Hauptseminar Biophysik der Systeme
Crime Scene
DNA
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Hauptseminar Biophysik der Systeme
Konvektive Polymerase Kettenreaktion
14.11.2007
Martina BucherSebastian Karpf
Hauptseminar Biophysik der Systeme
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Englisch: Polymerase Chain Reaction Millionenfache Vervielfältigung von DNA Erzwungene, kontrollierte Replikation DNA-Polymerase „produziert“ Kopien In vitro
PCR
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Gliederung
Grundbausteine der PCR Theoretische Grundlagen Schritte des PCR-Prozesses Was ist Konvektion? Bedingungen für Konvektion Aufbauten Anwendungsgebiete Zusammenfassung
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Grundbausteine der PCR
DNA Primer DNA-Polymerase Pufferlösung dNTP-Mix
Quelle: Wikipedia.de
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DNA – Träger der Erbinformation
Doppelhelix 4 heterozyklische Nukleobasen
– Purine: Adenin und Guanin– Pyrimidine: Thymin und Cytosin
Desoxyribose Phosphatreste Wasserstoffbrückenbindungen
Quelle: Wikipedia.de
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Primer
Einsträngig Keine Wiederholung von Motiven Länge: 20-30 Nukleotide GC-Gehalt: 40-60% cfrei/cgebunden = e(-G(T)/kT)
G(T) = H-TS Schmelztemperatur Tm: G(T) = 0 Tm = 2°C•(A+T)+4°C•(C+G) (Näherung)
Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum, Dieter Braun
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DNA-Polymerase
Allgemein: Enzyme für Polymerisation von Nukleotiden
Mit und ohne Korrektur-Funktion Für PCR meistens Tag-Polymerase
(Bakterium Thermus aquaticus) Außerordentlich hitzebeständig
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Pufferlösung und dNTP-Mix
Volumenregulation Chemische Umgebung:
– PH-Wert– Ionenkonzentration:
Mg2+-Ionen für DNA-Polymerase
dNTP-Mix: Bausteine für DNA-Strang
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Theoretische Grundlagen
cTemplate << cPrimer
Anstieg der Zahl der Kopien exponentiell Zahl der Duplikate dominant Zahl der Kopien nach n PCR-Zyklen:
N = (2n-2n) • N0
mit 2n: Zahl der Produkte des 1. und 2. Zyklusses
Quelle: F-Praktikum
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Schritte des PCR-Prozesses
(1) Denaturierung
(2) Primerhybridisierung
(3) Elongation
(4) Ende des 1.Zyklus
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Schritte des PCR-Prozesses
(1) Denaturierung (94-96°C): Schmelzen der DNA
(2) Primerhybridisierung (Tm-5°C): Andocken der Primer an das komplementäre DNA-Stück
(3) Elongation (72°C): Verlängerung
(4) Ende des 1.Zyklus
Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum
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2. Teil: Konvektive PCR
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Was ist Konvektion?
Konvektion (lat. Convehere = mittragen) = Fließen von Teilchen bzw. Flüssigkeiten aufgrund von Temperaturgradienten
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PCR durch Konvektion
Für die Polymerase Kettenreaktion
werden zyklisch-periodische
Temperaturstufen benötigt
Konvektion schafft diese Zyklen!
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Konvektive PCR versus Herkömmliche PCR
Vorteile: Schnelle Amplifikation Nur 2 Temperaturen nötig Nicht so träge, da keine großen Heizelemente
benötigt werden
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Konvektionsbedingungen I
Wichtige Eckpunkte für Konvektion: Fließgeschwindigkeit v Fließlänge L Viskosität Reynolds Nummer
Quelle: Wikipedia.de
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Konvektionsbedingungen II
Für Konvektion muss die Reynoldszahl unter 1000 liegen
Dies bedeutet:– Kleines v, Kleines L– Großes
– Zur Erinnerung:
Quelle: Wikipedia.de
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Konvektionsbedingungen III
Größe der Reaktionskammern müssen zwischen 100 m und einigen cm liegenDarunter: Diffusionsprobleme
Darüber: nicht-laminarer Fluß
D.h. Konvektion kann über bis zu 6 Größenordnungen durchgeführt werden
(L3 106) Bei gutem Verlauf Verdoppelung der DNA nach
jedem Zyklus
(=Zyklusperiode)Quelle: (1), (2)
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Aufbauten
Drei Beispiele für Konvektionskammern:a) Kreisrohr (circular pipe)
b) Rayleigh-Bénard-Zelle
c) Zylinderzelle (cylindrical chamber)
zu a)
zu b)
zu c)
Quelle: (1), (2)
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a) Kreisrohr (circular pipe)
Vorteile: • gesamtes Volumen zirkuliert• niedriger Energieverbrauch
(Batteriebetrieb möglich)
Nachteile:• Parabolisches Fließprofil
stark unterschiedliche Perioden der Amplifikationszyklen
Quelle: (1), (2)
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b) Rayleigh-Bénard-Zelle
Konvektionskammer zwischen 2 geheizten Platten.
