ZYTOLOGIE / HISTOPATHOLOGIE Vom Patienten bis zum Befund

Kryptokokkose, Nasenspiegel eines Hundes: Vor allem intrazellulär in den Makrophagen sind histologisch die runden, umkapselten Hefeformen des Pilzes zu beobachten.

Titelseite: Feinnadelaspirat eines Sarkoms bei einer Kornnatter

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So gelingt die zytologische und histopathologi-sche Untersuchung: vom Patienten bis zum aussagekräftigen Befund

Zytologische und histopathologische Untersuchungen

sind im Praxisalltag von großer Bedeutung. Nicht selten

hängen Diagnose, Therapie und Prognose der Patien-

ten von den Ergebnissen aus Zytologie und/oder His-

topathologie ab. Für welche Patienten bietet sich ein

Mehrwert durch diese Untersuchungen? Was muss in

der Praxis beachtet werden? Was darf der Tierarzt von

einem professionellen Befund erwarten? Antworten auf

diese Fragen und viele weitere Details finden Sie auf den

folgenden Seiten. Denn für einen aussagekräftigen Be-

fund aus zytologischer oder histopathologischer Unter-

suchung kommt es ganz wesentlich auf die enge und

vertrauensvolle Zusammenarbeit zwischen Praxis und

Labor an.

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Die Entscheidung, ob besser eine zytologische oder eine

histopathologische Untersuchung eingeleitet wird, kann

je nach zugrundeliegender Lokalisation und Verdachts-

diagnose unterschiedlich ausfallen. Unsere boardzer-

tifizierten Experten für Zytologie und Histopathologie

geben Ihnen hier Tipps zur Probenentnahme und Aus-

sagekraft der jeweiligen Untersuchung für eine optimale

Befundinterpretation.

Flüssigkeitsgefüllte Umfangsvermehrungen: Flüs-

sigkeiten in Umfangsvermehrungen können nur zytolo-

gisch und nicht histopathologisch beurteilt werden. Da

die Zellzusammensetzung der Flüssigkeit häufig keine

ätiologische Diagnosestellung erlaubt, empfiehlt sich

immer auch die Punktion aus soliden Bereichen der

Umfangsvermehrung.

Tipp: Nicht nur Flüssigkeit aus Umfangsvermehrungen

sondern (wenn vorhanden) auch solide Bereiche der Lä-

sion punktieren und diese separat beschriften.

Innere Organe: Häufig

kann die Punktion von in-

neren Organen wie Milz,

Leber, Niere etc. minimal-

invasiv unter Ultraschall-

kontrolle vorgenommen

werden. Insbesondere bei

großen diskreten Läsio-

nen oder bei diffusen Or-

ganveränderungen kann

die zytologische Untersu-

chung geeigneter Ausstri-

che eine hilfreiche erste

Einschätzung geben (z. B.

Beurteilung Entzündungs-

zellen, Hepatozyten) und

erlaubt im besten Falle die Diagnosestellung (z. B. Lym-

phom, andere Neoplasie, Lipidose). Für eine bestmögli-

che Aussage sollte das zytologische Bild mit klinischen

Informationen und weiteren Befunden interpretiert werden

– Vorbericht!

Welche Untersuchung für welche Patienten?

Körperhöhlenergüsse: Die Beurteilung von Pleural-,

Peritoneal- und Perikardergüssen kann weit über die klas-

sische Einteilung in Transsudat, modifiziertes Transsudat

und Exsudat anhand von Zellzahl und Gesamteiweiß

hinausgehen. Die zusätzliche zytologische Untersu-

chung gibt häufig weitere Hinweise auf mögliche oder

wahrscheinliche Ursachen der Ergussbildung (z. B. Neo-

plasie, septisches Exsudat, Galleperitonitis, Einblutung,

FIP). Am besten wird das Ergebnis immer mit klinischen

Informationen und weiteren Befunden (z. B. Bildgebung,

Klinische Chemie, Hämatologie) beurteilt.

Tipp: Für die Beurteilung von Körperhöhlenergüssen

sollten sinnvollerweise Zytologie, Zellzahl und Gesamtei-

weiß kombiniert werden. Fordern Sie bei Körperhöh-

lenergüssen unser Körperhöhlenergussprofil an.

Mammatumore und Sarkome: Zur genauen Klassifi-

kation dieser Tumore und eindeutigen Abgrenzung von

bestimmten reaktiven oder nicht-neoplastischen Läsio-

nen ist eine Beurteilung der Gewebearchitektur mittels

histopathologischer Unter-

suchung wichtig. Nach voll-

ständiger Entnahme können

so auch die Resektionsrän-

der beurteilt werden. Die

zytologische Untersuchung

kann zur Abgrenzung von

anderen Läsionen sinnvoll

sein (z. B. Mastzelltumor,

Fettgewebe, Entzündung)

und bei der Planung der

Chirurgie helfen.

Tipp: Immer angeben, ob

das entnommene Gewebe

eine Teilbiopsie oder Kom-

plettresektion der Läsion

darstellt, und ggf. Wundrän-

der markieren.

