Aus der
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
im St. Josef-Hospital
- Universitätsklinik -
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. E. H. Hamelmann
Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis
erkrankten Kindern und Jugendlichen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Caroline Doris Schmitz
aus Emsbüren
2008
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer
Koreferent: Prof. Dr. med. W. Görke
Tag der mündlichen Prüfung: 12. Mai 2009
Abstract
Schmitz
Caroline Doris
Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und
an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen
Problem: Regulatorische T-Zellen stellen eine Subpopulation von T-Lymphozyten dar. Sie zeichnen sich
durch die Oberflächenproteine CD4 und CD25 aus, exprimieren CD25 hoch und entwickeln sich teilweise
FOXP3-abhängig. FOXP3 ist als Transkriptionsfaktor von zentraler Bedeutung in der Entwicklung FOXP3
positiver regulatorischer T-Zellen. Regulatorische T-Zellen werden anhand ihrer Oberflächenproteine
CD45RA und CD45RO, welche sie vor bzw. nach Antigenkontakt exprimieren, in naive-like und memory-
like regulatorische T-Zellen unterschieden. Sie spielen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung der
Immunhomöostase und sind mit ihrer Funktion Effektorzellen zu unterdrücken an verschiedenen
Krankheitsbildern wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen oder Transplantatabstoßungen
beteiligt. Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis ist bisher
wenig erforscht.
In der vorliegenden Pilotstudie wird im Sinne der Grundlagenforschung erstmalig vergleichend die
absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden
und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht.
Methode: Mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen wurden in 5 ml heparinisiertem Vollblut von
gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden die Zellzahlen regulatorischer T-Zellen
bestimmt.
Ergebnisse: Patienten mit atopischer Dermatitis wiesen höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen auf als
gesunde Probanden. Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren konnten deutlich höhere Zellzahlen
bei Patienten mit atopischer Dermatitis beobachtet werden.
Die Anzahl naive-like regulatorischer T-Zellen verringerte sich in beiden Probandengruppen mit
zunehmendem Alter statistisch signifikant. Umgekehrt stieg gleichzeitig die Anzahl der memory-like
regulatorischen T-Zellen beider Probandengruppen.
Diskussion: Als mögliche Ursache der höheren Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit
atopischer Dermatitis wird eine geringere Funktion der Zellen und die daraus resultierende
kompensatorische Erhöhung der Zellzahl diskutiert.
Die deutlich höheren Zellzahlen in den ersten vier Lebensjahren werden als Reaktion auf eine hohe
entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter gesehen.
Als Grund des signifikanten Abfalls naive-like regulatorischer T-Zellen wird die stagnierende
Ausschleusung naiver Zellen aus dem Thymus abhängig von der Thymusinvolution erörtert. Für die
Aufrechterhaltung eines suffizienten Pools regulatorischer T-Zellen im Alter nach der Thymusinvolution
wird die periphere Expansion und die daraus resultierende Zunahme der memory-like regulatorischen T-
Zellen diskutiert.
Die vorliegende Studie leistet einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der immunologischen
Grundlagenforschung, indem sie basierend auf ihren Erkenntnissen zu absoluten Zellzahlen
regulatorischer T-Zellen und deren Veränderungen neue Fragen für die weitere Erforschung der Funktion
und der Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei Gesunden und im Krankheitsbild der atopischen
Dermatitis aufwirft.
1
INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungsverzeichnis................................................................................... 3
Abbildungsverzeichnis.................................................................................... 5
1 Einleitung ............................................................................................. 7
1.1 T-Lymphozyten...................................................................................... 7
1.2 CD4+ T-Zellen........................................................................................ 9
1.3 Regulatorische T-Zellen ...................................................................... 10
1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3 ................................................................ 16
1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen.......................................................... 18
1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen ............................... 19
2 Fragestellung..................................................................................... 21
3 Probanden, Material und Methoden................................................. 22
3.1 Probanden........................................................................................... 22
3.2 Materialien........................................................................................... 23
3.2.1 Labormaterialien und Geräte .................................................. 23
3.2.2 Reagenzien............................................................................. 24
3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper ........................................... 25
3.3 Methoden ............................................................................................ 25
3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes........................................ 25
3.3.2 Isolation der PBMC................................................................. 26
3.3.3 Anfärbung der PBMC.............................................................. 27
3.3.4 Durchflusszytometrie .............................................................. 31
3.3.5 Statistische Auswertung.......................................................... 39
2
4 Ergebnisse ......................................................................................... 40
4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit
atopischer Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als
Gesunde.............................................................................................. 41
4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-
Zellen: Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like
regulatorischen T-Zellen...................................................................... 43
4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer
Dermatitis erkrankter Kinder................................................................ 45
4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten............. 45
4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen ................... 48
5 Diskussion ......................................................................................... 51
5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten
mit atopischer Dermatitis: geringere Funktion -
kompensatorische Erhöhung der Zellzahl?! ........................................ 51
5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von
memory-like regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und
periphere Expansion............................................................................ 54
5.3 Ausblick ............................................................................................... 57
6 Literaturverzeichnis .......................................................................... 60
7 Anhang ............................................................................................... 67
3
Abkürzungsverzeichnis
+ positiv
- negativ
AD atopische Dermatitis
Ag Antigen
aTregs adaptive regulatorische T-Zellen (= iTregs)
BD Becton Dickinson
Cat.-No. Katalognummer
CD cluster of differentiation (Oberflächenmerkmale)
DNA Desoxyribonukleinsäure
DMSO Dimethylsulfoxid
Emmax Emissionsmaximum
Exmax Exzitationsmaximum
FACS fluorescence activated cell sorter
FCS fötales Kälberserum
FH forkhead-domain
FITC Fluorescein Isothiocyanat
FOXP forkhead box protein
FSC forward scatter
g Erdschwerebeschleunigung
Ig Immunglobulin
IFN Interferon
IL Interleukin
IPEX kompexes Krankheitsbild: Immundysregulation,
Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-chromosomal vererbt
iTregs induzierte regulatorische T-Zellen (= aTregs)
Jr Junior
LZ Leucin Zipper
M1 Marker1
M2 Marker2
MHC major histocompatibility complex
mRNA messenger ribonucleic acid
4
nm Nanometer
nTregs natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen
p Signifikanzniveau
PBMC peripher blood mononuclear cells
PBS phosphatgepufferte Salzlösung
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin Chlorophyll
R1 Region1
R2 Region2
R3 Region3
RAST Radio-Allergen-Sorbent-Test
RPMI Roswell Park Memorial Institute (Zellkulturmedium)
SSC side scatter
SCORAD severity scoring of atopic dermatitis
TCR t cell receptor
Teff T-Effektorzelle
TGF transforming growth factor
TH T-Helferzelle
TNF tumor necrosis factor
Tr/ Tregs T regulatorische Zellen
ZNfinger Zinkfinger
5
Abbildungsverzeichnis
Seite
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Entwicklung, des
Phänotyps und der Effektorfunktionen von
regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen
14
Abbildung 2 Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins 17
Abbildung 3 Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient 26
Abbildung 4 Zellzählung mittels Neubauerkammer 27
Abbildung 5 FOXP3 Antigen-Antikörperbindung 29
Abbildung 6 Immunfluoreszenz 30
Abbildung 7 Schematische Darstellung des Durchflusszytometers 32
Abbildung 8 Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung 33
Abbildung 9 Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut 35
Abbildung 10 Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von
Lymphozyten
36
Abbildung 11 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten
in Bezug auf Region1 (Abbildung 10)
37
Abbildung 12 Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf
Region2 (Abbildung 11)
37
Abbildung 13 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten
in Bezug auf Region1 (Abbildung 10)
38
Abbildung 14 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf
Region2 (Abbildung 13)
38
Abbildung 15 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf
Region3 (Abbildung 13)
39
Abbildung 16 Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen
(CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+
naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like)
regulatorischer T-Zellen
42
Abbildung 17 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der
Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen
44
Abbildung 18 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der
Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten
46
6
Abbildung 19 Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten,
mononukleären Zellen und Lymphozyten
47
Abbildung 20 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der
Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen
49
Abbildung 21 Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+,
CD4+CD45RA+ (naiven) und CD4+CD45RA- (Memory) T-
Helferzellen
50
7
1 Einleitung
1.1 T-Lymphozyten
T-Lymphozyten oder kurz T-Zellen sind eine für die Immunabwehr wichtige
Gruppe von Leukozyten. Sie sind in der Lage, spezifische Antigene zu
erkennen, gezielt zelluläre Abwehrmechanismen einzusetzen und
Antikörperbildung zu induzieren.
T-Lymphozyten erkennen Antigene ausschließlich in Form von Oligopeptiden,
die ihnen auf MHC-Molekülen von speziellen antigenpräsentierenden Zellen
(dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) präsentiert werden.
Dieses Phänomen wird als MHC-Restriktion bezeichnet. Die Antigen-MHC-
Komplexe werden von T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) erkannt, welche auf den
Oberflächen von T-Lymphozyten zu finden sind.
Ein T-Zell-Antigenrezeptor ist an den Proteinkomplex CD3 gebunden. CD3 ist
für die intrazelluläre Signaltransduktion nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors
verantwortlich. Die Signaltransduktion führt zur differenzierten Gentranskription,
die für die Proliferation, Differenzierung, Ausbildung der Effektorfunktionen und
das Überleben von T-Zellen notwendig ist.
Für eine effektive Antigenerkennung und Antigenreaktion sind verschiedenste
Korezeptoren von enormer Bedeutung. Sie verbessern und stabilisieren den
Kontakt zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle bzw. Zielzelle.
Außerdem sind sie an der Regulierung der Signaltransduktion über
kostimulierende oder hemmende Signale beteilgt.
Zwei dieser Korezeptoren dienen gleichzeitig als Oberflächenmarker für T-
Helferzellen: CD4 und CD45.
CD4 interagiert mit MHC-Klasse-II-Molekülen und stabilisiert den Kontakt
zwischen T-Zelle und Zielzelle. Außerdem ist CD4 durch Bindung einer
Thyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt.
CD45 besitzt eine katalytische Funktion als Thyrosinphosphatase und trägt
daher eine zentrale Rolle in der Bereitstellung notwendiger Kinasen für die
Signaltransduktion. Ohne funktionales CD45 können T-Lymphozyten nicht über
ihren Antigenrezeptor stimuliert werden.
8
T-Zellen entwickeln sich aus lymphatischen Vorläuferzellen, die wie alle
Blutzellenvorläufer im Knochenmark aus einer pluripotenten hämatopoetischen
Stammzelle entstehen. Einige dieser lymphatischen Vorläuferzellen wandern
zum Thymus. Dort werden sie als Thymozyten bezeichnet.
Der Thymus als primär lymphatisches Organ wird als Ort der zentralen T-Zell-
Entwicklung bezeichnet (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002).
Der Thymus wächst rapide während der Embryonalphase und in der Kindheit
und erreicht seine absolut maximale Größe in der Pubertät. Danach stagniert
sein Wachstum und er involiert fortschreitend bis in das hohe Alter. Die
Involution ist gekennzeichnet durch ein vermindertes Gewicht des Thymus, eine
lymphoide Atrophie und einen Ersatz durch Fettstrukturen (Simpson J.G. et al.,
1975).
Im Thymus reifen Thymozyten durch verschiedene Stimuli von
hämatopoetischen und epithelialen Stromazellen zu naiven T-Zellen aus.
Die Reifung der Thymozyten erfolgt in verschiedenen Stadien. Das erste
Stadium zeichnet sich durch die fehlende CD4 und CD8 Expression und den
Mangel eines vollständigen T-Zell-Antigenrezeptors auf Thymozyten aus. Die
Thymozyten werden hier als doppelt-negativ bezeichnet.
In der zweiten Reifungsphase zeichnen sich die Thymozyten durch eine
Expression von CD4 und CD8 aus. Sie werden nun als doppelt-positive
Thymozyten bezeichnet.
Aus den doppelt-positiven Thymozyten entwickeln sich schließlich im dritten
Stadium die reifen, einfach positiven, naiven CD4+CD8- oder CD4-CD8+ T-
Lymphozyten. Diese naiven T-Zellen verlassen den Thymus und wandern über
Blut oder Lymphgefäße in das periphere lymphatische Gewebe.
Im Thymus unterliegen die reifenden T-Zellen einem Prozess der als positive
oder negative Selektion bezeichnet wird. Dieser Prozess stellt sicher, dass reife
T-Zellen Fremd-Antigene ausschließlich im Kontext mit eigenen MHC-
Molekülen erkennen und dass eine Immunantwort gegen Selbst-Antigene
ausbleibt. Diese Selektion findet auf der zweiten Entwicklungsstufe der
Thymozyten statt.
