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286 It. 1~. I~ARTI: Der Nachweis yon Myoglobin mittels S~grkeblock-Elektrophorese Klinische Wochenachrift

Tabelle.

~ame A l t e r

N.W.,34 Is~ Soil

T. D., 28 Is~ Soll

B.C., 33 Is~ Soll

L.J., 20 Is~ Soll

K.U.,29 Is~ Soil

U.~. ,40 Is~ Soll

B.H., 20 Is~ Soll

Z.D., 32 Ist Soll

Untersuchung der Lun

#o~ VCO, ~t cm~/ cm~/ m~.-~ m!~-,

1309 272 0,88 2180 I 276 234 0,85 1919 264 250 0,945 2551 217 0,85 262 244 0,93 195 165 0,85 258 213 t 0,825 206 175 0,85 207 173 i 0,835 176 150 0,85 209 186 0,89 211 179 0,85 310 I 23O 0,74 289 245 0,85 243 243

len/unlction bei 8 gesunden Versuch~

~tz ~Q

1840 1775 1872 1355 1780 1434 1453 1226 1480 1248 2105 2012

206 0,85 1700 206 0,85 1700

AV m:_~ AMV c m ~ CI~ ~

645113 1839o 482 16 7720 523 15 7840t 445 16 7140

519 i i 67501 435 16 6970 532 10 53201 360 5770

474 12 15700 308 16 4925 383 16 6130 I 369 16 5900 I 402 18 7230 505 16 8080 404 16 6450 426 16 6810

#alv VD

cm a cm*

5840{2550 515812570 5260[2580 4760 t 2380 538011370 465012320 4410 I 910 385011920 402011680 3285 11640 4170/1960 3940 11965 5200 2030 5390 2690

443012020 4540 2270

)ersonen nach dem beschriebenen Prinzip

VK

c m a

4590 4406 4460 4335 3580 3081 3510 3339 3590 2920 2410 2910 3440 4419 2620 3968

Trunk t SK I c m a % VK

,0o 6608_80 186 78,4 149 105 145 9I

120 140 102 185 123 113 168 126 142

AGW

c m a

122500 110200 125800

60--80 108200 89,5 72 300 60--80 77100 92 59000 I 60--801 83500 75 70500 60--80 73000 81 43 550 60--80 72600 80,5 82300 60--801 110200 62,4 27300 60---80 99300

~p

27,1 28 29,6 28 25,7 28 20,6 28 27,5 28 29,3 28 23,3 28 26,5 28

PCO: alv

mm ltg

40,35 38,0-42,0 41,4 38,0--42,0 39,3 38,0--42,0 41,8 38,0-42,0 37,3 38,0-42,0 38,6 38,0-42,0 38,4 38,0--42,0 40,3 38,0q2,0

Absorbtionsschreiber ,Uras M" der Firma Hurt- mann & Braun fortlaufend registrier~.

Zusammen/assunff. Es wird fiber einen yon uns entwickelgen neuartigen Spirographen auf der Basis des offenen Systems berichtet, der auf einfache Weise die Vorzfige der gesehlossenen ~e~hode (Widers~ands- arrant und sichere I~egistrierung der Ven~ilations- grSBen) mi~ denen der offenen Methode (absolute Kon-

stanz der inspiratorisehen Gasspannnngen) kombinier~, und so insbesondere Ifir Simultanuntersuchungen der Ventilation und der Alveolar- bzw. Blutgasspannungen in t~uhe und unter Belastung geeignet erscheint. Seine Leistungsfghigkeig ist praktisch nnbegrenzt, seine Empfindliehkeit bei Belastungsuntersuchnngen grSl3er als bei Systemen mit grogen Spirome~erglocken. Schematischer Aufbau and Untersuchungsergebnisse sind beigeftigt.

