Zur Methodik der Planar-Chromatographie · 3 Warum heute Planar-Chromatographie?Warum heute Planar-Chromatographie? QSchnell QZuverlässig QKostengünstig QExtrem flexibel QGLP-konform

Zur Methodik derPlanar-ChromatographieZur Methodik derPlanar-Chromatographie

2

Planar-ChromatographiePlanar-Chromatographie

Wir benutzen “Planar-Chromatographie“ als

Synonym für:

• Moderne Dünnschicht-Chromatographie

• Instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie

• Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie

• DC/HPTLC

Wir benutzen “Planar-Chromatographie“ als

Synonym für:

• Moderne Dünnschicht-Chromatographie

• Instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie

• Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie

• DC/HPTLC

3

Warum heute Planar-Chromatographie?Warum heute Planar-Chromatographie?

Schnell

Zuverlässig

Kostengünstig

Extrem flexibel

GLP-konform

Übersichtlich

Sehr gut dokumentierbar

Schnell

Zuverlässig

Kostengünstig

Extrem flexibel

GLP-konform

Übersichtlich

Sehr gut dokumentierbar

4

EinsatzgebieteEinsatzgebiete

Forschung und Entwicklung• Screening• Qualitative Analyse• Prozessentwicklung und -optimierung• Mikropräparative TrennungRoutineanalytik • Qualitätskontrolle• Identitätsprüfung• Gehaltsbestimmung / Verunreinigungen

Forschung und Entwicklung• Screening• Qualitative Analyse• Prozessentwicklung und -optimierung• Mikropräparative TrennungRoutineanalytik • Qualitätskontrolle• Identitätsprüfung• Gehaltsbestimmung / Verunreinigungen

5

Weitere Vorteile Weitere Vorteile

Parallele Analyse von Proben und Standards

Wenig Matrixprobleme durch einmalige Verwendung der Platte

Gezielte Optimierung für einzelne Komponenten

Flexible und mehrfache Detektion

„Mehrdimensionales“ Ergebnis

Flexibilität durch off-line Methodik

Parallele Analyse von Proben und Standards

Wenig Matrixprobleme durch einmalige Verwendung der Platte

Gezielte Optimierung für einzelne Komponenten

Flexible und mehrfache Detektion

„Mehrdimensionales“ Ergebnis

Flexibilität durch off-line Methodik

6

Nachteile der Planar-ChromatographieNachteile der Planar-Chromatographie

Umwelteinflüsse durch offenes System

Begrenzte Trennleistung

Nicht durchgehend automatisierbar

(Begrenzte Kontrollierbarkeit der Gasphase)

Umwelteinflüsse durch offenes System

Begrenzte Trennleistung

Nicht durchgehend automatisierbar

(Begrenzte Kontrollierbarkeit der Gasphase)

7

Stationäre PhaseStationäre Phase Mobile PhaseMobile Phase

GasphaseGasphase

P r o b eP r o b e

Die planar-chromatographische TrennungDie planar-chromatographische Trennung

8

2

14

3

α−Front

β−Front

γ −Front

Die GasphaseDie Gasphase

Beeinflusst:• Schichtaktivität• RF• Trennung• Mobile Phase Hängt ab von:• Kammertyp• Konditionierung

Beeinflusst:• Schichtaktivität• RF• Trennung• Mobile Phase Hängt ab von:• Kammertyp• Konditionierung

9

Chromatographische Trennung – wie?Chromatographische Trennung – wie?

• Die mobile Phase fließt mit Kapillarkräften durch die

Poren (60 Angström = 6 nm)

• Die Substanzen werden in der mobilen Phase gelöst

und über eine gewisse Wegstrecke transportiert

• Unterschiedliche Adsorptions- und/oder Verteilungs-

GGW haben unterschiedliche Aufenthaltszeiten in

der stationären Phase zur Folge

• Die mobile Phase fließt mit Kapillarkräften durch die

Poren (60 Angström = 6 nm)

• Die Substanzen werden in der mobilen Phase gelöst

und über eine gewisse Wegstrecke transportiert

• Unterschiedliche Adsorptions- und/oder Verteilungs-

GGW haben unterschiedliche Aufenthaltszeiten in

der stationären Phase zur Folge

10

Wanderungsstrecke in der DCWanderungsstrecke in der DC

zzmaxmax ==

2 2 γγ

ρ ρ ** g g ** rr

zzmaxmax max. Steighöhe in einer einzelnen max. Steighöhe in einer einzelnen zylindrischen Kapillare [cm]zylindrischen Kapillare [cm]

γ γ Oberflächenspannung [Oberflächenspannung [dyndyn/cm]/cm]ρρ Dichte [g/mL]Dichte [g/mL]gg Erdbeschleunigung (9,81 m/sErdbeschleunigung (9,81 m/s22))rr Kapillarradius [cm]Kapillarradius [cm]

zzFF22 = = κ κ ** tt

zzFF Entfernung Entfernung Fm.frontFm.front--EintauchspiegelEintauchspiegelκκ FliesskonstanteFliesskonstantett ZeitZeit

11

Trennstrecke (mm)

Entwicklungszeit (min)

FliessmittelbewegungFliessmittelbewegung

12

Je länger die Laufstrecke, umso diffuser die Je länger die Laufstrecke, umso diffuser die Zonen und umso schlechter die Trennzahl!Zonen und umso schlechter die Trennzahl!