9
Thymische Selektion kann nicht in jedem Fall gewährleisten, dass autoreaktive
T-Zellen daran gehindert werden, als reife, funktionelle Zellen den Thymus zu
verlassen. Dieses Phänomen ist erklärbar durch die Antigen-Vielfalt des
Körpers und die gleichzeitige Insuffizienz des Thymus, alle körpereigenen
Antigene zu exprimieren.
Zur Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz, die die Fähigkeit des
Körpers beschreibt, peripher autoreaktives Verhalten zu unterdrücken, sind
verschiedene Mechanismen bekannt. Als wahrscheinlich wichtigster Bestandteil
der peripheren T-Zell-Toleranz ist hier die Aktivität der regulatorischen T-Zellen
zu nennen (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002).
1.2 CD4+ T-Zellen
CD4+ T-Zellen, auch T-Helferzellen genannt, stellen eine Subpopulation der T-
Lymphozyten dar und tragen den CD4-Korezeptor an ihrer Oberfläche. Sie
werden, wie in 1.1 beschrieben, im Thymus aus Thymozyten differenziert und
wandern als naive CD4+ T-Zellen in die Peripherie. Dort werden sie zu T-
Effektorzellen aktiviert oder differenzieren zu CD4+ Gedächtniszellen, den
Memory T-Zellen.
Diese Aktivierung der CD4+ T-Zellen erfolgt über Antigenkontakt. Antigene
werden von antigenpräsentierenden Zellen auf MHC-II-Molekülen dargeboten.
Durch Bindung des MHC-II/ Antigen-Komplexes an den TCR wird die CD4+ T-
Zelle aktiviert, setzt Zytokine frei und beginnt zu proliferieren.
Anhand des sezernierten Zytokinmusters können die aktivierten CD4+ T-Zellen,
die T-Effektorzellen, in zwei Subpopulationen unterteilt werden. Die Zellen vom
Subtyp TH1, auch TH1-Effektorzellen genannt, sezernieren typischerweise
IFNχ, IL-2 und TNFβ. Die TH2-Zellen, auch TH2-Effektorzellen genannt,
sezernieren die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und TGFβ.
10
TH1-Zellen steuern durch ihre Zytokinausschüttung die Immunantwort in eine
zellulär betonte Richtung, die sich unter anderem in einer
Aktivierung von Makrophagen äußert. TH2-Zellen steuern die Immunantwort in
eine humoral betonte Richtung. Sie aktivieren durch ihr Zytokinmuster B-Zellen
und veranlassen eine Antikörperproduktion.
Etwa 5% aller naiven CD4+ T-Zellen differenzieren zu Memory T-Zellen. Die
phänotypische Unterscheidung von naiven CD4+ T-Zellen und Memory T-Zellen
wird durch die Isoformen des Oberflächenproteins CD45 ermöglicht. Naive
CD4+ T-Zellen exprimieren die Isoform CD45RA, Memory T-Zellen hingegen die
Isoform CD45RO, die einer Spleißvariante des CD45RA entspricht.
Memory T-Zellen steuern im Gegensatz zu den T-Effektorzellen die
Immunantwort nicht in eine spezifische Richtung. Sie können sowohl
dendritische Zellen als auch B-Zellen aktivieren und die entsprechenden
Signale zur Antikörperproduktion bereitstellen. Memory T-Zellen besitzen
zudem die Fähigkeit, auch nach Jahren bei erneutem Kontakt mit dem gleichen
Antigen eine schnelle und effiziente Immunantwort zu vermitteln (Holländer
G.A. et al., 2006).
1.3 Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen, auch T-Regulatorzellen oder Tregs genannt, stellen
eine Subpopulation der CD4+ T-Zellen dar. Sie wurden 1995 erstmalig von
Sakaguchi et al. beschrieben.
So genannte Suppressor-Zellen, denen regulatorische Funktionen
zugesprochen wurden, wurden schon 1971 von Gershon und Kondo identifiziert
(Gershon R.K. et Kondo K., 1971).
Wegen widerspüchlicher Forschungsergebnisse verschwand jedoch das
Konzept der T-Zell-Suppression in den 1980ern.
Sakaguchi et al. erregten als Erste wieder das Interesse an den nun so
genannten regulatorischen T-Zellen durch Entdeckung einer Population von
CD4+ Zellen, die CD25 (alpha-Kette des IL-2-Rezeptors) hoch exprimierte und
in einem Mausmodell Autoimmunität verhinderte (Sakaguchi S. et al., 1995).
11
Heute weiß man, dass regulatorische T-Zellen bei Menschen in der Lage sind,
zerstörende immunologische Abwehrreaktionen zu kontrollieren und
Immunantworten gegen ungeeignete Ziele wie Selbst-Antigene oder nicht-
schädliche externe Antigene zu verhindern. Ihre Funktion ist wesentlicher
Bestandteil der periperen Toleranz (Bacchetta R. et al., 2007).
Es sind verschiedene Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen
beschrieben, die koexistieren und zur Immunsuppression beitragen (vgl.
Abbildung 2, S. 19).
Zu unterscheiden sind natürlich vorkommende CD4+CD25high regulatorische T-
Zellen, peripher induzierte CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, zum Beispiel
Tr1 und TH3 Zellen, sowie CD4+CD25high regulatorische T-Zellen, die sich in
der Peripherie durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entwickeln (Beyer M.
et Schultze L., 2006).
Die natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen werden auch
als nTregs bezeichnet. Sie entwickeln sich im Thymus und sind daher von
denjenigen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen abzugrenzen, welche in der
Peripherie induziert werden. Die peripher induzierten CD4+CD25+
regulatorischen T-Zellen werden auch als adaptive oder induzierte
regulatorische T-Zellen (aTregs/ iTregs) bezeichnet (Bacchetta R. et al., 2007;
Casares N. et al., 2007).
aTregs werden in verschiedene Zelltypen unterschieden: die IL-10
produzierenden Typ 1 regulatorischen T-Zellen (Tr1), deren suppressive
Funktion bei Allergien, Autoimmunität und allogener Transplantation gut belegt
ist (Bacchetta R. et al., 2007), sowie die TH3-Zellen, die die Aktivität
konventioneller T-Zellen in einer TGF-β abhängigen Art unterdrücken (Buckner
J.H. et al., 2004) und nach oralem Antigenkontakt oder durch Stimulation von
CD4+CD25- T-Zellen in Anwesenheit von TGF-β induziert werden (Valmori D. et
al., 2005).
12
aTregs entwickeln sich unter dem Einfluss von vermutlich unreifen
dendritischen Zellen und/ oder der Anwesenheit von IL-10 und TGF-β, aber
auch unter Anwesenheit immunsuppressiver Medikamente wie
Glukokortikoiden und Vitamin D3 (Verhagen J. et al., 2006). Sie entwickeln sich
Foxp3 unabhängig (Vieira P.L. et al., 2004).
Foxp3-abhängig entwickeln sich die nTregs (Hori S. et al., 2003) und die
peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs, die
den nTregs sehr ähnlich sind (Bacchetta R. et al., 2007).
nTregs, die im Thymus entstehen, unterdrücken die Proliferation von CD4+ und
CD8+ T-Effektorzellen, sowie die IL-2 mRNA-Transkription und die damit
verbundene IL-2 Produktion, welche als Wachstumsfaktor für die autokrine
Proliferation von T-Zellen fungiert. Sie supprimieren hauptsächlich via Zell-Zell-
Kontakt (Bacchetta R. et al., 2007). Der genaue Mechanismus der Suppression
ist jedoch bisher noch nicht bekannt.
nTregs unterdrücken nicht nur T-Zellen, wie die aTregs, sondern auch natural
killer cells, die Reifung von dendritischen Zellen und die Antikörperproduktion
der B-Zellen (Bacchetta R. et al., 2007).
Die peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs
sind eine von Akbar et al. beschriebene Population von regulatorischen T-
Zellen. Sie ähneln phänotypisch den nTregs und sind vermutlich diejenigen
Zellen, die nach der Thymusinvolution den Pool der nTregs aufrecht erhalten.
Das Modell für die periphere Entstehung von diesen Tregs im Menschen lautet:
Naive T-Zellen werden durch die Begegnung mit einem Antigen oder einer
antigenpräsentierenden Zelle geprimed. Sie verlieren daraufhin ihren
Oberflächenmarker CD45RA und exprimieren CD45RO. Erneuter
Antigenkontakt führt zur Differenzierung der nun aktivierten Zellen zu einer hoch
differenzierten Population, den CD4+CD45RO+ Memory T-Zellen. Diese hoch
differenzierten Zellen neigen zu Apoptose und produzieren insuffiziente Levels
von IL-2 für die autokrine Proliferation. Sie sind daher leicht in das Stadium der
Anergie zu überführen. Mit der Überführung erlangen sie ihre suppressive
Aktivität und werden als regulatorische T-Zellen bezeichnet.
13
Dieses Modell schließt die Koexistenz anderer Populationen von thymisch
produzierten oder cytokin-abhängigen Populationen regulatorischer T-Zellen
nicht aus (Akbar A.N. et al., 2003).
Abschließend lässt sich festhalten, dass in der aktuellen Literatur zu den
Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen keine klare schematische
Darstellung der Populationen vorliegt. Abbildung 1 zeigt ein selbsterstelltes
Schema aus Informationen zu regulatorischen T-Zellen der angegeben Quellen.
14
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entwicklung, des Phänotyps und der Effektorfunktionen von regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen. (Akbar, 2003;
Banham, 2006; Buckner, 2004; Chatenoud, 2006; Holländer, 2006; Shevach, 2004; Toda, 2006;
Vieira, 2004)
CD4+
CD4+
CD25high
FOXP3+
CD45RA+
TH1, TH2(Teff)
CD4+
CD25-
FOXP3-
Thymus
CD4+
CD25-
FOXP3-
Th3
Tr1
CD4+
CD25high
FOXP3+
CD45RO+
aTregs / iTregs
CD4+
CD25-
FOXP3-
CD4+
CD25high
FOXP3+
CD45RA+
Antigen-
stimulation
CD4+
CD25high
FOXP3+
CD45RO+
CD4+
CD25high
FOXP3-
CD45RO+
CD4+
CD25+
FOXP3-
CD45RO+
CD4+
CD25high
FOXP3-
CD45RO+
nTregs
TH1: IFNχ, IL-2, TNFβ
TH2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGFβ
IL-10high
TGF-βhigh
In vivo:
Zell-Zell Kontakt
Cytokinunabhängig
?
Z
I
E
L
Z
E
L
L
E
N
Antigen-
stimulation
naive-like nTreg
Antigen-
stimulation
memory-like nTreg
Naive CD4+
T-Zelle
Memory T-Zelle
15
Regulatorische T-Zellen können nach ihrem Entwicklungsstand in zwei
verschiedene Zelltypen unterschieden werden.
Der eine Typ regulatorischer T-Zellen ist charakterisiert durch die Expression
von CD45RAhigh und CD45ROlow. CD45RA gilt, wie bei den T-Helferzellen, als
Marker für naive Zellen. Zugehörige zu diesem Typ Zellen werden als naive-like
regulatorische T-Zellen bezeichnet.
Der andere Typ regulatorischer Zellen ist durch die Marker CD45ROhigh und
CD45RAlow charakterisiert. CD45RO gilt als Memory-Zell-Marker. Daher werden
Zugehörige zu diesem Typ Zellen als memory-like regulatorische T-Zellen
bezeichnet (Banham A.H. et al., 2006).
Zusammenfassend ist zu sagen, dass regulatorische T-Zellen CD4 und CD25
als Oberflächenproteine exprimieren, über Zell-Zell Kontakt und
Zytokinausschüttung Zielzellen unterdrücken und damit die Immunhomöostase
aufrecht erhalten. Außerdem sind sie anerg (inaktiv), besitzen eine geringe
Proliferationskapazität und neigen zu Apoptose (Akbar A.N. et al., 2003).
CD25 ist jedoch als Marker für regulatorische T-Zellen nicht spezifisch. CD25
wird außer auf regulatorischen T-Zellen auf aktivierten T-Effektorzellen, den
TH1- und TH2-Zellen exprimiert. Er kann daher nicht direkt genutzt werden, um
regulatorische T-Zellen von aktivierten T-Effektorzellen zu unterscheiden.
