Aus der Klinik für kleine Klauentiere und
forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Lungenadenomatose-Status einer mutterlos aufgezogenen Heidschnuckenherde
mittels Polymerase-Kettenreaktion
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Katja Voigt
aus Esslingen
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. M. Ganter
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter
2. Gutachterin: Prof. Dr. B. Grummer
Tag der mündlichen Prüfung: 2. Juni 2004
Diese Arbeit wurde durch die Niedersächsische Tierseuchenkasse,
die Heinrich-Behrens-Stiftung sowie durch ein Stipendium im Rahmen des
Niedersächsischen Graduiertenförderungsgesetzes (März bis Dezember 2001)
unterstützt
für
die „Döhler Herde“
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
Inhalt Seite
Abkürzungsverzeichnis............................................................................... 15
1. EINLEITUNG............................................................................................... 19
2. LITERATURÜBERSICHT........................................................................... 21
2.1 Lungenadenomatose (LA)........................................................................ 21
2.1.1 Historisches................................................................................................. 21
2.1.2 Klinische Symptome.................................................................................... 22
2.1.3 Pathologie................................................................................................... 23
2.1.3.1 Pathomorphologische Befunde.............................................. 23
2.1.3.2 Vorkommen von Metastasen................................................. 24
2.1.3.3 Sekundärinfektionen.............................................................. 25
2.1.3.4 Histologie............................................................................... 25
2.1.4 Ätiologie...................................................................................................... 26
2.1.4.1 Historisches........................................................................... 26
2.1.4.2 Retroviridae............................................................................ 28
2.1.4.3 Jaagsiekte Retrovirus (JSRV)................................................ 29
2.1.4.4 Endogene Retroviren............................................................. 31
2.1.5 Pathogenese............................................................................................... 32
2.1.5.1 Pathogenese der klinischen Symptome................................. 32
2.1.5.2 Zelltropismus und mögliche Mechanismen der
Onkogenese durch JSRV...................................................... 33
2.1.6 Epidemiologie.............................................................................................. 36
2.1.6.1 Verbreitung............................................................................ 36
2.1.6.2 Verluste in infizierten Herden................................................. 36
2.1.6.3 Übertragungswege................................................................. 37
2.1.6.4 Inkubationszeit und Altersverteilung...................................... 37
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.6.5 Begünstigende Faktoren / genetische Disposition,
Resistenzentwicklung und Immunreaktion............................. 38
2.1.6.6 Befall anderer Tierarten......................................................... 40
A Ziegen.................................................................................... 40
B Mufflons................................................................................. 41
C Andere Tierarten.................................................................... 41
2.1.7 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in Deutschland...... 41
2.1.8 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in der
Heidschnuckenzucht................................................................................... 43
2.1.9 Diagnostik und Nachweisverfahren............................................................. 44
2.1.9.1 Klinische Untersuchung......................................................... 44
2.1.9.2 Serologie und Virusanzüchtung............................................. 46
2.1.9.3 Thoraxperkussion.................................................................. 46
2.1.9.4 Ultraschalluntersuchung........................................................ 47
2.1.9.5 Endoskopie............................................................................ 47
2.1.9.6 Bronchoalveoläre Lavage...................................................... 48
A Endoskopische Entnahme von Trachealsekret-
und Lungenspülproben.......................................................... 48
B Transtrachealer Zugang......................................................... 49
C Nicht-invasive Techniken zur Entnahme von
Lungenspülproben unter Feldbedingungen........................... 50
2.1.9.6.1 Anwendung der BAL zur Diagnostik der
Lungenadenomatose................................................... 52
A Sekretzytologie............................................................ 52
B Biochemische Untersuchung....................................... 52
2.1.9.7 Röntgenuntersuchung............................................................ 53
2.1.9.8 Lungenbiopsie........................................................................ 54
2.1.9.9 Pathologie.............................................................................. 55
2.1.9.10 Eignung der genannten Verfahren zur Kontrolle von
Sanierungsverfahren.............................................................. 55
INHALTSVERZEICHNIS
2.2 Verfahren zum Virusnachweis................................................................. 56
2.2.1 Blocking ELISA, Immunhistochemie,
Restriktionsenzymanalyse........................................................................... 56
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion......................................................................... 56
2.2.2.1 Prinzip und Historisches........................................................ 56 2.2.2.2 Nested PCR / Heminested PCR............................................ 57
2.2.2.3 Auswertung der PCR............................................................. 58
2.2.2.4 U3 heminested PCR zum Nachweis von JSRV..................... 58
2.2.2.4.1 Anwendung der U3 hn PCR zum Virusnachweis in
verschiedenen Proben und Geweben......................... 59
2.2.2.5 Risiken der PCR.................................................................... 63
A Unspezifische Reaktionen..................................................... 63
B Falsch-positive Ergebnisse.................................................... 63
C Falsch-negative Ergebnisse................................................... 64
2.2.2.6 Kontrollen............................................................................... 65
2.3 Maßnahmen zur Kontrolle und Bekämpfung der Lungenadenomatose......................................................................... 66
2.3.1 Kontrollmaßnahmen in der Heidschnuckenzucht........................................ 66
2.3.2 Kontrolle und Sanierungsversuch durch Managementmaßnahmen........... 67
2.3.3 Eradikation der Lungenadenomatose in Island........................................... 68
2.3.4 Sanierung mittels Embryotransfer............................................................... 69
2.3.5 Sanierung mittels mutterloser Lämmeraufzucht am Beispiel
der Maedi-Visna-Infektion........................................................................... 70
2.3.6 Versuch der Lungenadenomatose-Sanierung mittels
mutterloser Aufzucht................................................................................... 71
2.3.6.1 Geschichte des Sanierungsprojekts...................................... 71
INHALTSVERZEICHNIS
3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN....................................................... 75
3.1 Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001......................................... 75
3.2 Herden........................................................................................................ 76
3.2.1 Schneverdinger Herde................................................................................ 76
3.2.2 Döhler Herde............................................................................................... 77
3.2.3 weitere Herden des VNP............................................................................. 77
3.2.4 Haltung, Ställe und Weideflächen............................................................... 78
3.3 Tiere und Probenmaterial......................................................................... 79
3.3.1 Tiere und Probenmaterial aus LA-positiven Herden................................... 79
A Sektionstiere .................................................................................... 79
B Schlachttiere..................................................................................... 80
C Lämmerblutproben........................................................................... 81
3.3.2 Tiere und Probenmaterial aus der mutterlos aufgezogenen
(Döhler) Herde............................................................................................ 83
A Sektionen.......................................................................................... 83
B Schlachttiere..................................................................................... 83
C Lungenspülproben............................................................................ 84
3.4 Klinische Untersuchung........................................................................... 85
3.4.1 Sektionstiere............................................................................................... 85
3.4.2 Schlachttiere............................................................................................... 87
3.4.3 Klinische Untersuchung der Döhler Herde.................................................. 87
3.5 Probenentnahme....................................................................................... 88
3.5.1 Blutentnahme.............................................................................................. 88
3.5.2 Lungenspülproben...................................................................................... 88
A Entnahme von Lungenspülproben nach
endotrachealer Intubation................................................................. 88
B Entnahme von Lungenspülproben mithilfe
eines flexiblen Endoskops................................................................90
3.5.3 Gewebeproben............................................................................................ 90
A Entnahme von Gewebeproben bei Schlachttieren........................... 90
INHALTSVERZEICHNIS
B Entnahme von Gewebeproben während der Sektion....................... 93
3.6 Probenbearbeitung................................................................................... 93
3.6.1 Allgemeine Maßnahmen............................................................................. 93
3.6.2 Buffy-Coat-Präparation............................................................................... 94
3.6.3 Lungenspülproben...................................................................................... 95
3.6.4 Formalinfixierung, Paraffineinbettung, Herstellung von
Gewebeschnitten und histologische Untersuchung.................................... 97
3.7 Gesamt-DNA-Isolierung............................................................................ 97
3.7.1 Allgemeine Maßnahmen............................................................................. 97
3.7.2 Gesamt-DNA-Isolierung aus Buffy-Coat- und Lungenspülprobenzellen..... 97
3.7.3 Gesamt-DNA-Isolierung aus Gewebeproben.............................................. 99
3.7.4 Präparationskontrollen................................................................................ 99
3.7.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA................................. 100
3.8 molekularbiologische Untersuchungen.................................................. 101
3.8.1 Allgemeine Maßnahmen............................................................................. 101
3.8.2 Nachweis von JSRV mittels PCR (U3 LTR PCR)....................................... 102
3.8.3 Heminested (hn) PCR................................................................................. 105
3.8.4 Grenzwert-Positivkontrollen........................................................................ 107
3.8.5 Visualisierung der PCR-Produkte im Agarosegel....................................... 108
3.9 Validierung der PCR................................................................................. 109
3.9.1 Template-Kontrolluntersuchungen.............................................................. 110
3.9.2 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCR am Modell
mit Plasmid versetzter DNA........................................................................ 111
3.9.3 Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamtsystems
(Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung)
am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.............................. 112
3.9.3.1 Vorversuche zum Zusatz von JS7-Zellen
zu Rinderblutproben .............................................................. 113
A Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat
mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut...... 113
INHALTSVERZEICHNIS
B Probenentnahme, Zusatz von JS7-Zellen
und Buffy-Coat-Präparation................................................... 113
C Isolierung von Gesamt-DNA aus Vollblut............................... 114
D DNA-Konzentrationsbestimmung und PCR-Untersuchung... 115
3.9.3.2 Detaillierte Bestimmung der Nachweisgrenze des
Gesamtsystems..................................................................... 115
3.9.4 Southern Blot.............................................................................................. 117
3.9.5 Sequenzierung von PCR-Produkten........................................................... 118
4. ERGEBNISSE............................................................................................. 121
4.1 weiterer Verlauf der Sanierung mittels mutterloser Aufzucht.............. 121
4.2 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung von Tieren aus LA-positiven Herden... 121
4.2.1 klinisch untersuchte Tiere (Sektionstiere)................................................... 121
4.2.1.1 Einteilung in die klinischen Gruppen und Gegenüber-
stellung der Ergebnisse der pathologisch-anatomischen
und pathohistologischen Untersuchung................................. 121
4.2.1.2 Einteilung in Kategorien anhand der Lungenbefunde............ 125
4.2.1.3 Vorkommen von Metastasen und
anderen Tumorerkrankungen................................................. 126
4.2.2 Schlachttiere............................................................................................... 127
4.2.2.1 Ergebnisse der Lebenduntersuchung.................................... 127
4.2.2.2 Pathologisch-anatomische und
histologische Untersuchung................................................... 127
4.2.2.3 Vorkommen von Metastasen................................................. 128
4.3 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Schneverdinger Herde.................... 128
4.3.1 Anzahl LA-positiver Tiere............................................................................ 129
4.3.2 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der
Schneverdinger Herde................................................................................ 130
INHALTSVERZEICHNIS
4.4 Altersverteilung an Lungenadenomatose erkrankter Tiere.................. 131
4.5 Praktikabilität der BAL und Probenqualität............................................ 133
4.5.1 Praktikabilität und Zeitaufwand der Entnahme von BAL-Proben nach
endotrachealer Intubation............................................................................ 133
4.5.1.1 Kosten.................................................................................... 133
4.5.1.2 Immobilisation und Wartezeit................................................. 134
4.5.1.3 Komplikationen...................................................................... 135
4.5.2 Qualität der Lungenspülproben................................................................... 136
4.5.2.1 Rückgewinnungsvolumen und
makroskopische Beurteilung.................................................. 136
4.5.2.2 Zellintegrität........................................................................... 137
4.5.2.3 Erzielte DNA-Konzentration................................................... 137
4.5.3 Blutproben................................................................................................... 137
4.5.3.1 Zellintegrität nach Buffy-Coat-Präparation............................. 137
4.5.4 Kontrolle der DNA-Qualität.......................................................................... 138
4.5.4.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA............ 138
4.5.4.2 Template-Kontrolluntersuchungen......................................... 139
4.6 Validierung der PCR................................................................................. 139
4.6.1 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von Wasser
(Grenzwert-Positivkontrollen)...................................................................... 139
4.6.2 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng
genomischer DNA (Inhibitionskontrollen).................................................... 140
4.6.3 Nachweisgrenze des Gesamtsystems (Probenbearbeitung/DNA-
Extraktion/PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter
Rinderblutproben......................................................................................... 146
4.6.3.1 Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus
Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA
aus Vollblut (Vorversuche)..................................................... 146
4.6.3.2 Nachweisgrenze des Gesamtsystems................................... 150
INHALTSVERZEICHNIS
A Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit
JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.................................150
B Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit
JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben.................................152
4.6.4 Southern Blot.............................................................................................. 154
4.6.5 Sequenzierung der PCR-Produkte.............................................................. 156
4.7 Untersuchung von Proben aus positiven Herden.................................. 158
4.7.1 Probenübersicht (positive Herden)................................................... 158
4.7.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchungen aus den positiven Herden... 159
4.7.2.1 Tiere mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren
(Kategorie I)........................................................................... 159
4.7.2.2 Tiere mit lediglich histologisch nachweisbaren
Läsionen (Kategorie II)........................................................... 163
4.7.2.3 Histologisch negative Tiere (Kategorie IV)............................. 164
4.7.2.4 Statistische Bewertung der Ergebnisse................................. 166
4.7.2.5 Histologisch fragliche Tiere (Kategorie III)............................. 170
4.7.2.6 Untersuchung von Lämmern aus einer positiven Herde........ 173
A Übersicht................................................................................ 173
B Ergebnis der PCR-Untersuchung der Lungenspülproben...... 173
C Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blut- und
Gewebeproben von vier ausgewählten Lämmern.................. 175
4.8 Untersuchung von Tieren und Probenmaterial aus der Döhler Herde................................................................................ 176
4.8.1 Klinische Untersuchung der Döhler Herde.................................................. 176
4.8.2 Sektionen verendeter Tiere......................................................................... 176
4.8.3 Untersuchung der Altböcke......................................................................... 178
4.8.4 Untersuchung der Schlachtlungen.............................................................. 178
4.8.4.1 Makroskopische Untersuchung.............................................. 178
4.8.4.2 Systematische Histologie....................................................... 179
INHALTSVERZEICHNIS
4.8.4.3 Untersuchung der Lungenlymphknoten
mittels PCR............................................................................ 181
4.8.4.4 Weiterführende Untersuchungen bei den drei Tieren mit
histologisch fraglichem bzw. positivem Ergebnis.................. 181
4.8.5 Untersuchung des Muttertieres des Lammes mit bestätigter
Lungenadenomatose................................................................................... 182
4.8.6 Untersuchung der Lungenspülproben......................................................... 183
5 DISKUSSION.............................................................................................. 185
5.1 Lungenadenomatose bei Heidschnucken.............................................. 185
5.1.1 Altersverteilung und Disposition.................................................................. 185
5.1.2 Atypische Lungenadenomatose.................................................................. 186
5.1.3 Metastasen und andere Tumorerkrankungen............................................. 187
5.2 Untersuchungsverfahren......................................................................... 188
5.2.1 Eignung der klinischen Untersuchung zur Diagnose der LA....................... 188
5.2.2 Blutproben................................................................................................... 189
5.2.3 BAL nach endotrachealer Intubation........................................................... 189
5.3 Molekularbiologische Untersuchungen.................................................. 192
5.3.1 Vor- und Nachteile des Nachweises proviraler DNA gegenüber
dem RNA-Nachweis mit RT-PCR................................................................ 192
5.3.2 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer Resultate und
Bestimmung der Nachweisgrenze.............................................................. 193
5.3.3 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-positiver Resultate....................... 195
5.4 Untersuchung von Proben aus positiven Herden.................................. 196
5.4.1 PCR aus Blutproben................................................................................... 196
5.4.2 PCR aus Lungenspülproben....................................................................... 198
5.4.3 PCR aus Gewebeproben............................................................................ 199
5.5 Untersuchung der mutterlos aufgezogenen Herde................................ 200
5.5.1 Beurteilung des Sanierungserfolges........................................................... 200
INHALTSVERZEICHNIS
5.5.2 Mögliche Ursachen für das Vorkommen von Lungenadenomatose
in der Döhler Herde..................................................................................... 203
5.5.3 Konsequenzen............................................................................................ 206
6. SCHLUSSFOLGERUNGEN....................................................................... 209
7. ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................. 211
8. SUMMARY................................................................................................. 215
9. LITERATURVERZEICHNIS....................................................................... 219
10. ANHANG.................................................................................................... 259
I. Geräte und Verbrauchsmaterialien für die Probenentnahme...................... 259
A Gewebeproben................................................................................. 259
B Blutproben........................................................................................ 259
C Lungenspülproben............................................................................ 260
II. Geräte für die Laboruntersuchungen.......................................................... 261
III. Verbrauchsmaterialien für die Laboruntersuchungen................................. 263
IV. Gebrauchslösungen.................................................................................... 264
A Herstellung der Lösungen................................................................ 264
B Zutaten für Gebrauchslösungen....................................................... 266
V. Tabellenverzeichns..................................................................................... 267
VI. Abbildungsverzeichnis................................................................................ 273
VII. Danksagung................................................................................................ 275
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ad. us. vet. zum Gebrauch in der Veterinärmedizin
AMG Arzneimittelgesetz
atyp. atypisch / atypische
BAL bronchoalveoläre Lavage
BALF bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit
bidest. bidestillata (doppelt destilliert)
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
CA Capsid
cDNA copy-DNA
DEPC Diethylpyrocarbonat
dest. destillata
diNaEDTA Dinatrium-EDTA
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNAse Desoxyribonuklease
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
e.V. eingetragener Verein
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
eitr. eitrig
ELISA enzyme-linked immunosorbant assay
Entn. Entnahme
ESRV endogenous sheep retroviruses
et al. et alii
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
ggf. gegebenenfalls
ggr. geringgradig
GPI Glycosylphosphatidylinositol
Gr. Gruppe
h Stunde(n)
hämolys. hämolysierend / hämolysierende
HE Hämalaun-Eosin
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
hgr. hochgradig
histolog. histologisch
hn heminested
Hyal-2 Hyaluronidase 2
hyperplast. hyperplastisch / hyperplastisches
i.v. intravenös
J Jahr / Jahre
JSRV Jaagsiekte Retrovirus
Kat. Kategorie
kat.-eitr. katarrhalisch-eitrig
kb Kilobasen
klass. klassisch / klassische
klin. Verd. klinischer Verdacht
klin. klinisch
LA Lungenadenomatose
Ln. med. caud. Lymphonodus mediastinalis caudalis
Ln. Lymphonodus
Lok. Lokalisation
LTR long terminal repeat
LUFA Landwirtschaftliche Untersuchungs- und
Forschungsanstalt
m männlich
m/V Masse pro Volumen
MA Matrix
mgr. mittelgradig
Mon Monate
MPMV Mason-Pfizer Monkey Virus
MRI Moredun Research Institute
MwSt. Mehrwertsteuer
NC Nucleocapsid
n Anzahl
o.b.B ohne besonderen Befund
OD optische Dichte
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
OM Ohrmarke
OPA ovine pulmonary adenocarcinoma
orf open reading frame
p.a. pro analysi
PBS phosphate buffered saline
PCR Polymerase-Kettenreaktion
pers. persönlich / persönliche
prolif. proliferiert / proliferiertes
PVC Polyvinylchlorid
RNA Ribonukleinsäure
RNAse Ribonuklease
RT-PCR PCR nach reverser Transkription
SD Standardabweichung
sog. sogenannt
SPA sheep pulmonary adenomatosis
SU surface protein
TÄHAV Tierärztliche Hausapothekenverordnung
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA
TE Tris-EDTA
TM transmembrane protein
U.K. United Kingdom
unverd. unverdächtig
UV ultraviolett
VLH Verband Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V.
VNP Verein Naturschutzpark e.V.
VR1, VR2, VR3 variable Region 1, 2, 3
w, weibl. weiblich
zahlr. zahlreich
zit. zitiert
ZNS zentrales Nervensystem
zzgl. zuzüglich
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
EINLEITUNG 19
1. EINLEITUNG Die Lungenadenomatose des Schafes ist eine ansteckende, durch ein Retrovirus
(Jaagsiekte Retrovirus, JSRV) hervorgerufene Erkrankung (PERK et al. 1971;
HERRING et al. 1983; PALMARINI et al. 1999a), das Eigenschaften der Typ-B und
Typ-D Retroviren aufweist (VERWOERD et al. 1980a; SHARP et al. 1983; YORK et
al. 1991). Nach einer Inkubationszeit von in der Regel sechs bis zwölf Monaten
(DUNGAL et al. 1938; WANDERA 1968), die jedoch auch mehrere Jahre erreichen
kann (VERWOERD et al. 1985), führt sie durch die Ausbildung progressiver primärer
Lungentumoren unter dem Bild einer chronischen respiratorischen Erkrankung mit
verringerter Belastungsfähigkeit, erhöhter Atemfrequenz, gelegentlichem Husten,
rasselnden Atemgeräuschen, hochgradigem Nasenausfluß und chronischer
Abmagerung letztlich zum Tod. Eine Heilung ist nicht möglich (SHARP und DE LAS
HERAS 2000).
Die Verluste durch die Lungenadenomatose können in neu infizierten Herden bis zu
50 – 80% des Tierbestandes ausmachen (DUNGAL et al. 1938). In bereits
endemisch infizierten Herden belaufen sich die jährlichen Verluste durch die
Erkrankung auf 2 –10% des Bestandes. (SHARP und DE LAS HERAS 2000).
Innerhalb der Herdbuchzuchtherden der Grauen gehörnten Heidschnucken wurde
Lungenadenomatose 1992 erstmals eindeutig diagnostiziert (GANTER 1999) und
breitete sich in der relativ kleinen Zuchtpopulation schnell aus. Seit 1998 ist
nachweislich auch eine genetisch wertvolle Stammzuchtherde betroffen. Aufgrund
der mit der Erkrankung einhergehenden großen Verluste und der damit verbundenen
existentiellen Bedrohung für eine selten gewordene alte Nutztierrasse wurde im Jahr
1998 an der Klinik für kleine Klauentiere in Zusammenarbeit mit dem Verband
Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V. (VLH), dem Verein Naturschutzpark e.V.
(VNP), der Niedersächsischen Tierseuchenkasse und den örtlichen Veterinärämtern
ein groß angelegter Sanierungsversuch ins Leben gerufen. Ziel des Projektes war
zur Erhaltung des genetischen Potentials die Sanierung einer wertvollen
20 EINLEITUNG
Stammzuchtherde von der Lungenadenomatose mittels mutterloser Aufzucht der
Lämmer.
Die hier vorgestellten Untersuchungen befassen sich mit der Entwicklung eines
praxistauglichen Nachweisverfahrens, das mit höherer Sicherheit als die
herkömmlichen Verfahren (klinische Untersuchung, Röntgen, Lungenbiopsie,
zytologische und biochemische Untersuchung von Lungenspülproben) am lebenden
Tier die Überprüfung der Lungenadenomatose-Unverdächtigkeit einer solchen
sanierten Herde ermöglicht, sowie dessen Anwendung zur Untersuchung der
mutterlos aufgezogenen Herde auf Lungenadenomatose. Besondere
Berücksichtigung fand die Untersuchung von Lungenspül- und Blutproben mittels
Polymerase-Kettenreaktion sowie die Untersuchung der Schlachttiere aus der
mutterlos aufgezogenen Herde im Untersuchungszeitraum Herbst 2000 bis Ende
2003.
LITERATURÜBERSICHT 21
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1 Lungenadenomatose (LA)
2.1.1 Historisches
Der erste dokumentierte Bericht über das Vorkommen der Lungenadenomatose
stammt aus dem Jahr 1825 in Südafrika. Es handelte sich um den Brief eines
Distriktverwalters namens P. AUCAMP am Kap der Guten Hoffnung an eine
übergeordnete Behörde, in dem er innerhalb von drei Monaten den Verlust von über
800 Schafen aus seinem Distrikt durch eine von ihm als Jaagziekte (afrikaans:
Hetzseuche) bezeichnete, vermutlich ansteckende Erkrankung beklagte (TUSTIN
1969). Die erste wissenschaftliche Beschreibung der klinischen Symptome und
pathologischen Veränderungen aus dieser Region wurde 1891 durch HUTCHEON
vorgenommen (zit. nach MITCHELL 1915). In Europa wurden die Symptome und
charakteristischen Lungenläsionen erstmals durch DYKES und McFADYEAN (1888)
beschrieben, zu diesem Zeitpunkt jedoch als eine neuartige Lungenwurmerkrankung
angesehen. In Deutschland erfolgte die Erstbeschreibung durch EBER (1892, zit.
nach EBER 1899). Der Begriff Jaagsiekte wurde unter anderem von ROBERTSON
(1904) und zahlreichen anderen internationalen Autoren übernommen. Daneben
wurden im angloamerikanischen Sprachraum verschiedene Begriffe wie sheep
pulmonary adenomatosis (SPA), ovine pulmonary carcinoma und ovine bronchiolo-
alveolar carcinoma verwendet. In jüngster Vergangenheit wurde die Übereinkunft
getroffen, die Erkrankung künftig international als ovine pulmonary adenocarcinoma
(OPA) zu bezeichnen (YORK und QUERAT 2003). Im deutschen Sprachraum hat
sich der Begriff Lungenadenomatose eingebürgert (OLAFSSON 1939; PALLASKE
1954; JAKOB und KRAUSE 1965; SCHULZ et al. 1965; GEISEL 1975; PROSKE und
WIEGAND 1991).
22 LITERATURÜBERSICHT
2.1.2 Klinische Symptome
DUNGAL et al. (1938) betonen den sehr schleichenden Verlauf der Erkrankung, der
es in den Anfangsstadien selbst für einen erfahrenen Untersucher unmöglich macht,
infizierte Tiere als solche zu erkennen. Als erste klinische Symptome fallen
verminderte Belastungsfähigkeit, Kurzatmigkeit und erschwerte Atmung auf, die den
Tieren den Eindruck verleihen, als seien sie gehetzt worden. Zum Teil wird auch
Husten beobachtet (ROBERTSON 1904; MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938),
dieser wird jedoch von SHARP und ANGUS (1990) nicht als Hauptsymptom
angesehen. Sofern keine Sekundärinfektionen bestehen, zeigen die Tiere kein
Fieber. Die Futteraufnahme ist bis zuletzt erhalten, dennoch magern erkrankte Tiere
zunehmend ab. In fortgeschritteneren Erkrankungsstadien zeigen sie feucht-
rasselnde Atemgeräusche, die zuletzt auch ohne Phonendoskop wahrnehmbar sind,
sowie im Endstadium schaumig-serösen Nasenausfluß, hochgradige Dyspnoe sowie
Kachexie (MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938; DE MARTINI und YORK 1997;
SHARP und DE LAS HERAS 2000). Durch Anheben der Tiere an den
Hintergliedmaßen (sog. „Schubkarrentest“) können in der Regel ca. 30 – 50 ml bis
hin zu 300 ml dieser Lungenflüssigkeit gewonnen werden (SHARP und DE LAS
HERAS 2000).
Häufig kommt es im Endstadium zu Sekundärinfektionen, insbesondere durch
Mannheimia haemolytica (SHARP und DE LAS HERAS 2000). Es erkranken
überwiegend erwachsene Schafe mit einer Häufung der Fälle bei drei bis vier Jahre
alten Tieren (MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983), Tumoren wurden
jedoch in einzelnen Fällen bereits bei zwei Monate alten Lämmern oder erst im Alter
von bis zu elf Jahren festgestellt (SHARP und DE LAS HERAS 2000). DE LAS
HERAS et al. (2000) beschreiben sogar das Auftreten von Lungenadenomatose bei
einem drei Tage alten Lamm. Eine Heilung erkrankter Tiere ist nicht möglich
(DUNGAL et al. 1938; SHARP und DE LAS HERAS 2000).
LITERATURÜBERSICHT 23
2.1.3 Pathologie
2.1.3.1 Pathomorphologische Befunde
Das pathologisch-anatomische und histologische Bild der Lungenadenomatose ist in
fortgeschrittenen Fällen in der Regel eindeutig. Bei der Erkrankung kommt es zur
Ausbildung primärer Lungentumoren (EBER 1892, zit. nach EBER 1899), die heute
als Adenokarzinome eingestuft werden (GARCIA-GOTI et al. 2000; DE LAS HERAS
et al. 2003). Sie ist die häufigste Tumorerkrankung des Schafes. In einer
südafrikanischen Studie über das Vorkommen von Neoplasien bei Schafen handelte
es sich bei 436 von 673 Tumorerkrankungen (64,8%) um Lungenadenomatose.
Außer diesen wurden lediglich vier andere Tumoren des Respirationstraktes
festgestellt (BASTIANELLO 1982). Eine britische Studie kommt zu ähnlichen
Ergebnissen. Demnach handelte es sich bei 71,4% aller untersuchten Schaftumoren
um Lungenadenomatose. Andere Lungentumoren wurden in den 679 untersuchten
Fällen nicht beobachtet (ROSS und WILLIAMS 1983).
Der Tumorcharakter der Erkrankung war anfänglich umstritten. Gegner dieser
Theorie waren unter anderem COWDRY (1925a, b), PALLASKE (1929, 1954),
MÖSENFECHTEL (1937), McFADYEAN (1938) und EYLAU (1953), frühe
Befürworter sind neben EBER (1892, 1899) auch AYNAUD (1926), DE KOCK
(1929a) und SCHULZ et al. (1965).
Klassische Lungenadenomatose
Zu Beginn der Erkrankung sind einzelne Tumorknötchen zu finden. Mit
fortschreitender Erkrankung konfluieren die Läsionen, mit häufig vollständiger
Konsolidierung der rechten und linken Spitzenlappen, des Lobus medius, Lobus
accessorius und der cranioventralen Anteile der beiden Hauptlappen. In
fortgeschrittenen Fällen ist die Lunge deutlich vergrößert und im Vergleich zu
normalen Schaflungen bis zu fünfmal schwerer. Die neoplastischen Gebiete sind
fest, grau bis leicht rosa und gegenüber benachbartem, gesundem Lungengewebe
24 LITERATURÜBERSICHT
leicht erhaben. Häufig findet man im Grenzbereich eine schmale emphysematöse
Zone. Im Anschnitt zeigt sich schaumige Flüssigkeit in den Luftwegen, deren Menge
erhebliche Ausmaße annehmen kann (DUNGAL et al. 1938; SHARP und ANGUS
1990). Diese Form wird als klassische Lungenadenomatose bezeichnet (GARCIA-
GOTI et al. 2000).
Atypische Lungenadenomatose
Von dieser Ausprägung wird neuerdings eine sogenannte atypische Form der
Erkrankung abgegrenzt (GARCIA-GOTI et al. 2000), deren Charakteristika jedoch
auch in früheren Arbeiten bereits beschrieben wurden (CUBA CAPARO et al. 1961;
SCHULZ et al. 1965). Diese insgesamt seltenere, von SCHULZ et al. (1965) jedoch
als häufigere Form beschriebene Ausprägung zeigt sich in einzelnen bis multiplen,
wenige Millimeter messende Knötchen, die hart, rund bis sternförmig, weiß und
trocken sind (CUBA CAPARO et al. 1961; SCHULZ et al. 1965; GARCIA-GOTI et al.
2000).
2.1.3.2 Vorkommen von Metastasen
Gelegentlich kommt es zur Metastasierung in regionäre Lymphknoten, selten auch
zu extrathorakalen Metastasen (AYNAUD 1926; CUBA CAPARO et al. 1961; NOBEL
et al.1969; SHARMA et al. 1975a; SHARP und ANGUS 1990). GEISEL und
BOMHARD (1977) beziffern das Vorkommen von Metastasen aus den
Untersuchungen verschiedener internationaler Autoren auf 3 - 13% der untersuchten
Fälle. In einer neueren Arbeit an ostdeutschem Schlachthofmaterial wurden bei der
Untersuchung der Mediastinallymphknoten von 63 Tieren in fünf Fällen (7,9 %)
Lymphknotenmetastasen gefunden (PROSKE und WIEGAND 1991). Metastasen
wurden außerhalb der regionären Lymphknoten in der Pleura, der Skelett- und
Herzmuskulatur sowie verschiedenen inneren Organen beschrieben (NOBEL et
al.1969; WANDERA 1971; GEISEL und BOMHARD 1977; HUNTER und MUNRO
1983).
LITERATURÜBERSICHT 25
2.1.3.3 Sekundärinfektionen
Fortgeschrittene Fälle gehen regelmäßig mit Sekundärinfektionen einher, so dass
das pathologische Bild durch bakterielle Pleuropneumonien kompliziert werden kann
(DE KOCK 1929a; SHARP und ANGUS 1990). Doppelinfektionen mit JSRV und
Maedi-Visna-Virus sind nicht selten (SHARP und ANGUS 1990; GONZALEZ et al.
1993). In solchen Fällen fehlt in der Regel das klinische Symptom des hochgradigen
Nasenausflusses (GANTER 1996). Nach bisherigen Erkenntnissen können die
Stammzuchtherden der grauen gehörnten Heidschnucken als frei von Maedi-Visna
angesehen werden (GANTER 2004, pers. Mitteilung).
2.1.3.4 Histologie
Die Tumoren entsprechen histologisch einem papillären, seltener azinären oder
soliden bronchioloalveolären Adenokarzinom. Proliferationen von in der Regel eher
gutartigen histologischen Kriterien (wenig infiltratives Wachstum, geringe Mitoserate,
hoher Differenzierungsgrad der Tumorzellen) finden sich im Bereich der Alveolen
und des bronchiolären Epithels (EBER 1899; DE KOCK 1929a; GARCIA-GOTI et al.
2000; DE LAS HERAS et al. 2003). Sie entstehen durch Proliferation von Typ II
Pneumozyten sowie Clara-Zellen (NISBET et al. 1971; PLATT et al. 2002). Trotz der
beschriebenen Wachstumscharakteristika werden die Läsionen aufgrund der
wiederholt beschriebenen Metastasierungstendenz heute als Adenokarzinom
bezeichnet (DE LAS HERAS et al. 2003).
Die Läsionen sind gekennzeichnet von kubischen bis hochprismatischen
Tumorzellen und wenig Stroma, das in geringen Mengen mononukleäre Zellinfiltrate
und Bindegewebsfasern enthält. In benachbarten, noch nicht neoplastisch
veränderten Gebieten sind die Alveolen in charakteristischer Weise mit vergrößerten
Makrophagen gefüllt. Die atypischen Läsionen gleichen diesem Bild histologisch
weitgehend, weisen jedoch in der Regel eine hochgradige Infiltration mit
26 LITERATURÜBERSICHT
mononukleären Zellen sowie eine deutliche Vermehrung des Bindegewebes auf
(GARCIA-GOTI et al. 2000).
2.1.4 Ätiologie
2.1.4.1 Historisches
Verschiedenste Ursachen wurden im Laufe der Zeit für die Entstehung der typischen
Lungenveränderungen verantwortlich gemacht. DYKES und McFADYEAN (1888)
sowie McFADYEAN (1894, 1920), AYNAUD (1926) und PALLASKE (1929) hielten
Lungenwürmer für den ursächlichen Erreger. Chronische Reizungen (EBER 1899;
DE KOCK 1929b) sowie eine Protozoeninfektionen (EBER 1899; ROBERTSON
1904) wurden ebenfalls diskutiert. Eine mögliche Virusätiologie der Erkrankung
wurde zeitgleich von anderen Autoren postuliert (MITCHELL 1915; DUNGAL et al.
1938, 1946; McFADYEAN 1938; MACKAY und NISBET 1966; WANDERA 1968).
Den im Zusammenhang mit Lungenadenomatose isolierten Mykoplasmen (MACKAY
et al. 1963) und Chlamydien (WANDERA 1971) maß man keine ätiologische
Bedeutung bei (MACKAY und NISBET 1966; WANDERA 1971).
Die Virustheorie erhielt neue Nahrung durch den Nachweis von Herpesviren durch
MACKAY (1969a, b). MACKAY und NISBET (1971), MARTIN et al. (1976), DE
VILLIERS und VERWOERD (1980) sowie SCOTT et al. (1984) berichten jedoch von
gescheiterten Versuchen, mittels experimenteller Infektion mit ovinen Herpesviren
Lungenadenomatose-typische Läsionen zu erzeugen. Verschiedene Autoren
kommen daher übereinstimmend zu dem Schluß, dass das ovine Herpesvirus
zumindest nicht das alleinige ätiologische Agens bei der Entstehung der Tumoren
sein kann (MARTIN et al. 1976; DE VILLIERS und VERWOERD 1980; SCOTT et al.
1984; LIEBERMANN und ROHRBACH 1990). MARTIN et al. (1976) sowie DE
VILLIERS und VERWOERD (1980) diskutieren seine mögliche Rolle als Cofaktor bei
der Krankheitsentstehung.
LITERATURÜBERSICHT 27
Erste Hinweise auf die Beteiligung von Retroviren an dem Krankheitsgeschehen
erbrachten PERK et al. (1971) durch ultrastrukturelle Untersuchungen, in denen sie
Retrovirus-ähnliche Partikel nachweisen konnten. Diese Beobachtungen wurden in
weiteren Untersuchungen bestätigt (VERWOERD et al. 1980b; ANGUS et al. 1985).
Die letztgenannten Autoren bemerkten morphologische Ähnlichkeiten der
nachgewiesenen Partikel mit Typ B und Typ D Retroviren. Die morphologische
Beobachtung von Retroviren wurde gestützt durch den Nachweis von Aktivitäten der
reversen Transkriptase im Zusammenhang mit Partikeln, die für Retroviren typische
Dichten zeigten (PERK et al. 1974; MARTIN et al. 1976; VERWOERD et al 1980b;
HERRING et al. 1983). Die beiden letztgenannten Autorengruppen bestätigten
aufgrund biochemischer Untersuchungen ebenfalls die Ähnlichkeit des Virus mit Typ
B und Typ D Retroviren. Weitere morphologische, biochemische und serologische
Untersuchungen legten den Schluß nahe, dass es sich bei dem als Jaagsiekte
Retrovirus (JSRV) bezeichneten Erreger vermutlich um ein neues Virus ohne nähere
Verwandtschaft zu anderen Retroviren, evtl. sogar um eine neue Gattung innerhalb
der Familie der Retroviridae handelte (VERWOERD et al. 1983; PAYNE et al. 1983).
Dass durch eine experimentelle Infektion mit dem neu entdeckten Retrovirus die
Induktion Lungenadenomatose-spezifischer Läsionen sowie klinischer Erkrankungen
möglich ist, zeigten die Versuche verschiedener Autoren (MARTIN et al. 1976;
VERWOERD et al. 1980b; HERRING et al. 1983; SHARP et al. 1983). Die Frage
nach möglichen Cofaktoren stand jedoch nach wie vor im Raum (MARTIN et al.
1976; DE VILLIERS und VERWOERD 1980; DE MARTINI et al. 1987). Ebenso war
die pathogenetische Rolle JSRV-ähnlicher endogener Retroviren (ESRV) lange Zeit
unklar (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994; PALMARINI et al. 1996a; PALMARINI
et al. 1999a). Den letzten Beweis, dass wie vermutet allein JSRV und nicht ESRV
oder ein Zusammenwirken verschiedener Faktoren die Ursache für die Erkrankung
ist, erbrachten PALMARINI et al. (1999a) mithilfe von Infektionsversuchen mit einem
infektiösen molekularen Klon des exogenen Virus und konnten somit zeigen, dass
JSRV notwendig und ausreichend ist, um Lungenadenomatose zu induzieren.
28 LITERATURÜBERSICHT
2.1.4.2 Retroviridae Bei der Familie der Retroviren handelt es sich um behüllte RNA-Viren, deren
Erbinformation auf zwei identischen, 7 - 12 kb großen, linearen einzelsträngigen
RNA-Molekülen von positiver Polarität gespeichert ist. Das Virion hat einen
Durchmesser von etwa 100 bis 150 nm. Eine familientypische Eigenschaft ist ihre
Replikationsstrategie mithilfe des Enzyms reverse Transkriptase. Dieses Enzym
transkribiert die virale RNA in lineare doppelsträngige DNA, die anschließend in das
Genom der infizierten Zelle integriert wird (sog. provirale DNA). Nach seiner
Integration in das Wirtsgenom nutzt das Provirus die Mechanismen der Zelle für
seine Transkription und Translation.
Man unterscheidet anhand der Organisation des Virusgenoms zwischen einfachen
und komplexen Retroviren. Alle Retroviren weisen drei Hauptdomänen mit
Informationen für virale Proteine auf, gag (interne Strukturproteine für Matrix (MA),
Capsid (CA) und Nucleocapsid (NC)), pol (reverse Transkriptase und Integrase) und
env (Glycoproteine der Hülle: SU (surface) und TM (transmembrane)), sowie
zusätzlich eine kleinere Domäne (pro), die die virale Protease codiert. Terminale
Sequenzen am 5’- und 3’-Ende sind für die Regulation der viralen Genexpression
verantwortlich. Sie beinhalten eine Region R, die an beiden Enden des Genoms
vorkommt, sowie je eine Region U5 und U3, deren Vorkommen jeweils auf das 5’-
Ende bzw. das 3’-Ende des RNA-Stranges begrenzt ist. Im Zuge der reversen
Transkription erhält die resultierende provirale DNA an beiden Enden sogenannte
long terminal repeats (LTR), die Sequenzen von beiden Enden der viralen RNA in
der Reihenfolge U3-R-U5 enthalten (VOGT 1997; PALMARINI und FAN 2003).
Das Genom komplexer Retroviren weist zusätzliche Informationen für regulatorische
Proteine auf. Manche onkogenen Retroviren beinhalten inkorporierte Fragmente
bestimmter zellulärer Gene (c-onc oder proto-Onkogene), die bei ihrer Integration in
das Virusgenom Veränderungen erfahren haben und damit zu viralen Onkogenen
(v−onc) geworden sind (VOGT 1997; PALMARINI und FAN 2003). Anhand des
Vorhandenseins oder Fehlens solcher Onkogene und der damit verbundenen
LITERATURÜBERSICHT 29
Schnelligkeit der Tumorinduktion bzw. der Fähigkeit der Transformation von
Zellkulturen werden onkogene Retroviren historisch auch in akut transformierende
und nicht akute Retroviren eingeteilt (VOGT 1997; FAN et al 2003).
Weiterhin ist die Familie in sieben Gruppen eingeteilt, die den taxonomischen Rang
einer Gattung haben: alpha-, beta-, gamma-, delta- und epsilon-Retroviren sowie die
Lenti- und die Spumaviren (PALMARINI und FAN 2003).
2.1.4.3 Jaagsiekte Retrovirus (JSRV)
JSRV gehört aufgrund seiner Genomorganisation zu den einfachen Retroviren mit
long terminal repeats (LTR), gag, pol, pro und env Regionen. Strukturell bestehen
keine Hinweise auf bekannte Onkogene oder andere Sequenzen, die normalerweise
mit Tumorentstehung assoziiert sind (HECHT et al. 1996b; FAN et al. 2003). Es
nimmt in seinen Eigenschaften eine Zwischenstellung zwischen Typ-B und Typ-D
Retroviren ein (VERWOERD et al. 1980b; SHARP et al. 1983; YORK et al. 1991),
wobei die Sequenzen für das Capsid eher den Typ-D, die der env-Region eher den
Typ-B Retroviren zuzuordnen sind (DE MARTINI und YORK 1997). Heute wird das
Virus als ein beta-Retrovirus klassifiziert. Diese Gattung beinhaltet Viren vom B- und
D-Typ (PALMARINI und FAN 2003). Neben morphologischen Beobachtungen
sprachen auch serologische Untersuchungen aufgrund von Kreuzreaktionen mit
Antiseren gegen das Haupt-Coreprotein anderer beta-Retroviren wie des Mason-
Pfizer Monkey Virus, MPMV, (SHARP und HERRING 1983), Squirrel Monkey
Retrovirus und Langur Virus (KAJIKAWA et al 1990) schon früh für eine enge
antigenetische Verwandtschaft.
Die Sequenzierung des Genoms von JSRV gelang erstmals an einem
südafrikanischen Virusisolat (YORK et al. 1991, 1992). PALMARINI et al. (1999a)
sowie DE MARTINI et al. (2001) erstellten die Sequenzen von zwei weiteren Isolaten
(JSRV21 bzw. JSRVJS7). Weitere Teilsequenzen aus Isolaten verschiedener
geographischer Herkunft sind ebenfalls untersucht (HECHT et al. 1994; BAI et al.
1996, 1999; PALMARINI et al. 1996a; ROSATI et al. 2000).
30 LITERATURÜBERSICHT
Demnach ist die Länge des RNA-Genoms etwa 7,4 kb, die des Provirus ca. 7,8 kb.
Neben den klassischen retroviralen Genen gag, pro, pol und env wurde ein
zusätzlicher offener Leserahmen identifiziert, der als orf-x bezeichnet wird und
dessen Funktion bislang unbekannt ist (PALMARINI et al. 1999a; ROSATI et al.
2000; PALMARINI und FAN 2003).
Zwischen den bekannten Virusisolaten ist eine große Homologie erkennbar. Es wird
jedoch zwischen einem afrikanischen (Typ I) und einem europäischen/
nordamerikanischen Stamm (Typ II) unterschieden (BAI et al. 1996). So weisen die
beiden Isolate JSRV21 und JSRVJS7 eine 99,2%ige Übereinstimmung auf. Beide
stammen aus Großbritannien, wurden jedoch in einem Abstand von zehn Jahren
gewonnen. Diese beiden zeigen zu dem südafrikanischen Isolat eine
Übereinstimmung von 93,3% (PALMARINI und FAN 2003).
Eine Besonderheit des Virus scheint eine relativ hohe Resistenz gegenüber
Einflüssen zu sein, durch die die meisten anderen Retroviren inaktiviert werden
(PALMARINI und FAN 2003). So wurde der Titer eines mit einer JSRV-Hülle
versehenen retroviralen Vektors durch physikalische Einflüsse (Temperatur,
wiederholtes Einfrieren und Auftauen, Zentrifugation) nicht beeinfußt, während
derselbe Vektor mit Hüllproteinen des Murinen Leukämievirus eine 30 bis 40%ige
Titerreduktion aufwies. Eine Resistenz der Virushülle von JSRV wurde auch
gegenüber Surfactant (Survanta, ein in der Humanmedizin verwendetes
Surfactantpräparat boviner Herkunft) festgestellt, während dieselben Vektoren in der
Hülle anderer Viren durch Surfactant 80% an Aktivität einbüßten. Gegenüber
üblichen Desinfektionsmitteln zeigten JSRV-Vektoren keine erhöhte Resistenz.
(COIL et al. 2001).
Die Expression großer Mengen von JSRV erfolgt nahezu ausschließlich in den
infizierten Tumorzellen (PALMARINI et al. 1995), provirale DNA und in manchen
Fällen auch virale RNA konnte mit sensitiven Nachweismethoden jedoch auch in
verschiedenen lymphatischen Geweben und in Leukozyten nachgewiesen werden
(PALMARINI et al. 1996b; HOLLAND et al. 1999).
LITERATURÜBERSICHT 31
2.1.4.4 Endogene Retroviren
Endogene Retroviren sind in zahlreichen Wirbeltieren einschließlich des Menschen
nachgewiesen worden (HECHT et al. 1996a; VOGT 1997). Sie werden als Relikte
vergangener retroviraler Infektionen angesehen, die zu einem frühen evolutionären
Zeitpunkt in das Wirtsgenom integriert und bei Befall von Keimzellen weitervererbt
wurden (HECHT et al. 1996a, b; DE MARTINI et al. 2003).
Im Genom gesunder Schafe finden sich regelmäßig 15 bis 20 Kopien endogener
Gensequenzen (endogenous sheep retroviruses, ESRV), die der Sequenz von JSRV
sehr ähnlich sind (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994, 1996a). Endogene
retrovirale Sequenzen wurden auf mindestens 15 der 28 Schafchromosomen
identifiziert und sie sind augenscheinlich zufällig verteilt (CARLSON et al. 2003).
Lange Zeit war deren Rolle in der Pathogenese der Erkrankung unklar. Zusätzlich
standen sie der Entwicklung molekularbiologischer Nachweisverfahren für JSRV im
Wege. Dies änderte sich erst, als es durch die Arbeiten von PALMARINI et al.
(1996a) gelang, mithilfe unterschiedlicher Restriktionsenzym-Schnittstellen zwischen
endogenen retroviralen Sequenzen und dem exogenen JSRV zu unterscheiden. BAI
et al. (1996) erkannten Unterschiede zwischen JSRV und ESRV in der Sequenz der
U3-Region des LTR. Auf der Basis dieser Informationen gelang es, JSRV-spezifische
Primer für einen Virusnachweis mittels PCR zu entwickeln (PALMARINI et al.
1996b). Eine Sequenzanalyse ergab weitere Unterschiede zwischen JSRV und
ESRV in der env-Region (BAI et al. 1999).
ESRV werden in geringen Mengen in Bronchialepithel exprimiert (PALMARINI et al.
2000b). Der Hauptort der Genexpression scheint jedoch der weibliche Genitaltrakt zu
sein (PALMARINI et al. 2000b, 2001a). Eine Expression von ESRV findet auch in
fetalen Geweben statt (SPENCER et al. 2003). Eine ätiologische Bedeutung von
ESRV an der Entstehung der Lungenadenomatose wird als unwahrscheinlich
angesehen. Es wird jedoch die Möglichkeit der Induktion einer Immuntoleranz
gegenüber JSRV diskutiert, die das beobachtete Fehlen einer Immunantwort
(SHARP und HERRING 1983; ORTIN et al. 1998; SUMMERS et al. 2002) erklären
32 LITERATURÜBERSICHT
könnte (SPENCER et al. 2003; DE MARTINI et al. 2003; PALMARINI et al. 2004).
Dieser Theorie widersprechen nach der Meinung von PALMARINI die Ergebnisse
von SHARP et al. (unveröffentlicht, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003) nicht,
denen eine experimentelle Induktion der Antikörperbildung durch rekombinante
Proteine (CA und SU) in Adjuvans gelang, da ein Durchbrechen einer erworbenen
Immuntoleranz unter dem Einfluß von Adjuvantien wiederholt beschrieben wurde
(PALMARINI et al. 2004). Ein positiver Effekt der Expression von ESRV ist eine
kompetitive Hemmung des Eintritts von JSRV in die Zelle sowie des Austritts neuer
JSRV-Partikel aus der Zelle durch Besetzen von Rezeptoren durch ESRV
(PALMARINI et al. 2004).
2.1.5 Pathogenese
2.1.5.1 Pathogenese der klinischen Symptome
Durch das Tumorwachstum kommt es zu einer Verringerung der für den
Gasaustausch zur Verfügung stehenden Alveolarfläche. Klinische Symptome einer
Dyspnoe treten erst dann auf, wenn die Fläche des verdichteten Lungengewebes so
groß ist, dass ein angemessener Gasaustausch nicht mehr möglich ist. Dies ist
natürlicherweise zuerst in Belastungssituationen zu erkennen (WANDERA 1971;
VERWOERD et al. 1985). Nach den Untersuchungen von GANTER trat eine
respiratorische Partialinsuffizienz erst bei Tieren auf, bei denen mindestens 30% des
Lungenparenchyms makroskopisch tumorös entartet waren. Bei Feststellung einer
respiratorischen Globalinsuffizienz waren regelmäßig mindestens 50% der Lungen
makroskopisch tumorös verändert (GANTER 2004, pers. Mitteilung). Der Tod der
Tiere tritt letztlich durch Hypoxie, respiratorische Azidose und Herz-
Kreislaufversagen ein (VERWOERD et al. 1985).
Die tumorös entarteten Typ II Pneumozyten und Clara-Zellen haben einen hohen
Differenzierungsgrad und haben sich ihre sekretorische Aktivität erhalten (PLATT et
LITERATURÜBERSICHT 33
al. 2002; SHARP und DE MARTINI 2003). Typ II Pneumozyten sind die Produzenten
eines feinen Phospholipidfilms, des Surfactant, der in gesunden Lungen das
Alveolarlumen auskleidet. Diese Substanz wirkt als spezifisches Detergens und
reduziert die Oberflächenspannung der Alveolarwand um den Faktor fünf bis zehn.
