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DIE ANWENDUNG NEUERER, MIKROCHEM[SCHER ELEKTROLYTREAKTIONEN AUF DAS VERKALKUNGS-

PROBLEM BEI DEI~ OSTEOGENESE.

Von

WERNER SCHULZE. (Anatomisches Institut Wiirzburgo}

Mit 4 Textabbildungen.

Wie eine Reihe eigener Arbeiten und Arbeiten yon Sehfi]ern beweist, haben neben Problemkreisen, die mehr im Vordergrund des Interesses ffir ihn standen, auch histologische und biochemische Probleme den vielseitigen Geist yon H]~I~_Aiv~ BleArS gefesselt, und damit mag es begrfindet sein, dab aueh eine mikrochemisehe Untersuchung sieh in diesem Bande finder, der dem Ged~chtnis des allzu frfih Verstorbenen gewidmet ist.

Mikrochemische lJntersuehungen haben schon yon jeher das grSgte Interesse tier I-Iistologen in Anspruch genommen, delm seit es eine wissen- schaftliche Nikroskopie gibt, war stets derWunsch lebendig, auJ3er fiber den morphologisehen Aufbau mit dieser Methode auch Erfahrungen fiber die ehemische und physikalisehe Beschaffenheit des Untersuchungs- objektes zu machen. Auf die Bedeutung der mikrochemischen Methoden in der Histologie hat STiiBEL kfirzlich in seinem Referat in den Ergeb- nissen der Physiologie besonders hingewiesen. Vor allen DingenVorg~nge, die sieh im Organismus innerhalb der Zwischensubstanz und nicht in den Zellen selbst abspielen, fordern eine Untersuchung mit diesen Me- thoden heraus, denn ffir sie ist eimvandfreier als ffir die Vorg~Lnge in den Zellen selbst zu postulieren, dab sie den ehemisehen und physikalisch- chemisehen Gesetzen folgen, die ffir die anorganische Materie gfiltig sind. Von den Methoden sind vor allem diejenigen in Betraeht zu ziehen, die an Sehnittmaterial zur Anwendung gebracht werden k5mlen. Ferner ist es yon Vorteil, wenn sieh die Endergebnisse der Reaktionen im Pr~- parat durch Entw~sserung und Oberffihrung dureh ein Intermedium in Balsam auf die Dauer erhalten lassen. Die Verwendung yon fiber- lebendem oder noch mSglichst lebendfrischem Material ist ein weiteres unumg~nglich notwendiges Postulat. Ffir die Untersuchungen, fiber die ich im folgenden berichte, sind alle diese Voraussetzungen gegebenl).

1) Die Versuche fanden unter Mitarbeit yon Herrn SDmx OR~ISTEI~ statt. Auf dem diesjiihrigen AnatomenkongreB in'Wien habe ich fiber ihre Ergebnisse beriehtet.

Die Anwendung neuerer, mikrochemischer Elektrolytreaktionen. 63

W~hrend die histogenetischen Vorg~nge bei der normalen Ver- kn6cherung vor allen Dingen dureh die Arbciten der Wiener Histo- ]ogenschule weitgehend erforseht sind, ist unsere Kenntnis fiber ein anderes Problem, das Problem der Verkalkung w:~khrend der Osteo- genese, trotz zahlreicher Arbeiten aus den letzten Jahrcn noch ein rccht dunkles Gebiet. Die Frage, unter welehen Bedingungen kommt es:'zur Ausbildung jener harten, unschneidbaren Masse, die bei allen Wirbel- tieren auffi~llig reich an anorganischen Substanzen ist und konstant nach Entfernung der organisehen Substanz 85--90 vH. Calciumphosphat und 10--15 vH. Caleiumcarbonat enth~ilt, ist noch relativ ungeklikrt. Zwar hat M. B. SC~IDT in seiner Arbei~ fiber die ,,Verkalkung" in dem K R V , ~ L - ~ C H ~ D s e h e n Handbuch der allgemeinen Pathologie ein ansehnliches M~terial fiber die physiologische Verkalkung, speziell wiSh- rend der Osteogenesa, zusammengetragen, doch weichen die Anschauun- gen, die sich Pa~hologen, Kinderkliniker, Chirurgen und Anatomcn yon dicsen Vorg~ngen machen, in wesentlichen Punkten voneinander ab, so dal~ ich entgegen der Ansicht yon RAiL jr. glaube, dab diese Vor- g/inge noch lange nieht als restlos aufgekl~rt anzusehen sind.