Zytologie von der Leber einer Katze: Neben Hepatozyten finden sich auch atypische Rundzellen, die stark für ein Lymphom sprechen. (50 x Objektiv)

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Das dürfen Sie vom Befund erwarten

Im Idealfall enthält der zytologische/histopathologische Befund die definitive Diagnose. Nicht immer ist dies je-doch möglich. Der Befund wird aber in jedem Fall fol-gende Informationen bieten:

• die wahrscheinlichste oder eine beschreibende Inter-pretation / Diagnose

• mögliche Differenzialdiagnosen im Kommentar

• die Diskussion im Vorbericht genannter klinischer Dif-ferenzialdiagnosen und (so weit möglich) die Beant-wortung vorberichtlich genannter Fragestellungen

• eine Begründung, warum eine eindeutige Interpreta-tion / Diagnose nicht möglich ist

• Empfehlung möglicher weiterführender Untersuchun-gen, die zu einer eindeutigeren Diagnose beitragen könnten

Untersuchungsmethoden: Vor- und Nachteile Zytologie vs. Histopathologie

Be

fun

du

ng

Strukturelle Zusammenhänge, Architektur

Z: Nicht beurteilbar

H: Beurteilbar (weniger bei Stanzbiopsien / Inzisionsbiopsien), z. B. genaue Lokalisation, Invasion, Exzisionsränder, Tumorklassifizie-rung, Tumorgradbestimmung

Quantitative Beurteilungen (z. B. Mitoserate)

Z: Eingeschränkte Schätzung wenn sehr gute Ausstrichsqualität

H: Ja

Detaillierte Beurteilung der Zellmorphologie

Z: Ja, z. B. Zytoplasma, Zellkerne, Granula

H: Eingeschränkt durch Fixierung/Einbettung

Pa

tie

nte

n

fakt

ore

n

Komplikationsrisiko durch Probennahme

Z: Häufig ohne Sedierung/Narkose möglich, geringes Blutungs-risiko, keine Wunde

H: Sedierung / Narkose nötig, Blutungsrisiko, Wunde

Kosten Probennahme Z: Gering

H: Höher

Prä

an

aly

tik

Aufbereitung im Labor Z: Geringer Aufwand (bei Objektträgern) bis mäßiger Aufwand (bei Flüssigkeiten)

H: Hoher Aufwand: Prozessierung und Einbettung in Paraffin, Anfertigung der mikroskopischen Schnitte

Standardisierte Probenaufbereitung

Z: Nein (v.a. in Praxen)

H: Ja (v.a. im Labor)

Dauer Probenaufbereitung Z: Minuten bis Stunden

H: Mindestens 24h

Pro

be

n

eig

nu

ng

Flüssigkeiten Z: Geeignet

H: Ungeeignet

Untersuchung postmortem Z: Meist ungeeignet, rasches Absterben der Zellen

H: Sektion und Histopathologie schnellstmöglich nach Tod möglich

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• Schlechter Zellerhaltungszustand

Zytologie: Nicht immer können alle vorhandenen Zel-len auch zytologisch beurteilt werden. Häufige Gründe für einen schlechten Erhaltungszustand sind Zelllyse, mehrschichtige Bereiche auf den Ausstrichen, lang-sames Trocknen des Materials und Formalinartefakte. Durch die Herstellung qualitativ hochwertiger dünner Ausstriche, rasche Lufttrocknung und Fernhalten der Ausstriche von Formalindämpfen können Sie Beein-trächtigungen des Zellerhaltungszustandes vermeiden (s. Kapitel Präanalytik in der Zytologie ab S.8).

• Blutige Ausstriche Zytologie: Bei manchen Geweben lässt sich eine Blut-kontamination bei der Probennahme nicht vollständig vermeiden (z. B. Milz oder Schilddrüsentumore). Unter Beachtung einiger Tricks kann eine Blutkontamination aber minimiert werden (s. Probenentnahme S. 8 und 9: Punktion ohne Spritze).

• Unspezifische Befunde

Bei einigen Fragestellungen finden sich häufig nur un-spezifische Befunde (z. B. sekundäre Entzündungsre-aktionen) ohne Hinweise auf die auslösende Ätiologie. Hierzu zählen unter anderem Hautbiopsien, gastroin-testinale Biopsien, Biopsien der Nasenhöhle, Nasen-spülproben, Urinzytologien oder Körperhöhlenergüs-se. In diesen Fällen kann aber der zytologische oder histopathologische Befund im Zusammenhang mit den klinischen Befunden häufig helfen, bestimmte Erkrankungen auszuschließen oder wahrscheinliche Gruppen von Erkrankungen einzugrenzen (z. B. Neo-plasie, Autoimmunerkrankung, Endokrinopathie).

Es gibt eine Vielfalt von Gründen, warum die zytologi-sche Interpretation oder histopathologische Diagnose uneindeutig sein kann. Einige sind hier aufgeführt:

• Schlecht differenzierter Tumor

In einigen Fällen ist neoplastisches Gewebe so schlecht differenziert, dass das Herkunftsgewebe nicht mehr festgestellt werden kann. In solchen Fäl-len kann eine histopathologische Untersuchung auf-grund der Gewebearchitektur häufig mehr Informati-onen liefern als die zytologische Untersuchung. Sollte auch histopathologisch eine Gewebezuordnung nicht möglich sein, kann eine Immunhistologie angeschlos-sen werden, die dann häufig eine Differenzierung des Gewebes ermöglicht.