Clara-Zellen sezernieren ein Sekret, das durch proteolytische Enzyme oder andere
Stoffe Schleim und Zelldetritus auflösen kann und somit einer Verlegung der
Luftwege entgegenwirkt (LEONHARDT 1990; LIEBICH 1993). Durch die große
Anzahl und sekretorische Aktivität der Tumorzellen kommt es mit zunehmender
Tumorausdehnung zu einer Ansammlung von Sekret (Lungenflüssigkeit) in den
Alveolen und Luftwegen (NISBET et al 1971; SHARP und DE MARTINI 2003; FAN et
al. 2003). Eine weitere Beeinträchtigung des Gasaustausches durch die
Flüssigkeitsansammlung und feucht-rasselnde, diskontinuierliche Atemgeräusche
sind die Folge, sowie im Endstadium einer unkomplizierten Erkrankung der Abgang
von großen Mengen Lungenflüssigkeit über die Nase, der durch den sog.
Schubkarrentest provoziert werden kann (SHARP und DE LAS HERAS 2000). In
manchen Fällen, z.B. bei Sekundärinfektionen (DUNGAL 1946; GANTER 1996) oder
der atypischen Lungenadenomatose (GARCIA-GOTI et al. 2000), kann dieses
Symptom jedoch auch fehlen.
2.1.5.2 Zelltropismus und mögliche Mechanismen der Onkogenese durch JSRV
Der Tropismus retroviraler Infektionen wird im wesentlichen durch Glycoproteine der
Hülle und die long terminal repeats (LTR) bestimmt. PALMARINI et al. (2000a)
konnten zeigen, dass JSRV LTR eine wichtige Rolle für den Tropismus dieser Viren
für epitheliale Zellen der Lunge einnimmt.
Die Mechanismen der Onkogenese nach einer Infektion mit JSRV sind noch nicht
abschließend geklärt. Das Genom von JSRV enthält keine bekannten Onkogene
oder andere bekannten, mit Tumorentstehung assoziierten Sequenzen (HECHT et
al. 1996b; FAN et al. 2003). Die Bedeutung der Region orf-x im Virusgenom, die
34 LITERATURÜBERSICHT
keine Homologie zu anderen bekannten retroviralen Genorten aufweist, wurde als
mögliches Onkogen diskutiert (COUSENS et al. 1999; FAN et al. 2003). Gegen diese
Theorie spricht sein paralleles Vorkommen in den nicht onkogenen endogenen
Retroviren (PALMARINI et al. 2000b; ROSATI et al. 2000) sowie die Tatsache, dass
die entsprechende Region im Genom des mit JSRV eng verwandten und ebenfalls
onkogenen Enzootic Nasal Tumour Virus, (ENTV, der Erreger des enzootischen
Siebbeinkarzinoms der Schafe) zwei Stop-Codons aufweist, damit also bei diesem
Virus kein offener Leserahmen im eigentlichen Sinne ist. Da vermutet wird, dass
beide Viren einen analogen Mechanismus der Onkogenese haben, erscheint die
Beteiligung von orf-x an diesem Prozeß unwahrscheinlich (COUSENS et al. 1999).
Eine andere prinzipielle Möglichkeit der Tumorentstehung durch Retroviren ist die
Aktivierung zellulärer proto-Onkogene durch die Insertion an der entsprechenden
Stelle in das Wirtszellgenom (VOGT 1997). Bei der Untersuchung der
Integrationsstellen von JSRV im Schafgenom verschiedener Tumorproben wurden
70 verschiedene Integrationsstellen auf 20 der 28 Schafchromosomen identifiziert.
Es scheint sich demnach hierbei um eine zufällige Verteilung ohne Bedeutung für die
Tumorentstehung zu handeln (FAN et al. 2003).
Die Eigenschaft der raschen Tumorinduktion insbesondere nach experimenteller
Infektion von neugeborenen Lämmern (SHARP et al. 1983) deutet darauf hin, dass
JSRV den akut transformierenden Retroviren zuzuordnen ist (FAN et al. 2003).
Weitere Hinweise hierauf und auf das Vorhandensein eines Onkogens liefert die
gelungene Transformation muriner Fibroblastenzellkulturen (NIH 3T3-Zellen)
(MAEDA et al. 2001). Diese Autorengruppe konnte orf-x endgültig als mögliches
Onkogen ausschließen, lieferte jedoch Hinweise, dass JSRV Hüllproteine für die
Transformation verantwortlich sind. Als JSRV-Rezeptor in der Zellmembran wurde
Hyaluronidase 2 (Hyal-2) identifiziert. Dieses Protein ist in die Membran mithilfe einer
Glycosylphosphatidylinositol-Verbindung (GPI) eingebaut, welche häufig an der
zellulären Signalübertragung beteiligt ist (RAI et al. 2001). Hyal-2 wird als mögliches
Tumorsuppressorgen angesehen (RAI et al. 2001; FAN et al. 2003).
LITERATURÜBERSICHT 35
FAN et al. (2003) diskutieren auf der Grundlage dieser Ergebnisse drei mögliche
Mechanismen einer Hüllprotein-induzierten Onkogenese durch JSRV:
1. Bindung von JSRV Hüllprotein (SU) an Hyal-2 auf der Zelloberfläche. Dies
könnte die mögliche tumorunterdrückende Funktion der Hyal-2 ausschalten.
Eine zweite Möglichkeit ist eine Wachstumsstimulation nach Bindung an Hyal-
2 durch Signalübertragung in das Zellinnere über GPI.
2. Bindung von JSRV SU an ein anderes Protein der Zellmembran (nicht Hyal-2)
und Stimulation des Zellwachstums durch dieses andere Membranprotein.
3. Bindung des Transmembranproteins (TM) von JSRV mithilfe seines
zytoplasmatischen Endes an ein zytoplasmatisches Protein, das wiederum
Zellwachstum induziert.
PALMARINI et al. (2000b) beschrieben weitreichende Homologien in der Sequenz
der endogenen Retroviren mit der des JSRV. Zwei variable Regionen (VR1 und VR2)
wurden innerhalb des gag Gens, eine weitere (VR3) innerhalb des env Gens
identifiziert. Die Region VR3 codiert unter anderem für das zytoplasmatische Ende
des Transmembranproteins (TM) der Virushülle. Anhand in vitro hergestellter
chimärischer Virushüllen, die einerseits endogenes TM und exogenes SU enthielten
und umgekehrt, wurde die Transformationskapazität dieser Chimären in murinen
Fibroblastenzellkulturen überprüft. Eine Transformation wurde lediglich durch die
Kombination exogenes TM – endogenes SU, nicht aber durch die Kombination
endogenes TM – exogenes SU induziert. Eine weitere Chimäre, die in einer
ansonsten ausschließlich exogenen Hülle lediglich den durch VR3 codierten Teil des
TM-Proteins endogener Herkunft enthielt, konnte ebenfalls keine Transformation der
Zellen hervorrufen (PALMARINI et al. 2001b). Das exogene TM und insbesondere
die exogene VR3-Region sind folglich notwendig für eine Zelltransformation
(PALMARINI et al. 2001b; LIU et al. 2003). Weitere Versuche konnten zeigen, dass
das 141 Aminosäuren lange Carboxy-terminale Ende des exogenen TM-Proteins für
eine Transformation von Fibroblastenzellkulturen ausreichend ist (CHOW et al.
2003). Der genaue Mechanismus der Zelltransformation durch JSRV TM ist derzeit
Objekt intensiver Untersuchungen an verschiedenen in-vitro-Modellen (FAN et al.
36 LITERATURÜBERSICHT
2003; CHOW et al. 2003; DANILKOVICH-MIAGKOVA et al. 2003; MAEDA et al.
2003; ZAVALA et al. 2003), jedoch noch nicht abschließend geklärt. CHOW et al.
(2003) äußern die Vermutung, dass für eine Onkogenese in vivo zusätzlich zur
Expression von JSRV TM weitere Faktoren nötig sind.
2.1.6 Epidemiologie
2.1.6.1 Verbreitung
Mit Ausnahme von Australien und Neuseeland ist die Lungenadenomatose in einer
Vielzahl von Ländern auf allen Kontinenten verbreitet. (SHARP und DE LAS HERAS
2000). Aus den beiden letztgenannten Ländern wurde jeweils ein Fallbericht bekannt,
in dem bei einem Einzeltier ein Adenom der Lunge diagnostiziert wurde. In beiden
Fällen gehen die Autoren jedoch von einer nicht-infektiösen Ursache der
Veränderungen aus (DALEFIELD und ALLEY 1988; HOOPER und ELLARD 1995).
Island ist seit 1952 durch radikale Eradikationsmaßnahmen ebenfalls frei von
Lungenadenomatose (SIGURDSSON 1958; PALSSON 1985).
2.1.6.2 Verluste in infizierten Herden
Die Verluste durch die Lungenadenomatose können in neu infizierten Herden bis zu
50 bis 80% des Tierbestandes erreichen (DUNGAL et al. 1938). In bereits endemisch
infizierten Herden belaufen sich die jährlichen Verluste durch die Erkrankung auf
2 - 10% des Bestandes. Etwa 50% aller Todesfälle sind in solchen Beständen mit
Lungenadenomatose assoziiert und bei bis zu 20% der aus einer Herde
aussortierten Schlachtschafe liegt die Erkrankung vor (SHARP und DE LAS HERAS
2000).
LITERATURÜBERSICHT 37
2.1.6.3 Übertragungswege
Die Einschleppung in Bestände erfolgt durch Zukauf von bzw. Kontakt mit infizierten
Tieren. Auf dem Wege des engen Kontaktes mit infizierten Tieren erfolgt auch die
Ausbreitung innerhalb eines einmal infizierten Bestandes, wobei die Übertragung
auch in der Inkubationszeit möglich ist (MITCHELL 1915; DUNGAL et al. 1938). In
der Außenwelt ist das Virus nur kurze Zeit lebensfähig (VERWOERD 1990).
Die Übertragung erfolgt überwiegend aerogen (DUNGAL et al. 1938, 1946; TUSTIN
1969; WANDERA 1971; DE LAS HERAS et al. 2003), wobei sowohl die Inhalation
virushaltiger, zellfreier Aerosole als auch die Transplantation von Tumorzellen mit
ausgehustetem Lungensekret möglich sind (VERWOERD und DE VILLIERS 1980).
Die intrauterine Übertragung wurde lange Zeit aufgrund verschiedener Experimente
und Beobachtungen als unwahrscheinlich angesehen (DUNGAL 1946; TUSTIN
1969; VERWOERD 1990). Der Erregernachweis in fetalen Geweben sowie die
Beschreibung eines JSRV-assoziierten Tumors bei einem drei Tage alten Lamm (DE
LAS HERAS et al. 2000) lässt jedoch auch einen intrauterinen Übertragungsweg
möglich erscheinen. Eine orale Übertragung kann nach derzeitigem Kenntnisstand
ebenfalls nicht völlig ausgeschlossen werden (DE LAS HERAS et al. 2003).
2.1.6.4 Inkubationszeit und Altersverteilung
In neu infizierten Herden scheint die Inkubationszeit unter natürlichen Bedingungen
etwa sechs bis acht Monate zu betragen (DUNGAL et al. 1938). Andere Autoren
postulieren eine Inkubationszeit zwischen neun Monaten und drei Jahren
(MARKSON und TERLECKI 1964; VERWOERD et al. 1985). Unter natürlichen
Bedingungen erkranken daher selten Tiere, die jünger sind als sieben bis neun
Monate. Eine Häufung der Fälle wird im Alter von drei bis vier Jahren beschrieben
(MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und DE LAS HERAS 2000).
Aufgrund experimenteller Übertragungsstudien scheinen alle Altersgruppen für die
Infektion empfänglich zu sein (DE LAS HERAS et al. 2003), die Effektivität
38 LITERATURÜBERSICHT
experimenteller Übertragungsversuche nimmt nach den Beobachtungen von
VERWOERD (1990) jedoch mit zunehmendem Alter ab, so dass er vermutet, dass
natürliche Infektionen hauptsächlich im Lämmeralter vorkommen. Nach
intratrachealer Inokulation von Tumorgewebe oder Lungenflüssigkeit in einige
Monate alte Lämmer oder erwachsene Schafe betrug die Inkubationszeit bis zum
Auftreten klinischer Erkrankungen fünf bis zwölf Monate (TUSTIN 1969; WANDERA
1971; MARTIN et al. 1976). Bei Verwendung gefroren gelagerten Materials wurde
nach 14 Monaten nur eine beginnende Tumorentwicklung festgestellt
(SIGURDSSON 1958). Nach intratrachealer Infektion unter 24 Stunden alter Lämmer
mit konzentrierter Lungenflüssigkeit reduzierte sich die Inkubationszeit auf drei bis
sechs Wochen, in Einzelfällen sogar auf vier bis sechs Tage (SHARP et al. 1983).
2.1.6.5 Begünstigende Faktoren / genetische Disposition, Resistenz-entwicklung und Immunreaktion
DUNGAL et al. (1938), MARKSON und TERLECKI (1964), sowie MACKAY und
NISBET (1966) weisen auf bestimmte Haltungs- und Managementfaktoren hin, die
die Ausbreitung der Erkrankung innerhalb einer Herde begünstigen. Hierzu gehören
z.B. die winterliche Aufstallung in kleinen, schlecht belüfteten Ställen, wie sie zu
Zeiten des großen Seuchenzuges im Island der 30iger Jahre üblich war, ein
regelmäßiges nächtliches Aufstallen oder Zusammentreiben in Pferchen, zum
Beispiel zum Zwecke des Melkens oder die längerfristige Stallhaltung unter
intensiven Produktionsbedingungen.
Verschiedene Autoren diskutieren eine mögliche Rassedisposition (DUNGAL et al.
1938; HUNTER und MUNRO 1983; VERWOERD 1990) oder sogar familiäre
Einflüsse (DE KOCK 1958; TUSTIN 1969). Demnach scheinen bestimmte Rassen
oder Bockfamilien resistenter zu sein als andere (SHARP und ANGUS 1990).
VERWOERD (1990) schildert ein Experiment, bei dem gleichgeschlechtliche
Zwillingslämmer unter identischen Bedingungen mit JSRV infiziert wurden. Eines
entwickelte innerhalb von sechs Wochen eine klinische Erkrankung, an der es starb,
LITERATURÜBERSICHT 39
das zweite Tier zeigte nach Ablauf von zwei symptomlosen Jahren lediglich einzelne
kleine Tumorknötchen in der Lunge. Er schließt daraus, dass manche Individuen
eine erhöhte Resistenz gegenüber der Erkrankung aufweisen oder entwickeln.
Es bestehen klinische Hinweise darauf, dass sich in infizierten Herden eine gewisse
Resistenz gegenüber der Erkrankung einstellt. Während die Verluste in neu
infizierten Herden zu Beginn mit 50 – 60% exorbitant hoch sein können, pendeln sie
sich im Verlauf der Jahre meist zwischen 5% und 10% ein (TUSTIN 1969;
VERWOERD et al. 1985). In Kenia wurde ein Abfall der Mortalität von zunächst
durchschnittlich 30% auf 1 – 5% beobachtet (WANDERA 1971). Als mögliche
Ursachen für dieses Phänomen kommen eine vermutlich immunologisch bedingte
Resistenzentwicklung der Tiere durch persistierenden Erregerkontakt in endemisch
infizierten Herden (TUSTIN 1969; VERWOERD 1990), eine Auslese in Richtung
genetisch widerstandsfähigerer Individuen oder Änderungen in Haltung und
Management, die im Laufe der Zeit aufgrund des Vorhandenseins der Erkrankung in
den betroffenen Herden eingeführt wurden, in Frage (WANDERA 1971).
Der Nachweis humoraler Antikörper ist bei natürlicher und experimenteller Infektion
bislang nicht gelungen (SHARP und HERRING 1983; VERWOERD 1990; ORTIN et
al. 1998; SUMMERS et al. 2002). Frühe Impfversuche waren nicht erfolgreich
(TUSTIN 1969). Eine experimentelle Induktion der Antikörperbildung durch
rekombinante Proteine (CA und SU) in Adjuvans gelang jedoch SHARP und
Mitarbeitern (unveröffentlicht, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003). Ob diese
eine protektive Wirkung haben, bedarf weiterer Untersuchungen. SUMMERS et al.
(2002) beobachteten bei JSRV-infizierten Lämmern eine reduzierte
lymphoproliferative Antwort auf die Stimulation mit bestimmten mitogenen
Substanzen, so dass die Autoren eine mögliche immunsuppressive Funktion von
JSRV postulieren. Veränderungen im Differentialzellbild bei natürlichen
Krankheitsfällen konnten bei experimentell infizierten Tieren nicht nachvollzogen
werden. Die Autoren führen diese auf unter natürlichen Bedingungen häufig
vorkommende Sekundärinfektionen zurück (SUMMERS et al. 2002).
40 LITERATURÜBERSICHT
2.1.6.6 Befall anderer Tierarten
A Ziegen
Bereits HUTCHEON (1905, zitiert nach MITCHELL 1915) äußerte den Verdacht,
dass auch Ziegen an Lungenadenomatose erkranken können. Dies wurde durch
anekdotische Berichte, z.B. aus Peru (CUBA CAPARO et al. 1961) und Ungarn
(GLAVITS et al. 1996) bestätigt. In diversen Regionen Indiens wurden von
verschiedenen Autoren Untersuchungen an Schlachtorganen und natürlich
verendeten Ziegen vorgenommen. Aus einem Untersuchungsgut von mehreren
hundert bis mehreren tausend Schlachtlungen wurden Prävalenzen zwischen 0,45%
und 0,58 % ermittelt (BHAGWAN und SINGH 1972; BANERJEE und GUPTA 1979;
DADHICH und SHARMA 1995). Lungenadenomatose-typische Läsionen wiesen
auch 0,72% der natürlich verendeten Ziegen auf (SRIRAMAN et al. 1982). Aus
Griechenland wurde von einem Vorkommen von 0,21% bei 1410 Schlachtziegen
berichtet (STEFANOU et al. 1975).
Die experimentelle Übertragung von Lungenadenomatose auf Ziegen ist
verschiedenen Autoren ebenfalls gelungen. Sie berichten jedoch nach einer
experimentellen Infektion übereinstimmend vom Fehlen klinischer Erscheinungen
sowie lediglich dezenten pathologisch-anatomischen Veränderungen, die dem Bild
der atypischen Form der Lungenadenomatose des Schafes glichen (SHARMA et al.
1975b; SHARP et al. 1986; TUSTIN et al. 1988). Ziegen scheinen demnach
gegenüber Lungenadenomatose wesentlich resistenter zu sein als Schafe. (SHARP
und DE MARTINI 2003). Dies wird auch durch Beobachtungen in den
Heidschnuckenherden des Vereins Naturschutzpark e. V. (VNP) bestätigt. Bei den in
den drei Gebrauchsherden mit den Schafen unter gleichen Bedingungen gehaltenen
Ziegen sind bislang trotz zum Teil extrem hoher Inzidenz und Verlustrate bei den
Schafen klinische Erkrankungen bei Ziegen noch nie beobachtet worden
(KOOPMANN 2004; GANTER 2004, pers. Mitteilungen). In Einzelfällen können nach
LITERATURÜBERSICHT 41
natürlicher Infektion jedoch auch bei Ziegen klinische Symptome beobachtet werden
(GLAVITS et al. 1996; GANTER 2004, pers. Mitteiung).
B Mufflons
Neben Ziegen ist auch die natürliche Übertragung auf Mufflons (Ovis musimon)
belegt. Diese erfolgte akzidentell durch Kontakt von zur Auswilderung vorgesehenen
Mufflons zu einer JSRV-infizierten Schafherde auf Sardinien. Nach Auswilderung
dieser Tiere ist die Erkrankung nun auch in der Wildpopulation der Mufflons
Sardiniens verbreitet (SANNA et al. 2001).
C Andere Tierarten
Andere Tierarten oder der Mensch erkranken nach derzeitigem Kenntnisstand nicht
an Lungenadenomatose. Die experimentelle Übertragung auf kleine Labortiere ist
lediglich durch subkutane Injektion von Tumormaterial in Nacktmäuse gelungen
(DUNGAL 1946; COETZEE et al. 1976; VERWOERD und DE VILLIERS 1980).
2.1.7 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in Deutschland
In Deutschland wurde Lungenadenomatose erstmals durch EBER (1892; zit. nach
EBER 1899) beschrieben. In den Jahren 1891 bis 1895 stellte er bei insgesamt 21
Schlachtlungen bzw. Schlachtlungenteilen von Schafen multiple Adenome fest,
deren detaillierte Beschreibung mit dem pathologisch-anatomischen und
histologischen Bild der Lungenadenomatose übereinstimmt (EBER 1899). In den
folgenden Jahrzehnten folgen anekdotische Berichte über einzelne Fälle
(MÖSENFECHTEL 1937) oder seuchenartige Ausbrüche in einzelnen Herden
(EYLAU 1953; PALLASKE 1954; JAKOB und KRAUSE 1965). Die Einschleppung
der Lungenadenomatose nach Island mit der Folge eines verheerenden
42 LITERATURÜBERSICHT
Seuchenzuges geht auf die Einfuhr einer Gruppe von Karakul-Zuchtböcken aus
Deutschland im Jahr 1933 zurück, von denen vermutlich einer mit
Lungenadenomatose infiziert war (DUNGAL et al. 1938). Dieser Bock hatte etwa ein
halbes Jahr nach seiner Eingliederung in die später als erstes erkrankte Herde
Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung gezeigt und war von den sommerlichen
Gebirgsweiden nicht zurückgekehrt. Der Kadaver wurde nicht aufgefunden
(OLAFSSON 1939). MIESSNER (1939) betont, dass der Herkunftsbetrieb der
importierten Tiere unter steter tierärztlicher Kontrolle stand und eine der
Lungenadenomatose vergleichbare Erkrankung dort niemals beobachtet worden sei,
was von DUNGAL (1939) auf ein mögliches „verborgenes Dasein“ in einer schon
längere Zeit infizierten Population zurückgeführt wird.
Verschiedene Autoren haben das Vorkommen der Lungenadenomatose in
unterschiedlichen Regionen Deutschlands anhand von Schlachtorganen untersucht.
Im Einzugsgebiet des Schlachthofes München wurde bei der Untersuchung von 1000
Schlachtlungen überwiegend adulter Tiere kein Fall von Lungenadenomatose
diagnostiziert. Bayern wurde aufgrund dessen als frei von Lungenadenomatose
angesehen. Die in einer Lunge festgestellte, von den Verfassern als „bronchioläres
Adenom“ bezeichnete Veränderung wurde von diesen als ein spontaner, primärer
Lungentumor angesprochen (SEDLMEIER et al. 1966). Sie wies der Beschreibung
nach jedoch Ähnlichkeit mit den für Lungenadenomatose charakteristischen
Läsionen auf (WEILAND 1966). Im Jahr 1969 wurden auch aus diesem Bundesland
zwei Fälle von Lungenadenomatose berichtet (SCHIEFER und KAST 1969). Dass es
sich in Bayern keineswegs um eine ausgesprochen seltene Erkrankung handelt,
betonen GEISEL et al. (1973), die neben dem anekdotischen Nachweis der
Lungenadenomatose in Sektionsmaterial die systematische Untersuchung von
Schlachtlungen am Schlachthof München betrieben und bei 0,317% der
geschlachteten Tiere Lungenadenomatose nachweisen konnten. SCHULZ et al.
(1965) berichten von einem Vorkommen von acht Fällen in 1000 konfiszierten
Schlachtlungen der Schlachtstätten Hannover, Berlin und Hamburg. Hochgerechnet
auf die Gesamtzahl der geschlachteten Tiere entspricht dies etwa 0,2% der
LITERATURÜBERSICHT 43
Schlachtschafe. Im internationalen Vergleich liegt Deutschland damit nach
Zusammenstellungen von WEILAND (1966) sowie SCHULZ und WEILAND (1968)
im Mittelfeld. In Spanien wurden Prozentsätze von ca. 0,05 bis 0,08%, in Peru von
0,5 bis 0,6%, in Chile 0,1% sowie in der Sowjetunion 0,25% ermittelt. PROSKE und
WIEGAND (1990) fanden in 6738 untersuchten Lungen aus der Normalschlachtung
an sechs verschiedenen ostdeutschen Schlachtbetrieben bei 103 Tieren (1,5%)
Veränderungen aufgrund von Lungenadenomatose. Dabei bemerkten sie deutliche
regionale Unterschiede (zwischen 0,2 und 2,5%).
2.1.8 Vorkommen und Bedeutung der Lungenadenomatose in der Heidschnuckenzucht
Innerhalb der Herdbuchzuchtherden der Grauen gehörnten Heidschnucken wurde
Lungenadenomatose 1992 erstmals eindeutig diagnostiziert (GANTER 1999). Im
Jahre 1993 wurde die Erkrankung in einer Herde im Gebiet der Lüneburger Heide
festgestellt und breitete sich in der relativ kleinen Zuchtpopulation schnell aus. Seit
1998 sind nachweislich auch eine Stamm- und sieben Gebrauchsherden, die dem
Verband Lüneburger Heidschnuckenzüchter e.V. (VLH) angehören, betroffen. Als
Folge daraus wurde von seiten des Zuchtverbandes ein Überwachungsprogramm
anhand der verpflichtenden Untersuchung von Schlachtlungen ins Leben gerufen.
Die Beschickung der traditionellen Auktion in Müden/Örtze bleibt zur Verhinderung
der weiteren Ausbreitung in der Zuchtpopulation Lungenadenomatose-
unverdächtigen Stammzucht- und Herdbuchherden vorbehalten. Im Zuge dieses
Überwachungsprogrammes wurde festgestellt, dass ca. ein Viertel der etwa 11.500
registrierten Zuchtschafe aus Lungenadenomatose-positiven Herden stammt. Aus
den verfügbaren Daten zu Heidschnuckenschlachtungen im Raum Lüneburger Heide
und Südheide ergeben sich für unterschiedliche Herden positive LA-Befunde bei 1,5
bis 29% der Schlachttiere (KRÄMER 2001).
44 LITERATURÜBERSICHT
Nach den Beobachtungen in den betroffenen Heidschnuckenherden scheinen diese
gegenüber anderen Schafrassen wesentlich früher zu erkranken. So weisen
aufgrund persönlicher Beobachtungen (GANTER 2000; KOOPMANN 2000, pers.
Mitteilungen) etliche der routinemäßig im Alter von sieben bis zwölf Monaten
geschlachteten Lämmer bereits Symptome einer klinischen Lungenadenomatose
auf. Einige erreichen aufgrund einer Lungenadenomatose-Erkrankung selbst dieses
Alter nicht und verenden vorzeitig. KRÄMER (2001) konnte bei der Untersuchung
von 47 Lämmern, die im Rahmen des Sanierungsversuches mittels mutterloser
Aufzucht bei ihren Müttern in der infizierten Herde verblieben, im Alter von
fünfeinhalb bis acht Monaten in vierzehn Fällen (29,8%) Lungenadenomatose
feststellen. Von diesen Tieren waren bereits fünf (10,6%) klinisch erkrankt.
2.1.9 Diagnostik und Nachweisverfahren 2.1.9.1 Klinische Untersuchung
Der klinische Untersuchungsgang des Atemtraktes ist für das Rind ausführlich von
STÖBER (1990b) und PRINGLE (1992a) beschrieben. Er ist im Wesentlichen auf
das Schaf übertragbar (WORKU 1994; GANTER 1996). Für die klinische
Untersuchung stehen die Methoden der Adspektion, olfaktorischen Prüfung,
Palpation, Perkussion und Auskultation zur Verfügung (STÖBER 1990a).
Eine Erhöhung der Atemfrequenz und Intensität kann auch durch andere Ursachen
als eine respiratorische Erkrankung begründet sein. Hierzu gehören z.B.
Kreislaufinsuffizienz, Anämie, raumfordernde Prozesse im Bauchraum, metabolische
Azidose oder die Thermoregulation. Andere Ursachen respiratorischer Symptome
müssen daher durch eine gründliche Untersuchung des gesamten Tieres und aller
Organsysteme ausgeschlossen werden (STÖBER 1990b). Insbesondere beim Schaf
unterliegt die Atemfrequenz einer großen Variation. Die Atmung ist für das Schaf das
wichtigste Instrument der Thermoregulation und wird bei gesunden Tieren vor allem
durch die Umgebungstemperatur und den Grad der Bewollung beeinflusst. Bei
LITERATURÜBERSICHT 45
gesunden, geschorenen Merinoland- und Schwarzkopfschafen wurde bei einer
Umgebungstemperatur von unter 20°C eine Ruhefrequenz von durchschnittlich 53
(+/- 28) Atemzügen pro Minute ermittelt. Bei Heidschnucken lag dieser Wert bei 43
(+/- 23) Atemzügen pro Minute. Bewollte Schafe bei einer Temperatur von über 20°C
wiesen durchschnittliche Ruheatemfrequenzen von 79 (+/- 27, für Merino- und
Schwarzkopfschafe) bzw. 97 (+/- 29, für Heidschnucken) Atemzüge pro Minute auf
(YOUSSEF 1986).
Während der langen Inkubationszeit ist die klinische Diagnose der
Lungenadenomatose mit den derzeit zur Verfügung stehenden Mitteln nicht möglich.
Zum Zeitpunkt der ersten sichtbaren Krankheitserscheinungen sind in der Regel
bereits ausgedehnte Lungenläsionen vorhanden (MACKAY und NISBET 1966;
TUSTIN 1969; VERWOERD et al. 1985). Die klinische Verdachtsdiagnose gründet
sich dann auf die Anzeichen einer progressiven, nicht fieberhaften respiratorischen
Erkrankung, die mit fortschreitender Abmagerung bei erhaltener Freßlust einhergeht.
Atemnot, insbesondere nach Belastung, feucht-rasselnde (diskontinuierliche)
Atemgeräusche, die in fortgeschrittenen Fällen sogar ohne Phonendoskop
wahrnehmbar sind, und gelegentlich Husten sind weitere Symptome (siehe 2.1.2).
Pathognomonisch ist im Endstadium der Erkrankung die Ansammlung großer
Mengen Flüssigkeit im Respirationstrakt, die bei Anheben der Hinterbeine über die
Nasenlöcher abfließt (DUNGAL 1946). In manchen Fällen, z.B. bei
Sekundärinfektionen (DUNGAL 1946; GANTER 1996) oder der atypischen
Lungenadenomatose (GARCIA-GOTI et al. 2000), kann dieses Symptom jedoch
auch fehlen.
46 LITERATURÜBERSICHT
2.1.9.2 Serologie und Virusanzüchtung
Das Fehlen einer nachweisbaren und diagnostisch nutzbaren Antikörperreaktion
(SHARP und HERRING 1983; ORTIN et al. 1998; SUMMERS et al. 2002) machen
einen frühzeitigen Nachweis einer stattgefundenen Infektion mit JSRV derzeit
unmöglich. Die zunächst vermutete diagnostische Verwertbarkeit eines
serologischen Tests (ELISA) auf der Grundlage einer Kreuzreaktivität gegen das
Major Core Protein p27 des Mason Pfizer Monkey Virus (KWANG et al. 1995) wurde
von ORTIN et al. (1998) widerlegt.
Obwohl es verschiedenen Arbeitsgruppen gelungen ist, Tumorzellen zu kultivieren
(TUSTIN und GEYER 1971; COETZEE et al. 1976; VERWOERD et al. 1980a;
SHARP et al. 1985; JASSIM et al. 1987; DE MARTINI et al. 2001) und für
verschiedene Zwecke zu nutzen, ist es bis 1999 nicht gelungen, Zellkulturen mit
JSRV zu infizieren. PALMARINI et al. (1999b) gelang dies für verschiedene ovine
Zellinien mithilfe eines in vitro hergestellten infektiösen Klons von JSRV21. Die in vitro
infizierten Zellinien produzierten jedoch nur äußerst geringe Virusmengen
(PALMARINI et al 1999b). Die Infektion von Zellkulturen mit Feldvirus ist bislang
nicht gelungen. Ein Virusnachweis mit klassischen virologischen Methoden durch in-
vitro-Infektion von Zellkulturen ist daher nach wie vor nicht möglich. Dies ist
hauptsächlich auf die extreme Spezialisierung von JSRV auf die Expression in Typ II
Pneumozyten und Clara-Zellen zurückzuführen, die sehr schwierig zu kultivieren sind
und ihren Differenzierungsstatus in der Zellkultur innerhalb kürzester Zeit einbüßen
(PALMARINI et al. 2000a).
2.1.9.3 Thoraxperkussion Nach den Untersuchungen von GANTER (1996) wird die Thoraxperkussion als eine
wenig sensitive und wenig spezifische Untersuchungsmethode angesehen. Neben
der praktischen Einschränkung, dass hierfür beim Schaf eine großflächige Schur des
Thorax nötig ist, wurden zwar bei allen untersuchten klinischen
LITERATURÜBERSICHT 47
Lungenadenomatose-Fällen Dämpfungsbezirke festgestellt. Auch in anderen
Untersuchungsgruppen (an anderen Lungenerkrankungen leidende Schafe) war dies
jedoch der Fall, und beginnende Läsionen unter Faustgröße bleiben bei dieser
Untersuchung unerkannt (GANTER 1996).
2.1.9.4 Ultraschalluntersuchung
Die transkutane Ultraschalluntersuchung ist eine vergleichsweise preisgünstige
Methode, die mithilfe tragbarer Ultraschallgeräte auch problemlos in Beständen
durchgeführt werden kann (SCOTT und GESSERT 1998). Durch die
Ultraschalluntersuchung des Thorax ist es möglich, an geschorenen Tieren
subpleural gelegene Veränderungen wie z. B. Abszesse oder eine Verdichtung des
Lungengewebes darzustellen (PUSTERLA et al. 1995; SCOTT und GESSERT
1998). Bei lungengesunden Tieren läßt sich das Lungenparenchym aufgrund der
Reflektion der Schallwellen nicht darstellen. Beurteilt werden können jedoch die
verschiedenen Schichten der Brustwand und die Pleura (BRAUN et al. 1996; SCOTT
und GESSERT 1998). In fortgeschrittenen Fällen mit ausgedehnten Tumoren sowie
zur gezielten Entnahme von Lungenbiopsien (MATHIS und SUTTERLÜTTI 1990;
PUSTERLA et al. 1995) kann die Ultrasonographie daher hilfreich sein. In tieferen
Gewebeschichten gelegene Tumoren sind jedoch ultrasonographisch nicht
darstellbar (REEF et al. 1991; SCOTT und GESSERT 1998), was diese
Untersuchungsmethode neben dem erheblichen Aufwand (Schur, Zeitaufwand) für
eine zuverlässige Frühdiagnostik ungeeignet erscheinen lässt.
2.1.9.5 Endoskopie
Mithilfe flexibler Endoskope ist eine Beurteilung von Nase, Kehlkopf, Trachea und
Bronchien möglich. Die normale Trachealschleimhaut des Wiederkäuers ist
feuchtglänzend, weißlich bis graurosa und von feinen Blutgefäßen durchzogen
(STÖBER 1990b; PRINGLE 1992b). Die Bronchoskopie und fiberoptische
48 LITERATURÜBERSICHT
Probenentnahme ist für alle großen Haustierarten einschließlich des Schafes
beschrieben und vielfach angewendet worden (BEGIN et al. 1981; WHITWELL und
GREET 1984; PRINGLE und VIEL 1986; PRINGLE et al. 1988; HEILMANN et al.
1988; WORKU 1994; GANTER 1996; VALARCHER et al. 1999). Nach GANTER
(1996) ist die Bronchoskopie beim Schaf am stehenden, mithilfe eines Halfters und
durch einen Helfer fixierten Tier nach Lokalanästhesie der Nasenschleimhaut und
des Kehlkopfes einfach durchzuführen.
2.1.9.6 Bronchoalveoläre Lavage
Für den Erregernachweis bei Erkrankungen des unteren Respirationstraktes ist die
Entnahme von Tracheobronchialsekret oder Lungenspülproben einer
Nasentupferentnahme überlegen (McLAUGHLIN und MISKE 1980; KIMMAN et al.
1986; STÖBER 1990b; HOFMANN 1991; PRINGLE 1992b; ESPINASSE et al. 2001;
CALDOW 2001). Verschiedene Verfahren zur Probengewinnung sind beschrieben:
A Endoskopische Entnahme von Trachealsekret- und Lungenspülproben
Die Durchführung einer bronchoalveolären Lavage (BAL) mithilfe eines flexiblen
Endoskops bietet die Möglichkeit der gezielten Probenentnahme aus dem unteren
Respirationstrakt bei gleichzeitiger optischer Kontrolle. Das Verfahren ist nicht
invasiv und kann wiederholt an demselben Tier durchgeführt werden (HEILMANN et
al. 1988). Eine ausführliche Literaturübersicht über die Anwendung der BAL beim
Schaf einschließlich eines detaillierten Methodenvergleichs ist bei GANTER (1996)
zu finden. Derselbe (1993; 1996) standardisierte die fiberoptische Entnahme von
Lungenspülproben beim Schaf und führte umfangreiche zytologische, biochemische
und mikrobiologische Untersuchungen an Lungenspülproben von gesunden und an
verschiedenen Lungenerkrankungen (einschließlich der Lungenadenomatose)
leidenden Schafen durch. Unter Lokalanästhesie der Nasenschleimhaut und des
Larynx zeigten die meisten Tiere wenig Abwehrverhalten. Bei allen Tieren wurde
LITERATURÜBERSICHT 49
eine Spülung des Bronchus trachealis mit insgesamt 100 ml körperwarmer, steriler
0,9%iger Kochsalzlösung in fünf Fraktionen durchgeführt. Nach Instillation jeder
Fraktion wurde die Spülflüssigkeit sofort mithilfe einer Vakuumpumpe wieder
abgesaugt. Bei klinisch gesunden Tieren betrug das Rückgewinnungsvolumen im
Mittel 71,8% (+12,8). Die Alveolarmakrophagen stellten mit 78-100% die größte
Zellfraktion, Lymphozyten (0-13%) und neutrophile Granulozyten (0-12%) waren in
geringen Mengen ebenfalls häufig nachweisbar. Trotz der Vorteile der hohen
Kontrollierbarkeit und Standardisierbarkeit der fiberoptischen Probenentnahme sind
ihrer breiten Anwendung aus Kostengründen in der Nutztierpraxis Grenzen gesetzt
(HEILMANN et al. 1988). WORKU (1994) wandte das endoskopische Verfahren als
Referenzverfahren zur Erprobung alternativer Probengewinnungstechniken aus dem
unteren Atemtrakt des Schafes an. Auch für andere Tierarten sind alternative
Techniken zur intravitalen Probenentnahme beschrieben (MANSMANN und KNIGHT
1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980; FOGARTY et al. 1983; HEILMANN 1988;
STÖBER 1990b; PRINGLE 1992b). Daneben wird in vielen Fällen für meist
wissenschaftliche Fragestellungen auch die postmortale Spülung exenterierter
Lungen genutzt (CORDIER et al. 1990; LEROUX et al. 1995; LEGASTELOIS et al.
1997; KIRAN et al. 2000).
B Transtrachealer Zugang
Der transtracheale Zugang zur Gewinnung von Sekret- oder Spülproben aus dem
unteren Atmungstrakt umgeht eine mögliche Probenkontamination aus der Nasen-
oder Maulhöhle (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980;
MAIR 1987; ESPINASSE et al. 1991; HOFMANN 1991; PRINGLE 1992b). Es ist
eine mit einfachen Mitteln und geringen Investitionskosten auch unter
Praxisbedingungen durchführbare Methode. Die gewonnenen Proben sind für den
kulturellen bakteriologischen und virologischen Erregernachweis geeignet
(ESPINASSE et al. 1991; PRINGLE 1992b). Die zytologische Untersuchung des
Trachealsekretes ist jedoch nicht immer aussagekräftig (WOOLUMS et al. 1991). Bei
50 LITERATURÜBERSICHT
Pferden, erwachsenen Rindern sowie Kälbern und Schafen ist die Entnahme
transtrachealer Spülproben unter Lokalanästhesie beschrieben. Mithilfe eines
Trokars wird nach chirurgischer Vorbereitung und subkutaner Infiltration mit einem
Lokalanästhetikum je nach Autor direkt oder erst nach Anlegen eines Hautschnittes
die Trachealwand zwischen zwei Knorpelspangen durchstoßen und ein
Plastikschlauch in das Tracheallumen eingeführt. Die Spülung erfolgt mit 10 - 30 (bis
100) ml steriler Kochsalzlösung, die Aspiration des Sekretes mit einer Pumpe oder
einer Spritze (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN und MISKE 1980;
STÖBER 1990b; HOFMANN 1991; ESPINASSE et al. 1991; PRINGLE 1992b;
WORKU 1994). Mögliche Komplikationen sind Blutungen, Husten, lokale Infektionen
oder ein lokalisiertes Emphysem (MANSMANN und KNIGHT 1972; McLAUGHLIN
und MISKE 1980; PRINGLE 1992b).
WORKU (1994) erprobte zwei verschiedene Techniken der transtrachealen
Probenentnahme beim Schaf und verglich sie mit bronchoskopisch entnommenen
Lungenspülproben. Einerseits wurde analog der beim Rind beschriebenen Technik
(McLAUGHLIN und MISKE 1980) nach transtrachealer Punktion eine Spülung mit
10 - 20 ml physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt. Parallel dazu wurde eine
transtracheale Zytobürsten-Probenentnahme untersucht. Von den 36 transtrachealen
Spülproben waren nur zwölf (33%) für die zytologische Untersuchung geeignet. Bei
17 Tieren (47%) konnte keine Spülflüssigkeit zurückgewonnen werden, sieben
Proben (19%) enthielten größere Blutbeimengungen. Von den 43 Zytobürstenproben
waren 25 (58%) für die zytologische Untersuchung geeignet (WORKU 1994).
C Nicht-invasive Techniken zur Entnahme von Lungenspülproben unter Feldbedingungen
Aufgrund des hohen materiellen Aufwandes ist die Anwendung der fiberoptischen
Probenentnahme in der Nutztierpraxis eingeschränkt (HEILMANN et al. 1988). Die
notwendige Zwischensterilisation des Instrumentariums limitiert die Anwendung
dieser Technik weiter, wenn zu einem Zeitpunkt Proben von mehreren Tieren
LITERATURÜBERSICHT 51
gewonnen werden sollen (HEILMANN et al. 1988; CALDOW 2001). Der invasive
Charakter der transtrachealen Techniken lässt dieses Verfahren für
Routineuntersuchungen ebenfalls weniger geeignet erscheinen (MAIR 1987;
CALDOW 2001).
Eine mit einfachen Mitteln am unsedierten Tier durchzuführende Methode zur
Gewinnung von Lungenspülproben wurde von FOGARTY et al. (1983) für das Kalb
beschrieben. Die Tiere wurden mit gestrecktem Kopf fixiert und ein Tubus mit einem
Innendurchmesser von 8 mm über die Nase in die Trachea eingeführt. Durch diesen
wurde eine 1,5 m lange Ernährungssonde mit einem Außendurchmesser von 6 mm
in die Trachea ein- und weiter vorgeschoben, bis das distale Ende der
Ernährungssonde in einem Bronchus steckenblieb. Es folgte die Spülung mit 180 ml
PBS in einer einzigen Fraktion. Die Spülflüssigkeit wurde dann mit einer Spritze
aspiriert. Das Rückgewinnungsvolumen betrug regelmäßig etwa ein Drittel des
eingesetzten Volumens. Auch nach wiederholter Spülprobenentnahme zeigten die
Kälber keine respiratorischen Symptome. Bei der systematischen histologischen
Untersuchung der Lungen konnten keine Läsionen nachgewiesen werden. Die
Ernährungssonde gelangte stets in den rechten Zwerchfellslappen (FOGARTY et al.
1983). KIMMAN et al. (1986) wandten diese Methode bei 98 lungenkranken Kälbern
an. Sie konnten von einem Spülvolumen von 60 ml regelmäßig zwischen 30 und
50 ml zurückgewinnen. Die Methode wird von ihnen als einfach und für
Feldbedingungen geeignet beschrieben. Eine Verschlechterung des Zustandes der
Kälber während oder nach der Probenentnahme wurde nicht beobachtet. CALDOW
(2001) betont die Notwendigkeit der Anwendung von Gleitgel, um ein Steckenbleiben
des inneren Tubus im äußeren Tubus zu verhindern.
HEILMANN et al. (1988) entwickelten eine Methode für die Entnahme von
Lungenspülproben am narkotisierten Kalb. Nach endotrachealer Intubation wurde
durch den Tracheotubus bzw. ein in die Luftröhre eingeführtes starres Endoskop ein
ca. 100 cm langer, 6 mm dicker Katheterschlauch eingeführt und mit bis zu fünf
Fraktionen zu 20 ml gespült. Die Aspiration der Spülflüssigkeit erfolgte ebenfalls über
eine Spritze.
52 LITERATURÜBERSICHT
2.1.9.6.1 Anwendung der BAL zur Diagnostik der Lungenadenomatose A Sekretzytologie
Das Differentialzellbild aus der nasal abfließenden Lungenflüssigkeit oder
bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit (BALF) kann zur Untermauerung einer
klinischen Verdachtsdiagnose genutzt werden. Zahlenmäßig überwiegen hier häufig
Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Ebenfalls regelmäßig anzutreffen sind
runde oder sphärische Haufen epithelialer Zellen sowie einzelne jugendliche Zellen.
Spezifisch für Lungenadenomatose sind allerdings lediglich Tumorzellhaufen
(GANTER 1996). NOBEL et al. (1970) konnten derartige Zellcluster in spontaner
Lungenflüssigkeit von sieben Schafen stets nachweisen. In 14 von 24 Fällen (58,3%)
mit fortgeschrittenen Tumoren wurden derartige Zellhaufen aus bronchoskopisch
gewonnenen Lungenspül- oder -sekretproben ebenfalls festgestellt (GANTER 1993).
KIRAN et al. (2000) konnten in 26 von 53 (49,1%) mithilfe des „Schubkarrentests“
gewonnenen Proben von Lungenflüssigkeit einzelne neoplastische Zellen oder
Tumorzellhaufen nachweisen. In postmortal an isolierten Schlachtorganen
gewonnenen Lungenspülproben wiesen die selben Autoren in allen 102 untersuchten
Fällen mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren Tumorzellcluster oder einzelne
neoplastische Zellen nach.
B Biochemische Untersuchung Darüber hinaus kann der klinische Verdacht durch den Nachweis einer erhöhten
Aktivität des Enzyms Alkalische Phosphatase in der BALF erhärtet werden. Dieses
wird von den tumorös veränderten Typ II Pneumozyten in großen Mengen produziert
(GANTER 1993). Der Nachweis einer Aktivität der Alkalischen Phosphatase von
>444 U/l in der epithelial lining fluid wies bei den untersuchten 42
Lungenadenomatose-positiven Tieren (davon 13 Tiere mit klinischer
LITERATURÜBERSICHT 53
Lungenadenomatose) eine Sensitivität von 51% und eine Spezifität von 90% auf
(GANTER 1996).
2.1.9.7 Röntgenuntersuchung
Weitere Möglichkeiten der intravitalen Diagnostik zur Absicherung einer klinischen
Verdachtsdiagnose ergeben sich aus der Röntgenuntersuchung des Thorax. Diese
ist bei kleinen Wiederkäuern und Kälbern problemlos durchführbar. Durch Vorziehen
der Vordergliedmaßen kann der gesamte Thorakalbereich röntgenologisch
dargestellt werden (PRINGLE 1992b). Gesunde Tiere weisen scharf abgegrenzte
Herz- und Zwerchfellschatten sowie eine nahezu vollständige Schwärzung des
Lungenfeldes auf. Im craniodorsalen und dorsalen Bereich ist das Lungenfeld durch
die Schulter- und Rückenmuskulatur geringgradig verschattet. Der spitzovale
Herzschatten erreicht caudoventral den Zwerchfellsschatten. Zudem sind regelmäßig
die Trachea, die beiden Hauptbronchien, die Vena cava cranialis und caudalis sowie
die Aorta und einige Lungengefäße darstellbar. Veränderte Befunde bei
lungenkranken Tieren beinhalteten je nach Art der Erkrankung Verdichtungsherde
(Verschattungen) unterschiedlichen Grades, Verteilungsmusters und
unterschiedlicher Abgrenzbarkeit, Bronchographie, sowie eine diffuse, eher granuläre
Strukturierung des Lungenparenchyms. Diese Befunde lassen oftmals zwar eine
Verdachtsdiagnose zu, eine ätiologische Diagnose kann hierdurch jedoch nicht
gestellt werden (GANTER 1996). Die Anwendung der Thoraxradiologie bleibt in der
Schafpraxis aufgrund des hohen apparativen Aufwandes wenigen wertvollen
Zuchttieren vorbehalten (SCOTT und GESSERT 1998).
GANTER (1993; 1996) konnte bei allen 24 untersuchten Lungenadenomatose-Fällen
Verschattungsherde in der Lunge nachweisen. In fortgeschrittenen Fällen waren in
der Regel große Lungenareale homogen verdichtet. Nach den Arbeiten von WYN-
JONES und CLARKSON (1984) können mithilfe der röntgenologischen
Untersuchung in der Lunge von Schafen Echinococcus-granulosus-Zysten von
54 LITERATURÜBERSICHT
>0,75 cm nachgewiesen werden. Demnach können verdächtige Läsionen schon früh
festgestellt, in diesem Stadium jedoch von Verdichtungen des Lungengewebes
aufgrund anderer Ursachen nicht mit Sicherheit abgegrenzt werden. Der hohe
apparative Aufwand macht dieses Untersuchungsverfahren für die Untersuchung
größerer Tierzahlen ungeeignet (GANTER 1996).
2.1.9.8 Lungenbiopsie
Die Entnahme von Lungenbiopsien ist entweder transbronchial unter endoskopischer
Sichtkontrolle (BEGIN et al. 1981) oder auf dem transkutanen Weg möglich
(PRINGLE und VIEL 1986; PRINGLE 1992b; PUSTERLA et al. 1995). Bei der
Verwendung großkalibriger Nadeln ist dieses Verfahren in der Humanmedizin mit
einer hohen Komplikationsrate von 10 - 30% an Pneumothorax und Blutungen
behaftet. Die ultraschallgeführte Feinnadelbiopsie wird bei peripheren
Lungentumoren jedoch als ein mit einer hohen diagnostischen Treffsicherheit und
geringen Komplikationen verbundenes Verfahren angesehen (MATHIS und
SUTTERLÜTTI 1990). PRINGLE (1992b) beschreibt die transthorakale
Lungenbiopsie auch beim Wiederkäuer als einen sowohl praktikablen als auch gut
tolerierten Eingriff, der unter Lokalanästhesie am wachen oder sedierten Tier
durchgeführt werden kann. PUSTERLA et al. (1995) gelang der intravitale Nachweis
der Lungenadenomatose durch die histologische Untersuchung einer unter
Ultraschallkontrolle gewonnenen Lungenbiopsie. Das untersuchte Tier war jedoch
bereits hochgradig klinisch erkrankt und bei der Sektion erwiesen sich ca. 75% des
Lungenparenchyms als tumorös verändert. Der invasive Charakter sowie die geringe
Wahrscheinlichkeit, in einem Feinnadelbioptat beginnende Läsionen bei einem
klinisch gesunden Tier nachweisen zu können, machen auch diese Methode für die
Frühdiagnostik der Lungenadenomatose ungeeignet.
LITERATURÜBERSICHT 55
2.1.9.9 Pathologie
Neben der pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung (siehe
2.1.3) stehen weitere Verfahren zum Nachweis der Virusätiologie der beobachteten
Läsionen zur Verfügung. Bereits DE KOCK (1929a) stellte fest, dass es
außerordentlich schwierig ist, sehr frühe Läsionen, die ohne makroskopisch
erkennbare Tumoren einhergehen, von entzündlich oder reaktiv bedingter
Hyperplasie des Bronchialepithels zu unterscheiden. Daran hat sich bis heute auch
für erfahrene Pathologen nichts geändert (VERWOERD 1990; BRÜGMANN 2004,
DE LAS HERAS 2004, pers. Mitteilungen).
Mit immunhistochemischen Verfahren kann die Virusätiologie der Läsionen durch
Nachweis viraler Antigene (CA und SU) abgesichert werden (PALMARINI et al. 1995;
GARCIA-GOTI et al. 2000; DE LAS HERAS 2004, pers. Mitteilung). SANNA et al.
(2001) führten auf der Basis der Arbeiten von PALMARINI et al. (1996b) einen
Nachweis mittels in-situ PCR. Neben den Tumorzellen wiesen auch die
Alveolarmakrophagen in den veränderten Regionen ein deutlich positives Signal auf.
