Arch. exper. Path. u. Pharmakoh, Bd. 230, S. 513--523 (1957)

Aus dem Pharmakologischen Institut der Universit~t Erlangen (Direktor: Prof. Dr. F. HEJ~'~)

Ausseheidungsprodukte des Salyrgans im Harn

Von I~RED LEUSCHNER

Mit 2 Textabbildungen

(Eingegangen am 8. Februar 1957)

Ffir das Verst~ndnis der pharmakologischen Wirkung des Salyrgans ist es yon Bedeutung, die S t ruk tu r und die zeitliche Yolge der Queck- s i lberverb indungen zu kennen, die im I-Iarn nach Verabreichung yon Salyrgan ausgeschieden werden. Aus der genauen K e n n t n i s der chemi- schen Zusammense tzung dieser Verb indungen k5nnen ffir die cellul/tre B indung des Hg in der Niere Hinweise erwarte t werden.

Als Ausscheidungsprodukte des Sa]yrgans ve rmu te t M6LLER ( I u n d II) das ungespal tene oder wenig veri tnderte Molekfil. Auch fiber die Aus- scheidungsprodukte anderer organischer Hg-Diure t ika liegen nur wenig Kenntn i s se vor (HA~DLEY II) . So wurde in jfingster Zeit gefunden, dab nach Mercuhydr in zwei noch zu identifizierende organische Hg-Verbin- dungen im H a m auf t re ten (HA~DL]~Y I I I ) .

) I e t h o d i s c h e r T e i l

1. Anreicherung und Reinigung der Hg-Verbindungen im Harm Jeweils 100 m Harn wurden auf 0 ° C abgekiihlt und zentrifugiert. Es lieB sich ein Kristallbrei ab- trennen, der nach einmaliger Waschung mit Wasser bei 0 ° C ann~hernd Hg-frei war. ])as t3bcrstehende wurde in gefrorenem Zustand zur Trockne gebracht und nacheinander mit 3 ml und 2 ml Wasser und 1 ml l°/~)iger w/~Briger Ammoniak- 10sung extrahiert. Aus dieser LSsung liel~ sich mit 6 Volumen Aceton eine nach zweimaliger Waschung praktisch Hg-freie Fraktion abtrennen. Eine sich gleich- zeitig absetzende braune, Harnfarbstoffe enthaltende Fliissigkeit wurde mit dem Uberstehenden abgegossen. Der weitaus gr61~te Teil des Hg konnte nun durch weiteren Zusatz yon 14 Volumen Aceton gewonnen werden. Neben dem Boden- k6rper fanden sich in tier Regel noch wenige Tropfen der braunen, Hg-haltigen Fliissigkeit. In VVasser oder in l°,~)iger w/il]riger Ammoniaklbsung aufgenommen, eignet sich dieser Riickstand zur Papierchromatographie.

2. Papierchromatographie. Alle Untersuchungen wurden auf SchL & Sch.- Papier Nr. 2043b bei Zimmertemperatur ausgefiihrt. Vom Harn wurden 50--120 #l - - vom Konzentrat entsprechend weniger - - mit Mikropipetten auf das Papier auf- getragen und im kalten Luftstrom getrocknet. Die Zusammensetzung der L6sungs- mittelgemische ist aus der Tab. 1 zu entnehmen.

3. Die quantitative Hg-Bestimmung erfolgte nach GI~FI~I u. GEROSA. Die Hg-Bestimmung in Chromatogrammflecken wurde nur in Papieren vorgenommen,

Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 230 35

514 IF. LEtSCHNEt~ :

die mit n/10 H(:I gewt~schen nnd gut mit bidestilliertem Wasser gespiilt worden waren. Der Leerwert der Papiere sehwankte zwischen 0,1 und 0,6 ,ug Hg/cm 2.

4. Nachweis [unktioneller Gruppen auf dem Chromatogramm: a) Sulfhydrylgruppen nach TOE:~=~IES U. KOI:B. Reagens I: 1,5 g Nitroprussid-

na t r ium gelOst in 5 ml 2nH~SOa + 95ml Methanol + 10ml 25~!ifige w~grige Ammoniakl6sung, filtrieren und in der K/tlte aufbewahrcn. Reagens I [ : 2 g KCN gel6st in 5 ml Wasser -- 95 ml Methanol. SH-Gruppen werden durch Eintauchen in das Reagens [ nachgewiesen. Zur F~rbung yon l)isulfiden und leieh~ spaltbaren Hg-Mercaptiden ~ird mit Reagens I I nachbehandelt .

Tabelle 1. Ldsun(tsmitle@'misch(~ /~r die Tren~tu~f! d~,r Hg-Verb~;~ldungen im Har~ u~d die ldentijizieru~g de,~ ('ysteins und Cy~'tin¢s.