Diffusion und TrennzahlDiffusion und Trennzahl

13

Ideales ZonenprofilIdeales Zonenprofil

Einzelwerte

Häufigkeit

14

Cs

Cm

Cs

Cm

Cs

Cm

VerteilungsisothermenVerteilungsisothermen

KonzentrationsprofileKonzentrationsprofile

ZonenformenZonenformen

TailingTailing FrontingFronting

konvexkonvex

konkavkonkav

o.k.o.k.

Verteilungsisothermen - KonzentrationsprofileVerteilungsisothermen - Konzentrationsprofile

15

Tailing - Ursachen und AbhilfeTailing - Ursachen und Abhilfe

Überladung: Substanzmenge reduzieren

Zu hohe Schichtaktivität: Sättigung, Vorbedampfen

Reaktion: Schicht wechseln, modifizieren

Polare Lösungsmittelreste: Trocknen

Konvexe Isotherme: Phasensystem ändern

Dissoziation: Schicht/Fließmittel puffern

Veränderung der Substanz: Schutzatmosphäre

Überladung: Substanzmenge reduzierenSubstanzmenge reduzieren

Zu hohe Schichtaktivität: Sättigung, VorbedampfenSättigung, Vorbedampfen

Reaktion: Schicht wechseln, modifizierenSchicht wechseln, modifizieren

Polare Lösungsmittelreste: TrocknenTrocknen

Konvexe Isotherme: Phasensystem ändernPhasensystem ändern

Dissoziation: Schicht/Fließmittel puffern Schicht/Fließmittel puffern

Veränderung der Substanz: SchutzatmosphäreSchutzatmosphäre

16

Fronting-Ursachen und AbhilfeFronting-Ursachen und Abhilfe

Feuchte Startzone & schwaches Fliessmittel:Startzone trocknen, stärkeres Fliessmittel

Konkave VerteilungsisothermePhasensystem ändern

aus: Frey, H.-P. und Zieloff, K.:Qualitative und quantitative Dünnschicht-Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992

Feuchte Startzone & schwaches Fliessmittel:Startzone trocknen, stärkeres FliessmittelStartzone trocknen, stärkeres Fliessmittel

Konkave VerteilungsisothermePhasensystem ändernPhasensystem ändern

aus: Frey, H.aus: Frey, H.--P. und Zieloff, K.:P. und Zieloff, K.:Qualitative und quantitative DünnschichtQualitative und quantitative Dünnschicht--Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992

RRFF-- bzw. bzw. RRrelrel--WertWert

LösemittelfrontLösemittelfront

StartzoneStartzone

aabb bbii

bbstst

18

Laufstrecke der Fließmittelfront (Startzone Laufstrecke der Fließmittelfront (Startzone -- Fließmittelfront)Fließmittelfront)

Laufstrecke der Fraktion (Startzone Laufstrecke der Fraktion (Startzone -- Substanzmitte)Substanzmitte)

aaRRFF

bb==

Rückhaltefaktor, Retardation Rückhaltefaktor, Retardation FactorFactor oder oder RelateRelate to Frontto FrontRelative Position einer Zone auf der DC/Relative Position einer Zone auf der DC/HPTLCHPTLC--PlattePlatte

aabb

hRhRFF = R= RF F ** 100100

< 1< 1

RRFF-- bzw. bzw. hRhRFF--WertWert

19Auflösung zweier ZonenAuflösung zweier Zonen

RS =2 (zF1 - zF2)w1 + w2

zF1, zF2 Wanderungsstrecken

w1, w2 Peak-Basisbreiten

Summe der Summe der PeakPeak--BasisbreitenBasisbreiten/2/2

LaufstreckenLaufstrecken--DifferenzDifferenz

Unterschiedliche KUnterschiedliche K--Werte (Steigung der Werte (Steigung der Isothermen, Selektivität)Isothermen, Selektivität)Arbeiten im linearen Bereich (Konzentration!)Arbeiten im linearen Bereich (Konzentration!)Optimale Entwicklungsstrecke (Diffusion!)Optimale Entwicklungsstrecke (Diffusion!)