2.1.9.10 Eignung der genannten Verfahren zur Kontrolle von Sanierungsverfahren
Die einzige praktikable Möglichkeit zur Kontrolle von Sanierungsverfahren stellen
bislang die klinische und pathologische Untersuchung dar (PARKER et al. 1998). Die
klinische Untersuchung ist aufgrund der langen Inkubationszeit hierfür wenig
geeignet, zumal schon DUNGAL et al. (1938) beobachteten, dass Ansteckungen
bereits während der subklinischen Phase der Erkrankung vorkommen können. Die
pathologische Untersuchung erlaubt lediglich retrospektive Studien. Die regelmäßige
pathomorphologische Untersuchung der Schlachtlungen ist jedoch ein geeignetes
Verfahren für das Monitoring des Gesundheitsstatus einer Herde.
56 LITERATURÜBERSICHT
2.2 Verfahren zum Virusnachweis
2.2.1 Blocking ELISA, Immunhistochemie, Restriktionsenzymanalyse
Verschiedene Methoden sind zum Nachweis von JSRV in Organmaterial entwickelt
worden. Mithilfe eines blocking ELISA und eines immunhistochemischen Verfahrens
konnten PALMARINI et al. (1995) Virus bzw. Capsidantigen ausschließlich im
Respirationstrakt (Tumorgewebe, Lungenflüssigkeit) sowie in einer Probe eines
regionären Lymphknotens erkrankter Schafe nachweisen. Das Vorkommen von 15
bis 20 Kopien endogener Retroviren (s. 2.1.4.4) im Genom gesunder Schafe, die der
Sequenz von JSRV sehr ähnlich sind (YORK et al. 1992; HECHT et al. 1994), hat
lange Zeit die Entwicklung molekularbiologischer Nachweisverfahren behindert.
PALMARINI et al. (1996a) gelang erstmals die Unterscheidung zwischen endogenen
und exogenen Gensequenzen durch eine für JSRV spezifische Restriktionsenzym-
Schnittstelle. Mit RT-PCR und anschließender ScaI-Digestion des PCR-Produktes
konnte exogenes Virus ebenfalls ausschließlich in Tumorgewebe, Lungenflüssigkeit
und regionären Lymphknoten nachgewiesen werden. Derselben Arbeitsgruppe
(PALMARINI et al. 1996b) gelang schließlich mithilfe JSRV-spezifischer Primer die
Entwicklung eines direkten Nachweisverfahrens von JSRV mittels Polymerase-
Kettenreaktion.
2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion
2.2.2.1 Prinzip und Historisches
Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine in-vitro-
Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente (SAIKI et al. 1985;
MULLIS und FALOONA 1987). Das Prinzip beruht auf einer Hitzedenaturierung des
DNA-Doppelstranges, gefolgt von einem Schritt der Anlagerung spezifischer
Oligonukleotidmoleküle, sogenannter Primer, an eine entsprechende komplementäre
LITERATURÜBERSICHT 57
Region des jeweiligen DNA-Einzelstranges. Die Primersequenzen werden so
ausgewählt, dass sie die zu amplifizierende Region flankieren. Mithilfe einer DNA-
Polymerase wird ausgehend von dem Primermolekül ein neuer komplementärer
DNA-Strang synthetisiert. Durch Wiederholung dieser Schritte in mehreren Zyklen
kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung der von dem Primerpaar begrenzten
Sequenz, da jedes in einem vorangegangenen Zyklus synthetisierte Molekül als
erneute Amplifikationsvorlage dient. In der Anfangsphase wurde eine thermolabile
DNA-Polymerase verwendet, die während der Hitzedenaturierung inaktiviert wurde
und daher für jeden Zyklus neu hinzugegeben werden musste (SAIKI et al. 1985;
MULLIS und FALOONA 1987). Der Einsatz einer thermostabilen Polymerase,
gewonnen aus einem hitzeliebenden Bakterium, Thermus aquaticus (Taq),
vereinfachte das Verfahren ungemein (SAIKI et al. 1988). Durch moderne PCR-
Automaten (Thermocycler) wurde das Verfahren zusätzlich praktikabler und hat in
verschiedensten molekularbiologischen Anwendungsgebieten eine rasante
Verbreitung gefunden (HAAS 1992; BELAK und BALLAGY-PORDANY 1993;
NEWTON und GRAHAM 1994; GASSEN et al. 1994; WINK und WEHRLE 1994).
2.2.2.2 Nested PCR / Heminested PCR
Eine Möglichkeit zur Steigerung der Sensitivität, aber auch der Spezifität der PCR-
Untersuchung ist die Durchführung einer sogenannten nested PCR. Dabei wird eine
kleine Menge des PCR-Produkts eines ersten Durchlaufes als Amplifikationsvorlage
für eine zweite PCR verwendet. Die verwendeten Primer binden innerhalb des ersten
Produktes, so dass man nach einem zweiten Durchlauf ein entsprechend kürzeres
Produkt erhält (MULLIS und FALOONA 1987; BELAK und BALLAGY-PORDANY
1993; NEWTON und GRAHAM 1994). Sofern nur ein Primer des zweiten Paares
innerhalb des ersten PCR-Produktes lokalisiert ist, spricht man von einer heminested
PCR. Während die Anzahl der Amplifikate in einer PCR theoretisch mit der Anzahl
der Zyklen exponentiell ansteigt, sind diesem Anstieg in praxi Grenzen gesetzt. Mit
einer einfachen PCR erreicht man in der Regel eine etwa 106-fache Amplifikation.
58 LITERATURÜBERSICHT
Durch einen zweiten PCR-Durchlauf mit nested oder heminested Primern kann das
Gesamtergebnis auf das 1011-1012-fache der Ausgangsmenge gesteigert werden
(BELAK und BALLAGY-PORDANY 1993).
2.2.2.3 Auswertung der PCR
Die häufigste Form der Darstellung von PCR-Produkten ist die Gelelektrophorese
und Färbung mit Ethidiumbromid oder anderen Fluoreszenzfarbstoffen, wodurch die
Banden unter UV-Bestrahlung sichtbar werden (NEWTON und GRAHAM 1994;
WINK und WEHRLE 1994; SAMBROOK et al. 1989). Die Größe des PCR-Produktes
kann mithilfe eines Größenmarkers auf dem Gel abgeschätzt werden (MULLIS und
FALOONA 1987). Silberfärbung, Restriktionsenzymanalyse, Southern-Blot-
Hybridisierung oder eine Sequenzierung sind weitere Möglichkeiten der
Charakterisierung von PCR-Produkten (NEWTON und GRAHAM 1994). In jüngerer
Vergangenheit entwickelte Real-time PCR-Geräte detektieren die Zunahme eines
Fluoreszenzsignales bereits während der laufenden Reaktion (ABU AL-SOUD und
RADSTRÖM 2001).
2.2.2.4 U3 heminested PCR zum Nachweis von JSRV PALMARINI et al. (1996b) machten sich für die Entwicklung eines PCR-Nachweises
Unterschiede zwischen JSRV und ESRV in der U3-Region des long terminal repeat
(LTR) zunutze. ESRV weist in dieser Region eine 30 bp lange Insertion gegenüber
JSRV auf (BAI et al. 1996, PALMARINI et al. 1996b). Nach DNA-Extraktion aus
Probenmaterial bzw. nach reverser Transkription der isolierten RNA erfolgt mithilfe
eines Primers, der diese 30 bp überbrückt, d.h. der komplementär zu jeweils etwa 10
Nukleotiden vor und hinter dieser Sequenz ist, eine selektive Bindung des Primers an
JSRV-cDNA bzw. provirale DNA und damit eine selektive Amplifikation der exogenen
viralen Sequenzen. In einer nachgeschalteten zweiten PCR mit heminested (hn)
Primern wird aus dem 176 bp langen Produkt des ersten Amplifikationszyklus ein
133 bp langes Stück weiter vervielfältigt. Das Endprodukt wird elektrophoretisch
LITERATURÜBERSICHT 59
dargestellt. Dieses Verfahren ist gegenüber dem der ScaI-Digestion etwa 105-fach
sensitiver und es gelang, bei klinisch erkrankten Tieren virale RNA sowie provirale
DNA auch in lymphatischen Geweben außerhalb des Respirationstraktes (periphere
Lymphknoten, Milz, Knochenmark und Thymus) sowie in Leukozyten nachzuweisen
(PALMARINI et al. 1996b).
2.2.2.4.1 Anwendung der U3 hn PCR zum Nachweis von JSRV in verschiedenen Proben und Geweben
Verschiedene Arbeitsgruppen haben dieses Verfahren seither als Referenzverfahren
(GARCIA-GOTI et al. 2000) bzw. für weitere Untersuchungen (HOLLAND et al. 1999;
PALMARINI et al. 1999a, DE LAS HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al. 2001;
SANNA et al. 2001) genutzt.
Nach den Ergebnissen von PALMARINI et al. (1996b) wurden 102-103 Kopien von
JSRV vor einem Hintergrund von 500 ng genomischer DNA bzw. 102 Kopien von
JSRV vor dem Hintergrund von 107 Kopien von ESRV LTR erfolgreich amplifiziert. Es
wurde sowohl der Nachweis viraler RNA mittels RT-PCR als auch der Nachweis
proviraler DNA bei natürlich und experimentell infizierten Tieren durchgeführt. Die
Ergebnisse sind (als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben) in
Tabelle 1 dargestellt.
60 LITERATURÜBERSICHT
Tabelle 1: Nachweis von Jaagsiekte Retrovirus RNA und proviraler DNA aus Probenmaterial natürlich und experimentell infizierter Tiere mit klinischer Lungenadenomatose (PALMARINI et al. 1996b)
Natürliche Infektion Experimentelle Infektion Probe
RNA DNA RNA DNA
Tumorgewebe/
Lungenflüssigkeit
18 / 18 6 / 6 4 / 4 4 / 4
Mediastinallymphknoten 6 / 6 6 / 6 4 / 4 3 / 3
andere Lymphknoten 2 / 9 0 / 9 - -
Milz 4 / 5 0 / 5 3 / 4 2 / 4
Knochenmark 2 / 5 2 / 4 2 / 3 1 / 3
Thymus - - 2 / 4 0 / 4
Niere 1 / 6 1 / 6 0 / 3 0 / 3
Haut 0 / 4 0 / 4 - -
Plasma 0 / 2 - 0 / 6 -
Leukozyten 3 / 7 0 / 6 - -
Angaben als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben
HOLLAND et al. (1999) erbrachten durch den Nachweis von JSRV proviraler DNA in
T- und B-Lymphozyten sowie Monozyten weitere Hinweise auf eine disseminierte
Infektion. Bei der Untersuchung von Leukozyten aus dem Blut natürlich infizierter,
klinisch kranker Schafe konnten sie bei fünf von acht Tieren JSRV nachweisen. Bei
jeweils acht Parallelamplifikationen aus je 200 ng genomischer DNA waren jedoch
maximal zwei Ansätze pro Tier positiv. Vorabuntersuchungen hatten gezeigt, dass
das PCR-System in der Lage ist, eine Kopie der JSRV proviralen DNA im PCR-
Ansatz zu detektieren (HOLLAND et al. 1999). Aus diesen Beobachtungen schlossen
die genannten Autoren auf eine sehr niedrige provirale Bürde der Leukozyten und
gehen davon aus, dass vermutlich weniger als eine von 240.000 Zellen infiziert ist.
Bei experimentell infizierten Lämmern konnten sie das Virus bereits sieben Tage
post infectionem zu einem Zeitpunkt, als noch keine histologischen Anzeichen für
LITERATURÜBERSICHT 61
Lungenadenomatose feststellbar waren, in Zellen aus mediastinalen Lymphknoten
nachweisen. Auch hier war die provirale Bürde, gemessen an der Zahl positiver
PCR-Reaktionen, sehr gering. Nach experimenteller Infektion gelang der Nachweis
aus Leukozyten bei einem von dreizehn Lämmern am 14. Tag, bei einem weiteren
am 28. Tag post infectionem (HOLLAND et al. 1999).
Spanische Untersuchungen konnten in 28% der Blutproben von Schafen aus einer
mit Lungenadenomatose infizierten Herde JSRV nachweisen. Aufgrund dieses
Screenings wurden 15 PCR-positive und fünf PCR-negative Tiere aus dieser Herde
ausgewählt und viermal in monatlichen Intervallen nachuntersucht. Während dieser
Zeit wurde lediglich bei neun der 15 zunächst positiven Tiere ein erneut positives
Untersuchungsergebnis erzielt, jedoch auch bei vier der initial negativen Tiere.
(GARCIA-GOTI 1999, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003).
GONZALEZ et al. (2001) untersuchten die Nachweisbarkeit von JSRV in Blutproben
und Geweben von zehn natürlich infizierten Tieren mit klassischer, sechs Tieren mit
atypischer Lungenadenomatose, zehn klinisch gesunden Kontakttieren aus einer
Lungenadenomatose-positiven Herde sowie zehn Kontrolltieren aus einem
Lungenadenomatose-freien Bestand. Es wurden jeweils sechs Parallel-
amplifikationen aus jeweils 300 ng DNA pro Probe durchgeführt. Eine Probe wurde
als positiv gewertet, wenn mindestens einer dieser Ansätze eine positive Reaktion
zeigte. Bei den Kontrolltieren wurde aus keiner der untersuchten Proben ein positives
Ergebnis erzielt. Für die übrigen drei Gruppen und eine Auswahl der untersuchten
Proben sind die Ergebnisse in Tabelle 2 zusammengefasst. Die
Untersuchungsergebnisse sind als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter
Proben der jeweiligen Kategorie dargestellt.
62 LITERATURÜBERSICHT
Tabelle2: Nachweis von JSRV proviraler DNA aus Probenmaterial von Tieren mit klassischer und atypischer Lungenadenomatose (LA) sowie klinisch gesunden Kontakttieren (GONZALEZ et al. 2001) Probe klassische LA atypische LA Kontakttiere
Leukozyten 10 / 10 5 / 6 4 / 10
Milz 4 / 10 2 / 6 2 / 10
unverändertes
Lungengewebe
10 / 10 3 / 4 1 / 10
Mediastinallymphknoten 10 / 10 5 / 6 2 / 10
Tumorgewebe 10 / 10 6 / 6 nicht verfügbar
Angaben als Anzahl positiver Proben pro Anzahl untersuchter Proben
Auch in fetalen Geweben bzw. fetalem Blut von ungeborenen Lämmern zweier an
Lungenadenomatose erkrankter Muttertiere wurde JSRV mittels U3 hn PCR
nachgewiesen. In einem dritten Fall waren alle untersuchten fetalen Proben negativ.
Weiterhin wurde bei einem drei Tage alten Lamm makroskopisch und histologisch
ein Bild wie bei Lungenadenomatose diagnostiziert. Die Läsionen erwiesen sich
durch Nachweis von JSRV-spezifischen Genomsequenzen mittels PCR und von
JSRV CA mittels immunhistochemischer Untersuchung als ein Fall von
Lungenadenomatose. Das Muttertier des Lammes wies keinerlei makroskopisch oder
histologisch (einschließlich immunhistochemisch) nachweisbare Läsionen auf. Die
PCR—Untersuchung von Leukozyten, Lungengewebe und mediastinalem
Lymphknoten des Mutterschafes ergab jedoch für alle drei Proben ein positives
Ergebnis (DE LAS HERAS et al. 2000).
Mittels in-situ PCR wurde neben den Tumorzellen und Zellen der regionären
Lymphknoten auch ein stark positives Signal von den Alveolarmakrophagen erhalten.
Ob diese selbst infiziert sind oder ob die Amplifikation von phagozytiertem Material
infizierter Zellen herrührt, ist nicht geklärt (SANNA et al. 2001).
LITERATURÜBERSICHT 63
2.2.2.5 Risiken der PCR
Eine ausführliche Literaturübersicht über mögliche Probleme der PCR ist bei
SCHEIBNER (2000) gegeben. Prinzipiell sind unspezifische Amplifikate, falsch-
positive und falsch-negative Ergebnisse möglich.
A Unspezifische Reaktionen
Die Bildung unspezifischer Amplifikate oder Primer-Dimere während der
Vorbereitungszeit der PCR bei Raumtemperatur (CHOU et al. 1992) kann durch
Arbeiten auf Eis oder hot-Start-Techniken verringert werden. Letztere beinhalten die
Zugabe einer oder mehrerer essentieller Zutaten (in der Regel der Polymerase) erst
nach initialer Denaturierung der Matrize oder die Trennung des Enzyms von dem
restlichen Reaktionsgemisch durch eine Wachsschicht. Diese schmilzt während der
ersten Denaturierungsphase und sorgt so für eine Vermischung der
Reaktionskomponenten zum exakt richtigen Zeitpunkt (NEWTON und GRAHAM
1994). Oligonukleotid-Inhibitoren der DNA-Polymerase, die bei Temperaturen über
40°C ihre Wirkung verlieren, ermöglichen die Vorbereitung des Reaktionsansatzes
bei Raumtemperatur und eliminieren die für oben genannte hot-Start-Verfahren
nötigen zusätzlichen Arbeitsschritte (DANG und JAYASENA 1996 ).
B Falsch-positive Ergebnisse
Aufgrund ihrer hohen Sensitivität ist die PCR ein für mögliche Kontaminationen sehr
anfälliges Verfahren. Dies gilt in ganz besonderem Maße für die nested PCR (KWOK
und HIGUCHI 1989; PERSING 1991; HAAS 1992; BELAK und BALLAGY-
PORDANY 1993). Mögliche Kontaminationsquellen und damit Ursache falsch-
positiver Ergebnisse sind bereits bei der Probenentnahme gegeben (NEWTON und
GRAHAM 1994). Im Labor selbst können sie durch Kreuzkontamination zwischen
verschiedenen Proben, Kontamination mit PCR-Produkten („carry-over“) oder
64 LITERATURÜBERSICHT
geklonter Plasmid-DNA entstehen (KWOK und HIGUCHI 1989; PERSING 1991).
Durch entsprechende Maßnahmen wie räumliche Trennung und separate
Gerätschaften für die einzelnen Arbeitsschritte, das Autoklavieren und Aliquotieren
von Lösungen, Tragen von Handschuhen, Wechsel der Arbeitskleidung, sorgfältiges
Arbeiten, um Aerosolbildung zu vermeiden, Verwendung gestopfter Pipettenspitzen
sowie die Anwendung adäquater Kontrollen kann dieses Risiko minimiert werden.
UV-Bestrahlung und Behandlung mit einmolarer HCl zerstört DNA und kann daher
zur Dekontamination genutzt werden. Autoklavieren degradiert DNA zu Partikeln von
sehr niedrigem Molekulargewicht (KWOK und HIGUCHI 1989). Zum Umgang mit
Produktkontaminationen sind verschiedene prae- und post-PCR-
Sterilisationsverfahren beschrieben (ISAACS et al. 1990; CIMINO et al. 1990;
PERSING 1991).
C Falsch-negative Ergebnisse
Falsch-negative Ergebnisse können durch ungeeignete PCR-Bedingungen oder
Primer oder durch eine Hemmung der PCR-Reaktion durch in der Probe enthaltene
Inhibitoren entstehen (HAAS 1992). Als solche wurde eine Vielzahl von Substanzen
identifiziert (WILSON 1997), darunter Komponenten von roten und weißen Blutzellen,
Hämoglobin und Lactoferrin, (ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001), Immunglobulin
G (ABU AL-SOUD et al. 2000) sowie verschiedene Gerinnungshemmer wie EDTA
(ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001) und Heparin (HOLODNIY et al. 1991; WANG
et al. 1992). Auch in anderen klinischen Proben wie Gewebe und Sputum wurde das
Vorhandensein von Inhibitoren beschrieben, diese sind jedoch größtenteils noch
nicht näher charakterisiert. Substanzen, die zur Probenaufbereitung verwendet
werden, sowie Handschuhpuder können darüber hinaus eine PCR-Reaktion
hemmen (WILSON 1997). Die Nachweisgrenze eines PCR-Systems ist zusätzlich
abhängig von der Art der Probenaufbereitung und den verwendeten Reagenzien,
insbesondere der Polymerase (SCHEIBNER 2000). Verschiedene Enzyme können
LITERATURÜBERSICHT 65
durch die Anwesenheit inhibitorischer Substanzen in sehr unterschiedlichem Maße
beeinträchtigt werden (ABU AL-SOUD und RADSTRÖM 1998).
2.2.2.6 Kontrollen
Aufgrund der genannten Gefahren ist das konsequente Mitführen adäquater positiver
und negativer Kontrollen unerlässlich. Dies sollte bereits während der
Probenaufbereitung und in allen nachgeschalteten Schritten erfolgen. Kontrollen sind
prinzipiell wie die anderen Proben zu behandeln (KWOK und HIGUCHI 1989;
SCHEIBNER 2000).
Negative Kontrollen dienen der Detektion falsch-positiver Resultate durch
Kontamination. Bekannt negatives Probenmaterial, Wasser sowie
Reaktionskontrollen, die alle PCR-Reagenzien, jedoch keine DNA enthalten, sind
geeignete Negativkontrollen (KWOK und HIGUCHI 1989; NEWTON und GRAHAM
1994; SCHEIBNER 2000).
Ein einfaches Mittel einer Positivkontrolle ist das Mitführen einer bekannt positiven
Probe, die mit den zu präparierenden Proben mitgeführt wird. Dies ermöglicht bereits
eine Kontrolle des Probenaufbereitungsschrittes (SCHEIBNER 2000). Als
Positivkontrollen können weiterhin in Plasmide einklonierte Zielsequenzen verwendet
werden, die den Nachteil einer erhöhten Kontaminationsgefahr tragen, jedoch durch
Verdünnung und den Einsatz einer bekannten Menge an Ziel-DNA als Grenzwert-
Positivkontrollen und damit zur Kontrolle einer gleich bleibenden Sensitivität des
Reaktionssystems dienen können (KWOK und HIGUCHI 1989; NEWTON und
GRAHAM 1994). Der Nachweis amplifizierbarer DNA und damit der Abwesenheit
von Inhibitoren kann durch eine PCR mit Primern für eine andere Zielsequenz, z. B.
ein sogenanntes housekeeping-Gen erbracht werden (NEWTON und GRAHAM
1994; SCHEIBNER 2000). Da diese in jeder Zelle vorkommen, sind sie zur Detektion
einer reduzierten Sensitivität durch Inhibitionen, die den Nachweis von geringen
Mengen Ziel-DNA negativ beeinflussen, jedoch nicht optimal. Besonders geeignet
66 LITERATURÜBERSICHT
sind sogenannte interne Kontrollen, die eine direkte Inhibitionskontrolle in jedem
einzelnen PCR-Ansatz ermöglichen (WILSON 1997; SCHEIBNER 2000). 2.3 Maßnahmen zur Kontrolle und Bekämpfung der Lungenadenomatose
2.3.1 Kontrollmaßnahmen in der Heidschnuckenzucht
Aufgrund der hohen Befallsrate der Zuchtpopulation und des verlustreichen
Verlaufes, die die Erkrankung bei Heidschnucken nimmt (siehe 2.1.8), wurden im
Jahr 1996 auf Initiative des Veterinäramtes Celle vom Zuchtverband Maßnahmen zur
Einschränkung der weiteren Ausbreitung in den Herdbuchbetrieben ergriffen. Diese
werden weitgehend als geschlossene Herden gehalten. Tierzukäufe finden nur im
Rahmen der traditionellen Bockauktion in Müden/Örtze statt. Diese wurde daher als
ein Hauptrisikofaktor für eine Weiterverbreitung der Lungenadenomatose in der
Zuchtpopulation angesehen. Als Folge daraus darf die Auktion der Grauen gehörnten
Heidschnucken nunmehr nur noch beschickt werden, wenn der Herkunftsbetrieb an
einem vom VLH festgelegten Monitoring-Programm teilnimmt und aufgrund dessen
als Lungenadenomatose-unverdächtig eingestuft wird. Abhängig von der
Herdengröße muß eine bestimmte Anzahl an dokumentierten Lungenbefunden
vorliegen. Eine von der Bestandsgröße abhängige festgelegte Mindestzahl der
Schlachtlungen aus dem jeweiligen Betrieb muß makroskopisch untersucht werden.
Zusätzlich müssen alle Veränderungen, die Walnußgröße überschreiten, sowie ab
dem Jahr 2004 auch eine Mindestzahl makroskopisch unveränderter Lungen zur
pathologisch-histologischen Untersuchung eingesandt werden. Verendete Tiere, die
älter als zwei Monate sind, sowie vorsorglich geschlachtete Tiere, die Symptome wie
Husten, Nasenausfluß oder Kümmern gezeigt haben, unterliegen ebenfalls der
Untersuchungspflicht. Dieses Monitoring wird von den Veterinärämtern der
beteiligten Landkreise überwacht. Herden mit positivem LA-Nachweis werden von
LITERATURÜBERSICHT 67
der Beschickung der Auktionen ausgeschlossen (KRÄMER 2001; GANTER 2004,
pers. Mitteilung).
2.3.2 Kontrolle und Sanierungsversuch durch Managementmaßnahmen
Eine Eindämmung der Erkrankung im Sinne der Minimierung der Verluste kann
durch konsequente sofortige Schlachtung erkrankter oder verdächtiger Tiere und
damit durch eine Senkung des Infektionsdruckes innerhalb einer Herde erreicht
werden. Sofern dies z. B. während der Trächtigkeit oder Säugezeit nicht möglich ist,
sind verdächtige Tiere separat zu halten. Zu diesen Maßnahmen wurde bereits von
HUTCHEON (1891, zit. nach TUSTIN 1969) und MITCHELL (1915) geraten. Der
letztgenannte Autor beobachtete jedoch auch, dass selbst bei konsequentester
Einhaltung dieses Verfahrens eine vollständige Eradikation der Erkrankung nicht
erzielt werden konnte.
Nach Auftreten von Lungenadenomatose in einer Herde einer britischen
landwirtschaftlichen Forschungseinrichtung (ADAS Liscombe) im Jahr 1983 und
nachfolgender Übertragung auf drei weitere Herden derselben Einrichtung wurde der
Versuch einer Sanierung durch strikte Managementmaßnahmen unternommen.
Hierzu zählten die sofortige Merzung klinischer Verdachtsfälle sowie deren
Nachkommen, der Zukauf von gesunden Tieren als Nukleus einer neuen Herde
sowie die getrennte Haltung dieser unverdächtigen Herde von den verdächtigen.
Innerhalb der verdächtigen Herden wurde eine nach Altersgruppen getrennte
Haltung eingeführt, da die älteren Schafe als die größte Infektionsquelle angesehen
wurden. Zu bestimmten Zeiten machte diese strikte Trennung die parallele Haltung
von 13 separaten Herden erforderlich, was selbst für die genannte
Forschungseinrichtung eine nahezu unerfüllbare Herausforderung darstellte. Zudem
verdreifachten sich die Kosten für die Einzäunung von Weideland, während durch die
strikte Merzungspolitik die Erlöse beträchtlich zurückgingen. JONES (1992) selbst rät
deshalb dringend von der Nachahmung ab. In den Jahren 1983 bis 1988 wurden 123
klinische Fälle beobachtet und bestätigt. Im April 1988 trat die letzte klinische
68 LITERATURÜBERSICHT
Erkrankung in einer der verdächtigen Herden auf. In der neu aufgebauten
unverdächtigen Herde wurden jedoch trotz des Fehlens klinischer Erkrankungen bei
einzelnen Tieren histologische Läsionen festgestellt (JONES 1992). Selbst mit dem
beschriebenen Maximalaufwand konnte eine vollständige Eliminierung der
Erkrankung nicht erreicht werden.
2.3.3 Eradikation der Lungenadenomatose in Island
Die Einführung einer Gruppe von Karakulböcken aus dem Raum Halle nach Island
im Jahr 1933 hatte schwerwiegende Folgen für die isländische Schafpopulation. Mit
diesen Tieren wurden vier in Island bisher nicht aufgetretene Erkrankungen
importiert, neben Lungenadenomatose auch Maedi-Visna, Paratuberkulose und
Aktinobazillose (PALSSON 1985). Die Einschleppung der Lungenadenomatose geht
vermutlich auf einen Bock dieser Gruppe zurück (DUNGAL et al. 1938) und die
traditionellen Haltungsbedingungen mit mehrmonatiger Stallhaltung im Winter und
gemeinschaftlichen Sommerweiden trugen zu einer raschen Verbreitung innerhalb
der isländischen Schafpopulation bei (DUNGAL et al 1938; PALSSON 1985). Nach
einem verheerenden Seuchenzug in den folgenden Jahren, zu dem auch Maedi-
Visna ihren Beitrag leistete, entschloß sich die Regierung zu einem radikalen
Eradikationsversuch. Kilometerlange Zäune wurden quer durch das Land errichtet
und bewacht, um betroffene Regionen von den Landesteilen zu trennen, in denen
Maedi und Lungenadenomatose bislang noch nicht aufgetreten waren. Die Schafe
dies- und jenseits des Zaunes wurden farblich gekennzeichnet und jeder
Grenzüberschreiter rigoros geschlachtet. Im Jahr 1944 begann man mit der
systematischen Schlachtung sämtlicher Schafe in den betroffenen Gebieten. Als
Grundstock für den Neuaufbau der Herden dienten Jungtiere aus den nicht
betroffenen Gebieten des Landes. Die letzten derartigen Schlachtungen wurden
Ende des Jahres 1952 durchgeführt, 1954 waren in allen betroffenen Gebieten neue
Herden angeschafft. Seit 1952 sind in Island keine Fälle von Lungenadenomatose
mehr aufgetreten. In den Folgejahren kam es wiederholt zu Neuausbrüchen von
LITERATURÜBERSICHT 69
Maedi, diese Erkrankung gilt jedoch seit 1965 in Island ebenfalls als ausgerottet.
Insgesamt fielen den beiden Erkrankungen nach Schätzungen mehr als 205.000
Schafe zum Opfer und im Zuge der Eradikationsmaßnahmen wurden mehr als
650.000 Schafe getötet (PALSSON 1985).
2.3.4 Sanierung mittels Embryotransfer
Aus einer Anpaarung von 76 Mutterschafen aus einer Lungenadenomatose-positiven
Herde mit Lungenadenomatose-negativen Böcken wurden in einer Untersuchung
von PARKER et al. (1998) 215 Embryonen gewonnen und mittels Embryotransfer in
Lungenadenomatose-freie Empfängertiere übertragen. Von den 125 geborenen
Lämmern stammten 51 von Muttertieren ab, die nach ihrer Tötung
Lungenadenomatose-spezifische Läsionen in der Lunge aufwiesen. Die
Empfängertiere und die gewonnenen Lämmer wurden fünf Jahre lang als
geschlossene Herde gehalten. In dieser Zeit wurden sie wiederholt mit
Lungenadenomatose-negativen Böcken belegt, um sie einem normalen
reproduktiven Stress auszusetzen, der eventuell eine Krankheitsentstehung
begünstigen könnte. Nach Ablauf der fünf Jahre wurden sowohl die Empfängertiere
als auch die Lämmer getötet und ihre Lungen sowie die Lungenlymphknoten
untersucht. Tiere, die dieses Alter nicht erreichten, wurden zum Zeitpunkt ihres
Todes ebenfalls in gleicher Weise auf Lungenadenomatose untersucht. Keines der
Empfängertiere oder der Lämmer wies nach dieser Zeit Anzeichen spezifischer
Läsionen auf. In gleicher Weise wurden als Nachkommen Lungenadenomatose-
negativer Mutterschafe mit einem Lungenadenomatose-positiven Bock elf
Embryonen gewonnen. Aus diesen gingen nach Übertragung in
Lungenadenomatose-negative Empfängertiere fünf Lämmer hervor, von denen vier
das Alter von fünf Jahren erreichten. Auch diese Empfängertiere und die Lämmer
wiesen zum Zeitpunkt ihres Todes keine spezifischen Lungenveränderungen auf.
Embryotransfer scheint daher eine geeignete Maßnahme zur Elimination der
70 LITERATURÜBERSICHT
Erkrankung aus einer Herde bei gleichzeitiger Bewahrung des genetischen Materials
der Spendertiere zu sein.
2.3.5 Sanierung mittels mutterloser Lämmeraufzucht am Beispiel der Maedi-Visna-Infektion
Maedi-Visna wird durch ein Lentivirus hervorgerufen. Sie kann als chronische
respiratorische Erkrankung (Maedi), in ihrer ZNS-Form (Visna), sowie in Form
chronischer Euterentzündungen und Arthritiden ausgeprägt sein. Die Erkrankung
zeigt einen langsamen Verlauf und klinische Symptome treten in der Regel erst bei
Tieren auf, die über drei Jahre alt sind (PALSSON 1990). Unter experimentellen
Bedingungen konnten DE BOER et al. (1979) zeigen, dass in der Geburt von ihren
Maedi-positiven Müttern getrennte und kolostrumfrei separat aufgezogene Lämmer
im Gegensatz zu bei den Müttern verbliebenen Kontrolltieren während einer
achtjährigen Beobachtungszeit weder klinische Symptome noch eine Serokonversion
zeigten. Unter Feldbedingungen erwies sich das Verfahren der mutterlosen Aufzucht
zur Maedi-Visna-Sanierung ebenfalls als erfolgreich (HOUWERS et al. 1983;
HOUWERS 1990). HOUWERS und HOUWERS et al. (1990; 1983) stellen für die
praktische Durchführung der Sanierung folgenden Maßnahmenkatalog auf:
• Sofortige Trennung der Lämmer in der Geburt; Minimierung des Kontaktes zur
Umgebung des Muttertieres
• Räumliche Trennung des Lämmerstalles
• möglichst personelle Trennung, zumindest allgemeine Hygienemaßnahmen
und Wechsel der Schutzkleidung
• Fütterung mit Rinderkolostrum in den ersten 24 Stunden, weitere Aufzucht mit
Schafmilchaustauscher, Heu und Kraftfutter
• Weiterhin getrennte Haltung und Aufzucht von der Muttertierherde
• Wiederholte halbjährliche serologische Untersuchung, beginnend ab dem
Alter von sechs Monaten
• Sofortige Entfernung von eventuellen Reagenten aus der Herde
LITERATURÜBERSICHT 71
2.3.6 Versuch der Lungenadenomatose-Sanierung mittels mutterloser Aufzucht
TUSTIN (1969) berichtet von einem Experiment, in dem zehn tragende Muttertiere
aus einer Lungenadenomatose-positiven Herde direkt nach der Geburt getötet
wurden. Vier dieser Muttertiere wiesen makroskopische Tumoren auf. Die Lämmer
wurden getrennt von anderen Schafen mutterlos aufgezogen, fünf Jahre lang separat
gehalten und sie pflanzten sich in dieser Zeit untereinander fort. Weder die mutterlos
aufgezogenen Tiere noch deren Nachkommen zeigten bei der Schlachtung Hinweise
auf eine Lungenadenomatose-Erkrankung.
2.3.6.1 Geschichte des Sanierungsprojekts
Im Jahr 1998 wurde in einer der wenigen großen Stammzuchtherden der Grauen
gehörnten Heidschnucken in der Lüneburger Heide mit über 200-jähriger
Zuchttradition Lungenadenomatose festgestellt. Der Besitzer entschloß sich zur
Schlachtung der gesamten Herde. Im letzten Moment konnten die Landkreise
Harburg und Soltau-Fallingbostel 111 zu diesem Zeitpunkt klinisch unauffällige
Muttertiere zur Erhaltung des wertvollen genetischen Materials dieser Herde
erwerben (GANTER 1999). Diese Tiere bildeten den Grundstock eines
Sanierungsversuches mittels mutterloser Aufzucht, der bei KRÄMER (2001)
ausführlich dargestellt ist. Im Juni 1998 ging diese im folgenden auch als
„Schneverdinger Herde“ bezeichnete Herde in den Besitz des Vereins
Naturschutzpark e.V. (VNP) über, der zu diesem Zeitpunkt an anderen Standorten
noch drei weitere, jeweils ca. 400 Muttertiere umfassende und allesamt mit
Lungenadenomatose infizierte Gebrauchsherden zur Heidepflege besaß.
Im Frühjahr 1999 und 2000 wurde die Schneverdinger Herde während der
Ablammperiode permanent überwacht und die Lämmer direkt nach Geburtshilfe
durch manuellen Auszug von den Müttern getrennt. Sie wurden dann in einen
separat gelegenen Lämmerstall verbracht und dort mit Rinderkolostrum bzw.
72 LITERATURÜBERSICHT
Kolostrumersatzpräparaten und anschließend mit Schafmilchaustauscher
großgezogen (KRÄMER 2001; WOLLNY 2000). Auf strikte Hygienemaßnahmen
wurde geachtet (kein Kontakt des Lammes zum Stallboden oder zum Muttertier,
Reinigung und Desinfektion der Hände, Wechsel der Schutzkleidung zwischen
Schaf- und Lämmerstall, räumliche Trennung), eine personelle Trennung war jedoch
aus organisatorischen Gründen während der ersten ein bis zwei Lebenstage der
Lämmer nicht möglich. Unbeobachtet geborene Lämmer sowie ein Teil der
Bocklämmer blieben bei ihren Müttern. Die männlichen Lämmer wurden kastriert, im
folgenden Herbst geschlachtet und ihre Lungen pathomorphologisch sowie
gegebenenfalls pathohistologisch untersucht.
Die weitere Aufzucht und Haltung der mutterlos aufgezogenen Lämmer erfolgte
zunächst getrennt von anderen Schafen im Tierhaus der Klink für kleine Klauentiere
und anschließend bis zum Herbst 2000 in einem landwirtschaftlichen Betrieb ohne
eigene Schafhaltung. Anschließend wurden sie in einen nach zwei Jahren Leerstand
gereinigten und desinfizierten Stall in der Nähe der Ortschaft Döhle in der
Lüneburger Heide verbracht. Diese Herde wird im folgenden daher als „Döhler
Herde“ bezeichnet.
Zu diesem Zeitpunkt wurden ihnen zwei Altböcke zugesellt. Diese stammten aus
kontrollierten Herkünften, bei denen vorberichtlich Lungenadenomatose noch nie in
Erscheinung getreten war. Zum Zeitpunkt der Einführung in die Döhler Herde waren
sie sechs Jahre alt und klinisch gesund. Röntgenologisch bestanden keine Hinweise
auf Lungenveränderungen. Die vorangegangenen eineinhalb Jahre hatten sie in
Quarantäne ohne Kontakt zu anderen Schafen am Institut für Tierzucht und
Tierverhalten des Instituts für Tierzucht der Bundesforschungsanstalt für
Landwirtschaft in Mariensee verbracht und auch zuvor waren sie eingehend klinisch
und röntgenologisch untersucht worden. Im selben Herbst kamen sie in der Döhler
Herde zum Deckeinsatz (KRÄMER 2001).
Entgegen der ursprünglichen Planung, die Schneverdinger Herde nach Abschluß der
Lammzeit 2000 aufzulösen, wurden auch im Frühjahr 2001 aus dieser Herde ca. 100
LITERATURÜBERSICHT 73
weibliche und männliche, sowie aus einer der Lungenadenomatose-positiven
Gebrauchsherden des VNP (Tütsberger Herde) weitere ca. 100 weibliche Lämmer
für die mutterlose Aufzucht gewonnen. (siehe 3.1 und 4.1), die weitere Aufzucht
dieser Lämmer nach der Kolostralphase erfolgte im Stall der Döhler Herde
(BIMCZOK 2002).
74 LITERATURÜBERSICHT
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 75
3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.1 Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001
Um ein schnelleres Anwachsen der Döhler Herde auf die gewünschte Kopfgröße von
ca. 400 Muttertieren zu erreichen, wurden auch im Frühjahr 2001 aus der
Schneverdinger Herde ca. 100 weibliche und männliche, sowie aus einer der
Lungenadenomatose-positiven Gebrauchsherden des VNP (Tütsberger Herde)
weitere ca. 100 weibliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Material
und Methoden sind ausführlich bei KRÄMER (2001) beschrieben. Eine
Brunstsynchronisation erfolgte im Herbst 2000 nicht. Es wurden in der Lammzeit die
selben hygienischen Standards eingehalten wie in den Vorjahren (KRÄMER 2001),
d.h. die Muttertiere wurden von Studierenden der Tierärztlichen Hochschule
Hannover und der Autorin rund um die Uhr überwacht. Alle für die Geburtshilfe und
Lämmerversorgung benötigten Utensilien wurden im Schafstall außerhalb der
Reichweite der Mutterschafe gelagert. In der Austreibungsphase wurden die Lämmer
durch sanfte Zughilfe entwickelt und ohne Kontakt zum Stallboden oder dem
Muttertier sofort in mit frischem, sauberem Stroh ausgelegte saubere Plastikkisten
gelegt. In diesen Kisten wurden sie sofort im Anschluß aus dem Schafstall in einen
separat gelegenen, ca. 100 m entfernten Lämmerstall verbracht. Zwischen Schaf-
und Lämmerstall erfolgte der konsequente Wechsel der Schutzkleidung (Stiefel,
Overalls) sowie eine gründliche Reinigung und Desinfektion der Hände. Die
Einrichtung des Lämmerstalles bestand aus neuen Holzhürden zur Abgrenzung der
Boxen. Diese waren mit zugekauften Sägespänen eingestreut. Es standen für die
Lämmer Wärmelampen zur Verfügung. Im Lämmerstall erfolgte ein gründliches
Trockenreiben der Lämmer mit sauberen Handtüchern, das Jodieren des Nabels und
während der ersten 24 Lebensstunden die Versorgung mit Rinderkolostrum.
Anschließend wurden die Tiere in den einige Kilometer entfernten Schafstall nach
Döhle verbracht und dort mit Schafmilchaustauscher weiter aufgezogen (BIMCZOK
2002).
76 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Im Schafstall sowie im Lämmerstall standen Wasser, Seife und
Händedesinfektionsmittel zur Verfügung und wurden regelmäßig genutzt. Alle im
Lämmerstall verwendeten Utensilien wurden nur dort verwendet und waren eigens
für diesen Zweck angeschafft worden. Sie hatten keinerlei Kontakt zur
Muttertierherde.
Nach Abschluß der Lammzeit 2001 wurde die Schneverdinger Herde aufgelöst.
3.2 Herden
3.2.1 Schneverdinger Herde
Diese Herde entstand durch Aufkauf von 111 weiblichen Zuchttieren aus einer
hochgradig mit Lungenadenomatose (LA) befallenen Stammzuchtherde im Jahr 1998
und bildete den Grundstock des bei KRÄMER (2001) detailliert beschriebenen
Sanierungsversuches mittels mutterloser Aufzucht.
Zu Beginn dieser Untersuchungen Ende des Jahres 2000 umfaßte diese Herde 113
Tiere (80 Muttertiere und Zutreter, 28 Lämmer, vier Böcke, ein Hammel)
(KOOPMANN 2003, pers. Mitteilung).
In den beiden Vorjahren hatten die Verluste an Zuchttieren durch Lungen-
adenomatose durchschnittlich ca. 15% betragen. Vierzehn der 47 in der Herde
verbliebenen Lämmer (29,8%) hatten im Alter von fünfeinhalb bis acht Monaten
bereits makroskopisch erkennbare Lungentumoren aufgewiesen. Fünf dieser 14
Tiere (10,6% aller untersuchten Lämmer; n=47) waren in diesem Alter bereits klinisch
erkrankt (KRÄMER 2001). Nach Abschluß der Lammzeit 2001 wurde diese Herde
aufgelöst. Die Mehrzahl (n=50) der Muttertiere wurde im selben Frühjahr
euthanasiert und pathologisch-anatomisch sowie histologisch untersucht.
Lämmerführende Muttertiere sowie die jüngeren Tiere wurden vorübergehend in die
ebenfalls LA-positive Tütsberger Herde (siehe 3.2.3) integriert und bis zum Sommer
2003 gemäß ihrem natürlichen altersgemäßen oder gesundheitsbedingten
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 77
Ausscheiden aus der Herde ebenfalls euthanasiert und der postmortalen
Untersuchung zugeführt (n=30). Drei weitere Muttertiere erreichten die Lammzeit im
Jahr 2001 nicht und wurden aufgrund klinischer Lungenadenomatose bereits im
Herbst 2000 eingeschläfert.
3.2.2 Döhler Herde
Diese durch mutterlose Aufzucht von Lämmern aus der Schneverdinger Herde
aufgebaute Herde setzte sich im Herbst 2000 wie folgt zusammen: 100 weibliche
Tiere (51 des Jahrganges 1999, 49 Zutreter aus dem Geburtsjahrgang 2000), vier
mutterlos aufgezogene, gekörte Böcke aus 1999, elf Lammböcke des Jahrganges
2000 und zwei dazugesellte Altböcke aus anderen, Lungenadenomatose-
unverdächtigen Herkünften.
Bis zu diesem Zeitpunkt waren in dieser Herde keine klinischen
Lungenadenomatose-Fälle aufgetreten. Von 55 Bocklämmern der Jahrgänge 1999
und 2000, die im Alter von acht bis 13 Monaten geschlachtet wurden, wies eines im
Schlachtalter von 13 Monaten in einer von vier Lungenlokalisationen nur histologisch
eindeutig als Lungenadenomatose zu identifizierende Läsionen auf. Bei einem
weiteren gleichaltrigen Tier wurde histologisch fokal eine geringgradige Proliferation
des Bronchialepithels festgestellt, so dass Lungenadenomatose histologisch nicht
eindeutig ausgeschlossen werden konnte (KRÄMER 2001).
3.2.3 Weitere Herden des VNP
Auf dem Gebiet des Naturschutzgebietes Lüneburger Heide wurden im Herbst 2000
in Trägerschaft des VNP zusätzlich zu den beiden oben genannten Herdbuchherden
drei weitere, jeweils ca. 400 Muttertiere umfassende Gebrauchsherden zur
Heidepflege gehalten. Diese Herden waren nicht Teil der Herdbuchzucht und alle
drei mit Lungenadenomatose infiziert. Nach ihren Standorten werden diese Herden
im folgenden als „Tütsberger Herde“, „Wilseder Herde“ und „Herde Undeloher
78 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Straße“ bezeichnet. In diesen drei Gebrauchsherden betrugen die Verluste an
Alttieren durch die Lungenadenomatose zum genannten Zeitpunkt zwischen 4% und
14% (KOOPMANN 2000, pers. Mitteilung).
3.2.4 Haltung, Ställe und Weideflächen
Für jede der fünf genannten Herden stehen an räumlich getrennten Standorten
eigene Ställe und Weideflächen zur Verfügung. Sie werden durch jeweils einen fest
angestellten Schäfer betreut und außerhalb der Lammzeit ganzjährig tagsüber auf
Heide- und Grünlandflächen innerhalb des Naturschutzgebietes gehütet. Es
bestehen keine Überschneidungen der Weideflächen. Nachts kehrt die Herde
ganzjährig in den Stall zurück. Die Ställe wurden in den sechziger Jahren in
landschaftstypischer Bauweise errichtet. Ein Steinsockel trägt den ansonsten aus
Holz bestehenden Stall, das Dach ist reetgedeckt, darunter befindet sich ein über
Leitern zugänglicher Heu- und Strohboden. Die Ställe haben keine Fenster,
nachträglich wurden jedoch zum Teil an den Längsseiten Lüftungsklappen
eingebaut. An beiden Giebelseiten befinden sich große Flügeltüren, die ganz oder
halb geöffnet werden können.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 79
3.3 Tiere und Probenmaterial
3.3.1 Tiere und Probenmaterial aus LA-positiven Herden
A Sektionstiere Aus der Schneverdinger Herde und den drei LA-positiven Gebrauchsherden des
VNP wurden insgesamt 124 Tiere an die Klinik für kleine Klauentiere gebracht, dort
eingehend klinisch untersucht und zunächst nach der Entnahme von Blutproben
durch intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital (EuthaR77, Essex
Tierarznei) euthanasiert. Da die Untersuchung der Blutproben der ersten LA-
positiven Sektionstiere ein überwiegend negatives Ergebnis lieferte, wurde im
Folgenden dazu übergegangen, zur Erweiterung des intravital gewonnenen
Probenspektrums von den verbleibenden Sektionstieren (n=109) zusätzlich
Lungenspülproben zu gewinnen. Anschließend erfolgte am Institut für Pathologie der
Tierärztlichen Hochschule die Sektion des Tierkörpers1 mit Entnahme von
Gewebeproben (Lungengewebe und Lymphonodus mediastinalis caudalis) für die
histologische Untersuchung sowie die Untersuchung mittels PCR.
Aus dieser Gruppe entstammten 83 Tiere der Schneverdinger Herde, weitere 21 der
Tütsberger Herde, 15 Tiere der Herde Undeloher Straße und drei Tiere der Wilseder
Herde. Für zwei weitere Tiere konnte die Zugehörigkeit zu einer der drei
Gebrauchsherden nicht mehr eindeutig nachvollzogen werden. Die Altersstruktur des
Sektionsgutes ist Abbildung 1 zu entnehmen. Durch die detaillierte Buchführung in
der Herdbuchzucht konnte für alle Tiere der Schneverdinger Herde das exakte Alter
ermittelt werden. Für die Tiere aus den drei Gebrauchsherden lagen derartige Daten
nicht vor. Bei diesen wurde daher eine Zahnaltersbestimmung vorgenommen. Nach
dem Wechsel aller Incisivi ist hiernach eine exakte Altersbestimmung jedoch nicht
mehr möglich, so dass für zehn Tiere lediglich die Aussage „vier Jahre oder älter“
1 Die Sektion und die histologische Untersuchung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der Landwirtschaftlichen Untersuchungs- und Forschungsanstalt (LUFA) Nord-West
80 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
getroffen werden konnte (zum Zahnwechsel bei Schafen siehe SCHUMMER und
HABERMEHL (1987)). Siebenunddreißig der 124 Sektionstiere (29,8%) waren jünger
als vier Jahre alt; 70,2% waren vier Jahre und älter, die ältesten beiden Tiere waren
elf Jahre alt. Der hohe Anteil älterer Tiere ist durch die überalterte Herdenstruktur der
Schneverdinger Herde bedingt, die einen Großteil des Sektionsgutes ausmachte.
Altersstruktur des Sektionsgutes n=124
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4
Alter (Jahre)
Abbildung 1: Altersstruktur der Sektionstiere aus LA-positiven Herden
B Schlachttiere Zusätzliche Blut- und Gewebeproben sowie bei einer geringen Tierzahl (n=17) auch
Lungenspülproben wurden von insgesamt 127 Schlachttieren aus den genannten
vier Lungenadenomatose-positiven Herden gewonnen. Von diesen Tieren stammten
neun aus der Schneverdinger Herde, 60 Tiere entstammten der Tütsberger Herde,
41 der Herde Undeloher Straße und 17 Tiere der Wilseder Herde. Das genaue Alter
war lediglich von den neun Schneverdinger Tieren bekannt (sieben Lämmer und
zwei Jährlinge), bei den anderen Tieren konnte bei der Lebenduntersuchung an den
Schlachtstätten lediglich eine Einteilung in Lämmer und adulte Tiere vorgenommen
werden. Die Altersstruktur der Schlachttiere ist in Tabelle 3 dargestellt:
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 81
Tabelle 3: Altersstruktur der Schlachttiere aus LA-positiven Herden (n=127)
Alter (Jahre) Anzahl relativer Anteil (%)
Lämmer < 1 82 64,6
Adulte (Jährlinge oder älter)
45 35,4
C Lämmerblutproben Während der Lammzeit 2001 und in den folgenden Wochen und Monaten wurden
von 18 in der Tütsberger Herde geborenen und verbliebenen Lämmern regelmäßig
Blutproben entnommen. Die erste Blutprobenentnahme erfolgte bei 17 Tieren direkt
nach der Geburt vor der ersten Kolostrumaufnahme, die zweite Entnahme im Alter
von zehn bis 14 Tagen. Das Lamm mit der Nummer 60 wurde, obwohl es vor Beginn
dieser Studie geboren war und daher keine präkolostrale Blutprobe gewonnen
werden konnte, dennoch in die weiteren Blutprobenentnahmen einbezogen, da seine
Mutter klinisch an Lungenadenomatose erkrankt und es daher einer hohen
natürlichen Infektionsdosis ausgesetzt war. Das Muttertier des Lammes 377 litt
ebenfalls an klinischer Lungenadenomatose. Die Muttertiere der übrigen Lämmer
waren zum Zeitpunkt der Geburt klinisch unauffällig. Es folgten bei allen Tieren
sieben weitere wöchentliche Blutentnahmen bis zum Alter von neun bis zehn
Wochen und eine weitere im Alter von circa fünf Monaten. Zwei Tiere erreichten
dieses Lebensalter nicht. Die genaue Todesursache ist nicht bekannt, da die Tiere
von dem Schäfer nicht zur Untersuchung eingesandt wurden. Im neunten
Lebensmonat wurden von allen verbleibenden Tieren erneut Blutproben und auch
Lungenspülproben entnommen. Ein Tier war zu diesem Zeitpunkt vermutlich durch
Verlust der Ohrmarke nicht mehr auffindbar. Nach Ablauf der Wartezeit des zur
Entnahme der Lungenspülproben angewandten Allgemeinanaesthetikums (siehe
3.5.2 A) wurden 12 Tiere im zehnten Lebensmonat geschlachtet, die Lungen
makroskopisch beurteilt und Gewebeproben für die Histologie und PCR gewonnen.