D e r N a c h w e i s v o n M y o g l o b i n m i t t e l s S t i i r k e b l o c k - E l e k t r o p h o r e s e *

Von

H. I~. M~TI A u s d e r ~ e d i z i n i s c h e n U n i v e r s i ~ g t s p o l i k l i n i k B a s e l ( D i r e k t o r : P r o f . D r . O. GSI~]~L)

Einleitung BLONDKEII~ U. Mitarb. I angegebene Aus/dllungs- Der Myoglobin-Nachweis ist vor allem fiir die Er- methode beruht darauf, dab bei 75 resp. 80% Sgtti-

fassung einer Myoglobinurie yon Bedeutung. Bei ver- gung mi~ Ammon_sulfa~ l ib ausgefgllt wird, wghrend schiedenen Zust/~nden kann Myoglobin aus der Musku- Oxy-Mb in L6sung bleibt und auf Grund einer posi- latur in die Blu~bahn fiber~reten, so nach mechanischen riven Benzidinreaktion nachweisbar ist. Die Methode oder elektrischen Muskeltraumata, nach Kgltetraurna, dient aber nur zum Nachweis yon Oxy-Mb, da Met-Mb bei Ischgmie durch ArterienverschluB, bei gewissen ent- ebenfalls ausgefgtlt ~4rd % ziindlichen and degenerativenMuskelerkrankungen,bei Die Untersuehung mittels Ultrazentri/uge setzt der epidemisehen Itaff-Krankheit,, bei endogener StS- einen en~sprechenden teehnisehen Aufwand voraus nnd rung des Energiestoffwechsels in der Muskulatur ~3 and hat zudem den Nachteil, dal~ andere Urinproteine mit schlieBlich bei der idiopatb]sehen Myoglobinurie. Das gleiehen Sedimentationskonstanten das Resulta~ ver- N[yoglobin geht im Blur keine tIaptoglobin-Bindung fglschen k6nnen ~°. einS, s u n d kann dureh andere Plasmaproteine nur bis Die Spektratanalyse erfordert ebenfalls einen er- zu einer Konzentration yon 20--30 rag-% gebunden hebliehen Arbeitsaufwand und ist dadurch erschwert, werden~,S, is. (Jberschreitet der Blutspiegel diese dub die Untersehiede im Spektrum zwisehen Mb and Schwelle, passiert freies Myoglobin das Nierenfilter, t tb sehr geringffigig sind: Oxy-Mb zeigt Absorptions- und es kommt zur Myoglobinurie. banden bei 582 und 544 m,u 2, a gegenfiber denjenigen

DerNaehweis von Myoglobin (Mb)undtIgmoglobin des Oxy-Hb bei 578 und 540 m#, Co-Mb solche bei (Hb) im Urin biet, eg vor ahem bei niedrigenKonzentra- 577 und 540 m# 17 gegeniiber denen des CO-Hb bei tionen und bei gleichzeigigem Vorliegen beider Farb- 572 und 538 m#. Bei lViet-Mb ist die Extinktion vom stoffe gewisse SchwierigkeR~en. Zur Identifizierung pg a.bhgngig a, und reduziertes Mb wie CNMet-Mb k6nnen grundsgtzlich AussMzung, Ultrazentrifuge, unterseheiden sich tiberhaupt nieht yon den entspre- SpektrManalyse and Elektrophorese verwendet wet- chenden Formen des I-Ib a,9. den. Die yon T~I~O~ELL U. DE DUVE ~7 und spgtervon Der elektrophoretisehe Mb-Nachweis ist einfacher;

als 5Iethoden wurden bisher Papierelelctrophorese s,n, * Die Arbeit wurde dutch einen Forschungsbei~rag des l<15,ls,,9,2OundStiirkegel.ElelctrophoreseS, G,~Sverwendet.