Zllst~lillilellSl!t zllng Ilei' |ASsungslllittelgomist!he Bemerkungen

Aeeton : 10°oige w~tl~rige Ammoniak- 10sung (85 : 15)

Pyridin : Wasser (65 : 35) Sek. Butanol : 99-100~!0ige Ameisen- sDmre : \Vasser (75 : lq,2 : 11,8)

96°0 iger/~thylalkohol

Propanol-(1) : 10~!oige w/~grige Ammo- niaklSsung (85 : 15)

Absteigende Methode, in 20 Std ge- niigende Auftrennung der Harnver- bindlmgen.

Aut~teigende Methode. Aufsteigende Methode, mit und ohne H~S- oder N2-Atmosph~tre.

Aufsteigende Meghode, mit und ohne H2S- oder N~-Atmosph~re.

Absteigende Methode, in 20 24 Std ~entigende Auftrennung der Harnver- bindungen.

b) Hg-Nachweis mit I) iphenylthiocarbazon (Dithizon). Die Papiere werden mit einer LSsung gesprayf, die 0,5 mg Dithizon/ml Chloroform enth~It. Oanz besonders naeh alkalisehen Steigfliissigkeiten mug das Chromatogramm mit n/10 HCI an- ges~uert werden, um die roten Fleeke auf grimem Orund hervortreten zu lassen.

c) Hg-Naehweis mit Kupferjodid. Reagens I: 5 g K J und 20 g Na~SO:~ • 7 H~O in 100 ml Wasser gel6st. Reagens I I : 5 g C u S Q • .5 H20 in 100 ml n HCI gel6st. Hg fiihrt zu orangeroten Flecken.

d) Ninhydrinreaktion. Reagens: 200 mg Ninh3drin werden in 95 ml Butanol mid 5 ml 2 n Essigs~ure gelSst.

5. Die UV-Aufnahmen wurden mit einem Spektraliflmtometer Beckman I)U ausgefiihrt.

6. Pr~parati<m der Salyrganverbindungen: a) Salyrgan-L(-b)-Cystein (1 : 1). 121 mg (1 mMol) L(:+ ).Cystein wurden in

20 ml n/10 NaOH unter Zusatz yon 506 mg (1 mMot) Salyrgan (theophyllinfrei) get6st. Das Salyrganmereaptid wurde zwisehen 6 und 18 Volumen Aeeton ausgef/~ltt, mi t Acet, on und Ather gewasehen und fiber Ca012 aufbewahrt. Papierehromato- graphie: Eigenschaften der HauptDakt ion in Tab. 2 und 3. Die mengenmi~gig geringen Nebenkomponenten (Tab. 5) enthielten alle Hg und SH-Gruppen, die sieh nach KCN-Behandlung nachweisen liegen.

b) Beim Versueh der Prg=paration der Salyrgan:Cystin-Verbindung wurden 121 mg (0,5 mMol) L(--)-Cyst in in 20 ml n/10 NaOH unter Zusatz yon 506 mg (1 mMol) Salyrgan (theophyllinfrei) gel6st. Die weitere t I andhabung erfolgte wie beim Salyrgan-Cystein.

Ausscheidungsprodukte des S~lyrg~ns im H~rn 515

c) Zur Darstelhmg der schwefelh~ltigen Vergleichssubst~nzen der H~rnfr~ktion 2 wurden jeweils 0,1 m~[ol der in Tab. 4 genannten Verbindungen unter Zusa~tz yon 51 mg (0,1 rnMol) S~lyrgan (theophyllinfrei) in 2 ml n/10 N~OH gel6st. Positions- konst~ntcn in T~b. 4.

Ergcbnisse und Besprechung Anreicherung und teilweise Reinigung der Hg-Verbindungen aus

menschlichem H a m . Um eine gleichmS~6ige Zusammensetzung der Harn- ausscheidungsprodukte des Salyrgans zu erzielen, erhielten die Versuchs- personen i.v. 2,5 mg Salyrga.n (theophyllinfrei)/kg KSrpergewicht, eine

70

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Abb_ 1. O e s a m t - H g - A u s s c h e i d u n g im nienschliclien l ]~rn (in % der ve rabre ich ten S0.1yrgt~li- Dosis) in den ers tcn 24 S td nach der in t r avenSsen ln j ek t ion yon 2,5 illg Sa lyrgan/kg KSrpergcwicht und Z u s a m m e n s c t z u n g tler p a p i e r c h r o m a t o g r a p h i s c h ge t renn ten Harnf i :ak t ionen ("/, des in 24 S td mi t dcm H a m ausgeschiedenen t tg) . [ ] H a r n f r a k t i o n 1, • H a r n f r a k t i o n 2, [ ] } t a rn f rak t ion 3 und 4,

