anti-RNA Polymerase III ELISA Kit

Kat. č. 7836E: 48 jamek

POUZE PRO PROFESIONÁLNÍ POUŽITÍ

MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.

KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F

4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008, Japonsko

Tel.: +81 52 238 1901 Fax: +81 52 238 1440 URL: http://www.mbl.co.jp

- OBSAH -

Symboly······· 59

7836E Česky

3

Česky

URČENÉ POUŽITÍ

Souprava anti-RNA Polymerase III ELISA je semikvantitativní enzymová imunosorpční analýza (ELISA)

k detekci protilátek proti RNA polymeráze III v lidském séru. Souprava anti-RNA Polymerase III ELISA

je určena k diagnostickému použití in vitro jako pomůcka pro zjištění určitých autoimunitních

onemocnění.

SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ

Systémová skleróza (SSc) je autoimunitní onemocnění charakterizované mikrovaskulárním poškozením a

fibrózou kůže a vnitřních orgánů(1)

. Hlavními cíli autoprotilátkových odpovědí u pacientů se systémovou

sklerózou jsou RNA polymerázy (RNAP) I, II a III. Každá z těchto RNA polymeráz katalyzuje transkripci

unikátní sady genů: RNA polymeráza I (RNAP I) transkribuje geny ribozomální RNA, RNA polymeráza II

(RNAP II) transkribuje všechny protein kódující geny a některé malé jaderné RNA geny a RNA

polymeráza III (RNAP II) transkribuje geny, které exprimují malé stabilní RNA včetně 5S RNA a

transferových RNA(2)

. Protilátky proti RNAP I a RNAP III jsou téměř vždy přítomné společně (anti-RNAP

I/III Ab) a některá séra obsahují rovněž protilátky proti RNAP II (anti-RNAP II Ab)(3-5)

. Protilátky proti

RNAP I/III jsou nejčastější u bílých severoamerických pacientů se systémovou sklerózou(6)

a jsou

asociované s difúzní formou systémové sklerózy, s vysokou četností „renálních krizí“ a vysokou

mortalitou(3,4,7)

. Navíc bylo prokázáno, že některá séra pacientů se systémovou sklerózou obsahují

autoprotilátky rozpoznávající RNAP II, avšak ne RNAP I ani RNAP III. Protilátky proti RNAP II jsou

rovněž přítomné v sérech některých pacientů se systémovým lupus erythematodes (SLE) nebo

překryvnými syndromy(8,9)

.

Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří metodou ELISA s vysokou citlivostí protilátky proti

RNA polymeráze III přítomné v séru.

PRINCIP

Souprava Anti-RNA Polymerase III ELISA měří protilátky proti RNAP III přítomné v séru metodou

ELISA. Sérum pacienta a naředěné kalibrátory se přidají do mikrojamek, které jsou potažené antigeny

RNA polymerázy III. Protilátky proti RNA polymeráze III následně reagují s imobilizovanými antigeny

(Inkubace se vzorkem). Po promytí, které odstraní veškeré nenavázané sérové proteiny, se přidá křenová

peroxidáza konjugovaná s protilátkou proti lidskému IgG a inkubuje se (Inkubace s konjugátem). Po

dalším kroku promytí se přidá substrát peroxidázy a inkubuje se po další dobu (Inkubace se substrátem).

Poté se do každé jamky přidá kyselý roztok, aby se enzymatická reakce zastavila a ustálil se vývoj

barevného produktu. Výsledek testu se kvantifikuje spektrofotometrickým měřením reakce a vynesením

hodnot do grafu.

STRUČNÝ POSTUP TESTOVÁNÍ

<Inkubace se vzorkem> Do každé mikrojamky přidejte 100 µl naředěného vzorku (1:101).

20-30 °C, 60 min ↓

Promytí

7836E Česky

4

↓

<Inkubace s konjugátem> Do každé jamky přidejte 100 µl konjugátu.

20-30 °C, 60 min ↓

Promytí

↓

<Inkubace se substrátem> Do každé jamky přidejte 100 µl substrátu.

20-30 °C, 30 min ↓

Do každé jamky přidejte 100 µl zastavovacího roztoku.