• Überlappende morphologische Charakteristika

Sowohl in der Zytologie als auch in der Histopatholo-gie gibt es Läsionen, die schwer von anderen Läsio-nen abgrenzbar sind. So kann ein amelanotisches Me-lanom beispielsweise einem Plasmazytom ähneln und ein Histiozytom wie ein kutanes Lymphom erscheinen. Zytologisch ist zudem eine sichere Differenzierung von Spindelzellen – reaktive Spindelzellen im Granulations-gewebe bzw. neoplastische bei Vorliegen eines Spin-delzelltumors – häufig schwierig.

• Kleine Proben

Histologie: Aufgrund der geringeren Invasivität werden manchmal kleine Inzisionsbiopsien oder Tru-cut Nadel-biopsien bevorzugt genommen. Häufig ist eine defini-tive Diagnose auch anhand kleiner Proben möglich, jedoch steigt das Risiko der Artefaktbildung und der Kontext des umgebenden Gewebes fehlt.

• Zellarme Ausstriche

Zytologie: Mit der Entnahme einer zytologischen Pro-be wird immer nur eine kleine Stichprobe an Zellen von einem Gewebe entnommen. Je mehr beurteilbare Zellen vorhanden sind, desto sicherer ist die zytolo-gische Interpretation. Sind nur wenige Zellen auf den Ausstrichen vorhanden, erhöht dies die Unsicherheit in der Beurteilung.

Spindelzellen in der Zytologie sind häufig nicht eindeutig als reaktiv oder neoplastisch einzuordnen.

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Die Befundinterpretation ist das Ergebnis der vorhande-nen zytologischen oder morphologischen Veränderun-gen. Die Qualität der Befundinterpretation hängt dabei von zwei großen Faktoren ab, die Sie als Tierarzt beein-flussen können:

1. Qualität der Proben

2. Vorberichtliche Informationen

• Probenqualität

Die Probennahme für die histopathologische und zytolo-gische Untersuchung ist häufig komplexer und auch we-niger standardisiert im Vergleich zur einfachen Blutpro-be. Fehler bei der Handhabung der Proben führen leicht zu Artefakten, die die Diagnostik beeinträchtigen. Tipps für die richtige Probennahme finden Sie in den Kapiteln Präanalytik in Zytologie und Histologie ab S. 8.

• Vorbericht

Wichtige Informationen über den Patienten, Anamnese, bisherige Be-handlung und die Umstände der Pro-bennahme sind in der Regel nur dem behandelnden Tierarzt bekannt. Je mehr relevante Informationen dem Pathologen auf dem Einsendeschein mitgeteilt werden, desto ausführli-cher kann die Beurteilung ausfallen. Es sollten Informationen zu Material, Probenherkunft und Anamnese an-gegeben werden. Für detailliertere Informationen siehe S. 7.

Zu vermeiden ist die Zusendung eines Auszugs der Pa-tientenakte ohne weiteren Kommentar, da relevante In-formationen übersehen werden können.

Eine schlechte Probenqualität und / oder ein unzureichen-der Vorbericht können schlimmstenfalls zu unnötigen weiterführenden Untersuchungen, wiederholter, häufig invasiver Probennahme, Fehldiagnosen oder gar verzö-gerter Therapie bzw. Fehlbehandlung führen.

Ein aussagekräftiger Befund braucht Ihre Vorarbeit

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Sinnvolle Informationen im Vorbericht

Umfangsvermehrung(en)• Probenart

Histopathologie: Exzisionsbiopsie, Inzisionsbiopsie, Trucut Zytologie: Punktion, Abklatsch

• Lokalisation• Bei mutiplen Umfangsvermehrungen Verteilung• Anzahl der Proben

Beschreibung der Umfangsvermehrung(en)• Größe (in cm)• Kutan / subkutan• Gut / schlecht abgegrenzt• Erhaben• Beweglich• Farbe• Gut oder schlecht resezierbar. Warum?• Makroskopisch komplett reseziert

Signalement• Tierart• Rasse (oder bei Mischlingen beteiligte Rassen

falls bekannt)• Geschlecht (kastriert)• Alter

Keine Umfangsvermehrung• Probenart

Histopathologie: Endoskopisch, «Full Thickness» Zytologie: Punktion, Abklatsch, Abstrich

• Genaue Lokalisation(en)• Anzahl der Proben / Lokalisationen

Beschreibung sichtbarer Veränderungen• Verteilung der Läsionen• Größe in mm / cm• Farbe

Bei Hauterkrankungen zusätzlich• Bilateral symmetrisch• Ulzeration, Schuppen, Pustelbildung

Hyperkeratose• Alopezie• Juckreiz

Weitere Informationen• Beobachtet seit wann? Akut verschlechtert / verändert?• Allgemeinbefinden• Vorerkrankungen• Weitere relevante Laborbefunde (Hämatologie, klini

sche Chemie, Imaging etc.)• Therapie(n) (inkl. anderer Erkrankungen)• Ansprechen auf Therapie. Momentan unter medika

menteller Therapie. Welche (besonders wichtig bei Antibio tika und Steroidtherapie)

Klinische Differenzialdiagnosen

Spezifische Fragestellungen• Neoplastisch oder reaktiv• Vollständigkeit lokaler Resektion bei Neoplasie• Lokales Rezidiv einer Neoplasie• Ausschluss bestimmter Erkrankungen (soweit möglich;

z. B. Autoimmunerkrankungen bei Hautbiopsien)

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Präanalytik in der ZytologieSowohl bei der Probennahme als auch bei der Herstellung der Ausstriche können einfache Tricks helfen, zellreiche, qualitativ hochwertige Präparate anzufertigen und somit die diagnostische Aussagekraft von zytologischen Präpara-ten deutlich zu verbessern.