20

2

K =CsCm

KK22

KK11Selektivität α =

K VerteilungskoeffizientCS Konzentration in der stationären PhaseCM Konzentration in der mobilen Phase

CS

Cm

frische mobile PhaseCS

Cm1 10

K2 = 2

K1 = 0,2

KK11KK22

Verteilungs-/AdsorptionsisothermeVerteilungs-/Adsorptionsisotherme

21Auflösung nach SnyderAuflösung nach Snyder

zF

HN =

RRss == 1144

KK11KK22

-- 11)) ** ** ((11 -- RRFF) ) √RRFF * * NN((

aa bb cca Selektivitätstermb Schichtqualitätc FliessmitteleinflussRF mittlere RF-Wert des zu trennenden SubstanzpaaresN TrennstufenzahlzF WanderungsstreckeH Trennstufenhöhe, HETP

Selektivität von Selektivität von grossemgrossem Einfluss: Einfluss: RRss ~ ~ ααTrennstrecke von geringem Einfluss: Trennstrecke von geringem Einfluss: RRss ~ ~ √ √ NNii

22

Der a-Term: SelektivitätDer a-Term: Selektivität

Abhängig von den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen

Abhängig von der chemischen Natur von:

• Probe

• Schicht

• Fliessmittel

Ist nicht einfach ΔRF

Abhängig von den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen

Abhängig von der chemischen Natur von:

• Probe

• Schicht

• Fliessmittel

Ist nicht einfach ΔRF

23

Der b-Term: SchichtqualitätDer b-Term: Schichtqualität

N ist die Trennstufenzahl über die gesamte

Trennstrecke

Beeinflusst Auflösung nur über Quadratwurzel

Auflösung ist proportional Wurzel RF

RF = 0 ergibt RS = 0

Verlangt hohen RF

N ist die Trennstufenzahl über die gesamte

Trennstrecke

Beeinflusst Auflösung nur über Quadratwurzel

Auflösung ist proportional Wurzel RF

RF = 0 ergibt RS = 0

Verlangt hohen RF

24

Der c-TermDer c-Term

Extremer RF Effekt:• RF =1 ergibt Rs=0

•

Verlangt kleinen RF

Vom b und c Term:• RF muss optimiert werden

• Rs maximal bei RF=0.3

1 Auflösung Rs

0.5

0 0.5 1

Rf

25Zonenverbreiterung nach van Zonenverbreiterung nach van DeemterDeemter

H = H = AA + + + + C C * * vv

A Schichtqualität, Eddy-DiffusionB Diffusionsterm, longitudinale DiffusionC Verzögerungsterm, lokales Nicht-GGW

H = 2 H = 2 λλ dpdp + + + +

H chromatographische Stufenhöhev Fliessmittelgeschwindigkeitλ Funktion der Schichtpackungdp Teilchendurchmesserγ Labyrinth-FaktorD Diffusionskoeffizientω Packungsstruktur-Faktor

vvBB

2 2 γγ DDvv

ωω dpdp2 2 vvDD

A,C bei DC: H ~ 30 A,C bei DC: H ~ 30 μμmmB bei HPTLC: H ~ 12 B bei HPTLC: H ~ 12 μμmm

26Ziel der ChromatographieZiel der Chromatographie

Trennung Anforderung

qualitativ geringe Differenz der Laufstrecken

quantitativ "genügende" Differenz der Laufstrecken

präparativ vollständige Peaktrennung

Welches Ziel will ich erreichen?Welches Ziel will ich erreichen?

- Trennung qualitativ oder quantitativ?- Zwei- oder Vielkomponenten-

gemische?- Trennzeitoptimierung

28

Was ist bekanntWas ist bekannt

Anzahl von KomponentenChemische StrukturenMolekulargewichteLöslichkeitenArt der MatrixKonzentrationsbereichSonstiges: pKa ; UV Spektrum, etc. NICHTS

Anzahl von KomponentenChemische StrukturenMolekulargewichteLöslichkeitenArt der MatrixKonzentrationsbereichSonstiges: pKa ; UV Spektrum, etc. NICHTS

29

InformationenInformationen

Ähnliche Trennungen in der Literatur finden• CAMAG Bibliography Service (CBS) auch auf CD-ROM• Chemical Abstract Service (CAS)• Chromatography Abstracts• J. Chromatography A (Bibliog. Sect.)Fachzeitschriften (Journal of Planar Chromatography)Offizielle Methoden (USP, EuPh, AOAC) Handbücher• CRC Handbook of Chemistry and Physics• CRC Handbook of Chromatography• Merck IndexDC-Literatur: siehe Auslage

Ähnliche Trennungen in der Literatur finden• CAMAG Bibliography Service (CBS) auch auf CD-ROM• Chemical Abstract Service (CAS)• Chromatography Abstracts• J. Chromatography A (Bibliog. Sect.)Fachzeitschriften (Journal of Planar Chromatography)Offizielle Methoden (USP, EuPh, AOAC) Handbücher• CRC Handbook of Chemistry and Physics• CRC Handbook of Chromatography• Merck IndexDC-Literatur: siehe Auslage