82 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Ein weiteres Tier wurde im Alter von 15 Monaten geschlachtet und in gleicher Weise
untersucht. Zwei Tiere verblieben als Zutreter in der Herde. Eine Übersicht über
diese Tiere ist in Tabelle 4 gegeben.
Tabelle 4: Übersicht der Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen regelmäßige Blutentnahmen erfolgten Lamm
OM Mutter geboren 1.
Blut-entn.
11. Blutentn.
+ BAL
Schlachtung Lungenbefund (makroskopisch u. histologisch)
377 klin. LA 09.02.2001 09.02. 02.11. 03.12.2001 positiv
372 10.02.2001 10.02. vorab gestorben (keine Hinweise auf LA)
371 10.02.2001 10.02. 02.11. 03.12.2001 fraglich
60 klin. LA 28.01.2001 11.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
363 12.02.2001 12.02. 02.11. 02.05.2002 positiv
362 12.02.2001 12.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
365 12.02.2001 12.02. Schicksal unbekannt (Ohrmarkenverlust?)
352 13.02.2001 13.02. 02.11. noch im Bestand (Zutreter)
347 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
349 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
350 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
354 13.02.2001 13.02. vorab gestorben (keine Hinweise auf LA)
348 13.02.2001 13.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
351 13.02.2001 13.02. 02.11. noch im Bestand (Zutreter)
326 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
325 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
331 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
370 15.02.2001 15.02. 02.11. 03.12.2001 negativ
OM: Ohrmarke; Blutentn.: Blutentnahmetermin klin.: klinisch
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 83
3.3.2 Tiere und Probenmaterial aus der mutterlos aufgezogenen (Döhler) Herde
A Sektionen
Im Zeitraum vom Herbst 2000 bis Ende 2003 gelangten neun verendete, über sechs
Monate alte Tiere aus der Döhler Herde zur Sektion2. Die Lungen dieser Tiere
wurden pathohistologisch untersucht und, soweit möglich, Gewebeproben für die
PCR entnommen. Ende des Jahres 2002 wurden die genannten Altböcke aus
züchterischen Gründen aus der Herde entfernt. Sie wurden nach der Entnahme von
Lungenspülproben euthanasiert, am Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule seziert, die Lungen makroskopisch und histologisch untersucht sowie
Lungen- und Lymphknotengewebeproben für die Untersuchung mittels PCR
entnommen.
B Schlachttiere
Die Lungen sämtlicher Schlachttiere im Zeitraum vom Frühjahr 2001 bis Ende 2003
(n=299) wurden makroskopisch untersucht. Von jedem der insgesamt 105 Tiere, die
zwischen dem Frühjahr 2001 und Frühjahr 2002 geschlachtet wurden, wurden
jeweils Lungengewebeproben und Lymphonodus (Ln.) mediastinalis caudalis für eine
systematische histologische Untersuchung sowie ein Teil des Ln. mediastinalis
caudalis für die Untersuchung mittels PCR entnommen. 104 dieser Tiere waren
Jungtiere im Alter von circa neun bis vierzehn Monaten, ein weiteres Tier war zum
Zeitpunkt der Schlachtung knapp drei Jahre alt (Geburtsjahrgang 1999).
Die 194 geschlachteten Tiere im Zeitraum vom Herbst 2002 bis Ende 2003 (184
Lämmer zwischen neun und vierzehn Monaten, zehn Alttiere der Jahrgänge 1999 bis
2001) wurden aus Kostengründen lediglich makroskopisch beurteilt. Bei
makroskopischen Abweichungen vom Normalbefund, bei sämtlichen geschlachteten 2 Die Sektion und die histologische Untersuchung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nord-West
84 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Alttieren (n=10) sowie bei einer Stichprobe makroskopisch unveränderter Lungen
(insgesamt 64 Tiere) wurde zusätzlich eine systematische histologische
Untersuchung durchgeführt. Auf eine routinemäßige Untersuchung der Lymphknoten
mittels PCR wurde bei diesen Tieren aus Kostengründen verzichtet.
C Lungenspülproben
Im Sommer der Jahre 2001 und 2002 wurden von allen Tieren der Geburtsjahrgänge
1999 und 2000 sowie den Altböcken Lungenspülproben für die Untersuchung mittels
PCR entnommen (n=121 im Jahr 2000 bzw. n=119 im Jahr 2001)).
Im Sommer 2003 wurde die Entnahme von Lungenspülproben unter Anleitung der
Autorin durch Frau Sandra Stamm und Herrn Klaus Schlotter (Klinik für kleine
Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule) wiederholt. Zu diesem Zeitpunkt wurden
zusätzlich zu den Jahrgängen 1999 und 2000 auch die Tiere des Geburtsjahrganges
2001 (mutterlos aufgezogene Lämmer aus der Schneverdinger und Tütsberger
Herde sowie in der Döhler Herde geborene und durch ihre Mütter aufgezogene
Tiere) in die Probenentnahme einbezogen. Insgesamt wurden im Sommer 2003 von
393 Tieren Lungenspülproben gewonnen.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 85
3.4 Klinische Untersuchung
3.4.1 Sektionstiere
Alle in die Klinik für kleine Klauentiere eingestellten Schafe wurden eingehend
klinisch untersucht und es wurden zu folgenden Punkten Befunde erhoben und
dokumentiert:
A Allgemeinuntersuchung unter Berücksichtigung von
• Haltung
• Verhalten
• Ernährungszustand
• Habitus
• Schleimhautfarbe
• Atemfrequenz
• Pulsfrequenz
• Körpertemperatur
• Zahnalter
B spezielle Untersuchung aller Organsysteme
• Haut/Vlies
• Herz/Kreislaufsystem
• Lymphknoten
• Digestionstrakt
• Bewegungsapparat
• Sinnesorgane/ZNS
• Harn- und Geschlechtsapparat, Euter
86 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
C spezielle Untersuchung des Atmungsapparates
• Atemtyp (costoabdominal, vermehrt abdominal, vermehrt costal)
• Nasenausfluß (Charakter und Menge, spontan oder provoziert durch
Anheben an den Hintergliedmaßen; sog. „Schubkarrentest“)
• Husten (spontan oder provoziert durch Kompression der ersten
Trachealspangen)
• Auskultation von Kehlkopf, Trachea und beider Lungen mit Dokumentation
der Lokalisation (laryngotracheal, tracheobronchial, bronchobronchulär),
des Grades (geringgradig, mittelgradig, hochgradig, höchstgradig) und des
Charakters der Atemgeräusche. Deren Benennung wurde nach STÖBER
(1990b) vorgenommen.
Die Tiere wurden anhand der in der Allgemeinuntersuchung und speziellen
Untersuchung des Atmungsapparates erhobenen Befunde in vier klinische Gruppen
eingeteilt:
A klinisch ohne besonderen Befund
B respiratorische Symptome verschiedenen Grades, die Hinweise oder
Verdachtsmomente auf eine Erkrankung des Respirationstraktes geben,
jedoch aufgrund ihres Grades und ihrer Ausprägung eine Abgrenzung
zwischen eventuell beginnender Lungenadenomatose und anderen
Erkrankungen des Atemtraktes nicht erlauben.
(verschärfte Atemgeräusche und/oder kontinuierliche Nebengeräusche
verschiedenen Grades, trockener Husten und ggf. Dyspnoe, jedoch kein Nasenausfluß, keine diskontinuierlichen Nebengeräusche, Schubkkarrentest negativ)
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 87
C klinischer Verdacht auf Lungenadenomatose
(kein Nasenausfluß, Schubkarrentest negativ, jedoch pathologische
diskontinuierliche Nebengeräusche mit feuchtem oder rasselndem Charakter)
D klinische Lungenadenomatose
(hochgradige diskontinuierliche Nebengeräusche mit feucht-rasselndem
Charakter sowie spontaner oder provozierter Nasenausfluß; Schubkarrentest positiv, Abgang von schaumig-serösem Sekret)
3.4.2 Schlachttiere
Eine eingehende klinische Untersuchung der Schlachttiere nach obigem Muster
konnte aus Gründen der Betriebsabläufe nicht durchgeführt werden. Die
Lebenduntersuchung beschränkte sich bei diesen Tieren daher auf die Adspektion
mit besonderem Augenmerk auf Atemfrequenz, Atemtyp, spontenen Husten,
spontanen Nasenausfluß sowie bereits ohne Phonendoskop wahrnehmbare
Atemgeräusche.
3.4.3 Klinische Untersuchung der Döhler Herde
Alle Herden des VNP einschließlich der Döhler Herde werden durch den Schaf- und
Ziegengesundheitsdienst von Prof. Dr. M. Ganter betreut. Dies beinhaltet einen
routinemäßigen Turnus von mindestens zwei Bestandsbesuchen im Jahr. Die
Besuchsfrequenz der Döhler Herde durch Prof. Ganter, die Autorin oder andere
Mitarbeiter der Klinik für kleine Klauentiere war aufgrund des beschriebenen
Sanierungsversuches und diverser Probenentahmetermine wesentlich höher. Tiere,
die husteten, wurden sofern sie nicht auf einfache therapeutische Maßnahmen durch
den Haustierarzt ansprachen, prinzipiell baldmöglichst geschlachtet und die Lungen
makroskopisch und histologisch sowie zum Teil mikrobiologisch untersucht.
88 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.5 Probenentnahme
Alle verwendeten Materialien, Gebrauchslösungen und Geräte sind in einer Liste im
Anhang aufgeführt.
3.5.1 Blutentnahme
Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena jugularis mit 10 ml Lithium-heparinisierten
Vacutainern (Fa. Medicalis, Garbsen). Bis zur Weiterverarbeitung der Proben wurden
sie bei 4°C maximal über Nacht gelagert. Bei den zur Sektion vorgesehenen Tieren,
die in der Klinik eingestallt waren, erfolgte die Weiterbearbeitung direkt im Anschluß
an die Entnahme im Labor der Klinik für kleine Klauentiere. Bei den Schlachttieren
konnten die Proben in der Regel erst am Abend des Schlachttages, in Einzelfällen
auch erst am folgenden Morgen weiterverarbeitet werden. Für die Buffy-Coat-
Isolation aus den während der Lammzeit 2001 gewonnenen Lämmerblutproben
wurde in den Räumlichkeiten des VNP auf dem Hof Tütsberg ein Behelfslabor
eingerichtet, so dass keine wesentlichen zeitlichen Verzögerungen in der
Probenbearbeitung auftraten.
3.5.2 Lungenspülproben
A Entnahme von Lungenspülproben nach endotrachealer Intubation
Für die Entnahme der Lungenspülproben wurde ein Verfahren entwickelt, das die
Entnahme von Proben von größeren Tierzahlen auch unter Bestandsbedingungen
ermöglichte. Dies erfolgte durch Adaptation eines für das Kalb beschriebenen
Verfahrens (FOGARTY et al. 1983; CALDOW 2001). Anders als dort beschrieben
war es beim Schaf nicht möglich, über die Nase einzugehen, weil die eingeführten
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 89
Schläuche regelmäßig abgeschluckt wurden. Auch ein transtrachealer Zugang
(WORKU 1994) erwies sich als nicht praktikabel.
Die Schafe wurden mittels intravenöser Gabe einer Dosis von 8 - 10 mg/kg Ketamin
(UrsotaminR, Serumwerk Bernburg AG) kurzzeitig immobilisiert, um das Einführen
eines Tubus in die Trachea zu ermöglichen. Nach Wirkungseintritt der Anästhesie
wurde das Schaf von einem Helfer in Brust-Bauchlage verbracht, der Kopf
überstreckt und mithilfe eines Laryngoskopes der Kehlkopf dargestellt. Dieser wurde
über einen Zerstäuber mit zweiprozentigem Lokalanästhetikum (Isocain ad us. vet.,
Selectavet) benetzt und anästhesiert. Ein ca. 40 cm langes Stück klarer PVC-
Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,8 cm und einer Wanddicke von 2 mm
wurde innen mit sterilem Gleitgel (BoviConceptR Gleit-Gel; A. Albrecht GmbH,
Aulendorf) benetzt und auf einen Führungsstab aus Edelstahl geschoben. Mithilfe
dieses Führungsstabes erfolgte unter Sichtkontrolle in der Inspirationsphase
(maximale Öffnung der Stimmritze) die Einführung des „Behelfs-Tracheotubus“ in die
Trachea. Der Führungsstab wurde entfernt, das proximale Ende des PVC-
Schlauches durch den Helfer fixiert, seitlich im Bereich des Diastema aus dem Maul
geführt und der Kopf in eine physiologische Haltung verbracht. Der korrekte Sitz des
Schlauches in der Trachea konnte durch atemsynchrones Beschlagen der klaren
Schlauchwand leicht überprüft werden. Durch diesen Schlauch wurde eine sterile,
100 cm lange Ernährungssonde (Aesculap AG, Melsungen) soweit vorgeschoben,
bis sie in einem kleinen Bronchus zu liegen kam und ein Weiterschieben nicht mehr
möglich war. Wichtig ist die ausreichende Verwendung von Gleitgel, um ein leichtes
Vorwärtsschieben der Sonde in dem PVC-Schlauch zu gewährleisten und ein
vorzeitiges Steckenbleiben zu vermeiden. An der Ernährungssonde wurde zuvor das
mit zwei seitlichen Öffnungen versehene distale Ende mit einer Schere direkt über
diesen abgeschnitten, um eine zentrale Öffnung zu erlangen. Hierdurch wird bei der
Aspiration der Spülflüssigkeit die Bronchialwand geschont. Mit Einwegspritzen
wurden nun in vier Fraktionen jeweils 25 ml sterile 0,9%ige Kochsalzlösung (B.
Braun Melsungen AG) instilliert und sofort wieder aspiriert. Alle vier Spülfraktionen
wurden in einem sterilen Schraubdeckelgefäß gesammelt und bis zur
90 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Weiterverarbeitung gekühlt. PVC-Schlauch und Ernährungssonde wurden aus der
Trachea entfernt und das Schaf bis zum Nachlassen der Ketaminwirkung in Brust-
Bauchlage gelagert. Beide an der Probenentnahme beteiligten Personen trugen
Latex-Handschuhe, die zwischen den Tieren gewechselt wurden. Es standen drei
Laryngoskopspatel zur Verfügung, die zwischen den einzelnen Tieren in
Desinfektionsmittel (HelipurR-Konzentrat in fünfprozentiger Lösung, Fa. Omnilab,
Gehrden) eingelegt und abgewaschen wurden. Mit dem zur Kehlkopfanästhesie
verwendeten Bronchialzerstäuber bestand kein direkter Tierkontakt, er wurde für alle
zu einem Termin zu spülenden Tiere verwendet und anschließend gereinigt und
desinfiziert. An einem Termin wurden jeweils nur Tiere aus Lungenadenomatose-
positiven Herden oder der mutterlos aufgezogenen Herde beprobt. Für jedes Tier
wurde ein eigener, zuvor gereinigter und desinfizierter Führungsstab verwendet. Bei
allen anderen Materialien handelte es sich um Einwegmaterialien.
B Entnahme von Lungenspülproben mithilfe eines flexiblen Endoskops
Bei einzelnen klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Tieren wurde nach einer
bei GANTER (1996) detailliert beschriebenen Methode über ein flexibles Endoskop
eine Lungenspülung durchgeführt. Dies diente der Gewinnung eines möglich großen
Probenvolumens, aus dem durch Aliquotierung Positivkontrollen für die PCR
hergestellt wurden.
3.5.3 Gewebeproben
A Entnahme von Gewebeproben bei Schlachttieren
Die Schlachtung der Tiere erfolgte in zwei ortsansässigen handwerklichen
Schlachtbetrieben in Behringen und Egestorf. Die maximale Anzahl bei einem
Schlachttermin beprobter Tiere betrug 20 Stück. Die Betäubung wurde je nach
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 91
Betrieb mittels Elektrozange bzw. Bolzenschuß durchgeführt, und die Tiere wurden
gemäß der betriebsinternen Routine entblutet, abgezogen und hergerichtet sowie die
Bauchhöhlenorgane entnommen. Für Tiere aus der Herde Döhle wurde jeweils ein
eigener Schlachttermin anberaumt, an dem außer diesen Tieren keine weiteren
Schafe geschlachtet wurden. Um eine Kreuzkontamination zwischen den einzelnen
Tieren bereits bei der Probennahme zu vermeiden, erfolgte die Eröffnung des Thorax
und die Entnahme der Lunge mit einem sterilen Messer. Hierfür wurden
handelsübliche hitzesterilisierbare Fleischermesser verwendet. Für jedes Tier wurde
ein eigenes, gereinigtes und desinfiziertes, für 20 min bei 121°C und 1,5 bar
autoklaviertes und individuell verpacktes Messer verwendet. Für diese Arbeiten trug
der jeweilige Mitarbeiter armlange Plastikhandschuhe, die zwischen der
Organentnahme bei den einzelnen Tieren gewechselt wurden. Die Lungen wurden
direkt nach der Entnahme einzeln in saubere Plastiktüten verpackt. Eine direkte
weitere Probenentnahme im Schlachtbetrieb war aus Gründen der Betriebsabläufe
nicht möglich. Nach Abschluß der Organentnahme wurden die Lungen daher in die
nahe gelegenen Räumlichkeiten des VNP auf dem Hof Tütsberg verbracht. Dort
wurde jede Lunge makroskopisch beurteilt, die Befunde dokumentiert und Gewebe
von vier definierten Lokalisationen (Pars caudalis des linken Spitzenlappens, Pars
cranialis des rechten Spitzenlappens und rechter und linker Hauptlappen) sowie die
Hälfte des Ln. mediastinalis caudalis für die histologische Untersuchung entnommen
und in zehnprozentigem, neutral gepuffertem Formalin eingelegt. Falls
makroskopisch erkennbare Lungenveränderungen an anderen als den vier
Standardlokalisationen bestanden, wurden von diesen zusätzliche Proben
entnommen. Zudem erfolgte die Entnahme eines Teils des Ln. mediastinalis caudalis
sowie von Lungengewebe von zwei definierten Lokalisationen (Pars caudalis des
linken Spitzenlappens und cranioventraler Teil des rechten Hauptlappens) für die
Untersuchung mittels PCR. Hierfür wurden für jede Probe individuelle, sterile
Bestecke verwendet. Die Probenentnahme erfolgte mit Latexhandschuhen, die
zwischen jeder Lunge gewechselt wurden. Als Arbeitsunterlage dienten saubere
Plastiktüten, von denen ebenfalls für jede Lunge eine neue verwendet wurde. Die für
92 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
die Untersuchung mittels PCR vorgesehenen Gewebeproben wurden in 2 ml Safe-
Lock Eppendorfgefäße verbracht und nach Abschluß der Probenentnahme vor Ort in
flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zeitverzögerung zwischen Schlachtung des
ersten Tieres und Einfrieren der Proben betrug maximal vier Stunden. Nach der
Rückkehr nach Hannover wurden die Proben bis zur Weiterverarbeitung bei –80°C
gelagert.
Die Lokalisation der Standardproben für die histologische Untersuchung ist
Abbildung 2 zu entnehmen.
Abbildung 2: Lokalisation der vier Standard-Lungengewebeproben für die histologische Untersuchung (Darstellung der Lunge in Dorsalansicht nach NICKEL und WILKENS (1987). Die Lage des ventral gelegenen Lobus accessorius ist gestrichelt eingezeichnet. Die Rechtecke kennzeichnen die Lage der für die histologische Untersuchung routinemäßig entnommenen Proben. Zusätzlich wurde auch der im caudalen Mediastinum gelegene Lymphonodus mediastinalis caudalis entnommen)
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 93
B Entnahme von Gewebeproben während der Sektion
Die zur Sektion vorgesehenen Tiere wurden an der Klinik für kleine Klauentiere durch
intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital (EuthaR 77, Essex Tierarznei)
euthanasiert und an das Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover verbracht. Dort erfolgte nach Feststellung des Gewichtes des Tierkörpers
die Sektion durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des Instituts für
Tiergesundheit der LUFA Nordwest. Für jedes Tier wurde ein eigenes, steriles
Sektionsbesteck verwendet und analog der Probenentnahme bei den Schlachttieren
Proben für die histologische Untersuchung sowie die Untersuchung mittels PCR
gewonnen. Die Entnahme letztgenannter Proben erfolgte unter sterilen Kautelen mit
für jede Probe individuellen Bestecken. Zusätzlich wurde die Lunge gewogen. Zur
Ermittlung des Organgewichtes wurden Herz, Zwerchfell, Aorta und Trachea (vor
Abgang des Bronchus trachealis) entfernt. Die für die PCR-Untersuchung
vorgesehenen Gewebeproben wurden zeitnah in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bis zur Weiterverarbeitung bei – 80°C gelagert. Die Zeitverzögerung zwischen
dem Tod des Tieres und dem Einfrieren der Proben betrug maximal zwei Stunden.
3.6 Probenbearbeitung
3.6.1 Allgemeine Maßnahmen
Alle Arbeitsschritte wurden in einem eigens der Probenbearbeitung vorbehaltenen
Raum mit ebenfalls nur für diesen Arbeitsplatz genutzten Geräten unter sterilen
Kautelen durchgeführt. Zwischen den Arbeitsschritten wurden die Arbeitsflächen mit
70%igem Ethanol gereinigt. Bei der Bearbeitung der Proben wurden ständig Latex-
Einweghandschuhe getragen und zwischen den Arbeitsschritten gewechselt. Zur
Herstellung von Puffern verwendete Glasgefäße und Gerätschaften wurden zuvor bei
180°C für 3h ausgebacken. Die Lösungen wurden nach der Herstellung in
94 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
ausgebackene Glasgefäße sterilfiltriert. Es wurden ausschließlich DNAse- und
RNAse-freie Mikroreaktionsgefäße verwendet, die vor der Verwendung bei 121°C
und 1,5 bar für 20 min autoklaviert wurden. Es wurden ebenfalls ausschließlich
sterile, DNAse- und RNAse-freie Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet.
3.6.2 Buffy-Coat-Präparation
Die Präparation des Buffy-Coat erfolgte durch Zentrifugation, anschließende Lyse
der Erythrozyten mit Tris-gepufferter 0,16 molarer Ammoniumchloridlösung und
zweimalige Waschung der Buffy-Coat-Zellen mit PBS (DEWAR und SHARP 2000,
pers. Mitteilung).
Das durch Li-Heparin gerinnungsgehemmte Vollblut wurde bei 3300 x g bei
Raumtemperatur zehn Minuten zentrifugiert. Die zwischen Erythrozyten und Plasma
deutlich sichtbare, weißliche Buffy-Coat-Schicht wurde mit einer sterilen 3 ml Plastik-
Einmalpasteurpipette (LiquipetteTM, Roth, Karlsruhe) abgenommen und in ein
ebenfalls steriles, unten spitz zulaufendes 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner
CellStarR, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen) überführt. Das Röhrchen wurde
mit 10 – 15 ml Tris-gepufferter 0,16 molarer Ammoniumchloridlösung aufgefüllt,
geschwenkt und bei Raumtemperatur inkubiert, bis die enthaltenen Erythrozyten
lysiert waren (ca. zwei bis fünf Minuten). Anschließend wurden die Proben erneut bei
2200 x g zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Hierdurch sammelten sich
die Buffy-Coat-Zellen als Pellet am Boden des Röhrchens. Der Überstand wurde
vorsichtig abgegossen und verworfen, und die Röhrchen kopfüber auf saugfähiges
Papier gestellt. Mit einer sterilen Plastik-Pasteurpipette wurde das Pellet in ca. 1 ml
PBS resuspendiert und in ein steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Dieses
wurde für eine Minute bei Raumtemperatur bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wurde mit einer Pipette abgenommen und verworfen und das entstandene
Pellet erneut in 1 ml PBS resuspendiert. Diese Suspension wurde jeweils auf zwei
sterile 1,7 ml Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Es folgte ein zweiter
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 95
Zentrifugationsschritt bei 16.000 x g. Der Überstand wurde erneut abpipettiert und
verworfen. Die gewonnenen Pellet wurden bei –80°C eingefroren und bis zur
Weiterverarbeitung gelagert.
Vor der routinemäßigen Anwendung dieser Methode wurden die Leukozyten von 10
Blutproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert und mithilfe eines
Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200 x g und 20°C
(Varifuge 20 RS + Zytosystem; Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) auf
Objektträger verbracht (GANTER 1996). Nach Färbung nach Pappenheim wurden
die Zellen hinsichtlich ihrer Integrität lichtmikroskopisch beurteilt.
3.6.3 Lungenspülproben
Die gewonnenen Spülproben wurden zunächst makroskopisch beurteilt. Hierzu
wurde die Menge der rückgewonnenen Spülflüssigkeit, deren Farbe (durch
eventuelle Schleimhautblutungen) sowie Beimengungen (evtl. Futterpartikel)
dokumentiert. Für den Grad der makroskopisch erkennbaren Blutbeimengungen
wurde eine subjektive Skala von 0 bis 3 (gegebenenfalls unter Verwendung von
Zwischenstufen) genutzt.
0 = makroskopisch ohne Blutbeimengungen
1 = makroskopisch geringgradige Blutbeimengungen
2 = makroskopisch mittelgradige Blutbeimengungen
3 = makroskopisch hochgradige Blutbeimengungen
Die Proben wurden anschließend in eine der Probenmenge entsprechende Anzahl
sterile, unten spitz zulaufende 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner CellStarR, Greiner
Bio-One GmbH, Frickenhausen) umgefüllt und bei 4°C zehn Minuten bei 200 x g
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das am Boden des Röhrchens
befindliche Sediment jeweils im verbleibenden Restüberstand mit einer sterilen 3 ml
96 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Plastik-Pasteurpipette (LiquipetteTM , steril, Roth, Karlsruhe) resuspendiert. Sofern
von einem Tier zu Beginn mehrere Zentrifugenröhrchen befüllt wurden, wurden die
resuspendierten Sedimente nun in einem Röhrchen gepoolt. Falls keine oder nur
eine geringgradige Blutbeimengung bestand, wurde das gepoolte Sediment mit einer
sterilen 3 ml Pasteurpipette in ein (je nach geschätzter Zellmenge auch zwei)
ebenfalls steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt, bei ca. 16 000 x g
zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Das Pellet wurde bei –80°C eingefroren
und bis zur Weiterverarbeitung gelagert.
Bei größerer Blutbeimengung (2 oder 3) wurde nach dem Poolen des Sediments das
Zentrifugenröhrchen mit 10 bis 15 ml Tris-gepufferter 0,16 molare
Ammoniumchloridlösung aufgefüllt und zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert, bis die Erythrozyten lysiert waren. Anschließend wurden die Proben
entsprechend der Blutprobenpräparation bei 2200 x g zehn Minuten bei
Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und
verworfen, und die Röhrchen kopfüber auf saugfähiges Papier gestellt. Mit einer
sterilen Plastik-Pasteurpipette wurde das Pellet in ca. 1 ml PBS resuspendiert und in
ein steriles 1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Dieses wurde für eine Minute bei
Raumtemperatur bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer
Pipette abgenommen und verworfen und das entstandene Pellet erneut in 1 ml PBS
resuspendiert. Es folgte ein zweiter Zentrifugationsschritt bei 16.000 x g. Der
Überstand wurde erneut abpipettiert und verworfen. Das gewonnene Pellet wurde bei
–80°C eingefroren.
Falls Futterbeimengungen vorhanden waren, wurde die Probe vor Beginn zunächst
durch eine Doppelschicht Gaze filtriert und anschließend wie oben beschrieben
weiterbehandelt.
Vor der routinemäßigen Anwendung dieser Methode wurden die Zellpellets von zehn
Lungenspülproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert und mithilfe eines
Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200xg und 20°C (Varifuge
20 RS + Zytosystem; Fa. Heraeus Sepatech GmbH, Osterode) auf Objektträger
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 97
verbracht (GANTER 1996). Nach Färbung nach Pappenheim wurden die Zellen
hinsichtlich Ihrer Integrität mikroskopisch beurteilt.
3.6.4 Formalinfixierung, Paraffineinbettung, Herstellung von Gewebeschnitten und histologische Untersuchung
Die entnommenen Gewebeproben wurden mindestens 24 Stunden in
zehnprozentigem, neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Entwässerung in einer
aufsteigenden Alkoholreihe und Paraffineinbettung sowie die Herstellung und
Färbung der Gewebeschnitte erfolgten automatisiert bzw. durch das Personal des
Instituts für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Die histologische
Untersuchung der Gewebeschnitte von jeweils mindestens vier definierten
Lungenlokalisationen sowie des Lymphonodus mediastinalis caudalis in der HE-
Färbung erfolgte durch Herrn Dr. Michael Brügmann, Abteilung Pathologie des
Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nordwest.
3.7 Gesamt-DNA-Isolierung
3.7.1 Allgemeine Maßnahmen
Diese Arbeiten erfolgten in denselben Räumlichkeiten wie die Probenaufbereitung.
Es wurden ebenfalls die unter 3.6.1 beschriebenen allgemeinen Maßnahmen
eingehalten.
3.7.2 Gesamt-DNA-Isolierung aus Buffy-Coat- und Lungenspülprobenzellen
Die Isolierung von Gesamt-DNA aus den genannten Proben erfolgte nach dem
Protokoll für Zellkulturzellen des DNeasyR Tissue Kit der Fa. Qiagen. Das Prinzip
98 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
dieses Kits beruht auf der Lyse von Gewebe bzw. Zellen mit anschließender
selektiver Bindung der DNA an die Membran der im Kit enthaltenen Säulen. Es
folgen zwei Wasch-Schritte und anschließend die Elution der gebundenen DNA
mithilfe eines Elutionspuffers. Alle Lösungen mit Ausnahme von PBS und Ethanol
sind im Kit enthalten.
Die tiefgefrorenen Zellpellets wurden aufgetaut und anschließend in 200 µl PBS
resuspendiert. Zu jeder Probe wurden 20 µl Proteinase K und 200 µl Puffer AL
zugegeben. Mit einem Vortex-Gerät wurden die Proben gut durchmischt und
anschließend für zehn Minuten bei 70°C in einem Wasserbad inkubiert.
Anschließend wurden 200 µl 99,8%iges Ethanol zugegeben und erneut gemischt.
Diese Mischung wurde auf eine im Kit enthaltene Säule gegeben und für eine Minute
bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Das Eluat und das Reaktionsgefäß wurden verworfen
und die Säule auf ein neues, ebenfalls im Kit enthaltenes Reaktionsgefäß gesteckt.
Auf die Säule wurden nun 500 µl Puffer AW1 (Waschpuffer 1) gegeben und erneut
bei ca. 16.000 x g zentrifugiert. Erneut wurden Eluat und Reaktionsgefäß verworfen,
die Säule auf ein neues Reaktionsgefäß verbracht und 500 µl Puffer AW2
(Waschpuffer 2) auf die Säule gegeben. Es folgte ein dreiminütiger
Zentrifugationsschritt bei ca. 16.000 x g. Eluat und Reaktionsgefäß wurden verworfen
und die Säule auf ein steriles, nicht im Lieferumfang des Kits enthaltenes, DNAse-
und RNAse-freies Mikroreaktionsgefäß verbracht. Von diesem war zunächst mit
einer mit 70%igem Ethanol gereinigten Schere der Deckel entfernt worden. Auf die
Säule wurden nun 200 µl Puffer AE (Elutionspuffer) gegeben und für eine Minute bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation bei ca. 16.000 x g für eine
Minute wurde die Säule verworfen und das Eluat mit der gelösten DNA in ein neues,
1,7 ml Mikroreaktionsgefäß überführt. Nach der Konzentrations- und
Reinheitsbestimmung über die OD260- und OD280-Messung im Spektrophotometer (s.
3.2.7.5) wurde die DNA bei –20°C eingefroren.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 99
3.7.3 Gesamt-DNA-Isolierung aus Gewebeproben
Gemäß des Protokolls für Gewebeproben des DNeasyR Tissue Kit wurde mit sterilen
Bestecken nach Auftauen der Probe ein kleines Gewebestück (max 25 mg) in ein
steriles, DNAse- und RNAse-freies 1,7ml Mikroreaktionsgefäß verbracht. Es wurden
180 µl Puffer ATL und 20 µl Proteinase K zugegeben und die Proben mithilfe eines
Vortex gut durchmischt. Anschließend wurden sie bei 55°C in einem
Schüttelwasserbad für mehrere Stunden bis zur vollständigen Auflösung des
Gewebestückes inkubiert. Während dieser Zeit wurden die Proben wiederholt mit
einem Vortex-Gerät gut durchmischt. Nach vollständiger Lyse des Gewebes wurden
200 µl Puffer AL zugegeben, erneut gemischt und bei 70°C für zehn Minuten im
Wasserbad inkubiert. Es folgte die Zugabe von 200 µl 99,8%igem Ethanol und die
Weiterpräparation analog dem oben beschriebenen Protokoll für die Zellproben.
3.7.4 Präparationskontrollen
Bei jeder DNA-Isolierung wurden jeweils eine positive und eine negative
Kontrollprobe mitgeführt und in gleicher Weise wie die anderen zu präparierenden
Proben behandelt. Für die Zellpräparationen handelte es sich hierbei routinemäßig
um BAL-Zellen eines klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Schafes aus der
Schneverdinger Herde (Positivkontrolle) und um Buffy-Coat eines klinisch gesunden
Schafes aus einer durch die Schlachtlungenuntersuchung und den Schaf- und
Ziegengesundheitsdienst Hannover langjährig kontrollierten, LA-unverdächtigen
Herde (Negativkontrolle). Für die Isolierung von DNA aus Gewebe wurde als
Positivkontrolle routinemäßig Tumorgewebe eines an Lungenadenomatose
erkrankten Schafes und als Negativkontrolle Gewebe des caudalen mediastinalen
Lymphknotens eines klinisch gesunden Schafes aus einer kontrollierten, LA-
unverdächtigen Herde eingesetzt. BAL-Zellen und Tumorgewebe bzw. Buffy-Coat
und Lymphknoten stammten jeweils von ein und demselben Tier. Die Proben waren
zu Beginn der Arbeit entnommen, aliquotiert und bei -80°C gelagert worden. Diese
100 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Präparationskontrollen wurden im folgenden gemeinsam mit den präparierten Proben
durch alle weiteren Schritte mitgeführt. Für besondere Fragestellungen wurden als
Negativkontrollen zudem Lungen- und Lymphknotengewebe und Leukozyten von
klinisch gesunden isländischen Schafen genutzt, die freundlicherweise von Herrn Dr. G. Georgsson (Institut für experimentelle Pathologie, Keldur-Universität, Reykjavik,
Island) zur Verfügung gestellt wurden. Zudem standen Blutproben gesunder Rinder
(Herkunft: Physiologisches Institut der Tierärztlichen Hochschule) sowie
Lungengewebe eines Rindes (Herkunft: Institut für Pathologie der Tierärztlichen
Hochschule) zur Verfügung.
3.7.5 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA
Nach der Elution der DNA wurde in einem sterilen, DNAse- und RNAse-freien
Mikroreaktionsgefäß eine Verdünnung 1:20 hergestellt. Hierzu wurden 30 µl der
gelösten DNA mit 570 µl DNAse-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) vermischt. Als
Leerwert wurde eine Mischung aus 30 µl Puffer AE und 570 µl Wasser verwendet.
Die photometrische Messung der optischen Dichte (OD) erfolgte mit einem Volumen
von 500 µl in einer Quarzküvette bei einer Wellenlänge von 260 und 280 nm. Die
Reinheit wurde durch Bildung des Quotienten OD260/OD280 bestimmt. Die
Berechnung der Konzentration der verdünnten Lösung erfolgte durch Multiplikation
der OD260 mit dem Faktor 50, da eine OD von 1 einer Konzentration von 50 ng/µl
doppelsträngiger DNA entspricht (SAMBROOK et al. 1989). Durch Multiplikation
dieses Wertes mit dem Verdünnungsfaktor 20 wurde auf die Ausgangskonzentration
der DNA-Lösung in ng/µl hochgerechnet.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 101
3.8 Molekularbiologische Untersuchungen
3.8.1 Allgemeine Maßnahmen
Alle Arbeitsschritte wurden unter sterilen Kautelen unter größtmöglicher Vorsicht zur
Vermeidung einer Kontamination mit DNAsen oder Fremd-DNA durchgeführt. Es
wurde eine strikte räumliche Trennung zwischen den fünf Arbeitsbereichen
1.) Probenbearbeitung und DNA-Isolierung
2.) Arbeiten mit Plasmid-DNA und JS7-Zellen (Herstellung und Aliquotieren von
Positivkontrollen)
3.) Herstellung des Mastermix
4.) Probenzugabe und Amplifikation sowie
5.) Elektrophorese
eingehalten. Zwischen den Räumen wurden die Arbeitskittel gewechselt. Es standen
an jedem Arbeitsplatz eigene Geräte und Materialien zur Verfügung. Für alle
Arbeitsschritte wurden ungepuderte Einweg-Latexhandschuhe getragen und
zwischen den Arbeitsschritten gewechselt. Die Arbeitsflächen wurden zwischen den
Arbeitsschritten mit 70%igem Ethanol gereinigt. Die zur Herstellung des PCR-
Reaktionsgemisches genutzte Sterilwerkbank wurde regelmäßig für 30 Minuten mit
UV-Licht bestrahlt. Es wurden ausschließlich DNAse- und RNAse-freie
Mikroreaktionsgefäße verwendet, die vor der Verwendung bei 121°C und 1,5 bar für
20 min autoklaviert worden waren. Es wurden ebenfalls ausschließlich sterile,
DNAse- und RNAse-freie Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet. Alle Zutaten
des Mastermixes wurden in kleinen Mengen aliquotiert. Es wurde für die
Durchführung der PCR und Verdünnung der Primer ausschließlich kommerziell
erhältliches Wasser für die Molekularbiologie (bidest. und Diethylpyrocarbonat-
(DEPC)-behandelt) verwendet. Bei allen PCR-Amplifikationen wurden in jeder
Reaktionscharge mindestens zwei Negativkontrollen in Form von DEPC-
behandeltem Wasser sowie die negative Präparationskontrolle mitgeführt. In jeder
Reaktionscharge wurden zudem drei Positivkontrollen in Form von Plasmid-DNA in
102 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
drei festen Verdünnungsstufen (Grenzwert-Positivkontrollen, siehe 3.8.4) sowie die
positive Präparationskontrolle mitgeführt.
Alle Kontrollen wurden stets wie die übrigen Proben behandelt. Alle Proben wurden
im Dreifachansatz untersucht. Eine Ausnahme bildeten die Lungenspülproben der
Döhler Herde aus dem Jahr 2003. Diese wurden unter Anleitung der Autorin durch
Frau Sabine Uhlenbruck (Klinik für kleine Klauentiere der Tierärztlichen Hochschule)
nach derselben Methode, jedoch lediglich im Doppelansatz untersucht.
3.8.2 Nachweis von JSRV mittels PCR (U3 LTR PCR)
Die verwendeten Primer entstammen der U3-Region der long terminal repeats (LTR).
Die PCR wird im folgenden daher als U3 LTR PCR bezeichnet. Zur Erhöhung der
Sensitivität ist ihr eine heminested (hn) PCR nachgeschaltet (PALMARINI et al.
1996b).
Die Untersuchung der Proben erfolgte mit einigen von DEWAR und SHARP (2000,
pers. Mitteilung) durchgeführten Modifikationen nach der Methode von PALMARINI
et al. (1996b) mit dem Ziel des Nachweises proviraler DNA. Als Amplifikationsvorlage
wurden 800 – 1000 ng Gesamt-DNA in einem Reaktionsvolumen von 50µl
eingesetzt. Das maximal eingesetzte Probenvolumen betrug 25 µl. Unterschiedliche
Probenvolumina wurden durch Vorlage von Wasser in das entsprechende
Reaktionsgefäß ausgeglichen, so dass sich das Volumen des Mastermixes als die
Differenz zwischen dem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl und dem größten
Probenvolumen errechnete.
Das Ansetzen und Aliquotieren des Mastermixes erfolgte unter einer Sterilwerkbank
in einem eigens diesen Arbeiten vorbehaltenen Raum. Diese wurde regelmäßig für
30 Minuten mit UV-Licht bestrahlt. Entsprechend der jeweils einzusetzenden
Probenmenge wurde zunächst in 0,2 ml PCR-Mikroreaktionsgefäße das
entsprechende Ausgleichsvolumen an Wasser vorgelegt. Der Ansatz des Mastermix
erfolgte in autoklavierten, DNAse- und RNAse-freien 2 ml Mikroreaktionsgefäßen.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 103
Die Zutaten wurden durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt und der
fertige Mastermix auf die PCR-Reaktionsgefäße verteilt. Pro Reaktionscharge wurde
an diesem Arbeitsplatz eine Negativkontrolle in Form von 5 µl DEPC-behandeltem
Aqua bidest. angesetzt und das Reaktionsgefäß unter der Sterilwerkbank
verschlossen. Die Zugabe der Proben einschließlich der positiven und negativen
Präparationskontrollen, der Plasmidkontrollen (s.u.) und einer weiteren Wasser-
Negativkontrolle (Volumen = 5 µl) erfolgte in einem anderen Raum, in dem auch die
Amplifikation stattfand. Die Reaktionskomponenten der U3 LTR PCR und das Zeit-
Temperaturprogramm sind nachfolgend in Tabelle 5 bis 7 aufgeführt. Das zu
erwartende Amplifikat hat eine Größe von 176 bp. Die Primer entsprachen der
Veröffentlichung von PALMARINI et al. (1996b). Sie wurden durch die Firma Roth
(Karlsruhe) synthetisiert. Die Berechnung der Schmelzpunkte erfolgte durch die
Herstellungsfirma.
Tabelle 5: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer für die U3 LTR PCR Bezeich-
nung Verwendung Sequenz (5’=> 3’) Schmelzpunkt
G/C-Regel/2+4-Regel
P-I Forward primer
U3 LTR PCR
TGG GAG CTC TTT GGC AAA AGC
49,2°C / 64°C
P-III
Reverse Primer
U3 LTR PCR
CAC CGG ATT TTT ACA CAA TCA
CCG G
52,6°C / 74°C
104 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 6: Reagenzien für die U3 LTR PCR Reagenzien eingesetzte
Konzentration Eingesetztes Volumen pro Reaktionsansatz
10 x PCR-Puffer 10 x 5 µl
MgCl2 25 mmol/l 2µl
Primer P-I 10 mmol/l 1 µl
Primer P-III 10 mmol/l 1 µl
dNTP-Stammlösung 10 mmol/l je dNTP 1 µl
Polymerase: Qiagen
HotStarTaqTM
5 units/µl 0,25 µl
Aqua bidest. ad 50 µl
Als Enzym wurde eine Hot-Start Polymerase verwendet (Qiagen HotStarTaqTM, Fa.
Qiagen, Hilden), so dass den Reaktionszyklen eine initiale Phase der
Enzymaktivierung bei 94°C vorangestellt ist.
Tabelle 7: Zeit-Temperaturprogramm für die U3 LTR PCR Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl
Initiale Denaturierung und
Enzymaktivierung
94°C 16 min -
Beginn Zyklus
Denaturierung 94°C 30 sec
Anlagerung 59°C 30 sec
Verlängerung 72°C 30 sec
34
Wiederholungen
Ende Zyklus
Finale Verlängerung 72°C 5 min -
Warten bis Entnahme 6°C unendlich -
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 105
3.8.3 Heminested (hn) PCR
Alle Proben, die in der U3 LTR PCR ein negatives oder fraglich positives Ergebnis
(d.h. eine sehr schwache/kaum sichtbare Bande der erwarteten Größe) zeigten,
wurden mittels hn PCR (PALMARINI et al. 1996b) nachuntersucht. Als Template
wurden hierfür 2 µl des Amplifikates der U3 LTR PCR verwendet. Das
Mastermixvolumen betrug konstant 48 µl. Die Arbeitsschritte erfolgten in der gleichen
Weise und unter denselben Bedingungen wie für die U3 LTR PCR beschrieben. Als
Negativkontrolle wurden unter der Sterilwerkbank 2 µl Aqua bidest. eingesetzt und
das Reaktionsgefäß verschlossen. Die Zugabe der Proben erfolgte auch hier in dem
separaten Raum, in dem die Amplifikation stattfand. An diesem Arbeitsplatz wurde
eine zweite Negativkontrolle in Form von 2 µl Aqua bidest. angesetzt. Zudem wurden
die beiden Wasser-Negativkontrollen der U3 LTR PCR sowie die negative
Präparationskontrolle wie alle anderen Proben mit der hn PCR nachuntersucht. Als
Positivkontrollen wurden mindestens die Amplifikate der zwei Plasmidverdünnungen
10-11 und 10-12 (siehe unten) eingesetzt. Das Amplifikat der im ersten Durchlauf
bereits stark positiven Präparations-Positivkontrolle wurde in der hn PCR ebenso wie
alle anderen in der U3 LTR PCR bereits deutlich positiven Proben nicht
nachuntersucht. Das zu erwartende Amplifikat der hn PCR hat eine Größe von 133
bp. Die Primer entsprachen der Veröffentlichung von PALMARINI et al. (1996b). Sie
wurden ebenfalls durch die Firma Roth (Karlsruhe) synthetisiert. Die Berechnung der
Schmelzpunkte erfolgte durch die Herstellungsfirma. Die verwendeten Primer,
Reagenzien und das Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR sind den Tabellen 8
bis 10 zu entnehmen.
106 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 8: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer der hn PCR Bezeich-
nung Verwendung Sequenz (5’=> 3’) Schmelzpunkt
G/C-Regel/2+4-Regel
P-I Forward primer
hn PCR
TGG GAG CTC TTT GGC AAA
AGC
49,2°C / 64°C
P-VI
Reverse Primer hn PCR
TGA TAT TTC TGT GAA GCA GTG
CC
48,4°C / 66°C
Tabelle 9: Reagenzien für die hn PCR Reagenzien eingesetzte
Konzentration Eingesetztes Volumen pro Reaktionsansatz
10 x PCR-Puffer 10 x 5 µl
MgCl2 25 mmol/l 2µl
Primer P-I 10 mmol/l 1 µl
Primer P-VI 10 mmol/l 1 µl
dNTP-Stammlösung 10 mmol/l je dNTP 1 µl
Polymerase: Qiagen
HotStarTaqTM
5 units/µl 0,25 µl
Aqua bidest. ad 50 µl
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 107
Tabelle 10: Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR
Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl
Initiale Denaturierung und
Enzymaktivierung
94°C 16 min -
Beginn Zyklus
Denaturierung 94°C 30 sec
Anlagerung 57°C 1 min
Verlängerung 72°C 1 min
34
Wiederholungen
Ende Zyklus
Finale Verlängerung 72°C 5 min -
Warten bis Entnahme 6°C unendlich -
3.8.4 Grenzwert-Positivkontrollen
Um laufend die Sensitivität der PCR-Reaktion zu überprüfen, wurden in jeder
Reaktionscharge insgesamt drei Verdünnungsstufen eines die volle provirale
Sequenz von JSRV enthaltenen Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a)
eingesetzt. Dieses wurde freundlicherweise von Dr. J. M. Sharp, Moredun Research
Institute, Penicuik, Schottland zur Verfügung gestellt. Ausgehend von einer
gemessenen Ausgangskonzentration der Plasmid-Stammlösung von 2,95 µg DNA/µl
und einer Gesamtmolekülgröße von 11,8 kb (Plasmid 3 kb, Insert 8,8 kb) wurde eine
Konzentration von 2,275 x 1011 Plasmidmolekülen pro µl Stammlösung errechnet
(DEWAR 2000, pers. Mitteilung).
Bis zum Erreichen der Verdünnungsstufe 10-8 wurden die Verdünnungsstufen jeweils
aus 10 µl Stammlösung bzw. vorangegangener Verdünnungsstufe und 990 µl TE-
Puffer hergestellt. Hierdurch wurde mit einem Arbeitsschritt eine Verdünnung um 2
Zehnerpotenzen erreicht. Zwischen jedem Verdünnungsschritt wurden die Lösungen
mithilfe eines Vortex gründlich durchmischt und kurz anzentrifugiert. Zur Herstellung
108 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
der Verdünnungsstufen 10-9, 10-10, 10-11 und 10-12 wurden jeweils 100µl der
vorangegangenen Verdünnungsstufe mit 900µl TE-Puffer vermischt. Die
Verdünnungsstufen 10-9, 10-11 und 10-12 wurden routinemäßig als Grenzwert-
Positivkontrollen in jeder PCR-Reaktionscharge eingesetzt. Für diesen Einsatz
wurden sie für die bessere Pipettierbarkeit zunächst 1:5 in TE-Puffer verdünnt,
aliquotiert und bei –20°C eingefroren. Jedes Aliquot wurde nur einmal verwendet und
nach der Entnahme von 5 µl als Positivkontrolle verworfen. Ein positives Ergebnis
war nach DEWAR (2000, pers. Mitteilung) in 100% der Fälle von den
Verdünnungsstufen 10-9 und 10-11 zu erwarten. War das nicht der Fall, so wurde das
Ergebnis der entsprechenden Reaktionscharge nicht gewertet und die Untersuchung
der betroffenen Proben wiederholt. In Tabelle 11 sind die verwendeten
Verdünnungsstufen und die in dem als Kontrolle eingesetzten Volumen von 5µl der
1:5 verdünnten Lösungen (entsprechend 1 µl der Ausgangslösungen) rechnerisch
enthaltene Anzahl der Plasmidmoleküle dargestellt.
Tabelle 11: Rechnerischer Gehalt an Plasmidmolekülen in 5 µl 1:5 verdünnter Plasmidlösung Verdünnungsstufe Moleküle pro 5µl 1:5 verdünnter Lösung
10-9 2,275 x 102 (= 227,5)
10-11 2,275 x 100 (= 2,275)
10-12 2,275 x 10-1 (= 0,2275)
3.8.5 Visualisierung der PCR-Produkte im Agarosegel
Agarose (SeaKemR LE Agarose, Biozym, Hess. Oldendorf) für ein 2%iges (m/V) Gel
wurde in einen Erlenmeyerkolben abgewogen, mit dem entsprechenden Volumen 1x
TBE-Puffer gemischt und im Mikrowellenherd bei 800 W Leistung erhitzt, bis die
Agarose vollständig gelöst war. Nach Abkühlung auf ca. 55 - 65°C wurde die Lösung
mit 5 µl GelStarR Nukleinsäurefarbstoff (Biozym) pro 50 ml Agaroselösung versetzt,
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 109
gut durchmischt und blasenfrei in eine vorbereitete Elektrophoresekammer
gegossen. Die Gele wurde stets kurz vor Gebrauch bzw. frühestens am Vorabend
angesetzt und über Nacht in Frischhaltefolie im Kühlschrank gelagert. Als Laufpuffer
wurde 1x TBE verwendet. Zu den PCR-Produkten wurden jeweils 4,5µl Glycerin-
Farbstoffpuffer pipettiert und durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gemischt. 20
µl dieser Mischung wurde jeweils in die Geltaschen aufgetragen. Als Größenmarker
wurde ein 100 bp-Marker verwendet. 2 µl dieses Längenmarkers wurden mit 2 µl des
Glycerin-Farbstoffpuffers und 18µl 1x TBE vermischt und 20 µl dieser Mischung in
die erste Geltasche gegeben. Die PCR-Produkte wurden je nach Größe des Gels bei
ca. 60 bzw. 90 Volt für ca. eineinhalb Stunden im Agarosegel elektrophoretisch der
Größe nach aufgetrennt. Zur Dokumentation wurden die Gele mithilfe eines
Blaulichttransilluminators bei 460-480 nm durchleuchtet und mit einem digitalen
Aufnahmesystem photographiert und digital gespeichert.