Um die regulatorischen T-Zellen mit einer nur geringen Kontamination von T-
Effektorzellen bestimmen zu können, bedarf es der Analyse der CD4+CD25high
Population. Diese Population besitzt regulatorische Aktivität und exprimiert
CD25 auf einem hohen Niveau.
Als signifikantester Marker für die regulatorischen T-Zellen gilt jedoch FOXP3,
ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung der regulatorischen T-Zellen
von zentraler Bedeutung ist (Banham A.H. et al., 2006).
16
1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3
Das „Forkhead box Protein“ FOXP3 ist Mitglied der P Subfamilie der Fox-
Transkriptionsfaktoren (Lopes J.E. et al., 2006).
Die Familie der Fox-Transkriptionsfaktoren wurde 1990 erstmalig von Weigel
und Jäckle beschrieben (Weigel D. et Jäckle H., 1990) und besteht heute aus
mindestens 43 Mitgliedern, welche in zwei Klassen unterteilt werden. Klasse 1
besteht aus den Subfamilien A-G, I-L und Q, Klasse 2 wird von den Familien H
und M-P gebildet. FOXP3 gehört demnach zur Klasse 2 dieser Familien
transkriptionaler Regulatoren (Katoh M. et al., 2004).
Die Schreibweise in Großbuchstaben definiert FOXP3 als einen humanen
Transkriptionsfaktor. Per Nomenklatur definiert die Schreibweise Foxp3 den
Transkriptionsfaktor in Mäusen, die Schreibweise FoxP3 den
Transkriptionsfaktor in allen anderen Spezies (Carlsson P. et al., 2002).
Die Fox-Transkriptionsfaktoren sind charakterisiert durch eine invariante, d.h.
stabile winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne (Lopes J.E. et al., 2006).
Diese besteht aus ca. 100 Aminosäuren (Kaestner K.H. et al., 2000).
Das FOXP3-Protein besteht aus insgesamt 431 Aminosäuren. Strukturell ist es
aus der C-terminalen winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne, einem
mittig liegenden C2H2 Zink Finger und einem ebenfalls mittig liegenden Leucin
Zipper aufgebaut. Der N-Terminus ist reich an Prolin, jedoch bisher nicht
funktionell definiert (Lopes J.E. et al., 2006).
Das FOXP3-Protein ist kodiert aus 11 Exons. Bei Menschen, im Gegensatz zu
Mäusen, ist eine zweite kürzere Isoform des FOXP3-Proteins bekannt, in
welcher das Exon 2 fehlt. Im Moment ist jedoch die Funktion dieser zwei
Unterformen nicht bekannt (Bacchetta R. et al., 2007).
17
Abbildung 2: Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins (Lopes, 2006) mit C-terminaler Forkhead-Domain, mittig liegendem Zink Finger (ZN finger) und Leucin Zipper (LZ) und
alternativ gesplicetem Exon 2.
Die winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne des FOXP3-
Transkriptionsfaktors kann an den IL-2 Promotor binden und die IL-2-mRNA
Transkription unterdrücken. Zusätzlich besitzt der N-Terminus des Proteins
essentielle Stellen für die Repressoraktivität. FOXP3 gilt allgemein als
Repressor, der die Bildung von IL-2, welches als Wachstumsfaktor für die
autokrine Proliferation von T-Zellen fungiert, unterdrückt.
Neben der DNA-bindungs Domäne, die außerdem wichtig für die
Kernlokalisation von FOXP3 ist, kodiert das Protein Zink Finger und Leucin
Zipper Domänen, die Homodimerisation und Heterodimerisation mit anderen
forkhead-Familienmitgliedern oder anderen DNA-bindenden Kofaktoren
erlauben (Bacchetta R. et al., 2007).
Bei einer Gen-Sequenzanalyse bildete sich das FOXP3 Gen auf dem
Chromosom Xp11.23 ab (Zavattari P. et al., 2004).
Ist das FOXP3-Protein durch Genmutationen in der kodierenden Region
verändert, kommt es klinisch zum seltenen, verherenden Krankheitsbild IPEX.
Das Krankheitsbild IPEX wurde vor mehr als 20 Jahren zum ersten Mal
beschrieben. IPEX steht als Abkürzung für ein Syndrom, das einem x-
chromosomal-rezessiven Erbgang unterliegt und sich in Immundysregulation,
Polyendokrinopathie und Enteropathie äußert. Es ist assoziiert mit einem
autoimmunen Diabetes, Hypothyreoidismus, autoimmuner hämolytischer
Anämie, wiederkehrenden Infektionen, membranöser Nephropathie, einem
Hyper-IgE und atopischer Dermatitis. Das Krankheitsbild geht meist mit einem
frühen Tod der männlichen hemizygoten Träger um den 24. Lebensmonat
einher. Todesursachen sind Sepsis und massive Gedeihstörung (Owen C.J. et
al., 2003; Torgerson T.R. et al., 2007).
Das FOXP3 Gen mutiert bei IPEX im Intervall 17-20-cM auf Chromosom Xp
11.23-Xq13.3 (Bennett C.L. et al., 2001).
18
1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen
Die Entdeckung von Foxp3 als einem spezifischen Marker für natürlich
vorkommende regulatorische T-Zellen (Hori S. et al., 2003) hat zu einer
regelrechten Explosion der Forschung auf dem Gebiet der regulatorischen T-
Zellen geführt.
FOXP3 fungiert als Hauptregulator in der Entwicklung und Funktion von
natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und ist damit ein
Schlüssel für die Aufrechterhaltung der normalen Immunhomöostase.
Der Funktionsverlust von FOXP3 führt zu einem Mangel an regulatorischen T-
Zellen und resultiert in dem letalen Krankheitsbild IPEX. Die Überexpression
dieses Modulators führt zu schwerer Immundefizienz (Ochs H.D. et al., 2005).
Bei verschiedenen Krankheiten wurden Änderungen in der Anzahl und Funktion
von FOXP3 positiven regulatorischen T-Zellen gefunden.
Patienten mit Tumoren zum Beispiel zeigen lokal einen relativen Überfluss an
FOXP3 positiven Zellen, welche die Möglichkeit des Körpers inhibieren, die
Bildung von tumorösen Zellen zu unterdrücken (Beyer M. et Schultze J.L.,
2006).
Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus
erythematodes hingegen besitzen eine relative Dysfunktion von FOXP3
positiven Zellen (Alvarado-Sánchez B. et al., 2006).
In Tierstudien führte die Induktion oder Zugabe von Foxp3 positiven T-Zellen zu
einer merklichen Reduktion der Schwere von Erkrankungen wie Diabetes,
Multipler Sklerose, Asthma, inflammatorischen Darmerkrankungen, Thyreoiditis
und renalen Krankheiten (Suri-Payer E. et al., 2006).
Um jedoch regulatorische Zellen für humane Immuntherapien, die zum Beispiel
zur Heilung von Autoimmunerkrankungen, zur Verhinderung von
Transplantatabstoßungen oder zur Tumorzellinhibition beitragen, nutzen zu
können, ist es wichtig die Biologie der regulatorischen T-Zellen genau zu
verstehen (Banham A.H. et al., 2006). Dies ist Gegenstand der aktuellen
Forschung.
19
1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen
Die atopische Dermatitis, auch atopisches Ekzem genannt, ist eine chronisch
rezidivierende, inflammatorische Hautkrankheit.
Die Diagnose der atopischen Dermatitis basiert auf folgender klinischer
Konstellation: Pruritus, faziale und extensorseitige rote, schuppende, manchmal
auch nässende Ekzeme bei Kindern, flexorseitige Ekzeme derselben
Morpholgie bei Erwachsenen und Chronizität der Dermatitis, die unter anderem
zur Lichenifikation führen kann.
Der klinische Phänotyp der atopischen Dermatitis ist als ein Produkt der
Interaktion zwischen prädisponierenden Genen, Umweltreizen, kutaner
Hyperreagibilität aufgrund einer defekten Hautbarrierefunktion und
immunologischen Antworten zu sehen.
Die atopische Dermatitis ist typischerweise eine Erkrankung des Säuglings- und
Kindesalters. Sie kann bis zur Pubertät ausheilen aber auch bis in das
Erwachsenenalter persistieren. Verschiedene Beobachtungen deuten darauf
hin, dass die atopische Dermatitis die kutane Manifestation einer systemischen
Erkrankung ist. Sie ist die initiale Erkrankung, die mit Nahrungsmittelallergien,
allergischer Rhinitis und Asthma bronchiale assoziiert sein kann. All diese
Erkrankungen gehören zum atopischen Formenkreis und sind charakterisiert
durch erhöhte Serum-IgE Spiegel (Leung D.Y. et al., 2004; Sitzmann F.C.,
2002; Koletzko B. et al., 1999).
Zur Beurteilung des Schweregrades der Erkrankung kann der SCORAD-Score
angewandt werden. SCORAD dient zur Klassifizierung des Schweregrades
einer atopischen Dermatitis. Als Einstufungskriterien gelten: Alter des Patienten,
dermale Ausbreitung der atopischen Dermatitis anhand der 9-er Regel (Gesicht,
Hände, Torso,...), Intensität (Erythem, Ödem/ Papulation, Exkoriation,
Lichenifikation, trockene/ nässende/ verkrustete Stellen) und subjektive
Beschwerdezeichen (Pruritus, Insomnie) (Oranje A.P. et al., 2007).
Auf histologischer Ebene kann eine dermale mononukleäre Infiltration der
Hautläsion der atopischen Dermatitis beobachtet werden.
20
Während der initialen Inflammationsphase wandern T-Effektorzellen in die
Dermis der Läsion ein und sezernieren IFN-χ. IFN-χ induziert die Apoptose von
Keratinozyten, was wahrscheinlich zu der charakteristischen ekzematösen
Hautveränderung der Patienten mit atopischer Dermatitis führt. Als Antwort auf
INF-χ regulieren die Keratinozyten die Produktion der durch INF-χ induzierten
Zytokine hoch. Dies fördert die Infiltration weiterer T-Zellen in die Epidermis und
erhöht damit die Schwere der Inflammation und der Keratinozyten-Apoptose
(Verhagen J. et al., 2006).
Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen
Dermatitis ist bisher wenig erforscht.
Bei Patienten mit atopischer Dermatitis konnten FOXP3 positive regulatorische
T-Zellen nicht in inflammatorischen Hautläsionen nachgewiesen werden.
Allerdings waren Tr1 Zellen, als eine Gruppe der peripher induzierten
regulatorischen T-Zellen nachweisbar. Die Abwesenheit der FOXP3+
regulatorischen T-Zellen deutete auf eine dysregulierte Kontrolle der
Inflammation hin (Verhagen J. et al., 2006).
Dass FOXP3 positive regulatorische T-Zellen eine zentrale Rolle in der
Regulation immunologischer Erkrankungen spielen, ist spätestens seit der
Beobachtung des Krankheitsbildes IPEX klar. IPEX Patienten besitzen aufgrund
eines Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine nTregs und leiden darausfolgend
an einer schweren Immundefizienz, die unter anderem von einer atopischen
Dermatitis begleitet wird (Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006).
Die genaue Rolle regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen
Dermatitis sowie die potentielle Einsetzbarkeit regulatorischer T-Zellen in der
Immuntherapie, welche möglicherweise zu einer Heilung der atopischen
Dermatitis beitragen könnte, wird weiterhin nachhaltig Gegenstand der
Forschung bleiben.
21
2 Fragestellung
Regulatorische T-Zellen wurden zuerst 1995 beschrieben. Seither sind die
regulatorischen T-Zellen zu einem zentralen Punkt der immunologischen
Forschung geworden.
Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Erforschung der absoluten
Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis
erkrankten Kindern und Jugendlichen. Außerdem umfasst sie die Analyse der
altersabhängigen Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen beider
Probandengruppen.
Hierbei stellen sich folgende Fragen:
• Gibt es hinsichtlich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen
Unterschiede zwischen der gesunden Kontollgruppe und der Gruppe von
Patienten mit einer atopischen Dermatitis? Wie wären diese zu werten?
• Ändern sich mit dem Alter die Zellzahlen verschiedener Subpopulationen
regulatorischer T-Zellen in beiden Probandengruppen? In welchem
Zusammenhang wären diese Veränderungen zu sehen?