30

31

32

Vom „Klecksen“ zur optimalen Probenauftragung

Probenauftragung allgemeine Hinweise

• Die Proben müssen exakt positioniert seinIdentitätsprüfung über den Rf-Wert nur möglich wenn Proben in gleichem Abstand vom unteren Rand aufgetragen sind. Abstand vom linken und rechten Rand und Bahnabstand müssendefiniert sein

Das Probevolumen muss kontrolliert seinVermeidung von Schichtüberladung oder Auftragemengen unter der Nachweisgrenze. Bei Quantifizierung geht das Probenvolumen in die Berechnung ein!

• Die Schicht darf nicht verletzt werdenSchichtschäden führen zu verzerrten Substanzflecken.Bleistiftmarkierungen können mit der Probe Wechselwirkungen eingehen und stören die densitometrische Auswertung

Auftragepositionen

8 mm15 mm

25 mm 15

mm

10 mm

5 mm

mindestens 4 mm

mindestens 2 mm

Eintauchtiefe 10 mm

Eintauchtiefe 5 mm

Auftragetechniken

Manuelle Auftragung

Halbautomatische Auftragung

Vollautomatische Auftragung

Manuelle Probenauftragung

Spritzen mit geradem KanülenanschnittAuftragung größerer Volumina möglichZwischentrocknung der Platte möglichAchtung: nicht während der Auftragung mit dem Fönoder Mund Flecken trocknen!

Nachteil:Beschädigung der Schicht- verzerrte Flecken

Schöllkraut

Elke Hahn-Deinstrop

Manuelle Auftragung

• DC-Platten bis 20x20 cm• Probevolumen: 0,5µl; 1µl, 2µl, 5µl• Rasterung 0,5 cm

Festvolumenkapillaren im µl und nl-BereichNachteile: unzureichende Füllung bedingt durch Adhäsions- oder Cohäsionsvorgänge (Oberflächenspannung und Viskosität der Lösungen)Füll- und EntleerzeitenInnendurchmesser der Kapillare

Probenauftragung

0,5µl 1µl 2µl 5µl

Die Größe des Startflecks resultiert aus dem Probevolumen und der Porosität und Dicke der Schicht.

d max = 4V(1+ Φ)/ Π dV Auftragevolumen in µlΦ Phasenverhältnis (Hptlc-Schichten=0,395)d Schichtdicke in mm

Die Größe des Startflecks belastet die Startbreite und damit die Auflösung des DC-Systems!

Dosierqualität:HPTLC ≤1 mmDC ≤ 3 mm

Einfluss der Probenmenge auf die Trennung

Probengröße (ng) Trennstufenzahl

5 3897

10 3333

50 1778

100 1250

250 1086

500 1026

H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

Menge pro Fleck entscheidend für die Trennung.Begrenzung durch Linearkapazität der Schicht (Masse die den oberen Linearbereich der Verteilungsisotherme markiert)

Für HPTLC-Schicht 10 bis 50 ngFür DC-Schicht 50 µg

Trocknen des StartflecksVor der Entwicklung Startfleck unbedingt

trocknen !Nicht mit dem Mund wegblasen – Atemluft enthält Feuchtigkeit

Nicht heiß abföhnen – kondensierende Feuchtigkeit und Aktivitätserhöhung durch Warmluft.

Nach der Trocknung Schicht erst äquilibrieren lassen

Probleme bei der Auftragung?

Nasse Auftragestelle• Platte vor der

Entwicklung trocknen!

CAMAG Applikationslabor

Probleme bei der Auftragung ?Gingko-Extrakt

Probe auf Bahn 2 wurde zuletzt aufgetragen und nicht ausreichend getrocknet.

MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/Wasser 100+11+11+26D: Naturstoffreagenz

ProbenauftragungEinfluss des Lösungsmittels auf Größe der

Startzone

n-H

exan

Tolu

ol

Chl

orof

orm

Ace

ton



Startzone

unpolarpolar



Startzone


ProbenvorbereitungEinfluss des Lösungsmittels auf das Ergebnis

Usninsäure und Moosextrakte

MP: Dichlormethan/Ameisensäure 19+1D: Anisaldehyd1-2 Moosextrakt Aceton3 Usninsäure in Methanol4 Usninsäure in Aceton5 Aceton6 Methanol

Aceton ist offensichtlich kein geeignetes Lösemittel !

E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

Einfluss der LösemittelsIslandmoos

MP: DCM/Ameisensäure 19+1

D: UV 366 nm

Bahn 1-6 Lösemittel Aceton

Bahn 7 Lösemittel Wasser

Startzonen sorgfältig trocknen!


