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Arzneimittelanalytik
Drug Monitoring, toxikologische und umweltrelevante Untersuchungen
WS 08/09 2
Termine I
Platzabgabe
13-18.30
10.11.-14.11.
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
03.11.-07.11.
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
27.10.-31.10.
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
20.10.-24.10.
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
Praktikum
13-18.30
13.10.-17.10
Praktikum
8-18
Praktikum
8-18
Praktikum
8-18
Praktikum
8-18
Praktikum
VB/SB 9-11 gr.
HS
Platzübergabe/
Reagenzien
06.10-10.10
freiSeminar gr.
HS
9-13
15-17
Seminar gr.
HS
9-13
15-17
freifrei29.09.-03.10.
FreitagDonnerstagMittwochDienstagMontagDatum
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WS 08/09 3
Termine II
� Abschlussklausur:Do 11.12.2008 14-16 Uhr gr. HS
� 1. WDH:Do 15.01.2009 14-16 Uhr gr. HS
� 2. WDHwird noch festgelegt
WS 08/09 4
Praktikumsabschnitte
� Nasschemische Identifizierung eines AS (A.1.)
� Trennung eines Stoffgemisches (Stas-Otto) (A.2.)
� Kleines Arzneistoffgemisch (2x) (A.3.)
� Großes Arzneistoffgemisch (A.4.)
� HPLC Versuche zur Stabilität von Arzneistoffen (B.)
� Stabilität von Omeprazol (B.1.)
� Stabilität von Rofecoxib (B.2.)
http://sem5.pharmazie.uni-marburg.de/downloads.php
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WS 08/09 5
nasschemische Identifizierung eines AS A.1.
� Identifizierung 1 Reinsubstanz
� Anforderung: je ein Reagenzglas mit Stopfen und Etikett (Name, Vorname, Box, „Aufgabe“)
� Substanzen siehe aktuelle Arzneistoffliste
WS 08/09 6
Arzneistoff-Reinsubstanzen (A.1.)
� Aussehen� Farbe
� Konsistenz: fest/flüssig
� evtl. Kristallform
� Geruch/Geschmack� Geruchs- und Geschmacksproben sind nicht
erlaubt!!!!
Sie werden als schwerer Verstoß gegen die Sicherheitsvorschriften gewertet!!!
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WS 08/09 7
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� Löslichkeiten� Wasser
� 3M NaOH
� 3N H2SO4
� Verhalten gegenüber konz. Säuren
WS 08/09 8
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� Anionennachweise� Chlorid, Bromid
� Sulfat
� Edisilat(Ethandisulfonsäure)
� Phosphat
� Tartrat
� Maleat (Maleinsäure)
� Lactat
� Lysinat
� Malonat
� Kationennachweise� Natrium
� Kalium
Prüfung auf anorganische Arzneistoffe nicht vergessen !
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WS 08/09 9
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� Farbreaktionen (Gruppennachweise)� Halogene („organisch gebunden“)
�Beilstein-Probe
�Lassaigne-Probe
� Filtrat mit verd. HNO3 ansäuern und mit AgNO3
fällen (Cl-, Br-, I-)Cave: AgF ist löslich, auch S2-, CN- und SCN-
bilden schwerlösliche Ag-Salzedeshalb: Λ T → HCN, H2S und HSCN↑
WS 08/09 10
Lassaigne Aufschluss
� 10-30 mg Substanz in einem kleinen Reagenzglas langsam mit einem Stück elementarem Natrium zuerst zur Schmelze bringen und dann langsam zur Rotglut erhitzen
� anschließend das Röhrchen in Rotglut in einem kleinen mit Wasser gefüllten Becherglas zertrümmern (Vorsicht!!!!)
� filtrieren� im Filtrat lassen sich nachweisen:
� Stickstoff → CN-, SCN-
� Schwefel: S2-, SCN-
� Halogene: F-, Cl-, Br-, J-
� Kohlenstoff: CN-, SCN-
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WS 08/09 11
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� Farbreaktionen (Gruppennachweise)� arom. Amine
�Bildung eines Azofarbstoffes� Diazotierung und Kuppeln
�ß-Naphthol
�Bratton-Marshall-Reagenz
�Bildung eines aromat. Imins. � Ehrlichs Reagenz
�ebenfalls möglich für:� Nitroverbdg. nach Reduktion,
� Amide nach Hydrolyse
WS 08/09 12
Alkaloide
� Nachweis:� i.d.R. mit Hilfe von Fällungsreagenzien:
�Dragendorff� Fröhde�Mayer� Pikrinsäure� Phosphormolybdänsäure�Reineckesalz�Natriumtetraphenylborat
� oder spezielle Farbreaktionen�Vitali-Morin f. Tropan-Alkaloide�Thalleiochin f. China-Alkaloide�Murexid f. Purine�u.v.a.