↓

Odečtěte absorbanci

↓

Interpretace výsledků

REAGENCIE A SKLADOVÁNÍ

1) Mikrojamkové proužky

48-jamkové mikrojamkové proužky (6 x 8 jamek) pokryté antigenem vyráběným z rekombinantních

purifikovaných proteinů a odlamovací proužky v držáku, které jsou neprodyšně uzavřené do foliového

obalu se sušidlem, jsou stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

2) Kalibrátor 1 (0 U/ml)

Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití,

není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

3) Kalibrátor 2 (100 U/ml)

Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v

rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Kalibrátor je připravený k použití, není třeba žádné další ředění.

Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

4) Konjugát

Jedna lahvička obsahující 15 ml křenové peroxidázy konjugované s kozí protilátkou proti lidskémi IgG,

HEPES, Proclin 150 a BSA. Konjugát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data

expirace.

5) Rozpouštědlo

Jedna 50ml lahvička obsahující PBS, Tween-20 a 0,09% azid sodný. Rozpouštědlo je připraveno k použití.

Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

7836E Česky

5

6) Koncentrát promývacího roztoku (20x)

Jedna 50ml lahvička obsahující PBS a Tween-20 ve formě 20násobného koncentrátu. Stabilní při 2-8 °C až

do vyznačeného data expirace.

7) Substrát

Jedna 20ml lahvička obsahující směs 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin dihydrochloridu a peroxidu vodíku

(TMB/H2O2). Substrát je připraven k použití. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

8) Zastavovací roztok

Jedna 20ml lahvička obsahující 1N kyselinu sírovou. Zastavovací roztok je připraven k použití. Stabilní

při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

9) Pozitivní kontrola

Jedna lahvička obsahující 1,5 ml lidského séra pozitivního na protilátky proti RNA polymeráze III v

rozpouštědle s 0,09% azidem sodným. Pozitivní kontrola je připravená k použití, není třeba žádné další

ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

10) Negativní kontrola

Jedna lahvička obsahující 1,5 ml rozpouštědla s 0,09% azidem sodným. Negativní kontrola je připravená k

použití, není třeba žádné další ředění. Stabilní při 2-8 °C až do vyznačeného data expirace.

BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ

(1) Tento výrobek je určen pouze pro diagnostické použití in vitro.

(2) Komponenty soupravy nepoužívejte po uplynutí data expirace.

(3) Zamezte kontaktu reagencií s kůží, očima a oblečením. Při kontaktu reagencií s kůží je okamžitě

omyjte velkým množstvím vody. TMB obsahuje dráždivou látku a zastavovací roztok obsahuje 1N

kyselinu sírovou, která je jedovatá a žíravá.

(4) Kalibrátor 2 a pozitivní kontrola jsou odvozené z lidského séra, v kterém nebyly detekovány antigeny

hepatitidy B ani protilátky proti hepatitidě C, HIV-1 nebo HIV-2. Žádná testovací metoda však

nedokáže zaručit nepřítomnost těchto ani jiných infekčních agens. S těmito reagenciemi a všemi

pacientskými vzorky se musí zacházet jako s materiálem potenciálně přenášejícím AIDS, hepatitidu a

jakákoli další infekční onemocnění.

(5) Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrola, negativní kontrola a rozpouštědlo obsahují azid sodný

(0,09 %) jako konzervační činidlo a musí se s nimi zacházet s opatrností - zabraňte požití a styku s

kůží a slizničními membránami. Azid sodný může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a

vytvářet výbušné azidy kovů. Při vylévání materiálů obsahujících azid sodný do odpadu je proto

nezapomeňte vždy spláchnout velkým množstvím vody.

(6) Některé komponenty soupravy obsahují materiály živočišného původu pocházející z neinfekčních

zvířat. S těmito komponentami se však musí při jejich použití a likvidaci zacházet jako s potenciálně

biologicky nebezpečným materiálem.

(7) V průběhu jednoho testování se musí používat mikrojamkové proužky, konjugát, rozpouštědlo a

kalibrátor 2 s odpovídajícími čísly šarží. Nikdy nepoužívejte reagencie z jiných souprav jako náhradu.

7836E Česky

6

(8) Před zahájením testování se musí všechny reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu (20-30 °C).

(9) Během testování a během skladování soupravu nevystavujte přímým slunečním paprskům.

(10) Zabraňte mikrobiální a křížové kontaminaci reagencií a vzorků.

(11) Inkubační teploty nad a pod normální pokojovou teplotu (20-30 °C), kratší nebo delší doby trvání

inkubace a nepřesné ředění mohou způsobit chybné výsledky.

(12) Jamky se musí důkladně proplachovat promývacím roztokem, aby se zabránilo falešným pozitivům.