[ ] ] [ a r n f r a k t i o n 5. Mit te lwer te aus 3 bis 6 B c s t i m m u n g e n

Dosis, die zu einer ausgepr/igten Diurese fiihrCe. Es wurden nur Personen zum Versuch herangezogen, deren Harn ein pH zwischen 6,2 und 7,4 aufwies. Die gem/ig Abb. 1 gesammelten Harnproben wurden bis zur endgiiltigen Verwendung in gefrorenem Zustand tmfbewahrt. Die Hg- Bestimmung in den Proben ergab Konzentrationen, die in Abb. 1 zu- sammengestellt sind. Dana ch haben im Mittel 50°~ des am ersten Tag nach der Salyrganinjektion ausgeschiedenen Hg die Niere nach etwa 90 rain passiert.. Diese Beobachtungen entsprechen den in der Literatur mitgeteilten Befunden (MOLLSU I I ; BVRCg u. Mitarb.).

Der Hgrn lg~t sich unmittelbar zur papierchromatogr~phischen Trennung verwenden, wenn die Hg-Konzentr,~tion 0,02~io iibersteigt.

35*

5 1 6 F. LEusCHNER:

H a r n p r o b e n mi t n iedr igerem Gehal t wurden durch Gef r ie r t rockmmg angereicher t . Ffir die Ident i f iz ierung der Aussehe idungsproduk te erwies sich neben der Konzen t r i e rung eine zus'gtzliche Reinigung yon beglei ten- den H a r n s u b s t a n z e n als vor te i lhaf t .

Der Versueh, die Hg-Verb indungen mi t verschiedenen organischen LSsungsmi t te ln aus dem H a r n zu ext rahieren , ver l ief negat iv . Die Reini- gung wurde deshalb durch mehrs tuf ige f rak t ion ie r te Fgl lung vorge- nommen. Dabe i liel3 sich eine nmorphe K o m p o n e n t e gewinnen, die an- nghernd das gesamte Hg enthiel t . I n ihr lagen die Hg-Verb indungen in einer Zusammense t zung vor, die der jenigen des H a m s en tsprach (wie sieh du tch pap ie reh romatograph i sehe Unte rsuehungen naehweisen lieg). AufsehluBreieh sind die Ergebnisse der H g - B e s t i m m u n g : I m Harn , der in der ers ten S tunde naeh der Sa ly rgan in jek t ion gesammel t worden war, be t rug die H g - K o n z e n t r a t i o n im Mittel 0,038(~) (~ : 5), in der gereinig- ten, a eetongef'gllten F r a k t i o n 3,2 -15, l ~)o, im Mit te l 7,5'~' o (n 5). Eine UmfSllung der P r / ipa ra te dureh L6sen in Wasser und Zusatz yon Aeeton oder ~thyl~flkohol ffihrte n icht zu reineren P roduk ten .

Papierchromatographi~che 7'rennung der Harnausscheidungspro- dulcte. Fi i r die Auf t r ennung dieser organischen Hg-Verb indungen des Harr is sind neut ra le oder alkal ische L6sungsmit te lgemische erforder- lich. Wie in Vorversuchen festgestel l t werden konnte , f / ihr t die An- wendung yon S'auren zum Zerfall der Verbindungen. Von den a lka l i schen Steigfl i issigkeiten zeigte ein Aceton- oder Prop~mol-(1)- Gemisch mi t Ammonbfl~ die g{instigsten Eigenschaf ten . Abhgngig yon der Zeit, in de," die H a r n p r o b e gesammel t worden war, ]iel3en sich his zu 5 Fr~k t ionen tmft rcnnen und mi t Di th izon ats Hg-Ver- b indungen nachweisen.

In normalem Harn wurde unter diesen Bedingungen in keinem FMle eine Fgrbung mit Dithizon beobachtet, (lie zur Vortguschung yon Hg hgtte AnlaB geben kSnnen. Wegen der begrenzten Spezifitgt des Hg-Nachweises mit Dithizon wurden trotzdem Kontrolten mit dem empfindlichen Kupferjodid-Reagens ausgefiihrt. Die Ergebnisse deckten sich mit denjenigen des Dithizons. Gegen die regelmggige An- wendung der Kupferjodid-Methode zum Hg-Nachweis sprich~ (tie rasehe gelbbraune Verfgrbung der Chromatogramme, in der (tie orangeroten Fleeken des Hg ver- sehwinden.

I n Tab. 2 sind die Pos i t ionskons tan ten der ~mfgetrennten F r a k t i o n e n angegeben. E inen quan t i t a t i ven i )be rb l i ek fiber die K o m p o n e n t e n ge- s t~ t t e t die Abb. 1. I n ihr sind als S//ulen die Hg-Mengen aufgetr~gen, die aus der q m m t i t a t i v e n Bes t immung der Chromatogrammfleeke ffir die Ha rnpo r t i onen bereehnet werden konnten .