22
3 Probanden, Material und Methoden
In diesem Kapitel werden zunächst die Auswahlkriterien für die teilnehmenden
gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden dargestellt. Es
folgt eine Auflistung der verwandten Materialien. Daraufhin werden die
angewandten Verfahren zur Markierung der Oberflächenantigene CD4 CD25
und CD45 sowie des intrazellulären Markers FOXP3 und die
durchflusszytometrische Analyse der Zellpopulationen beschrieben. Das Kapitel
schließt mit der Darstellung der verwandten statistischen Analyseverfahren der
experimentellen Daten.
3.1 Probanden
Insgesamt nahmen 54 Probanden an der klinischen Pilotstudie teil. Die
Probanden befanden sich im Alter von 0 bis 18 Jahren. 37 Probanden gehörten
der gesunden Kontrollgruppe an; 31 männlichen, 6 weiblichen Geschlechts; 32
deutscher, 5 anderer Herkunft. 17 Probanden waren der Gruppe an atopischer
Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zuzuordnen; 11 männlichen, 6
weiblichen Geschlechts; 13 deutscher, 4 anderer Herkunft.
Als Kriterien für die Gruppe der gesunden Kinder und Jugendlichen galten:
• Kein Leiden an einer akuten oder chronischen Krankheit
• Insbesondere kein Leiden an atopischer Dermatitis, Asthma oder
Allergien
• Keine Einnahme immunsupprimierender oder immunmodulierender
Medikamente
Als Kriterien für die Gruppe der an atopischer Dermatitis erkrankten Kinder und
Jugendlichen galten:
• Leiden an atopischer Dermatitis klassifiziert nach dem SCORAD-Score
• Erhöhtes Gesamt-IgE
• Positive RAST-Ergebnisse
23
Untersucht wurden 5 ml heparinisierten Vollbluts von gesunden und an
atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen. Die Teilnahme an
der klinischen Querschnittsstudie beschränkte sich auf die einmalige Abnahme
von 5 ml Blut. Die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum und die Eltern
der Kinder erklärten ihre Zustimmung.
Die Blutproben wurden im Rahmen einer geplanten Operation durch einen
standardmäßig gelegten venösen Zugang, im Rahmen einer erforderlichen
Blutabnahme zur Vaterschaftstestung oder im Rahmen einer geplanten
Allergietestung abgenommen.
Mitwirkende Abteilungen waren:
• die kinderchirugische Praxis Dr. med. M. Standke, Bochum-
Wattenscheid
• die anästhesiologische und unfallchirurgisch-orthopädische Abteilung
des St. Josef-Hospital Bochum
• die Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum
• die Praxis für Allgemeinmedizin Dr. med. J. Möllers, Rheine
• die Sprechstunde für Kinder mit atopischer Dermatitis von Herrn Prof. Dr.
med. U. Schauer in der Kinderklinik Bochum.
3.2 Materialien
3.2.1 Labormaterialien und Geräte
Labormaterialien
1,5 ml sicher verschließbares Röhrchen
1,8 ml Cryo Röhrchen
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube
10 ml serologische Pipette, steril
15 ml konisches Röhrchen (Blue Max Jr.)
50 ml konisches Röhrchen (Blue Max)
Deckgläser optisch plan geschliffen
Pipettenspitzen (klein/ groß)
Eppendorf, Bestell-Nr. 0030 120.086
Nunc, Dänemark, Cat.-No. 363401
Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352052
Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 357530
Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352096
Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352070
Eppendorf
24
Geräte
Arbeitsbank Heraeus LaminAir, steril
Auflichtmikroskop
Automatische Pipette Express
Durchflusszytometer FACScanTM
Eppendorf Reference 20 Pipette (2-20 µl)
Gefriertruhe (–88°C)
Kühlschrank
Labsystems 4500 Finnpipette (200-1000 µl)
Stickstoffbehälter
Styroporbehälter
Vortexer (VF2)
Wasserbad
Zählkammer nach Neubauer
Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS)
Heraeus Instruments
Zeiss (West Germany)
Falcon/ BD, USA
BD
Eppendorf
Profiline, National Lab Gubtt
Liebherr
Thermo Scientific
Chronos Biosafe, Messer
Falcon
Janke und Kunkel IKA-Labortechnik
Köttermann
Heraeus sepatech
3.2.2 Reagenzien
Biocoll-Trennlösung (Dichte 1.077 g/ ml)
Einfriermedium (Freeze):
4,4 ml RPMI 1640
100 µl Penicillin/ Steptomycin (1%)
1 ml DMSO
4,5 ml FCS
FoxP3 Staining Buffer Set
• Fixation/ Permeabilization Diluent
• 10x Permeabilization Buffer
• Fixation/ Permeabilization Concentrate
Heparin-Natrium Braun 100.000 I.E.
PBS (Dulbecco), steril
PBS-0,1% NaAcid
Rattenserum
Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L6115
Cat.-No. 00-5523-00, NatuTec
• Cat.-No. 00-5223-56, NatuTec
• Cat.-No. 00-8333-56, NatuTec
• Cat.-No. 00-5123-43, NatuTec
Braun Melsungen AG, Melsungen
Cat.-No. 3212010
Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L1825
Sigma, USA, Cat.-No. R 9759
25
Türk´sche Lösung
Fluka Chemie GmbH, Schweiz,
Cat.-No. 93770
3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper
Antikörper
FITC anti-human CD25
FITC labeled anti-human CD45RA
PE anti-human CD25
PE-conjugated anti-human Foxp3
PerCP labeled anti-human CD4
BD-Pharmingen™
Cat.-No. 555431
BD-Pharmingen™
Cat.-No. 555488
BD-Pharmingen™
Cat.-No. 555432
eBioscience
Cat.-No. 12-4776-73
BD Biosciences, USA
Cat.-No. 345770
Kontrollantikörper
Mouse IgG2a PerCP
Mouse γ1 FITC
Mouse γ1 PE
PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control
BD Immuncytometry systems, USA
Cat.-No. 349054
BD Immuncytometry systems, USA
Cat.-No. 345815
BD Immuncytometry systems, USA
Cat.-No. 345816
eBioscience
Cat.-No. 12-4321-71
3.3 Methoden
3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes
Zu Beginn der durchgeführten Studie wurden 5 ml Vollblut von gesunden
Kindern sowie von Patienten mit atopischer Dermatitis der Kinderklinik Bochum
abgenommen und in 200 µl Heparin aufgenommen. Von jeder heparinisierten
Blutprobe wurden 500 µl für ein Differentialblutbild entnommen. Die Erstellung
26
des Differentialblutbildes erfolgte im Labor des St. Josef-Hospital Bochum. Das
Blutbild wurde verwandt, um prozentuale Zellwerte in absolute Zellzahlen
umzurechnen.
3.3.2 Isolation der PBMC
Für die Präparation der PBMC, der peripher blood mononuclear cells, wurde
das heparinisierte Blut im Verhältnis 1:3 mit PBS gemischt und anschließend in
einem 50 ml Falcon Röhrchen auf 15 ml Ficoll (Biocoll) geschichtet. Danach
erfolgte die Auftrennung der Zellen bei 660xg und Zimmertemperatur für 20
Minuten in der Zentrifuge ohne Aktivierung der Bremse.
Abbildung 3: Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient. (Jacobs, 1996) Charakteristische Schichtung vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation von auf Ficoll-Lösung
geschichtetem heparinisiertem Vollblut. Rechts: mittig liegende Interphase mit Lymphozyten und
Monozyten.
Der PBMC-Ring mit Lymphozyten und Monozyten wurde abpipettiert und
zweimalig in PBS bei 300xg und 200xg sowie Zimmertemperatur und unter
Aktivierung der Bremse in der Zentrifuge gewaschen.
Für die Zellzählung wurde das gewonnene Zellpelet in 5 ml PBS aufgenommen.
Eine 10 µl Probe wurde entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt.
Die angefärbten Zellen wurden nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer
Neubauer-Zählkammer gezählt. Dabei wurden alle neun Quadranten mit ihren
16 Feldern berücksichtigt.
27
Abbildung 4: Zellzählung mittels Neubauerkammer. (Jacobs, 1996) Die Kammer (links) enthält zwei Zählgitter, eines davon ist rechts vergrößert dargestellt.
Die isolierten PBMC wurden in 1 ml gekühltes Einfriermedium aufgenommen
und zunächst in Styroporbehältern in einer Tiefkühltruhe langsam auf –80°C
heruntergekühlt, um sie dann nach einigen Tagen in die mit flüssigem Stickstoff
befüllten Tanks zu überführen. Dort wurden die Proben bis zu den endgültigen
Messungen gelagert und gesammelt.
3.3.3 Anfärbung der PBMC
Zur Analyse der Zellsubpopulationen wurden die eingefrorenen Zellen in 40 ml
37°C warmem PBS aufgetaut und resuspendiert. Bei 300xg wurde diese
Zellsuspension 10 Minuten in der Zentrifuge gewaschen und anschließend
nochmals in kaltem PBS bei 200xg für 15 Minuten zentrifugiert. Das
gewaschene Zellpelet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und hiervon wurde eine
10 µl Probe entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt. Die Zellen
wurden erneut nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer Neubauer-
Zählkammer ausgezählt. Die ermittelte Zellzahl diente zur Berechung des
Verdünnungsfaktors.
Anschließend wurden zwei Färbereihen durchgeführt.
28
3.3.3.1 Markierung von CD4, CD25 und FOXP3
Ziel der ersten Färbereihe war es, die Oberflächenmarker CD4 und CD25 und
den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3 fluoreszierend kenntlich zu
machen.
Dazu wurde die Probe zunächst mit PBS auf einen Wert von 1x106 Zellen/ 100
µl verdünnt. Von dieser geeichten Zellsuspension wurden zwei Proben à 100 µl
entnommen. Die Oberflächenmarker CD4 und CD25 wurden in beiden Proben
durch Zugabe von 20 µl PerCP labeled anti-human CD4 und 20 µl FITC anti-
human CD25 angefärbt.
Anschließend wurden die mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern
angereicherten Proben für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. In jede
Probe wurde 1 ml kühlschrankkaltes PBS hinzu gegeben und die Proben
wurden 5 Minuten bei 200xg gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes
wurde zu beiden Proben 1 ml nach Herstellerangabe erstellte Fix/ Perm
Solution gegeben. Diese diente der Perforierung der Zellmembran, sowie der
Nukleolenmembran, um eine Markierung des intranukleären Transkriptions-
faktors FOXP3 durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper zu ermöglichen.
Dann wurden die Proben 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank fixiert. Nach
darauf folgendem einmaligem Waschen mit 3 ml PBS bei 580xg wurde den
Proben der nach Herstellerangaben erstellte Permeabilisierungspuffer
hinzugefügt.
Nach 2-maligem Waschen der Proben mit Perm Puffer bei 200xg für 5 Minuten
wurden die Zellen durch Zugabe von 2 µl Rattenserum (2%) geblockt und
anschließend bei 4°C für 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Diese
Blockierung diente zur Stabilisierung der Zellstruktur und verhinderte damit eine
unspezifische Bindung des FOXP3-Antikörpers.
Zu einer Probe wurden anschließend 20 µl des PE-conjugated anti-human
FoxP3 hinzugegeben. Zur anderen Probe wurden 20 µl des Kontrollantikörpers
PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control pipettiertet.
29
Abbildung 5: FOXP3 Antigen-Antikörperbindung. (Lopes, 2006) Bindung des FOXP3 spezifischen Antikörpers an den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3. FOXP3
mit Exon 2, Zinkfinger (ZN finger), Leucin Zipper (LZ) und Forkhead-Domain (FH).
Darauf folgte die Inkubation der Proben für 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank.
Den Abschluss der Färbungen bildete das einmalige Waschen mit 2 ml Perm
Puffer.
Zusammenfassend wurde durch diese Färbereihe die Fluoreszenzmarkierung
der Oberflächenproteine CD4, CD25 und des intranukleären Proteins FOXP3
erreicht. Es konnte die Anzahl der CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und der
CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt
werden.
3.3.3.2 Markierung von CD4, CD25, CD45RA
Die zweite Messreihe diente der Färbung der Oberflächenmarker CD4, CD25
und CD45RA. Hieraus konnte die Anzahl CD4+ T-Zellen, der so genannten T-
Helferzellen, der CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- der so genannten naiven
und Memory T-Zellen, der CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA-,
der so genannten naive-like und memory-like regulatorischen T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt werden.
30
Abbildung 6: Immunfluoreszenz. (Jacobs, 1996) Markierung von oberflächlichen Proteinen (CD4, CD25, CD45RA) mit direkt Fluoreszenzfarbstoff-
markierten Antikörpern.