Probennahme• Punktion (Abb. Seite 9, links)

Häufig bietet es sich an, unabhängig von der Art der Läsion zunächst eine Punktion ohne Aspiration durch-zuführen. Diese Methode ist besonders gut geeig-net bei Organen oder Läsionen, die gut durchblutet sind, oder deren Zellen wenig Kohäsion zeigen (z. B. Lymphknoten, entzündliche Läsionen, Rundzelltumo-ren, Milz etc.) und liefert häufig ausreichend Zellmate-rial. Mit dieser Methode kann das Risiko einer starken Blutkontamination der Probe deutlich reduziert werden. Wird beim ersten Versuch kein Material gewonnen kann zunächst eine größere Kanüle verwendet werden.

• Aspiration (Abb. Seite 9, rechts)

Erst wenn eine Punktion alleine nicht erfolgreich ist, soll-te in einem zweiten Schritt eine Punktion mit Aspiration durchgeführt werden. Die Technik ist ähnlich wie oben beschrieben, allerdings wird zusätzlich mit einer aufge-setzten Spritze durch Anziehen des Kolbens Unterdruck erzeugt. Hierbei ist es wichtig, den Unterdruck vor Ent-fernen der Kanüle aus dem Gewebe wieder zu lösen. Diese Methode ist zwar bei schlecht abschilfernden Lä-sionen häufig nötig, birgt aber ein höheres Risiko der Blutkontamination.

Aufbringen des Materials auf ObjektträgerEine leere, luftgefüllte Spritze (mind. 5 – 10ml) mit zu-rückgezogenem Spritzenkolben wird nach der Punktion auf die Kanüle gesetzt und das Material durch rasches Eindrücken des Spritzenkolbens auf einen Objektträger gespritzt. Hier ist weniger oft mehr: zu viel Material führt zu mehrschichtigen Ausstrichen, in denen die Zellen nicht beurteilbar sind. Wenn viel Material punktiert wurde, sollte dies immer auf mehrere Objektträger verteilt werden.

Benötigte Materialien:• Kanülen (kleinlumig z. B. 22G - schwarz)

• Spritze (5 oder 10ml)

• mind. 2 Objektträger (mit Mattrand)

• Bleistift

Ein qualitativ guter Ausstrich für die zytologische Untersuchung nach Färbung. Lymphknotenpunktat von einem Hund.

Derselbe Ausstrich unter dem Mikroskop: es finden sich einschichtige Bereiche mit zytologisch gut be-urteilbaren Zellen. Zytologische Beurteilung: Lymphom (50 x Objektiv).

Punktion

Feinnadelaspiration

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Punktion mit Kanüle ohne Spritze

Eine Kanüle (ohne aufgesetzte Spritze) in das Gewebe stechen

Eine Kanüle mit aufgesetzter Spritze in das Gewebe stechen

Mehrmals bis knapp unter die Haut zurück-ziehen und dann jeweils in einer leicht abge-änderten Richtung (sternförmig) wieder in das Gewebe einführen

Vor dem Herausziehen der Kanüle aus dem Gewebe sollte man den Finger auf den Konus legen.

Spritze mit Kolben in Nullposition bis knapp unter die Haut zurückziehen und den Vorgang mit leicht veränder-ter Richtung mehrmals wiederholen

Kanüle erst aus dem Gewebe entfernen, wenn kein Unterdruck besteht, dann Spritze von Kanüle trennen und mit Luft befüllen

Luftgefüllte Spritze auf Kanüle setzen Rasch auf OT sprühen Sofort ausstreichen!

Ca. 2 – 4 mal Unterdruck erzeugen, dann Spritzenkolben in Nullposition zurückgleiten lassen

Aspiration mit Unterdruck

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Herstellung von Ausstrichen

• Ausstreichen

Das Material auf dem Objektträger wird sofort mit einem weiteren Objektträger bedeckt und beide Objektträger ohne Druck zügig zur Seite hin auseinandergezogen.

Manchmal können zusätzlich Ausstriche nach der Blut-ausstrich-Methode angefertigt werden. Bei besonders fragilen Zellen (z. B. Lymphom) kann dies sinnvoll sein. In vielen Fällen ist es aber auf diese Art schwieriger, gute Ausstriche herzustellen.

Ob die Objektträger längs (5) oder im 90° Winkel (1 – 4) angesetzt werden hängt von der persönlichen Vorliebe ab und ist für das Ergebnis irrelevant.