Es bilden sich Konvektions-Zirkulationen.
Quelle: (1), (2)
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b) Rayleigh-Bénard-Zelle
ΔT < ΔTkrit,1 : Viskosität überwiegt
Konvektionsströmung ΔTkrit,1 < ΔT < ΔTkrit,2 : Es treten regelmäßig
geformten Konvektionszellen auf, die Bénard-Zellen
ΔTkrit,2< ΔT : Das System gelangt ins Chaos
Quelle: Wikipedia.de
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b) Rayleigh-Bénard-Zelle
Vorteile: einfacher-kompakter Aufbau
Nachteile: Viel Energie für Heizplatten benötigt
Quelle: (1), (2)
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c) Zylinderzelle
Erklärung anhand der Versuchsaufbauten gefunden in:(1) „Exponential DNA Replication by Laminar Convection“Von Dieter Braun et al., 2003
(2) „PCR by Thermal Convection“ von Dieter Braun
Quelle: (1), (2)
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Arbeit von Dieter Braun
Infrarotlicht (1480 nm) im Zentrum des 1mm x 5mm großen Zylinders
Umgebungstemperatur 52°C
Errechnete Reynoldsnummer für: laminaren Fluss Länge L 2mm Viskosität von Wasser 1mm2/s typische Geschw. v 0,4mm/s
ergibt Re 1Quelle: (1), (2)
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Ergebnisse
Bereits nach 25 Minuten ergab sich 100.000-fache Amplifikation
DNA ließ sich durch Fluoreszenzmarker visualisieren
Gewünschte DNA-Amplifikation über Gelelektrophorese überprüft und bestätigt
Quelle: (1), (2)
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Visualisierung der DNA
• Interkalierende Fluoreszenzmarker binden nur an doppelsträngige DNA
• Man erkennt die Amplifikation der DNA• Dunkle Stellen deuten auf Einzelstränge hin• Nach Auschalten des IR-Lichtes verschwand
der schwarze Punkt im ZentrumQuelle: (1), (2)
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Visualisierung der DNA
Quelle: Dieter Braun
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Analyse durch Gelelektrophorese
Vergleich mit DNAbekannter Länge bestätigt,dass 100bp DNA-Sequenzenamplifiziert wurden.
Die Probe nach 0 min zeigt keine 100bp Sequenzen.
Quelle: (1), (2)
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Temperaturabhängigkeit
Quelle: (1), (2)
Temperaturabhängigkeit
der PCR wurde
durch kontinuierliche
Leistungsänderungen
der Infrarotquelle
bestimmt. (bei bestimmter Bahn z0=50m)
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Video der zylindrischen konvektiven PCR
Quelle: Dieter Braun
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c) Zylinderzelle
Vorteile: Sehr schnell (25 min für 100.000-fache
Amplifikation) Hohe Effizienz (50%), da gutes
Strömungsverhalten Geringe Energie benötigt
(Batteriebetrieb möglich) Nur optisch, keine Heizkontakte nötig
Quelle: (1), (2)
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Anwendungsgebiete
Genetischer Fingerabdruck Vaterschaftstest Erkennung von Krankheiten Klonierung von Genen Mutagenese Analyse alter (fossiler) DANN Geschlechtsbestimmung Pränataldiagnostik
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Zusammenfassung
PCR vermehrt exponentiell eine gewünschte DNA-Sequenz, wobei nur kurze Sequenzen amplifiziert werden können
Konvektive PCR ist high-speed PCR Einfache Designs Kostengünstige Möglichkeit Sehr kleine Versuchsaufbauten möglich