Zur Färbung der letzt genannten Oberflächenproteine wurden zwei Proben à
100 µl aus der geeichten PBMC-Zellsuspension mit einem jeweiligen Inhalt von
105 Zellen entnommen.
Zu der ersten Probe wurden jeweils 5 µl des PerCP labeled anti-human CD4,
des FITC labeled anti-human CD45RA und des PE anti-human CD25
hinzugegeben. Die Kontrollprobe erhielt jeweils 5 µl der Kontrollantikörper
Mouse IgG2a PerCP, Mouse γ1 FITC und Mouse γ1 PE.
Die Proben wurden für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert und
anschließend mit 1 ml PBS-Acid bei 200xg für 5 Minuten in der Zentrifuge
gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 200 µl PBS-
Acid resupendiert. Die Anwendung von PBS-Acid diente zur Stabilisierung der
Zellen.
Abschließend konnten die Proben durchflusszytometrisch gemessen werden.
Es wurde die Anzahl der CD4+, der CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, der
CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA- T-Zellen bestimmt.
Diese zwei Färbereihen wurden zur Erfassung der vier Parameter CD4, CD25,
CD45RA und FOXP3 in dem drei-kanaligen Durchflusszytometer des
Studienlabors durchgeführt.
31
3.3.4 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in
Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften.
Verschiedene physikalische und chemische Zelleigenschaften werden simultan
auf der Einzelzellebene gemessen. Relative Zellgröße, Granularität sowie bis
zu 12 verschiedene Fluoreszenzfarben (je nach Geräteausstattung) können für
viele tausend Zellen umgehend ermittelt werden.
Der Zellsuspension werden Antikörper-Fluorochrom-Konjugate zugesetzt. Die
Antikörper sind gegen spezifische Antigene der Zellen gerichtet (s. Abbildung 6,
Seite 30). Dadurch können beispielsweise Subpopulationen von Zellen
unterschieden werden.
Monoklonale fluoreszenzmarkierte Antikörper sind mittlerweile in großer
Auswahl kommerziell erhältlich, sodass breite Anwendungsmöglichkeiten in der
Klinik als auch in der Grundlagenforschung bestehen.
Zur Analyse wird die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension
über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende
Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Messküvette werden die Zellen
stark beschleunigt, wodurch sich Aggregate auftrennen. Umgeben von
Trägerflüssigkeit erreichen die Zellen so den Analysepunkt, einen Argonlaser
mit 488nm Wellenlänge, aufgereiht wie an einer Perlenschnur. Dieses
Phänomen wird als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet.
32
Abbildung 7: Schematische Darstellung des Durchflusszytometers. (Jacobs, 1996) Druckluftabhängige Wanderung der Einzelzellsuspension über eine Stahlkapillare in die Messküvette.
Nach hydrodynamischer Fokussierung Laserbestrahlung und Analyse der Streueigenschaften und der
Fluoreszenz der Zellen.
Das Licht des Lasers wird durch die Zellen gestreut. Die Streuung des Lichtes
wird durch die Zellgröße, die Struktur der Zellmembran sowie den Zellkern und
die intrazellulären Bestandteile beeinflusst.
Beim Streulicht unterscheidet man den sogenannten forward scatter, das
Streulicht längs zum Anregungslichtstrahl, und den sogenannten side scatter,
das Streulicht im rechten Winkel zu dieser Achse. Der forward scatter ist dabei
in erster Linie ein Maß für die Zellgröße (kleine Zellen streuen weniger),
während der side scatter vor allem die intrazelluläre Granularität misst
(Granulozyten streuen mehr als Leukozyten).
33
Abbildung 8: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung. (Shapiro, 2003) Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle, kommt es zu zelltypischen Streulichtphänomenen, durch die die Zelle
hinsichtlich Zellgröße, Granularität und Fluoreszenz charakterisiert werden kann. Das Vorwärtsstreulicht
gilt als Maß der Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht gilt als Maß der Zellgranularität.
Die Messung der Fluoreszenz erfolgt entlang der Laserachse im 90°-Winkel.
Die fluoreszierenden Farbstoffe absorbieren Licht über einen weiten, für sie
charakteristischen Wellenlängenbereich. Dadurch werden Elektronen der
äußeren Schalen auf ein höheres Energieniveau gehoben. Mit dem Rücksprung
auf das ursprüngliche Niveau wird ein Photon abgegeben. Dieser
Strahlungsübergang wird als Fluoreszenz bezeichnet. Bei diesem Vorgang geht
Schwingungs-Rotations-Energie verloren. Daher hat das emittierte Licht eine
größere Wellenlänge (energieärmer) als das anregende Licht.
Unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe haben unterschiedliche Exzitations- und
Emissionsspektren. Die Emissionsspektren der Farbstoffe bestimmen
nachfolgend die Kombinierbarkeit der Fluorochrome. Sie sollten sich in ihren
Wellenlängenbereichen möglichst wenig überschneiden, um sie trennscharf
auswerten zu können. Durch Mehrfarbenfluoreszenz wird die Korrelation
mehrerer Zelleigenschaften ermöglicht. In Tabelle 1 sind verschiedene
Farbstoffe zusammen mit ihrem Exzitationsmaximum (der Wellenlänge, bei der
sie am besten angeregt werden) und Emissionsmaximum (der Wellenlänge, bei
der das meiste Licht emittiert wird) aufgeführt.
34
Tabelle 1: Exzitations- und Emissonsmaxima verschiedener Fluorochrome. (Shapiro,
2003)
Farbstoff Exmax (nm) Emmax (nm) Fluorescein Isothiocyanat (FITC) 495 520
Phycoerythrin (PE) 480, 545, 564 575
Peridinin Chlorophyll-a (PerCP) 490 675
Auf einem Monitor eines an das Durchflußzytometer angeschlossenen
Computers werden die Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften der Zellen
graphisch dargestellt.
Dot Plot Graphiken sowie Histogramme der Streulicht- und
Fluoreszenzeigenschaften der Zellen wurden in der vorliegenden Studie mittels
der CELLQuest Software erstellt.
Eine Dot Plot Graphik von Scattereigenschaften aller Zellen einer Vollblutprobe,
die auf der x-Achse die Zellgröße (forward scatter) und auf der y-Achse die
Zellgranularität (side scatter) repräsentiert verdeutlicht nachfolgend, dass sich
spezifische Zellpopulationen durch charakteristische Punktwolken darstellen
lassen.
35
Abbildung 9: Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut. (Jacobs, 1996) Die x-Achse repräsentiert mit dem forward scatter (FSC) die Zellgröße, die y-Achse mit dem side scatter
(SSC) die Zellgranularität. Punktwolken stellen spezifische Zellpopulationen dar, die sich in ihren
Streulichteigenschaften ähneln.
Ein gating, d.h. die Eingrenzung einer Zellpopulation mit Hilfe des
Computerprogrammes ermöglicht die genauere Betrachtung einer einzelnen
Zellpopulation.
In der vorliegenden Studie wurde die Population von Lymphozyten genauer
untersucht. Dazu erfolgte ein gating jener Zellpopulation.
36
Abbildung 10: Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von Lymphozyten. Eingrenzung der Zellpopulation von Lymphozyten in die Region1 (R1) für die detailliertere Analyse von
Zelleigenschaften.
Neben der Streulichtdetektion erlaubte das zur Verfügung stehende FACScanTM
die Erfassung dreier Fluoreszenzfarbstoffe. Die Fluoreszenzintensität der Zellen
nach Antikörpermarkierung konnte mit Hilfe des Computerprogrammes
CELLQuest graphisch verdeutlicht werden. Die Autofluoreszenz und
unspezifische Bindung von fluoreszierenden Antikörpern, die durch
Negativkontrollen bestimmt werden konnte, ließ sich bei der Auswertung am
Computer diskriminieren.
Zweifarbenfluoreszenzen wurden in Dot Plot Graphiken, Einfarbenfluores-
zenzen in Histogrammen dargestellt.
Zunächst erfolgte die Messung der CD4+CD25+ Zellen aus der Population von
Lymphozyten. Anschließend wurde die Anzahl der CD4+CD25+FOXP3+ Zellen
aus der Population der CD4+CD25+ Zellen bestimmt.
37
Abbildung 11: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ CD25+ Lymphozyten, die als Population der
regulatorischen T-Zellen definiert ist. Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, FITC.
Abbildung 12: Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 11). Marker1 (M1) beschreibt die Population der FOXP3+ CD4+ CD25+ Lymphozyten, die der Population der
FOXP3+ regulatorischen T-Zellen entspricht. Fluoreszenzfarbstoff: PE.
38
Darauf folgend wurden die Populationen: CD4+CD45RA+ (naive) T-Zellen und
CD4+CD45RA- (Memory) T-Zellen analysiert. Abschließend erfolgte die
Detektion der CD4+CD25+CD45RA+ (naive-like) sowie der CD4+CD25+CD45RA-
(memory-like) regulatorischen T-Zellen aus der Lymphozytenpopulation.
Abbildung 13: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ Lymphozyten, der T-Helferzellen, R3 (Region3)
beschreibt die Population der CD4+CD25+ Lymphozyten, der regulatorischen T-Zellen.
Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, PE.
Abbildung 14: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+, der naiven T-Zellen; Marker2 (M2) beschreibt
die Population der CD45RA- CD4+, der Memory T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC.
Links: Ergebnisse eines 8 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl naiver T-Zellen.
Rechts: Ergebnisse eines 8 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von Memory T-Zellen.
39
Abbildung 15: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region3 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+ CD25+, der naive-like regulatorischen T-
Zellen; Marker2 (M2) beschreibt die Population der CD45RA- CD4+ CD25+, der memory-like
regulatorischen T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC.
Links: Ergebnisse eines 6 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl von naive-like regulatorischen T-
Zellen.
Rechts: Ergebnisse eines 14 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von memory-like
regulatorischen T-Zellen.
3.3.5 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der orientierenden Pilotstudie wurde mit Hilfe der
GraphPad PRISM Software vorgenommen.
Die Analyse der Daten erfolgte durch einfache lineare Regression. Der
Vergleich der Daten der Patienten- und Kontrollgruppe wurde mit Hilfe des t-
Tests durchgeführt.
Die Darstellung der Daten erfolgte in Scatterdiagrammen mit Hilfe von
Regressionsgeraden und Mittelwertlinien.
Für die Ergebnisse wurde ein Signifikanzniveau von p = 0,05 festgelegt.
p ≤ 0,05 gilt als schwach signifikantes, p ≤ 0,01 als signifikantes und p ≤ 0,001
als hoch signifikantes Ergebnis. p > 0,05 gilt als nicht signifikant.
40
4 Ergebnisse
Im Sinne einer vergleichenden Querschnittsstudie wurden absolute Zellzahlen
regulatorischer T-Zellen verschiedenaltriger gesunder und an atopischer
Dermatitis erkrankter Probanden durchflusszytometrisch bestimmt und
altersabhängige Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen analysiert.
Hierbei wurden folgende Populationen regulatorischer T-Zellen berücksichtigt:
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische T-
Zellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische T-
Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like
regulatorische T-Zellen.
Zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und Interpretation der absoluten
sowie altersabhängigen Anzahl regulatorischer T-Zellen wurden verschiedene
Leukozytensubpopulationen per Differentialblutbild und Durchflusszytometrie
bestimmt. Diese werden in 4.3 beschrieben.
41
4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit atopischer
Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als Gesunde
Der Vergleich beider Probandengruppen ergab in jeder Subpopulation
regulatorischer T-Zellen eine höhere Anzahl Zellen bei den an atopischer
Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen.
Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren wurde eine deutlich höhere
Zellzahl bei Probanden mit atopischer Dermatitis beobachtet (vgl. Abbildung 18,
Seite 49).
Besonders hervorzuheben ist der anzählige Unterschied in der Population der
CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen. Hier liegt die Anzahl
jener Zellen von Patienten mit atopischer Dermatitis mit einem
Signifikanzniveau von 0.0014 signifikant höher als die der gesunden
Kontrollgruppe.
Schwach signifikant mit einem Signifkanzniveau von 0.0207 stellt sich der
Unterschied in der Anzahl der CD4+CD25+CD45RA- memory-like
regulatorischen T-Zellen zwischen den Probandengruppen dar.
Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen beider
Probandengruppen wurde mit Hilfe des t-Tests durchgeführt. Waagerechte
Linien in nachfolgenden Diagrammen stellen den Mittelwert der Zellzahl jener
Probandengruppe dar.