GewiB muB man bei der Frage naeh den chemisehen und physikalischen Bedingungen fiir die Entstehung einer bestimmten Substanz im KSrper w~hrend tier Morphogenese m6gliehs~ aUe physikalisehen und chemischen Vorg~nge des EiweiB-Kohlehydrat-Fett- und ~norga- niseh-ehemisehen Stoffwechsels zu erfassen suehen, doeh ist das bisher nichts weiter als ein Postulat. Ieh habe mir die Aufgabe gestellt, mit mikrochemischen Elektrolytreaktionen die einze]nen Gewebe, Zellen wie Zwischensubstanzen, w~ihrend der verschiedenen Phasen der Knochenbildung aus dem Bindegewebe heraus und wKhrend der En$- stehung yon peri- und enchondralem Knochen auf ihren ElektrolytgehaR zu untersuehen, um zu sehen, ob man auf diesem Wege etwa einen neuen Einbliek in die Verkalkungsvorg~nge wKhrend der Osteogenese bekommen kann.

Methodologisch ist zu bemerken, dab mir als Material m6gliehst lcbendfrische Embryonen yon Rind, Schwein und Schaf dienten, die ich im Tragsaek direkt nach der Schlaehtung des Muttertieres in die Anatomie braehte und sofort vcrarbeitete. Dazu kommt eine Reihe yon Hiihnerembryonen, die ich vSllig lebendfrisch aus dem Ei herauspr/~- parierte und sofort untersuchte, l%rner standen mir zwei menschliehe Embryonen yore :Ende des 5. und 7. Monats zur Verf/igung, die ich 2 bzw. 3 Stunden p .p . erhielt und.sofort verarbcitete. Die einzelnen Embryonalteile (Schadel, Unterkiefer, Rippen- und Extremit~ten- stiicke) wurden auf dem Gefriermikrotom frisch gesehnitten und die einzelnen Schnitte in gefrorenem Zustande in versehiedenen Reagenzicn aufgefangen. Diese Gefrierschnitte vom leben~risehen Embryonal-

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material wurden zur parallelen, gleichzeitigen Anstellung einer ganzen Reihe von mikrochemischen Reakt ionen aufgefangen. Die nach An- stellung der Reakt ion gewonnenen Pr~parate wurden meistens nieht naeh- gef/irbt, sie 1assert sieh naturgem~B iiberhaupt nicht irgendwie mi t gewShnhchen histologischen Sehnit tpr~paraten vergleichen, da sic ein- faeh das Endergebnis mikrochemiseher Reaktionen darstellen, die man keineswegs differenzieren oder sonstwie versch6nern kann, da das einer Veranderung des Reaktionsergebnisses gleiehk/ime. Sehr angenehm ist der Umstand, daf~ man bei einiger Vorsicht die Sehnitte naeh Anstellung der yon mir angewandten l~eaktionen in aufsteigendem Alkohol ent- w/~ssern und dann fiber Xylol in Balsam einsehliel~en kann ohne, wie die dauernde mikroskopische Kontrolle zeigt, Ver/~nderungen der Re- aktionsergebnisse zu bekommen. Man erh/ilt so gut vorzeigbare Pr/~- parate, die bis je tzt - - nach 6 Monaten Aufbewahrungszeit - - keine Ver~nderungen zeigen. W/~hrend ich immer die Organe yon tier rechten Seite des Embryos zur Anstellung der Reaktionen benutzte, habe ieh yon der linken Seite entspreehende Stfieke zur Herstellung yon Kontroll- pr/iparaten in Zenker fixiert, sp~ter entkalkt und in Celloidin eingebettet. Ich habe yon demselben 0b jek t stets eine ganze Reihe yon Reaktiormll nebeneinander angestellt, denn meines Erachtens kann uns nur tier Vergleich des Vorkommens m6gliehst vieler, mikrochemisch fal]barer, anorganischer Substanzen in unseren Anschauungen weiterffihrei1. Dieser Versueh ist bisher, wie die Einsicht in die Li tera tur einschliel]- hch der neueren Arbeiten, z. B. RAiL jr.s, zeigt, noch nicht unternom- men women, und hierin erblieke ieh einen p~4nzipiellen Fortsehri t t gegenfiber den bisher vorliegenden Untersuchungen.

Calcium habe ich nach v. KOSSA sowie naeh MAc~a~Lv~ naehgewiesen, ferner stellte ich die Reakt ion desselben Autors auf Kal ium an, unter- suehte auf Phosphate nach ROEn~ und wies das Eisen mit der gewShn- lichen Berhnerblaureaktion naeh. Die Methoden sind, wie ieh wei$ (ieh verweise auf LIESEOA_nG u. a.) im einzelnen zum Tefi umstri t ten. Die an tier 0berfl~che des Sehnittes yon den durehtrennten Zellen und Zwisehensubstanzen herrShrenden K6rnchen, die bei versehiedenen l~eaktionen auftreten, babe ich i iberhaupt vernachl~ssigt und nut die ira Innern des Schnittes in den Zellen und der Zwischensubstanz auf- t retenden l~eaktionen beriieksichtigt. :Nehenbei bemerkt boten sie bei Material versehiedenster t I e r k m d t sehr konstante Befunde. Bis auf das Eisen kommen sowohl Kal ium wie Calcium und Phosphate in allen Geweben vet , doch spricht die unterschiedliche St~rke tier Reaktionen in den verschiedenen Geweben und Zellen desselben Schnittes ffir den verschieden grol~en Gehalt der einzelnen Teile an den einzelnen Sub- stanzen. Da ieh auf m6glichst gleichm/~Big dieke Schnitte achtete und auf gleichm~l~ige Durchdringung der gefrorenen Schnitte mit dem ersten

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l-r erh/tlt man in jedem Schnitt Reihcn yon ,,Aquivalentbildern". Wenn man atmh keinerlci Anhaltspunkt hat, um aus der Stiirkc tier einzelnen Niedersehliige die wirkliehe Quantitiit der anorganisehcn Substan- zen in den einzelnen Gewebsarten zu erschliegen, so hat man doch tin Recht, konstant auftretende Differenzen (ler Niedersehliige in (len versehiedenen Zellen und Geweben auf relativ hSheren mM nie(lrigert,n Gehalt des anorganischen Stoffes zuriickzufiihren.

Da bei der Bearbeitung der peri- und enchondralcn VerknSeherung die mikrochemische Untersuchmlg der allerersten Stadien noch nicht abgeschlossen ist, beschr:~inke ich reich hicr auf dic Darstelhmg dcr mikrochemischen Befunde bei der Verkalkmlg wiihrend der direkten Knochenentstehung platter Schhdelknochen. Ieh bemerke aber aus- drficklich, dab dic wcscntlichen Resultate bei der direkten VcrknScher,mg und bei der VerknScherung als Ersatz yon Knorl)el und um den Knorpel herum fibereinstimmen.

Fiir den Nachweis des Calciums nach v. Kossh wer(ltnl die gc- frorenen Schfidelschnitte in Silbernitrat aufgefangcn, dann beliehtet man, und der entstandene schwarze Silberniedcrschlag wird dm'eh Aus- wasehen dcr Schnittc mit Natrimnthiosulfat fixiert 1) . l'~]all kann (lie Schnitte mit Carmin nachfiirbcn und nach Entwiisserung in Balsam einschlie[ten. Man bekommt bei dieser iiltcrcn Mcthodc des Caleium- nachweises einen krassen schwarzen Silbernicdcrschlag in den fertig ausgebildeten Knochenb/ilkchen, wi~hrend (tie osteoiden Siiume smvie (lie bindegewebigen Teilc des Schhdcls nicderschlagsfrci bleiben (Abb. l). Da nun bekanntlich alle Zellen und Gewcbe das lebensnotwen(lige Calcium enthalten, ist es Mar, dab durch diesc Mcthodc nicht alles Calcium zur Darstellung kommt. Vielmehr entstehen (lie Nicderschliig(, nur immer dort, wo sich die feste, unschneidbare, fertig entwickeltc Knochensubstanz finder.

Der Naehweis des Calciums naeh MACALLUM gesehieht auf folgt, nth' Weise: Durch Schwefelshure wird das Calcium als Gil)s ausgefiillt. Nach grandlichem Auswaschen in gekiihltem absolutcn Alkohol ersetzt man dutch Behandlung mit J31eiaeetat das Calcium des Sulfats dutch Blei. Nach Entstehung des Bleisulfates wird durch Behandhmg mit destilliertem Wasser das iiberschiissige Bleiacctat ausgcwasehcn, und durch Zusatz yon Schwcfelammonimn mid Glycerin cntsteht ein schwarzer Niederschlag yon Schwcfelblci dort, wo sich das Ca[eimn befand. Die haupts~tchliche Fehlerquelle der Methode ]iegt in dem Umstand des indirekten Nachweiscs. Man ist nicht sicher, ob alles fiberschiissige Bleiacetat, soweit das Blei nicht zur Verdriingung des

1) Genaue Angaben iiber die verschicdcnen ~Icthoden finder man in ABDV.~mtLD~.~S Handbuch der biologisehen Arbeitsmethodcn und in ttmtx- ~E[MERS Mikroskopischer Technik.

W. Roux' Archly f. l,]ntwlcklungsmechanik ]M, 106. 5


Calcium v e r b r a u c h t wurde, (lurch (lie N a e h b e h a n d h m g mi t des t i l l i e r t em Wasscr rest los aus den Schni t t en en t fc rn t wurde. Es sprcchen aber cine Reihe yon Arbe i t en anderer Au to ren daf i i r (vgl. z. B. (lie A r b c i t ro l l GANS und PAKHEISER fiber den Calc iumgehal t der gesunden un(l k r anken Hau t ) , (tag man mi t (ler Methode doch ein ziemlich genaues Bild yon der Ver te i lung des Calciums in den Geweben e rha l ten kmm.

Abb. t . Menschlicher Eml,ryo, Ende des 7. Monats. Schgdelde( 'ke, Ca lc iunmachwcis nach yon KOSSA. Nur die zentralen, ~>verkalkten,, ])art icn der Knochenl) i i lkchenanlagen haben eine s ta rk posi t ive Reakt ion . AIle iibrigen C, ewebste i le geben eine nega t ive Reakt ion . Zur topographischen Orien- tiel'llllg ist (lie Lage der mi t Carinin aufgef~il'blen OsteoblaslPn dllr(']l grlllle WOllllIig :lllgegebell.

Behande l t mai l so die Sehni t t e vom lebendfr ischen Embryona l sch / ide l , so m a c h t m a n die Fes t s te l lung , (tal~ in dcm Mater ia l viel ausgedehnte re Niederschli ige en ts tehen als nacb der Methode v. Kossns . Man f inde t einen m~il3ig s t a rken R e i c h t u m des Bindegewebes an Calcium, dessen einzelne Fasc ru in zierl icheu F igu ren dunkel hc rvor t r e t en . W/ ih rend bei der v. KossAschen Methode die du rch Carminf i i rbung s i ch tba r ge- mach t en os teoiden S~iume der Knochenb/ i lkchen und die Os teob las ten yon j cdem Niedersch lag freibl ieben, geben bei der Methode MACALLIYMS Knochenb/ i lkchen wie os teoide S/~ume eine sehr s t a rk pos i t ive Reak t ion ,

Elektrolytreaktionen auf das Verkalkungsproblem bei dcr Ostcogenese. 67

(lie die ganzen Ktloehenl) i i lkehenanlagen als I)reitc, t iefs( 'hwarze I~iin(h'r erseheinen liiBt, un(I atteh (lie Osteoblas ten rt'a~ieren so s tark , dab man sie nur seltell ~ti dot' Oberfliiehe der sehwarzen Kt~()(.henl)iilkehen- anlagen einzeln erkennen kann. ]) ieser Befund. niimli(.h sehr s t a rk pos i t ive Ca le iumreak t ion auoh der osteoiden I~au(lsiium(,. ist k o n s t a n t bei a l len veILschie(lenen unters tmhten Eml)ryonen und z('i~t uns, (lal.~ schon vor dem Festwer( ten, dem . ,Verkalken", das ('ah.iumi()tl in groI.h'n

Al)b. 2. Mcn~,t'hlichcr En+,bryo+ J+'nde des 7. Mortals. S('hii<leld;t('h, ( 'al('ittmna('hwoi+ tm('h 3[ACALLUM. Die s t a rk posi t ive Reakt ion tlFllflll~t die gc+allltt!]i Knol'ltenbS+ll-:<.hellanhigt!n Cill- .~chtielJlk.h der Osteobla>+tenreihen. Die kollagencn Hilidegewebsf0+P+tq'n roagioren el)enfalls I)ositiv.

Mengen in der spi i teren Knoehel iSul)s tanz el l t l la l ton ist (Abb. 2). Einell / ihnlichen Befund haben schon EDEN filial HERRMANN bei der quan t i t a t iv - chemischen _Analyse von weichem Kn<)ehencallus und festcm Knochen, sowie P~ABL jr. bei der Un te r suehung der Osteogenese mit andercr Me thod ik erha l ten . Die W e r t e f/Jr Calcium s t immten bei EDENS Unter- suchung fiir Callus und feste Knochensu l ) s t anz iiberein. EI)EN Illld ] - . [ E R R M A N N fanden nun eine re la t ive A r m u t des weichen Calhts an 1)hos- pha t en , und da das Calcium in der fcr t igcn, festen Kno(,hensubstanz, wie oben erw/ihnt, groBenteils als Ca lc iumphospha t en tha l t en ist,

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68 W. Schulzc: Die Anwendung neuerer, mikrochemischcr

schlossen sic (laraus, (lal.~ (lie Anrcichermlg (ler Phosphate neben an(leren Bc(lingungen zum Festwer(len des Callusgewet):,s beitriigt.