Zwisehen dem Gesamt-Hg der Harnprobe und der Summe der aufgetrennten Hg-f'raktionen lgBt sieh in fast allen Fallen eine wesentliehe DitI~renz entdeeken. Sie betr/igt im Mittel fiir alte Harnproben 16°~> Ihre Ursaehe kann tells im mangel- haften Auftrennungsverfahren und tells in Hg-Verbindungen, die sieh dem Naehweis entziehen, gesueht werden.

Ausscheidungsprodukte des Salyrg~ns im Harn 517

Aus Abb. 1 is t fernerhin zu en tnehmen , dab in de r 24 S tunden - t t g - Bi lanz 2 F r a k t i o n e n vorherrschen. Die i ibr igen Verb indungen t r e t en mengenm//Big weir zurfick. Die fo lgenden Abschn i t t e en tha l t en Un te r - suchungen, die der S t r u k t u r a u f k l ~ r u n g dieser zwei grSBten K o m p o n e n - t en (F rak t ion 1 und 2) im H a r n dienen sollen.

Tabelle 2. Hg-Komponenten im /rischen Harn nach Salyrgan-In]ektion

Aceton: NHB Hg - - S H UV- l 'co,~st Dithizon nach KCN ]Yinhydrin Absorption

Harnfraktion 1 100 ~ - - - - Harnfraktion 2 54 -[- ~ --

(gelbraun) 34--37 ~- + 1 21--23 ~ _L 1

Salyrgan . . . : : 0 - - 4 _1_ ( V ~-' )1 1 ~00 -4- 54 + Salyrgan-L(+ )-Cystein ~- ~-

(gelbbraun) Entfernung des Fleckes vom Startpunkt × 100

Pconst Entfernung des Salyrgans (Vergleichssubstanz} vom Startpunkt

Harnfraktion 3 . . Harnfraktion 4 . . Harnfraktion 5

289 nm 289 nm

1 1

289 nm 289 nm

1 UngewiB wegen zu geringer Konzentration.

Identi/izierung der Fraktionen 1 und 2. Die Unte r suchung der Salyr- ganaussche idungsp roduk te se tz t Methoden voraus , mi t denen der Nach- weis des unve r~nde r t en Sa lyrganmolekf i l s m5glich ist. Geeignet s ind daf i i r die Wande rungsgeschwind igke i t au f dem P a p i e r c h r o m a t o g r a m m , der I~achweis des J ig und des Benzolkernes im Salyrgan . Die beiden zu- l e tz t genann ten Besonderhe i ten des Molekfils - - H g - A t o m und der Ben- zolkern des Salicyls/~urerestes - - schliel~en durch ihre endst~indige Lage im Sa ly rgan das Molekiil g le ichsam zwischen sich ein. U n t e r der Vor- aussetzung, dab die Bindung der beiden Se i t enke t t en im Sa ly rgan (-OCH~ und -OCH2COOH ) sehr s tab i l ist, k a n n be im gleichzei t igen Vor- l iegen al ler Kr i t e r i en au f das unver~nder te Sa ly rgan geschlossen werden.

0 OCH~ Salyrgan

Die Rt-Werte und Positionskonstanten des Salyrgans sind ffir mehrere

LSsungsmittelgemische in Tab. 3 zusammengestellt.

Ffir den Nachweis des Salicyls~urerestes im Salyrgan fanden sich

keine Farbreaktionen mit ausreichender Empfindlichkeit. Salyrgan zeigt

jedoch im UV-Bereich eine charakteristische Absorptionsbande bei

518 F. LEKSCHNER:

289 nm. Sie kann dem Benzolkern (B-Bande) im Salieylsi iurerest zu- geordne t werden. Der Ext inkt ionskoeff iz ien t s t immt mi t dem der vergleiehsweise un te r such ten SMicylsiiure fiberein. Die geringe Verschie- bung zur kurzwel l igen Seite kann mi t pa raeh romen Effekten du tch die Subs t i tuen ten der Carboxyl- und H y d r o x y l g r u p p e gedeute t werden. Das H g s t6r t die Absorp t ion in diesem Spekt ra]bere ich nicht. Abb. 2 zeigt das U V - S p e k t r u m des Salyrgans, der Salicyls/ iure und tier Harn f rak - t ionen 1 und 2.