42
Abbildung 16: Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen (CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+ naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like) regulatorischer T-Zellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen
jeweils höhere Anzahlen regulatorischer T-Zellen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen
mit niedrigerem Zellzahlniveau.
43
4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen:
Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like regulatorischen T-
Zellen
Die Subpopulationen regulatorischer T-Zellen Gesunder und an atopischer
Dermatitis erkrankter Patienten zeigen keinen signifikanten Unterschied in der
altersabhängigen Veränderung der Zellzahl.
Die nahezu gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen werden mit Hilfe von
Regressionsgeraden in nachfolgenden Scatterdiagrammen verdeutlicht.
Insbesondere im Altersintervall 0-10 Jahre sind verhältnismäßige
Übereinstimmungen zu entdecken.
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische T-
Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorische T-Zellen weisen in
beiden Probandengruppen einen Abfall der Zellzahl im Laufe des Alters auf.
Statistisch signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0011 bei Gesunden
und von 0.0086 bei an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden ist hierbei
der Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen.
CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorische T-Zellen unterliegen in beiden
Probandengruppen einem Anstieg (nicht signifikant) der Zellzahl im Laufe des
Alters.
44
AD
Kontrollen
Abbildung 17: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen. Verringerung der Anzahl von CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+ und CD4+CD25+CD45RA+ naive-like
regulatorischen T-Zellen; Zuwachs von CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorischen T-Zellen in
beiden Probandengruppen (Links: Gruppe atopischer Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe).
Zusatzbeobachtung: In den ersten vier Lebensjahren weisen Patienten mit atopischer Dermatitis deutlich
höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf.
45
4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer Dermatitis
erkrankter Kinder
Das vorliegende Kapitel beschreibt Ergebnisse von Leukozyten-
subpopulationen, die zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und
Interpretation der Ergebnisse regulatorischer T-Zellen genutzt wurden.
Die Ergebnisse der Leukozytensubpopulationen stimmen mit bestehenden
Normwerten überein (Plenert W. et Heine W., 1984; Comans-Bitter W.M. et al.,
1997; Shearer W.T. et al., 2003; Vitelli-Avelar D.M. et al., 2005; Schauer U. et
al., 1991; Sullivan K.E. et al., 2002).
4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten
In der gesunden Kontrollgruppe sowie in der Gruppe der Patienten mit
atopischer Dermatitis ist ein Abfall der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären
Zellen sowie von Lymphozyten im Laufe des Alters zu verzeichnen.
Statistisch hoch signifikant mit einem Signifikanzniveau < 0.0001 verringert sich
die Anzahl der mononukleären Zellen und der Lymphozyten altersabhängig in
der Gruppe der gesunden Probanden.
46
AD
Kontrollen
Abbildung 18: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten in
beiden Probandengruppen. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontroll-
gruppe
47
Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der
Leukozyten, der mononukleären Zellen und der Lymphozyten minimal höhere
Zellzahlen (nicht signifikant) gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf.
Abbildung 19: Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen
jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem
Zellzahlniveau.
48
4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen
Im direkten Vergleich beider Probandengruppen ist ein Abfall der Zellzahl von
CD4+ T-Helferzellen und von CD4+CD45RA+ naiven T-Helferzellen in beiden
Probandengruppen zu verzeichnen.
Der Abfall der naiven T-Helferzellen stellt sich hierbei bei Gesunden mit einem
Signifikanzniveau von 0.0036 und bei an atopischer Dermatitis erkrankten
Probanden mit einem Signifikanzniveau von 0.0017 statistisch signifikant dar.
Die CD4+CD45RA- Memory T-Zellen folgen in der gesunden Kontollgruppe
signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0038 einer altersabhängigen
Zunahme der Zellzahl.
In der Gruppe der an atopischer Dermatitis leidenden Patienten ist ein Abfall
der Zellzahl zu beobachten. Dieser ist jedoch mit einem Signifikanzniveau von
0.3582 statistisch nicht signifikant.
49
AD
Kontrollen
Abbildung 20: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von CD4+ T-Helferzellen und CD4+CD45RA+ naiven T-
Helferzellen. Zunahme der CD4+CD45RA- Memory T-Zellen bei Gesunden, Abnahme bei Patienten mit
atopischer Dermatitis. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe
50
Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der CD4+,
der CD4+CD45RA+ (naiven) und der CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen
höhere Zellzahlen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf. Statistisch
schwach signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0274 stellt sich der
Unterschied in der Population der naiven T-Helferzellen dar.
Abbildung 21: Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+, CD4+CD45RA+ (naiven) und CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen
jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem
Zellzahlniveau.
51
5 Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die absolute Anzahl regulatorischer T-
Zellen mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen bei gesunden und an
atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zu bestimmen und
die altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen in
beiden Probandengruppen vergleichend zu analysieren.
Dabei wurden folgende Populationen berücksichtigt:
CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische T-
Zellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische T-
Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like
regulatorische T-Zellen.
In Bezug auf die altersabhängigen Veränderungen wurde der Schwerpunkt
besonders auf die Populationen der naive-like und der memory-like
regulatorischen T-Zellen gelegt.
5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit
atopischer Dermatitis: geringere Funktion - kompensatorische Erhöhung
der Zellzahl?!
Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und
an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen ergab in jedem
Fall eine höhere Zellzahl regulatorischer T-Zellen bei den an atopischer
Dermatitis erkrankten Probanden.
Für das Kindesalter werden mit der vorliegenden Studie erstmalig höhere
Zellzahlergebnisse regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer
Dermatitis veröffentlicht.
An Erwachsenen wurde die Anzahl CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen bei
Patienten mit atopischer Dermatitis erstmalig von Ou et al. im Jahr 2004
untersucht. Auch hier fand sich bei Patienten mit atopischer Dematitis im
52
Gegensatz zu den gesunden Kontrollen eine signifikant höhere Anzahl von
regulatorischen T-Zellen (Ou L.S. et al., 2004).
Die atopische Dermatitis als eine Erkrankung mit autoimmunen Reaktionen
würde jedoch primär niedrigere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen erwarten
lassen, durch die es zu einer Störung der Immunhomöostase und damit zu
einem Ausbruch der atopischen Dermatitis kommt.
So wie bei Patienten mit dem Krankheitsbild IPEX, bei denen aufgrund eines
Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine natürlich vorkommenden
regulatorischen T-Zellen zu finden sind und die daraus folgend an einer
schweren Immundefizienz, begleitet von einer atopischen Dermatitis, leiden
(Ochs H.D. et al., 2005 ;Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006),
könnte bei Patienten mit einer atopischen Dermatits die atopische Dermatitis als
ein Ausdruck der gestörten Immunhomöostase verstanden werden.
Unsere Ergebnisse, die bei Patienten mit atopischer Dermatitis höhere
Anzahlen regulatorischer T-Zellen beschreiben, widersprechen der Erwartung
primär niedrigerer Zellzahlen.
Als ein Interpretationsansatz der höheren Zellzahlergebnisse kann die Funktion
der regulatorischen T-Zellen in Frage gestellt werden. Eine verminderte
Funktion regulatorischer T-Zellen könnte erstens zu einer kompensatorischen
Erhöhung der Zellzahl führen und würde zweitens eine Möglichkeit der
Entstehung bzw. des Ausbruchs einer atopischen Dermatitis bei Kindern und
Jugendlichen erklären.
Erstmalig 2008 konnten Smith et al. bei Kindern mit einer Hühnereiallergie, die
in 80% der Fälle von einer atopischen Dermatitis begleitet wurde, eine
verminderte Funktion von regulatorischen T-Zellen nachweisen. Der Nachweis
erfolgte durch die verminderte Unterdrückung von Zytokinantworten bei
Atopikern im Gegensatz zu Gesunden nach Kokultivierung von Effektorzellen
mit regulatorischen T-Zellen (Smith M. et al., 2008).
53
Mit diesem Beweis der verminderten Funktion regulatorischer T-Zellen bei
atopischen Dermatitikern stellt sich die Frage, wie diese Funktionsminderung
ausgeglichen werden kann, um insgesamt ein hohes Funktionsniveau der
Zellen zu erreichen. Eine Antwort könnte die kompensatorische Erhöhung der
Zellzahl sein.
Der oben beschriebene Zusammenhang zwischen höheren Zellzahlen und
verminderter Funktion regulatorischer T-Zellen kann auch noch anhand einer
anderen Beobachtung diskutiert werden:
Bei älteren Menschen (70.-90. Lebensjahr) wurden höhere Zellzahlen
regulatorischer T-Zellen beschrieben als bei jungen Menschen (20.-30.
Lebensjahr) (Gregg R. et al., 2005). Angenommen diese Zellen seien in ihrer
Funktion unbeeinträchtigt, so könnten regulatorische T-Zellen gemäß ihrer
normalen Funktion hoch effektiv autoimmune Prozesse unterdrücken und
immunologische Reaktionen kontrollieren. Hieraus wäre auf eine hoch effektive
Kontrolle prinzipiell immunologischer Reaktionen und damit auf eine
erfolgreiche Prävention von Autoimmunkrankheiten zu schließen.
Entgegen dieser Schlussfolgerung erkranken ältere Menschen jedoch häufiger
an Autoimmunkrankheiten, chronischen Infektionen und Tumoren (Dejaco C. et
al., 2006). Es ist daher anzunehmen, dass regulatorische T-Zellen auch bei
älteren Menschen weniger funktional sind. Die Funktionsminderung führt zu der
Notwendigkeit einer erhöhten Prävalenz von regulatorischen T-Zellen, d.h. zu
einer kompensatorischen Zellzahlerhöhung, um das immunologische System
auf einem entsprechendem Funktionsniveau aufrecht zu erhalten (Dejaco C. et
al., 2006).
Kombiniert aus den Beobachtungen von Smith et al. und Dejaco et al. kann
parallel in der vorliegenden Studie für Patienten mit einer atopischen Dermatitis
eine verminderte Funktion regulatorischer T-Zellen und eine daraus folgende
Zellzahlerhöhung angenommen werden. Die kompensatorische Hyperplasie der
Anzahl regulatorischer T-Zellen könnte als Ausdruck des Versuchs der
Aufrechterhaltung eines hohen Funktionsniveaus der immunologischen
Kontrolle bei Patienten mit atopischer Dermatitis verstanden werden.
54
Wie genau allerdings regulatorische T-Zellen an der immunologischen Kontrolle
der atopischen Dermatitis beteiligt sind, ist bisher noch nicht erforscht.
Bekannte Effektormechanismen, wie die Interleukin-10 Produktion, die TGF-β
Produktion und der Zell-Zell Kontakt (Bacchetta R. et al., 2007; Buckner J.H. et
al., 2004) sind von zunehmendem Interesse. Die Entdeckung, dass zum
Beispiel die IL-10 Produktion regulatorischer T-Zellen allergenspezifische
Effektorzellen unterdrückt (Verhagen J. et al., 2006), stellt nur den
Anfangspunkt der Quantifizierung regulatorischer Funktionen dar.
Eine weitere Aufklärung wird die Entwicklung von Immuntherapien ermöglichen.
5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von memory-like
regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und periphere Expansion
In der vorliegenden Studie wurde in den Populationen der CD4+CD25+
regulatorischen T-Zellen, der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen und
der CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen bei Gesunden
sowie bei Patienten mit atopischer Dermatitis ein altersabhängiger Abfall der
Zellzahl beobachtet. Insbesondere die Abnahme der Anzahl von naive-like
regulatorischen T-Zellen stellte sich hierbei als statistisch signifikant heraus.
Umgekehrt konnte in der Population der CD4+CD25+CD45RA- memory-like
regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen ein Anstieg der Zellzahl
im Laufe des Alters beobachtet werden.
Bei gesunden Erwachsenen wurde die altersabhängige Veränderung der
Anzahl naive-like und memory-like regulatorischer T-Zellen erstmals 2005 von
Seddiki et al. und Valmori et al. untersucht und prozentual beschrieben.
In ihren Studien nahm parallel zur Abnahme der CD4+ Zellen die Anzahl der
naive-like CD4+CD25+CD45RA+ regulatorischen T-Zellen statistisch signifikant
mit dem Alter ab (Seddiki N. et al., 2006; Valmori D. et al., 2005). Umgekehrt
nahm gleichzeitig die Anzahl der memory-like CD4+CD25+CD45RA-
regulatorischen T-Zellen zu (Valmori D. et al., 2005).