➊ ➎

➋

➌

➍

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• Herstellung von Ausstrichen bei zu großer Materialmenge

Wenn zu viel Material auf den Objektträger gelangt, kann ein zweiter Objektträger vorsichtig flach auf-getupft und damit Material auf einen dritten Objektträger übertragen und ausgestrichen werden. Dies kann so oft wiederholt werden, bis auf dem ersten Objektträger ausreichend wenig Material übrig bleibt und ausgestrichen werden kann. Wenn viel Material punktiert wurde, wird das Material am besten stets direkt aus der Kanüle auf mehrere Objektträger verteilt, hierfür reicht ein kleiner Tropfen.

➊ ➎

➋ ➏

➌ ➐

➍ ➑

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Alternative ProbennahmemethodenDie folgenden Methoden eignen sich vor allem für ober-flächliches Probenmaterial z. B. in der Dermatologie. Zu beachten ist, dass tiefere Gewebebereiche nicht darge-stellt werden.

• Abklatsch-Dermatologie

ObjektträgerAbklatschIndikation: Schmierig-fettige und exsudative Läsionen, Erosionen, Ulzerationen, Pusteln und Krusten (nach Ab-heben der Kruste), epidermale Kolaretten und Fisteln.

Technik: Der Objektträger wird vorsichtig auf die Läsion gedrückt.

KlebefilmAbklatschIndikation: Trockene Haut, im Zwischenzehenbereich, Hautfalten oder bei wehrhaften Tieren.

Technik: Der Klebestreifen wird mit der klebenden Seite nach unten auf die Haut gepresst. Danach wird er mit der klebenden Seite auf einen Objektträger geklebt und ungefärbt ins Labor geschickt. Zur Beurteilung in der Praxis wird alternativ ein Tropfen Methylenblau oder der blauen Färbelösung der Zytologie-Schnellfärbung unter den Klebefilm aufgebracht.

• Abstrich

Indikation: z. B. Ohrabstrich (Otitisdiagnostik), Vaginal-abstrich (Zyklusbestimmung), Kornealabstrich

Technik: Tupferprobenentnahme aus dem gewünschten Bereich. Unmittelbar danach wird der Tupfer in mehre-ren Bahnen auf einem sauberen Objektträger ausgerollt. Das Material sollte dünn auf dem OT verteilt sein. Ein Ausstreichen ist hier zu vermeiden, da dies zur Lyse von Zellen führt.

• Abklatsch-Tumordiagnostik

Indikation: Oberflächliche Abklatschpräparate sind für die Tumordiagnostik bei Umfangsvermehrungen nur eingeschränkt geeignet, da nicht alle Tumorzellen gut oberflächlich abschilfern und häufig oberflächliche Ent-zündung oder Infektionen das Bild verkomplizieren. Bei abgrenzbaren Umfangsvermehrungen ist eine Punktion oder Biopsie i.d.R. besser geeignet um auch tiefere Ge-webebereiche darzustellen. Ausnahme hiervon ist die Herstellung von Abklatschpräparaten von chirurgischen Gewebebiopsien, diese können von allen Geweben her-stellt werden.

Technik: Eine frische Schnittfläche der Läsion wird mehrmals auf einen Objektträger getupft. Falls es sich um ein blutiges Gewebe handelt, sollte zuvor das Blut mit saugfähigem Papier abgetupft werden, bis die Ober-fläche leicht klebrig erscheint. Achtung: Falls die Gewe-beprobe in Formalin gegeben wird, den Behälter erst nach Entfernen der Objektträger öffnen, damit die Ob-jektträger nicht Formalindämpfen ausgesetzt werden.

Objektträger-Abklatsch

Klebefilm-Abklatsch

Ausrollen des Abstrichtupfers auf OT

TIPP Bitte auf dem Schein immer die Entahme-methode angeben, da diese Information die Beur-teilung durch den Pathologen beeinflusst. Bei der Verwendung mehrerer Entnahmemethoden bei der-selben Einsendung sollte diese Information auch auf den Objektträgern und dem Schein vermerkt werden (z. B. 1 = Abklatsch, 2 = FNA).

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FlüssigkeitenUm Flüssigkeiten für die zytologische Untersuchung zu verschicken sind EDTA-Röhrchen ideal, da EDTA die Zellen stabilisiert und die Gerinnung verhindert. Flüs-sigkeiten, die in unbeschichteten Röhrchen eingesandt werden, können auch bearbeitet werden, allerdings ver-schlechtert sich der Zellerhaltungszustand bei Verzö-gerungen schneller. Zu beachten ist jedoch, dass eine mikrobiologische Untersuchung von Flüssigkeiten in EDTA-Röhrchen nicht möglich ist.

Röhrchen mit Gerinnungsaktivatoren („Serum-Röhrchen“, Gel-Separator) sind ungeeignet für die zytologische Un-tersuchung (s. S. 17).

Wie bei allen anderen Proben ist es wichtig, die Röhr-chen eindeutig zu identifizieren. Idealerweise wird hierzu ein Barcode-Aufkleber benutzt und zusätzlich immer die Herkunft der Flüssigkeit (z. B. Pleuralerguss, Abszess etc.), sowohl auf dem Röhrchen als auch auf dem Schein an-gegeben.