3.9 Validierung der PCR
Neben dem routinemäßigen Mitführen der oben genannten Positiv- und
Negativkontrollen wurden weitere Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer
und falsch-positiver Resultate durchgeführt. Die Nachweisgrenze der PCR wurde
durch den Zusatz einer bekannten Menge Plasmid zu der Proben-DNA sowie die
Nachweisgrenze des Gesamtsystems einschließlich der vorgeschalteten Schritte der
Probenaufbereitung und DNA-Extraktion durch den Zusatz JSRV-positiver Zellen zu
negativen Proben (Rinderblut) bestimmt. Die Spezifität der nachgewiesenen Banden
wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung und Sequenzierung des PCR-Produktes
überprüft.
110 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
3.9.1 Template-Kontrolluntersuchungen
Um bei Proben, die in dreimaliger Untersuchung mittels U3 LTR PCR und hn PCR
ein negatives Ergebnis erbracht hatten, ein falsch-negatives Ergebnis durch
mangelhafte DNA-Qualität oder die Präsenz von PCR-Inhibitoren auszuschließen,
wurden diese alle auf die Nachweisbarkeit einer spezifischen Sequenz der
Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) untersucht. Die
Untersuchungen erfolgten im Einfachansatz nach einer Methode von DEWAR und
SHARP (2000, pers. Mitteilung). Als Amplifikationsvorlage wurden jeweils ca. 100 ng
DNA verwendet. Unterschiedliche Probenvolumina wurden entsprechend der U3
LTR PCR durch die Vorlage eines entsprechenden Ausgleichsvolumens an Wasser
ausgeglichen. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug auch hier 50 µl.
Es wurden entsprechend der U3 LTR PCR jeweils zwei Negativkontrollen in Form
von 5 µl Aqua bidest. mitgeführt, von denen eine im Arbeitsbereich des Herstellens
des Mastermixes, die zweite beim Zupipettieren der Proben angesetzt wurde. Die
Reaktionskomponenten der PCR und das Zeit-Temperaturprogramm sind
nachfolgend (Tabelle 12 bis 14) aufgeführt. Die Schmelzpunkte der Primer wurden
durch die Herstellungsfirma Roth (Karlsruhe) berechnet. Das für jede Probe zu
erwartende Amplifikat hat eine Größe von 388 bp (DEWAR 2000, pers. Mittteilung).
Tabelle 12: Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung) und Schmelzpunkte der Primer für die Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-PCR Bezeich-
nung Verwendung Sequenz (5’=> 3’) Schmelzpunkt
G/C-Regel/2+4-Regel
Primer I Forward primer
GAPDH PCR
TGT TCC AGT ATG ATT CCA
CCC
47,3°C / 62°C
Primer II
Reverse Primer
GAPDH PCR
ATA AGT CCC TCC ACG ATG CC
48,7°C / 62°C
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 111
Tabelle 13: Reagenzien für die GAPDH PCR Reagenzien eingesetzte
Konzentration Eingesetztes Volumen pro Reaktionsansatz
10 x PCR-Puffer 10 x 5 µl
Primer I 5 mmol/l 1 µl
Primer II 5 mmol/l 1 µl
dNTP-Stammlösung 10 mmol/l je dNTP 1 µl
Polymerase: Qiagen
HotStarTaqTM
5 units / µl 0,25 µl
Aqua bidest. ad 50 µl
Tab 14: Zeit-Temperaturprogramm für die GAPDH PCR Programmschritt Temperatur Dauer Zyklenzahl
Initiale Denaturierung und
Enzymaktivierung
94°C 15 min -
Beginn Zyklus
Denaturierung 94°C 45 sec
Anlagerung 54°C 1 min
Verlängerung 72°C 1:30min
29
Wiederholungen
Ende Zyklus
Finale Verlängerung 72°C 5 min -
Warten bis Entnahme 6°C unendlich -
3.9.2 Bestimmung der Nachweisgrenze der PCR am Modell mit Plasmid
versetzter DNA
Da die Zielsequenz der GAPDH in jeder Zelle ubiquitär ist, werden durch den
Nachweis eines solchen housekeeping-Gens Sensitivitätsprobleme beim Nachweis
112 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
geringer Mengen der Zielsequenz nicht detektiert. Durch eine Untersuchung mit
Plasmid versetzter Proben (DNA aus Blut, BAL und Gewebe) wurde die
Nachweisgrenze der PCR vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer
DNA bestimmt. Zugleich dienten diese Versuche der Untersuchung auf die
Anwesenheit inhibitorischer Substanzen in den Proben, die möglicherweise lediglich
den Nachweis geringer Mengen der Zielsequenz negativ beeinflussen.
Exemplarisch wurde an 29 willkürlich ausgewählten, in dreimaliger Untersuchung in
U3 LTR PCR und hn PCR negativen Gewebeproben (24 Lymphknoten- und 5
Lungengewebeproben) sowie an 32 ebenfalls negativen Zellproben (15 Buffy-Coat-
und 17 BAL-Proben) eine derartige Inhibitionskontrolle durchgeführt. Hierzu wurden
jeweils 800 – 1000 ng DNA der jeweiligen Probe mit jeweils 5 µl der drei als
Grenzwert-Positivkontrollen verwendeten, 1:5 verdünnten Plasmidverdünnungs-
stufen 10-9, 10-11 und 10-12 versetzt. Zusätzlich wurde pro Probe ein erneuter Ansatz
ohne Plasmidzusatz mitgeführt. Das Gesamtprobenvolumen (Proben-DNA und
Plasmidverdünnung) betrug nicht mehr als 25µl. Die Durchführung der Untersuchung
einschließlich Art und Anzahl der mitgeführten Positiv- und Negativkontrollen
entsprach dem oben beschriebenen Protokoll für die U3 LTR und hn PCR. Zusätzlich
wurden sieben weitere Blut- und vier weitere BAL-Proben lediglich mit den ersten
beiden Verdünnungsstufen versetzt und mittels U3 LTR PCR nach obenstehendem
Protokoll untersucht.
3.9.3 Untersuchungen zur Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamt-systems (Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Da die Nachweisgrenze einer PCR auch wesentlich durch die Art der
Probenaufbereitung beeinflußt wird (SCHEIBNER 2000), wurde am Modell künstlich
mit einer bekannten Anzahl JSRV-positiver Zellen versetzter Rinderblutproben die
Nachweisgrenze des Gesamtsystems untersucht und mit einem alternativen
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 113
Verfahren der DNA-Extraktion aus Vollblut verglichen. Da Lungenadenomatose in
Deutschland und Schottland endemisch ist, ist die Beschaffung von frischen
Blutproben definitiv LA-negativer Schafe aus kontrollierten Beständen sehr schwierig
und stets mit einem Restrisiko behaftet. Aus diesem Grund wurde für diese Versuche
als Negativprobe Rinderblut verwendet. Dieses konnte in größeren Mengen aus
bekannter Herkunft stets frisch beschafft werden, und aufgrund der fehlenden
Empfänglichkeit von Rindern für eine Infektion mit JSRV erfüllte es die
Anforderungen an sicher negatives Probenmaterial. Für die Versuche wurden Zellen
einer permanenten Lungenadenomatose-Tumorzellinie (JS7-Zellen) verwendet. Jede
JS7-Zelle enthält eine Kopie der kompletten proviralen Sequenz von JSRV (DE
MARTINI et al. 2001). Diese Zellen wurden freundlicherweise ebenfalls von Dr. J. M.
Sharp, Moredun Research Institute, Penicuik, Schottland zur Verfügung gestellt.
3.9.3.1 Vorversuche zum Zusatz von JS7-Zellen zu Rinderblutproben
A Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut
In Vorabuntersuchungen an einer kleinen Probenzahl wurde die oben beschriebene
Methode zur Gewinnung von Buffy Coat aus gerinnungsgehemmtem Vollblut mit
anschließender Isolierung von Gesamt-DNA mit dem Qiagen Kit mit einer Methode
zur Isolierung von DNA aus Vollblut verglichen. Diese Untersuchungen wurden durch
die Autorin am Moredun Research Institute (MRI) in Penicuik, Schottland
durchgeführt. Hinsichtlich der Ausstattung des Labors und der allgemeinen
Maßnahmen waren die Untersuchungsbedingungen dort vergleichbar mit denen an
der Klinik für kleine Klauentiere. Die verwendeten Geräte und Reagenzien sind im
Anhang nicht detailliert aufgeführt, da ihre Verwendung sich auf diesen und weitere
nicht im Detail dargestellte Vorversuche beschränkte.
114 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
B Probenentnahme, Zusatz von JS7-Zellen und Buffy-Coat-Präparation
Von zwei klinisch gesunden Rindern (Proben 1 und 2) wurden in Li-heparinisierten
Vacutainern insgesamt jeweils ca. 30 ml Blut entnommen. Durch das Personal des
MRI wurde an diesen Proben eine Leukozytenzählung vorgenommen. Das Blut jedes
Rindes wurde zu jeweils 7 ml auf vier sterile Zentrifugenröhrchen verteilt. Die
Gesamtzahl der in 7 ml Blut enthaltenen Leukozyten wurde errechnet und diese
Blutproben wurden mit einer bekannten Anzahl JSRV-positiver Zellen aus einer
permanenten Tumorzellinie (JS7-Zellen, DE MARTINI et al. 2001) im Verhältnis
1:100, 1:1.000 und 1:10.000 versetzt. Die bei – 70°C in Pellets zu jeweils 6,125 x 105
Zellen aliquotiert gelagerten JS7-Zellen (COUSENS 2001, pers. Mitteilung) wurden
hierfür aufgetaut und in 500 µl PBS resuspendiert, so dass man eine Konzentration
von 12,25 x 105 Zellen pro ml erhielt. Die Zugabe der benötigten Zellmenge zu den
Rinderblutproben erfolgte durch Zupipettieren eines entsprechenden Volumens
dieser Stammsuspension. Jede JS7-Zelle enthält eine Kopie der proviralen DNA-
Sequenz von JSRV (DE MARTINI et al. 2001). Dem vierten Aliquot jeder Probe
wurden keine JS7-Zellen zugesetzt. Die Proben wurden anschließend durch
vorsichtiges mehrmaliges Schwenken gemischt. Aus jedem Aliquot jeder Probe
wurden anschließend 500 µl entnommen und für die DNA-Isolierung aus Vollblut in
autoklavierte 2 ml Mikroreaktionsgefäße überführt. Die restlichen 6,5 ml der
jeweiligen Proben wurden dem oben beschriebenen Verfahren zur Buffy-Coat-
Isolation unterworfen. Parallel dazu wurden vier vorab hergestellte Buffy-Coat-Pellets
mit bekannter Zellzahl eines weiteren gesunden Rindes (Probe 3) ebenfalls in
Verhältnis 1:100, 1:1.000 und 1:10.000 mit JS7-Zellen versetzt. Das vierte Aliquot
verblieb auch hier ohne Zusatz. Aus diesen und denen aus den anderen acht Proben
hergestellten Buffy-Coat-Pellets wurde routinemäßig mit dem DNeasyR Tissue Kit
Gesamt-DNA isoliert und in 400µl Puffer AE eluiert.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 115
C Isolierung von Gesamt-DNA aus Vollblut
Die Isolierung erfolgte mit der DNAzolR-Methode (Helena Biosciences, Sunderland,
U.K.) im wesentlichen nach den Angaben des Herstellers mit leichten Modifikationen
durch WALSH (2001, pers. Mitteilung). 500 µl Vollblut wurden in einem 2 ml
Mikroreaktionsgefäß unter einem Abzug mit 1 ml DNAzolR BD (enthält Guanidinium
Thiozyanat) versetzt und mit einem Vortex gemischt. Anschließend wurden 400 µl
Isopropanol zugegeben, die Probe erneut gevortext und für fünf Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß wurde die Probe für sechs Minuten bei
Raumtemperatur bei 6.000 x g zentrifugiert. Mit einer gestopften Glas-Mikropipette
wurde der Überstand entfernt. Für jede Probe wurde eine neue Pipette verwendet.
Es wurden erneut 500 µl DNAzolR BD zugegeben und mit einem Vortex-Gerät kräftig
gemischt. Anschließend wurde bei 9.000x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut mit einer gestopften Glasmikropipette
abgenommen. Eventuell im Deckel des Reaktionsgefäßes zurückgebliebene
Flüssigkeits- oder Blutreste wurden mit einem Zellstofftuch abgewischt. Zu dem am
Boden des Reaktionsgefäßes sichtbaren Pellet wurde 1 ml 75%iges Ethanol
zugegeben und anschließend gemischt. Im Anschluß wurde erneut bei 16.000 x g für
fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Ethanol wurde dekantiert und
restliche Flüssigkeit vorsichtig mit einer Mikropipette abgenommen. Das
Reaktionsgefäß wurde mit offenem Deckel für zwei Minuten stehen gelassen, um
restliches Ethanol verdampfen zu lassen. Danach wurden 200 µl Aqua bidest.
zugegeben, gemischt und zur Unterstützung der Lösung des DNA-Pellets für eine
Stunde in einem Wasserbad bei 60°C inkubiert. Während dieser Zeit wurden die
Proben mehrfach mit einem Vortex-Gerät gemischt.
D DNA-Konzentrationsbestimmung und PCR-Untersuchung
Die Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der nach beiden Methoden
präparierten Proben erfolgte wie oben beschrieben durch photometrische
116 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
Bestimmung der OD260 und OD280 in einer Verdünnung von 1:10 mit einem
Messvolumen von 100 µl. Es wurden jeweils 800 – 1000 ng DNA in der U3 LTR PCR
wie oben beschrieben eingesetzt. Die Visualisierung der PCR-Produkte erfolgte nach
elektrophoretischer Auftrennung in einem zweiprozentigen Agarosegel durch
Färbung mit Ethidiumbromid. Als Laufpuffer wurde 1 x TBE verwendet.
3.9.3.2 Detaillierte Bestimmung der Nachweisgrenze des Gesamtsystems
Obige Vorversuche wurden zur genauen Bestimmung der Nachweisgrenze des
Gesamtsystems, bestehend aus Buffy-Coat-Präparation, DNA-Isolierung mit dem
Qiagen Kit und anschließender U3 LTR und hn PCR im Labor der Klinik für kleine
Klauentiere weitergeführt. Hierzu wurden in 10 ml Li-heparinisierten Vacutainern
Blutproben einer gesunden Kuh (Herkunft: Physiologisches Institut der Tierärztlichen
Hochschule Hannover) entnommen. Mit einem für Rinderblut geeichten
Blutanalysegerätes (Modell MEK – 6108G, Nihon Kohden, Bad Homburg) wurde in
zweimaliger Messung die Gesamtleukozytenzahl bestimmt. Als Grundlage für die
weiteren Berechnungen wurde der Mittelwert aus beiden Messungen verwendet. Das
Rinderblut wurde mit einer sterilen Plastik-Pasteurpipette zu jeweils 7 ml auf 17
sterile Zentrifugenröhrchen verteilt. Wie oben beschrieben wurde aus bei –70°C
gelagerten JS7-Zellen (DE MARTINI et al. 2001) eine Zellsuspension mit einem
Zellgehalt von 12,25 x 105 Zellen pro ml PBS hergestellt und entsprechende
Volumina dieser Stammsuspension genutzt, um den Rinderblutproben JSRV-haltige
Zellen im Verhältnis 1:100, 1:1.000, 1:2.000, 1:3.000 usw. bis 1:15.000 zuzusetzen.
Eine Blutprobe blieb ohne Zusatz von JS7-Zellen. Rinderblut und zugefügte JS7-
Zellen wurden durch Schwenken der Röhrchen gründlich gemischt und wie oben
beschrieben routinemäßig der Buffy-Coat-Präparation unterworfen. Der zweimalig
mit PBS gewaschene Buffy-Coat wurde gleichmäßig auf jeweils zwei autoklavierte
1,7 ml Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt und die Pellets bei –80°C eingefroren. Es
folgten die DNA-Isolierung mit dem Qiagen Kit aus jeweils einem dieser Buffy-Coat-
Pellets und eine Untersuchung von jeweils 800 – 1.000 ng DNA mittels U3-LTR PCR
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 117
im Vierfachansatz. In dieser Untersuchung fraglich positive oder negative Proben
wurden in der hn PCR nachuntersucht.
Nach erneuter Blutentnahme von einem gesunden Rind (Herkunft: Physiologisches
Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover) wurden auf identische Weise elf
Rinderblutproben jeweils im Verhältnis 1:1.000, 1:15.000, 1:30.000, 1:40.000,
1:50.000 usw. bis 1:100.000 mit JS7-Zellen versetzt. Um das Pipettieren der kleinen
Mengen JS7-Zellen zu erleichtern, wurde von der Stammsuspension zunächst eine
1:10- und eine 1:100-Verdünnung in PBS hergestellt und entsprechende Volumina
dieser Verdünnungen verwendet. Eine Blutprobe blieb auch hier ohne Zusatz von
JS7-Zellen. Das weitere Vorgehen erfolgte wie oben beschrieben. Nach der DNA-
Isolierung wurden ab der Verdünnungsstufe 1:30.000 jeweils 800 – 1.000 ng DNA
jeweils sechsmal (zweimal im Dreifachansatz) mittels U3 LTR und hn PCR
untersucht. Die Stufen 1:1.000 und 1:15.000 wurden in jeder Reaktionscharge
zusätzlich zu den üblichen Kontrollen jeweils im Einfachansatz als Kontrollen
mitgeführt.
3.9.4 Southern Blot
Zur Verifizierung von in der Darstellung der PCR-Produkte im Agarosegel negativen
Blutprobenergebnissen klinisch erkrankter Tiere und zur Überprüfung der Spezifität
der nachgewiesenen Banden aus positiven Proben wurde unter Anleitung von Frau
Dr. Korinna Huber und mit der freundlichen Hilfe von Frau Alexandra Muscher
(Institut für Physiologie der Tierärztlichen Hochschule) für eine kleine Anzahl Proben
ein Southern Blot durchgeführt. Diese Arbeiten wurden im Labor des Instituts für
Physiologie durchgeführt.
Als Sonde wurden zunächst im Doppelansatz jeweils 10µl der Verdünnungsstufe 10-9
des Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a) als Template amplifiziert. Die
PCR-Produkte beider Ansätze wurden gepoolt, das gesamte Volumen von 100µl in
118 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
einem zweiprozentigen Agarosegel aufgetragen und nach einer Laufzeit von ca. 1 h
bei 50V mit Ethidiumbromid gefärbt. Unter UV-Licht wurde die Bande auf einer
ethanolgereinigten Glasplatte mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf zwei
autoklavierte Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Das Gewicht der Gelausschnitte wurde
durch Differenzwägung bestimmt und die im Agarosegel enthaltene DNA mit dem
JETsorb Kit (Fa. Genomed, Bad Oeynhausen) extrahiert und in 20 µl Aqua dest.
eluiert. Zur Kontrolle des Erfolges der DNA-Extraktion wurden 2 µl des Überstandes
mit 3 µl Glycerin-Farbstofflösung auf ein zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen
und nach elektrophoretischer Auftrennung durch Färbung mit Ethidiumbromid unter
UV-Licht dargestellt.
Eine Anzahl positiver und negativer Proben sowie die üblichen Plasmid- und
Wasserkontrollen wurden wie oben beschrieben mittels U3 LTR PCR amplifiziert und
die Amplifikate auf ein zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen. Nach
elektrophoretischer Auftrennung bei 60V für eine Stunde und Färbung mit GelStarR
Nucleinsäurefarbstoff wurde das Gel zunächst photographiert und die Bilddatei digital
gespeichert. Die Durchführung eines Southern Blots erfolgte durch Frau Alexandra
Muscher nach etablierten Verfahren (SOUTHERN 1975; SAMBROOK et al 1989).
Der Erfolg des Transfers mittels Kapillar-Blot-Verfahrens wurde durch Färbung des
Gels mit Ethidiumbromid und Durchleuchtung mit UV-Licht kontrolliert. Es waren
keine Banden mehr darstellbar.
Die Durchführung der Prähybridisierung und Hybridisierung mithilfe der zuvor
radioaktiv markierten Sonde (Rediprime II Random Prime Labelling System;
Amersham Pharmacia Biotech) erfolgte ebenfalls durch Frau A. Muscher nach
etablierten Verfahren (SAMBROOK et al. 1989). Da diese Arbeiten überwiegend
nicht von der Autorin selbst durchgeführt wurden, sind die verwendeten Materialien
und Geräte im Anhang nicht im Detail aufgeführt.
TIERE, MATERIAL UND METHODEN 119
3.9.5 Sequenzierung von PCR-Produkten
Zur Überprüfung der Spezifität der im Agarosegel nachgewiesenen Banden wurde
eine Sequenzierung der PCR-Produkte der U3 LTR PCR sowie der GAPDH PCR
durchgeführt. Hierzu wurden zunächst die nach elektrophoretischer Auftrennung
durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht visualisierten Banden auf einer
ethanolgereinigten Glasplatte mit einem Skalpell ausgeschnitten und auf zwei
autoklavierte Mikroreaktionsgefäße aufgeteilt. Das Gewicht der Gelausschnitte wurde
durch Differenzwägung bestimmt und die im Agarosegel enthaltene DNA mithilfe des
JETsorb Kits (Fa. Genomed, Bad Oeynhausen) extrahiert. Diese Arbeiten wurden im
Labor des Instituts für Physiologie der Tierärztlichen Hochschule durchgeführt. Die
extrahierte DNA wurde in 20 µl Aqua dest. gelöst. Zur Kontrolle des Erfolges der
DNA-Extraktion wurden 2 µl dieser Lösung mit 3 µl Glycerin-Farbstofflösung auf ein
zweiprozentiges Agarosegel aufgetragen und nach elektrophoretischer Auftrennung
durch Färbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht dargestellt. Aus dem restlichen
Eluat wurde durch die Firma AGOWA GmbH, Berlin eine Sequenzierung
vorgenommen. Die Sequenzen wurden unter www.ncbi.nlm.nih.gov über das Basic
Local Alignment Search Tool (BLAST) mit bei GenBank registrierten DNA-
Sequenzen verglichen.
120 TIERE, MATERIAL UND METHODEN
ERGEBNISSE 121
4 ERGEBNISSE
4.1 weiterer Verlauf der Sanierung mittels mutterloser Aufzucht
Aus der Schneverdinger Herde wurden im Frühjahr 2001 53 weibliche und 50
männliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Elf Lämmer verblieben bei
ihren Müttern und wurden nach der Auflösung der Schneverdinger Herde mit den
Mutterschafen vorübergehend in die Tütsberger Herde integriert.
In derselben Lammzeit wurden aus der Tütsberger Herde 101 weibliche und zwei
männliche Lämmer für die mutterlose Aufzucht gewonnen. Die weitere Aufzucht
dieser Tiere nach Abschluß der Kolostralphase erfolgte durch BIMCZOK (2002) in
Döhle.
Am Ende des Untersuchungszeitraumes im Januar 2004 umfaßte die Döhler Herde
204 Herdbuchmuttern, 162 nicht angekörte Muttertiere, 113 Zutreter, 21 Jungböcke,
neun Böcke und vier Hammel.
4.2 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histo-logischen Untersuchung von Tieren aus LA-positiven Herden
4.2.1 klinisch untersuchte Tiere (Sektionstiere)
4.2.1.1 Einteilung in die klinischen Gruppen und Gegenüberstellung der Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohisto-logischen Untersuchung
Aufgrund der Ergebnisse der klinischen Untersuchung zum Zeitpunkt der
Einlieferung an die Klinik für kleine Klauentiere wurden die 124 Sektionstiere aus
positiven Herden wie folgt in die vier klinischen Gruppen A – D eingeteilt:
122 ERGEBNISSE
Gruppe A: Definition: Respirationstrakt klinisch ohne besonderen Befund
In diese Gruppe wurden 32 der 124 untersuchten Tiere eingeordnet (25,8%). Die
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der
Tiere aus dieser Gruppe sind in Tabelle 15 zusammengestellt.
Tabelle 15: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe A (n=32) makroskopische und histologische Beurteilung
Anzahl Tiere relativer Anteil(%)
makroskopisch und histologisch o.b.B 14 43,75
pneumonische Veränderungen
(makroskopisch und/oder histologisch) ohne
Beteiligung von LA
13
(alle geringgradig)
40,6
makroskopisch LA, histologisch bestätigt 0 0
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch LA
3 9,4
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch fraglich
2 6,25
o.b.B: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose
Gruppe B Definition: respiratorische Symptome verschiedenen Grades, jedoch kein Nasenausfluß, keine diskontinuierlichen Nebengeräusche, Schubkkarrentest negativ
Dieser Gruppe wurden 55 Tiere zugeordnet (44,3%des Sektionsgutes). Die
Ergebnisse der makroskopischen und histologischen Untersuchung der Gruppe B
sind Tabelle 16 zu entnehmen.
ERGEBNISSE 123
Tabelle 16: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe B (n=55) makroskopische und histologische Beurteilung
Anzahl Tiere relativer Anteil (%)
makroskopisch und histologisch o.b.B 13 23,6
pneumonische Veränderungen
(makroskopisch und/oder histologisch) ohne
Beteiligung von LA
25 45,5
makroskopisch LA, histologisch bestätigt 8 14,5
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch LA
9 16,4
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch fraglich
0 0
o.b.B: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose
Gruppe C Definition: klinischer Verdacht auf Lungenadenomatose (kein Nasenausfluß,
Schubkarrentest negativ, jedoch pathologische diskontinuierliche Nebengeräusche
mit feuchtem oder rasselndem Charakter)
Zwölf der 124 untersuchten Tiere (9,7%) wurden aufgrund der beobachteten
Symptome der Gruppe C zugeordnet. Deren pathologisch-anatomische und
histologische Untersuchungsbefunde sind in Tabelle 17 dargestellt.
124 ERGEBNISSE
Tabelle 17: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe C (n=12) makroskopische und histologische Beurteilung
Anzahl Tiere relativer Anteil (%)
makroskopisch und histologisch o.b.B 0 0
pneumonische Veränderungen
(makroskopisch und/oder histologisch) ohne
Beteiligung von LA
0 0
makroskopisch LA, histologisch bestätigt 12 100
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch LA
0 0
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch fraglich
0 0
o.b.B: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose
Gruppe D Definition: klinische Lungenadenomatose (hochgradige diskontinuierliche
Nebengeräusche mit feucht-rasselndem Charakter sowie spontaner oder
provozierter Nasenausfluß; Schubkarrentest positiv, Abgang von schaumig-
serösem Sekret)
Bei 25 Tieren (20,2%) konnte bereits klinisch die Diagnose Lungenadenomatose
gestellt werden. Sie wurden zur Gruppe D zusammengefasst. Die Ergebnisse der
pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung sind in Tabelle 18
zusammengestellt.
ERGEBNISSE 125
Tabelle 18: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe D (n=25) makroskopische und histologische Beurteilung
Anzahl Tiere relativer Anteil (%)
makroskopisch + histologisch obB 0 0
pneumonische Veränderungen
(makroskopisch und/oder histologisch) ohne
Beteiligung von LA
0 0
makroskopisch LA, histologisch bestätigt 25 100
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch LA
0 0
makroskopisch keine Hinweise auf LA,
histologisch fraglich
0 0
o.b.B: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose
4.2.1.2 Einteilung in Kategorien anhand der Lungenbefunde
Anhand der makroskopischen und histologischen Befunde wurden die Tiere in die
Lungenbefund-Kategorien I bis IV eingeteilt:
Kategorie I: makroskopisch LA, histologisch bestätigt
Kategorie II: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA
Kategorie III: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch fraglich
Kategorie IV: weder makroskopisch noch histologisch Hinweise auf LA
Die Zuordnung der Tiere zu den entsprechenden Lungenbefund-Kategorien ist
Tabelle 19 zu entnehmen. Die Kategorie I umfasst eine relativ heterogene
Tiergruppe, die von klinisch kranken Tieren bis hin zu klinisch weitgehend
126 ERGEBNISSE
unauffälligen Tieren reicht, bei denen jedoch bei der Sektion makroskopisch
erkennbare Tumoren oder tumorverdächtige Areale festgestellt wurden.
Tabelle 19: Einteilung der Sektionstiere aus positiven Herden (n=124) in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde
Kategorie I II III IV
Definition makroskopisch LA, histologisch
bestätigt
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histolo-gisch fraglich
weder makro-skopisch noch
histologisch Hin-weise auf LA
Anzahl Tiere 45 12 2 65
relativer Anteil (%)
36,3 9,7 1,6 52,4
histologische Beurteilung
positiv 46 % fraglich 1,6 % negativ 52,4%
LA: Lungenadenomatose
Zum Teil wurden gezielt klinisch an LA erkrankte oder verdächtige Tiere der
Untersuchung zugeführt, so dass der ermittelte Prozentsatz von Tieren mit
nachgewiesener LA am Sektionsgut höher ist als der Anteil in den Herkunftsherden.
4.2.1.3 Vorkommen von Metastasen und anderen Tumorerkrankungen
Bei drei der 57 LA-positiven Sektionstiere (5,3%) wurde eine Metastasierung eines
bronchiolo-alveolären Adenokarzinoms der Lunge (Lungenadenomatose) festgestellt.
In einem Fall war der Ln. mediastinalis caudalis betroffen, in einem weiteren Fall
bestand eine Metastasierung in zahlreiche Organe (Pleura, Niere, Leber, Herz). Bei
dem dritten Tier fanden sich Metastasen in der Muskulatur der Hintergliedmaßen. In
allen drei Fällen wurden mittels U3 LTR PCR aus dem unter sterilen Kautelen
entnommenen Gewebe der Tumormetastasen JSRV-spezifische Genomfragmente
nachgewiesen.
Bei einem weiteren, spontan im Bestand verendeten Tier der Schneverdinger Herde
wurde ein metastasierendes Adenokarzinom des Dünndarms (primärer Darmtumor)
ERGEBNISSE 127
diagnostiziert, mit dem Vorkommen von Metastasen in der Lunge, der Pleura, dem
Peritoneum und der Leber. Aus Tumormaterial dieses Tieres konnte mittels U3 LTR
und hn PCR JSRV nicht nachgewiesen werden.
4.2.2 Schlachttiere
4.2.2.1 Ergebnisse der Lebenduntersuchung
Aus der Gruppe der 127 Schlachttiere aus den vier LA-positiven Herden bestand bei
der adspektorischen Schlachttieruntersuchung bei sieben Tieren (5,51%) der
klinische Verdacht auf Lungenadenomatose (ohne Phonendoskop hörbare
diskontinuierliche Nebengeräusche mit feuchtem oder rasselndem Charakter, aber
kein spontaner Nasenausfluß) bzw in drei Fällen (2,36%) bereits eine klinisch
manifeste Lungenadenomatose-Erkrankung (spontaner Nasenausfluß zusätzlich zu
ohne Phonendoskop hörbaren diskontinuierlichen Nebengeräuschen). Die
makroskopische und histologische Untersuchung der Schlachtlungen bestätigte
diesen Verdacht in allen zehn Fällen. Vier weitere Tiere (3,15%) waren vor der
Schlachtung durch Husten aufgefallen. Bei drei dieser Tiere wurden in der Lunge LA-
typische Läsionen makroskopisch und histologisch festgestellt. Die übrigen 113
Schlachttiere (88,98%) waren bei der Lebenduntersuchung unauffällig.
4.2.2.2 Pathologisch-anatomische und histologische Untersuchung
Die Einteilung in die Kategorien I bis IV wurde für die Schlachtlungen in gleicher
Weise wie für die Lungen der Sektionstiere vorgenommen. Eine Übersicht ist in
Tabelle 20 gegeben.
128 ERGEBNISSE
Tabelle 20: Einteilung der Schlachttiere aus positiven Herden (n=127) in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde
Kategorie I II III IV
Definition makroskopisch LA, histologisch
bestätigt
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA
makroskopisch keine Hinweise auf
LA, histologisch fraglich
weder makroskopisch
noch histologisch Hinweise auf LA
Anzahl Tiere 20 2 5 100
relativer Anteil (%)
15,7 1,6 3,9 78,7
Histologische Beurteilung
positiv 17,3% fraglich 3,9 % negativ 78,7%
LA: Lungenadenomatose
Die Schlachttiere entstammten Routineschlachtungen ohne eine Vorauswahl der
Tiere, so dass der ermittelte Anteil Lungenadenomatose-erkrankter Tiere der
natürlichen Prävalenz der Erkrankung in den Herkunftsbeständen gleichzusetzen ist.
4.2.2.3 Vorkommen von Metastasen
Bei einem der 22 LA-positiven Schlachttiere (4,55%) wurde eine Metastasierung in
den Ln. mediastinalis caudalis festgestellt.
4.3 Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histo-logischen Untersuchung der Schneverdinger Herde
Der Gesundheitszustand der Schneverdinger Herde als Ausgangsherde des
Sanierungsversuches ist hier noch einmal gesondert dargestellt. Da nach Abschluß
der Lammzeit 2001 alle bis dahin noch lebenden erwachsenen Tiere getötet und
untersucht wurden, sind die ermittelten Anteile LA-positiver Tiere der natürlichen
Prävalenz in dieser Herde gleichzusetzen.
ERGEBNISSE 129
4.3.1 Anzahl LA-positiver Tiere
Aus der Schneverdinger Herde gelangten im Rahmen der Auflösung der Herde
insgesamt 83 Tiere zur Sektion, neun Lämmer und Zutreter wurden geschlachtet.
Von diesen 92 Tieren wiesen zwölf (13,0%) klinische Symptome der
Lungenadenomatose auf (Gruppe D), bei zwei weiteren (2,2%) bestand der klinische
Verdacht (Gruppe C). Die Ergebnisse der makroskopischen und histologischen
Untersuchung der Lungen der 92 Schneverdinger Tiere sind in Tabelle 21
dargestellt.
Tabelle 21: Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Lungen der Schlacht- und Sektionstiere aus der Schneverdinger Herde (n=92) makroskopische und histologische Beurteilung
Anzahl Tiere relativer Anteil (%)
makroskopisch und histologisch o.b.B
29 31,5
pneumonische Veränderungen (makroskopisch und/oder histologisch) ohne Beteiligung von LA
34 36,9
makroskopisch LA, histologisch bestätigt
17 18,5
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA
9 9,8
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch fraglich
3 3,3
o.b.B.: ohne besonderen Befund LA: Lungenadenomatose
28,3% der untersuchten Tiere wiesen demnach makroskopisch und/oder histologisch
typische Läsionen der Lungenadenomatose auf; 3,3% zeigten ein fragliches
histologisches Ergebnis.
130 ERGEBNISSE
4.3.2 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde
Die Hauptbefunde der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen
Untersuchung von Tieren mit Lungenläsionen (außer LA) aus der Schneverdinger
Herde (n=34) sind in Tabelle 22 zusammengefaßt. Häufig traten mehr als eine
typische Läsion gleichzeitig auf, so dass Mehrfachnennungen möglich sind. Eine
mikrobiologische Untersuchung wurde aus Kostengründen nicht in allen Fällen
durchgeführt. Als pathogene Erreger wurden z.T wiederholt Mannheimia
haemolytica, Corynebacterium pseudotuberculosis, alpha-hämolysierende
Streptokokken und Arcanobacterium pyogenes nachgewiesen.
Tabelle 22: Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde
Befund Anzahl % der veränderten
Lungen (n=34)
% der Gesamtzahl der untersuchten
Tiere (n=92) solitäre, vermutlich parasitär bedingte Granulome
3 8,8 3,3
katarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie
10 29,4 10,9
abszedierende/apostematöse Pneumonie
19 55,9 20,7
fibröse Pleuritis
8 23,5 8,7
herdförmig ggr. aspiriertes Pflanzenmaterial mit fokaler entzündlicher Reaktion (vermutlich Artefakt als Folge der Lungenspülproben)
5 14,7 5,4
abszedierende Lymphadenitis der Mediastinallymphknoten
3 8,8 3,3
Metastasen eines Adenokarzinoms des Dünndarms
1 2,9 1,1
ggr: geringgradig
ERGEBNISSE 131
4.4 Altersverteilung an Lungenadenomatose erkrankter Tiere
Aufgrund der Beobachtungen in den infizierten Heidschnuckenherden, dass diese
Rasse im Vergleich zu anderen sehr früh zu erkranken scheint (GANTER 2000;
KOOPMANN 2000, pers. Mitteilungen), ist die Altersverteilung der in dieser Studie
untersuchten 79 Fälle von klinisch, makroskopisch und/oder histologisch
nachgewiesener Lungenadenomatose in den Abbildungen 3 und 4 dargestellt.
In Abbildung 3 wurden die klinischen Erkrankungs- bzw. Verdachtsfälle
herausgegriffen. Diese wurden allesamt makroskopisch und histologisch bestätigt.
Aus dieser Gruppe waren 29 von 47 Tieren (61,7%) zwischen vier Monate und zwei
Jahre alt. Bei sechs Schlachttieren war das genaue Alter unbekannt, es handelte
sich jedoch um Tiere, die mindestens Jährlinge oder älter waren. Bei vier weiteren
Tieren konnte das Alter anhand des Zahnbefundes lediglich als vier Jahre oder älter
geschätzt werden.
Altersverteilung klinisch erkrankter bzw. verdächtiger Tiere
n=47
0
2
4
6
8
10
12
14
16
<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4 ?
Alter (Jahre)
Abbildung 3: Altersverteilung klinisch an LA erkrankter und LA-verdächtiger Heidschnucken (Gruppen D und C)
132 ERGEBNISSE
Abbildung 4 stellt die Altersverteilung aller 79 bestätigten Lungenadenomatose-Fälle
dar. Diese beinhalten sowohl klinisch, makroskopisch als auch lediglich histologisch
nachgewiesene Läsionen. Zwölf der untersuchten Tiere waren Schlachttiere, bei
denen eine genaue Altersbestimmung nicht durchgeführt werden konnte. Es
handelte sich hierbei um Tiere, die mindestens Jährlinge oder älter waren.
Die Ergebnisse zeigen, dass Lungenadenomatose-assoziierte Läsionen in allen
Altersgruppen festgestellt wurden. Auch hier zeigt sich jedoch eine Häufung bei sehr
jungen Tieren mit 40 Fällen bei Tieren im Alter von zwei Jahren oder darunter
(50,6%). Die jüngsten betroffenen Tiere waren Zwillingslämmer eines klinisch
erkrankten Muttertieres, die bereits im Alter von vier Monaten eine klinisch manifeste
Lungenadenomatose entwickelt hatten.
Altersverteilung von LA-Läsionen aller Stadien n=79
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
<1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 >4 ?
Alter (Jahre)
Abbildung 4: Altersverteilung LA-positiver Heidschnucken (alle Erkrankungsstadien)
ERGEBNISSE 133
4.5 Praktikabilität der BAL und Probenqualität 4.5.1 Praktikabilität und Zeitaufwand der Entnahme von BAL-Proben nach
endotrachealer Intubation
Zur Entnahme von Lungenspülproben mit der unter 3.5.2 A beschriebenen Methode
ist stets eine weitere Hilfsperson vonnöten. Die Methode ist problemlos unter
Bestandsbedingungen anwendbar. Für die Entnahme größerer Probenzahlen sind
einige vorbereitende Arbeiten empfehlenswert (vorheriges Zuschneiden der PVC-
Schläuche und Aufziehen der NaCl-Lösung in Einwegspritzen), um einen
reibungslosen und raschen Arbeitsablauf zu gewährleisten. Ein geübtes Team kann
bei gleichzeitiger Entnahme von Blutproben auf diese Weise im Durchschnitt neun
Tiere pro Stunde beproben, was einem Zeitaufwand pro Tier von knapp sieben
Minuten entspricht. Eine Tagesleistung von 40 bis 50 Tieren ist realistisch. Danach
treten bei den probennehmenden Personen insbesondere durch das Einfangen und
Umsetzen der Tiere zur i.v.-Applikation des Anästhetikums Ermüdungs-
erscheinungen auf.
4.5.1.1 Kosten
Einmalige Kosten fallen für die Anschaffung eines oder mehrerer Laryngoskop-
Kaltlichtspatel (Modell Miller 4 je € 131,90) sowie des Laryngoskopgriffes mit
Ladegerät (zusammen € 293,50), eines Bronchialzerstäubers (€ 73,90) sowie einer
entsprechenden Anzahl Edelstahl-Rundstangen (im Stahlhandel € 11,06/kg) an
(Netto-Einkaufspreise in € zzgl. MwSt).
134 ERGEBNISSE
Kosten für Verbrauchsmaterialien (Netto-Einkaufspreise in € zzgl. MwSt.)
PVC-Schlauch (ca. 40 cm / Tier): € 0,18 / Tier
Ernährungssonde: € 0,71 / Stück
UrsotaminR: € 0,51 / ml
Gleitgel: € 2,84 / l
Isocain: € 0,02 / ml
0,9% NaCl: € 0,80 / 500ml
Einwegspritzen 5ml: € 0,034 / Stück
Einwegspritzen 20 ml: € 0,085 / Stück
Injektionskanüle: € 0,02 / Stück Latexhandschuhe: € 10,60 / Karton (100 Stück)
Desinfektionsmittel HelipurR-Konzentrat: € 98,25 / 5l Kanister
(€ 0,019 / ml)
(Anwendung als 5%ige Lsg. für 15min oder 1,5%ige Lsg. für 1h)
Schraubdeckeldose, steril: € 0,32 / Stück
Die Kosten an Verbrauchsmaterialien betragen folglich pro Tier unter fünf Euro
(Netto-Einkaufspreise). Als Hauptkostenfaktor schlägt hierbei das UrsotaminR
(Serumwerk Bernburg) zu Buche. Nicht in diese Überschlagsrechnung eingeflossen
sind die Kosten für das Desinfektionsmittel, da sie sehr stark mit dem Volumen und
der Konzentration der angesetzten Lösung sowie der Anzahl der zu einem Termin
beprobten Tiere variieren.
4.5.1.2 Immobilisation und Wartezeit
Eine Vollnarkose mit Erreichen des Toleranzstadiums ist für die Entnahme von
Lungenspülproben nicht notwendig. Der relativ kurze Nachschlaf bei alleiniger
Verwendung von Ketamin-HCl macht diesen Wirkstoff für die erforderliche
kurzzeitige Immobilisation und Sedation für diesen Eingriff ideal. Das Risiko von
ERGEBNISSE 135
Narkosezwischenfällen ist bei klinisch unauffälligen Tieren bei Verwendung einer
Dosis von 8 – 10 mg/kg i.v. sehr gering und eine rasche Anflutung durch intravenöse
Applikation ist die Voraussetzung für einen zügigen Arbeitsablauf. Circa 15 bis 20
Minuten nach dem Eingriff waren die Schafe wieder auf den Beinen. Bei der
Anwendung von Ketamin ist die fehlende Zulassung des Präparates UrsotaminR für
die Tierart Schaf zu beachten, so dass eine Wartezeit von 28 Tagen einzuhalten ist
(§56a AMG und §12 TÄHAV, in: ZRENNER und PAINTNER 2003).
4.5.1.3 Komplikationen
Bei der Entnahme der Spülproben, insbesondere beim Einführen der
Ernährungssonde in die tieferen Luftwege, kann es bei den Tieren zu Husten
kommen. Auch direkt im Anschluß an die Entnahme wurde bei einigen Tieren Husten
beobachtet. Spätestens eine Stunde nach der Probenentnahme waren diese
Symptome abgeklungen und die Tiere zeigten keine negative Beeinflussung ihres
Allgemeinbefindens.
Bei insgesamt 367 von der Autorin durchgeführten Lungenspülprobenentnahmen
traten insgesamt zwei Todesfälle auf (0,54%). In einem Fall handelte es sich um ein
klinisch hochgradig an Lungenadenomatose erkranktes Tier, das in der Narkose
verendete. In einem weiteren Fall trat bei einem klinisch unauffälligen Tier während
der Probenentnahme heftiges Regurgitieren auf. Die Entnahme wurde abgebrochen,
doch das betroffene Tier verendete am folgenden Tag infolge einer akuten
Aspirationspneumonie. Bei 393 nach demselben Verfahren durch andere Personen
durchgeführten Lungenspülungen traten keine weiteren Todesfälle auf. Störungen
des Allgemeinbefindens wurden ebenfalls in keinem Fall beobachtet.
129 Tiere wurden zeitnah nach der Entnahme von Lungenspülproben getötet (109
Sektionstiere aus positiven Herden, 17 Schlachttiere aus positiven Herden, zwei
Altböcke aus der Döhler Herde, ein Jungbock aus Döhle) und ihre Lungen
systematisch makroskopisch und pathologisch-histologisch untersucht. Bei acht
dieser Tiere (6,20%) wurde histologisch eine geringgradige, fokale Aspiration von
136 ERGEBNISSE
Pflanzenbestandteilen in einzelnen Bronchioli mit fokaler reaktiver Entzündung
festgestellt. In keinem dieser Fälle waren nach der Probenentnahme Störungen des
Allgemeinbefindens oder klinische Hinweise auf eine Aspirationspneumonie
aufgetreten. 4.5.2 Qualität der Lungenspülproben
4.5.2.1 Rückgewinnungsvolumen und makroskopische Beurteilung
Insgesamt wurden von der Autorin 367 Lungenspülproben nach endotrachealer
Intubation gewonnen. Nach Abschluß einer Übungsphase wurde für 326
routinemäßig gewonnene Proben eine systematische Beurteilung nach dem unter
3.6.3 beschriebenen Schema vorgenommen. Das durchschnittliche Rück-
gewinnungsvolumen betrug für diese Proben 45 ml. Die Beurteilung bezüglich der
Beimengung von Blut ist Tabelle 23 zu entnehmen. Die Einteilung wurde subjektiv
anhand der makroskopischen Färbung der Probe vorgenommen.
Tabelle 23: makroskopische Beurteilung der Lungenspülproben (n=326)
Blutbeimengungen
Wert 0 0,5 1 1,5 2 3
Grad keine sehr ggr. ggr. ggr.-mgr. mgr. hgr.
Anzahl Proben (%) 55,21 23,93 13,19 2,15 5,21 0,31
Zusammenfassung Anzahl Proben (%)
92,33 7,67
ggr: geringgradig; mgr: mittelgradig; hgr.: hochgradig
Proben, die aufgrund makroskopisch feststellbarer Blutbeimengungen in die Gruppen
0 bis 1 eingeteilt wurden (92,33% des Gesamtprobengutes) konnten ohne den
Zusatzschritt der Lyse der Erythrozyten direkt weiterverarbeitet werden.
ERGEBNISSE 137
Bei Futterverunreinigungen handelte es sich in der Regel um einzelne, maximal ca.
1-2 mm lange, feinzerkaute Pflanzenpartikel, die durch Regurgitieren und Husten in
die Proben gelangten. Dies war bei 39 (11,96%) der 326 beurteilten Proben der Fall.
4.5.2.2 Zellintegrität
Nach Herstellung von nach Pappenheim gefärbten Zytospots aus den Zellpellets von
zehn nach der unter 3.6.3 beschriebenen Methode behandelten Lungenspülproben
war problemlos eine lichtmikroskopische Differenzierung der Zellen möglich.
4.5.2.3 Erzielte DNA-Konzentration
Die 121 im Sommer 2001 in der Döhler Herde entnommenen Lungenspülproben
gelangten zugunsten der in den Folgejahren 2002 und 2003 entnommenen Proben
nicht mehr zur Untersuchung. Aus diesen Proben wurde daher auch keine DNA-
Extraktion vorgenommen. Aus insgesamt 217 von der Autorin mit der Methode der
endotrachealen Intubation entnommenen Lungenspülproben wurde mit dem Qiagen
Kit eine DNA-Extraktion durchgeführt. Aus 12 dieser Proben (5,5%) konnte keine für
die Untersuchung ausreichende DNA-Konzentration (<25 ng/µl) erzielt werden.
4.5.3 Blutproben
4.5.3.1 Zellintegrität nach Buffy-Coat-Präparation
Nach der routinemäßigen Buffy-Coat-Präparation wurden die Leukozytenpellets von
zehn Blutproben in 0,9%iger Kochsalzlösung resuspendiert, verdünnt und mithilfe
eines Zytospotverfahrens durch zehnminütige Zentrifugation bei 200xg und 20°C auf
Objektträger verbracht. Nach Färbung nach Pappenheim war eine
lichtmikroskopische Differenzierung der Zellen möglich.
138 ERGEBNISSE
4.5.4 Kontrolle der DNA-Qualität
4.5.4.1 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA
Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit der mit dem Qiagen DNeasy tissue
Kit gewonnenen DNA erfolgte durch photometrische Messung der optischen Dichte
(OD) in einem Volumen von 500 µl in einer Quarzküvette bei einer Wellenlänge von
260 und 280 nm in einer Verdünnung 1:20. Mittelwert, Median und
Standardabweichung der Reinheitswerte (OD260/OD280) sowie der erzielten DNA-
Konzentration in ng/µl (eine OD von 1 entspricht 50 ng/µl doppelsträngiger DNA
(SAMBROOK et al. 1989); anschließend Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor
20) für die einzelnen Probenarten (BAL, Buffy-Coat, Gewebe) sind Tabelle 24 zu
entnehmen. Unter der Rubrik „Gewebeproben“ sind alle präparierten Gewebearten
zusammengefasst. Aus Lymphknoten- und Tumorgewebe waren aufgrund der
höheren Zelldichte stets deutlich höhere DNA-Gehalte zu erzielen als aus
unverändertem Lungengewebe.
Tabelle 24: Konzentration und Reinheit der aus verschiedenen Probenarten gewonnenen DNA
Lungenspülproben n=286
Buffy-Coat-Proben
n=161
Gewebeproben n=546
Reinheit
(OD260/OD280)
Konzentration
( ng/µl)
Reinheit
(OD260/OD280)
Konzentration
( ng/µl)
Reinheit
(OD260/OD280)
Konzentration
( ng/µl)
Mittelwert 1,95 102,22 1,94 117,50 1,95 232,37
Median 1,96 95,25 1,95 96,60 1,93 132,70
SD 0,12 58,14 0,07 72,62 0,16 237,28
SD: Standardabweichung; OD260: optische Dichte bei 260 nm
ERGEBNISSE 139
4.5.4.2 Template-Kontrolluntersuchungen
Insgesamt 583 in dreimaliger Untersuchung in der U3 LTR und hn PCR negative
Proben wurden auf die Nachweisbarkeit einer spezifischen Sequenz der
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) untersucht. Das Probengut
gliederte sich wie folgt:
Lungenspülproben: n = 170
Buffy-Coat n = 144
Lungengewebe n = 62
Ln. mediastinalis caudalis n = 201
andere Gewebe n = 6
Die Untersuchung erfolgte im Einfachansatz. Aus allen 583 Proben wurde eine
Bande der erwarteten Größe von 388 bp nachgewiesen.
4.6 Validierung der PCR
4.6.1 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von Wasser (Grenzwert-Positivkontrollen)
In jeder Reaktionscharge wurden jeweils 5 µl von drei 1:5 verdünnten
Verdünnungsstufen eines die volle provirale Sequenz von JSRV enthaltenden
Plasmids pCMV2JS21 (PALMARINI et al. 1999a) eingesetzt. Die rechnerisch im
Probenvolumen enthaltene Anzahl an Plasmidmolekülen, ausgehend von der
gemessenen Ausgangskonzentration der Stammlösung, sowie der Prozentsatz
positiver Reaktionen in der U3 LTR PCR und der hn PCR sind Tabelle 25 zu
entnehmen. Sofern eine Plasmidverdünnung bereits in der U3 LTR PCR deutlich
positiv war, wurde nicht in jedem Fall eine hn PCR durchgeführt. Die Anzahl der in
die Berechnung eingegangenen Reaktionen pro Verdünnungsstufe ist in Klammern
140 ERGEBNISSE
gestellt. Sofern nicht mindestens die beiden Verdünnungsstufen 10-9 und 10-11
mindestens in der hn PCR positiv waren, wurde der Ansatz wiederholt. Ein solches
Sensitivitätsproblem trat im Zuge der Verwendung einer neuen Charge des dNTP-
Mixes der Fa. Roth (Rotimix PCR 3) auf, so dass daraufhin die Lieferfirma
gewechselt wurde. Die in diesem Zusammenhang zur Abklärung der Ursache des
Sensitivitätsproblems durchgeführten Reaktionen sind nicht in diese Berechnung
eingeflossen.