Schweizerischen Nationalfonds zur F6rderung der wissen- schaf~lichen Forschung ermSglich~. Dabei karm die Wanderungsgesehwindigkeit des Mb

Jg. 39, l~eft, 6 H.R. N~AgTI: Dcr Naehweis von Myoglobin mittels Stgrkeblock-Elektrophorese 287 15.1K/irz 1961

le ieht mi t der jenigen yon I t b vergl iehen werden. Seit den Un te r suehungen yon S l sa~m u. tVIitarb.~ i s t be- kann t , dal~ Met-Mb bei Paz 8,6 e twas l angsamer wande r t als l i b S . Die 1955 yon KU~K~L und WALLESlUS 7 angegebene Sti~rt:eblock-Etektrophorese ha t fiir die Hb- Un te r suchungen wesentl iche Fo r t s ch r i t t e gebracht , i ndem sic gesta~tet , sehr kleine t { b - F r a k t i o n e n noeh q u a n t i t a t i v nachzuweisen. Der zweifache Vorte i l gegeniiber der Pap ie r - und S t~rkege l -Elek t rophorese l iegt dar in , dab gr6Bere Mengen Mater ia l aufge t ragen und die e rha l t enen F r a k t i o n e n wJeder vo l l s tand ig e luier t werden kSnnen.

In der vor l iegenden Arbe i t wird untersueht , ob die S tg rkeb lock-E lek t rophorese geeignet ist, e inersei ts aueh den d iagnos t i schen Nachweis k M n e r Mb-Mengen zu verfe inern und andererse i t s die exper imente l le Dar- s te l lmlg yon Mb-LSsungen zu vereinfachen.

Eigene Untemuchungen

Material. Es s t anden uns zwei zur Unte r suehung e ingesandte Ur inp roben einer 57j£hrigen Pa t i en t i n mi t pa roxysma le r Myogtobinur ie zur Verf i igung*. Das Mb lag zu 80 bzw. 90% als M e t M b und zu 20 bzw. 10% als Oxy-Mb vor. Die U m w a n d l u n g in C N M e t M b erfolgte du tch Zugabe yon je 1 Tropfen 5 % KaFe(CN)s und 5% K C N zu 3 mI Urin. Als Verg le ichsmater ia l d iente eine selbst hergeste l l te Mb-LSsung aus menseh- Iieher Ske le tmusku la tu r .

MethodiC. Spek~trophotometri.sche Untersuchungen. Alle 1Kcssungen wurden mit einem Beckman Quartz-Spektrophoto- meter vorgenommen mit Cuvetten yon 1 cm Sehiehtdieke. Die Konzentrationsbestimmung yon CNMet-Mb kann dabei naeh der yon B o w ~ 3 verwendeten Formel eriolgen c --: die. Dabei bedeutet c molare Konzentration, d optisehe Diehte bei 540 m#, s = Extinktionskoeffizient 11,3,10 a. Das Molekular- gewieht yon 5fb betragt 17000.

Stgrkeblock-t~le/ctrophorsse. Wit verwenden einen selbst konstruierten Appara t bei dem die Kiiblung dureh eine im Handel crh~ltliehe Kiihlplatte der Firma Therma AG, Sehwan- den (G1) vorgenommen wild. Auf die puffergetrgnkte Stgrke- sehieht yon 3 Inm Dicke (Veronal-Veronal-Na-Puffer p~ 8,6 Ionenstarke 0,075) werden streifenfSrmig Mengen yon 0,05 oder 0,1 ml des Untersuehungsmaterials aufgetragen. Naeh Anlegen einer Spanrmng yon 600 V kommg es zu einem Gleich- strom von 50--70 mA pro Stgrkebloek. Eine Laufzeit yon 14--I8 Std bei + 4 ° C gestatte~ eine gute Auftrennung von Mb und I-Ib. GrSgere Fraktionen sind an ihrer Eigenfarbe erkennbar und k6nnen aus der Stgxke dutch Aqua bidest, auf einer Glasfritte quantitativ eluiert und spektrophotometriseh gemessen werdem Kleinere Mengen lassen sieh auf dem Stgrke- block dureh Entwicklung mit Benzidin siehtbar maehen (Spray mit 2 Vol. Benzidin-Eisessig + 3 Vol; 3% tI202).