(13) Pipetujte opatrně, abyste zabránili napěnění vzorků a reagencií, což by mohlo způsobit křížovou

kontaminaci mezi mikrojamkami.

(14) Všechny mikrojamkové proužky, které nejsou právě potřebné, se musí vrátit zpět do sáčku se zipovým

uzávěrem a ten opětovně pečlivě těsně uzavřít, aby se zabránilo absorpci vlhkosti.

(15) Koncentrát promývacího roztoku se může při 2-8 °C zakalit. To však není příčinou rozporných

výsledků.

(16) Vybavení použité pro testování se musí zlikvidovat nebo ošetřit tak, jak je uvedeno níže.

Inkubujte ve 2% (finální koncentrace) roztoku glutaraldehydu po dobu více než 1 hodiny nebo v 0,5%

chlornanu sodném (ekvivalent přibližně 5000 ppm chlóru) po dobu více než 1 hodiny nebo

autoklávujte při 121 °C po dobu více než 20 minut.

(17) Naměřené hodnoty protilátek proti RNA polymeráze III lze použít pouze jako pomocnou informaci při

diagnóze. Každý lékař musí výsledky interpretovat s ohledem na anamnézu pacienta, fyzické nálezy a

výsledky dalších diagnostických postupů.

POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ BALENÍ

・ Čtečka mikrodestiček (vlnová délka: 450 nm, 620 nm / reference)

・ Multikanálová pipeta (např. 100 µl-300 µl)

・ Jednokanálová pipeta (např. 10 µl a 100 µl)

・ Nádržka na reagencie

・ Automatická myčka nebo promývačka

・ Deionizovaná nebo destilovaná voda

・ Jednolitrový kalibrovaný válec na přípravu promývacího roztoku

・ Testovací zkumavky na ředění pacientských vzorků (např. 1000 µl)

・ Jednorázové pipetovací špičky

・ Papírové utěrky

・ Umyvadlo a dezinfekční prostředek

・ Kryt na mikrodestičku

POSTUP

PŘÍPRAVA REAGENCIÍ

・ Před použitím vytemperujte reagencie a vybavení na pokojovou teplotu (20-30 °C).

・ Mikrojamkové proužky: Vyjměte požadované mikrojamkové proužky ze sáčku a umístěte je do rámečku.

Nepoužité proužky uložte ihned zpět do chladničky.

・ Promývací roztok: Koncentrát promývacího roztoku nařeďte před použitím v poměru 1:20 (např. přidejte

50 ml koncentrátu promývacího roztoku k 950 ml destilované vody). Naředěný promývací roztok je stabilní

2 týdny při 2-8 °C.

7836E Česky

7

・ Kalibrátor 1, kalibrátor 2, pozitivní kontrolu, negativní kontrolu, konjugát, rozpouštědlo, substrát ani

zastavovací roztok neřeďte, jsou připravené k použití.

PŘÍPRAVA VZORKŮ

・ Používejte čerstvé sérum pacienta. Pokud je zapotřebí, je možné ho zamrazit na teplotu nižší než -20 °C po

dobu až jednoho měsíce nebo na teplotu nižší než -70 °C pro delší skladování. Zabraňte opakovanému

zmrazování a rozmrazování.

*V případě skladování při teplotě pod -20 °C po dobu delší než 6 měsíců nebo po opakovaném zmrazování

a rozmrazování jsou v důsledku denaturace IgG získávány nespecifické výsledky.

・ Každý vzorek séra pacienta nařeďte v poměru 1:101 přidáním 10 µl séra k 1 ml rozpouštědla.

*Naředěné vzorky se musí použít v průběhu jednoho dne.

*Rozpouštědlo může vytvářet sraženinu. To však není příčinou rozporných výsledků.

POSTUP TESTOVÁNÍ

KROK 1. (INKUBACE SE VZORKEM)

Za použití multikanálové pipety přeneste 100 µl kalibrátoru 1, kalibrátoru 2, pozitivní kontroly, negativní

kontroly a každého naředěného vzorku do příslušných mikrojamek testovací destičky s antigenem.

Kalibrátory a pozitivní ani negativní kontroly neřeďte.

* Inkubace začíná napipetováním do mikrojamek potažených antigenem. Pipetování je třeba provést

co možná nejrychleji.

Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).

KROK 2. (PROMYTÍ)

Odsajte a zlikvidujte obsah každé jamky. Každou jamku naplňte promývacím roztokem a poté obsah opět

zcela odsajte a zlikvidujte. Promytí proveďte celkem 4krát. Zbývající promývací roztok odstraňte z

destičky sklepnutím do papírové utěrky. Pokud používáte automatickou myčku, promytí proveďte celkem

4krát.

* Doporučujeme, aby si každá laboratoř ověřila dobu promývání vhodnou pro přítomné vybavení.

* Promývací roztok se musí používat při 20-30 °C.

KROK 3. (INKUBACE S KONJUGÁTEM)

Roztok konjugátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl konjugátu do každé jamky pomocí multikanálové

pipety. Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).

KROK 4. (PROMYTÍ)

Mikrodestičku promyjte podle postupu uvedeného v kroku 2.

KROK 5. (INKUBACE SE SUBSTRÁTEM)

Roztok substrátu nalijte do nádržky. Přidejte 100 µl substrátu do každé jamky pomocí multikanálové

pipety.

* Použijte jinou nádržku, než kterou jste použili na pipetování konjugátu. Je třeba použít novou

nádržku na jedno použití, protože substrát se může snadno oxidovat kovovými ionty.

* Jakmile se substrát jednou nalije do nádržky, nesmí se vracet zpět do zásobní lahve.

Jamky zakryjte krycí folií a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě (20-30 °C).

KROK 6. (ZASTAVENÍ REAKCE)

Zastavovací roztok nalijte do nádržky. Do každé jamky napipetujte 100 µl roztoku multikanálovou

pipetou.

7836E Česky

8

ODEČTENÍ

Absorbanci každé jamky odečtěte při 450 nm. Pokud je k dispozici čtečka destiček s duální vlnovou

délkou, nastavte testovací vlnovou délku na 450 nm a referenční na 620 nm.

* Odečtení je třeba provést co možná nejrychleji po zastavení reakce.

* Před odečtením se ujistěte, že dno destičky je čisté a suché a že na povrchu kapaliny v jamkách

nejsou přítomné žádné bubliny.

VÝPOČET VÝSLEDKŮ

( A450<vzorek> - A450<kalibrátor 1>)

Jednotková hodnota (U/ml) = x 100 (

(A450<kalibrátor 2> - A450<kalibrátor 1>)

*A450 je zkratka hodnoty absorbance při 450 nm.

*Pro protilátky proti RNA polymeráze III není k dispozici mezinárodní referenční materiál. Test je

kalibrovaný na relativní arbitrární jednotky.

KONTROLA KVALITY

Každý výsledek testu musí splňovat následující kritéria.

A450 kalibrátoru 1: ≤ 0,100

A450 kalibrátoru 2: ≥ 0,500

Pozitivní a negativní kontroly musí vždy poskytnout následující výsledky:

Hodnota Anti-RNAP III (U/ml): Podle popisu na daném štítku.

Nedosažení těchto hodnot může indikovat, že soupravu již nelze dále používat. Pokud se kterékoli z těchto

kritérií nesplní, výsledky nelze použít a test se musí zopakovat. Před zopakováním testu zkontrolujte

následující parametry postupu.

inkubační teplota

inkubační doba

promytí

ředění vzorků

INTERPRETACE TESTU A OČEKÁVANÉ HODNOTY

Následující informace jsou určeny pouze jako vodítko při interpretaci. Doporučujeme, aby si každá

laboratoř stanovila vlastní kritéria pro interpretaci testu na základě populací vzorků, které běžně

zpracovává.

Hodnota anti-RNAP III (U/ml) Interpretace

< 28 Negativní na anti-RNAP III Ab

≥ 28 Pozitivní na anti-RNAP III Ab

7836E Česky

9

OMEZENÍ

Stejně jako u kteréhokoli jiného diagnostického testovacího postupu slouží výsledky získané pomocí

soupravy Anti-RNA Polymerase III ELISA pouze jako pomůcka při diagnóze a nelze je interpretovat jako

vlastní diagnostiku.