55
Erstmals für gesunde Kinder und Jugendliche konnten mit der vorliegenden
Studie Veränderungen der Zellzahlen naiver und memory-like regulatorischer T-
Zellen beschrieben werden. Diese Ergebnisse stimmen in der Beobachtung der
altersabhängigen Abnahme der Zellzahl naive-like regulatorischer T-Zellen und
der Zunahme memory-like regulatorischer T-Zellen mit den Studien von Seddiki
et al. und Valmori et al. überein. Die vorliegende Studie kann demnach mit ihren
Ergebnissen an die Studien von Seddki et al. und Valmori et al. anknüpfen, die
Studien um Ergebnisse altersabhängiger Zellzahlveränderungen naiver und
memory-like regulatorischer T-Zellen im Zeitraum der Geburt bis zum 18.
Lebensjahr ergänzen und darüberhinaus Auskunft über absolute Zellzahlen der
Subpopulationen regulatorischer T-Zellen geben. Sie kann zusammen mit den
Studien von Seddiki et al. und Valmori et al. als Ausgangspunkt für die
Erstellung von Normwerten für Subpopulationen regulatorischer T-Zellen
genutzt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Studie dienen unsere Ergebnisse der
altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen
gesunder Probanden als Vergleichsgrundlage für gewonnene Ergebnisse der
Patienten mit atopischer Dermatitis.
Die hier erstmalig beschriebenen altersabhängigen Veränderungen der Anzahl
naive-like und der memory-like regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit
atopischer Dermatitis verlaufen gerade in den ersten zehn Lebensjahren
identisch mit den Veränderungen der Zellzahlen in der gesunden
Kontrollgruppe, d.h. der Abnahme der naive-like und der Zunahme der memory-
like regulatorischen T-Zellen.
Diese gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen verweisen auf einen
übergeordneten Zusammenhang, der für Gesunde sowie Patienten mit
atopischer Dermatitis gleichermaßen Ausschlag gebend zu sein scheint: die
Thymusinvolution und periphere Expansion.
56
Das Altern ist verbunden mit der progressiven Involution des Thymus. Diese
äußert sich in einem signifikanten Verlust der Fähigkeit des Thymus, neue T-
Zellen zu generieren und zu exportieren. Begleitend zur reduzierten Produktion
naiver nicht-regulatorischer T-Zellen ist anzunehmen, dass sich auch der
thymische Output an naiven regulatorischen T-Zellen verringert (Dejaco C. et
al., 2006; Gregg R. et al., 2005).
Der signifikante altersabhängige Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen
kann demnach in Beziehung zur Thymusinvolution gesetzt werden.
Um den thymischen Ausfall zu kompensieren, müssten frühzeitig alternative
Wege der Generierung regulatorischer T-Zellen zur Aufrechterhaltung eines
suffizienten Pools von regulatorischen T-Zellen initiiert werden (Dejaco C.,
2006).
Lange war nicht klar, wie der Pool regulatorischer T-Zellen mit der Tendenz der
Zellen zu Inaktivität, geringer Proliferationskapazität und zu Apoptose effizient
aufrechterhalten werden konnte.
Akbar et al. entwarfen erstmals ein Modell der peripheren Entstehung
regulatorischer T-Zellen. Die regulatorischen T-Zellen schienen sich demnach
in der Peripherie aus dem Memory T-Zell-Pool zu entwickeln (Akbar A.N. et al.,
2003). Dieses Modell konnte von Vukmanovic-Stejic et al. bestätigt werden. Es
konnte gezeigt werden, dass sich eine gewisse Anzahl von regulatorischen T-
Zellen, die phänotypisch mit den memory-like regulatorischen T-Zellen
übereinstimmt, aus schnell-teilenden, hochdifferenzierten Memory CD4+ T-
Zellen entwickelt (Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006).
Memory CD4+ T-Zellen weisen eine periphere Expansion der Zellzahl im Laufe
des Alters auf (Gregg R. et al., 2005). Da sich memory-like regulatorische T-
Zellen wie oben beschrieben aus Memory CD4+ T-Zellen entwickeln
(Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006), ist auch im Pool der memory-like
regulatorischen T-Zellen eine Expansion und damit altersabhängigen Zunahme
der Zellzahl denkbar. Diese Theorie erklärt die Zunahme der memory-like
regulatorischen T-Zellen in der vorliegenden Studie.
57
Es kann daher angenommen werden, dass die memory-like regulatorischen T-
Zellen den suffizienten Pool regulatorischer T-Zellen im Alter nach der
Thymusinvolution und damit die periphere Immuntoleranz aufrechterhalten.
Memory-like regulatorische T-Zellen sind vermutlich, genau wie Memory T-
Zellen in der Lage, antigenspezifische Immunantworten gegen ein bekanntes
Antigen auch nach Jahren abzurufen und damit vor Autoimmunität und
immunologischen Fehlregulationen zu schützen.
5.3 Ausblick
In der vorliegenden Pilotstudie wurde im Sinne der Grundlagenforschung
erstmalig die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl
regulatorischer T-Zellen vergleichend bei gesunden und an atopischer
Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht.
Für Patienten mit atopischer Dermatitis werden hier demnach erstmalig
Ergebnisse über die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der
absoluten Anzahl von regulatorischen T-Zellen im Kindes- und Jugendalter
veröffentlicht.
Diese Ergebnisse können, genau wie die erstmalig veröffentlichten Ergebnisse
der regulatorischen T-Zellen bei Gesunden, als grundlegende Vergleichsdaten
für nachfolgende Studien genutzt werden. Sie können zusammenfassend als
orientierende Richtwerte in der Erstellung von Normwerten für Subpopulationen
regulatorischer T-Zellen gelten.
Als eine wertvolle Zusatzbeobachtung stellte sich in der vorliegenden Studie die
deutlich höhere Anzahl regulatorischer T-Zellen von Patienten mit atopischer
Dermatitis in den ersten vier Lebensjahren heraus.
Als ein Interpretationsansatz dieser höheren Zellzahlen könnte eine reaktive
Hochregulierung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei hoher entzündlicher
Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten Lebensjahren gelten.
58
Diese Annahme stützt sich auf den durch Caramalho et al. erbrachten Beweis,
dass die Proliferation regulatorischer T-Zellen durch Exposition der Zellen mit
proinflammatorischen Bakterienprodukten hochreguliert wird. Durch Auslösung
des Entzündungsreizes durch Interleukin-2 und Lipopolysachariden kam es
hierbei außerdem zu einer 10fach erhöhten Supressoraktivität von
regulatorischen T-Zellen (Caramalho I. et al., 2003).
Parallel zu den Beobachtungen von Caramalho et al. kann in unserer Studie die
gesicherte hohe entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten
zwei Lebensjahren (Turner J.D. et al., 2006) als auslösender Reiz für die
Proliferation regulatorischer T-Zellen verantwortlich gemacht werden.
Die hohe entzündliche Aktivität wird durch verstärkte Infiltration von T-
Effektorzellen in die Epidermis aufrecht erhalten und weiter gesteigert
(Verhagen J. et al., 2006), sodass angenommen werden, dass dieser
Entzündungsreiz, verglichen mit der Stimulation mit proinflammatorischen
Bakterienprodukten bei Caramalho et al., eine bis zu 10fach erhöhte
Supressoraktivität regulatorischer T-Zellen auslöst.
Hohe Anzahlen regulatorischer T-Zellen mit gesteigerter Suppressoraktivität
(Caramalho I. et al., 2003) könnten zu einer effektiven Unterdrückung von
Effektorzellen führen und damit die Inflammation eindämmen. Zusätzlich könnte
eine Toleranzentwicklung von Effektorzellen gegenüber regulatorischen T-
Zellen zu einer Abschwächung des Entzündungsreizes und einer vereinfachten
Eindämmung der Inflammation führen.
Die regulatorischen T-Zellen von Atopikern weisen zwar eine herabgesetzte
Aktivität auf, aber ihre erhöhte Anzahl könnte sich klinisch in einer deutlichen
Besserung der atopischen Dermatitis äußern. Diese Besserung der atopischen
Dermatitis, die auch als Selbstheilungstendenz bei primär hoher
Entzündungsaktivität im frühen Kindesalter beschrieben wird, ist aus klinischer
Erfahrung gut belegt.
59
Es stellt sich nun die Frage: Könnte demnach sogar eine stark erhöhte Zellzahl
regulatorischer T-Zellen im Säuglings- und Kleinkindesalter ein prognostisch
günstiges Zeichen für die Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis
darstellen und damit als klinischer Prognoseparameter angewandt werden? Die
Antwort auf diese Frage stellt zusammen mit der genaueren Erforschung der
Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter eine
interessante Forschungsperspektive dar.
Durch genauere Untersuchungen von Hautläsionen, in denen zum Beispiel
höhere Anzahlen und erhöhte Suppressoraktivitäten regulatorischer T-Zellen
nachweisbar sein könnten, und durch gleichzeitige Beobachtung der klinischen
entzündlichen Aktivität der atopischen Dermatitis, könnte im Rahmen einer
Längsschnittstudie dieser These nachgegangen werden.
Bedeutsam wäre insgesamt die Identifikation von Interaktionsmechanismen
regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis, um die
Pathogenese der atopischen Dermatitis immunologisch genauer definieren zu
können.
Die vorliegende Studie stellt mit der selbsterstellten zusammenfassenden
Übersicht regulatorischer T-Zellen (siehe Abbildung 1, Seite 14) und den
Ergebnissen der Zellzahlbeobachtungen einen Ausgangspunkt für die
Erforschung der Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der
atopischen Dermatitis dar.
60
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67
7 Anhang
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum
Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger
Patienteninformation und Einwilligungserklärung zur Teilnahme an der
klinischen Studie
„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell
Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern
verschiedener Altersklassen“
Sehr geehrte Eltern!
Neurodermitis, Allergien, Infektanfälligkeit und rheumatische Erkrankungen im
Kindesalter stellen ein zunehmendes Problem dar. Die Universitäts-Kinderklinik
Bochum beschäftigt sich intensiv mit diesen Erkrankungen und erforscht ihre
Entstehungsweise. Grundlage ist die Kenntnis der normalen Reifung des
Immunsystems.
Sie können uns bei der weiteren Forschung helfen, indem Sie einwilligen, dass
Ihrem Kind im Rahmen der Einleitung der Narkose einer geplanten Operation,
im Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Vaterschaftstestung oder im
Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Allergietestung bei der
Neurodermitis zusätzlich 5 ml Blut für unsere Untersuchungen abgenommen
werden.
Die Teilnahme an dieser klinischen Studie ist freiwillig. Sie können die Teilnahme ablehnen, ohne dass Ihrem Kind hierdurch Nachteile in seiner medizinischen Betreuung entstehen. Klinische Studien sind notwendig, um verlässliche neue medizinische
Forschungsergebnisse zu gewinnen. Unverzichtbare Voraussetzung für die
Durchführung einer klinischen Studie ist jedoch, dass Sie Ihr Einverständnis zur
Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie schriftlich erklären. Bitte
68
lesen Sie den folgenden Text als Ergänzung zum Informationsgespräch
sorgfältig durch und zögern Sie nicht, Fragen zu stellen.
Bitte unterschreiben Sie die Einwilligungserklärung nur
- wenn Sie Art und Ablauf der klinischen Prüfung vollständig verstanden haben,
- wenn Sie bereit sind, der Teilnahme Ihres Kindes zuzustimmen und
- wenn Sie sich über Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Teilnehmers
an dieser klinischen Studie im Klaren sind.
1. Was ist der Zweck der klinischen Studie? Von der Zusammensetzung der weißen Blutkörperchen hängt die Art der
Immunantwort ab. Wir möchten untersuchen, wie die Zusammensetzung der
weißen Blutkörperchen vom Alter und von einer bestehenden Erkrankung wie
der Neurodermitis abhängt. Mit dieser klinischen Studie wird die Anzahl
bestimmter Arten weißer Blutkörperchen, den sog. T-Regulatorzellen, den T-
Memoryzellen und den B-Zell Subpopulationen, Ihres Kindes bestimmt.
Diese Arten weißer Blutkörperchen werden in einen Zusammenhang mit der
Entstehung von Neurodermitis, Allergien und allgemeiner Abwehrschwäche
gebracht.
In dieser klinischen Studie werden Bezugswerte für diese Arten weißer
Blutkörperchen erstellt. Dazu wird die Anzahl dieser Zellen im Blut gesunder
Kinder untersucht. Des Weiteren wird die Anzahl der Zellen im Blut einer
Vergleichsgruppe an Neurodermitis erkrankter Kinder untersucht. Diese
Ergebnisse werden mit denen von gesunden Kindern verglichen.