Gewinnung yon Myogl~bin aus Skeletmuslculatur. Menseh- liehe Muskulatur wird von Fett und Bindegewebe so weR als mSglieh freipr~pariert und in etwa 3 mm messende Stiieklein zerkleinert, mit 11/2 Vol. Aqua bidest, verse~zg und unter Ktih- lung mit Eiswasser im I-Iomogenisator zertrtimmert. Zum er- hMtenen Muskelbrei gibt man P/e Vol. Aqua bidest., sehiittelt gut auf und lgBt den Ansatz 12 Std bei + 40 C stehen. Nach- her wird die iiberstehende F1/issigkeit 30 rain bei 3000 T/rain und einer Temperatur yon + 60 C zentrffugiert, die wg~grige Sehicht M)gehebert und filtriert, anschliegend mit a/4 Vol. CCI~ 5 min ausgeseh~ittelt und wieder 30 min bei 3000 T/rain und + 6 ° C zentriiugiert. Die danaeh abgeheberte wgBrige Schieht wird mit je 1 Tropfen 5% KaFe(CN)~ und 5% KCN pro ml verse~zt. Die so erhaltene L6sung enthglt neben farb- losen Eiweif~kSrpern etwa 100 mg-% CNMet-Mb und wenige rag-% CNMet-Hb; sic dient als Ausgangsmaterial fiir die elek~rophoretisehe Trennung.

* Wir danken Herin Dr. chem. K. LAvsnI~, lVIedizinisehes Chemisches Institut der Universitgt Bern, ftir die freundliche Zustellung des UntersuehungsmateriaL%

Klim Wschr., 39. gahrg.

Ergebnisse

Myoglobin l~gt sieh im S tgrkeb loek e inwandfre i darstet ten, und zwar wander t Met-Mb bei p g 8,6 lang- samer, Oxy-Mb und CNMet-Mb ctwas raseher als O x y - I t b S (Abb. 1). Es e rg ib t sieh d a m i t folgende Skala dcr Wanderungsgesehwir td igkei t :

O x y - I t b A 2 <. Met-Mb < O x y - H b S < Oxy-Mb C N M e t M b < O x y - g b F < O x y - l i b A v

;!

r Abb. I. \ on links nach reehts : I. 0xy-HbA~ u. A~ ; 2. Oxy-HbA~ u. F ; 3. Oxy- Mb u. Met-Mb; 4. Oxy-KbS; 5. CNMet-Mb. St&rkeblock~Iglektrophorese

p~ 8,6/600 V/60 mA/14 Std

Abb. 2. Yon links nach rechts: 1. CNIvlet-Mb aus Urilx bei paroxysmaler 1Kyoglobinurie; 2. CNMet-Mb aus normaIer Mllskulatur; 3. Oxy-HbA~ u F.

St/irkebloek-Elektrophorese p~ 8,6/600 V/50 mA/l$ Std

Die Gesehwindigkei t yon Oxy-Mb und CNMet-Mb zeigt nur eine sehr geHnge Dffferenz. Das s tabi le und pho tomet r i sch le ieht meBbare C N M e t M b l~uft e twas l angsamer als O x y - H b F und unte rsche ide t sich du tch seine Pos i t ion e indeut ig von allen normalen I t b - K o m - ponenten. CNMet-Mb aus Ur in bei pa roxysma le r Myo- globinurie zeigt dieselbe Wanderungsgeschwind igke i t wie CNMet-Mb aus no rma le r Musku la tu r (Abb. 2). Ein Gemisch yon b ib und l i b in Ur in I~IR sieh ohne weiteres auf t rennen (Abb. 3).