Probleme bei der Auftragung?

Matrixeffekte

Gingko-Extrakt

Auf Bahn 2 enthält die Probe Glycerin als nicht flüchtige Komponente die sich nicht mit der mobilen Phase mischt

MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/

Wasser 100+11+11+26

D: Naturstoffreagenz

Probleme beim Auftragen ?


Automatisches Probenauftragen

Hahn-Deinstrop „Applied Thin-Layer Chromatography“, Willey-VCH

HalbautomatischesProbenauftragen

Linomat 5

Anzeige undProgrammierung

Anzeige undProgrammierung

PlattenhalterPlattenhalterTurm mit DosierspritzeTurm mit Dosierspritze

Automatisches Probenauftragen

DC-Probenautomat 4

Plattenhalter

Verwerf- und

Spülflasche

Abdeckhaube

Turm mit Spritze

Probenrack

Verwerfplatte

Display und Programmiereinheit

Arten der Auftragung

Vergleich punktförmige und strichförmigeAuftragung

(unpolares Lösemittel)


BärentraubenblätterBestimmung von Arbutin


Rechteckauftragung

OversprayingCAMAG DC-Probenautomat 4

Vorteile der automatischenAuftragung

• Proben können punkt- und strichförmig auf die DC/HPTLC-Platte aufgetragen werden

• Die Proben werden auf die DC-Platte aufgesprüht - keine Verletzung der Schicht

• Das Lösemittel der Probe verdampft während der Auftragung

• Problemlose Dosierung im nl-Bereich• Exakte Positionierung der Auftragungen• Rechteckauftragung möglich

Arbeitsgruppe Prof. Dr. Schwack, Universität Hohenheim

Was man noch so alles machen kann…

Erzeugung von Startbanden durchVorlauftechniken

Vorlauf auf Schichten mit Konzentrierungszone

Retentionsfreier

Schichtbereich

Erzeugung von Startbanden durchVorlauftechniken

Vorlauf in polaren Fließmitteln Rf ≈ 1Fließmittel vor der Entwicklung sorgfältig trocknen !!

Vergleich strichförmige Auftragung manuell / automatisch


Manuelle Auftragung Instrumentelle Auftragung

Strich durch aneinanderfügen von

Punkten

Probenanordnung

• Chrom. Eigenschaften benachbarter Bahnen unterscheiden sich geringer als weit entfernter Bahnen. Daraus folgt, dass es für die Reproduzierbarkeit falsch ist, die Proben auf der einen, die Standards auf der anderen Seite der HPTLC-Platteanzuordnen!

Probenanordnungalternierend

S1 P1 S2 P2 S3 P3 S4 P4 S5 P5

Probe wird jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen


S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6

Proben werden jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen


S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6 S4

Proben werden jeweils auf den Mittelwert benachbarterStandards bezogen

S 1,2 S2,3 S3,4

ProbenanordnungData-pair-Technik

S80 P1 S100 P2 S120 P3 S80 P1 S100 P2 S120 P3

S80

S100

S120

P1

P2P3

Hinweise zur Probenauftragung

• Startfleck nicht größer als 1-2 mm• Wenn möglich, strichförmig auftragen• Nicht mehrere Fraktionen übereinander

auftragen• Bei Proben- und Vergleichslösungen das

gleiche Lösemittel verwenden• Ist Matrix vorhanden, Vergleichslösung mit

Matrix ansetzen, da Begleitstoffe Veränderung der Rf-Werte hervorrufen können.

Trenntechniken

Kammerformen und Trennung

ChromatogrammentwicklungRunge-Bilder

Chromatogrammentwicklung

Gasraumtiefe vor der Schicht:> 3 mm- große Trogkammer

< 3 mm- Schmalkammer

Kammersättigung

Alle Komponenten des Fließmittels vor und während der Entwicklung stehen im Gleichgewicht mit allen Zonen des Gasraumes.

In der mit Filterpapier ausgekleideten Kammer Gasraumsättigung nach 5 min erreicht, wenn Kp < 100°C,

ohne Filterpapier 2h

Das Einstellen einer Platte verzögert die Sättigung

Fließmittel

Vorbeladung

VorbeladungSorptive SättigungSorptive Aufnahme von Gasmolekülen aus

der Kammeratmosphäre durch unbenetzte DC-Schicht

Polare Moleküle werden bevorzugt festgehalten

Gleichgewicht Wasser-KG stellt sich nach wenigen Minuten ein

Beeinflussung durch Dampfsättigung der Partner im Fließmittelgemisch

Kapillare Sättigung

Aufsteigen der Front führt zur kapillaren Sättigung der Schicht

Maximaler endgültiger Sättigungszustand der Schicht mit Fremdmolekülen(keine Homogenität der Molekülsorten)

Schematische Darstellung chromatographischer Begriffe

kap.