Links: EDTA-Röhrchen, rechts: unbeschichtetes Röhrchen

Um die beste Beurteilbarkeit der Zellen in Flüssigkeiten zu garantieren, sollten zusätzlich unmittelbar nach der Pro-bennahme in der Praxis einige Nativausstriche hergestellt werden (siehe Ausstrichtechnik oben), bei zellarmen Pro-ben ggf. auch Sedimentausstriche.

• Sedimentausstriche

Indikation: Insbesondere für TBS & BAL (v.a. beim Pferd), Körperhöhlenergüsse, Urin und flüssigkeitsge-füllte Umfangsvermehrungen.

Die Sedimentation erlaubt eine Anreicherung von Zellen, damit auch aus zellarmen Flüssigkeiten zellreiche Aus-striche für die zytologische Beurteilung hergestellt wer-den können. Um die Zellen optimal zu erhalten, sollten diese Ausstriche sofort nach der Probennahme herge-stellt werden, wenn möglich noch in der Praxis. Dies gilt insbesondere für proteinarme Flüssigkeiten und wenn die Probe nicht taggleich im Labor eintrifft.

Technik: Ein möglichst großes Aliquot (mind. 1 – 2 ml) Flüssigkeit wird in ein unbeschichtetes zentrifugierbares Spitzröhrchen (z. B. Eppendorf) gegeben. Nach lang-samer Zentrifugation der Probe bei niedriger Drehzahl (z. B. 400g für 5min) wird der Überstand abpipettiert und das verbleibende Sediment mit einer Pipette aufge-schwemmt. Ist kein oder nur wenig Sediment makros-kopisch erkennbar, wird der Vorgang mit einer größeren Flüssigkeitsmenge wiederholt. Ausstriche vom Sediment werden hergestellt (siehe Ausstrichsherstellung).

Sedimentiertes Exsudat nach Zentrifugation

Alternativ kann die Probe zur Sedimentation für ca. 2 Stun-den in den Kühlschrank gestellt werden, bevor der Über-stand abpipettiert und nur das Sediment zentrifugiert wird (v.a. geeignet bei großen Flüssigkeitsmengen z. B. Spülproben der Atemwege beim Pferd).

Für die korrekte Beurteilung durch den Zytologen sollten die Ausstriche (und eingesandten Flüssigkeitsröhrchen) unbedingt als „nativ“ oder „Sediment“ beschriftet wer-den, da sonst Zellzahlschätzungen oder -messungen beispielsweise zur falschen Klassifizierung von Körper-höhlenflüssigkeiten führen können.

Besonderheiten von zellarmen Flüssigkeiten/SynoviaFalls nur geringe Mengen einer sehr zellarmen Flüssig-keit vorhanden sind (z. B. Liquor, Transsudate) ist eine Herstellung von Sedimentausstrichen mit einer Zentri-fuge schwieriger. Ein rascher Transport zum Labor als Flüssigkeit (im EDTA-Röhrchen) ist dann vorzuziehen, um eine optimale Aufarbeitung der wertvollen Probe zu gewährleisten.

Nicht nötig ist die Sedimentation auch bei Gelenkflüssig-keiten, hier bieten gute Nativausstriche selbst bei ge-sunden Gelenken mit niedriger Zellzahl meist ausrei-chend Zellen für die Beurteilung.

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Vorbereitung für den Versand

• Lufttrocknung der Objektträger

Alle Objektträger sollten sofort nach der Herstellung an der Luft getrocknet werden. Vermeiden Sie das Ein-packen von noch nassen Ausstrichen, da dies häufig zur Zerstörung der Zellen (Zelllyse) führt. Dünn ausge-strichenes Material trocknet rasch an Raumluft. Notfalls kann man mit einem Ventilator oder Fön (nur kalte Luft) nachhelfen.

• Beschriftung der Objektträger

Es empfiehlt sich die Verwendung von Objektträgern mit Mattrand, die mit Bleistift beschriftet werden soll-ten. Andere Beschriftungsarten, z. B. mit Kugelschrei-ber, Filzstiften, auch wasserfesten Stiften, führen bei der Färbung der Objektträger im Labor zur Ablösung der Be-schriftung. Um Verwechslungen zu vermeiden, müssen alle Objektträger eindeutig dem Patienten zugeordnet werden können. Daher ist eine Beschriftung der Objekt-träger mit mindestens Halternamen (+ 4 stellige Praxis-Alias) oder Probennummer (8-stellige Nummer auf dem Schein und Barcode) essentiell. Besonders wenn meh-rere Läsionen vom selben Patienten punktiert werden, ist es sehr wichtig, den Objektträger bezüglich der Her-kunft zu beschriften. Mehrere Läsionen können auch auf dem Schein nummeriert werden und die Objektträger mit der entsprechenden Nummer identifiziert werden. Bei Präparaten von Flüssigkeiten ist es außerdem wich-tig für die Beurteilung, die Ausstrichart (Nativ- oder Sedi-mentausstrich) entsprechend zu kennzeichnen.