Enth~Llt der mi t 0,1 ml auf den S tgrkeb loek aufge t ragene Ur in 50 rag- % oder mehr Mb bzw. Lib, b i lde t die F r a k t i o n auf dem S~£rkeblock einen dunklen F leck und k a n n etuier t nnd bei 540 m,a pho tomet r i seh gemessen werden. Dazu werden 5 gleiche F rak t ionen , die insgesamt 0,5 ml der Ausgangsl6sung entspreehen,

19e

2 8 8 H. ~. M~RTI" Der Nachweis yon Myoglobin mittels Stgrkeblock-Elektrophorese Klinische Wochenscbrift

mit 5 ml Aqua bidest, eluiert. Enth/~lt die Ausgangs- 15sung weniger als 50 rag- % Mb oder Hb, ist die Frak- tion auf dem St~rkebloek nut schwach oder tiberhaupt nieht erkennbar (Abb. 4); in diesen F/illen kann die Konzentration nur approximativ dnreh Vergleieh der Farbintensit/it mit einer gMchzeitig aufgetragenen be- kannten Verdiinnungsreihe bestimmt werden. Die Mb- oder Hb-Fraktion ist ohne Anf/~rbung bis zu einer Aus-

Abb. 3. Von links nach rechts: 5, Oxy-HbA~, 13 % F, A~; 2. CNMet-Mb arts Urin bei paroxysmaler ~[yoglobinurie; 3. Kontrollurin mit ktlnstlicher Zu-

gabe yon t tb ; 4. Gemisch yon 2 und 3; 5. Oxy-HbA~ u. A~. St~rkeblock-]~lektrophorese p~ 8,6/600 V/60 mA/15 Std

a b Abb. 4. Links: Oxy-KbA~ u. A~, recht.s: kiinstliche Verdiinnung yon 10 rag- %

CN5fe~-3Ib in Urin. a vor, b naeh ]~ntwicklung mit Benzidin. Sttirkeblock-Elektrophorese p~ 8,6/600 V/70 mA/14 Std

gangskonzentration yon 20 rag-% hinunter und naeh Entwiekiung mit Benzidin bis zu einer Minimal- konzentration yon I rag-% noeh siehtbar. Die Grenze der photometrisehen Bestimmbarkeit yon Mb und Hb in Urin wurde dureh Messung einer ktinstlieh her- gestellten Verd/innungsreihe ermittelt und bei 5 rag- % gefunden.

Diskussion Die Sthrkeblock-Elektxophorese gestattet die Auf-

tragung yon 0,t ml Untersuchungsmaterial und stellt die empfindlichste Differenzierungsmethode fiir Mb und I tb dar. Sic erm6glieht den getrennten Nach- weis yon Mb und I ib in Urin bis zur minimalen Kon- zentration yon 1 mg- %. Es ist zweekm/~l~ig, den Farb- s~off vor der Untersuehung in die stabile CNMet-Form tiberzufiihren. CNMet-Mb 1/igt sieh dutch seine Wan- derungsgesehwindigkeit, wetehe bei pH 8,6 hinter der-

jenigen yon Oxy-HbF liegt sowie dureh die positive Benzidinreaktion miihelos identifizieren. Auger eini- gen ~ugerst seltenen anomalen Hb, deren Vorhanden- sein dureh gleiehzeitige Untersuehung einer Blutprobe leieht ausgeschlossen warden kann, zeigt kein anderer Benzidin-positiver Stoff die gleiehe Wanderungsge- sehwindigkeit. Haptoglobingebundenes Hb l~,uft lang- samer, dutch andere Plasmaproteine gebundenes Hb oder I-I/imatin sowie ttiimatbumin wandern wesentlieh raseher ~8.

Die vergleiehende Untersuehung yon Mb aus nor- maler Musknlatur und aus Urin eines Falles yon paroxysmaler Myoglobinurie best/itigt die Erfahrungen anderer AntorenlO, n, dag sieh die beiden Mb nieht unterseheiden lassen.

Da sieh Hb und Mb auf dem Sti~rkebloek gut von- einander trennen (Abb. 3) und quan~itativ eluieren lassen, kann die Elektrophorese zur Herstellung einer weitgehend gereinigten Mb-L6sung verwendet werden. Enthi~lt die Ausgangssubstanz t00 rag-% Mb, so lal~t sieh aus der St~rke eine 10 mg-%ige Mb-L6sung ge- winnen, deren Konzentration fiir zahlreiehe weitere Untersuehungen ausreieht. Dieses Verfahren gestattet einerseits, aus Muskutatur mit geringem Arbeitsauf- wand eine Hb-freie 10 mg-%ige LSsung herzustellen. Es eignet sieh andererseits aueh zur Gewinnung einer gereinigten ivlb-L6sung aus Urin, sofern es m6glieh ist, eine 10faehe Verminderung der Mb-Konzentration in Kauf zu nehmen. IV[it Mb liegen meistens gleiehzeitig aueh andere EiweigkSrper im Urin vor, da Myo- globinurien versehiedener ~tiologie hgufig mit einer Albuminurie oder Mikrohtim aturie einhergehen ~, ~ ~, 16,19.

Zusammen]assung. Mit Hilfe der Stgrkeblock- Elektrophorese ist es mSglieh, diagnostisch Myoglobin und H/imoglobin bis zu einer minimalen Konzentration yon 1 mg-% getrennt naehzuweisen und fiir experi- mentelle Zweeke auf einfache Art eine h/~moglobin- freie verdfinnte Myoglobin-LSsung herzustellen.

Wir danken Frl. L. BARGETZI ffir ihre wertvolle Hilfe bei allen Untersuchungen.

L i t e r a t u r . 1 BLONDt tEI~ , S . H . , E . MARGOLIASH a n d E . Sm~lrRm: J. Amer. reed. Ass. 167, 453 (1958). - - e BOWDEN, D. i., D. :FRASER, S. H. JACKSO~ and N. F. WALKER: Nedi- eine (Baltimore) 35, 335 (1956). -- ~ BOWEN, W. J.: J. biol. Chem. 179, 235 (1949). -- ~ JASI~SKI, B., u. H. BM)TSGH: Schweiz. med. Wsehr. 82, 29 (1952). 5 JAVID, J., D.S. FISC~I~R and T. H. SPAET: Blood 14,682 (1959).- 6 JAVID, J., H. I. HOROW~TZ, A. S. SANDERS U. T. H. SPAET: A.M.A. Arch. i n t e r n , ivied. 104 , 6 2 8 (1959) . 7 KUNKEL, I-I. G . , a n d G. WAL- LENIVS: Science 122, 288 (1955). s LATHE~C,W.: J. clin. Invest. 118, 1020 (1959). - - 9 PEARSOn-, C. M., W. S. BECK a.nd W. H. BLAHD: A.M.A. Arch. intern. Med. 99, 376 (1957). - - lo P~mI(OFF, G. T., H. C. SCHWARTZ and F. H. TYLER: J. clin. In- vest. 88, 1599 (1959). 11PR~KERD, T. A. J. : Brit. J. Haemat. ~., 8 0 (1956) . - - l e RlSINER, L . , N . KONIKOFF, D . M. ~LLTSCItULE, G. J. DA~MIN and J. P. MERRILL : A.M.A. Arch. intern. Med. 97, 537 (1956). 1 3 Sem~IID, I¢., and R. MAiqL~R: J. clin. Invest. 38, 2044 (1959). - - 14 SINGER, K., B. ANGELOPOULOS and B. RA- ~IOT: Blood 10, 979 {1955). --~s S~GE~, K., B. A~GELO~OVLOS ~nd B. I~AMOT: Blood 10, 987 (1955). - - 16 STAHL, W. C.: J. Amer. reed. Ass. 164, 1458 (1957). - - 1~ THEOR]SLL, H., and C. DE DUVE: Arch. Biochem. 12, 113 (1947). - - i s WHEBY, M. S., O'NEILL BARRET and W. It. C~os~Y: Blood 16, 1579 (1960). - - ~ WHE]~Y, M. S., and It. S. MILLER: Amer. J, IVied. 29, 599 (1960). - - ~o W~m~A~T, C. L., R. H. OwIs~s, C. G. CA~TRELL and G. 1~,. C o o ~ : Ann. intern. Med. 51, 140 (1959).