anti-RNA Polymerase III ELISA Kit
Kat. č. 7836E: 48 jamek
POUZE PRO PROFESIONÁLNÍ POUŽITÍ
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F
4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008, Japonsko
Tel.: +81 52 238 1901 Fax: +81 52 238 1440 URL: http://www.mbl.co.jp
- OBSAH -
Symboly······· 59
7836E Česky
3
Česky
URČENÉ POUŽITÍ
Souprava anti-RNA Polymerase III ELISA je semikvantitativní enzymová imunosorpční analýza (ELISA)
k detekci protilátek proti RNA polymeráze III v lidském séru. Souprava anti-RNA Polymerase III ELISA
je určena k diagnostickému použití in vitro jako pomůcka pro zjištění určitých autoimunitních
onemocnění.
SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ
Systémová skleróza (SSc) je autoimunitní onemocnění charakterizované mikrovaskulárním poškozením a
fibrózou kůže a vnitřních orgánů(1)
. Hlavními cíli autoprotilátkových odpovědí u pacientů se systémovou
sklerózou jsou RNA polymerázy (RNAP) I, II a III. Každá z těchto RNA polymeráz katalyzuje transkripci
unikátní sady genů: RNA polymeráza I (RNAP I) transkribuje geny ribozomální RNA, RNA polymeráza II
(RNAP II) transkribuje všechny protein kódující geny a některé malé jaderné RNA geny a RNA
polymeráza III (RNAP II) transkribuje geny, které exprimují malé stabilní RNA včetně 5S RNA a
transferových RNA(2)
. Protilátky proti RNAP I a RNAP III jsou téměř vždy přítomné společně (anti-RNAP
I/III Ab) a některá séra obsahují rovněž protilátky proti RNAP II (anti-RNAP II Ab)(3-5)
. Protilátky proti
RNAP I/III jsou nejčastější u bílých severoamerických pacientů se systémovou sklerózou(6)
a jsou
asociované s difúzní formou systémové sklerózy, s vysokou četností „renálních krizí“ a vysokou
mortalitou(3,4,7)
. Navíc bylo prokázáno, že některá séra pacientů se systémovou sklerózou obsahují
autoprotilátky rozpoznávající RNAP II, avšak ne RNAP I ani RNAP III. Protilátky proti RNAP II jsou
rovněž přítomné v sérech některých pacientů se systémovým lupus erythematodes (SLE) nebo
překryvnými syndromy(8,9)
.
Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří metodou ELISA s vysokou citlivostí protilátky proti
RNA polymeráze III přítomné v séru.
PRINCIP
Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří protilátky proti RNAP III přítomné v séru metodou
ELISA. Sérum pacienta a naředěné kalibrátory se přidají do mikrojamek, které jsou potažené antigeny
RNA polymerázy III. Protilátky proti RNA polymeráze III následně reagují s imobilizovanými antigeny
(Inkubace se vzorkem). Po promytí, které odstraní veškeré nenavázané sérové proteiny, se přidá křenová
peroxidáza konjugovaná s protilátkou proti lidskému IgG a inkubuje se (Inkubace s konjugátem). Po
dalším kroku promytí se přidá substrát peroxidázy a inkubuje se po další dobu (Inkubace se substrátem).
Poté se do každé jamky přidá kyselý roztok, aby se enzymatická reakce zastavila a ustálil se vývoj
barevného produktu. Výsledek testu se kvantifikuje spektrofotometrickým měřením reakce a vynesením
hodnot do grafu.
STRUČNÝ POSTUP TESTOVÁNÍ
<Inkubace se vzorkem> Do každé mikrojamky přidejte 100 µl naředěného vzorku (1:101).
20-30 °C, 60 min ↓
Promytí
7836E Česky
4
↓
<Inkubace s konjugátem> Do každé jamky přidejte 100 µl konjugátu.
20-30 °C, 60 min ↓
Promytí
↓
<Inkubace se substrátem> Do každé jamky přidejte 100 µl substrátu.
20-30 °C, 30 min ↓
Do každé jamky přidejte 100 µl zastavovacího roztoku.