Sättigung

Kammersättigung

Vorbeladung

Fließmittel

Austausch Dampf-

Flüssigkeit

NormalkammerDoppeltrogkammer

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Ungesättigt vorkonditioniert gesättigt vorkonditioniert,

anderes LösemittelFalsch eingelegte Platte

N-Kammer ohne Vorbeladung

kap.

Sättigung

Fließmittel

Trockene Schicht

Entstehung eines Gradienten von unten nach oben mit abnehmender Sättigung

Nach 10 min- Sättigung im unteren Drittel, oben nach mehr als einer Stunde

Erhöhter Fließmitteltransport bewirkt Erhöhung der Laufstrecke der Substanzen

Verbesserung der Trennung von zusammen liegenden Flecken

Unsicher hinsichtlich der Reproduzierbarkeit

Entwicklung ohne Vorbeladung

ohne Vorbedampfung

Entwicklung

Gasmolek. Fließmittel

Fließm. Moleküle Flüssig

ads. Wasser

F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

N-Kammer mit Vorbeladung

kap.

Sättigung

Filterpapier

Kap. Sättigung

Vorbeladung

Austausch Dampf-

Flüssigkeit

Je größer die Vorbeladung, desto größer dieFrontwanderungsgeschwindigkeit = kleiner Rf

Wasserverdrängung durch Vorbeladung = Veränderung der Polarität der stationären Phase

Entwicklung mit Vorbeladung

Vorbedampfung Entwicklung

Gasmolek. Fließmittel

Fließm. Moleküle Flüssig

ads. Wasser


Gegenüberstellung der Entwicklungmit und ohne Vorbeladung

Kap. transp. Flüssigkeit

35%

Vorbedam-pfung mit Fließmittel

50%

Adsorb. Wasser

15%

Kap. transp. Flüssigkeit

85%

Adsorb. Wasser15%

Vorbeladung der SchichtUnterscheiden Sie zwischen Kammersättigung und Schichtvorbeladung

Rechnen Sie immer mit Vorbeladung – Luftfeuchte, Lösemitteldämpfe

Vorbeladung mit FM-Dämpfen verringert den Wassergehalt im Adsorbens, erhöht damit die Aktivität.

Vorbeladung durch Fließmittelgemische mit polaren Komponenten verändert die Schichteigenschaften.

Vorbeladung erhöht die Frontwanderungsgeschwindigkeit, nicht dieFleckgeschwindigkeit

Vorbeladung mit Einkomponenten-FM erniedrigt den Rf, Trennung wird oft nicht beeinflusst

S-Kammern sind ideal ungesättigt und ermöglichen Chromatogrammeohne Vorbeladung

Ungesättigt, gesättigt, vorbeladen

Entwicklung im TrogEinfluss der Eintauchtiefe der Platte auf die nachfolgende Entwicklung

A : zu hoher FließmittelstandPartielle Wechselwirkungmit dem Fließmittel

B: korrekter Fließmittelstand

E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006

Entwicklung im TrogEinfluss der Randabstände auf die Entwicklung

Randeffekt• Proben sind zu nahe an

den Ränden der Platte!


LaufstreckeTheorie für beste Auflösung: HPTLC-Platten 5 bis 7 cm mit max. 6 cm

DC-Platten 10-15 cm mit max. 12 cm

Wenn das chromatographische System hochselektiv ist, und die Anzahl der Komponenten gering, reichen auch kürzere Laufstrecken

Hydrastis canadensis

HPTLC-Platte

MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylacetat

10+10+80

1 Hydrastinin

2 Hydrastin

3 Berberil

4 cm

6 cm


Laufstrecke

8 cm

12 cm

Erhöhung der Laufstrecke gibt signifikante Ergebnisse

TLC-Platte

MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylformat

8+4+881 Rutin

2 Hyperosid

3 Phenazon

4 bis 6 Tausendgüldenkraut

7 Enzian


Laufstrecke

Ginseng

6 cm

8 cm

HPTLC Platte

MP: Chloroform/Ethylacetat/Methanol/Wasser

15+40+22+9

Seltener Fall: Auflösung ändert sich nicht signifikant mit der Erhöhung der Laufstrecke


Entwicklung im Trog


„Bananenfront“- Kammer ist nicht dicht

Entwicklung im TrogGewelltes Chromatogramm

• Ungenügende Kammersättigung• Luftzug?


Entwicklung im TrogStörung des Gleichgewichtes Kammersättigung

MP: Chloroform/Methanol 9+1

Trocknen der Platte

• Schnelles Trocknen der Platte, um die Chromatographie zu stoppen, und um Fleckendiffusion zu vermeiden

• Überschüssiges Lösemittel ablaufen lassen• Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels und

damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie Feuchte offensichtlich).

