1976, FEHR 1977, ZILLIES 1977, KLOPPENBURG 1977). Sollte dies ftir Poncirus ebenfalls zutreffen, so ist dieser Umstand bei Einbauversuchen mit radioaktiven Vorstufen der Terpensynthese zu berficksichtigen. Aus Tab. 1 sind die g.nderungen in der Zusammensetzung des ~itherischen ~ls aus den Exkretbeh~iltern der Schale im Verlauf einer Vegetationsperiode zu entnehmen. Das Verh~iltnis der MTKW zu den STKW und O-haltigen Ver- bindungen ist in Abb. 4 festgehalten. Die MTKW nehmen mit fortschreitendem Fruchtalter leicht zu, die STKW dagegen etwas ab. Die O-haltigen Komponenten weisen geringe Schwankungen auf. Auff~illig ist das gegenl~iufige Verhalten der beiden Hauptkomponenten Myrcen und Limonen. Das in jungen Frfichten dominierende Myrcen nimrnt mit steigendem Fruchtalter immer mehr ab (yon 52 auf 22~ w~ihrend der Limonengehalt yon 4 auf 38~ ansteigt..Ahnlich wie das Limonen verh~ilt

Zur Kompartimentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 121

sich das (3-Phellandren mit einer Zunahme yon 6 auf 17~ p-Cymol zeigt symbat mit Myrcen eine Abnahme yon 9 auf weniger als 2~ In Tab. 2 sind die ontogenetischen 2inderungen im Komponentenspektrum des 5.therischen Dls aus den Saftschlauchbehihern aufgefiihrt. Die Hauptkompo- nente, der STKW [3-Caryophyllen, nimmt mit steigendem Fruchtalter yon

% 100 -

90-

8 0 -

70 -

60

50

4 0

30

20

10

~ ~ . ~ : - - - - - - - ' 4 " -~ _ _ M T K W

~ - - L i m o n e n

- - M y r c e n

, I �9 , - t I '..~F , O - h a l t , ~ ~ V e r b i n d .

10.6 23.6 12.7 3.8 27.8 17.9 11.10 21.10 1976

Abb. 4. B:nderungen im Gehah der MTKW, STKW, O-hahigen Komponenten und der beiden Haupt-MTKW-Substanzen Limonen und Myrcen im Verlauf der Vegetationsperiode 1976 im Schalen~51 yon Poncirt~s

%

100

90

80 ..... --'2"'- 70 -'-::-..

60 ""'.""-. 5 0 ... -o.. / S T K W

40 " .~ .._.---- B - C a r y o p h y | l e n . . . . . " ..... ~ O- h a t t i g e V e r b nd .

30 ..."" ,,.- ' " ' " ~ L i n o l o o i

20' .-"* *'"....""" ""'" I 0 - �9 ............ �9 ...... .-"" . . . i " - - M T KW

I I i I

12,7 3.8 27.8 11.10 21.10 1976

Abb. 5. Anderungen im Gehah der MTKW, STKW und O-hahigen Komponenten, sowie der O-hMtigen Hauptkomponente Lina[ool und dem Haupt-STKW {3-CaryophyiIen im VerIaus der Vegetationsperiode 1976 im SaftschlauchS1 yon Poncirus

81 auf 42~ ab, Linalool verh~ilt sich mit einem Anstieg yon 2.3 auf 33~ gegenl~iufig. Daraus resuhiert insgesamt eine Abnahme der STKW yon 87 auf 48~ und ein Anstieg der O-hahigen Komponenten yon 10 auf 41~ (Abb. 5). Eine Zunahme yon 2,5 auf 11~ zeigen auch die MTKW. Aus Abb. 5 kann man entnehmen, dag die STKW, verglichen mit den MTKW und den O-hahigen Verbindungen, deutli& iiberwiegen. 9 Protoplasma 103/2

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3.4. Einbauversuche mit radioaktiv markierten Terpenvorstufen

Auf das Vorliegen einer Kompartimentierung der MTKW- und STKW- Syntheseorte innerhalb der Zelle schloi~ man bei mehreren Pflanzen auf Grund des differenten Einbaus verschiedener Substrate in bestimmte Terpenoide. Dieses Verhalten gilt auch ftir Poncirus. Freigesetztes, durch gepfliickte Poncirus-Frfichte assimiliertes 14CO2 ist nach 3 Stunden sowohl in die MTKW als auch in die STKW eingebaut (Tab. 3).