↓
Odečtěte absorbanci
↓
Interpretace výsledků
REAGENCIE A SKLADOVÁNÍ
1) Mikrojamkové proužky
48-jamkové mikrojamkové proužky (6 x 8 jamek) pokryté antigenem vyráběným z rekombinantních
purifikovaných proteinů a odlamovací proužky v držáku, které jsou neprodyšně uzavřené do foliového
obalu se sušidlem, jsou stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
2) Kalibrátor 1 (0 U/ml)
Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití,
není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
3) Kalibrátor 2 (100 U/ml)
Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v
rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití, není třeba žádné další ředění.
Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
4) Konjugát
Jedna lahvička obsahující 15 ml křenové peroxidázy konjugované s kozí protilátkou proti lidskémi IgG,
HEPES, Proclin 150 a BSA. Konjugát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data
expirace.
5) Rozpouštědlo
Jedna 50ml lahvička obsahující PBS, Tween-20 a 0,09% azid sodný. Rozpouštědlo je připraveno k použití.
Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
7836E Česky
5
6) Koncentrát promývacího roztoku (20x)
Jedna 50ml lahvička obsahující PBS a Tween-20 ve formě 20násobného koncentrátu. Stabilní při 2-8 °C až
do vyznačeného data expirace.
7) Substrát
Jedna 20ml lahvička obsahující směs 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin dihydrochloridu a peroxidu vodíku
(TMB/H2O2). Substrát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
8) Zastavovací roztok
Jedna 20ml lahvička obsahující 1N kyselinu sírovou. Zastavovací roztok je připraven k použití. Stabilní
při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
9) Pozitivní kontrola
Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v
rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Pozitivní kontrola je připravená k použití, není třeba žádné další
ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
10) Negativní kontrola
Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Negativní kontrola je připravená k
použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.
BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ
(1) Tento výrobek je určen pouze pro diagnostické použití in vitro.
(2) Komponenty soupravy nepoužívejte po uplynutí data expirace.
(3) Zamezte kontaktu reagencií s kůží, očima a oblečením. Při kontaktu reagencií s kůží je okamžitě
omyjte velkým množstvím vody. TMB obsahuje dráždivou látku a zastavovací roztok obsahuje 1N
kyselinu sírovou, která je jedovatá a žíravá.
(4) Kalibrátor 2 a pozitivní kontrola jsou odvozené z lidského séra, v kterém nebyly detekovány antigeny
hepatitidy B ani protilátky proti hepatitidě C, HIV-1 nebo HIV-2. Žádná testovací metoda však
nedokáže zaručit nepřítomnost těchto ani jiných infekčních agens. S těmito reagenciemi a všemi
pacientskými vzorky se musí zacházet jako s materiálem potenciálně přenášejícím AIDS, hepatitidu a
jakákoli další infekční onemocnění.
(5) Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrola, negativní kontrola a rozpouštědlo obsahují azid sodný
(0,09 %) jako konzervační činidlo a musí se s nimi zacházet s opatrností - zabraňte požití a styku s
kůží a slizničními membránami. Azid sodný může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a
vytvářet výbušné azidy kovů. Při vylévání materiálů obsahujících azid sodný do odpadu je proto
nezapomeňte vždy spláchnout velkým množstvím vody.
(6) Některé komponenty soupravy obsahují materiály živočišného původu pocházející z neinfekčních
zvířat. S těmito komponentami se však musí při jejich použití a likvidaci zacházet jako s potenciálně
biologicky nebezpečným materiálem.
(7) V průběhu jednoho testování se musí používat mikrojamkové proužky, konjugát, rozpouštědlo a
kalibrátor 2 s odpovídajícími čísly šarží. Nikdy nepoužívejte reagencie z jiných souprav jako náhradu.
7836E Česky
6
(8) Před zahájením testování se musí všechny reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (20-30 °C).
(9) Během testování a během skladování soupravu nevystavujte přímým slunečním paprskům.
(10) Zabraňte mikrobiální a křížové kontaminaci reagencií a vzorků.
(11) Inkubační teploty nad a pod normální pokojovou teplotu (20-30 °C), kratší nebo delší doby trvání
inkubace a nepřesné ředění mohou způsobit chybné výsledky.
(12) Jamky se musí důkladně proplachovat promývacím roztokem, aby se zabránilo falešným pozitivům.
(13) Pipetujte opatrně, abyste zabránili napěnění vzorků a reagencií, což by mohlo způsobit křížovou
kontaminaci mezi mikrojamkami.