Die Tab. 2 ges t a t t e t den Vergleieh der Ha rn f r ak t i onen mi t den Eigen- sehaf ten des Salyrgans . Von den 5 K o m p o n e n t e n zeigt die am schnel |s ten wtmdernde (F rak t ion 1 ) Ube re ins t immung mi t dem unver~nder ten Mole- kill. Die I d e n t i t ~ t lieI~ sich sowohl in wei teren - - in Tab. 1 genannten ...... Steigflfissigkeiten als aueh m~ch Misehung des Ansa tzes mi t Sa lyrgan be- st3tigen. Bei der Mischung zeigte sich eine F leekvers t~rkung , abe t kein neuer F leck .

Tabelle 3. Rf_Werte und Positionskonstanten von de~ Harn/rak:tionen l und 2 im Vergleich mit synthetischen Sal crganverbindungen und Cystein und C!]stin

A

A c e t o n : N t t a

Peonst a

I-larnfraktion 1 . . . 100 Salyrgan . . . . . . 100

P y r i d i u : W a s s e r

R f

C D ! E sek.But, ano l : [ sek. B u t a n o l : !

I A lne i s ens i i u r e : iAmei sens i i u r e : : ' i~thylalko- Wasse r o h n e ] W a s s e r l n i t hol : Wt~sser

IL.~S I L S N~ t l r l~f Rf

0,64 0,93 0,64 0,93

I-Iarnfl';~ktion 2 . . . . Salyrgan-L(+)-Cystein Salyrgan-L(--)-Cystin L( ~- )-Cystein . . . . L(--)-Cystin . . . . .

i In HgS.

54 54 54 37 a 23

0,54 0,54 0,54

4

0

0,04 0,05 0,05 0,48

0

3 ] ) (ons t - - siehe Tat). 2.

1

t

2

'2

2

0,26 0

Im wesentliehen in HgS und Cystein. 4 Sehwanzbildung.

0,12 0,12 0,13 0,12 0,12 0,28

0

Die im H a m anzutref fenden Mengen an unver i inder tem Salyrgan (Abb. 1) sind gering und liegen weir h in ter der F r a k t i o n 2 zuriiek. Diese Komponen te , die sieh analog dem Sa lyrgan dureh den H g - G e h a l t und die Abso rp t ion bet 289 nm (Abb. 2) auszeiehnet , besi tz t eine langsamere Wanderungsgesehwind igke i t (Tab. 2). H g - G e h a l t und Abso rp t ion bet 289 nm lassen auf einen AbkSmml ing des SMyrgans sehliegen. U m die E igensehaf ten dieser Subs tanz kennenzulernen, wurde auf dem Chroma- t o g r a m m die Pr i i fung au f versehiedene funkt ionel le A tomgrupp ie rungen vorgenommen. Dabe i lieB sieh feststellen, dag diese Subs tanz naeh Be- hand lung mi t K C N eine posi t ive R e a k t i o n auI SH- Gruppen mi t Nat i ' ium- n i t rop russ id und eine ge lbbraune F/ / rbung mi t N inhydr in gab.

Ausseheidungsprodukte des Salyrgans im Ham 519

Mit Natriumnitroprussid reagieren fast aussehlieBlich nur freie Sulfhydryl- gruppen. Sind diese Gruppierungen gebunden, so k6nnen sie in vielen F~llen dutch Behandlung mit Alkalien, Cyaniden, Sulfiten, Sulfiden oder H2S freigelegt werden und nunmehr mit Natriumnitroprussid reagieren. Aueh aus leieht spaltbaren Hg- Mereaptiden gelingt es naeh eigenen Erfahrungen, mit KCN die SH-Gruppe fiir Natriumnitroprussid reaktionsf£}lig zu maehen.

Naeh diesen Voruntersuehungen konnte die Fraktion 2 im H a m ein Mereaptid des Salyrgans mit einer Verbindung sein, die eine ninhydrin- positive Aminogruppe enth/~lt. Der Substanzfleek aus dem H a m wurde

a,6

1,0

E

o,8

3,2

z,$

i [

g,8

4z

L 260 280 JO0 • TL~ 32P

b

i b b . 2a. Absorptionsspektren yon Salyrgan (1) und SalicylsEure (2) (in Wasser) Abb. 2b. Absorptionsspektren dcr Harnfraktioncn 1 und 2 nach teilweiser Reinigung (in Wasser)

deshalb mit Salyrganmercaptiden bekannter schwefel- und stickstoff- haltiger Verbindungen papierchromatographisch verglichen. Lediglich eine Verbindung des Salyrgans mit Cystein bzw. Cystin, die wegen ihres gelbbraunen Ninhydrinfleckes bereits in die engere Wahl gezogen worden war, zeigte gleiches Verhalten wie die Substanz aus dem Harn. In Tab. 4 sind die gefundenen Positionskonstanten fiir die einzelnen Ver- bindungen angegeben, die auf einem Chromatogramm entwickelt wurden.