2. Wie läuft die klinische Studie ab?
Diese klinische Studie wird ausgehend von der Kinderklinik Bochum in
Zusammenarbeit mit der kinderchirurgischen Praxis Dr. med. Standke, der
orthopädisch-unfallchirurgischen und anästhesiologischen Abteilung des St.
Josef-Hospital Bochum, sowie der Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik
und der Neurodermitissprechstunde von Herrn Prof. Dr. med. Schauer der
Kinderklinik Bochum durchgeführt. Es werden insgesamt ungefähr 70 Kinder
daran teilnehmen.
69
Im Rahmen dieser klinischen Studie werden Ihrem Kind vor der anstehenden
Operation oder vor der anstehenden Blutentnahme im Rahmen einer
Vaterschaftstestung oder einer Allergietestung bei der Neurodermitis zusätzlich
5 ml Blut abgenommen. Diese Abnahme erfolgt durch einen venösen Zugang,
der Ihrem Kind standardmäßig im Rahmen der Operationsvorbereitung oder im
Rahmen der geplanten Blutabnahme gelegt wird, was bedeutet, dass keine
zusätzliche Blutentnahme nötig wird.
Die Blutentnahme wird von Ihrem betreuenden Arzt durchgeführt, mit dem Sie
zusammen an der Studie teilnehmen. Nach allen Erfahrungen ist die
Blutentnahme von bis zu 10 ml für Ihr Kind ungefährlich und unbedenklich. Es
kann allerdings sein, dass ihr Kind die Blutentnahme als unangenehm, vielleicht
sogar schmerzhaft empfindet und sich deshalb etwas wehren wird. Wenn Ihr
betreuender Arzt den Eindruck hat, dass das geschehen könnte, wird bei der
Blutentnahme zunächst eine örtlich betäubende Creme aufgetragen, sodass die
Abnahme schmerzlos erfolgen kann. In sehr seltenen Fällen kann sich nach der
Blutentnahme ein kleines Hämatom, also ein Bluterguss bilden, der sich aber
ohne Zutun wieder zurückbilden wird.
Das abgenommene Blut wird laborchemisch untersucht und die Anzahl der
vorhandenen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen
wird bestimmt.
Die Teilnahme an dieser klinischen Studie beschränkt sich auf die einmalige
Abnahme von 5 ml Blut.
3. Worin liegt der Nutzen einer Teilnahme an der klinischen Studie?
Ein Nutzen besteht darin, dass Sie uns helfen, Bezugswerte und
Vergleichswerte für die Anzahl der T-Regulatorzellen, der T-Memoryzellen und
der B-Zell Subpopulationen zu erstellen. Diese Werte könnten in Zukunft zu
neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen auf dem Gebiet der Immunologie
führen. Damit kann Kindern, die an Immundefektkrankheiten wie z.B.
Neurodermitis, Allergien, allgemeiner Abwehrschwäche leiden, zu neuen
Therapiemöglichkeiten verholfen werden.
70
Es ist nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser klinischen
Studie einen Nachteil haben wird.
Es ist auch nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser
klinischen Studie einen direkten Nutzen haben wird.
4. Gibt es Risiken, Beschwerden und Begleiterscheinungen? Es bestehen keine zusätzlichen Risiken.
5. Zusätzliche Einnahme von Arzneimitteln?
Es sollten keine Arzneimittel eingenommen werden, die positiv oder negativ auf
die Stimulierung bzw. Unterdrückung des Immunsystems wirken.
6. In welcher Weise werden die im Rahmen dieser klinischen Prüfung gesammelten Daten verwendet?
Sofern gesetzlich nicht etwas anderes vorgesehen ist, haben nur die
Doktorandin, ihr Betreuer und deren Mitarbeiter Zugang zu den vertraulichen
Daten, in denen Sie und Ihr Kind namentlich genannt werden. Diese Personen
unterliegen der Schweigepflicht.
7. Entstehen für die Teilnehmer Kosten? Gibt es einen Kostenersatz oder eine Vergütung?
Durch die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie entstehen für Sie
keine zusätzlichen Kosten.
Für die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie erhalten Sie keine
Vergütung.
71
8. Möglichkeit zur Diskussion weiterer Fragen
Für weitere Fragen im Zusammenhang mit dieser klinischen Studie stehen
Ihnen Ihre Doktorandin und ihr Betreuer gern zur Verfügung. Auch Fragen, die
Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Patienten und Teilnehmer an
dieser klinischen Studie betreffen, werden Ihnen gerne beantwortet.
Name der Kontaktperson: Herr Prof. Dr. med. U. Schauer - 0234 / 509-2660
Name der Kontaktperson: Caroline Schmitz (Doktorandin) - 0176 / 21936426
......................................................................................................
(Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten)
......................................................................................................
(Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden)
72
Einverständniserklärung
Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................
Geburtsdatum: ............................. Blutabnahmeindikation: ...............................
Ich erkläre mich bereit, mein Kind an der klinischen Studie
„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern
verschiedener Altersklassen“
teilnehmen zu lassen.
Ich bin von ........................................................................ ausführlich und
verständlich über die mit der klinischen Studie verbundene Blutentnahme,
mögliche Belastungen und Risiken, sowie über Wesen, Bedeutung und
Tragweite der klinischen Studie aufgeklärt worden. Aufgetretene Fragen wurden
mir verständlich und genügend beantwortet. Ich hatte ausreichend Zeit, mich zu
entscheiden. Ich habe zur Zeit keine weiteren Fragen mehr.
Ich behalte mir jedoch das Recht vor, die freiwillige Mitwirkung meines Kindes jederzeit zu beenden, ohne dass meinem Kind daraus Nachteile für die weitere medizinische Betreuung entstehen. Ich bin zugleich damit einverstanden, dass die im Rahmen dieser klinischen
Studie ermittelten Daten meines Kindes aufgezeichnet werden.
Beim Umgang mit den Daten werden die Bestimmungen des
Datenschutzgesetzes beachtet.
Eine Kopie dieser Patienteninformation und Einwilligungserklärung habe ich
erhalten. Das Original verbleibt beim Prüfarzt.
......................................................................................................
(Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten)
......................................................................................................
(Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden)
73
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum
Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger
Patienteninformation und Einwilligungserklärung für Kinder zur Teilnahme an der klinischen Studie
„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell
Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern
verschiedener Altersklassen“
Hallo!
Bevor Du Dich entschließt, bei dieser klinischen Studie mitzumachen, wird Dir
Dein Doktor genau erklären, warum diese Studie gemacht wird. Er wird Dir
erzählen, was mit Dir passieren wird und was die guten und die schlechten
Dinge an der Studie sind. Bitte sei nicht zu schüchtern, Deinem Doktor Fragen
zu stellen. Du kannst ihn alles fragen, was Du nicht verstehst und er wird es Dir
erklären.
Warum wird diese Studie gemacht?
Diese Studie wird gemacht, um zu sehen, wie viele weiße Blutkörperchen von
einer bestimmten Art in Deinem Blut sind. In Deinem Blut gibt es rote und weiße
Blutkörperchen. Uns interessieren die weißen Blutkörperchen. Einige von
denen heißen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen
und nicht jedes Kind hat gleich viele von ihnen. Wir wollen untersuchen, ob Du
genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast, wie ein anderes Kind,
das eine Krankheit hat, die Neurodermitis heißt. Wenn Du Neurodermitis hast
schauen wir, ob Du genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast wie
ein ganz gesundes Kind.
74
Was wird Dir während der Studie passieren?
Wenn Du einverstanden bist, nimmt der Doktor Dir ein bisschen Blut ab. Dazu
muss er Dich mit einer dünnen Nadel einmal kurz pieksen. Wenn Du möchtest,
kannst Du vorher ein Pflaster bekommen, dann spürst Du fast nichts von dem
Pieks. Ganz selten mal kannst Du einen kleinen blauen Fleck an der Stelle
bekommen, wo der Doktor das Blut abgenommen hat. Die Abnahme von bis zu
10 ml Blut ist ungefährlich für Dich.
Was sind die schlechten Dinge an der Studie?
Die Blutabnahme kann etwas weh tun, aber nur für eine kurze Zeit. Es kann
auch passieren, dass Du einen Bluterguss bekommst oder eine Schwellung, die
aber schnell wieder weg geht.
Was sind die guten Dinge an der Studie?
Gut ist, dass Du uns hilfst ein bisschen mehr über diese weißen Blutkörperchen
zu erfahren. Vielleicht kann dann einmal Kindern, die diese Krankheit
Neurodermitis haben, besser geholfen werden.
Kannst Du selber entscheiden, ob Du an der Studie teilnimmst?
Du musst nicht an der klinischen Studie teilnehmen, wenn Du das nicht
möchtest. Selbst wenn Du jetzt ja sagst, kannst Du immer auch nachdem die
Studie begonnen hat Deine Meinung ändern und aufhören. Niemand wird auf
Dich böse sein und Dein Doktor würde sich auch dann noch weiter um Dich
kümmern.
75
Einverständniserklärung
Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................
Geburtsdatum: ........................ Blutabnahmegrund: .............................................
Ich war anwesend, als .…………………………………. dieses Formular gelesen
hat oder vorgelesen bekam und seine / ihre mündliche Einwilligung gab.
......................................................................................................
(Datum, Name und Unterschrift des Kindes)
.............................................................................................................................
(Datum, Name und Unterschrift der Person, die das Aufklärungsgespräch
geführt hat)
Danksagung Mein Dank gilt...
... allen Patienten und gesunden Kindern, die an meiner Studie teilgenommen haben.
... im Besonderen meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. med. U. Schauer für die
Ermöglichung und Betreuung dieser Arbeit. Er stand mir jederzeit mit Rat, konstruktiver
Kritik und Geduld zur Seite.
... Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die Einführung in die
Laborarbeit und den erheblichen Beitrag zum Gelingen meiner Doktorarbeit.
... Herrn Dr. med. M. Standke, Frau Wahlkamp, Herrn Professor Dr. med. Schleberger
in Gedenken, Herrn Dr. med. J. Möllers und Mitwirkenden der Vaterschaftssprech-
stunde in der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum für die Unterstützung bei der
Sammlung der Blutproben.
… meinen lieben Eltern, die mir das Studium der Humanmedizin ermöglicht haben.
… meiner Mama, die mir in jeder Hisicht den Rücken frei gehalten und die mich
besonders in der Endphase meiner Arbeit liebevoll aufgemuntert und stets motiviert
hat.
... meinem Papa und meiner Schwester Anne, die mit hohem Interesse vor allem
meinem Diskussionsteil gefolgt sind und mich - obwohl fachfremd - sowohl gedanklich
als auch tatkräftig durch geduldiges Zuhören und Korrekturen an meiner Arbeit
unterstützt haben.
... meinem lieben Freund Stephan, der mir jederzeit zur Seite stand, mich stets mit
wertvollen Ratschlägen unterstützt hat und mir immer wieder Kraft gegeben hat.
… meinen Freunden, die mir durch liebevolle Nachfragen und gegenseitige Motivation
halfen, das Ziel nicht aus dem Auge zu verlieren.
LEBENSLAUF
PERSÖNLICHE DATEN Name Caroline Doris Schmitz
Geburtsort Emsbüren
Familienstand ledig
Konfession römisch-katholisch
SCHULAUSBILDUNG 08/1988 – 06/1990 Keplerschule Korb, Grundschule
08/1990 – 06/1992 Gertrudenschule Rheine, Grundschule
08/1992 – 06/2001 Gymnasium Dionysianum Rheine
06/2001 Allgemeine Hochschulreife – Abitur
STUDIUM 10/2001 – 08/2003 Vorklinisches Studium der Humanmedizin
Ruhr-Universität Bochum
08/2003 Ärztliche Vorprüfung – Physikum
09/2003 – 08/2006 Klinisches Studium der Humanmedizin
Ruhr-Universität Bochum
08/2006 – 07/2007 Praktisches Jahr
1.Tertial: Chirurgie, Kalix sjukhus,
Lehrkrankenhaus der Universität Umeå,
Schweden
2.Tertial: Innere Medizin, St. Josef-Hospital,
Universitätsklinik der Ruhr-Universität
Bochum
3.Tertial: Pädiatrie, Klinik für Kinder- und
Jugendmedizin im St. Josef-Hospital,
Universitätsklinik der Ruhr-Universität
Bochum
05/2008 2. Ärztliche Prüfung
PROMOTION 06/2005 – 09/2008 „Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der
Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an
atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen“
Prof. Dr. med. Uwe Schauer
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital,
Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum