286 It. 1~. I~ARTI: Der Nachweis yon Myoglobin mittels S~grkeblock-Elektrophorese Klinische Wochenachrift

Tabelle.

~ame A l t e r

N.W.,34 Is~ Soil

T. D., 28 Is~ Soll

B.C., 33 Is~ Soll

L.J., 20 Is~ Soll

K.U.,29 Is~ Soil

U.~. ,40 Is~ Soll

B.H., 20 Is~ Soll

Z.D., 32 Ist Soll

Untersuchung der Lun

#o~ VCO, ~t cm~/ cm~/ m~.-~ m!~-,

1309 272 0,88 2180 I 276 234 0,85 1919 264 250 0,945 2551 217 0,85 262 244 0,93 195 165 0,85 258 213 t 0,825 206 175 0,85 207 173 i 0,835 176 150 0,85 209 186 0,89 211 179 0,85 310 I 23O 0,74 289 245 0,85 243 243

len/unlction bei 8 gesunden Versuch~

~tz ~Q

1840 1775 1872 1355 1780 1434 1453 1226 1480 1248 2105 2012

206 0,85 1700 206 0,85 1700

AV m:_~ AMV c m ~ CI~ ~

645113 1839o 482 16 7720 523 15 7840t 445 16 7140

519 i i 67501 435 16 6970 532 10 53201 360 5770

474 12 15700 308 16 4925 383 16 6130 I 369 16 5900 I 402 18 7230 505 16 8080 404 16 6450 426 16 6810

#alv VD

cm a cm*

5840{2550 515812570 5260[2580 4760 t 2380 538011370 465012320 4410 I 910 385011920 402011680 3285 11640 4170/1960 3940 11965 5200 2030 5390 2690

443012020 4540 2270

)ersonen nach dem beschriebenen Prinzip

VK

c m a

4590 4406 4460 4335 3580 3081 3510 3339 3590 2920 2410 2910 3440 4419 2620 3968

Trunk t SK I c m a % VK

,0o 6608_80 186 78,4 149 105 145 9I

120 140 102 185 123 113 168 126 142

AGW

c m a

122500 110200 125800

60--80 108200 89,5 72 300 60--80 77100 92 59000 I 60--801 83500 75 70500 60--80 73000 81 43 550 60--80 72600 80,5 82300 60--801 110200 62,4 27300 60---80 99300

~p

27,1 28 29,6 28 25,7 28 20,6 28 27,5 28 29,3 28 23,3 28 26,5 28

PCO: alv

mm ltg

40,35 38,0-42,0 41,4 38,0--42,0 39,3 38,0--42,0 41,8 38,0-42,0 37,3 38,0-42,0 38,6 38,0-42,0 38,4 38,0--42,0 40,3 38,0q2,0

Absorbtionsschreiber ,Uras M" der Firma Hurt- mann & Braun fortlaufend registrier~.

Zusammen/assunff. Es wird fiber einen yon uns entwickelgen neuartigen Spirographen auf der Basis des offenen Systems berichtet, der auf einfache Weise die Vorzfige der gesehlossenen ~e~hode (Widers~ands- arrant und sichere I~egistrierung der Ven~ilations- grSBen) mi~ denen der offenen Methode (absolute Kon-

stanz der inspiratorisehen Gasspannnngen) kombinier~, und so insbesondere Ifir Simultanuntersuchungen der Ventilation und der Alveolar- bzw. Blutgasspannungen in t~uhe und unter Belastung geeignet erscheint. Seine Leistungsfghigkeig ist praktisch nnbegrenzt, seine Empfindliehkeit bei Belastungsuntersuchnngen grSl3er als bei Systemen mit grogen Spirome~erglocken. Schematischer Aufbau and Untersuchungsergebnisse sind beigeftigt.

D e r N a c h w e i s v o n M y o g l o b i n m i t t e l s S t i i r k e b l o c k - E l e k t r o p h o r e s e *

Von

H. I~. M~TI A u s d e r ~ e d i z i n i s c h e n U n i v e r s i ~ g t s p o l i k l i n i k B a s e l ( D i r e k t o r : P r o f . D r . O. GSI~]~L)

Einleitung BLONDKEII~ U. Mitarb. I angegebene Aus/dllungs- Der Myoglobin-Nachweis ist vor allem fiir die Er- methode beruht darauf, dab bei 75 resp. 80% Sgtti-

fassung einer Myoglobinurie yon Bedeutung. Bei ver- gung mi~ Ammon_sulfa~ l ib ausgefgllt wird, wghrend schiedenen Zust/~nden kann Myoglobin aus der Musku- Oxy-Mb in L6sung bleibt und auf Grund einer posi- latur in die Blu~bahn fiber~reten, so nach mechanischen riven Benzidinreaktion nachweisbar ist. Die Methode oder elektrischen Muskeltraumata, nach Kgltetraurna, dient aber nur zum Nachweis yon Oxy-Mb, da Met-Mb bei Ischgmie durch ArterienverschluB, bei gewissen ent- ebenfalls ausgefgtlt ~4rd % ziindlichen and degenerativenMuskelerkrankungen,bei Die Untersuehung mittels Ultrazentri/uge setzt der epidemisehen Itaff-Krankheit,, bei endogener StS- einen en~sprechenden teehnisehen Aufwand voraus nnd rung des Energiestoffwechsels in der Muskulatur ~3 and hat zudem den Nachteil, dal~ andere Urinproteine mit schlieBlich bei der idiopatb]sehen Myoglobinurie. Das gleiehen Sedimentationskonstanten das Resulta~ ver- N[yoglobin geht im Blur keine tIaptoglobin-Bindung fglschen k6nnen ~°. einS, s u n d kann dureh andere Plasmaproteine nur bis Die Spektratanalyse erfordert ebenfalls einen er- zu einer Konzentration yon 20--30 rag-% gebunden hebliehen Arbeitsaufwand und ist dadurch erschwert, werden~,S, is. (Jberschreitet der Blutspiegel diese dub die Untersehiede im Spektrum zwisehen Mb and Schwelle, passiert freies Myoglobin das Nierenfilter, t tb sehr geringffigig sind: Oxy-Mb zeigt Absorptions- und es kommt zur Myoglobinurie. banden bei 582 und 544 m,u 2, a gegenfiber denjenigen

DerNaehweis von Myoglobin (Mb)undtIgmoglobin des Oxy-Hb bei 578 und 540 m#, Co-Mb solche bei (Hb) im Urin biet, eg vor ahem bei niedrigenKonzentra- 577 und 540 m# 17 gegeniiber denen des CO-Hb bei tionen und bei gleichzeigigem Vorliegen beider Farb- 572 und 538 m#. Bei lViet-Mb ist die Extinktion vom stoffe gewisse SchwierigkeR~en. Zur Identifizierung pg a.bhgngig a, und reduziertes Mb wie CNMet-Mb k6nnen grundsgtzlich AussMzung, Ultrazentrifuge, unterseheiden sich tiberhaupt nieht yon den entspre- SpektrManalyse and Elektrophorese verwendet wet- chenden Formen des I-Ib a,9. den. Die yon T~I~O~ELL U. DE DUVE ~7 und spgtervon Der elektrophoretisehe Mb-Nachweis ist einfacher;

als 5Iethoden wurden bisher Papierelelctrophorese s,n, * Die Arbeit wurde dutch einen Forschungsbei~rag des l<15,ls,,9,2OundStiirkegel.ElelctrophoreseS, G,~Sverwendet.

Schweizerischen Nationalfonds zur F6rderung der wissen- schaf~lichen Forschung ermSglich~. Dabei karm die Wanderungsgesehwindigkeit des Mb

Jg. 39, l~eft, 6 H.R. N~AgTI: Dcr Naehweis von Myoglobin mittels Stgrkeblock-Elektrophorese 287 15.1K/irz 1961

le ieht mi t der jenigen yon I t b vergl iehen werden. Seit den Un te r suehungen yon S l sa~m u. tVIitarb.~ i s t be- kann t , dal~ Met-Mb bei Paz 8,6 e twas l angsamer wande r t als l i b S . Die 1955 yon KU~K~L und WALLESlUS 7 an- gegebene Sti~rt:eblock-Etektrophorese ha t fiir die Hb- Un te r suchungen wesentl iche Fo r t s ch r i t t e gebracht , i ndem sic gesta~tet , sehr kleine t { b - F r a k t i o n e n noeh q u a n t i t a t i v nachzuweisen. Der zweifache Vorte i l gegeniiber der Pap ie r - und S t~rkege l -Elek t rophorese l iegt dar in , dab gr6Bere Mengen Mater ia l aufge t ragen und die e rha l t enen F r a k t i o n e n wJeder vo l l s tand ig e luier t werden kSnnen.

In der vor l iegenden Arbe i t wird untersueht , ob die S tg rkeb lock-E lek t rophorese geeignet ist, e inersei ts aueh den d iagnos t i schen Nachweis k M n e r Mb-Mengen zu verfe inern und andererse i t s die exper imente l le Dar- s te l lmlg yon Mb-LSsungen zu vereinfachen.

Eigene Untemuchungen

Material. Es s t anden uns zwei zur Unte r suehung e ingesandte Ur inp roben einer 57j£hrigen Pa t i en t i n mi t pa roxysma le r Myogtobinur ie zur Verf i igung*. Das Mb lag zu 80 bzw. 90% als M e t M b und zu 20 bzw. 10% als Oxy-Mb vor. Die U m w a n d l u n g in C N M e t M b erfolgte du tch Zugabe yon je 1 Tropfen 5 % KaFe(CN)s und 5% K C N zu 3 mI Urin. Als Verg le ichsmater ia l d iente eine selbst hergeste l l te Mb-LSsung aus menseh- Iieher Ske le tmusku la tu r .

MethodiC. Spek~trophotometri.sche Untersuchungen. Alle 1Kcssungen wurden mit einem Beckman Quartz-Spektrophoto- meter vorgenommen mit Cuvetten yon 1 cm Sehiehtdieke. Die Konzentrationsbestimmung yon CNMet-Mb kann dabei naeh der yon B o w ~ 3 verwendeten Formel eriolgen c --: die. Dabei bedeutet c molare Konzentration, d optisehe Diehte bei 540 m#, s = Extinktionskoeffizient 11,3,10 a. Das Molekular- gewieht yon 5fb betragt 17000.

Stgrkeblock-t~le/ctrophorsse. Wit verwenden einen selbst konstruierten Appara t bei dem die Kiiblung dureh eine im Handel crh~ltliehe Kiihlplatte der Firma Therma AG, Sehwan- den (G1) vorgenommen wild. Auf die puffergetrgnkte Stgrke- sehieht yon 3 Inm Dicke (Veronal-Veronal-Na-Puffer p~ 8,6 Ionenstarke 0,075) werden streifenfSrmig Mengen yon 0,05 oder 0,1 ml des Untersuehungsmaterials aufgetragen. Naeh Anlegen einer Spanrmng yon 600 V kommg es zu einem Gleich- strom von 50--70 mA pro Stgrkebloek. Eine Laufzeit yon 14--I8 Std bei + 4 ° C gestatte~ eine gute Auftrennung von Mb und I-Ib. GrSgere Fraktionen sind an ihrer Eigenfarbe er- kennbar und k6nnen aus der Stgxke dutch Aqua bidest, auf einer Glasfritte quantitativ eluiert und spektrophotometriseh gemessen werdem Kleinere Mengen lassen sieh auf dem Stgrke- block dureh Entwicklung mit Benzidin siehtbar maehen (Spray mit 2 Vol. Benzidin-Eisessig + 3 Vol; 3% tI202).

Gewinnung yon Myogl~bin aus Skeletmuslculatur. Menseh- liehe Muskulatur wird von Fett und Bindegewebe so weR als mSglieh freipr~pariert und in etwa 3 mm messende Stiieklein zerkleinert, mit 11/2 Vol. Aqua bidest, verse~zg und unter Ktih- lung mit Eiswasser im I-Iomogenisator zertrtimmert. Zum er- hMtenen Muskelbrei gibt man P/e Vol. Aqua bidest., sehiittelt gut auf und lgBt den Ansatz 12 Std bei + 40 C stehen. Nach- her wird die iiberstehende F1/issigkeit 30 rain bei 3000 T/rain und einer Temperatur yon + 60 C zentrffugiert, die wg~grige Sehicht M)gehebert und filtriert, anschliegend mit a/4 Vol. CCI~ 5 min ausgeseh~ittelt und wieder 30 min bei 3000 T/rain und + 6 ° C zentriiugiert. Die danaeh abgeheberte wgBrige Schieht wird mit je 1 Tropfen 5% KaFe(CN)~ und 5% KCN pro ml verse~zt. Die so erhaltene L6sung enthglt neben farb- losen Eiweif~kSrpern etwa 100 mg-% CNMet-Mb und wenige rag-% CNMet-Hb; sic dient als Ausgangsmaterial fiir die elek~rophoretisehe Trennung.

* Wir danken Herin Dr. chem. K. LAvsnI~, lVIedizinisehes Chemisches Institut der Universitgt Bern, ftir die freundliche Zustellung des UntersuehungsmateriaL%

Klim Wschr., 39. gahrg.

Ergebnisse

Myoglobin l~gt sieh im S tgrkeb loek e inwandfre i darstet ten, und zwar wander t Met-Mb bei p g 8,6 lang- samer, Oxy-Mb und CNMet-Mb ctwas raseher als O x y - I t b S (Abb. 1). Es e rg ib t sieh d a m i t folgende Skala dcr Wanderungsgesehwir td igkei t :

O x y - I t b A 2 <. Met-Mb < O x y - H b S < Oxy-Mb C N M e t M b < O x y - g b F < O x y - l i b A v

;!

r Abb. I. \ on links nach reehts : I. 0xy-HbA~ u. A~ ; 2. Oxy-HbA~ u. F ; 3. Oxy- Mb u. Met-Mb; 4. Oxy-KbS; 5. CNMet-Mb. St&rkeblock~Iglektrophorese

p~ 8,6/600 V/60 mA/14 Std

Abb. 2. Yon links nach rechts: 1. CNIvlet-Mb aus Urilx bei paroxysmaler 1Kyoglobinurie; 2. CNMet-Mb aus normaIer Mllskulatur; 3. Oxy-HbA~ u F.

St/irkebloek-Elektrophorese p~ 8,6/600 V/50 mA/l$ Std

Die Gesehwindigkei t yon Oxy-Mb und CNMet-Mb zeigt nur eine sehr geHnge Dffferenz. Das s tabi le und pho tomet r i sch le ieht meBbare C N M e t M b l~uft e twas l angsamer als O x y - H b F und unte rsche ide t sich du tch seine Pos i t ion e indeut ig von allen normalen I t b - K o m - ponenten. CNMet-Mb aus Ur in bei pa roxysma le r Myo- globinurie zeigt dieselbe Wanderungsgeschwind igke i t wie CNMet-Mb aus no rma le r Musku la tu r (Abb. 2). Ein Gemisch yon b ib und l i b in Ur in I~IR sieh ohne weiteres auf t rennen (Abb. 3).

Enth~Llt der mi t 0,1 ml auf den S tgrkeb loek auf- ge t ragene Ur in 50 rag- % oder mehr Mb bzw. Lib, b i lde t die F r a k t i o n auf dem S~£rkeblock einen dunklen F leck und k a n n etuier t nnd bei 540 m,a pho tomet r i seh ge- messen werden. Dazu werden 5 gleiche F rak t ionen , die insgesamt 0,5 ml der Ausgangsl6sung entspreehen,

19e

2 8 8 H. ~. M~RTI" Der Nachweis yon Myoglobin mittels Stgrkeblock-Elektrophorese Klinische Wochenscbrift

mit 5 ml Aqua bidest, eluiert. Enth/~lt die Ausgangs- 15sung weniger als 50 rag- % Mb oder Hb, ist die Frak- tion auf dem St~rkebloek nut schwach oder tiberhaupt nieht erkennbar (Abb. 4); in diesen F/illen kann die Konzentration nur approximativ dnreh Vergleieh der Farbintensit/it mit einer gMchzeitig aufgetragenen be- kannten Verdiinnungsreihe bestimmt werden. Die Mb- oder Hb-Fraktion ist ohne Anf/~rbung bis zu einer Aus-

Abb. 3. Von links nach rechts: 5, Oxy-HbA~, 13 % F, A~; 2. CNMet-Mb arts Urin bei paroxysmaler ~[yoglobinurie; 3. Kontrollurin mit ktlnstlicher Zu-

gabe yon t tb ; 4. Gemisch yon 2 und 3; 5. Oxy-HbA~ u. A~. St~rkeblock-]~lektrophorese p~ 8,6/600 V/60 mA/15 Std

a b Abb. 4. Links: Oxy-KbA~ u. A~, recht.s: kiinstliche Verdiinnung yon 10 rag- %

CN5fe~-3Ib in Urin. a vor, b naeh ]~ntwicklung mit Benzidin. Sttirkeblock-Elektrophorese p~ 8,6/600 V/70 mA/14 Std

gangskonzentration yon 20 rag-% hinunter und naeh Entwiekiung mit Benzidin bis zu einer Minimal- konzentration yon I rag-% noeh siehtbar. Die Grenze der photometrisehen Bestimmbarkeit yon Mb und Hb in Urin wurde dureh Messung einer ktinstlieh her- gestellten Verd/innungsreihe ermittelt und bei 5 rag- % gefunden.

Diskussion Die Sthrkeblock-Elektxophorese gestattet die Auf-

tragung yon 0,t ml Untersuchungsmaterial und stellt die empfindlichste Differenzierungsmethode fiir Mb und I tb dar. Sic erm6glieht den getrennten Nach- weis yon Mb und I ib in Urin bis zur minimalen Kon- zentration yon 1 mg- %. Es ist zweekm/~l~ig, den Farb- s~off vor der Untersuehung in die stabile CNMet-Form tiberzufiihren. CNMet-Mb 1/igt sieh dutch seine Wan- derungsgesehwindigkeit, wetehe bei pH 8,6 hinter der-

jenigen yon Oxy-HbF liegt sowie dureh die positive Benzidinreaktion miihelos identifizieren. Auger eini- gen ~ugerst seltenen anomalen Hb, deren Vorhanden- sein dureh gleiehzeitige Untersuehung einer Blutprobe leieht ausgeschlossen warden kann, zeigt kein anderer Benzidin-positiver Stoff die gleiehe Wanderungsge- sehwindigkeit. Haptoglobingebundenes Hb l~,uft lang- samer, dutch andere Plasmaproteine gebundenes Hb oder I-I/imatin sowie ttiimatbumin wandern wesentlieh raseher ~8.

Die vergleiehende Untersuehung yon Mb aus nor- maler Musknlatur und aus Urin eines Falles yon par- oxysmaler Myoglobinurie best/itigt die Erfahrungen anderer AntorenlO, n, dag sieh die beiden Mb nieht unterseheiden lassen.

Da sieh Hb und Mb auf dem Sti~rkebloek gut von- einander trennen (Abb. 3) und quan~itativ eluieren lassen, kann die Elektrophorese zur Herstellung einer weitgehend gereinigten Mb-L6sung verwendet werden. Enthi~lt die Ausgangssubstanz t00 rag-% Mb, so lal~t sieh aus der St~rke eine 10 mg-%ige Mb-L6sung ge- winnen, deren Konzentration fiir zahlreiehe weitere Untersuehungen ausreieht. Dieses Verfahren gestattet einerseits, aus Muskutatur mit geringem Arbeitsauf- wand eine Hb-freie 10 mg-%ige LSsung herzustellen. Es eignet sieh andererseits aueh zur Gewinnung einer gereinigten ivlb-L6sung aus Urin, sofern es m6glieh ist, eine 10faehe Verminderung der Mb-Konzentration in Kauf zu nehmen. IV[it Mb liegen meistens gleiehzeitig aueh andere EiweigkSrper im Urin vor, da Myo- globinurien versehiedener ~tiologie hgufig mit einer Albuminurie oder Mikrohtim aturie einhergehen ~, ~ ~, 16,19.

Zusammen]assung. Mit Hilfe der Stgrkeblock- Elektrophorese ist es mSglieh, diagnostisch Myoglobin und H/imoglobin bis zu einer minimalen Konzentration yon 1 mg-% getrennt naehzuweisen und fiir experi- mentelle Zweeke auf einfache Art eine h/~moglobin- freie verdfinnte Myoglobin-LSsung herzustellen.

Wir danken Frl. L. BARGETZI ffir ihre wertvolle Hilfe bei allen Untersuchungen.

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