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WS 08/09 13
Nachweis CH-acider Verbindungen
� 1) Bildung eines mesomeriestabilisierten Enolat-Ions(elektronenreiches Nukleophil)
� 2) nucleophile Addition an einen Nitroaromaten (auchPolynitro) (elektronenarm, in o- oder p-Position)Janovsky-Bedingungen: Überschuss Enolat
� 3) Oxidation durch überschüssiges ReagenzZimmermann Bedingungen: ÜberschussPolynitroverbdg.; Oxidation
� 4) falls die Carbonylverbindung einen weiterenCH-aciden Wasserstoff besitzt � erneute Deprotonierung
WS 08/09 14
Ester – Bildung von Hydroxamsäuren
� Gruppenbez. für organ. Säuren, die durch Umsetzung von Hydroxylamin (auch N-mono-substituierte) mit Carbonsäurehalogeniden, -anhydriden u. -estern entstehen
� Reaktivität von Carbonsäurederivaten
� Carbonsäuren: Aktivierung nötig
R Cl
O
R O
O O
R R O
O
R'
R NH
O
R'R
O
OH R O
O
> >
> >
>
-
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WS 08/09 15
Nachweis von Phenolen
� 1) Reaktion mit FeCl3� 2) Reaktion mit diazotierter Sulfanilsäure
(siehe Azokupplung)
� 3) Reaktion mit Gibbs-Reagenz
� 4) Emerson-Reaktion
WS 08/09 16
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� Farbreaktionen (Gruppennachweise)� Murexid: Purine
� Liebermann-Burchard: Steroide
� Zwicker
� Fehling
� und viele mehr
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WS 08/09 17
Arzneistoff-Reinsubstanzen
� DC:� Laufmittel variieren (es gibt kein Universal-FM)
� Probe und Referenz übereinander auftragen
� wenig Substanz auftragen
� Farbreaktionen auf DC möglich
� Buch-Tipp: DFG-Liste (Bibliothek 5.Semester)sowie „A Compendium of Unofficial Methods for Rapid Screening of Pharmaceuticals by Thin-Layer Chromatography”
immer auch mit Referenzsubstanz arbeiten („CRS“)
Trennung eines Stoffgemisches A.2.
modifizierter Trennungsgang nachStas-Otto
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WS 08/09 19
� Anforderung: ein Reagenzglas mit Stopfen und Klebe-Etikett (Name, Box, "Stas-Otto")
� Substanzen: Es wird ein Gemisch aus 2 bis 4 Stoffen der aktuellen Stoffliste des Praktikums ausgegeben.
� Durchführung: Das Gemisch soll durch einen modifiziertenTrennungsgang nach Stas-Otto getrennt und die einzelnen Komponenten mittels DC, Schmelzpunkt und nasschemischen Nachweisen identifiziert werden. Die Durchführung des Trennungsganges richtet sich nach der Vorlesung sowie "Auterhoff – Kovar: Identifizierung von Arzneistoffen". Anstelle von IBMK wird jedoch mit einem 3:1 Gemisch aus Dichlormethan und Isopropanolausgeschüttelt!
� Abgabe: Im Analysenheft sind unter der Überschrift "Stas-Otto Trennungsgang" alle identifizierten Substanzen aufzuführen, sowie die Fraktion(en) in der sie angefallen sind.
� Bewertung: Bei fehlerhaften Analysen muss ohne Korrekturmöglichkeit eine neue Analyse angefordert werden.