• Verwendung von Kaltluftstrom, wenn Substanzen das zulassen• Bei schwer flüchtigen Lösemitteln -Warmluftstrom

Horizontalentwicklungskammern

HorizontalentwicklungskammerMehrfachfunktion:

S-Kammer mit ideal ungesättigtem GasraumKammersättigungKammersättigung + Vorbeladung

Planar-Chromatographie heute

Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)

Vergleich HPLC-HPTLC

Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)

Fließmittel-Entmischung in derungesättigten S-Kammer

Ursache: Binäre Fließmittelgemische mitunterschiedlicher Polarität verlieren einen Teil Ihrer polaren Komponente zumAufbau der stationären Phase

Ausbildung von ß-Fronten

stat. Phase mobile Phase

Wassermoleküle

unpolare Komponente

polare Komponente

ß-Front

Alpha-Front


Peakform in der ß-Front

Start

ß-Front

Front

Su - Kammer

• Gasraum < 3mm

• Keine Vorbedampfung

• Fließmittel- Entmischung

• Mehrere Fronten

• Reproduzierbare

Trennung

• Vergleichbar zur SäuleF. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

Entwicklung im Trog

Sekundäre Front• Kammersättigung nötig!• Änderung der mobilen

Phase


CAMAG VARIO-System

1.Entwicklung mit 6 verschiedenen Lösemitteln Nebeneinander in S-Konf.

2.Entwicklung in ges. Tank-Konfiguration

3.Vorkonditionierung derPlatte,dann wie 2

4.Vorkonditionieren mit 6 untersch. Lösemitteln

Spezielle Techniken-warum?

Besserer Reproduzierbarkeit: Automatische Entwicklung (ADC2)

Komplexe Matrix/schwierige Gemische: Mehrfachentwicklung

2-Dimensionale Entwicklung

Durchlauftechnik

Großer Polaritätsbereich: Gradiententechnik (AMD2)

Höhere Fleckenkapazität: Gradiententechnik (AMD2)

Mehrfach- Entwicklung(gleiche Mobile Phase)

Erste

Entwicklung

ZweiteEntwicklung

Fingerprint von Ölen nach

Pharm.Eur. 2x entwickeln gleiche mobile Phase

Bessere Auflösung?

MP: Dichlormethan/Essigsäure/Aceton 20+40+50

D: Phosphormolybdänsäure

1: Maiskeimöl

2: Olivenöl

3: Verfälschung

CAMAG ADC 2

Einhängen der Platte Kammersättigung

Laufstreckenkontrolle

Wichtigste Eigenschaften der ADC2• Vollautomatische Entwicklung von TLC/HPTLC-

Platten und Folien der Größen 20x10 und 10x10 cm

• Hohe Reproduzierbarkeit der Rf-Werte• Einstellung einer definierten Aktivität der Schicht

über die Option “Feuchtekontrolle“ möglich • Überwachungsfunktion durch den Nutzer entfällt• Einsatz einer herkömmlichen Doppeltrogkammer• Betrieb im stand-alone Modus oder unter

winCATS

Reproduzierbarkeit der Rf-Werte

Probe: Chlortoluron, Desethylatrazin, Cyanazin, Atrazin je 50 ng/µl in Acetonitril

Auftragevolumen: 5 µlBandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15Schicht: HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F 254

20 x 10 cm, Merck Fliessmittel: t-Buthylmethylether – n-Hexan 60 : 40, Laufstrecke: 60 mmLabortemperatur: 27°C/35% rel. Feuchte

Reproduzierbarkeit der Rf-Werte

Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis

Modul Feuchtekontrolle

36,075757575757576Natriumchlorid

222,547Kaliumthiocyanat

54,433333333333333Magnesiumchlorid

40353025201510

Löslichkeit bei 20°C g/100 g Wasser

Relative Luftfeuchtigkeit (%) bei einer Temperatur von … °C

Salz

Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis

Sojalecithin Standardlösung gemäss Vorschrift in CBS90

Auftragevolumen: 1 µl, Bandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15Fliessmittel: Chloroform –Methanol - Aceton – Wasser

18:15:3:1.ungesättigte Entwicklung, Laufstrecke: 70 mmDerivatisierung: Tauchen in CuSo4/H3PO4 Reagenz

10 Min. auf 170°C erwärmt. Messung: 338 nm.

Einfluss der Feuchte auf das Ergebnis der TrennungSojalecetin-Standard (Phospholipide)

Feuchteeinstellung 17 %Ohne FeuchteeinstellungLabortemperatur 25°C/52%rel.F.