Wenn anhand der ehromatographischen Wanderungswerte in ver- schiedenen LSsungsmittelgemischen und der Farbreaktionen fiir funk- tionelle Gruppen die Identi t~t der Frakt ion 2 mit dem Salyrgan-Cystein bzw. -Cystin eine gewisse Wahrscheinliehkeit erhalten konnte, so war doch die Anwendung eines mSglichst spezifischen Naehweises ftir diese beiden Aminos~uren wiinschenswert. Dieser Beweis wurde durch die papierehromatographische Isolierung des Cysteins naeh Spaltung des Sa]yrganmereaptides gefiihrt.

Es ist bekannt, da6 die Kohlenstoff-ttg-Bindung im Salyrgan in saurer L6sung instabil wird (M6LLER I I I ) . Aueh in eignen Vorunter- suchungen konnte die Zerlegung der Ausscheidungsprodukte des

520 F. LEusCH~E~:

Salyrgans im angesb;uerten H a r n in niedermolekulare Hg-Verbindungen papierchromatographisch beobachtet werden. Bei Z immer tempera tu r spaltet sich im Laufe von S tunden neben anderen u n b e k a n n t e n Verbin- dungen das Hg-Salz des mi t dem Salyrgan reagierenden Thiols ab. Aus dieser B indung 1/il3t sich das Hg durch H2S freisetzen (NEUBERa U. KER~) und der organische Rest papierehromatographisch in verschiede- hen L6sungsmit te lgemischen als Cystein nachweisen (Tab. 3). Die Ent - wieklung mug zum Schutze des Cysteins un te r N 2- oder H2S-Atmo- sph/ire erfolgen. Bemerkenswert ist, dag das synthetische Salyrgan- Cystein ein vSllig gleichartiges Verhal ten zeigt. Auch beim Zusatz yon Salyrgan-Cystein zum sauren Salyrganharn bildet sich lediglich eine Fleckverst ' / /rkung aus.

Tabelle 4. Papierchron~atographischer Vergleich verschiedener Salyrganmercaptide

Hg-Verbindungen bei der i Aceton : Reakt ion w)n Salyrgan in NH3

alkalischem ~[ilieu mi t i Pconst2

Glutathion . . . . : 2--51 Ergothionein . . . a) 5

b) 42 Cysteinamin . . . 268 L( ~)-Cystein . . 54 L(=--)-Cystin . . . 54

1 Geringe Schwanzbildung. 2 p ..... t -- siehe Tab. 2.

H g St[ (Dithizon) i (nach KCN)

!

÷ i=

÷

_ r _

÷

Nach Mi)TI~G werden tiiglich mit dem Harn 36--92 mg (ira Mittel 62 mg) freies Cystin und 77--154 mg (im Mittel 110 mg) peptidgebundenes Cystin ausgeschieden. Um eine Tguschung durch diesen natiirlichen Aminos/~uregehMt zu verhindern, wurden ]eere Harnproben der Versuchspersonen aus der Zeit unmittelbar vor der Salyrganinjektion unter gleichen Bedingungen gepriift. In 2 yon 10 Proben lieI] sieh eine Spur Cystein, das durch die intensive H2S-Einwirkung entstanden sein kann, entdecken. Diese Mengen standen jedoch in keinem Verhgltnis zu den Ausbeuten im Salyrganharn. Der normale Cystingehalt des NormMharns liegt in der Regel unter der Empfind]ichkeitsschwelle bei der angewendeten chromatographischen Methode. Gegen eine fehlerhafte Beeintr/ichtigung durch diesen norma]en Cystingehalt sprieht fernerhin, dab sieh die Wanderungsgeschwindigkeiten des Cysteins bzw. Cystins von denen des Salyrgan-Cysteins bzw. der Harnfraktion 2 unterscheiden.

Aus den bisher beschriebenen Nachweismethoden von Cystein und Cystin ist n icht ohne weiteres auf das Vorliegen entweder der einen oder der anderen Aminos'~ure zu schliel3en. Als Folge der kriiftigen H~S-Be- hand lung im sauren H a r n kann ein (3bergang yon Cystin in Cystein s ta t t f inden, so dal3 am Ende der Aufarbe i tung das nattirl iche P roduk t verschwunden sein kann. Zur Entsche idung dieser Frage wurden die Sa ly rganverb indungen der beiden Aminosi iuren pr/ipariert und mi t der Harn f rak t ion 2 verglichen.