WS 08/09 20
Stas-Otto-Gang (modifiziert)
AS in H2O
suspendiert
H2SO4
pH 1
I
Ausschüttelnmit NaOH
Ether-Phase IB
Neutralstoffe
Stoffe mit pK>12
Wasser-Phase
H2SO4
Ether
IA
Säuren
OH, NH, CH-acide Stoffe
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WS 08/09 21
Stas-Otto-Gang (modifiziert)
AS in H2O
suspendiert
H2SO4
pH 1
I
IB IA
NaHCO3
pH 7 Weinsäure
pH 4-5
II
schwache Basen
Basen mit pKB > 8-12 (aromat. Amine, Imine)
WS 08/09 22
Stas-Otto-Gang (modifiziert)
AS in H2O
suspendiert
H2SO4
pH 1
I
IB IA
NaHCO3
pH 7 Weinsäure
pH 4-5
II
NaOH
pH12
III
starke Basen
Basen mit pKB < 8
Amine, Amidine
Guanidine
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WS 08/09 23
Stas-Otto-Gang (modifiziert)
AS in H2O
suspendiert
H2SO4
pH 1
I
IB IA
NaHCO3
pH 7 Weinsäure
pH 4-5
II
NaOH
pH12
III
H2SO4
pH 7
NH3
pH9IV
VPhenolbasen
Schwache HA/HB in einem
Molekül
WS 08/09 24
Stas-Otto-Gang (modifiziert)
AS in H2O
suspendiert
H2SO4
pH 1
I
IB IA
NaHCO3
pH 7 Weinsäure
pH 4-5
II
NaOH
pH12
III
H2SO4
pH 7
NH3
pH9IV
VNicht ausschüttelbare
Substanzen
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Arzneimittel-Analysen
A.3. – A.4.
WS 08/09 26
Arzneimittel-Analytik
� kleine Gemische: (A.3.)
� groβes Gemisch: (A.4.)
� Die Einwaage an Arzneistoff liegt zwischen 200mg-700mgDie Angabe kleinerer und größerer Mengen an AS ergibt daher keinen Sinn!!!
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WS 08/09 27
kleine Gemische (A.3.)
� enthalten:� 1 Arzneistoff� 1-2 Hilfsstoffe
� Anforderung:� Etikett (Name, Vorname, Box, kleines Gemisch Nr)
� werden nach Indikation gemischt!!!
� Es ist also nur sinnvoll, auf Arzneistoffe zu prüfen, die unter das jeweilige Indikationsgebiet fallen
� man sollte sich zuerst darüber klar werden, um welche Stoffklassen es sich handeln könnte und sich eine Liste zusammenstellen
WS 08/09 28
kleine Gemische (A.3.)
� 2 kleine Gemische müssen erfolgreich bearbeitet werden� pro Gemisch müssen 8 Punkte erreicht werden!
� Bewertung:
ff
Korrektur möglich und
verlangt
rf
fr
Quantitative
Bestimmung kann
erfolgen
rr
PunkteTrägerstoffArzneistoff
siehe
nächste
Folie
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WS 08/09 29
kleine Gemische (A.3.)
� Qualitative Bewertung
Arzneistoff bei der ersten Ansage richtig : 4 Punkte
Arzneistoff bei der 2. Ansage richtig : 1 Punkt
Hilfsstoffe (alle) bei der ersten Ansage richtig : 2 Punkte
Hilfsstoffe bei der 2. Ansage richtig : 1 Punkt
� Quantitative BewertungAbweichung bis 2 % (absolut) : 6 Punkte
Abweichung bis 4 % : 4 Punkte
Abweichung bis 8 % : 2 Punkte
WS 08/09 30
kleine Gemische (A.3.)
� 2 kleine Gemische müssen erfolgreich bearbeitet werden
� Für jeweils 3 nicht erfolgreich identifizierte Gemische erhöht sich die erforderliche Anzahl um eins!
� => Hat man z.B. bereits 4 kleine Gemische analysiert, jedoch nur einmal die erforderliche Mindestpunktzahl erlangt, so muss man noch weitere 2 Gemische erfolgreich analysieren!
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WS 08/09 31
kleine Gemische (A.3.)
� Hinweise zur Bearbeitung� Allg. Vorproben (siehe Reinsubstanzen)
� Identifizierung der Hilfsstoffe
� sehr hilfreich: DC
� Stas-Otto-Gang (Trennung des AS vom HS, an dieser Stelle nicht quantitativ)
� oder � eigene Ideen
� Abgabe des Analysenheftes zur Identität
WS 08/09 32
kleine Gemische (A.3.)