Auf Mattrand mit Bleistift beschrifteter Objektträger

• Verpackung für den Transport

Objektträgerhülsen mit gepolsterter Umverpackung schützen die Glasobjektträger während des Transpor-tes. Formalindämpfe können Zellen beschädigen und verfärben (siehe Seite 17), daher sollten Proben für Zyto-logie unbedingt separat von Proben für Histopathologie verschickt werden.

Die OT-Hülsen können mit dem Barcode-Aufkleber ver-sehen werden, jedoch ersetzt dies nicht die Beschriftung der Objektträger. Bitte den Proben immer den komplett ausgefüllten Untersuchungsschein beilegen.

Objektträgerhülse für den Versand

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Häufige präanalytische Probleme

• Zellüberlagerungen

Zellüberlagerungen und das Fehlen einschichtiger Berei-che auf den Ausstrichen sind ein häufiger Grund dafür, dass zytologische Proben nicht beurteilbar sind. Häufige Ursachen hierfür sind:

1. Fehlendes Ausstreichen

Unausgestrichene Tropfen sind in der Regel zu dick.

Ausschnitt mikroskopisch (20 x Objektiv) Keine Zellen erkennbar

OT mit Tropfen

Punktat von einem Mammatumor einer

Hündin (50 x Objektiv).

OT mit Tropfen Ausschnitt mikroskopisch (4 x Objektiv)

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2. Quetschen ohne Ausstreichen

Die Herstellung von Quetschpräparaten durch Abheben des zweiten Objektträgers anstelle von Ausstreichen sollte vermieden werden, da auch hier einschichtige Be-reiche meist fehlen.

Quetschpräparate ohne Ausstreichen sind in der Regel ungeeignet.

3. Ausstreichen mit der Kanüle

Das Herstellen von Ausstrichen mit einer Kanüle führt ebenfalls zu sehr ungleichmäßiger Verteilung des Mate-rials. Einschichtige Bereiche sind häufig nur zufällig vor-handen.

Mit der Kanüle hergestellte Ausstriche

4. Ungleichmäßiges Ausstreichen

Zögern oder Schräges Aufsetzen des ausstreichenden Objektträgers beim Ausstreichen führt zu ungleichmäßi-ger Verteilung des Material (z. B. «Stottern»).

Ungleichmäßiger Ausstrich

• Langsames Trocknen

Zu dicke Ausstriche oder nass verpackte Ausstriche trocknen langsam, was zur Lyse von Zellen führt und die Zellen häufig unkenntlich macht. Erythrozyten for-men häufig kristalline Strukturen. Die Herstellung dünner Ausstriche und das Durchtrocknen vor dem Verpacken hilft dies zu vermeiden.

Langsames Trocknen des Ausstriches hat bei diesem Mastzelltumor zur Bildung von Erythrozytenkristallen geführt (50 x Objektiv)

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• Deckgläschen

Deckgläschen sind nicht geeignet für die Verwendung von ungefärbten zytologischen Proben, da durch eine fehlende oder verzögerte Lufttrocknung eine unzurei-chende Fixation der Zellen und eine Zelllyse stattfindet. Selbst nach nachträglichem Entfernen des Deckglases für den Färbevorgang finden sich meist keine intakten Zellen mehr in den abgedeckten Bereichen.

Zytologie von einem Abszess. Die rechte Bildhälfte ist von einem Deckglas bedeckt und keine Zellen sind er-kennbar. In der linken Bildhälfte (neben Deckglas) sind zahlreiche neutrophile Granulozyten erkennbar (10 x Objektiv).

• Störende Substanzen

Ultraschallgel

Gelartige Substanzen (z. B. Ultraschallgel oder Lubrikant-gel) färben sich intensiv lila und überlagern die Zellen, häufig bis zur Unkenntlichkeit. Eine Kontamination mit diesen Substanzen sollte daher vermieden werden.

Ultraschallgel stellt sich mikroskopisch als dunkellila-farbenes amorphes Material dar.

Gerinnungsaktivator

Flüssigkeiten, die in Röhrchen mit Gerinnungsaktivator (z. B. in Serumröhrchen und Granulatröhrchen) eingesandt werden, sind ungeeignet für die zytologische Untersu-chung.

Gerinnungsaktivator stellt sich mikroskopisch als lila-farbenes Präzipitat dar, Zellen fehlen komplett.

Formalinartefakte

Formalinartefakt: Erythrozyten sind grün verfärbt und kernhaltige Zellen nicht beurteilbar (50 x Objektiv.).

In einem normalen Ausstrich sind die Zellumrisse klar zu sehen. Die Färbung von Zellkern und Zytoplasma ist typisch für die Zellart. Aufgrund der Einwirkung von Formalindämpfen zeigen die Zellen eine artifizielle blau-grüne Verfärbung. Die kernhaltigen Zellen sind teilweise lysiert.

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• Probenvorbereitung

Sollten bestimmte Areale von besonderem Interesse sein (z. B. Bereiche, in denen Tumorgewebe nahe an den Ge-weberand reicht) können diese mit chirurgischer Tinte oder einer Naht gekennzeichnet werden. Fügen Sie dem Einsendungsschein eine entsprechende Legende bei. Es kann auch der gesamte periphere Geweberand mit Tinte angefärbt werden, das erleichtert die histologische Bestimmung des tumorfreien Geweberandes.