FUNKČNÍ CHARAKTERISTIKY

KLINICKÁ SPECIFICITA A SENZITIVITA

Onemocnění Pozitivní vzorek Četnost pozitivů

MCTD 0/10 0,0%

SLE 0/20 0,0%

SjS 0/27 0,0%

SSc 14/40 35%

CREST 2/5 40%

MCTD: smíšené choroby pojiva

SLE: systémový lupus erythematodes

SjS: Sjögrenův syndrom

SSc: systémová skleróza

CREST syndrom: syndrom zahrnující kalcinózu, Raynaudův fenomén, ezofageální dysfunkci,

sklerodaktylii a teleangiektázii

SPOLEHLIVOST MĚŘENÍ

Opakovatelnost byla demonstrována testováním 3 vzorků v 8 replikátech. Reprodukovatelnost byla

stanovena testováním 3 vzorků v 5 různých dnech (day-to-day) a testováním 3 vzorků na 2 šaržích (lot-to-

lot). Hodnoty CV (%) reprodukovatelnosti i opakovatelnosti byly nižší než 15 % u každého vzorku.

ROZSAH TESTU

Rozsah metody této soupravy je od 5 U/ml do 300 U/ml.

INTERFERUJÍCÍ LÁTKY

Hemoglobin (až 523 mg/dl), bilirubin (až 20,9 mg/dl), chylus (až 2800 jednotek turbidity formazinu) ani

revmatoidní faktor (až 500 IU/ml) nemají vliv na výsledek testu, avšak zabraňte použití vysoce

hemolyzovaných vzorků nebo vysoce lipemických vzorků.

LITERATURA

1. Medsger TA Jr. Systemic sclerosis (scleroderma): clinical aspects. In: Koopman WJ, editor. Arthritis and

allied conditions. 13th ed. Philadelphia: Lea & Febiger; 1997. p. 1433-64.

2. Roeder RG. Nuclear RNA polymerases: role of general initiation factors and cofactors in eukaryotic

transcription. Methods Enzymol 1996; 273: 165-71

3. Kuwana M, Kaburaki J, Mimori T, Tojo T, Homma M. Autoantibody reactive with Three classes of

RNA polymerases in sera from patients with systemic sclerosis. J Clin Invest 1993; 91: 1399-404.

7836E Česky

10

4. Okano Y, Steen VD, Medsger TA Jr. Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic

sclerosis. Ann Intern Med 1993; 119: 1005-13.

5. Hirakata M, Okano Y, Pati U, Suwa A, Medsger TA Jr, Hardin JA, et al. Identification of autoantibodies

to RNA polymerase II: occurrence in systemic sclerosis and association with autoantibodies to RNA

polymerase I and III. J Clin Invest 1993; 91: 2665-72.

6. Kuwana M, Okano Y, Kaburaki J, Toji T, Medsger TA Jr. Racial differences in the distribution of

systemic sclerosis-related serum antinuclear antibodies. Arthritis Rheum 1994; 37: 902-6.

7. Kuwana M, Kaburaki J, Okano Y, Tojo T, Homma M. Clinical and prognostic associations based on

serum antinuclear antibodies in Japanese patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum 1994; 37:

75-83.

8. Satoh M, Ajmani AK, Ogasawara T, Langdon JJ, Hirakata M,Wnag J et al. Autoantibodies to RNA

polymerase II are common in systemic lupus erythematosus and overlap syndrome. J Clin Invest 1994;

94: 1981-9.

9. Satoh M, Kuwana M, Ogasawara T, Ajmani AK, Langdon JJ, Kimpel D, et al. Association of

autoantibodies to topoisomerase I and the phoshorylated(IIO) form of RNA polymerase II in Japanese

scleroderma patients. J Immunol 1994; 153: 5838-48.

11

** Na štítku jsou použity následující symboly.

K diagnostickému použití in vitro

Katalogové číslo

Č. šarže

48 testů Viz návod k použití

Viz návod k použití dostupný na webové stránce

Viz návod k použití dostupný telefonicky

Datum použitelnosti

Skladujte při 2 až 8°C.

12

Vyrábí

Autorizovaný zástupce

13

<Komponenty ELISA soupravy>

Mikrojamkové proužky

Kalibrátor 1 Kalibrátor 2 Konjugát

Rozpouštědlo

Koncentrát promývacího pufru (20x)

14

Substrát

Zastavovací roztok

Pozitivní kontrola

Negativní kontrola

15

Výrobce:

MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.

KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F

4-5-3 Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi 460-0008,

Japonsko Tel: +81 52 238 1901

Fax: +81 52 238 1440

Autorizovaný zástupce v EU:

QARAD b.v.b.a.

Cipalstraat 3, B-2440 Geel, BELGIE

www.e-labeling.eu/MBL009286

+800 135 79 135

GR 00800 161 2205 7799

TR 00800 142 064 866

Revize:

27. listopadu 2014

27/11/2014

Č. 7836CE0051-1