Ausseheidungsprodukte des Salyrgans im Harn 521

Im Salyrgan-L(T)-Cystein betr/~gt das molare Verh~ltnis der Komponenten 1:1. Die Zusammensetzung wurde auf papierchromatographischem Wege ermittelt, in dem bei der Darstellung die Partner in verschiedenen molaren Verh~ltnissen zu- sammengegeben wurden und ihr Verbleib kontrolliert wurde. Die Identifizierung er- folgte mit den beschriebenen Methoden. Neben Salyrgan-Cystein (1 : 1) bilden sich weitere drei recht schwache Fraktionen (Tab. 5). Alle drei sind S- und Hg-enthaltende Substanzen. Das Verh/~ltnis der Reaktionsprodukte zueinander verschiebt sich mit abnehmender Wasserstoffionenkonzentration zugunsten des Sa]yrgan-Cysteins (1 : 1).

Beim Versuch die Salyrgan-Cystin-Verbindung zu pr/~parieren ent- stand ein Komplex, der im molaren Verh/Cltnis Salyrgan : Cystin = 1 : 2/2 die giinstigste Ausbeute zeigte und in seinen chromatographi- TabelleS. 5Teben/raktionen bei der Priipa- schen und f/irberischen Eigen- ration yon Salyrganmercaptiden.

LSsungsmittelgemische A (Tab. 4) schaften mit demjenigen des Salyrgan-Cysteins (1:1) tiberein- ~eb~n- Salyrgan- ,,Salyrgan- stimmte (Tab. 3). Um f e s t z u - fraktion L(÷)-Cystein L(--)-Cystin"

i)const L rconstl

stellen, ob eine eehte Identit/~t 1 145 145 der beidenVerbindungen besteht, 2 34 34 wurden sie unter Bedingungen ge- 3 18 (18) spalten und chromatographiert, 1 Pconst = siehe Tab. 2. die zu keiner Umwandlung des Cystinsin Cystein ffihrt. In einem stark sauren LSsungsmittelgemisch unter H2S-Atmosph/Cre reagieren die Salyrganverbindungen w/~hrend der papier- chromatographisehen Auftrennung mit H~S. Die Atmosph/~re schfitzt dabei Cystein vor der Oxydation, reicht dagegen nicht zur Reduktion des Cystins aus. Beim Vergleich mit beiden Aminos/~uren ergab sich, dai~ sowohl aus Salyrgan-Cystein ( l : l ) als auch aus Salyrgan-Cystin (1:1/2 ) Cystein abgetrennt werden kann (Tab. 3, D). Aus diesem Versuch und den f/~rberischen und ehromatographischen Eigenschaften der Verbindung kann geschlossen werden, daft bei der Reaktion yon Salyrgan mit Cystin im wesentlichen Salyrgan-Cystein entsteht. Eine Best/~tigung dieser An- nahme finder sich in Untersuchungen yon PREISLE~ U. PREISLgR, ANDREWS U. WYMAN und SIMONSEN an analogen Disu]fiddicarbon- s/~uren. Danach tritt bei der Einwirkung yon Hg-Verbindungen auf diese S~uren eine Disproportionierung in Mereaptid und Sulfonat ein. Die Umsetzung verl~uft nach folgender Gleiehung (BLACKBURN U. CHALLEN- GER, CHALLENGER U. RAWLINGS):

3 HOOC--CH2NH 2 - C H 2 - - S - - S - - C H 2 - N H 2 CH 2 --COOH-~ 3 H20--> 5 ttOOC --CH~NH 2 - -CH 2 - - S H -~ H 0 0 C --CH~NH 2 --CH~ --S03H.

Nach den vorgelegten Ergebnissen verhalten sich die beiden wich- tigsten Salyrganausscheidungsprodukte im t tarn wie Salyrgan-Cystein und unver/indertes Salyrgan. Die Ausscheidung des Mercaptids erfolgt haupts~chlich in der ersten Stunde nach der Injektion des Salyrgans und ist in der Regel mit der 3. Std abgeschlossen (Abb. 1). Salyrgan

522 F. LEUSCHNER:

finder sieh dagegen noch Each 8 S td im H a m mi t einem Max imum in der 2. Std. Von besonderem Interesse is t es, die Ausscheidung dieser Sub- s tanzen mi t der Diurese ill Verb indung zu setzen. Seit SaXL u. HEILIG ist bekannt , dab die Harn f lu t mi t einer zei t l ichen Verz6gerung hinter der Hg-Aussche idung folgt. Nachdem etwa 30~)'~) der am ers ten Tage ausge- schiedenen Hg-Menge die Niere berei ts pass ier t ha!)en ( innerhalb 45 bis 60 rain Each der In jekt ion) , se tz t die Diurcse ein. Aus den Bes t immun- geE des Hg auf dem Chroma tog ramm (Abb. 1) is t ohne weiteres zu er- sehen, dab die Hg-Ausscheidung vor der Diurese p rak t i sch yore Salyrgan- Cystein bes t r i t t en wird. Mit der Diurese nahezu paral le l 1//uft dagegen die geringe Sa lyrganausscheidung.