Tabelle 1. ~nderung der Zusammensetzung des iitherischen Ols aus den Exkretbehgiltern der Schale yon Poncirus im Verlauf der Vegetationsperiode 1976. Die Angaben erfolgen in un- korrigierten Fl~ichenprozenten

Substanz Erntezeit

10.6. 23.6. 12.7. 3.8. 27.8. 17.9. 11,10. 21.10.

c~-Pinen 0,6 0,1 1,3 1,3 1,1 0,1 1,5 1,8 /3-Pinen 1,4 3 3,6 4,5 5,8 3,6 4,6 4,6 Sabinen 0,7 1,2 0,1 1,5 1,4 1,1 1,8 1,2 Myrcen 52,3 42,4 28,2 22,2 23,3 27,3 17,6 21,9 ct-Phellandren 8,8 7 6 7,1 6,7 5,8 7,5 4,6 Limonen 4,2 12,6 6,/ 31 36,7 36,7 43,5 37,4 [3-Phellandren 6,6 11 43,3 17,4 16,9 15 18,7 16,8 trans-Ocimen 0,9 p-Cymol + Hexylacetat 9,2 6,5 2,6 2,7 2,4 2,7 0,I 1,7 Terpinolen 0,2 n-Butylcapronat 0,6 0,4 0,1 1,1 Linalool 0,5 0,4 0,3 0,3 0,1 0,1 0,4 Sek. oder tert. MT-Alkohol 1 1 0,6 1,6 0,2 0,3 0,1 0,4 Terpinen-4-ol 0,8 1 0,6 0,9 0,7 0,9 0,6 1,6 [3-Caryophyllen 5 4,3 2,6 7,1 2 2,2 1,5 3,2 Unbekannt 0,4 0,2 0,1 0,2 13-Farnesen 0,5 0,8 0,4 0,i 0,3 0,3 0,4 0,4 Unbekannt 0,2 e~-Terpineo! 0,4 0,8 0,3 0,7 0,4 0,4 0,5 0,5 STKW 0,I 0,1 0,3 0,7 0,5 0,4 0,5 0,5 Germacren D + ~x-Farnesen 5 5,4 2,6 1,2 1,3 t,9 0,2 1 O-haltige Verbindungen 0,9 1,4 0,5 0,2 0,2 0,4 0,4 Nerol 0,2 0,1 STKW O,3 0,1 O-haltige Verbindungen 0,5 0,4 0,2

Abb. 6. Ausschnitt aus junger Driisenzelle aus einem Saftschlauchexkretbeh~iiter. Glut., OsO4, Epon. In den Plastiden befinden sich osmiophile Tropfen, deren Inneres in Folge u,~geniigender Fixierung herausgel~Jst wurde Abb. 7. Ausschnitt aus elner jungen Driisenzelle eines Saftschlauchexkretbeh~ilters. 20 rain Glut., anschlieflend 100 Stunden Gefriertrocknung. Infiltration mit 2,5~ Glut., Epon, Bleicitrat- und Uranylacetatkontrastierung. Die Plastiden sind frei yon osmiophilen Substanzen

Zur Kompartlmentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 123

Abb. 6 and 7

9*

124 G. HEINRICH, W. SCHLILTZE und RENATE WEGENER

Tabelle 2. A'nderung der Zusammensetzung des dtherischen C)ls aus den SaftschlauchbehMtern yon Poncirm im Verlauf der Vegetationsperiode I976. Angaben in unkorrigierten Fl~ichenprozenten

Substanz Erntezeit

12. 7. 3.8. 27. 8. 11.10. 21.10.

c~-Pinen 0,2 0,1 Unbekannte 2-O-Verbindungen 0,6 0,3 0,4 2,6,6~Trimethyl-2-vinyl- tetrahydropyran 1,5 1,5 2,2 1,5 Sabinen 0,4 0,4 0,4 1,5 2,1 Myrcen 0,4 0,2 0,6 2 ~.-Phellandren 0,6 Limonen + n-Butylbutyrat 0,2 0,1 0,1 0,6 1,4 [3-Phellandren 0,1 0,8 cis-Ocimen 0,3 0,4 0,5 0,4 0,5 trans-Ocimen 1,2 3,2 3,8 4,1 2,7 Terpinolen 0,6 0,6 n-Butylcapronat 0,9 1,3 3,8 F~thylcaprylat 0,3 Linalool 2,3 3,4 6,7 28 33 [3-Caryophyllen 80,6 78,8 71,5 48,2 41,8 trans-Ocimenol 0,6 0,1 0,5 1 (3-Farnesen 0,7 c~-Terpineol 2,8 2,8 2 5 4,1 Humulen 2,8 2,8 2 5 4,1 Germacren D + c~-Farnesen 3,2 2,8 3,6 0,7 1,1 Alkohol 0,5 STKW O,4 O,6 O-haltige Verbindungen 0,7 1,3 STKW 0,3 0,3 0,7 0,7 0,7 Geranlol 1,3 1,2 1 2,5 2

Mittlere Fruchtgr6fle in cm 2,4/2,2 2,8/2,8 --3,5/3,5 3/3 4/4 (H/She/Breite)

Der Einbau in die MTKW bleibt mit steigender Versuchszeit in Relation zu den iibrigen Terpenklassen gesehen etwa gleich, die Markierung der O-haltigen Komponenten und der STKW nimmt dagegen stark zu. Stellt man Poncirus- Zweige mit ansitzenden Friichten in L-Leucin-14C, so betr~igt das Markierungs- verh~iltnis der MTKW zu den STKW und den O-haltigen Komponenten nach drei Stunden 1,66 : 1 als Mittel aus 5 Versuchen, bei denen jeweils 4 Zweige in je 5 ~tCi L-Leucin-14C kamen, das Verh~iltnis der MTKW zu den STKW des Ols verh~ilt sich aber wie 5,6 : 1. L~igen gleich viel STKW und O-haltige Komponenten wie MTKW vor, so w~ire der Einbau in die zuerst genannten Stoffgruppen 3,4real gr6t~er als in die MTKW, nach l~[ngeren Zeiten ver- schiebt sich das Einbauverh~iltnis leicht zugunsten der MTKW.

Zur Kompartimentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 125

3.5. Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Exkretzellkomplexe aus der Fruchtscbale und den SaftschI~uchen

Vergleicht man Abbildungen der jiingsten Stadien der Exkretzellen mit ~ilteren, so l~ii~t sich feststellen, an welchem Ort die ~itherischen iJle in den Zellen des Beh~lters zuerst auftreten und wohin sie schlief~lich verlagert wer- den. In den Beh~iltern der Schale, die das MTKW-reiche 131 erzeugen, nimmt

Tabelle 3. Quantitative Auswertung yon 9 Radiogaschromatogrammen. Poncirus-Friichte assi- milierten drei Stunden lang aus 5,uCi Na2~4CO3 #eigesetztes 14CO2. Die Frtichte wurden anschlieBend sofort (I), nach 33 (II) und 65 Stunden (III) destilliert. Die angegebenen Werte sind das Mittel aus je drei Gaschromatogrammen. In der Spalte ,,Einbauverh~iltnis" wird angenommen, daf~ im iitherischen O1 gleichviel MTKW wie STKW und O-haltige Kompo- nenten vorliegen. Auf~erdem werden hier die MTKW willkiirlich 1 gesetzt, da ihre absolute Markierung nicht abnimmt, was ein Bezug auf die O-haltigen Komponenten suggerierte