Tabelle 25: Prozentsatz positiver Reaktionen der Plasmidkontrollen in der U3 LTR und der hn PCR vor dem Hintergrund von Wasser
Verdünnungs-stufe
Rechnerischer Gehalt an
Molekülen pro 5µl 1:5
verdünnter Lösung
% positiver PCR-
Reaktionen in U3 LTR
PCR
% fraglich positiver
PCR-Reaktionen in U3 LTR PCR
% positiver PCR-
Reaktionen in hn PCR
10-9 2,275 x 102 100 (n=62) - 100 (n=21)
10-11 2,275 x 100 91,9 (n=62) 8,1 (n=62) 100 (n=56)
10-12 2,275 x 10-1 3,8 (n=56) 17,8 (n=56) 77,4 (n=53)
4.6.2 Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA (Inhibitionskontrollen)
Um einen möglichen Sensitivitätsverlust des Reaktionssystems vor dem Hintergrund
von 800 – 1000 ng DNA durch die Anwesenheit möglicher Inhibitoren oder die
Hintergrund-DNA selbst zu untersuchen, wurden exemplarisch 29 willkürlich
ausgewählte, in dreimaliger Untersuchung in U3 LTR PCR und hn PCR negative
Gewebeproben (24 Lymphknoten- und 5 Lungengewebeproben) sowie 32 ebenfalls
negative Zellproben (15 Buffy-Coat- und 17 BAL-Proben) mit jeweils 5 µl der drei als
Grenzwert-Positivkontrollen verwendeten, 1:5 verdünnten Plasmidverdünnungs-
stufen 10-9, 10-11 und 10-12 versetzt. Zusätzlich wurde pro Probe ein erneuter Ansatz
ERGEBNISSE 141
ohne Plasmidzusatz mitgeführt. Diese Untersuchungen wurden jeweils im
Einfachansatz durchgeführt. In Einzelfällen war die vorhandene Restmenge der
Proben nicht ausreichend, um diesen Leeransatz oder einzelne der genannten
Plasmidverdünnungen mitzuführen. Weiterhin wurden fünf weitere Blut- und vier
weitere BAL-Proben sowie Rinderlungen-DNA lediglich mit den ersten beiden
Verdünnungsstufen versetzt und mittels PCR untersucht. In allen Fällen lieferte der
Ansatz ohne Plasmidzusatz sowohl in der U3 LTR als auch der hn PCR ein erneutes
negatives Ergebnis. Mit Plasmidzusatz wurde für die Verdünnungsstufe 10-9 für alle
Probenarten in 100% der Fälle, für die Verdünnungsstufe 10-11 abhängig von der Art
der Probe in 94,1 – 100 % der Fälle im Einfachansatz ein positives Ergebnis in der
hn PCR erzielt. Bei allen diesen Untersuchungen wurden routinemäßig Positiv- und
Negativkontrollen mitgeführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind nach
Probenarten getrennt in den Tabellen 26 bis 28 dargestellt.
Tabelle 26 zeigt die Ergebnisse der Inhibitionskontrollen für die Gewebeproben
(n=30). Die Ergebnisse sind getrennt nach denen der U3 LTR und der hn PCR
aufgeführt. In der U3 LTR PCR positive Proben wurden nicht in allen Fällen mit der
hn PCR nachuntersucht.
142 ERGEBNISSE
Tabelle 26: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Gewebeproben)
Plasmid- verdünnungsstufe
positiv in U3 LTR PCR
fraglich in U3 LTR PCR
negativ in U3 LTR PCR
positiv in hn PCR
negativ in hn PCR
nicht untersucht in hn PCR
10-9
n=30
16
(53,3%)
5
(16,7%)
9
(30,0%)
17
(100%)
- 13 (alle positiv in U3 LTR
PCR) 10-11
n=30
10
(33,3%)
6
(20,0%)
14
(46,7%)
28
(96,6%)
1
(3,4%)
1
(positiv in U3 LTR PCR)
10-12
n=27
1
(3,7%)
1
(3,7%)
25
(92,6%)
15
(55,6%)
12
(44,4%)
-
Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt
In gleicher Weise sind in Tabelle 27 die Ergebnisse für die Blutproben (n=20)
dargestellt.
Tabelle 27: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Blutproben)
Plasmidver-dünnungsstufe
positiv in U3 LTR PCR
fraglich in U3 LTR PCR
negativ in U3 LTR PCR
positiv in hn PCR
negativ in hn PCR
nicht untersucht in hn PCR
10-9
n=20
15
(75%)
3
(15%)
2
(10%)
15
(100%)
- 5
(alle positiv in U3 LTR
PCR) 10-11
n=20
12
(60%)
2
(10%)
6
(30%)
15
(100%)
- 5
(alle positiv in U3 LTR
PCR) 10-12
n=15
1
(6,7%)
3
(20%)
11
(73,3%)
12
(80%)
3
(20%)
-
Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt
ERGEBNISSE 143
Die Abbildungen 5 und 6 zeigen die elektrophoretische Darstellung der Produkte der
U3 LTR bzw. hn PCR von sieben mit Plasmid versetzten Blutproben sowie der
entsprechenden Kontrollen.
Abbildung 5: Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der U3 LTR PCR mit Plasmid versetzter Blutproben. Das Produkt ist 176 Basenpaare (bp) lang Bezeichnung der Spuren: 1 Probe 1, ohne Plasmidzusatz 1/1 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 1/2 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 1/3 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 Die Bezeichnung der Proben 2 bis 7 erfolgte in gleicher Weise 8 positive Kontrollprobe, BAL eines an LA erkrankten Schafes 9 negative Kontrollprobe, Buffy-Coat eines LA-negativen Schafes 10 5 µl 1:5 verdünnte Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 11 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 12 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 13 Wasser-Negativkontrolle I 14 Wasser-Negativkontrolle II In den äußeren Spuren wurde als Längenstandard ein 100bp-Marker aufgetragen
144 ERGEBNISSE
Alle Proben außer der bereits in der U3 LTR PCR deutlich positiven Probe Nr. 8
wurden in der hn PCR nachuntersucht. Das Ergebnis ist in Abbildung 6 dargestellt.
Abbildung 6: Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der hn PCR mit Plasmid versetzter Blutproben. Das Produkt hat eine Größe von 133 Basenpaaren (bp). Die Bezeichnung der Spuren entspricht Abbildung 5. Probe 8 entfällt. Zusätzlich wurden zwei neue Wasser-Negativkontrollen (Proben 15 und 16) mitgeführt: 1 Probe 1, ohne Plasmidzusatz 1/1 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 1/2 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 1/3 Probe 1, mit 5 µl 1:5 verdünnter Stufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 Die Bezeichnung der Proben 2 bis 7 erfolgte in gleicher Weise 8 entfällt aufgrund des deutlich positiven Ergebnisses in der U3 LTR PCR 9 negative Kontrollprobe, Buffy-Coat eines LA-negativen Schafes 10 Verdünnungstufe 10-9 des Plasmids pCMVJS21 11 Verdünnungsstufe 10-11 des Plasmids pCMVJS21 12 Verdünnungsstufe 10-12 des Plasmids pCMVJS21 13 Wasser-Negativkontrolle I 14 Wasser-Negativkontrolle II 15 Wasser-Negativkontrolle III 16 Wasser-Negativkontrolle IV In den äußeren Spuren wurde als Längenstandard ein 100bp-Marker aufgetragen
ERGEBNISSE 145
Tabelle 28 zeigt die Ergebnisse der Inhibitionskontrollen für 21 Lungenspülproben.
Tabelle 28: Ergebnis der Inhibitionskontrollen (BAL-Proben)
Plasmidver-dünnungsstufe
positiv in U3 LTR PCR
fraglich in U3 LTR PCR
negativ in U3 LTR PCR
positiv in hn PCR
negativ in hn PCR
nicht untersucht in hn PCR
10-9
n=21
11
(52,4%)
5
(23,8%)
5
(23,8%)
17
(100%)
- 4
(alle positiv in U3 LTR PCR)
10-11
n=21
6
(28,6%)
4
(19,0%)
11
(52,4%)
16
(94,1%)
1
(5,9%)
4
(alle positiv in U3 LTR PCR)
10-12
n=17
0 0 17
(100%)
6
(35,3%)
11
(64,7%)
-
Die relativen Werte (in % der jeweils pro Verdünnungsstufe untersuchten Proben) sind in Klammern gesetzt Zusammenfassung und Beurteilung
Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Nachweisgrenze vor dem Hintergrund von
800 – 1000 ng DNA sind für alle Probenarten in Tabelle 29 zusammengefaßt:
Tabelle 29: Zusammenfassung der Inhibitionskontrollen für alle Probenarten; n = 71
Plasmid- verdünnungsstufe
% positiver PCR-Reaktionen in U3
LTR PCR
%fraglicher PCR-Reaktionen in U3
LTR PCR
% positiver PCR-Reaktionen in hn
PCR 10-9 59,2 (n=71) 18,3% (n=71) 100 (n=49)
10-11 39,4 (n=71) 16,9 (n=71) 96,7 (n=61)
10-12 3,4 (n=59) 6,8 (n=59) 55,9 (n=59)
Die Sensitivität der Blutprobenuntersuchung mit der heminested PCR scheint
ungeachtet der relativ kleinen Probenzahl der des Nachweises von Plasmid-DNA vor
dem Hintergrund von Wasser zu entsprechen. Auffallend ist jedoch ein deutlicher
146 ERGEBNISSE
Sensitivitätsverlust der U3 LTR PCR bei allen untersuchten Probenarten im Bereich
aller drei Verdünnungsstufen. Bis hin zur Stufe 10-11 wird dieser bei den Blutproben
zu 100% und bei den Gewebe- und den Lungenspülproben zu 96,6 bzw. 94,1%
durch den Einsatz der heminested PCR wettgemacht. Die sichere Nachweisgrenze
von JSRV vor dem Hintergrund von 800-1000 ng genomischer DNA im
Einfachansatz aus allen untersuchten Probenmaterialien kann daher, entsprechend
der in der Verdünnungsstufe 10-9 rechnerisch enthaltenen Molekülzahl mit etwa 230
JSRV-Molekülen angegeben werden. Da aufgrund des in etwa 80% der Fälle
ebenfalls positiven Ergebnisses der Verdünnungsstufe 10-12 vor dem Hintergrund von
Wasser davon ausgegangen werden muß, dass der tatsächliche Gehalt an
amplifizierbaren Molekülen höher als der errechnete ist (für ein positives Ergebnis
muß mindestens ein Zielmolekül im Ansatz vorhanden sein), muß die
Nachweisgrenze realistischer mit etwa 230 – 1000 Plasmidmolekülen vor dem
Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA angegeben werden. In
durchschnittlich 96,7% der Fälle kann in den verschiedenen untersuchten Proben im
Einfachansatz auch die Verdünnungsstufe 10-11, entsprechend zwischen zwei und
zehn Plasmidmolekülen, vor dem Hintergrund genomischer DNA detektiert werden.
Durch Anwendung eines Mehrfachansatzes kann die Nachweisgrenze hier auf
nahezu 100% gesteigert werden.
4.6.3 Nachweisgrenze des Gesamtsystems (Probenbearbeitung / DNA-Extraktion / PCR-Untersuchung) am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
4.6.3.1 Vergleich der Isolierung von Gesamt-DNA aus Buffy-Coat mit einer Methode zur Gewinnung von DNA aus Vollblut (Vorversuche)
Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA
Die Bestimmung der OD260 und OD280 erfolgte für die nach beiden Verfahren
präparierten Proben in einer Verdünnung 1/10 mit einem Messvolumen von 100µl.
ERGEBNISSE 147
Mit beiden Verfahren wurden brauchbare DNA-Konzentrationen erzielt. Die
Durchschnittswerte lagen für die mithilfe des Qiagen DNeasyR tissue kits präparierten
Proben (Elution in 400µl Puffer AE) bei 37,96 ng/µl, bei den nach der DNAzolR-
Methode bearbeiteten Proben bei 48,54 ng/µl. Beide Probengruppen unterschieden
sich deutlich in ihren Reinheitswerten (OD260/OD280). Die Werte der OD260/OD280 sind
im einzelnen in Tabelle 30 dargestellt.
Tabelle 30: Vergleich der OD260/OD280 für mit verschiedenen Verfahren aus mit JS7-Zellen versetzten Proben isolierter DNA Verhältnis JS7-
Zellen zu Rinderleukozyten
Qiagen DNeasyR tissue kit
DNAzolR
1:100 1,94 1,55
1:1.000 1,96 1,32
1:10.000 1,99 1,28
Probe 1
ohne Zusatz 1,95 1,55
1:100 1,96 1,65
1:1.000 1,95 1,62
1:10.000 1,97 1,60
Probe 2
ohne Zusatz 1,95 1,59
1:100 1,92 -
1:1.000 2,06 -
1:10.000 1,85 -
Probe 3
(Buffy-Coat
Pellet)
ohne Zusatz 1,90 -
Mittelwert (+ SD) 1,95 (+ 0,05) 1,52 (+ 0,13)
SD: Standardabweichung; OD260: optische Dichte bei 260 nm
148 ERGEBNISSE
PCR-Ergebnisse
Abbildung 7: vergleichende elektrophoretische Darstellung der PCR-Produkte von mit verschiedenen Verfahren zur DNA-Extraktion präparierten, mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben. Die mit schwarzer Schrift gekennzeichneten Spuren beinhalten die mit dem Qiagen DNeasyR Kit präparierten Proben. Die mit der DNAzolR-Methode präparierten Proben sind weiß beschriftet. Die mitgeführten Kontrollen sind mit den Buchstaben a bis h gekennzeichnet.
Die Bezeichnung der Spuren ist wie folgt: 1/1 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 1/2 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 1/3 Probe 1, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 1/4 Probe 1, Rindervollblut, ohne Zusatz von JS7-Zellen
ERGEBNISSE 149
2/1 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 2/2 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 2/3 Probe 2, Rindervollblut, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 2/4 Probe 2, Rindervollblut, ohne Zusatz von JS7-Zellen 3/1 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:100 3/2 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:1.000 3/3 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, versetzt mit JS7-Zellen im Verhältnis 1:10.000 3/4 Probe 3, Rinder-Buffy-Coat, ohne Zusatz von JS7-Zellen a Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-9 b Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-11
c Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-12
d Plasmidkontrolle, unverdünnt e Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-4 f Plasmidkontrolle, Verdünnungsstufe 10-6 g Wasser-Negativkontrolle I h Wasser-Negativkontrolle II
a) PCR-Ergebnisse der mit dem Qiagen DNeasyR tissue Kit präparierte Proben
Es ergaben sich, wie aus Abbildung 7 ersichtlich, keine Hinweise auf offensichtliche
Unterschiede in der Nachweisgrenze zwischen dem Zusatz von JS7-Zellen zu der
frischen Blutprobe (Proben 1 und 2) im Vergleich zum Zusatz zu dem bereits
präparierten Leukozytenpellet (Probe 3) bei anschließender DNA-Extraktion mit dem
Qiagen DNeasy tissue kit. Die JS7-Zellen scheinen folglich bei der Buffy-Coat-
Präparation keinen die Nachweisgrenze beeinflussenden Schaden zu nehmen. Bei
beiden gespikten Frischblutproben erhielt man wie bei der gespikten Buffy-Coat-
Probe jeweils im Dreifachansatz eine deutliche Bande der erwarteten Größe für das
Zellverhältnis 1:100, jeweils eine etwas schwächere, jedoch nach wie vor deutliche
Bande für das Zellverhältnis 1:1000. Zusätzlich waren bei beiden Frischblutproben 1
und 2 für das Verhältnis 1:10.000 jeweils in zwei von drei Ansätzen eine sehr
schwache Bande erkennbar, während in dieser Stufe alle drei Ansätze der gespikten
Buffy-Coat-Probe (Probe 3) negativ blieben. Die ohne Zusatz von JS7-Zellen für jede
der drei Proben ebenfalls im Dreifachansatz durchgeführte Untersuchung verlief für
alle drei Proben negativ.
150 ERGEBNISSE
b) PCR-Ergebnisse der nach der DNAzolR-Methode (Helena Biosciences,
Sunderland, U.K.) präparierte Proben
Jeweils ein Aliquot der verschiedenen Stufen der Proben 1 und 2 wurde nach dem
Zusatz der entsprechenden Menge der JS7-Zellen abgenommen und einer Methode
der DNA-Extraktion aus Vollblut unterzogen. Für die Stufe 1:100 erhielt man für
beide Proben im Dreifachansatz eine deutlich positive, spezifische Bande, in der
Stufe 1:1000 zeigte nur die Probe 1 in einem von drei Ansätzen eine schwach
positive Bande. Alle übrigen Ansätze zeigten ein negatives Ergebnis. Überdies
schien die mit dieser Methode gewonnene DNA aufgrund der Darstellung im
Agarosegel zum Teil degradiert zu sein.
4.6.3.2 Nachweisgrenze des Gesamtsystems
A Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Die Untersuchung von jeweils 800 – 1.000 ng DNA mittels U3-LTR PCR der
verschiedenen Stufen der mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben erfolgte im
Vierfachansatz. In dieser Untersuchung fragliche oder negative Proben wurden in der
hn PCR nachuntersucht. Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Feststellung der
Nachweisgrenze der U3 LTR PCR sind in Tabelle 31 zusammengefasst.
ERGEBNISSE 151
Tabelle 31: Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Verhältnis JS7-
Zellen:Rinderleukozyten
Ergebnis der U3 LTR PCR
Ergebnis der hn PCR
1:100 + + + + nicht untersucht
1:1000 + + + + nicht untersucht
1:2000 + + + + nicht untersucht
1:3000 + + + + nicht untersucht
1:4000 + + + + nicht untersucht
1:5000 + + (+) + nicht untersucht
1:6000 + + + + nicht untersucht
1:7000 + + + + nicht untersucht
1:8000 + + (+) + nicht untersucht
1:9000 + + + + nicht untersucht
1:10.000 + + + + nicht untersucht
1:11.000 + + + (+) nicht untersucht
1:12.000 + + + + nicht untersucht
1:13.000 ((+)) (+) + (+) + + + +
1:14.000 ((+)) + ((+)) (+) + + + +
1:15.000 ? + (+) ((+)) + + + +
ohne Zusatz - - - - - - - -
Untersuchung jeweils im Vierfachansatz +: positiv; (+): schwach positiv; ((+)): sehr schwach positiv; -: negativ; ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande der erwarteten Größe) ++++: vier Ansätze positiv
Bis zur Stufe 1:12.000 wurde jeweils in allen vier Ansätzen in der U3 LTR PCR ein
eindeutig positives Ergebnis erzielt. In den darauffolgenden Stufen wurden die
Banden so schwach, dass eine Nachuntersuchung mit der hn PCR nötig wurde.
152 ERGEBNISSE
B Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Diese Untersuchungen erfolgten ab der Stufe 1:30.000 (Verhältnis JS7-
Zellen:Rinderleukozyten) zweimal im Dreifachansatz. Jeweils 800 – 1000 ng DNA
wurden mittels U3 LTR PCR und hn PCR untersucht. Die Stufen 1:1000 und
1:15.000 wurden in jeder Reaktionscharge zusätzlich zu den üblichen Kontrollen
jeweils im Einfachansatz als Kontrollen mitgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 32
dargestellt.
Tabelle 32: Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Verhältnis JS7-Zellen:Rinderleukozyten
Ergebnis der U3 LTR PCR
Ergebnis der hn PCR
1:1000 + + nicht untersucht
1:15.000 + - + +
1:30.000 (+) (+) (+) - - - + + + + + +
1:40.000 (+) (+) ? - - - + + + + + +
1:50.000 (+) (+) ? - - - + + + + - +
1:60.000 ? ? - - - - + + + - + +
1:70.000 - - - - - - - + - + + -
1:80.000 - - - - - - + + + + + +
1:90.000 - - - - - - - + - + + +
1:100.000 - - - - - - - - - - + -
ohne Zusatz - - - - - - - - - - - -
Untersuchung ab der Stufe 1:30.000 jeweils zweimal im Dreifachansatz +: positiv; (+): schwach positiv; -: negativ ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande) ++++++: sechs Ansätze positiv
Nach einem notwendigen Wechsel des Lieferanten der dNTP’s von der Fa. Roth
(RotimixR PCR 3) zur Fa. Biometra (Finnzymes dNTP Mix) im Januar 2003 wurden
diese Untersuchungen an denselben Proben wiederholt. Für diese Neubestimmung
ERGEBNISSE 153
der Nachweisgrenze wurden die Stufen 1:100, 1:1.000, 1:3.000, 1:9.000 und
1:11.000 aus Tabelle 30 und 1:15.000, 1:30.000 und 1:40.000 aus Tabelle 32 jeweils
im Dreifachansatz, die Stufen 1:50.000 bis 1:100.000 sowie die Probe ohne Zusatz
von JS7-Zellen aus Tabelle 32 jeweils sechsmal (zweimal im Dreifachansatz)
untersucht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 33 zusammengefaßt.
Tabelle 33: Nachweisgrenze der U3 LTR und hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben bei Verwendung von Finnzymes dNTP’s
Verhältnis JS7-Zellen:Rinderleukozyten
Ergebnis der U3 LTR PCR
Ergebnis der hn PCR
1:100 + + + nicht untersucht
1:1000 + + + nicht untersucht
1:3000 + + + nicht untersucht
1:9000 (+) + + + + +
1:11.000 (+) (+) (+) + + +
1:15.000 - - - + + +
1:30.000 - - - + + +
1:40.000 - - - + + +
1:50.000 - - - - - - + + + - + +
1:60.000 - - - - - - + - + + + -
1:70.000 - - - - - - + + - + + +
1:80.000 - - - - - - + - - + + +
1:90.000 - - - - - - - - - - - -
1:100.000 - - - - - - - + - + - -
ohne Zusatz - - - - - - - - - - - -
Untersuchung im Dreifachansatz, ab der Stufe 1:50.000 jeweils zweimal im Dreifachansatz: +: positiv; (+): schwach positiv; -: negativ ?: fraglich positiv (d.h. extrem schwache, kaum erkennbare Bande) +++: drei Ansätze positiv
154 ERGEBNISSE
Bis zur Verdünnungsstufe 1:40.000 wurde mittels hn PCR mit beiden verwendeten
Nukleotidmischungen in allen untersuchten Ansätzen ein JSRV-spezifisches
Genomfragment detektiert. Danach wurde der Nachweis unzuverlässig. Nach den
vorliegenden Ergebnissen ist jedoch damit zu rechnen, dass bei Untersuchung eines
Dreifachansatzes ein positives Ergebnis (d.h. mindestens einer von drei Ansätzen
positiv) mit beiden verwendeten Nukleotidmischungen bis etwa zur Stufe 1:80.000
erreicht wird. 4.6.4 Southern Blot
Eine Anzahl in der U3 LTR PCR positiver Gewebeproben sowie negativer Blutproben
von an Lungenadenomatose erkrankten Tieren wurden mit den üblichen Plasmid-
und Negativkontrollen einem Southern-Blot unterworfen und mithilfe einer radioaktiv
markierten Sonde (Rediprime II Random Prime Labelling System; Amersham
Pharmacia Biotech) dargestellt. Das als Blotvorlage dienende Agarosegel und die
geblottete Nitrocellulosemembran sind in Abbildung 8 und 9 dargestellt. Alle auf dem
Agarosegel deutlich sichtbaren Banden stellen sich auch auf der geblotteten
Membran dar. Zusätzlich zeigt die Plasmidverdünnungsstufe 10-12 (Probe Nr. 18) ein
schwaches Signal. Die überprüften Blutproben klinisch erkrankter Tiere (Proben 7 bis
11) sowie die Wasser-Negativkontrollen (Proben 19 und 20) sind auch im Southern
Blot negativ.
ERGEBNISSE 155
Abbildung 8: Agarosegel vor Durchführung des Southern Blot
Bezeichnung der Spuren: 1 bis 6: Blutproben-DNA aus dem MRI 7 bis 11: Blutproben von Heidschnucken mit klinischer LA 12 bis 15: Gewebeproben LA-positiver Heidschnucken 16: Plasmidverdünnungsstufe 10-9 17: Plasmidverdünnungsstufe 10-11 18: Plasmidverdünnungsstufe 10-12 19 und 20: Wasser-Negativkontrollen
156 ERGEBNISSE
Abbildung 9: Geblottete Nitrozellulosemembran
Bezeichnung der Spuren: 1 bis 6: Blutproben-DNA aus dem MRI 7 bis 11: Blutproben von Heidschnucken mit klinischer LA 12 bis 15: Gewebeproben LA-positiver Heidschnucken 16: Plasmidverdünnungsstufe 10-9 17: Plasmidverdünnungsstufe 10-11 18: Plasmidverdünnungsstufe 10-12 19 und 20: Wasser-Negativkontrollen
4.6.5 Sequenzierung der PCR-Produkte
Zur Überprüfung der Spezifität der nachgewiesenen Banden wurde eine
Sequenzierung der PCR-Produkte der U3 LTR PCR sowie der GAPDH PCR
durchgeführt. Diese wurde durch die Firma AGOWA GmbH, Berlin vorgenommen.
ERGEBNISSE 157
a) GAPDH PCR
Aus dem 388 bp langen Reaktionsprodukt der GAPDH PCR aus einer
Lungenspülprobe wurde ein 279 bp langes Teilstück sequenziert:
5’ - AGC TCA TCA TCA ATG GAA AGG CCA TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG
ATC CTG CCA ACA TCA AGT GGG ATG ATG CTG GTG CTG AGT ACG TGG
TGG AGT CCA CTG GGG TCT TCA CTA CCA TGA AGA AGG CTG GGG CTC
ACT TGA AGG GTG GCA CCA AGA GGG CAT CAT CTC TGC GCC TTC TGC
CGA TGC CCC CAT GTT TGT GAT GGG CGT GAA CCA GAG AAG TAT AAC ACC
CTC ATG ATT GTC AGC AAT GCC TCC TGC ACC ACC AAC TGC TTG TCC CCC
CC – 3’
b) U3 LTR PCR
Aus dem 176 bp langen Reaktionsprodukt der LTR PCR aus Tumorgewebe eines
klinisch kranken, mit Feldvirus infizierten Schafes wurde ein 117 bp langes Teilstück
sequenziert:
5’ – GCC ACC CTC AAG AAT TTT TAA AGG CTC TTA AGG CTC GGA TGT TTG
CTT TTG GCA CTG CTT CAT AGA AAT ACC AGG AAA TCT GAT TAT ATA AGA
ATC CGG TGA TTG TGT AAA AAT CCG – 3’
Die Sequenzen wurden unter www.ncbi.nlm.nih.gov über das Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) mit bei GenBank registrierten DNA-Sequenzen verglichen.
Das Produkt der GAPDH PCR wies eine Basensequenzhomologie von 94% zu
Sequenzen der Ovis aries Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase auf
(GenBank accession no. AF030943)
158 ERGEBNISSE
Für das Produkt der U3 LTR PCR wurde eine 98%ige Basensequenzhomologie zum
Genom des britischen JSRV-Stammes JS21 ermittelt (GenBank accession no.
AF105220).
4.7 Untersuchung von Proben aus positiven Herden
4.7.1 Probenübersicht (positive Herden)
Entgegen den Literaturangaben (HOLLAND et al. 1999; GONZALEZ et al. 2001)
sowie den Erfahrungen von DEWAR und SHARP (2000; pers. Mitteilung) erwies sich
die Untersuchung von Blutproben bei den untersuchten Heidschnucken in
Voruntersuchungen als wenig vielversprechend (selbst von klinisch erkrankten
Tieren wurden überwiegend negative Ergebnisse erzielt), so dass im Laufe der
Untersuchungen dazu übergegangen wurde, neben den unter 3.9 und 4.6
beschriebenen Untersuchungen zur Abklärung möglicher falsch-negativer Resultate
von den zur Sektion vorgesehenen Tieren und einigen Schlachttieren auch
Lungenspülproben zu entnehmen. Dies war bei den ersten Tieren nicht erfolgt, so
dass nicht von allen Tieren Lungenspülproben für die PCR-Untersuchung zur
Verfügung standen. Bei den Tieren der Kategorie IV wurde auf die routinemäßige
Untersuchung der Blut- und Lungengewebsproben aus Kostengründen zugunsten
der vielversprechenderen Untersuchung von Lungenspülproben und Ln.
mediastinalis caudalis verzichtet.
Eine Übersicht über die Anzahl und Art der untersuchten Proben von Sektions- und
Schlachttieren der verschiedenen Kategorien aus positiven Herden ist in Tabelle 34
gegeben.
ERGEBNISSE 159
Tabelle 34: Probenübersicht (positive Herden); Anzahl mit der PCR untersuchter Proben von Schlacht- und Sektionstieren der verschiedenen Kategorien
Kategorie I II III IV
Definition makroskopisch LA, histologisch bestätigt
n = 65 (davon Gruppe D n=28 /
Gruppe C n = 19)
makroskopisch keine Hinweise
auf LA, histologisch LA
n = 14
makroskopisch keine Hinweise auf LA, histo-
logisch fraglich
n = 7
weder makroskopisch
noch histologisch
Hinweise auf LA
n = 72
BAL n = 39 (Gr. D n=17 / Gr. C n=12)
n = 12 n = 3 n = 67
Blut n = 57 (Gr. D n=24 / Gr. C n=19)
n = 13 n = 6 n = 4
Ln. mediastinalis
caudalis
n = 58 (Gr. D n=25 / Gr. C n=19)
n = 11 n = 7 n = 66
Tumorgewebe n = 57 (Gr. D n=26 / Gr. C n=19)
- - -
makroskopisch unverändertes Lungengewebe
n = 25 (Gr. D n=7 / Gr. C n=9)
n = 11 n = 7 n = 7
n = Anzahl Tiere/Proben der entsprechenden Kategorie. Für die Kategorie I wurden zusätzlich zur Gesamtzahl die entsprechenden Zahlen der klinischen Untergruppen D (klinisch krank) und C (klinischer Verdacht) in Klammern dahinter gesetzt. Gr: Gruppe; LA: Lungenadenomatose Ln.: Lymphonodus
4.7.2 Ergebnisse der PCR-Untersuchungen aus den positiven Herden
4.7.2.1 Tiere mit makroskopisch nachweisbaren Tumoren (Kategorie I) Definition der Kategorie I: makroskopisch LA, histologisch bestätigt
Die 65 Tiere der Kategorie I umfassen ein recht heterogenes Probengut – sie setzen
sich zusammen aus 28 klinisch an Lungenadenomatose erkrankten Tieren (klinische
160 ERGEBNISSE
Gruppe D, Schubkarrentest positiv), 19 Tieren der klinische Gruppe C (Verdacht auf
Lungenadenomatose) und 18 Tieren, die bei der klinischen Untersuchung wenig oder
keine Verdachtsmomente auf eine respiratorische Erkrankung lieferten (Gruppen A
und B), die jedoch bei der Sektion makroskopisch Lungenadenomatose-verdächtige
Läsionen aufwiesen. Die Größe dieser Läsionen war zum Teil sehr gering (ca.
Kirschgröße).
Das Ergebnis der PCR-Untersuchung der verschiedenen Proben bei dreifacher
Untersuchung mittels U3 LTR und gegebenenfalls hn PCR ist für die klinischen
Untergruppen und die Probengesamtheit der Kategorie I in den Tabellen 35 bis 39
dargestellt. Ein Untersuchungsergebnis wurde als positiv gewertet, wenn in
mindestens einem von drei Ansätzen ein positives PCR-Ergebnis erzielt wurde und
alle mitgeführten Negativkontrollen ein negatives Ergebnis aufwiesen.
Tabelle 35: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren der Kategorie I (n=39)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR
+ + +
hn PCR
+ + -
hn PCR
+ - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 16 1 - - - klin. krank
n=17 positiv: 100 % negativ: 0 %
12 - - - - klin. Verd. n=12 positiv: 100 % negativ: 0 %
7 - 1 - 2 klin. LA-unverd. n= 10 positiv: 80 % negativ: 20%
35 1 1 - 2 Gesamtheit der Kat. I
n=39 positiv: 94,9 % negativ: 5,1%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ; unverd.: unverdächtig; klin.: klinisch; Verd.: Verdacht
ERGEBNISSE 161
Tabelle 36: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Blutproben (Buffy-Coat) von Tieren der Kategorie I (n=57)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - - 2 1 1 24 klin. krank
n=24 positiv: 20 % negativ: 80%
- - - - 19 klin. Verd. n=19 positiv: 0 % negativ: 100%
- - - - 14 klin. LA-unverd. n= 14 positiv: 0 % negativ: 100%
- 2 1 1 53 Gesamtheit der Kat. I
n=57 positiv: 7 % negativ: 93%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
Tabelle 37: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis von Tieren der Kategorie I (n=58)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 16 5 2 2 - klin. krank
n=25 positiv: 100 % negativ: 0 %
10 4 1 - 4 klin. Verd. n=19 positiv: 78,9 % negativ: 21,1%
7 - 2 2 3 klin. LA-unverd. n= 14 positiv: 78,6 % negativ: 21,4%
33 9 5 4 7 Gesamtheit der Kat. I
n=58 positiv: 87,9 % negativ: 12,1%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
162 ERGEBNISSE
Tabelle 38: Ergebnis der PCR-Untersuchung von Tumorgewebe bzw tumorverdächtigem Gewebe von Tieren der Kategorie I (n=57)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 26 - - - - klin. krank
n=26 positiv: 100 % negativ: 0 %
18 - - - - klin. Verd. n=18 positiv: 100 % negativ: 0 %
12 1 - - - klin. LA-unverd. n= 13 positiv: 100 % negativ: 0 %
56 1 - - - Gesamtheit der Kat. I
n=57 positiv: 100 % negativ: 0 %
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
Tabelle 39: Ergebnis der PCR-Untersuchung von makroskopisch unverändertem Gewebe von Tieren der Kategorie I (n=25)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 4 1 - - 2 klin. krank
n=7 positiv: 71,4 % negativ: 28,6%
3 2 - - 2 klin. Verd. n=7 positiv: 71,4 % negativ: 28,6%
3 2 2 - 4 klin. LA-unverd. n= 11 positiv: 63,6 % negativ: 36,4%
10 5 2 - 8 Gesamtheit der Kat. I
n=25 positiv: 68 % negativ: 32%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
ERGEBNISSE 163
4.7.2.2 Tiere mit lediglich histologisch nachgewiesener Lungen-adenomatose (Kategorie II)
Definition der Kategorie II: makroskopisch keine Hinweise auf LA, histologisch LA
nachgewiesen
Diese 14 Tiere entstammen alle den klinischen Gruppen A und B. Das
Untersuchungsergebnis der verschiedenen Proben dieser Tiere ist in Tabelle 40
zusammengefasst.
Tabelle 40: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie II (n=14)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 4 2 - 3 3 BAL
n=12 positiv: 75 % negativ: 25%
- - - - 13 Blut
n=13 positiv: 0 % negativ: 100%
3 - - 2 6 Ln. mediastinalis
caudalis n=11
positiv: 45,5 % negativ: 54,5%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
Zusätzlich wurden von elf dieser Tiere jeweils makroskopisch unverändertes
Lungengewebe von zwei Lungenlokalisationen mittels PCR untersucht. Bei zwei
Tieren wurde in beiden Lokalisationen ein positives Ergebnis erzielt, dabei aus
mindestens einer Lokalisation bereits in der U3 LTR PCR. Bei fünf weiteren Tieren
wurde in der hn PCR aus jeweils einer Lokalisation JSRV detektiert (3x +++; 1x ++-;
1x +--), während die Untersuchung der jeweils zweiten Lokalisation des
entsprechenden Tieres ein negatives Ergebnis lieferte. Mit einer Untersuchung von
164 ERGEBNISSE
zwei Lungenlokalisationen wurde demnach JSRV bei sieben Tieren (63,6%)
nachgewiesen. Bei vier Tieren (36,4%) war die dreimalige Untersuchung beider
Lokalisationen negativ.
4.7.2.3 histologisch negative Tiere (Kategorie IV) Definition der Kategorie IV: weder makroskopisch noch histologisch Hinweise auf LA
Von den 72 Tieren dieser Kategorie wurden zunächst lediglich die Lungenspülproben
und Gewebe des Ln. mediastinalis caudalis mittels PCR untersucht. Diese
Ergebnisse sind in Tabelle 41 dargestellt.
Tabelle 41: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie IV (n=72)
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 1 2 - 1 63 BAL
n=67 positiv: 6 % negativ: 94%
- - 1 - 65 Ln. mediastinalis
caudalis n=66
positiv: 1,5 % negativ: 98,5%
Die Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; n=Anzahl Tiere +++: alle drei Ansätze positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
Die insgesamt vier Tiere mit positivem Nachweis von JSRV-spezifischen
Genomfragmenten mittels PCR aus der Lungenspülprobe (bei einem Tier zusätzlich
auch aus dem Lymphknoten) sind sehr wahrscheinlich als falsch-negative Befunde
der histologischen Untersuchung anzusehen. Bei allen vier Tieren bestanden weder
klinisch noch makroskopisch Hinweise oder Verdachtsmomente auf eine
Lungenadenomatose-Erkrankung. Aus dem asservierten Gewebe konnte jedoch bei
zwei dieser vier Tiere der positive JSRV-Nachweis bestätigt werden. Die
ERGEBNISSE 165
Untersuchungsergebnisse dieser vier Tiere sind im Detail der Tabelle 42 zu
entnehmen.
Tabelle 42: Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der vier PCR-positiven Tiere aus Kategorie IV (histologisch negativ)
Tier 1 OM 1683
Tier 2 OM 1701
Tier 3 OM 1727
Tier 4 OM 60
klin. Befund 7 Jahre, w klinisch o.b.B
7 Jahre, w klinisch o.b.B
7 Jahre, w klinisch o.b.B
10 Monate, m klinisch o.b.B Mutter an LA
erkrankt makro-
skopisch keine Hinweise auf LA, rechter cranio-
ventraler Hauptlappen
solitärer, ca. 1,5 cm großer Abszeß
keine Hinweise auf LA
keine Hinweise auf LA
keine Hinweise auf LA
histologisch subakute bis chronische
abszedierende Herdpneumonie
o.b.B o.b.B o.b.B
PCR BAL U3 LTR - - - hn + - -
U3 LTR + + + U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +
U3 LTR - - - hn + + +
PCR Ln. med.
caud.
U3 LTR - - - hn - - -
U3 LTR - - - hn + + -
U3 LTR - - - hn - - -
U3 LTR - - - hn - - -
PCR Lungenge-
webe
2 Lokalisationen U3 LTR - - -
hn - - -
2 LokalisationenU3 LTR - - -
hn - - -
2 Lokalisationen U3 LTR - - -
hn - - -
1. Lokalisation U3 LTR - - -
hn + - - 2. Lokalisation
negativ Die PCR-Untersuchung erfolgte für jede Probe im Dreifachansatz; OM: Ohrmarke; o.b.B.: ohne besonderen Befund U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+):alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; + - -: einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
166 ERGEBNISSE
4.7.2.4 Statistische Bewertung der Ergebnisse
Der Wert eines diagnostischen Tests wird mit zwei Maßzahlen beschrieben. Die
Sensitivität eines Tests besagt, mit welcher Wahrscheinlichkeit tatsächlich Kranke als
krank, die Spezifität, mit welcher Wahrscheinlichkeit tatsächlich Gesunde als gesund
erkannt werden (GUGGENMOOS-HOLZMANN und WERNECKE 1995).
Das fehlen eines sogenannten „Golden Standard“ macht die statistische Bewertung
der Ergebnisse dieser Untersuchung schwierig. Ein sicheres Nachweisverfahren für
eine stattgefundene Infektion mit JSRV existiert bislang nicht. Sowohl bei der
systematischen histologischen Untersuchung als auch bei der PCR aus den
verschiedenen Proben können falsch-negative Resultate auftreten. Aufgrund der
Spezifität der Primer sind falsch-positive Ergebnisse der PCR primär durch
Laborkontaminationen möglich. Durch adäquate Kontrollen kann dies weitestgehend
ausgeschlossen werden. Das Restrisiko sporadischer Kontaminationen, bei denen
es zu einem falsch-positiven Ergebnis einer Probe kommt, ohne dass gleichzeitig ein
positives Ergebnis bei einer der Negativkontrollen auftritt, ist nicht quantifizierbar.
Falsch-positive oder fragliche Ergebnisse in der histologischen Untersuchung können
durch Fehlinterpretationen von Hyperplasien des Bronchialepithels aufgrund anderer
Ursachen zustande kommen.
Die Ermittlung der Sensitivität des Nachweises von JSRV aus verschiedenen
intravital zu gewinnenden Proben ist daher nur in Relation zu der hier als
Referenzmethode verwendeten histologischen Untersuchung möglich. Sie errechnet
sich wie folgt:
Anzahl positiver Proben mit der untersuchten Methode Relative Sensitivität (%) = x 100 Anzahl positiver Proben mit der Referenzmethode
Falsch-positive Resultate sind aufgrund der oben genannten Schwierigkeiten nicht
quantifizierbar, und im Grenzbereich beginnender Läsionen stoßen beide
Untersuchungsverfahren an ihre Grenzen, so dass hier falsch-negative Befunde
ERGEBNISSE 167
auftreten können. Die Berechnung einer relativen Spezifität auf der Grundlage der
Einordnung eines histologisch negativen Ergebnisses als „richtig negativ“ und
eventueller positiver PCR-Befunde von diesen Tieren als „falsch-positiv“ ist daher
nicht uneingeschränkt zulässig. Die Untersuchungen histologisch negativer und
zugleich PCR-positiver Tiere haben gezeigt, dass das positive PCR-Ergebnis der
Lungenspülprobe in drei von vier Fällen durch unabhängige Untersuchung von
Organmaterial mittels PCR oder eine Mehrfachuntersuchung der Probe verifiziert
werden konnte.
Da die Blutproben der histologisch negativen Tiere aufgrund der extrem niedrigen
Sensitivität einer PCR aus diesem Probenmaterial aus Gründen der Kostenersparnis
nicht untersucht wurden, kann eine Berechnung der relativen Spezifität für diese
Probenart nicht durchgeführt werden. Unter Berücksichtigung der genannten
Einschränkungen berechnet sich die relative Spezifität wie folgt:
Anzahl negativer Proben mit der untersuchten Methode Relative Spezifität (%) = x 100 Anzahl negativer Proben mit der Referenzmethode
Bezogen auf die Gesamtheit aller histologisch bestätigten Lungenadenomatose-Fälle
(Tiere der Kategorie I und II) wurden für die PCR-Untersuchung von
Lungenspülproben, Blutproben und des Lymphonodus mediastinalis caudalis (als
mögliche Alternativmethode zur Histologie in der Schlachttieruntersuchung) die in
Tabelle 43 und 44 dargestellten relativen Sensitivitäten und Spezifitäten ermittelt. Sie
wurden sowohl für die hier durchgeführte Untersuchung der Proben im
Dreifachansatz, als auch für eine Untersuchung im Einfachansatz berechnet. Für
letztere Berechnung wurden Proben als im Einfachansatz detektierbar eingeordnet,
wenn in sie in allen drei Ansätzen ein positives Ergebnis gezeigt hatten. Der
Möglichkeit, dass auch ein Teil der Proben mit zwei oder lediglich einem positiven
Ergebnis in den drei untersuchten Ansätzen mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit
bei einer Untersuchung im Einfachansatz ein positives Ergebnis zeigen wird, wurde
dahingehend Rechnung getragen, dass die Hälfte der Proben mit zweifach positivem
168 ERGEBNISSE
Ergebnis und ein Drittel der Proben mit einfach positivem Ergebnis ebenfalls als im
Einfachansatz detektierbar eingestuft wurden.
Tabelle 43: Relative Sensitivität der PCR-Untersuchung (Tiere der Kategorie I und II) im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen)
Relative Sensitivität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz
BAL 51 90,2 % 85,3 %
Blut 70 5,7 % 4,0 %
Ln. med. caud. 69 81,2 % 71,7 %
Ln. med. caud.: Lymphonodus mediastinalis caudalis
Tabelle 44: Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die Gesamtheit der Tiere der Kategorie IV (n=67 bzw. n=66)
Relative Spezifität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz
BAL 67 94,0 % 95,0 %
Ln. med. caud. 66 98,5 % 99,2 %
Es wurde bereits darauf hingewiesen, dass das histologisch negative Ergebnis von
mindestens drei der vier PCR-positiven Tiere der Kategorie IV (siehe Tabelle 41 und
42) aufgrund der Ergebnisse einer wiederholten Untersuchung der Proben bzw. des
parallelen Nachweises von JSRV aus Gewebematerial mittels PCR als falsch-negativ
betrachtet werden muß. Diese drei falsch-negativen histologischen Befunde dürfen
daher nicht in die Berechnung der Spezifität einbezogen werden. Für die
verbleibende Anzahl mutmaßlich richtig-negativer histologischer Befunde von 64
bzw. 63 Tieren ergibt sich daher für eine PCR-Untersuchung im Dreifach- und
Einfachansatz von Lungenspül- und Lymphknotengewebeproben die in Tabelle 45 dargestellte relative Spezifität.
ERGEBNISSE 169
Tabelle 45: Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die richtig-negativen histologischen Befunde der Tiere der Kategorie IV (n=64 bzw n=63)
Relative Spezifität Probenart Anzahl untersuchter Proben Dreifachansatz Einfachansatz
BAL 64 98,4 % 99,5 %
Ln. med. caud. 63 100 % 100 %
Die in Tabelle 34 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Untersuchung von
Lungenspülproben ein geeignetes diagnostisches Hilfsmittel ist, um einen klinischen
Verdacht auf Lungenadenomatose zu bestätigen. Bei allen klinisch erkrankten Tieren
und allen Tieren mit klinischem Verdacht wurde JSRV mittels PCR aus einer
Lungenspülprobe nachgewiesen. Für einen erfahrenen Kliniker ist eine derartige
Untersuchung in diesem fortgeschrittenen Erkrankungsstadium jedoch sicherlich oft
entbehrlich. Interessant ist daher für die Untersuchung in Sanierung befindlicher
Herden oder die Ankaufsuntersuchung von Einzeltieren die relative Sensitivität der
PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren, bei denen bei eingehender
klinischer Untersuchung keine Hinweise auf eine mögliche Lungenadenomatose-
Erkrankung bestehen (klinische Gruppen A und B), bei denen jedoch postmortal
makroskopisch und/oder histologisch Lungenadenomatose nachgewiesen wurde. Zu
diesem Zweck wurden die Untersuchungsergebnisse der Lungenspülproben sowie
der Blut- und Gewebeproben klinisch LA-unverdächtiger Tiere der Kategorie I mit
denen der Kategorie II in der Tabelle 46 zusammengefasst.
170 ERGEBNISSE
Tabelle 46: Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von klinisch LA-unverdächtigen Tieren der Kategorien I und II
U3 LTR PCR + + +
hn PCR + + +
hn PCR + + -
hn PCR + - -
U3 LTR und hn PCR
- - - 11 2 1 3 5 BAL
n=22 positiv: 77,3 % negativ: 22,7%
- - - - 27 Blut
n=27 positiv: 0 % negativ: 100%
10 - 2 4 9 Ln. mediastinalis
caudalis n=25
positiv: 64 % negativ: 36%
Bei der Durchführung eines Dreifachansatzes beträgt die relative Sensitivität der
PCR-Untersuchung von Lungenspülproben klinisch LA-unverdächtiger Tiere
demnach 77,3 %. Eine Untersuchung im Doppelansatz reduziert die relative
Sensitivität auf 70,5%, im Einfachansatz auf 65,9 %.
4.7.2.5 histologisch fragliche Tiere (Kategorie III)
Die Untersuchungsergebnisse der Proben der histologisch fraglichen Tiere aus den
positiven Herden (Kategorie III) sind für die sieben Tiere dieser Kategorie in Tabelle
47 zusammengestellt. Bei zwei Tieren konnte das histologische Ergebnis mittels
PCR erhärtet werden. Es war jeweils jedoch nur eine der untersuchten Proben
positiv. Bei den übrigen Tieren verlief die PCR-Untersuchung aller vorhandenen
Proben negativ. Interessant ist ein Tier (Ohrmarke Nr. 1606), das zum Zeitpunkt der
Sektion mit einem Fetus (Scheitel-Steiß-Länge ca. 14 cm) tragend war. Unter sterilen
Kautelen entnommenes fetales Lungen- und Thymusgewebe wurde ebenfalls jeweils
im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Während die Untersuchung des
Lungengewebes ein negatives Ergebnis lieferte, war einer von drei Ansätzen bei der
Untersuchung des fetalen Thymus in der heminested PCR positiv. Bei der
ERGEBNISSE 171
Wiederholung im Sechsfachansatz war einer von sechs Ansätzen in der hn PCR
positiv. Sämtliche mitgeführten Negativkontrollen waren negativ. Eine erneute PCR-
Untersuchung im Sechsfachansatz nach einer erneuten DNA-Extraktion aus
asserviertem Thymusgewebe konnte das positive Ergebnis jedoch nicht
reproduzieren.
172 ERGEBNISSE
ERGEBNISSE 173
4.7.2.6 Untersuchung von Lämmern aus einer positiven Herde
A Übersicht
Eine Übersicht der 18 Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen im Jahr 2001
regelmäßige Blutprobenentnahmen erfolgten, ist in Tabelle 4 (Kapitel 3.3.1 C)
gegeben. Im neunten Lebensmonat wurden von 15 dieser Tiere Lungenspülproben
entnommen. Von 13 Lämmern konnten im Alter von zehn bis 15 Monaten
Schlachtbefunde und histologische Befunde erhoben werden.
B Ergebnis der PCR-Untersuchung der Lungenspülproben
Die Lungenspülproben der 13 Lämmer, von denen postmortale Lungenbefunde
erhoben werden konnten, wurden jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn
PCR untersucht. Die Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und
histologischen Untersuchung sowie der Untersuchung der BAL mittels PCR sind in
Tabelle 48 dargestellt.
174 ERGEBNISSE
Tabelle 48: Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Tütsberger Lämmer und molekularbiologische Untersucnung der Lungenspülproben Lamm Mutter Klinischer
Befund am 2.11.01
Lungenbefund (histologisch)
PCR BAL
377 klin. LA Gruppe B rechter und linker Spitzen- und Hauptlappen Bild wie
bei LA; solitäre Lymphknotenmetastase
U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +
371 unauffällig Gruppe A fraglich negativ
60 klin. LA Gruppe A negativ U3 LTR - - - hn + + +
363 unauffällig Gruppe B 1 Hauptlappenlokalisation makroskopisch und
histologisch Bild wie bei LA
U3 LTR - - - hn + + -
362 unauffällig Gruppe A negativ negativ
347 unauffällig Gruppe A negativ negativ
349 unauffällig Gruppe A negativ negativ
350 unauffällig Gruppe A negativ negativ
348 unauffällig Gruppe A negativ negativ
326 unauffällig Gruppe A negativ negativ
325 unauffällig Gruppe A negativ negativ
331 unauffällig Gruppe A negativ negativ
370 unauffällig Gruppe A negativ negativ
Gruppe A: klinisch ohne besonderen Befund; Gruppe B: respiratorische Symptome, jedoch klinisch keine konkreten Hinweise auf LA U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR; alle Untersuchungen im Dreifachansatz; +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+): alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
ERGEBNISSE 175
C Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blut- und Gewebeproben von vier ausgewählten Lämmern
Aufgrund der Ergebnisse der histologischen Untersuchung, der PCR-Untersuchung
der Lungenspülproben und des Vorberichtes (zum Teil klinisch an LA erkrankte
Muttertiere) wurden die vier Lämmer mit den Ohrmarken 377, 371, 60 und 363 zur
weiteren Untersuchung ausgewählt. Alle elf Blutproben dieser vier Lämmer wurden
jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR untersucht. Zusätzlich wurden
Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis sowie von zwei Lungenlokalisationen
ebenfalls im Dreifachansatz in der PCR untersucht. Die Ergebnisse dieser
Untersuchungen sind in Tabelle 49 dargestellt:
Tabelle 49: Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blutproben sowie Gewebe- und BAL-Proben von vier ausgewählten Lämmern Lamm
OM BAL Blutproben Ln. med.
caud. Lungengewebe
377 U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +
6. Entnahme (44. Lebenstag):
U3 LTR - - - hn + - -
übrige 10 Proben negativ
U3 LTR (+)(+)(+) hn + + +
U3 LTR + + +
371 negativ Zu allen 11 Entnahme-zeitpunkten:
negativ
negativ 2 Lokalisationennegativ
60 U3 LTR - - - hn + + +
Zu allen 11 Entnahme-zeitpunkten:
negativ
negativ 1 von 2 Lokalisationen U3 LTR - - -
hn + - - 363 U3 LTR - - -
hn + + - Zu allen 11 Entnahme-
zeitpunkten: negativ
U3 LTR - - - hn + - -
U3 LTR + + +
OM: Ohrmarke; U3 LTR: Ergebnis der U3 LTR PCR; hn: Ergebnis der hn PCR; alle Untersuchungen im Dreifachansatz; +++: alle drei Ansätze positiv; (+)(+)(+): alle drei Ansätze schwach positiv; ++-: zwei von drei Ansätzen positiv; +- -:einer von drei Ansätzen positiv; - - -: alle drei Ansätze negativ
176 ERGEBNISSE
4.8 Untersuchung von Tieren und Probenmaterial aus der Döhler Herde
4.8.1 Klinische Untersuchung der Döhler Herde
Zu keinem Zeitpunkt wurden bei Bestandsbesuchen im Rahmen der
Herdenbetreuung durch den Schaf- und Ziegengesundheitsdienst, bei zahlreichen
Probenentnahmeterminen oder durch den für respiratorische Erkrankungen stark
sensibilisierten Schäfer Hinweise auf klinische Lungenadenomatose-Erkrankungen
festgestellt. Andere respiratorische Erkrankungen traten im Untersuchungszeitraum
lediglich als Einzelfälle auf. Tiere, die Husten zeigten, wurden prinzipiell
baldmöglichst geschlachtet und ihre Lungen makroskopisch und histologisch
untersucht.