1. Kennzeichnung von Schnitträndern von besonde-rem Interesse mit chirurgischen Nähten

2. Kennzeichnung von Schnitträndern von besonde-rem Interesse mit chirurgischer Tinte

3. Kennzeichnung des gesamten Schnittrandes mit chirurgischer Tinte

• Umgang mit großen Proben

Bei großen Proben muss entschieden werden, ob die gesamte Probe untersucht werden muss (z. B. wenn auf Vollständigkeit der lokalen Resektion untersucht werden soll) oder ob eine Teileinsendung für die Fragestellung ausreicht.

Optimale Probennahem einer Umfangsvermehrung in der Milz

Bei Teileinsendung sollten je nach Größe mehrere Loka-lisationen eingesendet werden, unbedingt sollte dabei der Übergang von gesundem zu verändertem Gewebe repräsentiert sein. Fügen Sie dem Einsendungssschein ggf. eine Skizze mit Angabe der eingesendeten Teile bei. Ein häufiges Beispiel ist eine Umfangsvermehrung in der Milz mit Fragestellung Hämangiosarkom. Es ist je nach Größe der Milz nicht immer möglich diese kom-plett einzusenden; bei großen Milzen ist zudem die Fixa-tion häufig sehr schlecht. Nach einer neuen Publikation (Herman 2019) reichen fünf repräsentative Proben aus, um ein Hämangiosarkom mit 95% Wahrscheinlichkeit zu diagnostizieren. Die Proben sollten aus dem Übergang zwischen Tumor und unverändertem Milzgewebe stam-men, die Kapsel ist zu vermeiden.

Wenn große Proben im Ganzen verschickt werden, kön-nen sie zur besseren Fixation eingeschnitten werden, z. B. ein Hauttumor. Setzen Sie einen Einschnitt in die Haut bis tief in den Tumor. Große Proben können auch geteilt werden. Dies sollte auf dem Einsendungsschein unbedingt vermerkt werden. Kennzeichnen Sie hierfür die Probengefäße und legen eine entsprechende Legen-de auf dem Einsendungsschein an.

Einschnitt bzw. Teilung großer Proben zur besseren Fixation

Präanalytik in der Histopathologie

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• Umgang mit kleinen Proben

Bei sehr kleinen Proben (z. B. gastrointestinale oder Leber-biopsien), besteht die Gefahr der Fragmentierung mit eventuellem Verlust relevanten Probenmaterials. Sehr kleine Proben werden daher am besten in Histokas-setten oder eventuell ‘Safety Cells’ verschickt. Kleine Proben, die nicht zur Fragmentierung neigen (z. B. Haut-biopsien) können auch in einem bis zum Rand mit For-malin gefüllten Gefäß versendet werden, dies vermeidet Schäden durch Scherkräfte. Auftackern auf Pappe/Kork oder Aufkleben auf Papier ist nicht zu empfehlen, dies verursacht Artefakte und die Proben lösen sich häufig ab.

Safety cells (links) und Histologiekassetten (rechts) können zum sicheren Transprot kleiner Proben ver-wendet werden.

• Verpackung für den Transport

Es empfiehlt sich, wenn möglich, die Verwendung der zur Verfügung gestellten schon mit Formalinlösung be-füllten Behälter. Falls dies nicht möglich ist: Proben in dicht verschließbaren Gefäßen mit weitem Hals in 10% normalgepufferter Formalinlösung versenden. Bitte ver-wenden Sie zur Sicherheit des Laborpersonals niemals Glasbehälter. Verpacken Sie den Probenbehälter in ei-ner Tüte und fügen Sie genügend saugfähiges Material bei. Bitte legen Sie den Auftragsschein nicht unmittelbar in das Probenfach, da er durch auslaufende Formalin-lösung verunreinigt und unleserlich werden kann. Ver-wenden Sie ggf. eine weitere Tüte, um den Auftrags-schein der Probentüte beizufügen.

Probe optimal verpackt in saugfähiger Watte

Optimale Verwendung einer Tüte mit 2 Fächern: ein Fach enthält die Probe und das andere Fach enthält den Einsendungsschein.

• Volumenverhältnis Formalin : Probe

Die Proben dürfen nicht in zu kleinen Gefäßen gelagert werden, das Verhältnis Volumen Formalin : Probe sollte mindestens 10 : 1 betragen.

Optimales Volumenverhältnis von Formalin und Probe

Weiterführende LiteraturHerman, Stern, Fox and Dark: Understanding the Efficiency of Splenic Hemangiosarcoma Diagnosis Using Monte Carlo Simulations. Vet-Path 56: 856-859 (2019)

Jubb, Kennedy & Palmer’s Pathology of Domestic Animals, Volume 1

Kamstock et al.: Recommended Guidelines for Submission, Trim-ming, Margin Evaluation, and Reporting of Tumor Biopsy Specimens in Veterinary Surgical Pathology. VetPath 48:19-31 (2011)

Mischke: Zytologisches Praktikum für die Veterinärmedizin, Schlü-tersche

Raskin, Meyer: Canine and Feline Cytology, A Color Atlas And Inter-pretation Guide, Elsevier

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