(14) Všechny mikrojamkové proužky, které nejsou právě potřebné, se musí vrátit zpět do sáčku se zipovým
uzávěrem a ten opětovně pečlivě těsně uzavřít, aby se zabránilo absorpci vlhkosti.
(15) Koncentrát promývacího roztoku se může při 2-8 °C zakalit. To však není příčinou rozporných
výsledků.
(16) Vybavení použité pro testování se musí zlikvidovat nebo ošetřit tak, jak je uvedeno níže.
Inkubujte ve 2% (finální koncentrace) roztoku glutaraldehydu po dobu více než 1 hodiny nebo v 0,5%
chlornanu sodném (ekvivalent přibližně 5000 ppm chlóru) po dobu více než 1 hodiny nebo
autoklávujte při 121 °C po dobu více než 20 minut.
(17) Naměřené hodnoty protilátek proti RNA polymeráze III lze použít pouze jako pomocnou informaci při
diagnóze. Každý lékař musí výsledky interpretovat s ohledem na anamnézu pacienta, fyzické nálezy a
výsledky dalších diagnostických postupů.
POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ BALENÍ
・ Čtečka mikrodestiček (vlnová délka: 450 nm, 620 nm / reference)
・ Multikanálová pipeta (např. 100 µl-300 µl)
・ Jednokanálová pipeta (např. 10 µl a 100 µl)
・ Nádržka na reagencie
・ Automatická myčka nebo promývačka
・ Deionizovaná nebo destilovaná voda
・ Jednolitrový kalibrovaný válec na přípravu promývacího roztoku
・ Testovací zkumavky na ředění pacientských vzorků (např. 1000 µl)
・ Jednorázové pipetovací špičky
・ Papírové utěrky
・ Umyvadlo a dezinfekční prostředek
・ Kryt na mikrodestičku
POSTUP
PŘÍPRAVA REAGENCIÍ
・ Před použitím vytemperujte reagencie a vybavení na pokojovou teplotu (20-30 °C).
・ Mikrojamkové proužky: Vyjměte požadované mikrojamkové proužky ze sáčku a umístěte je do rámečku.
Nepoužité proužky uložte ihned zpět do chladničky.
・ Promývací roztok: Koncentrát promývacího roztoku nařeďte před použitím v poměru 1:20 (např. přidejte
50 ml koncentrátu promývacího roztoku k 950 ml destilované vody). Naředěný promývací roztok je stabilní
2 týdny při 2-8 °C.
7836E Česky
7
・ Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrolu, negativní kontrolu, konjugát, rozpouštědlo, substrát ani
zastavovací roztok neřeďte, jsou připravené k použití.
PŘÍPRAVA VZORKŮ
・ Používejte čerstvé sérum pacienta. Pokud je zapotřebí, je možné ho zamrazit na teplotu nižší než -20 °C po
dobu až jednoho měsíce nebo na teplotu nižší než -70 °C pro delší skladování. Zabraňte opakovanému
zmrazování a rozmrazování.
*V případě skladování při teplotě pod -20 °C po dobu delší než 6 měsíců nebo po opakovaném zmrazování
a rozmrazování jsou v důsledku denaturace IgG získávány nespecifické výsledky.
・ Každý vzorek séra pacienta nařeďte v poměru 1:101 přidáním 10 µl séra k 1 ml rozpouštědla.
*Naředěné vzorky se musí použít v průběhu jednoho dne.
*Rozpouštědlo může vytvářet sraženinu. To však není příčinou rozporných výsledků.
POSTUP TESTOVÁNÍ
KROK 1. (INKUBACE SE VZORKEM)
Za použití multikanálové pipety přeneste 100 µl kalibrátoru 1, kalibrátoru 2, pozitivní kontroly, negativní
kontroly a každého naředěného vzorku do příslušných mikrojamek testovací destičky s antigenem.
Kalibrátory a pozitivní ani negativní kontroly neřeďte.
* Inkubace začíná napipetováním do mikrojamek potažených antigenem. Pipetování je třeba provést
co možná nejrychleji.
Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).
KROK 2. (PROMYTÍ)
Odsajte a zlikvidujte obsah každé jamky. Každou jamku naplňte promývacím roztokem a poté obsah opět
zcela odsajte a zlikvidujte. Promytí proveďte celkem 4krát. Zbývající promývací roztok odstraňte z
destičky sklepnutím do papírové utěrky. Pokud používáte automatickou myčku, promytí proveďte celkem
4krát.