1

2 3

42+3+45

6

75+6+7

1stde

velo

pmen

t: ve

ry p

olar

sol

vent

2nd de

velo

pmen

t: m

obile

pha

se, l

ess

pola

r

1stde

velo

pmen

t: he

xane

2nd de

velo

pmen

t: m

obile

pha

se

Abtrennen nicht-polarer Matrix

Abtrennenpolarer Matrix Fokussierung

2nd de

velo

pmen

t: m

obile

pha

se

1st de

velo

pmen

t: m

etha

nol

App

licat

ion

Mehrfach-Entwicklung (verschiedene Mobile Phasen)

Mehrfachentwicklung

Metoclopramid in Suppositorien1. Entwicklung mit polarem Fließmittel, um Matrix in die Front zu schieben

2. Entwicklung mit geeignetem FMFür die Trennung

E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006

DC-HPTLC

Lavendelöl mit Toluen/Ethylacetat 95+5

Derivatisierung: Anisaldehyd

DC 1.Entw. DC 2.Entw

HPTLC 1.Entw

Der Effekt des Wechsels in diesem Fall- Zeitersparnis !E.Reich,A. Schibli „HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

Mehrfach- Entwicklung(gleiche Mobile Phase)

1. Entfernen der Matrix

2. Trennung der Probe

... Verschiedene Fliessmittel, Platte um 180° gedreht

1.

180°

2. "

“Zweidimensionale” Trennung

TRT-Technik: Trennung-Reaktion-Trennung

1. 2.

1.

90°

... mit dem gleichen Fliessmittel, Platte um 90° gedreht

Zweidimensionale Entwicklung

Stabilitätsuntersuchung(Zwei-Dimensionale Chromatographie)


Das AMD 2 – Systemautomatisierte Mehrfachentwicklung

Gestaltung des Gradienten

DichlormethanAcetonitrilMethanol/Wasser

n-Hexant-ButylmethyletherMethanol

n-HexanDichlormethanMethanol

AbschwächerBasisfließmittelVerstärker

Universalgradient Normalphasengradient sehr polar beginnend

über mittelpolar und unpolar endend

Basisfließmittel Fließmittel mittlerer Polarität- bestimmend für die Selektivität

Verstärker Fließmittel mit hoher Elutionskraft

Abschwächer Unpolares Fließmittel

Gestaltung des Gradienten

Fokussiereffekt

AMD2

Schrittweise Entwicklung

Step 1Step 1 Step 2Step 2 Step 3Step 3 Step 4Step 4 Step 5Step 5 Step ..Step ..

Focu

sing

Focu

sing


GradientenoptimierungFarbstoffgemisch + Benzoesäure

AMD2-AnwendungFrangulaextrakt

Gelb fluoreszierende Zone- AloinGelb fluoreszierende Zone- AloinCAMAG Applikationslabor

AMD2 Anwendungen

Trennung verbotener Amine

2µL 5µL10µL 10µL5µL2µL 2µL 5µL10µLS1 S2 S3 S4 S4S3S2S1Black leather Textile ‘red’ cotton Textile ‘blue’ cotton


AMD2 Anwendungen

Pestizidtrennung mit Gradient A

Atr

azin

e

2,4-

D

I-St =

Ben

zani

lid

Pend

imet

halin

Met

azac

hlor


AMD2 Anwendungen

Pestizidtrennung mit Gradient B

Atr

azin

e

2,4-

D

I-St =

Ben

zani

lid

Pend

imet

halin

Met

azac

hlor


AMD2-Trennung von Zuckern

FructoseGlucose


AMD-Charakteristika

• Fokussierung zu scharfen Zonen• Zonenprofil nahezu unabhängig von der

Trennstrecke• Laufstrecke unabhängig von der Matrix• Polaritätsgradienten frei programmierbar• Substanzen sehr unterschiedlicher Polarität

trennbar• Trennzahl > 40 auf 80 mm Trennstrecke

Nutzen Sie für die Lösung Ihres analytischen Problems immer die angemessene Trennkammer

•Es gibt keine beste Kammer

•Kriterium für gutes Entwicklungssystem: Reproduzierbarkeit der Arbeitsparameter, klimatisierte Räume, gute Schichtqualität, ausgereifte Verfahren

OPLC – SystemOverpressured Thin-Layer Chromatography

Fließmittel wird in eine horizontale hermetisch abgeriegelte Schicht hineingepumpt

Fließmittel für Linearentwicklung durch einen gefrästen Spalt auf die Chromatogrammbreite verteilt

Linearisierung des Fließgesetzes-dadurch kaum Fleckverbreiterung

Zirkularentwicklung

• Punktförmige Einspeisung des Fließmittels• Auftragung der Proben im Startkreis

Documents

Zur Methodik der Planar-Chromatographie · 3 Warum heute Planar-Chromatographie?Warum heute Planar-Chromatographie? QSchnell QZuverlässig QKostengünstig QExtrem flexibel QGLP-konform