Substanzklassen I II III

Anteil am iOl Einbau Anteil Einbau Anteil Einbau in ~ in ~ in % in ~ in 0/0 in ~

MTKW 86,3 98,1 88,4 96,3 87,4 72,4 STKW 8,1 1,4 5,4 1,8 5,9 17,3 O-haltige 5,6 0,6 6 1,8 6,7 10,4

Verh~.ltnis der MTKW : STKW : O-haltigen Komponenten im ~1 15,4 : 1,4 : 1 16,3 : 1,2 : 1 14,8 : 1,1 : 1

Einbauverh~iltnis der MTKW : STKW : O-hakigen Komponenten 1 : 0,2 : 0,1 1 : 0,3 : 0,35 1 : 2,3 : 3,3

die Ulbildung ihren Ausgang in den Plastiden (HEINRICH 1970). Dasselbe gilt aber auch ftir die Zellen aus den Drtisenkomplexen der Saftschl~iuche (Abb. 6). Nach Kurzzeitfixierung mit Glut. und anschlief~ender langdauernder Gefrier- trocknung gelingt es, die in Abb. 6 dargestellten osmiophilen Substanzen aus den Plastiden vollst~ndig zu entfernen, womit deren Fliichtigkeit bewiesen ist (Abb. 7).

4. D i s k u s s i o n

Bei der Poncirus-Frucht entstehen, wie elektronenmikroskopische Aufnahmen der jiingsten Stadien aus den Exkretzellenkomplexen der Schale und der Saft- schl~iuche nahelegen, sowohl die MTKW als auch die STKW plastid~ir. Das Vorhandensein zweier Exkretzellkomplexe, yon denen die auf~en gelegenen ein

126 G. HEINRICI~, W. SCI-tUI~TZ~ und RENATE W~6ENER

MTKW-reiches O1 erzeugen, die inneren aber eines, in dem die STKW- und O-haltigen Komponenten tiberwiegen, ist hier ein Grund ffir die differente Markierung der beiden Terpengruppen. Nach exogenem Angebot yon 14CO2 sind zun~ichst die MTKW ausgiebiger markiert als STKW und die O-haltigen Komponenten. Nach l~ingeren Ver- suchszeiten steigt die Markierung in den beiden letzteren Gruppen im Ver- gleich zu den MTKW stark an. Dieses Phiinomen kann dadurch erkl~irt wer- den, daft bei dieser Art des Angebots die in den Chloroplasten der Rinden- zellen gebildeten Assimilate zuerst den auflen gelegenen Exkretzellkomplexen mit ihrem hohen MTKW-Anteil zugute kommen und erst sp~iter den Saft- schlauchbeh~iltern, in denen die STKW und die O-haltigen Komponenten fiberwiegen. Beim Leucinangebot tiber den Ferntransportweg scheinen beim angeffihrten Versuch die Saftschlauchbeh~ilter rascher beliefert zu werden als die in der Schale gelegenen Ulbeh~ilter. Eine weitere M/Sglichkeit w~ire, daft in letzteren zur Versuchszeit bereits das Maximum der Olsynthese tiberschritten war. Dieses w~ire mSglich, da die Exkretkomplexe in der Schale friiher angelegt werden als die in den Saftschl~iuchen. Das Markierungsmuster ist also nicht nur yon der Art des Substratangebots abh~ingig, sondern wird je nach Terpen- synthese-Aktivit~it der aul3en bzw. innen gelegenen Exkretbeh~ilter unterschied- lich ausfallen. Als dritte Komponente, die den Markierungsausfall beeinfluf~t, ist die _Anderung des Ulkomponentenspektrums innerhalb der aui~en und innen gelegenen Ulkomplexe im Verlauf der Vegetationsperiode zu bertick- sichtigen. Verschiedene Griinde sind fiir eine derartige _X_nderung eines Kompo- nentenspektrums in Betracht zu ziehen. Die Abnahme einer Komponente mit gleichzeitiger Zunahme einer anderen wurde h~iufig als Hinweis dafiir ge- wertet, daf~ die abnehmende Substanz als Ausgangsmaterial ftir die Synthese der anderen dient. Zwingend scheint dieser Zusammenhang gegeben, wenn Enzyme vorhanden sind, die in vitro eine derartige Umsetzung katalysieren. Da Limonen zu Carvon umgesetzt werden kann, vermutete z. B. SANDt~R~ANN und BRims (1964), dat~ die Biosynthese yon Carvon in Anethum graveolens ebenso wie bei Carurn carvi iiber Limonen verliefe. Dutch Einbauversuche mit 14CO 2 in Kiimmelpflanzen unterschiedlicher Entwicklungsstadien wird ge- zeigt, daf~ in vivo keine grS13eren Limonenmengen in Carvon umgesetzt wer- den, was fiir die Entstehung beider Terpene aus einer gemeinsamen Vorstufe spricht (YON SCHANTZ und I-IuHTIKANGAS 1971, vgl. RICHARDS und H~NDR~CK- sON 1964). Zur .Anderung der Zusammensetzung ~itherischer Ole triigt sicher auch das bevorzugte Abdunsten bestimmter Komponenten bei. Dies ist z.B. bei Ruta graveoIens der Fall, bei der die stetige relative Zunahme yon Undecanon-2 und die fast proportional dazu verlaufende Abnahme des Methylketons Nonanon-2 w~ihrend der Fruchtreife zumindest teilweise auf das schnellere Abdunsten des Nonanon-2 verglichen mit dem des Undecanon-2 zurtick- zuftihren ist (KuBEcZXA 1967). Diese Ver~inderung kann aber nur teilweise

Zur Kompartimentierung der Synthese yon Mono- und Sesqui-Terpenen 127

durch das bevorzugte Abdunsten einer Komponente, also als physikalischer Vorgang, erkl~irt werden. Symbat dazu verl~iuft n~imlich eine allm~ihliche Verschiebung der Neusynthese in Richtung der letzteren Komponente. Da in einem Exkretbeh~lter ein zentrifugaler Abbau der Exkretzellen stattfindet, ist eine Analyse, welche Vorg~inge in den roll vitalen Exkretzellen ablaufen u n d welche nachtr~iglich im lytisch entstandenen Beh~ilterinnenraum ers schwer durchfiihrbar. Ob alle Enzyme der MTKW- und STKW-Synthese wirklich plastid~ir vorliegen, oder einige in Analogie zur Steriodsynthese (CHI~ISTrNS~N und FAXVCrTT 1961) als 1/Ssliche Enzyme im Zytosol oder in Bindung an das ER vorkommen, kSnnte zweifelsfrei nur dutch den Einbau yon radioaktiv markierten Vorstufen in die Terpene isolierter U1-Leucoplasten gekl~irt wer- den. Da isolierte Leucoplasten nicht iiber 14CO2 zu markieren sind, mi.issen zun~ichst andere Terpenvorstufen auf einen m/Sglichen Einbau in Terpene isolierter Plastiden getestet werden. In isolierte Chloroplasten yon Spinat, Vicia faba und Erernosphaera viridis gelang eine Markierung der Carotinoide und der Chlorophylle bei Verwendung der radioaktiv markierten Vorstufen CO2, Leucin und Mevalons~iure. Acetat wurde nut in sehr geringen Mengen eingebaut, unerwarteterweise erfolgte kein Einbau yon Glucose (PLAwEI~ 1978).

Danksagung Herrn A. LOERBI~OXS danken wir fiir die Quantifizierung yon Gaschromatogrammen, Herrn Prof. F.-C. CZXGAN und Herrn Prof. K.-H. KUBECZKA, Universit~it Wiirzburg, fiir die Be- nutzung des Massenspektrometers, der Deutschen Forschungsgemeinschaft ffir die Bereit- stellung einer RGC-Einhelt und fiir Sachmittel.

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