� Ist der Arzneistoff richtig, kann die quantitative Bestimmung erfolgen:
� Die Auswahl einer entsprechenden Gehalts-bestimmungsmethode sollte hierbei so gewähltwerden, dass der/die Hilfsstoffe diese nichtstören
� oder
� der Arzneistoff muss zuvor vollständig vondem/den Hilfsstoffen abgetrennt werden
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WS 08/09 33
große Gemische (A.4.)
� enthalten:� 2 Arzneistoffe� 1-2 Trägerstoffe
� Anforderung:� Etikett (Name, Vorname, Box, großes Gemisch Nr)
� Bewertung:� benötigte Punktzahl 14
� Indikation� wichtig für die quantitative Bestimmung:
� Isolierung der einzelnen AS häufig nötig (Stas-Otto-Gang)
� oder� selektive Bestimmungsmethode
WS 08/09 34
Gehaltsbestimmungen I
� Fällungstitrationen� Argentometrie
� Komplexometrie
� Redoxtitrationen� Iodometrie
� Cerimetrie
� Detektion: Farbindikatoren, potentiometrisch (Chlorid)
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WS 08/09 35
Gehaltsbestimmungen II
� Säure-Base-Titrationen� in wässriger Lösung (Indikator)
� wasserfreie Titrationen� gegen Indikator oder
� potentiometrisch
� UV-VIS � theoretisch: Quantifizierung über die spezifische Absorption
� praktisch: Quantifizierung über Kalibrationskurve
WS 08/09 36
Noch mehr nützliche Tipps:
� bitte nicht vergessen, die Analyse auszuwiegen
� Bitte sparsam mit der Analysensubstanz umgehen. Es gibt keine Nachsubstanz !!!!
� man muss nicht exakt 0,150 g einwiegen, es muss nur genau eingewogen sein (verkürzt die Wartezeit an den Waagen enorm!!!!!!)
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WS 08/09 37
Noch mehr nützliche Tipps:
� bitte nicht vergessen, die Analyse auszuwiegen
� Bitte sparsam mit der Analysensubstanz umgehen. Es gibt keine Nachsubstanz !!!!
� man muss nicht exakt 0,150 g einwiegen, es muss nur genau eingewogen sein (verkürzt die Wartezeit an den Waagen enorm!!!!!!)
� Richtigkeit, Genauigkeit und Präzision
WS 08/09 38
Noch mehr nützliche Tipps:
� immer auch eine Referenz titrieren!!! (sollte imgleichen Gehaltsbereich liegen)
� Da gegen Referenz titriert wird, muss man keine gekauften Maßlösungen verwenden!!!! Man kann sehr schnell eine etwa 0,1 N Maßlösung selber herstellen (literweise) !!!!
� Das Arzneibuch lässt Reinsubstanzenbestimmen (und einwiegen). Sie wiegen imAM-Praktikumein Arznei-und Hilfsstoff-Gemisch ein !!!
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HPLC Versuche zur Stabilität von Arzneistoffen
B.1. und B.2.
WS 08/09 40
Stabilität von Omeprazol
� Untersuchung der Stabilität von Omeprazolgegenüber Säure mittels HPLC
� Messung der Abnahme des WS Gehaltes in Abhängigkeit der Zeit
� unterschiedliche Säurestärke
� Literatur:� Rücker: Inst. Pharm. Analytik
� Mutschler
� Bauer
� Steinhilber
� u.a.
21
WS 08/09 41
WS 08/09 42
Photostabilität von Rofecoxib
� Quelle:Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis, 28 (2002) 1101–1113
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WS 08/09 43
Hydrolyse von Rofecoxib
WS 08/09 44
Weitere Informationen
� Praktikumsscript (Internet)
� Bücher
� Schwarzes Brett
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WS 08/09 45
Analysenheft
11.06
xy
3 Punkte420 mgTitrationmit NaOHgg. ??
1.kl. GemischGehalt
11.10
10.06
xy
richtigASSFormel
HS: Mannit
DCAcetylnachweis
1. kl. GemischIdentität
10.10.
TestatBewertungErgebnisDurchführungAnalyseDatum
WS 08/09 46
Laborjournal
� Im Analysenheft oder in einem anderen Heft soll die Vorgehensweise protokolliert werden (Stichpunkte)
� Einwaagen, Gesamtauswaage usw.
� beobachtete Phänomene
� Substanzklassen auf die geprüft wurde
� usw.
� zentrale Arbeitsschritte sollen dokumentiert werden