* Doporučujeme, aby si každá laboratoř ověřila dobu promývání vhodnou pro přítomné vybavení.
* Promývací roztok se musí používat při 20-30 °C.
KROK 3. (INKUBACE S KONJUGÁTEM)
Roztok konjugátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl konjugátu do každé jamky pomocí multikanálové
pipety. Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).
KROK 4. (PROMYTÍ)
Mikrodestičku promyjte podle postupu uvedeného v kroku 2.
KROK 5. (INKUBACE SE SUBSTRÁTEM)
Roztok substrátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl substrátu do každé jamky pomocí multikanálové
pipety.
* Použijte jinou nádržku, než kterou jste použili na pipetování konjugátu. Je třeba použít novou
nádržku na jedno použití, protože substrát se může snadno oxidovat kovovými ionty.
* Jakmile se substrát jednou nalije do nádržky, nesmí se vracet zpět do zásobní lahve.
Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).
KROK 6. (ZASTAVENÍ REAKCE)
Zastavovací roztok nalijte do nádržky. Do každé jamky napipetujte 100 µl roztoku multikanálovou
pipetou.
7836E Česky
8
ODEČTENÍ
Absorbanci každé jamky odečtěte při 450 nm. Pokud je k dispozici čtečka destiček s duální vlnovou
délkou, nastavte testovací vlnovou délku na 450 nm a referenční na 620 nm.
* Odečtení je třeba provést co možná nejrychleji po zastavení reakce.
* Před odečtením se ujistěte, že dno destičky je čisté a suché a že na povrchu kapaliny v jamkách
nejsou přítomné žádné bubliny.
VÝPOČET VÝSLEDKŮ
( A450<vzorek> - A450<kalibrátor 1>)
Jednotková hodnota (U/ml) = x 100 (
(A450<kalibrátor 2> - A450<kalibrátor 1>)
*A450 je zkratka hodnoty absorbance při 450 nm.
*Pro protilátky proti RNA polymeráze III není k dispozici mezinárodní referenční materiál. Test je
kalibrovaný na relativní arbitrární jednotky.
KONTROLA KVALITY
Každý výsledek testu musí splňovat následující kritéria.
A450 kalibrátoru 1: ≤ 0,100
A450 kalibrátoru 2: ≥ 0,500
Pozitivní a negativní kontroly musí vždy poskytnout následující výsledky:
Hodnota Anti-RNAP III (U/ml): Podle popisu na daném štítku.
Nedosažení těchto hodnot může indikovat, že soupravu již nelze dále používat. Pokud se kterékoli z těchto
kritérií nesplní, výsledky nelze použít a test se musí zopakovat. Před zopakováním testu zkontrolujte
následující parametry postupu.
inkubační teplota
inkubační doba
promytí
ředění vzorků
INTERPRETACE TESTU A OČEKÁVANÉ HODNOTY
Následující informace jsou určeny pouze jako vodítko při interpretaci. Doporučujeme, aby si každá
laboratoř stanovila vlastní kritéria pro interpretaci testu na základě populací vzorků, které běžně
zpracovává.
Hodnota anti-RNAP III (U/ml) Interpretace
< 28 Negativní na anti-RNAP III Ab
≥ 28 Pozitivní na anti-RNAP III Ab
7836E Česky
9
OMEZENÍ
Stejně jako u kteréhokoli jiného diagnostického testovacího postupu slouží výsledky získané pomocí
soupravy Anti-RNA Polymerase III ELISA pouze jako pomůcka při diagnóze a nelze je interpretovat jako
vlastní diagnostiku.
FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY
KLINICKÁ SPECIFICITA A SENZITIVITA
Onemocnění Pozitivní vzorek Četnost pozitivů
MCTD 0/10 0,0%
SLE 0/20 0,0%
SjS 0/27 0,0%
SSc 14/40 35%
CREST 2/5 40%
MCTD: smíšené choroby pojiva
SLE: systémový lupus erythematodes
SjS: Sjögrenův syndrom
SSc: systémová skleróza
CREST syndrom: syndrom zahrnující kalcinózu, Raynaudův fenomén, ezofageální dysfunkci,
sklerodaktylii a teleangiektázii
SPOLEHLIVOST MĚŘENÍ
Opakovatelnost byla demonstrována testováním 3 vzorků v 8 replikátech. Reprodukovatelnost byla
stanovena testováním 3 vzorků v 5 různých dnech (day-to-day) a testováním 3 vzorků na 2 šaržích (lot-to-
lot). Hodnoty CV (%) reprodukovatelnosti i opakovatelnosti byly nižší než 15 % u každého vzorku.
ROZSAH TESTU
Rozsah metody této soupravy je od 5 U/ml do 300 U/ml.
INTERFERUJÍCÍ LÁTKY
Hemoglobin (až 523 mg/dl), bilirubin (až 20,9 mg/dl), chylus (až 2800 jednotek turbidity formazinu) ani
revmatoidní faktor (až 500 IU/ml) nemají vliv na výsledek testu, avšak zabraňte použití vysoce
hemolyzovaných vzorků nebo vysoce lipemických vzorků.
LITERATURA
1. Medsger TA Jr. Systemic sclerosis (scleroderma): clinical aspects. In: Koopman WJ, editor. Arthritis and
allied conditions. 13th ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1997. p. 1433-64.
2. Roeder RG. Nuclear RNA polymerases: role of general initiation factors and cofactors in eukaryotic
transcription. Methods Enzymol 1996; 273: 165-71
3. Kuwana M, Kaburaki J, Mimori T, Tojo T, Homma M. Autoantibody reactive with Three classes of
RNA polymerases in sera from patients with systemic sclerosis. J Clin Invest 1993; 91: 1399-404.
7836E Česky
10
4. Okano Y, Steen VD, Medsger TA Jr. Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic
sclerosis. Ann Intern Med 1993; 119: 1005-13.
5. Hirakata M, Okano Y, Pati U, Suwa A, Medsger TA Jr, Hardin JA, et al. Identification of autoantibodies
to RNA polymerase II: occurrence in systemic sclerosis and association with autoantibodies to RNA
polymerase I and III. J Clin Invest 1993; 91: 2665-72.
6. Kuwana M, Okano Y, Kaburaki J, Toji T, Medsger TA Jr. Racial differences in the distribution of
systemic sclerosis-related serum antinuclear antibodies. Arthritis Rheum 1994; 37: 902-6.
7. Kuwana M, Kaburaki J, Okano Y, Tojo T, Homma M. Clinical and prognostic associations based on
serum antinuclear antibodies in Japanese patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum 1994; 37:
75-83.
8. Satoh M, Ajmani AK, Ogasawara T, Langdon JJ, Hirakata M,Wnag J et al. Autoantibodies to RNA
polymerase II are common in systemic lupus erythematosus and overlap syndrome. J Clin Invest 1994;
94: 1981-9.
9. Satoh M, Kuwana M, Ogasawara T, Ajmani AK, Langdon JJ, Kimpel D, et al. Association of
autoantibodies to topoisomerase I and the phoshorylated(IIO) form of RNA polymerase II in Japanese
scleroderma patients. J Immunol 1994; 153: 5838-48.
11
** Na štítku jsou použity následující symboly.
K diagnostickému použití in vitro
Katalogové číslo
Č. šarže
48 testů Viz návod k použití
Viz návod k použití dostupný na webové stránce
Viz návod k použití dostupný telefonicky
Datum použitelnosti
Skladujte při 2 až 8°C.
12
Vyrábí
Autorizovaný zástupce
13
<Komponenty ELISA soupravy>
Mikrojamkové proužky
Kalibrátor 1 Kalibrátor 2 Konjugát
Rozpouštědlo
Koncentrát promývacího pufru (20x)
14
Substrát
Zastavovací roztok
Pozitivní kontrola
Negativní kontrola
15
Výrobce:
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F
4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008,
Japonsko Tel: +81 52 238 1901
Fax: +81 52 238 1440
Autorizovaný zástupce v EU:
QARAD b.v.b.a.
Cipalstraat 3, B-2440 Geel, BELGIE
www.e-labeling.eu/MBL009286
+800 135 79 135
GR 00800 161 2205 7799
TR 00800 142 064 866
Revize:
27. listopadu 2014
27/11/2014
Č. 7836CE0051-1