4.8.2 Sektionen verendeter Tiere
Die Befunde der neun im Untersuchungszeitraum natürlich verendeten Tiere sind in
Tabelle 50 dargestellt. Sie wurden routinemäßig durch Herrn Dr. Michael Brügmann
(Abteilung Pathologie des Instituts für Tiergesundheit der LUFA Nord-West)
untersucht. Bei allen Tieren wurde routinemäßig auch eine systematische
histologische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Makroskopische oder
histologische Hinweise auf Lungenadenomatose wurden bei keinem der
untersuchten Tiere festgestellt.
ERGEBNISSE 177
Tabelle 50: Sektionsbefunde verendeter Tiere > 6 Monate aus der Döhler Herde (Herbst 2000 bis Ende 2003) Todesjahr Alter Geschlecht klinischer Befund Sektionsbefund
2000 1,5 J w perakut verendet Myokardose ungeklärter Ursache
2001 6 Mon w im Elektrozaun hängend tot aufgefunden
histologisch mittelgradig alveoläre katarrhalisch-eitrige
Herdpneumonie (Mikrobiologie: mgr.
unspezifischer Keimgehalt) 2001 2 J w perakut verendet hgr. Cholangitis +
Pericholangitis eosinophilica ungeklärter Ursache
2002 2 J m Husten, nach kurzer Zeit trotz antibiotischer Behandlung
verendet
hgr. katatarrhalisch-eitrige Bronchopneumonie; keine
mikrobiologische Untersuchung
2002 3 J m Husten, nach kurzer Zeit trotz antibiotischer Behandlung
verendet
hgr. eitrig-nekrotisierende Bronchopneumonie;
Mikrobiologie: hgr. alpha-hämolys. Streptokokken, hgr. Arcanobacterium pyogenes,
mgr. unspezifischer Keimgehalt
2003 2 w Über Raufe gesprungen und
hängengeblieben, nach 24 h verendet
hgr. Muskeltrauma der Hintergliedmaßen,
Myoglobinurie
2003 2 w Zurückbleiben hinter der Herde, Festliegen; nach
24 h verendet
Fibrinopurulente Endometritis; Volvolus jejuni
2003 4 w perakut verendet Lunge o.b.B; Todesursache unklar
2003 1 J w perakut verendet Clostridium-perfringens- Enterotoxämie
o.b.B: ohne besonderen Befund; w: weiblich; m: männlich; J: Jahre; Mon: Monate; mgr.: mittelgradig; hgr.:hochgradig; hämolys.: hämolysierend
178 ERGEBNISSE
4.8.3 Untersuchung der Altböcke
Ende des Jahres 2002 wurden die von Herbst 2000 an in der Döhler Herde als
Deckböcke genutzten Altböcke aus züchterischen Gründen aus der Herde entfernt.
Zu diesem Zeitpunkt waren sie ca. acht Jahre alt. Beide Tiere waren klinisch gesund
und zeigten insbesondere keine Anhaltspunkte für das Vorliegen respiratorischer
Erkrankungen (klinische Gruppe A). Beide Tiere wurden nach Entnahme von Blut-
und Lungenspülproben euthanasiert. Es bestanden bei beiden Tieren weder
pathomorphologisch noch histologisch Anhaltspunkte für das Vorliegen einer
Lungenadenomatose.
Die vor der Euthanasie gewonnenen Lungenspülproben wurden ebenso wie
Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis und zweier Lungenlokalisationen
jeweils im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Diese Untersuchungen verliefen
für alle genannten Proben negativ. Auch im Sommer 2002 waren im Rahmen der
Herdenuntersuchung von diesen Tieren Lungenspülproben entnommen worden.
Diese Proben waren in dreifacher PCR-Untersuchung ebenfalls negativ.
4.8.4. Untersuchung der Schlachtlungen
4.8.4.1 Makroskopische Untersuchung
Bei keiner der 299 untersuchten Schlachtlungen bestand makroskopisch der
Verdacht auf Lungenadenomatose. Häufige Befunde waren solitäre,
stecknadelkopfgroße, vermutlich parasitär bedingte Granulome (n = 45), fokale,
sublobulär begrenzte oder straßenförmige Atelektasen (n = 33) und fleckige
Rötungen aufgrund agonal bedingter Blutaspiration (n = 61). Bei 15 der untersuchten
Lungen (5,0%) bestand makroskopisch der Verdacht auf pneumoniebedingte
Veränderungen. Eine mikrobiologische Untersuchung wurde lediglich in zwei Fällen
durchgeführt. Als pathogene Keime wurden alpha-hämolysierende Streptokokken
ERGEBNISSE 179
und in einem Fall Mannheimia haemolytica nachgewiesen. Corynebacterium
pseudotuberculosis oder Pseudotuberkulose-verdächtige Läsionen wurden nicht
nachgewiesen.
4.8.4.2 Systematische Histologie
Von insgesamt 169 Schlachttieren (56,5% der im Untersuchungszeitraum
geschlachteten Tiere) wurden mindestens vier definierte Lungenlokalisationen sowie
der Lymphonodus mediastinalis caudalis histologisch untersucht. Sofern an anderen
Lokalisationen makroskopische Veränderungen bestanden, wurden hiervon
Zusatzproben genommen. Alle elf in der Zeit vom Frühjahr 2001 bis Ende 2003
geschlachteten Alttiere sind in dieser Untersuchungsgruppe enthalten. Von diesen
Tieren waren drei jeweils knapp fünf Jahre alt, zwei Tiere waren vier Jahre, vier
waren drei Jahre und zwei Tiere zwei Jahre alt. Bei den übrigen Tieren handelte es
sich um Schlachtlämmer im Alter von neun bis 14 Monaten.
Bei einem im Frühjahr 2001 geschlachteten, ca. 13 Monate alten mutterlos
aufgezogenen Lamm des Geburtsjahrganges 2000 wurde histologisch in einer der
vier untersuchten Lokalisationen die Diagnose Lungenadenomatose gestellt. Bei
einem weiteren gleichaltrigen Tier bestand in einer Hauptlappenlokalisation fokal
eine mittelgradige Proliferation von Bronchialepithel mit dem Verdacht auf maligne
Transformation. Lungenadenomatose konnte histologisch weder bestätigt noch
ausgeschlossen werden. Die Untersuchungsergebnisse dieser beiden Tiere sind
bereits in die Arbeit von KRÄMER (2001) eingeflossen.
Eine weitere histologisch fragliche Diagnose wurde bei einem im Alter von ca.
viereinhalb Jahren geschlachteten Alttier des Geburtsjahrganges 1999 gestellt. Hier
wurde in einer Spitzenlappenlokalisation eine umschriebene Atelektase infolge
geringgradiger subakuter katarrhalisch-eitriger Herdpneumonie diagnostiziert.
Innerhalb dieser Lokalisation fand sich fokal geringgradig hyperplastisches Epithel
des bronchioloalveolären Überganges. Lungenadenomatose konnte histologisch
180 ERGEBNISSE
weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Bei den übrigen 166 untersuchten
Tieren bestanden histologisch keine Anhaltspunkte für das Vorliegen einer
Lungenadenomatose. Die detaillierte makroskopische und histologische Beurteilung
der Lungen der drei oben genannten Tiere ist in Tabelle 51 zusammengefasst.
Tabelle 51: makroskopische und histologische Untersuchungsergebnisse von Tieren mit histologischem Verdacht auf bzw. histologisch nachgewiesener LA aus der Döhler Herde Schlacht- nummer
Alter makroskopisch histologisch
119 13 Mon mgr. bis hgr. punktförmige bis flächenhafte Blutungen.
Dorsal am rechten Hauptlappen ca. 5 mm im
Durchmesser großer, farblich nicht abgegrenzter, ggr.
verfestigter Bereich
Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: hgr.
intrabronchioläre und –alveoläre Blutaspiration; rechter und linker
Hauptlappen: in einer Lokalisation Bild wie bei
Lungenadenomatose 121 13 Mon ggr. bis mgr. punktförmige bis
flächenhafte Blutungen Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: o.b.B; rechter und linker Hauptlappen: fokal
mgr. Proliferation von Bronchialepithel, Verdacht auf
maligne Transformation 1865 4,5 J dorsal in beiden Hauptlappen
ca. 0,5 – 1 cm große, blaurötliche Verfärbungen
Ln.: o.b.B; rechter und linker Spitzenlappen: in einer
Lokalisation umschriebene Atelektase infolge
geringgradiger katarrhalisch-eitriger subakuter
Herdpneumonie, innerhalb dieser Lokalisation fokal
geringgradig hyperplastisches Epithel des bronchioloalveolären
Überganges; histologisch keine eindeutigen
Anhaltspunkte für das Vorliegen einer Lungen-
adenomatose; rechter und linker Hauptlappen: o.b.B
Mon: Monate; J: Jahre; ggr.: geringgradig; mgr.: mittelgradig; hgr.: hochgradig; o.b.B.: ohne besonderen Befund
ERGEBNISSE 181
4.8.4.3 Untersuchung der Lungenlymphknoten mittels PCR
Gewebeproben des Lymphonodus mediastinalis caudalis der 105 im Zeitraum vom
Frühjahr 2001 bis Frühjahr 2002 geschlachteten Tiere (104 Lämmer der
Geburtsjahrgänge 2000 und 2001 sowie ein ca. dreijähriger Bock) wurden jeweils im
Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR auf JSRV untersucht. Bei dem Tier Nr.
119 mit histologisch nachgewiesener Lungenadenomatose konnte diese Diagnose
bestätigt werden. In zwei von drei untersuchten Ansätzen konnten mittels hn PCR
JSRV-spezifische Genomfragmente nachgewiesen werden. Bei allen anderen
untersuchten Tieren (einschließlich des histologisch fraglichen Tieres Nr. 121) verlief
die PCR-Untersuchung negativ. Von dem im Herbst 2003 geschlachteten Tier Nr.
1865 stand kein frisches Gewebe für die PCR-Untersuchung zur Verfügung.
4.8.4.4 Weiterführende Untersuchungen bei den drei Tieren mit histo-logisch fraglichem bzw. positivem Ergebnis
An formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe dieser drei Tiere wurde
durch Prof. Dr. M. de las Heras (Abteilung Pathologie der veterinärmedizinischen
Fakultät der Universität Zaragoza) freundlicherweise eine immunhistochemische
Untersuchung durchgeführt. Zusätzlich wurde von den Tieren Nr. 119 und 121
Lungengewebe von zwei Lokalisationen sowie der Ln. mediastinalis caudalis jeweils
im Dreifachansatz mittels PCR untersucht. Von dem Tier mit der Nummer 1865 stand
kein frisches Lungengewebe für die PCR zur Verfügung, jedoch wurden von diesem
Tier die Lungenspülproben aus dem Jahr 2002 routinemäßig im Dreifachansatz und
aus dem Jahr 2003 insgesamt achtmal untersucht. Von diesem Tier wurden zudem
aus dem asservierten formalinfixierten Lungengewebe sechs weitere Lokalisationen
in der HE-Färbung histologisch beurteilt.
Die Ergebnisse dieser weiterführenden Untersuchungen sind in Tabelle 52
zusammengefasst:
182 ERGEBNISSE
Tabelle 52: Weiterführende Untersuchungen bei Tieren mit positivem oder fraglichem histologischem Ergebnis
Tier-nummer
Immunhistochemie1 PCR Ln. med.
caud.
PCR Lungen-gewebe
PCR BAL
Weitere Histologie
(HE) 119 positiv positiv
(hn + + -)in 2 Lokali-sationen negativ
- -
121 negativ negativ in 2 Lokali-sationen negativ
- -
1865 einzelne sehr schwach angefärbte
Zellen; fraglich
- - 2002: 3x negativ
2003: 8x negativ
In 6 Lokali-sationen negativ
1 M. DE LAS HERAS (2001, 2004; pers. Mitteilung)
4.8.5 Untersuchung des Muttertieres des Lammes mit bestätigter Lungen-adenomatose
Aufgrund der Führung der Schneverdinger und der Döhler Herde als
Herdbuchbetrieb war die Abstammung des Lammes Nr. 119 eindeutig
nachvollziehbar. Das Muttertier wurde im Rahmen der Auflösung der Schneverdinger
Herde im Frühjahr 2001 an der Klinik für kleine Klauentiere klinisch untersucht,
anschließend euthanasiert und am Institut für Pathologie seziert und Gewebeproben
für die histologische Untersuchung gewonnen. Für die PCR-Untersuchung standen
von diesem Tier Lungenspülprobe, Blutprobe, Lymphonodus mediastinalis caudalis
sowie Gewebe von zwei Lungenlokalisationen zur Verfügung.
Zum Zeitpunkt der beschriebenen Untersuchungen war das Muttertier sieben Jahre
alt. Es zeigte klinisch keinerlei Hinweise auf eine respiratorische Erkrankung
(Einordnung in die klinische Gruppe A) oder Erkrankungen anderer Organsysteme.
Makroskopisch war die Lunge ohne besonderen Befund, und in den vier histologisch
untersuchten Lokalisationen bestanden keinerlei Hinweise auf das Vorliegen einer
Lungenadenomatose oder anderer respiratorischer Erkrankungen. Die jeweils
ERGEBNISSE 183
dreimalige Untersuchung des Lymphonodus mediastinalis caudalis, zweier
Lungenlokalisationen, der Lungenspül- und der Blutprobe mittels U3 LTR und hn
PCR verlief für alle Proben negativ.
4.8.6 Untersuchung der Lungenspülproben
Die im Sommer 2001 entnommenen Lungenspülproben wurden zugunsten der zu
späteren Zeitpunkten entnommenen Proben nicht weiter untersucht.
Von den 119 entnommenen Proben aus dem Jahr 2002 waren 110 für die
Untersuchung mittels PCR geeignet. Aus neun Proben war aufgrund schlechter
Probenqualität (zu geringe Rückgewinnungsmenge / zu geringer Zellgehalt) die
gewonnene DNA-Konzentration für eine PCR-Untersuchung zu gering. Zum
Zeitpunkt der Probenentnahme waren die Tiere drei bzw. zwei Jahre alt. Alle 110
Proben wurden jeweils im Dreifachansatz mittels U3 LTR und hn PCR untersucht.
Bei diesen Untersuchungen konnten aus keiner Probe JSRV-spezifische
Genomfragmente nachgewiesen werden.
Im Sommer 2003 wurden durch Frau Sandra Stamm und Herrn Klaus Schlotter
(Klinik für kleine Klauentiere) von 393 Tieren Lungenspülproben gewonnen. Die Tiere
waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme vier, drei und zwei Jahre alt. Bei 40
Tieren wurde die Probenentnahme aufgrund schlechter Probenqualität wiederholt.
Insgesamt standen danach von 378 Tieren jeweils eine geeignete Probe für die
PCR-Untersuchung zur Verfügung. Die Bearbeitung und Untersuchung der Proben
erfolgte unter Anleitung der Autorin durch Frau Sabine Uhlenbruck, Klinik für kleine
Klauentiere. Jede Probe wurde jeweils im Doppelansatz mittels U3 LTR und hn PCR
untersucht. Bei diesen Untersuchungen konnten aus keiner Probe JSRV-spezifische
Genomfragmente nachgewiesen werden.
Insgesamt wurden im Sommer 2002 92,4%, im Sommer 2003 96,2% aller zum
Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre alten Tiere
untersucht.
184 ERGEBNISSE
DISKUSSION 185
5. DISKUSSION
5.1 Lungenadenomatose bei Heidschnucken
5.1.1 Altersverteilung und Disposition
Berichte von einer vergleichsweise frühen Erkrankung der Heidschnucken an
Lungenadenomatose (GANTER 2000; KOOPMANN 2000, pers. Mitteilungen)
konnten durch diese Untersuchungen bestätigt werden. Klinische Erkrankungen und
LA-typische Läsionen wurden zwar in allen Altersgruppen bis in das hohe Alter von
zehn Jahren beobachtet, es bestand jedoch eine deutliche Häufung bei um ein Jahr
alten Tieren. 61,7% der klinischen Erkrankungen bzw. 50,6% der nachgewiesenen
Läsionen traten bei Tieren auf, die zwei Jahre oder jünger waren. Lämmer unter
einem Jahr machten 10,6% der klinischen Erkrankungsfälle bzw. 15,2% der Fälle mit
LA-typischen Läsionen aus. Der Median lag in der Gruppe der klinisch erkrankten
Tiere bei einem Jahr, in der Gruppe der Tiere mit LA-typischen Läsionen aller
Stadien bei zwei Jahren. Demgegenüber werden klinische Erkrankungen bei
Lämmern in der Literatur als Seltenheit beschrieben (HUNTER und MUNRO 1983;
SHARP und DE LAS HERAS 2000). Aus verschiedenen geographischen Regionen
wird eine Häufung der klinischen Erkrankungen bei drei bis vier Jahre alten Tieren
beobachtet (MITCHELL 1915; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und DE LAS
HERAS 2000).
Dieses frühe Auftreten und die hohen durchschnittlichen jährlichen Verluste von 4%
bis 15% der Zuchttiere (KOOPMANN 2000, pers. Mitteilung; KRÄMER 2001) in den
Herden des VNP, gepaart mit den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchungen,
dem Nachweis von Lungenadenomatose-typischen Läsionen bei 17,3% der
Schlachtlämmer und 28,3% der untersuchten Tiere aus der Schneverdinger Herde,
lassen eine besondere Empfänglichkeit der Heidschnucken gegenüber dieser
186 DISKUSSION
Erkrankung vermuten. Eine vermehrte Empfänglichkeit bestimmter Rassen oder
Zuchtlinien ist in der Literatur wiederholt beschrieben (DUNGAL et al. 1938; DE
KOCK 1958; TUSTIN 1969; HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und ANGUS
1990), so dass eine genetische Disposition bzw. verminderte Resistenz dieser Rasse
denkbar ist. Die Verwandtschaft der Heidschnucken zu den isländischen Schafen,
die ebenfalls zu den kurzschwänzigen, behornten nordischen Heideschafen gehören
(OLAFSSON 1939), kann ebenfalls als ein Hinweis auf eine mögliche genetische
Disposition gewertet werden. Auch in Island traten in einem Ausmaß Verluste auf,
die aus anderen Regionen bislang unbekannt waren (DUNGAL et al. 1938).
Auch die traditionellen Haltungsbedingungen der Heidschnucken mit regelmäßiger
nächtlicher Aufstallung während des ganzen Jahres sowie mehrwöchiger
kontinuierlicher Stallhaltung in der Lammzeit in schlecht belüfteten Ställen, die
insbesondere in lämmerführenden Herden eine beträchtliche Besatzdichte erreichen
können, tragen sicherlich zu dem verlustreichen Verlauf der Erkrankung bei dieser
Rasse bei. DUNGAL et al. (1938), MARKSON und TERLECKI (1964), sowie
MACKAY und NISBET (1966) haben auf einen Einfluß derartiger
Haltungsbedingungen auf die Ausbreitung der Erkrankung in infizierten Herden
hingewiesen.
5.1.2 Atypische Lungenadenomatose
In allen untersuchten Fällen entsprachen die Läsionen dem Bild der sogenannten
klassischen Lungenadenomatose (siehe 2.1.3.1). Die Läsionen der atypischen
Lungenadenomatose sind in der Literatur aus Südamerika, Deutschland und Spanien
beschrieben (CUBA CAPARO et al. 1961; SCHULZ et al. 1965; GARCIA-GOTI et al.
2000). Beide Formen können in derselben Herde vorkommen, und Unterschiede in
den beteiligten Virusisolaten wurden nicht gefunden (DE LAS HERAS et al. 2003).
Ob das Vorkommen der atypischen Läsionen mit dem zeitgleichen Vorkommen
anderer Erkrankungen, z.B. der Maedi-Visna-Virusinfektion korreliert ist, ist nicht
DISKUSSION 187
untersucht. Der hohe Durchseuchungsgrad spanischer Schafherden mit Maedi-Visna
(GONZALEZ et al. 1993), gepaart mit der häufigen Beobachtung atypischer Läsionen
in diesem Land (GARCIA-GOTI et al. 2000) sowie fehlende Beobachtungen
atypischer Läsionen aus Schottland (HUNTER und MUNRO 1983; SHARP und
ANGUS 1990), wo Maedi kaum eine Rolle spielt, lassen einen Zusammenhang
möglich erscheinen. Die Herdbuchzuchten der Grauen gehörnten Heidschnucken
sind nach derzeitigem Kenntnisstand frei von Maedi-Visna (GANTER 2004,
persönliche Mitteilung).
5.1.3 Metastasen und andere Tumorerkrankungen
Bei vier der 79 untersuchten Tiere mit makroskopischen und/oder histologischen
Läsionen von Lungenadenomatose wurde eine Metastasierung festgestellt. Dies
entspricht einem Prozentsatz von 5,1% und liegt im Rahmen dessen, was in der
Literatur genannt wird (GEISEL und BOMHARD 1977). Es muß jedoch darauf
hingewiesen werden, dass eine gezielte Untersuchung auf Metastasen nicht
durchgeführt wurde. Es wurde routinemäßig lediglich ein Gewebeschnitt des
Lymphonodus mediastinalis caudalis angefertigt. Es ist möglich, dass bei
Untersuchung mehrerer Schnittebenen und weiterer regionärer Lymphknoten
zusätzliche Fälle von Metastasen gefunden worden wären.
In einem weiteren Fall wurden in der Lunge Metastasen eines Dünndarmkarzinoms
festgestellt. Das makroskopische Bild dieser sekundären Lungentumoren war
deutlich verschieden von dem der klassischen Lungenadenomatose. Sie zeigten sich
als weißlich-derbe, multifokale, bis zu 5 mm im Durchmesser messende
Herdveränderungen, die histologisch einem infiltrativ wachsenden Adenokarzinom
entsprachen. Weitere Metastasen befanden sich in Leber, Pleura und Peritoneum.
Eine Verwechslung solcher Veränderungen mit dem Bild der atypischen
Lungenadenomatose ist insbesondere im Falle des Übersehens des Primärtumors
möglich. Das Dünndarmkarzinom der Schafe wird von ROSS und WILLIAMS (1983)
als eine ebenfalls häufige Tumorerkrankung der Schafe beschrieben.
188 DISKUSSION
5.2 Untersuchungsverfahren
5.2.1 Eignung der klinischen Untersuchung zur Diagnose der LA
Schwierigkeiten bei der klinischen Untersuchung des Atemtraktes des Schafes
entstehen dadurch, dass die Atemfrequenz sehr stark durch äußere Einflüsse
variiert. Neben der Temperatur und Bewollung spielen auch Stressfaktoren wie das
Betreten des Stalles durch Personen (YOUSSEF 1986) eine Rolle. Gerade die in
großen Herden in Hütehaltung gehaltenen Heidschnucken sind den direkten Umgang
mit Menschen wenig gewöhnt und durch das zur Untersuchung notwendige Handling
starken Stressfaktoren ausgesetzt. Durch eine Intensivierung der Atmung wird auch
die Intensität der auskultierbaren Atemgeräusche erhöht (STÖBER 1990b), so dass
eine klinische Unterscheidung zwischen einer derartigen Beeinflussung und
dezenten Veränderungen bei subklinischen Lungenerkrankungen schwer möglich ist.
Bei Tieren, die lediglich aufgrund subjektiv geringgradig verschärfter Atemgeräusche
in die klinische Gruppe B eingeordnet wurden, kam es daher zu Fehleinschätzungen.
23,6 % der Tiere der Gruppe B wiesen weder pathomorphologisch nach histologisch
nachweisbare Lungenveränderungen auf. In gleicher Weise sind Fehleinschätzungen
bei den klinisch als gesund eingeordneten Tieren vorgekommen. In dieser Gruppe
wiesen 40,6% geringgradige pneumonische Veränderungen und 9,4 % histologisch
nachweisbare Läsionen einer beginnenden Lungenadenomatose auf, die klinisch
trotz eingehender Untersuchung nicht nachweisbar waren. Makroskopisch
erkennbare Tumoren und mittel- oder hochgradige pneumonische Veränderungen
wurden in dieser Gruppe nicht nachgewiesen.
In fortgeschrittenen Erkrankungsfällen der Lungenadenomatose wird die
diagnostische Sicherheit der klinischen Untersuchung deutlich besser. Bei allen zwölf
Tieren, bei denen aufgrund des Vorhandenseins diskontinuierlicher Nebengeräusche
trotz des fehlenden pathognomonischen Symptoms des Nasenausflusses
(Schubkarrentest negativ) der klinische Verdacht auf Lungenadenomatose geäußert
wurde, wurde dieser Verdacht pathologisch-anatomisch und histologisch bestätigt.
DISKUSSION 189
5.2.2 Blutproben
Der Nachweis von JSRV in weißen Blutzellen klinisch erkrankter Tiere, gesunder
Kontakttiere sowie in der Inkubationszeit einer experimentellen Infektion durch
verschiedene Autoren (PALMARINI et al. 1996b; HOLLAND et al. 1999; DE LAS
HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al. 2001) ließ die Hoffnung auf ein praktikables
Verfahren zur Frühdiagnose der Lungenadenomatose durch eine Untersuchung von
Blutproben mittels PCR aufkommen. Die Lösung des Problems, wie eine in
Sanierung befindliche Herde auf ein mögliches Vorkommen von
Lungenadenomatose überprüft werden könnte ohne sie komplett zu schlachten, wie
dies von PARKER et al. (1998) praktiziert wurde, schien in greifbare Nähe gerückt.
Untersuchungen an größeren Tierzahlen bezüglich einer Eignung der
Blutuntersuchung mittels PCR als Diagnostikum lagen nicht vor. Nach den
Erfahrungen von DEWAR und SHARP (2000, pers. Mitteilung) war jedoch bei
Lungenadenomatose-erkrankten Schafen nahezu immer mit einem positiven PCR-
Befund der Blutprobe zu rechnen.
Nachdem erste eigene Untersuchungen an Blutproben klinisch an
Lungenadenomatose erkrankter Heidschnucken in der Mehrzahl der Fälle ein
negatives Ergebnis lieferten, wurde neben der Abklärung möglicherweise falsch-
negativer Resultate der Blutprobenuntersuchung (siehe 3.9 und 4.6) dazu
übergegangen, parallel die diagnostische Eignung einer weiteren intravital zu
gewinnenden Probenart zu untersuchen.
5.2.3 BAL nach endotrachealer Intubation
Aufgrund der Tatsachen, dass sich in dem Lungensekret erkrankter Tiere große
Virusmengen (SHARP und DE LAS HERAS 2000) sowie Tumorzellen (NOBEL et al.
1970; VERWOERD und DE VILLIERS 1980; GANTER 1996; KIRAN et al. 2000)
befinden und dass in den Untersuchungen von SANNA et al. (2001) auch die
Alveolarmakrophagen deutlich JSRV-positiv waren, erschien eine intravital
190 DISKUSSION
entnommene Lungenspülprobe das ideale Probenmaterial. Die wesentlich einfachere
Entnahme von Nasentupfern wurde nicht näher in Betracht gezogen, da sie durch
ihre Entfernung vom Ort der Läsionen eine deutlich geringere Sensitivität bei Tieren
vermuten ließ, die noch keinen exzessiven Nasenausfluß aufwiesen. Intravital
gewonnene Lungenspülproben wurden auch von anderen Autoren z.B. bei Kälbern
für einen Virusnachweis mittels PCR genutzt (VALARCHER et al. 1999).
Das Verfahren der transtrachealen Aspiration unter Lokalanästhesie (WORKU 1994)
erwies sich zur Gewinnung von Lungenspülproben in eigenen Untersuchungen durch
das Auftreten von Blutungen als nicht praktikabel. WORKU (1994) selbst beschreibt
sehr schlechte Rückgewinnungsraten, und der invasive Charakter wurde als ein
weiterer großer Nachteil der Methode (auch hinsichtlich der Akzeptanz bei den
Schäfern) angesehen. Die direkte Übertragung eines für das Kalb beschriebenen
Verfahrens (FOGARTY et al. 1983; CALDOW 2001), in dem eine Intubation über den
ventralen Nasengang erfolgt und eine Lungenspülung über einen durch diesen
Tubus in die Lunge vorgeschobenen Schlauch möglich ist, war nach eigenen
Versuchen auf das Schaf nicht möglich, da auch bei Überstrecken des Kopfes der
über die Nase eingeführte äußere Schlauch regelmäßig abgeschluckt wurde. Die
bronchoskopische Entnahme wurde aus Praktikabilitätsgründen wegen der zu
untersuchenden großen Tierzahl sowie aufgrund der Gefahr der Kreuzkontamination
bei der Probenentnahme für diesen Untersuchungszweck als ungeeignet erachtet.
Praktikabilität und Probleme der BAL nach endotrachealer Intubation
Gegenüber der fiberoptischen Entnahme von Lungenspülungen bietet die hier
entwickelte Technik den Vorteil, dass sie problemlos in Beständen auch für eine
größere Tierzahl anwendbar ist. Die überwiegende Verwendung von
Einwegmaterialien ermöglicht den Ausschluß von Kreuzkontaminationen bei der
Probenentnahme. Die vergleichsweise niedrigen Anschaffungskosten und sehr
geringen Kosten für Verbrauchsmaterialien sind weitere Vorteile gegenüber der
DISKUSSION 191
Nutzung eines Bronchoskops. Das Rückgewinnungsvolumen von durchschnittlich
45% ist zufriedenstellend, liegt jedoch deutlich unter dem von durchschnittlich 71,8%
bei der fiberoptischen Entnahme (GANTER 1996). Aus 94,5% der von der Autorin
gewonnenen Lungenspülproben konnte eine für den Untersuchungszweck
ausreichende DNA-Konzentration mit einem durchschnittlichen Reinheitswert
(OD260/OD280) von 1,95 gewonnen werden.
Das Risiko ist trotz der Notwendigkeit einer medikamentellen Immobilisation sehr
gering. Bei einer Gesamtzahl von 760 im Rahmen dieser Untersuchungen von der
Autorin und anderen Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere entnommenen
Lungenspülproben traten zwei Todesfälle auf (0,26%). Eines dieser Tiere war
hochgradig an Lungenadenomatose erkrankt und wies daher ein deutlich erhöhtes
Narkoserisiko auf. Ein weiteres klinisch gesundes Tier starb an einer
Aspirationspneumonie, nachdem es während der Probenentnahme zu heftigem
Regurgitieren gekommen war.
Husten war zum Zeitpunkt der Entnahme und kurz darauf ein häufig beobachtetes
Symptom, das jedoch nach spätestens einer Stunde bei den Tieren nicht mehr
beobachtet wurde. Anhaltende Symptome als Hinweis einer respiratorischen
Erkrankung oder eine Verschlechterung des Allgemeinbefindens bei bereits
erkrankten Tieren wurde in keinem weiteren Fall beobachtet. Auffallend ist jedoch bei
11,96% der Proben eine Beimengung von kleinsten Futterpartikeln sowie bei 6,20%
der zeitnah nach der Entnahme der Spülprobe getöteten und untersuchten Tiere eine
fokale Aspiration von Pflanzenmaterial. Obwohl eine schwerwiegende
Aspirationspneumonie nur in 0,13% der Fälle auftrat, ist dies als ein Nachteil der
Methode anzusehen, da neben einer Gefährdung der Probanden auch die Qualität
der Proben und damit ihre Verwendbarkeit für andere Fragestellungen leidet. Ein
mikrobiologischer Nachweis aus einer futterverunreinigten Probe ist zum Beispiel
wenig sinnvoll. FOGARTY et al. (1983) ließen die Kälber vor Entnahme von
Lungenspülproben acht Stunden hungern. Eine Phase der Nahrungskarenz erscheint
daher auch für die hier beschriebene Methode bei Schafen sinnvoll. Ein für andere
192 DISKUSSION
Eingriffe üblicher Zeitraum bei erwachsenen Schafen ist eine Nahrungskarenz von
etwa 24 Stunden (GANTER 2004, pers. Mitteilung). Dies wird in praxi insbesondere
bei Weidehaltung größerer Bestände jedoch sicher nicht immer einzuhalten sein.
5.3 Molekularbiologische Untersuchungen
5.3.1 Vor- und Nachteile des Nachweises proviraler DNA gegenüber dem RNA-Nachweis mit RT-PCR
Die Eigenschaft der Retroviren, ihre virale RNA mithilfe des viruseigenen Enzyms
reverse Transkriptase in DNA umzuschreiben und als provirale Sequenz in das
Wirtszellgenom zu integrieren (VOGT 1997), ermöglicht es, einen Nachweis aus
genomischer DNA zu führen. Während PALMARINI et al. (1996b) aus Leukozyten
lediglich JSRV-RNA nachweisen konnten, gelang HOLLAND et al. (1999) auch der
Nachweis proviraler DNA in weißen Blutzellen. Alle weiteren in der Literatur
beschriebenen Untersuchungen (DE LAS HERAS et al. 2000; GONZALEZ et al.
2001; SANNA et al. 2001) wurden ebenfalls auf der Basis des Nachweises proviraler
DNA geführt. Dem Vorteil einer möglicherweise größeren Anzahl an RNA-
Zielmolekülen in einer JSRV-exprimierenden Zelle stehen die Nachteile einer für den
RNA-Nachweis benötigten RT-PCR gegenüber. Hierzu ist es nötig, die aus dem
Probenmaterial isolierte RNA in vitro mithilfe einer reversen Transkriptase in cDNA
(copy-DNA) umzuschreiben (GASSEN et al. 1994). Dieser zusätzliche Arbeitsschritt
führt zu einer Erhöhung des Aufwandes und damit der Kosten einer Untersuchung.
Jeder zusätzliche Schritt birgt zudem ein zusätzliches Risiko der Kontamination.
Nach einer Literaturübersicht bei SCHEIBNER (2000) liegt die Effizienz der reversen
Transkription zwischen 10 und 90%, so dass mit diesem Schritt unter Umständen ein
erheblicher Sensitivitätsverlust einhergehen kann. Durch die besondere Anfälligkeit
der RNA erfordert die Laborarbeit zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen (SCHEIBNER
2000).
DISKUSSION 193
5.3.2 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-negativer Resultate und Bestimmung der Nachweisgrenze
Aus klinischen Proben und insbesondere aus Blutproben sind verschiedene Stoffe
beschrieben, die eine PCR-Reaktion vollständig hemmen oder ihre Nachweisgrenze
negativ beeinflussen können (ABU AL-SOUD und RADSTÖM 2001; HOLODNIY et
al. 1991; WILSON 1997). Die mögliche Anwesenheit solcher inhibitorischer
Substanzen wurde durch eine erfolgreiche Amplifikation einer Sequenz des GAPDH-
Gens aus allen in der hn PCR negativen Proben ausgeschlossen. Da diese
Zielsequenz jedoch in jeder Zelle ubiquitär ist, werden durch den Nachweis eines
solchen housekeeping-Gens Sensitivitätsprobleme beim Nachweis geringer Mengen
der Zielsequenz nicht detektiert. Durch eine exemplarische Untersuchung mit
Plasmid versetzter Proben konnte eine die Nachweisgrenze der heminested PCR
von zwei bis zehn Plasmidmolekülen beeinflussende Hemmung für die 20
untersuchten Blutproben ausgeschlossen werden. Für die Gewebe- und
Lungenspülproben wurde eine geringgradige Sensitivitätsminderung beobachtet, die
nur noch in 96,6 bzw. 94,1% der Fälle im Einfachansatz eine Detektion von zwei bis
zehn Plasmidmolekülen vor dem Hintergrund von 800 – 1000 ng genomischer DNA
ermöglichte. Eine deutliche Hemmung wurde jedoch für die U3 LTR PCR für alle
Probenarten beobachtet, die durch eine Nachuntersuchung in der hn PCR für den
Nachweis von 230 – 1000 Plasmidmolekülen zu 100%, für den Nachweis von 2 bis
10 Plasmidmolekülen zu durchschnittlich 96,7% ausgeglichen wurde. Die
Durchführung der hn PCR ist zum Ausschluß falsch-negativer Resultate daher
unbedingt erforderlich.
Nach SCHEIBNER (2000) wird die Nachweisgrenze eines PCR-Systems auch durch
die Methode der Probenaufbereitung beeinflusst. Für diese Arbeit wurden die
gleichen Probenbearbeitungs- und DNA-Isolationsverfahren wie im Labor des
Moredun Research Institute (MRI) angewendet. Dennoch beobachten die dortigen
Mitarbeiter bei der Untersuchung schottischer Proben einen deutlich höheren Anteil
PCR-positiver Blutproben (DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung). Um
194 DISKUSSION
laborinterne Variablen auszuschließen, wurden Proben der untersuchten
Heidschnucken sowohl durch das Personal des MRI als auch durch die Autorin
selbst mit unverändertem Ergebnis unter den Bedingungen des MRI nachuntersucht.
Ein alternatives Verfahren der DNA-Extraktion aus Vollblut wurde getestet und für
ungeeignet befunden.
Auch die Nachweisgrenze des Detektionssystems für die PCR-Produkte hat einen
Einfluß auf die Gesamtsensitivität der Untersuchung. Die Southern Blot-
Hybridisierung gilt hier als die sensitivste Methode für den Nachweis von PCR-
Produkten (BELAK und BALLAGI-PORDANY 1993). Selbst mit dieser sensitiven
Methode wurde bei einer Auswahl negativer Blutproben von klinisch erkrankten
Tieren das negative Ergebnis der Agarosegelelektrophorese bestätigt.
Die Nachweisgrenze des Gesamtsystems bestehend aus Buffy-Coat-Isolation, DNA-
Extraktion und PCR-Untersuchung wurde am Modell künstlich mit JSRV-positiven
Zellen (JS7-Zellen, DE MARTINI et al. 2001) versetzter Rinderblutproben bestimmt.
Für einen sicheren Nachweis von JSRV im Einfachansatz liegt sie bei dem Verhältnis
1:12.000 von JS7-Zellen zu Rinderleukozyten, für die heminested PCR bei 1:40.000.
Bei einer Untersuchung im Dreifachansatz ist bis zu einem Verhältnis von 1:80.000
mit einem positiven Ergebnis (d.h. mindestens 1 von 3 Ansätzen positiv) der
heminested PCR zu rechnen.
Die für jeden Reaktionsansatz mitgeführten Grenzwert-Positivkontrollen
(Plasmidverdünnungen vor dem Hintergrund von Wasser) erwiesen sich zur
Detektion von Sensitivitätsproblemen der PCR als adäquat. Während bei Einsatz
einer neuen Charge des zunächst verwendeten Nukleotidgemisches der Fa. Roth
(RotiMixR PCR 3, Roth, Karlsruhe) die klinische Positivprobe weiterhin ein deutlich
positives Signal in der U3 LTR PCR zeigte, entfielen die stets zu erwartenden
schwachen Banden der Plasmidverdünnungsstufen 10-9 und 10-11. Das Problem
konnte auf die neu eingesetzte Charge zurückgeführt und durch einen Wechsel des
Lieferanten eliminiert werden.
DISKUSSION 195
5.3.3 Untersuchungen zum Ausschluß falsch-positiver Resultate
Bei jeder DNA-Extraktion wurde eine bekannt negative Probe mit präpariert. Zudem
wurden je eine Wasser-Negativkontrolle bei der Vorbereitung des
Reaktionsgemisches sowie zum Zeitpunkt der Zugabe der Proben-DNA angesetzt.
Bei Durchführung einer heminested PCR wurden diese drei Negativkontrollen wie
alle anderen Proben nachuntersucht. Zusätzlich wurden zwei weitere neue
Negativkontrollen angesetzt. Während der eigenen Untersuchungen trat in keinem
Fall ein positives PCR-Ergebnis aus einer der Negativkontrollen auf. Durch die
Untersuchung im Dreifachansatz konnte eine mögliche sporadische Kontamination
ebenfalls weitgehend ausgeschlossen werden. Mit hundertprozentiger Sicherheit ist
bei Proben mit sehr geringem Virusgehalt, bei denen nur einer der drei Ansätze ein
positives Ergebnis liefert, eine Unterscheidung zwischen einer sporadischen
Kontamination und einem richtig-positiven Ergebnis nicht möglich. Dies kann durch
eine Wiederholung der Untersuchung weiter abgeklärt werden. In fraglichen Fällen
wie bei positiven PCR-Befunden von histologisch negativen oder fraglichen Tieren
wurde eine derartige Wiederholungsuntersuchung regelmäßig durchgeführt.
Bei der routinemäßigen Untersuchung der im Sommer 2003 entnommenen 378
Lungenspülproben aus der Döhler Herde durch Frau Sabine Uhlenbruck, Klinik für
kleine Klauentiere, trat zu einem Zeitpunkt ein positives Ergebnis in der zweiten
Wasser-Negativkontrolle auf (Ansatz zum Zeitpunkt der Zugabe der Proben-DNA).
Zeitgleich war von sechs der in dieser Charge untersuchten Proben je einer der zwei
Ansätze in der hn PCR positiv. Von keiner dieser Proben konnte in bis zu neunfacher
Nachuntersuchung dieses positive Ergebnis reproduziert werden. Die sechs
betroffenen Tiere wurden vorsorglich geschlachtet. Bei der pathologisch-
anatomischen sowie histologischen Untersuchung konnte Lungenadenomatose nicht
nachgewiesen werden. Die ersten Untersuchungsergebnisse wurden daraufhin als
falsch-positiv gewertet und die Tiere als negativ eingeordnet. Weitere Vorfälle dieser
Art traten nicht auf, sie verdeutlichen jedoch die Gefahr, die von einem hohen
196 DISKUSSION
Probendurchsatz und dem diagnostischen Einsatz einer nested PCR trotz höchster
Vorsichtsmaßnahmen ausgeht.
Durch Southern-Blot-Hybridisierung (SOUTHERN 1975; SAMBROOK et al. 1989)
und eine Sequenzierung des PCR-Produktes konnte exemplarisch die Spezifität der
nachgewiesenen Banden gezeigt werden.
5.4 Untersuchung von Proben aus positiven Herden
5.4.1 PCR aus Blutproben
Die Beobachtung einer Virämie in frühen Infektionsstadien bei experimentell
infizierten Lämmern durch HOLLAND et al. (1999) konnte unter natürlichen
Infektionsbedingungen bestätigt werden. Von drei Lämmern, die sich innerhalb der
ersten zehn Lebensmonate nachweislich mit JSRV infiziert hatten sowie einem
histologisch fraglichen Lamm konnten jedoch bei regelmäßiger Blutentnahme
lediglich bei einem der zum Zeitpunkt der Schlachtung makroskopisch LA-positiven
Tiere zu einem Entnahmezeitpunkt im Alter von sechs Wochen JSRV aus dem Buffy-
Coat nachgewiesen werden. Die Mutter dieses Tieres war an Lungenadenomatose
erkrankt, so dass das Lamm einer hohen natürlichen Infektionsdosis ausgesetzt war.
Lediglich einer der untersuchten drei Ansätze wies zu dem genannten Zeitpunkt ein
positives Ergebnis auf. Zu allen folgenden Entnahmeterminen verlief die
Blutuntersuchung negativ. Die Nachweisbarkeit von JSRV im Blut scheint daher
entweder, wie von GARCIA-GOTI (1999, zit. nach SHARP und DE MARTINI 2003)
beobachtet, ein transientes Phänomen zu sein, oder die Zahl infizierter Leukozyten
ist so gering, dass sie in den meisten Fällen unter der Nachweisgrenze liegt.
Während HOLLAND et al. (1999) bei fünf von acht klinisch erkrankten Tieren JSRV
aus weißen Blutzellen nachweisen konnten, gelang dies GONZALEZ et al. (2001) in
15 von 16 Fällen mit makroskopischen Läsionen sowie bei vier von zehn gesunden
Kontakttieren.
DISKUSSION 197
Der Nachweis von JSRV aus Blutproben beschränkte sich in den eigenen
Untersuchungen demgegenüber zusätzlich zu dem oben genannten Lamm auf vier
Tiere, die bereits deutliche klinische Symptome einer Lungenadenomatose-
Erkrankung zeigten (Gruppe D). Bei Tieren aus anderen klinischen Gruppen sowie
bei Tieren ohne nachweisbare Läsionen konnte mit Ausnahme des oben genannten
sechs Wochen alten Lammes in keinem Fall ein positives Blutprobenergebnis erzielt
werden. Bezogen auf die Gruppe der klinisch erkrankten Tiere konnte daher lediglich
bei 20% der Tiere JSRV aus einer Blutprobe nachgewiesen werden. Bezogen auf
alle Tiere mit makroskopischen Läsionen (Kategorie I) reduziert sich der Anteil auf
7%, bezogen auf die Gesamtheit der LA-positiven Tiere (Kategorie I und II) auf 5,7%.
Diese Zahlen beziehen sich auf die Untersuchung im Dreifachansatz. Ein solcher ist
für den routinemäßigen Einsatz eines Diagnostikverfahrens nicht finanzierbar. Für
eine Untersuchung im Einfachansatz reduziert sich die relative Sensitivität der
Blutprobenuntersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie auf lediglich
4,0%. Nach den vorliegenden Ergebnissen ist ein Nachweis von JSRV aus
Blutproben als diagnostisches Hilfsmittel ungeeignet, zumal bei Tieren, die bereits
das pathognomonische Symptom des hochgradigen Nasenausflusses zeigen, eine
aufwendige Laboruntersuchung obsolet ist.
Inwiefern die Diskrepanz der Ergebnisse zwischen den eigenen Untersuchungen und
den Erfahrungen anderer Untersucher (DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung;
GONZALEZ et al. 2001) durch mögliche Rasseunterschiede bei den untersuchten
Tieren, mögliche Unterschiede im Virusstamm oder andere Faktoren bedingt ist,
müsste weiter untersucht werden. Die Sequenz des in der PCR nachgewiesenen
LTR-Fragmentes wies eine 98%ige Basensequenzhomologie zu dem britischen LA-
Isolat JS21 auf. Untersuchungsbedingte Unterschiede sowie falsch-negative
Resultate wurden weitestgehend ausgeschlossen.
198 DISKUSSION
5.4.2 PCR aus Lungenspülproben
Eine Untersuchung von Lungenspülproben zum Nachweis von JSRV wurde von
anderen Autoren bislang nicht durchgeführt, so dass Vergleichsdaten hierzu fehlen.
Nach Literaturangaben ist jedoch bei der PCR-Untersuchung der Lungenflüssigkeit
klinisch erkrankter Schafe in 100 % der Fälle mit einem positiven Ergebnis zu
rechnen (PALMARINI et al. 1996b; GONZALEZ et al. 2001; DEWAR und SHARP
2000, pers. Mitteilung). Diese Beobachtung wurde in den eigenen Untersuchungen
bestätigt. Die Lungenspülproben klinisch erkrankter Tiere wiesen in 100% der Fälle
ein positives Ergebnis, überwiegend bereits im ersten PCR-Durchgang auf. Eine
Nachuntersuchung mit der hn PCR war nur in einem Fall nötig. Die PCR-
Untersuchung von Lungenspülproben ist folglich ein geeignetes diagnostisches
Hilfsmittel, um einen klinischen Verdacht auf Lungenadenomatose zu bestätigen.
Bezogen auf alle Tiere mit nachgewiesenen LA-typischen Läsionen aller Stadien
betrug die relative Sensitivität der PCR-Untersuchung aus Lungenspülproben im
Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen 90,2% mit
einer relativen Spezifität von 98,4%. Definiert man eine klinisch nicht nachweisbare
Lungenadenomatose anhand des Fehlens des pathognomonischen Symptoms des
Abgangs von Lungenflüssigkeit (negativer „Schubkarrentest“), so ergibt sich für die
Tiere der Gruppe A, B und C eine relative Sensitivität der PCR-Untersuchung von
Lungenspülproben im Dreifachansatz von 85,3% (im Einfachansatz 77,9%). Für die
Untersuchung einer klinisch gesund erscheinenden Herde, in der respiratorische
Symptome eine Seltenheit darstellen, ist die Berechnung der relativen Sensitivität für
klinisch LA-unverdächtige Tiere (Gruppen A und B) interessant. Im Dreifachansatz
liegt sie bei 77,3%. Eine Untersuchung im Doppelansatz reduziert die relative
Sensitivität auf 70,5%, im Einfachansatz auf 65,9 %.
In Anbetracht der Tatsache, dass am lebenden Tier ein Diagnostikum mit einer
höheren Sensitivität bei vergleichbarer Spezifität derzeit nicht existiert, wurde das
Verfahren der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben für die Untersuchung der
wertvollen Zuchttiere der mutterlos aufgezogenen Döhler Herde angewendet.
DISKUSSION 199
Die Röntgenuntersuchung ist daneben ein Verfahren, mit dem zwar bereits dezente
Lungenläsionen erkannt werden können (WYN-JONES und CLARKSON 1984).
Diese können jedoch vielfältiger Ätiologie sein und der apparative Aufwand lässt
lediglich Einzeltieruntersuchungen zu. Das Verfahren der Lungenspülung nach
endotrachealer Intubation ermöglicht auch Herdenuntersuchungen in großem Stil.
Trotz der vergleichsweise niedrigen Materialkosten für die Probenentnahme sind bei
Mitberechnung der Arbeitszeit der Aufwand und die Kosten für die Probennahme und
die folgenden Laboruntersuchungen jedoch sicherlich ein limitierender Faktor für eine
weitere Anwendung auf Herdenbasis. Im Zuge einer Ankaufsuntersuchung wertvoller
Zuchttiere kann die PCR aus Lungenspülproben im Zusammenhang mit einer
gründlichen klinischen und gegebenenfalls röntgenologischen Untersuchung die
diagnostische Sicherheit jedoch wesentlich erhöhen. Eine „Freiheit von
Lungenadenomatose“ kann jedoch bei negativem Ergebnis für Einzeltiere nicht
bescheinigt werden. Hinsichtlich der besseren Kontrollierbarkeit der PCR für einen
möglichen diagnostischen Einsatz wäre die Entwicklung eines internen
Inhibitionsstandards wünschenswert.
5.4.3 PCR aus Gewebeproben
Die PCR-Untersuchung aus Gewebeproben ist ein geeignetes Mittel, in histologisch
fraglichen Fällen zu einer Abklärung der möglichen Virusätiologie beobachteter
Läsionen beizutragen (DE LAS HERAS et al. 2000; SANNA et al. 2001). Die relative
Sensitivität der PCR-Untersuchung des Ln. mediastinalis caudalis im Vergleich zur
histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen beträgt bei
Untersuchung im Dreifachansatz 81,2%, im Einfachansatz 65,2%. Dem stehen
lediglich 1,5% (im Einfachansatz 0,76%) positive PCR-Befunde bei histologisch
negativen Tieren gegenüber. Der erhöhte Aufwand für eine kontaminationsfreie
Probenentnahme und die durch die Notwendigkeit der Durchführung einer nested
PCR höheren Laborkosten sprechen zusätzlich gegen einen routinemäßigen Einsatz
der PCR-Untersuchung von Lungenlymphknoten zur Herdenüberwachung. Die
200 DISKUSSION
histologische Untersuchung ist daher am toten Tier nach wie vor das praktikabelste,
kostengünstigste und sicherste Verfahren zum Nachweis von Lungenadenomatose.
Für die geschilderten Untersuchungen wurde die histologische Beurteilung
sämtlicher Proben durch einen in der Beurteilung von Schaflungen sehr erfahrenen
Pathologen durchgeführt, was die diagnostische Sicherheit sicherlich positiv
beeinflusst. Für verbleibende fragliche Fälle und weniger erfahrene Untersucher
kann die PCR hier eine wertvolle Ergänzung sein.
