Der erfolgreiche Einsatz von total porösen 1.8 um Partikel und teilporösen Poroshell und teilporösen Poroshell Säulen in 400, 600 und 1200 bar LC-Systemen
Dr. Ulrike JegleProduktspezialistinSäulen und Verbrauchsmaterialien
Was ist das Geheimnis der U/HPLC-Partikel?
Gemeinsamkeiten und Unterschiede:Poroshell 120 superficial Partikel
Page 2
Poroshell 120 superficial Partikel total poröse 1.8 um Partikelin Theorie und Praxis
Theoretische Bodenhöhe
H = A + B/u + C x u
grosse Partikel kleine Partikel
1.8 um
Je kleiner die theoretische Bodenhöhe HETP
desto besser die Auflösung R!
Poroshell 120
Voraussetzung ultra-schnelle und ultra-effizienteU/HPLC – kleinste Partikel
Page 3
Theoretische Bodenhöhe
HETP
Linearer Fluss u
Mehrwegs-Term
Eddy Diffusion
Resulting Van-Deemter Kurve
Massentransfer
H = A + B/u + C x u
u opt
H min
Longitudinale Diffusion
C Term der van Deemter Kurve: Massentransfer
Abweichungen im Diffussionspfad in die Poren der Partikel
Page 4
Poröses Partikel
Statische mobile Phase
Gross, total poröser Partikel
Klein, total poröser Partikel
300 Poroshell 5 µm fester Kern, poröse Schicht
Die Diffusionsgeschw. grosser Biomoleküle ist Faktor 10 kleiner verglichen zu kleinen Molekülen
Partikeltyp – Bodenzahl
Page 5
ReduzierterDiffusionspfad
0.25 µm2.5 µm5 µm 1.8 µm
ReduzierterDiffusionspfad
Poroshell 120 2.7umfester Kern, poröse Schicht
0.5 µm
ReduzierterDiffusionspfad
Die Kerne besitzen eine uniformeGrösse und eine glatte Oberfläche
Dies führt zu einer engenPartikelgrössenverteilung – engerals das mit total porösen Partikelnmöglich wäre
Ein Coacervation Prozess wird in einem
Herstellung von Poroshell 120 Partikeln
Page 6
Ein Coacervation Prozess wird in einemeinzigen Schritt durchgeführt, nicht wiesonst üblich in einemMehrschichtprozess.
In einem Coacervation Prozess werdenkleine Sol-Partikel aggregiert um den Partikel zu formen.
Massentransfer und Eddy Diffusion werden optimiert.
Pla
te H
eigh
t
Verschiedene Diffusionspfade
A Term: Eddy Diffusion
Page 7
Pla
te H
eigh
t
Lineare Geschwindigkeit
verschiedene Länge Packqualität
A Term – Eddy Diffusion / Mehrwegsdiffusionabhängig von Partikelgrösse, Partikelgrössenverteil ung, Packqualität des Betts
PartikelgrössenverteilungTotal Poröse Partikel und Poroshell 120 Partikel
Van Deemter Plot 2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)
van Deemter
0.0015
0.002
0.0025
0.003
HE
TP
(cm
)
Eclipse Plus C18, 3.5 µm
Eclipse Plus C18, 1.8 µm
Poroshell 120 C18, 2.6umPoroshell 120 C18, 2.6 µm
Poroshell 120 C18, 2.7 µm
Page 9
0
0.0005
0.001
0.0015
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Flow rate (mL/min)
HE
TP
(cm
)
Poroshell erreicht ca. 90% der Trenneffizienz von s ub2 micron Partikeln
40,0
50,0
60,0
70,0
Pea
k C
apac
ity
Average Peak Capacity
Poroshell 120 EC C18
Peakkapazität2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)
June 17, 2011Confidentiality Label
10
0,0
10,0
20,0
30,0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Pea
k C
apac
ity
Flow Rate (ml/min) scaled gradient
Competitor C18 2.5 um
Eclipse Plus C18 5 um
Eclipse Plus 3.5 um
Eclipse Plus C18 1.8 um
Formel: Pc=1+ (tp-to)/1.699*(pw @ half height).
Poroshell 120 EC C182 ml/min 220 BarPc Ave=54
minminminmin0 1 2 3 4 5 6
mAUmAUmAUmAU
0
10
20
30
40
50
60
0.35
6
0.70
7
1.34
9
1.81
5
3.04
4
4.17
1
4.41
0
4.54
1
4.86
3
5.28
6
5.51
95.
605
6.14
4
Eclipse Plus C18 RRHTmAUmAUmAUmAU
Peakkapazität2.7 um Poroshell Partikel (120 A) - total poröse 1.8um (80A)Säulen: 4.6 x 50mm Flussrate: 2 mL/min
June 17, 2011Confidentiality Label
11
minminminmin0 1 2 3 4 5 6
Eclipse Plus C18 RRHT2 ml/min 364 BarPc Ave=61
minminminmin0 1 2 3 4 5 6
mAUmAUmAUmAU
0
10
20
30
40
50
60
0.34
8
0.76
4
1.53
1
2.04
2
3.30
9
4.38
8
4.62
6
4.78
1
5.17
7
5.47
9
5.72
75.
809
6.31
7
Probe: Hydroquinone, Resourcinol, Catechol, Phenol, 4-Nitrophenol, p-Cresol, o-Cresol, 2-nitrophenol, 3,4 di methyl phenol, 2,3 di methyl phenol, 2,5 di methyl phenol, 1 -napthol
2 ml/min
Time % B
1 1 5
2 8.5 60
3 10 60
4 11 5
Bedingungen: Compounds were combined in equal volum es to yield approximately 0.1 mg/ml in Wasser, 10ul InjektionSäule: 4.6 x 50 mm, A: 0.1 % Ameisensäure in Wasser, B: Acetonitril, Detektion: 270 nm, no reference
Rückdruck : superficial – total porös2.7um Poroshell 120 ca. 40% kleiner als 1.8um total po rös
400
500
600
Pressure, 60/40 CH3CN/H2O
Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USCFX01009)
Ascentis Express
Poroshell 120 EC-C18
Kinetex1.8 um
June 17, 2011
Confidentiality Label12
0
100
200
300
0 2 4 6 8 10 12
Pre
ssu
re (
ba
r)
u (mm/s)
(USCFX01009)
Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USKJ001754)
Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um
(501286-43)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8
um (USUYB01455)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5
um (USUXV01435)
3.5 um
Rückdruck: Poroshell 120 - Sub 2-micron
Poroshell 120
EC-C18
2.7 um
P = 332 Bar
Säulen: 4.6 x 100 mmA: Wasser 0.1% AmeisensäureB: Acetonitrile 0.1% AmeisensäureGradient 2 ml/minInitial 8 % B10 min 30% B275 nm 2mm FlusszelleInjektion: 10 uL Agilent 1200 SL 40 °C
1. Hydroquinon2. Resorcinol3. Catechol4. 4-Nitrophenol5. p-cresol6. o-cresol7. 2-Nitrophenol8. 2,3 Dimethyl
phenol9. 2,5 Dimethyl
phenol10. 1-Naphthol
10
12
34 5
67
8
9
Agilent RRHT zeigt einen geringeren Rückdruck als die meisten sub 2um Säulen, aber für Poroshell 120 ist er noch geringer.
Page 13
min0 2 4 6 8 10
min0 2 4 6 8 10
RRHT Eclipse Plus C18
1.8 um
P = 510 Bar
10
4 56 7
8
9
12
3
Poroshell 120 liefert ähnliche Effizienz wie sub 2- micron aber bei geringerem Rückdruck.
Beladbarkeit der Poroshell 120
0,3
0,4
0,5
0,6
Pe
ak
Wid
th (
s)
Acid Loading with Benzoic Acid
Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USCFX01009)
Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USKJ001754)
Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um pKa = 4.19
June 17, 2011
Confidentiality Label14
0
0,1
0,2
0,01 0,1 1 10 100
Pe
ak
Wid
th (
s)
Concentration of Benzoic Acid (mg/mL)
Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um
(501286-43)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8
um (USUYB01455)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5
um (USUXV01435)
85% 25 mM Na2HPO4 Puffer, pH 3.0 15% Acetonitril
275 nm, 30 °C
pKa = 4.19
Superficially poröse und total poröse Säulen eine ähnliche Beladbarkeit.
Beladbarkeit der Poroshell 120
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Pe
ak
Wid
th (
s)
Base Loading with Dextromethorphan
Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USCFX01009)
Supelco Ascentis Express C18, 3.0 mm x 100 mm, 2.7 um
(USKJ001754)
pKa = 8.3
June 17, 2011
Confidentiality Label15
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,001 0,01 0,1 1
Pe
ak
Wid
th (
s)
Concentration of Dextromethorphan (mg/mL)
(USKJ001754)
Phenomenex Kinetex C18, 4.6 mm x 100 mm, 2.6 um
(501286-43)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 1.8
um (USUYB01455)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18, 3.0 mm x 100 mm, 3.5
um (USUXV01435)
80% 25 mM Na2HPO4 Puffer, pH 3.0 20 % Acetonitrile205 nm, 30 °C
Superficially poröse und total poröse Säulen eine ähnliche Beladbarkeit.
Peakform und Tailingfaktor – Qualitätskriteriumstationärer Phasen
mAU
60
80 Poroshell 120
Poroshell 120 EC C18 Tf = 1.48Ascentis Express Tf = 2.68Kinetex Tf = 4.78
Amitryptilin
June 17, 2011Confidentiality Label
16
min0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
0
20
40 KinetexAscentis Express
Säulen: 4.6 x 50mm, Mobile Phase: 20 mM 40% Na2HPO4, pH 7.00 60% Acetonitril Flussrate: 1.5 mL/minProbe: 2 uL Injektion von 250 ug/mL Amitriptylin , 50 ug/mL Uracil in H2O/CH3CN (9:1) Temp: 24°C Deteckor 254nm, 2-uL Flusszelle
Poroshell 120 Säulen für HPLC und UHPLC:
• 80-90% der Trenneffizienz von “sub 2um”• bei ~40-50% geringerem Rückdruck• Partikelgrösse: 2.7um • Fritte: 2um Porengrösse für minimiertes
Verstopfungspotential
Beschreibung: Poroshell 120
Verstopfungspotential• Druckgrenze: 600 bar
• Der superficial Partikel hat einen festenKern (1.7um) und eine poröseAussenschicht von nur 0.5 um
June 17, 2011Confidentiality Label
17
RRHD und RRHT Säulen für HPLC und UHPLC Maximale Trennleistung
• 100% der Trenneffizienz• Höherer Rückdruck (Dimension, Solvent, T)
• Partikelgrösse: 1.8 um • Fritte: 0.2/0.3 um Porengrösse• Druckgrenze: 600 bzw 1200 bar
• Beschreibung: sub 2 um total porös
June 17, 2011
Confidentiality Label18
• Druckgrenze: 600 (RRHT) bzw 1200 bar (RRHD)
• Der Partikel ist total porös und hat damitden klassischen Aufbau für ultra-reineKieselgelmaterialien.
Rapid Resolution High Definition RRHD
1.8 µm Partikel in 1200 bar Säulen-Hardware ideal für 1290 Infinity LC Systeme
StableBond C18/C8, SB Phenyl, SB CN und Eclipse Plu s C18/C8, Eclipse XDB C18, Extend C18,
Rapid Resolution High Throughput RRHT
Optionen für U/HPLCWelche Partikel in welchem Säulentyp?
Page 19
Rapid Resolution High Throughput RRHT
1.8 µm Partikel in 600 bar Säulen-Hardware mehr als 140 Optionen
StableBond, Eclipse XDB, Eclipse Plus, Bonus RP, E xtend C18
Poroshell 120
Superficial Partikel in 600 bar Säulen-Hardware
StableBond C18 and EndCapped EC C18/C8
Ultra-schnelle und ultra- hoch effiziente Analysen Wann nutze ich welche Säule?ultra-schnelle Analyse:
• Hoher Probendurchsatz oder Bedarf für schnelle Resultate
• kurze, generische Gradienten
• Kurze Säulen
• Hohe Flussrate
ultra-hoch auflösende Analyse:
• Komplexe Proben, Bedarf jede Komponente zu trennen
• lang dedizierte Gradienten
• lange Säulen
• „normale“ Flussrate
Page 20
• 1.8 um Partikel
partikel- / matrix- haltige Proben:• 2.7 um Poroshell • Säulen für Proben, die die Fritte der 1.8 µm- Partik el-Säulen blockieren würden und schnelle Analysen
• Hohe Auflösung bei moderatem Druck
• 1.8 um Partikel und 2.7 um Poroshell
Sub 2um versus Poroshell 12017 Aminosäuren auf 1290 Infinity
min0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
mAU
Poroshell 120 EC-C183.0 x 100mm, 2.7um
Pmax=331 barF=0.86 mL/min
RRHT Eclipse Plus C183.0 x 100mm, 1.8um
Rs6,5=1.98
Rs6,5=2.28
Rs14,13=1.81W½ 9 =0.043 min.
.
Group/Presentation TitleAgilent Restricted
Month ##, 200X
min0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
min0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
50
3.0 x 100mm, 1.8um
Pmax=474 barF=0.86 mL/min
RRHD Eclipse Plus C183.0 x 100mm, 1.8um
Pmax=528 barF=0.86 mL/min
Rs6,5=2.28
Rs6,5=2.90
Rs14,13=2.34
Rs14,13=1.81
W½ 9 =0.036 min.
W½ 9 =0.045 min.
Überlegungen zum Einsatz der „sub-2-micron“ und Poroshell120 Säulen in der Praxis - Applikationen
June 17, 2011Confidentiality Label
22
Optimale Flussrate: für Poroshell 120 höher als für 5 oder 3.5 micronErhöhung der Flussrate - kein Verlust an N
June 17, 2011Confidentiality Label
23
Empfohlene Flussratenfür Poroshell 120 Säulen:für 4.6 mm Säulen 2 ml/min für 3 mm Säulen 0.85 ml/minfür 2.1 mm Säulen 0.42 ml/min
Drei Details zu van Deemter Kurven
0.0025
0.0030
0.0035
0.0040
0.0045
HE
TP
(cm
/pla
te)
1. Van Deemter Kurven gelten nur für isokratische Läufe
2. Van Deemter Kurven sind substanzspezifisch3. Van Deemter Kurven sind auch für sub-2- µm
oder Poroshell 120 Partikel nicht horizontal, aber sehr flach
Page 24
-0.0005
0.0000
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
0.0025
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
5.0 µµµµm
3.5 µµµµm
1.8 µµµµm total porös
2.7 um teilporös
HE
TP
(cm
/pla
te)
Interstitial linear velocity ( ue- cm/sec)
Flussratenerhöhung ohne Verlust an Bodenzahl
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
100
200
300
400
5004.6 x 150 mm, 5 µm1 mL/min
min1 2 3 4 5
mAU
0
200
400
600
8004.6 x 50 mm, 1.8 µm1 mL/min
Page 25
min2 4 6 8 10 12 14 min1 2 3 4 5
min0.5 1 1.5 2 2.5
mAU
0
200
400
600
800 4.6 x 50 mm, 1.8 µm2 mL/min
min0.2 0.4 0.6 0.8 1
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700 4.6 x 50 mm, 1.8 µm5 mL/min
Flussratenerhöhung ohne Verlust an Bodenzahl
min1 2 3 4 5
mAU
0
200
400
600
mAU
0
200
400
600
4.6 x 150 mm, 5 µm1 mL/min
4.6 x 50 mm, 1.8 µm1 mL/min
Page 26
min1 2 3 4 5
min1 2 3 4 5
mAU
0
200
400
600
min1 2 3 4 5
mAU
0
200
400
6004.6 x 50 mm, 1.8 µm5 mL/min
4.6 x 50 mm, 1.8 µm2 mL/min
Optimierung der Geschwindigkeit unter Erhalt der Auflösung – pharmazeutische Sulfa-Verbindungen
Methodentransfer
June 17, 2011Confidentiality Label
27
Ursprungsmethode: 4.6 x 250 mm, 5-um Säulepharmazeutische Sulfa-Verbindungen
Agilent 1100, kein Mischer, grüne Kapillaren, Temp.: 30C5 ul injection, 2 ul Flusszelle, Detektion: 254 nm, Datenrate = response time 0.1s
mAU
80
100
kritisches Peakpaar
Rs=1.21Druck = 110 bar
Zeit %B0 830 3333 33
Flussrate: 1 ml/min
A: 0.1 % Formic Acid in WasserB: 0.1 % Formic Acid in MeCN
Eclipse Plus C18, 4.6 x 250mm, 5um
Sulfadiazine,Sulfathiazole SulfapyridineSulfamerazine,Sulfamethazine, Sulfamethazole, Sulfamethoxypyridazine,SulfachloropyridazineSulfamethoxazole, Sulfadimethoxine
Methodentransfer auf Poroshell 120 EC-C18 zur Beschleu nigung unter Erhalt derAuflösung des kritischen Peakpaares
min5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
33 3334 8
Methodentransfer auf eine 100 mm Poroshell 120 EC C18
4.35
6
4.69
1Druck = 172 bar
Time %B0 810 3311 3312 8
Angepasste ParameterSäule: Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100mm, 2.7umInjektion: 5 ul auf 2 ul
Zeit: (100/250 x30 min) = 12 minFlussrate: 1 ml/minGradient:
kritisches Peakpaar
Rs=1.21
min2 4 6 8 10 12
3.63
3 4.21
8
4.69
1
5.61
3
5.98
1 6.06
4
7.46
0
8.27
0
10.4
00
Druck = 172 bar
Beschleunigung > Faktor 2 unter Erhalt der Auflösung des kritischen Peakpaares
2.43
0
2.82
62.
921
3.14
5
3.77
4
4.01
74.
075
5.00
2
5.53
9
6.97
4
Time %B0 8
6.7 337.4 33
1.5 ml/min
Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100mm, 2.7um
Methodentransfer: weitere Beschleunigung durch Flussra te
angepasste Parameter
min2 4 6 8
min2 4 6
1.82
1
2.12
12.
192
2.35
8
2.83
3
3.01
03.
055
3.73
9
4.13
5
5.21
9
Flussratenerhöhung unter Erhalt der Gradientensteilheit – Beschleunigung unter Erhalt der Auflösung
Time %B0 85 335.5 33
2.0 ml/min
Druck < 400 bar
Optimierung der Auflösung bei optimal hoher Flussrate zur schnellst möglichen hochauflösenden Analyse - Phenole
June 17, 2011Confidentiality Label
31
Trennung: 12 Phenole auf Poroshell 120 EC-C18
Instrument: 1200 SLSäule: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 50mm, 2.7umMobile Phase:Solvent A: Wasser with 0.1% AmeisensäureSolvent B: AcetonitrilTemp.: 25 °CGradient::Time %B0.8 5%6.8 60%Detektion: 2 mm Flusszelle
1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol
274 bar, 2.5 ml/mintrotz der hohen Flussrate
min0 5
gute Trenneffizienz, gute Auflösung und schnell, aber k eine Basislinientrennung des kritischen Peakpaares -> höhere Auflösung?
Höhere Auflösung durch längere Säule
mAU100
Instrument: 1200 SLSäule: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 100 mm, 2.7umMobile Phase:Solvent A: Wasser with 0.1% AmeisensäureSolvent B: AcetonitrilTemp.: 25 °CGradient::Time %B2.0 5%17 60%Detektion: 2 mm Flusszelle
1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol
2.0 ml/min, 394 bartrotz der hohen Flussrate und der langen Säule
20
40
60
80
min2 4 6 8 10 12
0
sehr gute Trenneffizienz, sehr gute Auflösung aber wenige r schnell -> höhere Auflösung?
Höhere Auflösung durch längere Säule
2 mL/min
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
20
40
60
80
100
120 P = 538 bar
Instrument: 1200 SL, Säulen: Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 150mm, 2.7um Mobile Phase: Solvent A: Wasser with 0.1% Ameisensäure Solvent B: Acetonitrile Temperatur: 25 °C, Deteketionszelle: 2 ul
1. Hydroquinon2. Resourcinol3. Catechol4. Phenol5. 4-Nitrophenol6. p-Cresol7. o-Cresol8. 2-Nitrophenol9. 3,4 Di methyl phenol10. 2,3 Di methyl phenol11. 2,5 Di methyl phenol12. 1-Napthol
für 600 bar Drucklimit
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
min0 5 10 15 20 25 30 35
mAU
0
20
40
60
80
100
120 1 mL/min P = 285 barGradient: 1mL/minTime%B6.0 5%51 60%Gradient: 2mL/minTime%B3.0 5%25.5 60%
12. 1-Napthol
optimaleTrenneffizienz, optimale Auflösung brauchten Z eit, höheres Drucklimit spart Zeit
für 400 bar Drucklimit
Hohe Flussraten auch für optimale Trennungen mit Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18
Methode
Säule ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm
total porös (SN USDAY01001)
Mobile Phase A=0.02% H3PO4, B=Acetonitril/Methanol 3/1
Flussrate 1.6 mL/min
Gradient 0-1.85 min 30-100% B
Injektionsvolumen 1 µL
Detektor Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz
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Detektor Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz
Sig=255/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz
Temperatur 45°C
Probe Antioxidanten ca. 100 ppm
Daten: Gerd Vanhoenacker Forschungsinstitut für C hromatographieKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgien
1.6 mL/min ist eine sehr hohe Flussrate für 2.1 mm ID Säu len
Schnelle Analyse – hohe Flussrate: ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18
mAU
400
500
600
DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
0.4
15
DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)
THBP
Daten: Gerd Vanhoenacker Forschungsinstitut für Chromatographie
RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um, Pmax 1070 barDiese Probe mit 10 Komponenten benötigt einen Gradienten, der zu Drücken über 1000 bar führtAnalysenzeit < 2 Minuten!
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min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
0
100
200
300
0.2
72
0.4
80
0.7
57
0.8
83
1.0
11
1.0
55
1.5
24
1.5
56 1.6
84
PG
TBHQNDGA
BHA
Ionox-100
OGDG
BHT AP
Forschungsinstitut für ChromatographieKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium
Optimale Auflösung für Gradientenanalysen mit RRHD Säulen
Einfache Optimierung :
(αααα - 1)
αααα[ ]Rs = √√√√ N k-FaktorN = Bodenzahl
aaaa = Selektivität
k = Kapazitätsfaktor – isokratische ElutionK* = Retentionsfaktorsfaktor – Gradientenelution
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optimal anwendbar für Säulen im Längenbrereich von 50 – 150mm.
k* =S •••• ∆Φ∆Φ∆Φ∆Φ •••• Vm
tG •••• FEinfache Optimierung : tG = GradientenzeitF = FlussrateVm = Säulenvolumen (Änderungder Säulenlänge)∆Φ∆Φ∆Φ∆Φ = GradientenbereichS = substanzspez. Konstante
Analyse: Süssholzwurzel (Lakriz) auf RRHD Säulen 30 Minutengradienten für jede Säulenlänge
minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAUmAUmAUmAU
0
50
100
150
200
mAUmAUmAUmAU
200
RRHD SB-C18 2.1 x 50 mm, 1.8umPmax=366 barnc = 424
RRHD SB-C18 2.1 x 100 mm , 1.8umRs: 1.37
Rs: 0
Instrument: 1290 InfinityMobile Phase: 10-100% B /30 min A: 0.1% Ameisensä ure B: Acetonitril mit 0.1% Ameisensäure, Flussrate: =0.4 mL/min, Raumtemperatu r, Detektion: 280nm UV
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minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 180
50
100
150
minminminmin0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAUmAUmAUmAU
0
50
100
150
200
RRHD SB-C18 2.1 x 100 mm , 1.8umPmax=595 bar nc = 485
RRHD SB-C18 2.1 x 150 mm, 1.8umPmax=768 bar nc = 589
Rs: 2.40
Rs: 1.37
Analyse: Süssholzwurzel (Lakriz) auf RRHD Säulen 30 Minutengradienten für jede Säulenlänge
50 mm 100 mm 150 mm
7 Peaks 8 Peaks 9 Peaks
Peakkapazität und Auflösung werden durch die Paramet er Säulenlänge und Gradietenzeit optimiert.
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1290 InfinityMobile Phase: 10-100% B /30 min, A: 0.1% Ameisensäu re B: Acetonitril mit 0.1% Ameisensäure, Flussrate =0.4 mL/min, RT, Detektion: 280nm UV
2 4 2 4 6
Rs: 2.40Rs: 1.37
2 4
Rs: 0
7 Peaks 8 Peaks 9 Peaks
Vergleich: Peakkapazität Säulenlänge und Gradientenzeit
10 Minuten 20 Minuten 30 Minuten
Analyse: SüssholzwurzelGradienten-zeit Säulen-
länge
nc= tg/wBasisline des letzten eluierten Peaks 1
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50 313 358 424
100 343 418 485
150 386 483 589
Farbig unterlegte Zahlen entsprechen vergleichbarer Peak kapazität
1. Neue, U.D., et. al, Advances in Chromatography, 41, 93 (2001)
Hochauflösende Analysen: lange 1.8um Säulen
mAU
150
200
DAD1 A, Sig=254,4 Ref=off (E:\090422JWH\PRESSURE000027.D) PMP1, PMP1B, Pressure
Gradient 10-100% B/15 min.Druck 800- 900 barDruck zu Gradientenbeginn ca. 480 bar
Lange Säulen in Serie geschaltet liefern max. Rs fü r komplexe Proben Aromastoffe für geräucherte Lebensmittel
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min0 2 4 6 8 10 12 14
0
50
100
Mobile Phase A: Wasser B:Acetonitril, Flussrate=0.2 5 mL/min, Raumtemperatur, Säule: ZORBAX RRHD, SB-C18, 2.1 x 150+100 mm, 1.8um
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!!