Aus der bisherigen Mitteilung ist nicht zu entnehmen, ob das Salyrgan-Cystein ein echtes Aussdmidungsprodukt neben dem freien Salyrgan ist oder ob die Mercap- tidbildung auf (Irund der ReaktionsmSglichkeiten im Hare erfolgt. Zur K1/~rung dieser Frage wurde Normalharn mit Salyrgan versetzt und bei 37 ° C inkubiert. Die Salyrgankonzentration war so gewghlt, dab sie den Ausseheidmlgsverhgltnissen Each i.v. Injektion entspraeh. Naeh 1 stiindiger Inkubation entstand in 6 Versuchen hSchstens 260ug Salyrgan-Cystein (1 : 1)/ml Harm Im Mittel reagierten 6oo des zugesetzten Salyrgans mit SH-Gruppen, wghrend in vivo am Ende der ersten Stunde EaCh der Injektion etwa 800o ale Salyrgan-Cystein im Ham vorliegen (Abb. 1). l)er Oft der Mercaptidbildung wird demnach in Abschnitten des Organis- mus zu suchen sein, in denen die J3indung des Hg erhebliches toxikologisches und pharmakologisches Inte~esse fiir den Wirkungsablauf besitzt.

Die l~eakt ionsf reudigkei t des H g und seiner Verb indungen mi t Sulf- h y d r y l g r u p p e n wird seit l 'angerer Zeit zur Deutung der Wi rkung im Organismus und andererse i t s auch zur Behand lung der Hg-Vergi f tung herangezogen (WALKER ; EAGLE ; BARRON U. SINGER ; SINGEP~ U. BARRON ;

STOCKEN U. TIIOMPSON ; LONG U. FARAH ; HANDLEY U. LAFORGE ; ~[ARESH

u. FARAH). Eine wichtige Erg~inzung dieser Beziehungen des Hg zu SH- Gruppen im Organismus haben die Unte r suehungen yon BAnRO~- U. KALNITZKY, HANDLEY I u n d HANDLEY u n d SLAVIK gebracht . In der Niere und im Herz wird die Berns te ins~ure-Dehydrogenase , ein F e r m e n t der E n d o x y d a t i o n der Brenz t raubens~ure mi t funkt ionswicht igen SH- Gruppen, durch org~nische Hg-Verb indungen gehemmt.

Die Ausscheidung des Salyrgans alE Cyste in-Verbindung bedeu te t eine weitere Best~t igung, dab im Organismus t ro tz Vielzahl der Reak- t ionsm6gl ichkei ten ffir Hg die S H - G r u p p e und ganz besonders das Cv- s te in eine Sonders te l lung e innimmt. Inwiewei t die Verb indung des Salyr- gans mi t Cystein u n m i t t e l b a r ffir den Diu reseab lau f bedeu tungsvol l ist, beda r f wei terer Kli~rung.

Summary

Af ter in t ravenous inject ion of Mersaly], up to five Hg-compounds could be sepa ra t ed from the h u m a n urine b y means of paper chromato- g raphy .

Ausscheidungsprodukte des Salyrgans im Harn 523

T h e e x c r e t i o n o f these subs t ances was s t u d i e d in t h e i r t e m p o r a l o r d e r

b y q u a n t i t a t i v e ana lys i s o f t h e m e r c u r y in t h e spo t s o b t a i n e d b y c h r o m a -

t o g r a p h y . I t cou ld be s h o w n t h a t t h e t w o l a rges t f r a c t i o n s b e h a v e d l ike M e r s a l y l - L ( ~ - ) - e y s t e i n e ( i : 1 ) a n d l ike u n c h a n g e d Mersa ly l .

I d e n t i f i c a t i o n o f t h e Mersa ly l was poss ible b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ,

b y d e t e r m i n a t i o n o f t h e m e r c u r y , a n d b y s p e e t r o p h o t o m e t r i e iden t i f i ca - t i on o f t h e benzene r ing. T h e c o m p o s i t i o n o f t h e M e r s a l y l - c y s t e i n e was

d e t e r m i n e d b y c o m p a r a t i v e e x p e r i m e n t s w i t h s y n t h e t i c M e r s a l y l - c y s t e i n e a n d by i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e p a r a t e d a m i n o acid.

Herrn Prof. Dr. F. HEL'~ danke ich ftir die FSrderung und Diskussion der Arbeit. Salyrgan (theophyllinfrei) wurde fl'eundlieherweise yon den Farbwerken Hoechst A.G., Frankfurt(M)-Hoeehst, zur Verfiigung gestellt.

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Dr. F. LEUSC~ER, Pharmakologisehes Inst. d. Univ. Erlangen