Es muß darauf hingewiesen werden, dass die makroskopische Untersuchung allein
zum Ausschluß von Lungenadenomatose nicht ausreichend ist. Von den 79
untersuchten Tieren mit LA-typischen Lungenläsionen wiesen 14 (21,5%) lediglich
histologisch nachweisbare Veränderungen auf. Auch bei makroskopisch
unveränderten Lungen ist daher eine systematische histologische Untersuchung
mehrerer Lungenlokalisationen unverzichtbar. Der Verband Lüneburger
Heidschnuckenzüchter e.V. hat dem Rechnung getragen und seit 2004 die obligate
histologische Untersuchung einer Stichprobe in sein Herdenüberwachungsprogramm
aufgenommen.
5.5 Untersuchung der mutterlos aufgezogenen Herde
5.5.1 Beurteilung des Sanierungserfolges
In den Jahren 1999 bis 2001 wurden insgesamt 390 Tiere für die mutterlose Aufzucht
gewonnen (WOLLNY 2000; KRÄMER 2001; BIMCZOK 2002). Bei keinem der
inzwischen 509 Zuchttiere (Stand Januar 2004) sind im Laufe der seit
Sanierungsbeginn vergangenen fünf Jahre klinische Lungenadenomatose-
Erkrankungen aufgetreten. Die ältesten Tiere der Herde sind inzwischen fünf Jahre
alt und haben damit das Alter, in dem die meisten Heidschnucken an
Lungenadenomatose erkranken, weit überschritten (siehe Kapitel 4.4).
DISKUSSION 201
Von den jeweils ältesten Tieren, das heißt den Tieren, bei denen die
Wahrscheinlichkeit am größten ist, dass sie bereits Lungenadenomatose-typische
Läsionen entwickelt haben könnten, wurden für die PCR-Untersuchung
Lungenspülproben entnommen. So wurden im Jahr 2002 von den 119 Tieren der
Geburtsjahrgänge 1999 und 2000 110 und im Jahr 2003 von den 393 Tieren der
Jahrgänge 1999, 2000 und 2001 378 Lungenspülproben mittels PCR untersucht.
Dies entspricht für das Entnahmejahr 2002 92,4%, für das Jahr 2003 96,2% aller
zum Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre alten Tiere.
Bei keinem dieser Tiere konnte in drei- bzw. zweifacher Untersuchung ein JSRV-
spezifisches Genomfragment nachgewiesen werden.
Alle 299 im Untersuchungszeitraum geschlachteten Tiere wurden makroskopisch auf
Lungenadenomatose untersucht. Bei 169 Schlachttieren (56,5%) wurde zusätzlich
eine systematische histologische Untersuchung durchgeführt. Zusätzlich wurden 23
weitere Schlachtlämmer des ersten Jahrganges durch KRÄMER (2001) untersucht.
Diese wiesen weder makroskopisch noch histologisch LA-typische Läsionen auf. In
einem Fall (0,31% der insgesamt 322 Schlachtlungen) wurde Lungenadenomatose
histologisch nachgewiesen und mittels Immunhistochemie und PCR bestätigt. Bei
zwei weiteren Tieren konnte ein histologisch fragliches Ergebnis durch
weiterführende Untersuchungen als negativ eingeordnet werden.
Auch alle neun im Untersuchungszeitraum verendeten, über sechs Monate alten
Tiere wiesen keine Hinweise auf Lungenadenomatose auf. Mit den verschiedenen
Verfahren (klinische Herdenuntersuchung bei 509 Zuchttieren, PCR-Untersuchung
der Lungenspülproben von 378 dieser Zuchttiere (bei 110 dieser Tiere in zwei
aufeinanderfolgenden Jahren) sowie postmortale Untersuchung bei 331 Schlacht-
und Sektionstieren) wurden insgesamt 840 Tiere (mutterlos aufgezogene Tiere und
deren Nachkommen) untersucht. Bei einem dieser 840 Tiere konnten beginnende
Läsionen der Lungenadenomatose nachgewiesen werden, was einem relativen
Anteil von 0,12% entspricht. Bezogen auf die Gesamtzahl der mutterlos
aufgezogenen Tiere (n=390) liegt der Anteil nachgewiesener LA-Fälle bei 0,26%.
202 DISKUSSION
Diesen Zahlen stehen ein Anteil von 17,3% makroskopisch und/oder histologisch LA-
positiver Schlachttiere aus den positiven Herden des VNP und 29,8% LA-positiver
Lämmer aus der Schneverdinger Herde, durchschnittlich 15% Verluste durch
klinische Lungenadenomatose in der Schneverdinger Herde (KRÄMER 2001) sowie
ein Anteil von 28,3% makroskopisch und/oder histologisch LA-positiver Tiere zum
Zeitpunkt der Auflösung der Schneverdinger Herde gegenüber. Obwohl eine
100%ige Eradikation der Lungenadenomatose zunächst nicht erreicht werden
konnte, konnte die Prävalenz der Erkrankung extrem gesenkt werden. Parallel dazu
wurden andere Lungenerkrankungen ebenfalls deutlich reduziert.
Pseudotuberkulose-verdächtige Läsionen und Corynebacterium pseudotuberculosis
wurden im Gegensatz zur Schneverdinger Herde bei keinem der Döhler Tiere
nachgewiesen.
Nach LORENZ (1990) kann aufgrund des Stichprobenumfangs eine Schätzung der
Prävalenz einer Erkrankung in einer Herde vorgenommen werden. Für die 509
Zuchttiere der heutigen Herde wurde anhand der im Sommer 2003 untersuchten 378
Lungenspülproben eine solche Schätzung vorgenommen. Von diesen 378 im
Doppelansatz untersuchten Proben können bei einer relativen Sensitivität dieser
Untersuchung von 70,5% (siehe Kapitel 5.4.2) 266 Tiere als richtig-negativ
angesehen werden. Anhand dieser Stichprobe von 266 negativen Tiere kann
angenommen werden, dass mit 95%iger Sicherheit die Prävalenz der Erkrankung in
der heutigen Döhler Herde unter 1% liegt.
Auch bei der Maedi-Visna-Sanierung sind „Durchbrüche“ beschrieben. In einem
ersten Feldversuch in elf kleinen Beständen trat in zwei Betrieben im Zeitraum bis 36
Monate nach der Geburt bei zwei bzw. einem mutterlos aufgezogenen Lamm eine
Serokonversion auf (HOUWERS et al. 1983). In den Niederlanden wurde das
Verfahren der mutterlosen Aufzucht fester Bestandteil des nationalen Maedi-
Kontrollprogramms. Nach den Berichten von HOUWERS (1990) traten in 23 der
DISKUSSION 203
beteiligten 185 Herden Serokonversionen auf, die 1,1% der über 5000 mutterlos
aufgezogenen Tiere betrafen.
5.5.2 Mögliche Ursachen für das Vorkommen von Lungenadenomatose in der
Döhler Herde
Als mögliche Ursachen für das Auftreten von Lungenadenomatose in der mutterlos
aufgezogenen Herde wurden von KRÄMER (2001) folgende Punkte genannt.
1. infizierte Ei- oder Samenzellen
2. diaplazentare Übertragung
3. perinataler Erregerkontakt (im Stallmilieu der infizierten Muttertierherde
oder durch Erregerverschleppung der Lammhelfer vom Schaf- in den
Lämmerstall)
4. Einschleppung von Lungenadenomatose durch die zugesellten Altböcke
5. Einschleppung des Erregers durch Personenkontakt (Personal, Touristen)
6. Erregerpersistenz im Stall
Eine Erregerpersistenz im Schafstall erscheint nach zwei Jahren Leerstand,
Bodenaushub, Reinigung und Desinfektion sowie Ausstattung mit neuen Raufen und
Hürden unwahrscheinlich, zumal das Virus in der Außenwelt wenig resistent und
gegenüber handelsüblichen Desinfektionsmitteln empfindlich ist (VERWOERD 1990;
COIL et al. 2001). Gegen eine Neueinschleppung des Virus durch das Personal
wurden durch Haltung der Döhler Herde als eine geschlossene Herde mit eigenem
fest angestelltem Schäfer und strikte Hygieneregeln Vorsichtsmaßnahmen getroffen.
Zu den allgemeinen Hygienemaßnahmen zählten Stiefeldesinfektion,
bestandseigene Schutzkleidung, Zutrittsverbot für fremde Personen und bei
Bestandsbesuchen oder Schur wurde diese Herde stets als erstes vor den positiven
Gebrauchsherden besucht. Trotz getrennter Weideflächen und sogenannter
204 DISKUSSION
Sicherheitszonen, in denen keine Beweidung stattfindet (KOOPMANN 2003, pers.
Mitteilung) ist eine Erregerverschleppung von benachbarten Herden durch
Wildwiederkäuer oder den regen Touristenverkehr zumindest denkbar. Im
Naturschutzgebiet Lüneburger Heide kommen neben zahlreichen anderen Wildarten
auch Mufflons vor (ZIMMERMANN 2004, pers. Mitteilung), die nach den
Untersuchungen von SANNA et al. (2001) ebenfalls für Lungenadenomatose
empfänglich sind und daher als mögliche Überträger fungieren könnten. Das
betroffene positive Lamm war jedoch die meiste Zeit in einer Bockgruppe auf einer
eingezäunten Weide in der Nähe des Schafstalles gehalten worden und hatte
insofern wenig Möglichkeiten für einen Kontakt mit Wanderern und Wildwiederkäuern
(KOOPMANN 2001, pers. Mitteilung). Die beiden der Herde im Herbst 2000
zugesellten Altböcke konnten durch die vorliegenden Untersuchungen als mögliche
Infektionsquelle weitestgehend ausgeschlossen werden. Nach ihrer Entfernung aus
der Herde im Herbst 2002 zeigten sie weder klinische noch pathologisch-
anatomische oder histologische Hinweise auf Lungenadenomatose. Die dreimalige
Untersuchung einer Lungenspülprobe sowie von Gewebe des Lymphonodus
mediastinalis caudalis und zweier Lungenlokalisationen mittels PCR verlief für beide
Tiere negativ. Infizierte Keimzellen sind nach den Untersuchungen von PARKER et
al. (1998) ebenfalls sehr unwahrscheinlich. Es bleiben folglich noch die Möglichkeiten
einer intrauterinen (diaplazentaren) Übertragung sowie einer perinatalen Infektion,
die näher diskutiert werden müssen.
Intrauterine Übertragung
Das Ergebnis des Sanierungsversuches legt die Vermutung nahe, dass der
intrauterine Übertragungsweg, wenn überhaupt, eine untergeordnete Rolle spielt.
Eine intrauterine Übertragung ist nach den Ergebnissen von DE LAS HERAS et al.
(2000) durch den Erregernachweis in fetalen Geweben sowie die Beschreibung
eines JSRV-assoziierten Tumors bei einem drei Tage alten Lamm durchaus möglich.
Auch durch die eigenen Untersuchungen konnten Hinweise auf die Möglichkeit einer
DISKUSSION 205
intrauterinen Infektion erbracht werden. Bei einem histologisch fraglichen tragenden
Muttertier mit positivem BAL-Ergebnis wurde aus dem Thymus des Fetus in einem
von drei bzw. bei Wiederholung der PCR in einem von sechs Ansätzen ein JSRV-
spezifisches Genomfragment nachgewiesen. Alle mitgeführten Negativkontrollen
waren negativ. Eine erneute PCR-Untersuchung im Sechsfachansatz nach einer
erneuten DNA-Extraktion aus asserviertem Thymusgewebe konnte das positive
Ergebnis jedoch nicht reproduzieren. Das Lungengewebe dieses Fetus war in
dreimaliger Untersuchung negativ. Ein klinisch erkranktes Tier sowie ein klinisch
weitgehend unauffälliges Tier mit pathologisch-anatomisch feststellbaren Tumoren
waren zum Zeitpunkt der Sektion ebenfalls tragend. Bei beiden Tieren konnte aus
fetalen Geweben (Thymus, Lunge) JSRV mittels PCR nicht nachgewiesen werden.
Das Muttertier des mutterlos aufgezogenen Lammes mit positivem histologischem
Befund (Geburtsjahrgang 2000) konnte anhand detaillierter Buchführung identifiziert
werden. Es war klinisch unauffällig und wurde im Rahmen der Auflösung der
Schneverdinger Herde im Frühjahr 2001 getötet und eingehend untersucht. Weder
pathomorphologisch noch histologisch bestanden Hinweise auf
Lungenadenomatose. Alle von diesem Tier verfügbaren Proben (BAL, Blut, Ln.
mediastinalis caudalis, zwei Lungenlokalisationen) waren in dreimaliger PCR-
Untersuchung negativ. In dem von DE LAS HERAS et al. (2000) beschriebenen Fall
des drei Tage alten Lammes mit LA-typischen Läsionen hatte das Muttertier
ebenfalls keinerlei makroskopisch oder histologisch (einschließlich
immunhistochemisch) nachweisbare Läsionen aufgewiesen. Die PCR-Untersuchung
einer Blutprobe sowie von Lungengewebe und Gewebe des mediastinalen
Lymphknotens war jedoch bei diesem Tier für alle drei Proben positiv. Die
Beobachtung einer intermittierenden Virämie durch GARCIA-GOTI (1999, zit. nach
SHARP und DE MARTINI 2003) lassen eine intrauterine Übertragung im Fall des
Döhler Lammes zwar möglich erscheinen. Aufgrund des negativen
Untersuchungsergebnisses sämtlicher Proben des Muttertieres ist sie jedoch
unwahrscheinlich.
206 DISKUSSION
Perinatale Infektion
Aufgrund der beschriebenen besonderen Empfänglichkeit neugeborener Lämmer für
eine Infektion mit JSRV (SHARP et al. 1983; VERWOERD 1990) erscheint eine
perinatale Infektion trotz größtmöglicher Vorsichtsmaßnahmen im vorliegenden Fall
am wahrscheinlichsten. Eine solche ist möglich, da der Geburtshelfer durch die wilde
Natur der Heidschnucken häufig gezwungen ist, das Muttertier vorher einzufangen
und seine Hände dadurch möglicherweise mit dem Erreger kontaminiert werden
(KRÄMER 2001). Im dritten Jahr der Sanierung waren die Überwachungsschichten
daher nach Möglichkeit mit zwei Personen besetzt. Auch die Utensilien zur
Geburtshilfe und die zum Lämmertransport genutzten Kisten stellen eine mögliche
Infektionsquelle dar, da sie zwar außerhalb der Reichweite der Mutterschafe gelagert
wurden, jedoch für ein schnelles Eingreifen innerhalb des Schafstalles bereitgehalten
werden mussten und damit zwangsläufig mit möglicherweise erregerhaltiger Stalluft
in Kontakt kamen. Die Lammhelfer selbst, die in Personalunion auch die Versorgung
der neugeborenen Lämmer übernahmen, stellen trotz strikter Hygienemaßnahmen
und Wechsel der Schutzkleidung ebenfalls ein mögliches Risiko dar (KRÄMER
2001).
5.5.3 Konsequenzen
Eine Übertragung von Lungenadenomatose ist bereits in der langen subklinischen
Phase der Erkrankung möglich (DUNGAL et al. 1938). Ab welcher Größe der
Läsionen eine solche Übertragung stattfinden kann, entzieht sich der Möglichkeit
einer gezielten Untersuchung. Bei Auftreten klinischer Symptome sind in der Regel
bereits ausgedehnte Tumoren vorhanden (MACKAY und NISBET 1966; TUSTIN
1969; VERWOERD et al. 1985). Inwiefern eine fokale, lediglich histologisch
nachweisbare Läsion bereits das Potential einer Infektion anderer Tiere in sich birgt,
ist nicht geklärt. Eine solche ist angesichts des minimalen Ausmaßes der
nachgewiesenen Läsion bei dem positiven Lamm sicherlich unwahrscheinlich, jedoch
DISKUSSION 207
theoretisch möglich. Die Haltung des histologisch positiven Lammes in einer
separaten Bockgruppe, die wenig Kontakt zur übrigen Herde hatte und von der ein
Großteil der anderen Bocklämmer zeitgleich mit dem betroffenen Tier im Frühjahr
2001 geschlachtet wurde, reduzieren das Risiko einer Weiterverbreitung der Infektion
innerhalb der Herde weiter.
Seit Entfernen des Bocklammes aus der Herde sind inzwischen nahezu drei Jahre
vergangen. Die Häufung früher Erkrankungsfälle in den positiven Herden legt eine
vergleichsweise kurze Inkubationszeit bei Heidschnucken nahe, so dass in der
Zwischenzeit klinische Erkrankungen hätten auftreten müssen, zumal sich durch die
Fortführung der Sanierung im Frühjahr 2001 sowie durch den eigenen Nachwuchs
der Döhler Herde eine große Anzahl hochempfänglicher Jungtiere in der Herde
befand. Die Wahrscheinlichkeit, dass durch das LA-positive Bocklamm weitere Tiere
infiziert wurden, ist nach menschlichem Ermessen daher gering.
Durch die Untersuchung der Mehrzahl der in der Herde vorhandenen Alttiere mittels
Lungenspülung und PCR (im Sommer 2002 von 92,4% und im Sommer 2003 von
96,2% aller zum Entnahmezeitpunkt in der Herde befindlichen, zwei und mehr Jahre
alten Tiere) konnten weitere LA-Fälle weitgehend ausgeschlossen werden. Die
Herde kann daher heute mit ausreichender Sicherheit als LA-unverdächtig
angesehen werden.
208 DISKUSSION
SCHLUSSFOLGERUNGEN 209
6. SCHLUSSFOLGERUNGEN
• Als praktikables Verfahren des Lungenadenomatose-Monitorings und der
Herdenuntersuchung steht die pathologisch-anatomische und histologische
Untersuchung von Schlachtlungen zur Verfügung.
• Am lebenden Tier sind Herdenuntersuchungen durch die Untersuchung von
Lungenspülproben mittels PCR möglich, da mit der Methode zur Entnahme
von Lungenspülproben nach endotrachealer Intubation ein praxistaugliches
Verfahren zur Entnahme von Lungenspülproben unter Feldbedingungen zur
Verfügung steht. Die PCR-Untersuchung von Lungenspülproben weist am
lebenden Tier im Vergleich zu anderen Verfahren die derzeit höchste
diagnostische Aussagekraft auf.
• Die relative Sensitivität der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben beträgt
im Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen
für alle Stadien der LA 90,2% bei einer relativen Spezifität von 98,4%. Für
klinisch unauffällige Tiere mit pathologisch-anatomisch oder histologisch
nachgewiesenen LA-typischen Läsionen beträgt die relative Sensitivität
77,3%.
• Die Untersuchung von Blutproben mittels PCR ist aufgrund einer relativen
Sensitivität von lediglich 5,7% diagnostisch wertlos.
• Die PCR-Untersuchung des Lymphonodus mediastinalis caudalis ist im
Vergleich zur histologischen Untersuchung von vier Lungenlokalisationen mit
einer relativen Sensitivität von 81,2% dieser in der postmortalen Untersuchung
unterlegen. Die PCR-Untersuchung von Gewebeproben kann zur Abklärung
fraglicher Fälle jedoch hilfreich sein.
210 SCHLUSSFOLGERUNGEN
• Die mutterlose Aufzucht der Lämmer ist mit einem geringen Restrisiko ein für
die Sanierung einer Herde von der Lungenadenomatose geeignetes
Verfahren.
• Bei 840 mit verschiedenen Verfahren untersuchten Tieren wurde in der
mutterlos aufgezogenen Döhler Herde im Jahr 2001 ein histologisch positives
Schlachtlamm identifiziert. Die diaplazentare Übertragung der LA ist zwar
selten, aber möglich. In diesem Fall konnte sie durch Untersuchung des
Muttertieres weitestgehend ausgeschlossen werden. Mit 95%iger Sicherheit
beträgt die Prävalenz der Erkrankung in der heutigen Herde unter 1%. Die
Herde kann daher heute als Lungenadenomatose-unverdächtig betrachtet
werden.
ZUSAMMENFASSUNG 211
7. ZUSAMMENFASSUNG
Katja Voigt
Untersuchungen zum Lungenadenomatose-Status einer mutterlos aufgezogenen Heidschnuckenherde mittels Polymerase-Kettenreaktion
Im Rahmen eines Versuchs der Sanierung einer wertvollen Heidschnuckenherde von
der Lungenadenomatose durch mutterlose Aufzucht wurde die diagnostische
Anwendbarkeit der Untersuchung von Blut- und Lungenspülproben mittels
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) untersucht.
Für die Entnahme von Lungenspülproben (BAL) wurde ein kostengünstiges und
unter Feldbedingungen auch für die Probennahme bei größeren Tierzahlen
geeignetes Verfahren entwickelt. Unter kurzzeitiger medikamenteller Immobilisation
erfolgt nach endotrachealer Intubation über eine durch den Behelfs-Tracheotubus
eingeführte Sonde eine Lungenspülung mit vier Fraktionen á 25ml steriler 0,9%
NaCl-Lösung. Von 94,5% der untersuchten Tiere konnte eine für den
Untersuchungszweck brauchbare Probe gewonnen werden. Die Methode ist
risikoarm, es besteht jedoch ein geringes Risiko von tödlichen
Aspirationspneumonien (0,13% von 760 beprobten Tieren).
Die relative Sensitivität und Spezifität des Nachweises proviraler DNA des
Jaagsiekte Retrovirus (JSRV) aus Blut- und Lungenspülproben sowie Gewebe des
Lymphonodus (Ln.) mediastinalis caudalis mittels PCR im Vergleich zur
histologischen Untersuchung der Lunge wurden an Proben von 124 Sektions- und
127 Schlachttieren aus Lungenadenomatose (LA)-positiven Heidschnuckenherden
bestimmt. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der klinischen Untersuchung mit den
Ergebnissen der postmortalen Untersuchung verglichen und weitere Daten zu der
Altersverteilung erkrankter Tiere und der Prävalenz der Erkrankung in der LA-
positiven Muttertierherde ermittelt.
212 ZUSAMMENFASSUNG
61,7% der klinisch erkrankten Tiere (n=47) und 50,6% der Tiere mit makroskopisch
und/oder histologisch nachgewiesenen Läsionen (n=79) waren zwei Jahre alt oder
jünger. Der Median lag in der Gruppe der klinischen Erkrankungen bei einem Jahr, in
der Gruppe der Tiere mit LA-typischen Läsionen bei zwei Jahren. Die jüngsten
erkrankten Tiere waren vier Monate, das älteste zehn Jahre alt. Die Prävalenz
histologisch bestätigter LA betrug bei den Schlachttieren aus positiven Herden 17,3%
und in der Herde, aus der die Mehrzahl der Lämmer für die mutterlose Aufzucht
gewonnen wurden (sog. „Schneverdinger Herde“) 28,3%.
Die klinische Untersuchung weist nur in fortgeschrittenen Erkrankungsstadien eine
hohe diagnostische Sicherheit auf. Bei klinisch unauffälligen Tieren und Tieren mit
lediglich geringgradigen oder unspezifischen respiratorischen Symptomen (Summe:
n=87) aus den positiven Herden wurden bei der pathologisch-anatomischen und
histologischen Untersuchung in 23,0% der Fälle LA-typische Läsionen
nachgewiesen.
Für die PCR-Untersuchung von Blutproben wurde im Vergleich zur Histologie von
vier Lungenlokalisationen eine relative Sensitivität von 5,7% ermittelt. Die PCR-
Untersuchung von Lungenspülproben wies eine relative Sensitivität von 90,2%
(n=51) und eine relative Spezifität von 98,4% auf (n=64). Für die Untersuchung des
Ln. mediastinalis caudalis wurde im Vergleich zur Histologie von vier
Lungenlokalisationen eine relative Sensitivität von 81,2% (n=69) und eine relative
Spezifität von 100% (n=63) ermittelt.
Zur Untersuchung der inzwischen auf 509 Zuchttiere angewachsenen mutterlos
aufgezogenen Herde wurde unter anderem das Verfahren der makroskopischen und
histologischen Untersuchung der Schlachtlungen angewendet. Die Lungen
sämtlicher im Untersuchungszeitraum vom Herbst 2000 bis Ende 2003
geschlachteter Tiere (n=299) wurden pathologisch-anatomisch, sowie von 56,5%
zusätzlich histologisch untersucht. Von 105 Tieren wurde außerdem Gewebe des Ln.
mediastinalis caudalis mittels PCR untersucht. Daneben erfolgte eine regelmäßige
klinische Begutachtung der Herde sowie im Sommer 2002 und 2003 jeweils die
ZUSAMMENFASSUNG 213
Entnahme von Lungenspülproben bei allen über zwei Jahre alten Tieren und deren
Untersuchung mittels PCR. Bei einem im Frühjahr 2001 im Alter von 13 Monaten
geschlachteten Lamm wurde eine lediglich histologisch nachweisbare LA-typische
Läsion festgestellt. Die PCR-Untersuchung des Ln. mediastinalis caudalis sowie eine
immunhistochemische Untersuchung bestätigten diesen Fall. Durch Untersuchung
der im Herbst 2000 der Herde zugesellten Altböcke sowie des Muttertieres des
histologisch positiven Lammes konnte eine Neueinschleppung der LA durch die
zugekauften Böcke sowie eine diaplazentare Übertragung weitestgehend
ausgeschlossen werden. Am wahrscheinlichsten ist als Infektionsquelle eine
perinatale Infektion im Stallmilieu der infizierten Muttertierherde.
Weitere positive Befunde traten für alle mit den verschiedenen genannten Verfahren
untersuchten Tiere und Proben nicht auf. Drei Jahre nach dem Entfernen des
histologisch positiven Tieres aus der Herde sind in der Herde keine klinischen
Erkrankungen oder Verdachtsfälle aufgetreten. Die geschätzte Prävalenz möglicher
weiterer LA-Fälle in der Herde liegt mit 95%iger Sicherheit unter 1%. Die Herde kann
daher heute als Lungenadenomatose-unverdächtig angesehen werden.
214 ZUSAMMENFASSUNG
SUMMARY 215
8. SUMMARY
Katja Voigt
Studies on the presence of Ovine Pulmonary Adenocarcinoma in a motherless reared flock of German Heath Sheep by use of polymerase chain reaction
The diagnostic value of polymerase chain reaction (PCR) testing of blood and
bronchoalveolar lavage (BAL) samples was evaluated as part of a clinical trial to
eradicate OPA from a severely infected flock by snatching the lambs at birth and
rearing them artificially.
A simple and ecomomical technique for BAL sampling in sheep was developed,
which can be used for sampling large numbers of animals under field conditions.
After a short-term medical immobilisation the animal is intubated endotracheally and
a smaller tube introduced into the lower airways. The lavage is performed using four
aliquots of 25 ml sterile 0.9% NaCl solution. A decent sample for the intended PCR
examination could be obtained from 94.5% of the animals examined. The method
bears a very low risk of fatal aspiration pneumonia (0.13% of the 760 animals that
had been sampled).
The relative sensitivity and specificity of a PCR test for proviral DNA from blood and
BAL samples as well as the caudal mediastinal lymph node was evaluated using
histological examination as golden standard. Samples from 124 animals designated
for post mortem examination as well as 127 slaughter sheep from OPA-infected
flocks were obtained for that purpose. In addition, the results of a thorough clinical
examination were compared to those of gross pathology and histology, and
additional information was gathered on the age distribution of diseased animals and
on the prevalence in slaughter animals from infected flocks and in the maternal flock
where the motherless reared lambs were taken from.
216 SUMMARY
Of the 47 animals with clinical or clinically suspected OPA 61.7% were two years old
or younger, as well as 50.6% of the 79 animals with grossly or histologically proven
lesions. The median of the age of clinical cases was one year, while the median was
two years for the group of animals with grossly or histologically proven lesions. The
youngest animals that showed clinical OPA were four months old, the oldest one was
ten years. The prevalence in slaughter animals from infected flocks was 17.3% and
in the maternal flock as high as 28.3%.
Clinical examination is of high diagnostic value in advanced cases only. In 87
apparently clinically healthy sheep or animals showing just very slight or inconclusive
respiratory signs, 23.0% showed grossly or histologically discernable lesions of OPA.
PCR testing of blood samples resulted in a relative sensitivity of 5.7% compared to
the results of histological examination. It can therefore be considered as useless for
diagnostic purposes. PCR testing of BAL samples showed a relative sensitivity of
90.2% (n=51) and a relative specificity of 98.4% (n=64). The relative sensitivity of
PCR testing of tissue samples from the caudal mediastinal lymph node is 81.2%
(n=69) with a relative specificity of 100% (n=63).
The motherless reared flock has now grown to a number of 509 breeding stock.
Among several techniques to examine this flock for the presence of OPA gross
pathological and histological examination of slaughter specimen was applied. The
lungs of all the 299 animals slaughtered between autumn 2000 and the end of 2003
were examined grossly. 56.5% of these were also examined histologically. In
addition, 105 lymph node samples were examined by PCR. A regular clinical
examination of the flock was performed and in summer 2002 und 2003 BAL samples
for PCR examination were taken from all animals older than two years of age. OPA
was diagnosed histologically (there were no discernible gross lesions) in one lamb 13
months old, which was slaughtered in spring 2001. This diagnosis was confirmed by
PCR testing of the lymph node sample and immunohistochemistry. Examination of
the two rams that had been introduced into the flock and of the positive lamb’s
mother did exclude re-introduction of OPA into the flock and intrauterine
transmission. The most likely source of infection appears to be perinatal infection.
SUMMARY 217
There was not obtained any other positive result from any other of the samples or
animals described above, and no clinical or suspicious cases have been seen during
the three years that have passed since the histologically positive animal was
removed from the flock.
The estimated prevalence of possible other cases of OPA in the remaining flock is
less than 1 % with a statistical confidence of 95%. Today OPA can be considered as
eradicated from this flock.
218 SUMMARY
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ANHANG 259
10. ANHANG
I. Geräte und Verbrauchsmaterialien für die Probenentnahme
A Gewebeproben 10 % neutral gepuffertes Formalin Bezug über Institut für Pathologie,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Besamungsbehälter Rinderproduktion Niedersachsen
Bestecke : J. Lehnecke, Schortens
Aesculap Schere BC323130,
Pinzette, chir.,11,5 cm, Zähne 1x2
Dewargefäß, Edelstahl Landgraf, Langenhagen
EuthaR 77 Essex Tierarznei, München
Fleischermesser, hitzesterilisierbar Schlachthofbedarf
Flüssiger Stickstoff Rinderproduktion Niedersachsen
Gefrierbeutel, 30 l Schlachthofbedarf
Kälte-Schutzhandschuhe Landgraf, Langenhagen
Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Karlsruhe
Rektalisierhandschuhe, 100 cm Tierärztebedarf
Runddosen aus Polyethylen, 500 ml Engelbrecht, Edermüde
Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf Bezug über Omnilab, Gehrden
B Blutproben
Vacutainer, Li-Heparin, 10 ml Medicalis, Garbsen
Vacutainer Kanüle 20G 1 1/2“ Medicalis, Garbsen
Vacutainer Hütchen Medicalis, Garbsen
260 ANHANG
C Lungenspülproben BoviConceptR Gleit-Gel A. Albrecht, Aulendorf
Bronchialzerstäuber Karl Storz, Tuttlingen Desinfektionsmittel: HelipurR-Konzentrat Omnilab, Gehrden
Desinfektionswannen
Edelstahl-Rundstangen, Durchm. 0,6cm Stahlhandel
Einwegspritzen, 20ml (BD DiscarditTM)
Einwegspritzen 5 ml (BD DiscarditTM) Fa. Transatlantic, Bremen
Ernährungssonde, geschlossen, abgerundete
Spitze, 2 seitliche Augen, Trichteran-
satz (Luer), Länge 100 cm, steril Aesculap AG, Melsungen.
Handtücher
Injektionskanüle (BD MicrolanceTM)
18G 1 1/2“: 1,2x40 Fa. Transatlantic, Bremen
Isocain ad us. vet. Selectavet, Weyarn-Holzolling
Isotone Kochsalzlösung 0,9%
zur i.v. Infusion B. Braun, Melsungen Laryngoskop mit
Laryngoskopspatel Miller 4 (207mm,
Breite am distalen Ende 15,9mm)
F.O.NT 3,5V Ladegriff, komplett
mit NT 200 Ladegerät Heine Optotechnik, Herrsching
Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Karlsruhe
Müllbeutel
PVC Schlauch, klar,
GuttasynR TOL 0,8 cm x 2mm Vertrieb: Frommeyer, Isernhagen.
Schraubdeckeldosen, 90 ml, steril Roth, Karlsruhe
UrsotaminR Serumwerk Bernburg AG,
ANHANG 261
II. Geräte für die Laboruntersuchungen
Biometra Standard Power Pack P25 Biometra, Göttingen
Blaulichttransilluminator Flu-O-Blu,
Wellenlänge 460 – 480 nm Biozym , Hess. Oldendorf;
Blutbildanalysegerät Modell MEK – 6108G Nihon Kohden, Bad Homburg
Computer mit Bildbearbeitungsprogramm
Gel Pro 3 Biozym, Hess. Oldendorf
Dampfsterilisator
GETINGE AB GE 2606 EC-1 / P20278
Digitalkamera Sony, Modell XC-0003P
Color video camera module +
TV zoom lens 1:16 / 12,5 – 75
mit Kaiser Orange Filter Bezug über Biozym, Hess. Oldendorf
Elektrophoresekammern Biozym, Hess. Oldendorf
ComPhor Midi Gelelektrophoresesystem SN 00082102,
ComPhor Mini Gelelektrophoresesystem,
Kamm Standard 10 Zähne, 1mm, für ComPhor Mini;
Kamm Standard, 20 Zähne, 1mm, für ComPhor Midi;
Gefrierschränke -20°C Gefriertruhe -80°C Glaswaren für Laborbedarf
ausgebacken bei 180°C für 3 h Bezug über Landgraf, Langenhagen Laborspülmaschine MIELABOR G 7783 Multitronic, Miele
Lichtmikroskop Leica DMLB, Okular 10x, Objektiv 100x
Magnetrührer Mikrowelle SHARP R-202 Elektrofachhandel
pH-Meter: Mikroprozessor pH-Meter Omnilab, Gehrden
Photometer Uvikon 930 Spectrophotometer
Uvikon XL, Bio-Tek Instruments Kontron Instruments
262 ANHANG
Pipetten: Probenaufbereitung: Eppendorf Research 100-1000 µl; Biozym PreCision 20 – 200 µl Biozym PreCision 2-20 µl Mastermix Eppendorf Reference 0,1-10 µl Eppendorf Research 2-20 µl Eppendorf Research 10-100 µl Eppendorf Research 20-200 µl Eppendorf Research 100-1000 µl Geräteraum Eppendorf Research 10-100 µl Biozym PreCision 0,5 – 10 µl Biozym PreCision 2 – 20 µl
Elektrophorese Eppendorf Research 10-100 µl Biozym PreCision 0,5 – 10 µl Biozym PreCision 2 – 20 µl Quarzkuvette
Reverse-Osmose-Anlage RO 20 Fa. Werner, Leverkusen
Schüttelwasserbad GFLR 1083 GFL Gesellschaft für Labortechnik
mbH, Burgwedel
Schutzbrille :Gold Vision Blue Block GV Biozym, Hess. Oldendorf
Sterilbank: HeraSafe, Sicherheitswerkbank Heraeus (Kendro Laboratory
Products); Osterode
Thermocycler: Eppendorf Mastercycler Eppendorf, Wesseling
Trockenschrank: Köttermann R 2717
Vortex Mastermix: MS2 Minishaker IKA R; Omnilab, Gehrden
Vortex Probenaufbereitung: Vortex Genie 2R G 560E, Scientific Industries, Inc.
Bezug über Omnilab, Gehrden
Wasserstrahlpumpe
Zentrifuge Hauptlabor: Varifuge 20 RS Heraeus, Osterode
Zentrifuge Mastermix: Biofuge pico Heraeus, Osterode
Zentrifuge Probenaufbereitung: Biofuge pico Heraeus, Osterode
ANHANG 263
III. Verbrauchsmaterialien für die Laboruntersuchungen
Agarose: SeaKemR LE Agarose Biozym, Hess. Oldendorf
Dampfsterilisationsverpackung, 7,5 cm
200 m Rolle Heiland, Hamburg
dNTP-Mix: RotiMixR PCR 3 Roth, Karlsruhe
Finnzymes dNTP-Mix Biometra, Göttingen
Ethanol 99,8% Roth, Karlsruhe Gaze :Topper8, Gaze-Kompressen,
7,5 x 7,5 cm Johnson&Johnson; Norderstedt GelStarR Nukleinsäurefarbstoff Biozym, Hess. Oldendorf
Greiner CellStarR Röhrchen, 15 ml Greiner Bio-One GmbH,
Frickenhausen
Latexhandschuhe: RotiprotectR Latex Roth, Kralsruhe
Nitrilhandschuhe: RotiprotectR Nitril Roth, Karlsruhe
Pasteurpipette, 3 ml, steril, graduiert:
LiquipetteTM , steril Roth, Karlsruhe
PeqGOLD 100 bp DNA-Leiter Peqlab, Erlangen
Pipettenspitzen (Eppendorf) Bezug über Omnilab, Gehrden
epT.I.P.S. Filter 0,1 – 10 µl
epT.I.P.S. Filter 2 – 100 µl,
epT.I.P.S. Filter 20 – 300 µl
epT.I.P.S. Filter 50 – 1000 µl
Primer Roth, Karlsruhe
Qiagen DNeasyR Tissue kit (250) Qiagen, Hilden
Qiagen HotStarTaqTM Qiagen, Hilden
Reaktionsgefäße, steril, DNAse/RNAse-frei: Roth, Karlsruhe
0,2ml: Mµlti Ultra TubesR, 0,2ml
0,65ml: MµltiR-Reaktionsgefäße, 0,65 ml, farblos,
1,7ml: MµltiR-Reaktionsgefäße, 1,7 ml, farblos,
264 ANHANG
Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf Bezug über Omnilab, Gehrden
SteritopTM, 500 ml und StericupTM 250 ml Millipore, Schwalbach
Wasser für die Molekularbiologie,
DEPC-behandelt Roth, Karlsruhe
Wasser, doppelt destilliert, 30l Kanister Roth, Karlsruhe
IV. Gebrauchslösungen
A Herstellung der Lösungen 10x TBE Tris (Molekulargewicht 121,1) 108 g
Borsäure 55 g
diNaEDTA 9,3 g
demineralisiertes Wasser ad 1000 g
(pH sollte ca. 8,3 sein, nicht einstellen)
für die Herstellung der Arbeitslösung 1 in 10 verdünnen. Aufbewahrung bei 4°C
Für alle folgenden Puffer alle Gerätschaften und Flaschen vor Verwendung zur
Pufferherstellung bei 180°C für 3 h ausbacken
1x TE
10 mmol/l Tris, 1 mmol/l EDTA (pH 8,0) in doppelt autoklaviertem (autokl.) Aqua
dest. pH mit 1N HCl einstellen, anschließend sterilfiltrieren. Bei 4°C aufbewahren
für 1/2 l für 1 l
Tris 605,7 mg 1,2114 g
EDTA 146,15 mg 292,3 g
2x autokl. Aqua bidest. ad 500 ml ad 1000 ml
ANHANG 265
Erythrozyten-Lysispuffer (Tris-gepufferte 0,16 mol/l NH4Cl-Lösung)
Lösung A: 0,16 mol/l NH4Cl (Molekulargewicht 53,49)
NH4Cl 8,3 g
2x autokl. Aqua bidest ad 1000 ml
Lösung B 0,17 mol/l Tris (Molekulargewicht 121,1)
Tris 20,6 g
in 900 ml Aqua bidest (doppelt autokl.) auflösen, pH mit HCl auf 7,65
einstellen
dann mit Aqua bidest. (doppelt autokl.) auf 1000 ml auffüllen.
Für die Herstellung der Arbeitslösung 450 ml der Lösung A mit 50 ml der Lösung B
mischen und sterilfiltrieren. Alle Lösungen (A, B u. Arbeitslösung bei 4°C
aufbewahren)
PBS (pH 7,4)
NaCl 137 mmol/l
KCl 2,7 mmol/l
Na2HPO4 8,1 mmol/l
KH2PO4 1,12 mmol/l
sterilfiltrieren und bei 4°C aufbewahren
für 1 l:
NaCl 8,006 g
KCl 201,31 mg
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 152,42 mg
266 ANHANG
Ladungspuffer für Elektrophorese
Stammlösung:
Bromphenolblau 0,25%
Xylencyanol 0,25%
30% Glycerol (autoklaviert)
zur Herstellung der Arbeitslösung:
100µl Stammlösung + 1 ml 30% Glycerol (autoklaviert)
B Zutaten für die Herstellung der Gebrauchslösungen
Ammoniumchlorid > 99,5% p.a. Roth, Karlsruhe
Borsäure USP, BP, PH.EUR Roth, Karlsruhe
Bromphenolblau Na-Salz Roth, Karlsruhe Demineralisiertes Wasser aus eigener reverse Osmose-Anlage (für TBE)
Di-Natrium-EDTA p.a. Roth, Karlsruhe
Doppelt destilliertes Wasser Roth, Karlsruhe
Glycerol, > 99,5%, p.a. Roth, Karlsruhe
HCl 1N Merck, Darmstadt KCl > 99,5% p.a.. Roth, Karlsruhe
KH2PO4, wasserfrei, p.a. Roth, Karlsruhe
Na2HPO4, wasserfrei, p.a. Roth, Karlsruhe
NaCl p.a. Merck, Darmstadt
Tris-Puffer p.a. Roth, Karlsruhe
Xylencyanol Roth, Karlsruhe
ANHANG 267
V. Tabellenverzeichnis
Tabelle Seite
Tabelle 1: 60 Nachweis von Jaagsiekte Retrovirus RNA und proviraler DNA aus Probenmaterial natürlich und experimentell infizierter Tiere mit klinischer Lungenadenomatose (PALMARINI et al. 1996b)
Tabelle2: 62 Nachweis von JSRV proviraler DNA aus Probenmaterial von Tieren mit klassischer und atypischer Lungenadenomatose (LA) sowie klinisch gesunden Kontakttieren (GONZALEZ et al. 2001)
Tabelle 3: 81
Altersstruktur der Schlachttiere aus LA-positiven Herden Tabelle 4: 82 Übersicht der Lämmer aus der Tütsberger Herde, von denen regelmäßige Blutentnahmen erfolgten
Tabelle 5: 103 Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer für die U3 LTR PCR
Tabelle 6: 104 Reagenzien für die U3 LTR PCR
Tabelle 7: 104 Zeit-Temperaturprogramm für die U3 LTR PCR
Tabelle 8: 106
Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach PALMARINI et al. 1996b) und Schmelzpunkte der Primer der hn PCR
268 ANHANG
Tabelle Seite
Tabelle 9: 106
Reagenzien für die hn PCR
Tabelle 10: 107
Zeit-Temperaturprogramm für die hn PCR
Tabelle 11: 108 Rechnerischer Gehalt an Plasmidmolekülen in 5 µl 1:5 verdünnter Plasmidlösung
Tabelle 12: 110
Bezeichnung, Verwendung, Sequenz (nach DEWAR und SHARP 2000, pers. Mitteilung) und Schmelzpunkte der Primer für die Glycerinaldehyd–3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH)-PCR
Tabelle 13: 111
Reagenzien für die GAPDH PCR
Tabelle 14: 111
Zeit-Temperaturprogramm für die GAPDH PCR
Tabelle 15: 122
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe A
Tabelle 16: 123
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe B
Tabelle 17: 124
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe C
ANHANG 269
Tabelle Seite
Tabelle 18: 125
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Tiere der Gruppe D
Tabelle 19: 126
Einteilung der Sektionstiere aus positiven Herden in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde
Tabelle 20: 128
Einteilung der Schlachttiere aus positiven Herden in Kategorien anhand der pathologisch-anatomischen und histologischen Lungenbefunde
Tabelle 21: 129
Ergebnisse der pathologisch-anatomischen und pathohistologischen Untersuchung der Lungen der Schlacht- und Sektionstiere aus der Schneverdinger Herde
Tabelle 22: 130 Vorkommen anderer Lungenerkrankungen in der Schneverdinger Herde
Tabelle 23: 136
makroskopische Beurteilung der Lungenspülproben
Tabelle 24: 138
Konzentration und Reinheit der aus verschiedenen Probenarten gewonnenen DNA
Tabelle 25: 140
Prozentsatz positiver Reaktionen der Plasmidkontrollen in der U3 LTR und der hn PCR vor dem Hintergrund von Wasser
Tabelle 26: 142
Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Gewebeproben)
270 ANHANG
Tabelle Seite
Tabelle 27: 142
Ergebnis der Inhibitionskontrollen (Blutproben)
Tabelle 28: 145
Ergebnis der Inhibitionskontrollen (BAL-Proben)
Tabelle 29: 145
Zusammenfassung der Inhibitionskontrollen für alle Probenarten
Tabelle 30: 147
Vergleich der OD260/OD280 für mit verschiedenen Verfahren aus mit JS7-Zellen versetzten Proben isolierter DNA
Tabelle 31: 151
Nachweisgrenze der U3 LTR PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Tabelle 32: 152
Nachweisgrenze der hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben
Tabelle 33: 153
Nachweisgrenze der U3 LTR und hn PCR am Modell mit JS7-Zellen versetzter Rinderblutproben bei Verwendung von Finnzymes dNTP’s
Tabelle 34: 159
Probenübersicht (positive Herden); Anzahl mit der PCR untersuchter Proben von Schlacht- und Sektionstieren der verschiedenen Kategorien
Tabelle 35: 160
Ergebnis der PCR-Untersuchung von Lungenspülproben von Tieren der Kategorie I
ANHANG 271
Tabelle Seite
Tabelle 36: 161
Ergebnis der PCR-Untersuchung von Blutproben (Buffy-Coat) von Tieren der Kategorie I
Tabelle 37: 161
Ergebnis der PCR-Untersuchung von Gewebeproben des Ln. mediastinalis caudalis von Tieren der Kategorie I
Tabelle 38: 162
Ergebnis der PCR-Untersuchung von Tumorgewebe bzw tumorverdächtigem Gewebe von Tieren der Kategorie I
Tabelle 39: 162
Ergebnis der PCR-Untersuchung von makroskopisch unverändertem Gewebe von Tieren der Kategorie I
Tabelle 40: 163
Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie II
Tabelle 41: 164
Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL- und Gewebeproben von Tieren der Kategorie IV
Tabelle 42: 165
Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der vier PCR-positiven Tiere aus Kategorie IV (histologisch negativ)
Tabelle 43: 168
Relative Sensitivität der PCR-Untersuchung (Tiere der Kategorie I und II) im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen)
272 ANHANG
Tabelle Seite
Tabelle 44: 168
Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die Gesamtheit der Tiere der Kategorie IV
Tabelle 45: 169
Relative Spezifität der PCR-Untersuchung im Vergleich zur systematischen Histologie (vier Lungenlokalisationen), berechnet für die richtig-negativen histologischen Befunde der Tiere der Kategorie IV Tabelle 46: 170
Ergebnis der PCR-Untersuchung von BAL-, Blut- und Gewebeproben von klinisch LA-unverdächtigen Tieren der Kategorien I und II
Tabelle 47: 172
Übersicht über die Untersuchungsergebnisse der histologisch fraglichen Tiere
Tabelle 48: 174
Ergebnisse der klinischen, pathologisch-anatomischen und histologischen Untersuchung der Tütsberger Lämmer und molekularbiologische Untersucnung der Lungenspülproben
Tabelle 49: 175
Ergebnisse der PCR-Untersuchung der Blutproben sowie Gewebe- und BAL-Proben von vier ausgewählten Lämmern
Tabelle 50: 177
Sektionsbefunde verendeter Tiere > 6 Monate aus der Döhler Herde (Herbst 2000 bis Ende 2003)
Tabelle 51: 180
makroskopische und histologische Untersuchungsergebnisse von Tieren mit histologischem Verdacht auf bzw. histologisch nachgewiesener LA aus der Döhler Herde
ANHANG 273
Tabelle Seite
Tabelle 52: 182
Weiterführende Untersuchungen bei Tieren mit positivem oder fraglichem histologischem Ergebnis
VI. Abbildungsverzeichnis
Abbildung Seite
Abbildung 1: 80 Altersstruktur der Sektionstiere aus LA-positiven Herden
Abbildung 2: 92
Lokalisation der vier Standard-Lungengewebeproben für die histologische Untersuchung
Abbildung 3: 131
Altersverteilung klinisch an LA erkrankter und LA-verdächtiger Heidschnucken (Gruppen D und C)
Abbildung 4: 132
Altersverteilung LA-positiver Heidschnucken (alle Erkrankungsstadien)
Abbildung 5: 143
Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der U3 LTR PCR mit Plasmid versetzter Blutproben.
Abbildung 6: 144
Elektrophoretische Darstellung des Ergebnisses der hn PCR mit Plasmid versetzter Blutproben.
274 ANHANG
Abbildung Seite
Abbildung 7: 148
vergleichende elektrophoretische Darstellung der PCR-Produkte von mit verschiedenen Verfahren zur DNA-Extraktion präparierten, mit JS7-Zellen versetzten Rinderblutproben
Abbildung 8: 155
Agarosegel vor Durchführung des Southern Blot
Abbildung 9: 156
Geblottete Nitrozellulosemembran
ANHANG 275
VII. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt
Martin für all die Räume, seine Menschlichkeit und Unterstützung, seinen Einsatz für meine
Finanzierung, die Ermöglichung zweier Gastaufenthalte in Schottland, seine Toleranz
gegenüber dem Wunsch, unbedingt nebenbei arbeiten zu müssen sowie sein Engagement in
der „heißen Phase“
Mike Sharp, Pat und Chris sowie allen Mitarbeitern des Moredun Research Institute für die
Gastfreundschaft, eine Einführung in die Tücken der PCR, gute Ideen und die Überlassung
von Positivkontrollen, sowie ganz besonders Pat für Ihren Sarkasmus und ihren Humor
Korinna für positive Energie, ihre stete Hilfsbereitschaft, die Überwindung von
Institutsgrenzen und ihre Funktion als „PCR-Beraterin“
Michael für die hervorragende Zusammenarbeit bei den Sektionen und die Begutachtung
ungezählter Schaflungen, obwohl er Lungenadenomatose langweilig findet...
Ilona und Bea für ihre Blutspenden
Andreas und Tobias für ihre Gastfreundschaft in der Lammzeit und danach, sowie für ihre
Küche, ihre Waschmaschine und zahlreiche Heideausflüge
Silvio, Uwe mit Familie und Herrn Salzmann für ihr trotz mancher Vorbehalte gegen „die
Wissenschaft“ großes Engagement für die Sanierung, sowie Mützen, warme Eier, Lektüre
und Kuchen im kalten Schafstall
Allen Lammhelfern für ihren Einsatz, durchwachte und durchfrorene Nächte und den Spaß,
den wir hatten
276 ANHANG
Der Landschlachterei Albers, Egestorf, besonders Herrn Ewald Albers für Kaffee, das
Tragen zu kleiner Handschuhe, eine Fortbildung in Sachen vorbildlicher Schafschlachtung
und seine unkomplizierte Mitarbeit
sowie den Mitarbeitern der Landschlachterei Meier, Behringen, ebenfalls für die Mitarbeit
bei der Probennahme und ein Kontrastprogramm
Klaus für seinen unglaublichen Einsatz und seine guten Ideen, seine unbezahlbare Hilfe bei
der Entnahme der Lungenspülproben und unterhaltsame Heidefahrten,
sowie Klaus und Sandra für die Entnahme der Lungenspülproben im Sommer 2003
Babs für Puffer und Lösungen, Sabine für ihren Kampf mit den Lungenspülproben, sowie
zusätzlich Jutta, Antje und Thekla für gute Laune im Labor
Elke für den Steri und ihren Erfindergeist sowie Herrn Fiedler und Herrn Richter für
unzählige Fahrten zur Patho
Tanja, Klaus, Thorsten, Steffi und Saskia für die Versorgung zahlloser Heidschnucken
allen nicht namentlich genannten Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere für das
gute Arbeitsklima
Jan, Arnim und „Schweinchen Dick“ für Unterstützung rund um den Apfel
Gordon für seinen Küchentisch, beständige Kritik, Platz im Gefrierschrank, Garp, die
schönen Seiten des Lebens, sowie Gordon und den „Jungs“ für den Heimwerkerkurs
Korinna, Martin Runge, Isa und Ursula für wertvolle Anregungen, Alexandra für Hilfe beim
Blot und Hakan für eine Übersetzung aus dem Türkischen
sowie last but not least Frauke für Gemüsesuppe und „Ben Hur“ (den ich im übrigen bis
heute nicht gesehen habe...)!!!