Bei mcinen Untersuchungen an den entstehenden Knochcnhfilkchen des Sch:~i(lels wics ich (lie Phosphate mit dcr Methode yon blOEtIL nach. I)azu kamcn dic gefrorenen Schnitte in cine lproz, salpetersaure LSsung yon molybdfinsaurcm Ammonium, wodurch molyb(liinsaure Ammonium- phosphate entstan(l(,n. Man wiischt (tie Schnitte mit Wasscr aus, das

Abb. ,3. l ( imlercmbryo, N. S.-15ngc 9,5 ('m, S('lffideh|a(.h. Phosplmtnachwcis nach IIOEItL. 5Ial 'k positiw! Reakt ion der Kno(,henbii ikch( 'nanlagen peril)her bis zu den Osteoblastellreihc[l. I 'osi t ivc

[r der Osteoblas ten, s(,hwii(,h(,r posi t ive Reakt ion der kollagencn l l indegewebsfascrn .

mit Salpetcrs~iure angesiiuert ist. So(lmm reduziert man mit einer LSsung v<m Zimlchloriir. l)as (lurch Reduktion cntstandcnc Molybdfin- oxyd z(,igt im Schnittpriiparat mit seincr charaktcristischcn blmlcn Farbe die Verteihmg der Phosphatc in den verschie<lencn Gcwebsteilcn. Wo (lie Phosl)hate in grol3er Mengc vorhanden waren, cntstehen ticf- schwarzblauc Nicderschliigc, so in den ausdifferenzierten Knochcn- I)iilkchen (in (;bcrcinstimmung mit den Ergebnissen yon EDEN, I/ABL jr. un(l den gcw6hnlichen quantitativ-analytischen Untcrsuchmlgcn des Knochens). Da in den Schii(tclschnittcn siimtlichc Gcwcbe mchr o(ler

Elektrolytreaktionen auf das Vcrkalkungsproblem bei der Osteogenese. 69

minder Phosl ,hatc (mthaltcn, fiirl)('n si(' si(.h hell- und mittell)lau mit. Es ist interessant, dab die ()stcoblastcntal)ctcn. die die Knochcn- 1)~ilkehenanlagen umget)en, tier dunkelblau sind, so dab die ()stcol)lasten anscheinend ein 1)eson(l('lcs SI)cicherungsv('rmiigen fiir die I)hosl)hatc 1)esitzen. Der osteoide Santo ist in gewissem (~eg('nsalz zu EPEes Unter- suehungen so tief hlaus(.l~_warz, dab c r sich nicht \on (h'm umschh>ss('nc,,

A b b . I, M e n s c h l i c h e r l,~]]]l)[/}'o. E n d e des 7. Mor ta r s . S v h i i d c h l a c h . Ka l iunm:~ l . l l~ l . i s nach M.~(!AI,I,I'M ,, O s t e o b l a s t e n r c i h e n m i ( sial'l-: p o s i t i v e r Real . : t ion. b Ogteo ido S / iume lni l I l eg : l | i ve r I{l,al.:lion,

(' Z e n t r a l e , ~Vel ' l (a lk te '~ B a l k c n t c i h , ra i l p o s i t i v c r R e a k l i m l ,

fcrtigen Knochenbii lkchen unterschci<h'n IiiBt. Nm' manchmal tr i t t zwischen der Knochenanlage und (ler mngcben(h'n ()ste(d)lastenschicht ein schmaler, etwas heller blauer Streifen auf (Aid). 3). l)a der ostcoide Saum also naeh meinen Untersuchungen groBen (~('halt an l 'hosphaten aufweist, kann ihr Auftreten nicht dcr einzig maBgcl)end(' Fakt()r fiir <lie En t s t ehung <let festen, , ,verkalkten'" Knochcnsul)stanz sein. Es mu6 also noch eine Reihc anderer Faktoren t)eteiligt scin.

Nach den Lehrt)iichenl (Icr physiologischen ('heroic un(I (l(',l Angaben der Li te ra tur t r i t t gegeniil)er dem (~ehalt (les seincr ()r~anis('hen Sub-


stanzen beraubten Knoehens an Calcium, Phosphaten, Carbonaten und auch Magnesium der Gehalt an Kal ium und Natr ium der Menge nach stark zuriick. Nach den Angaben in ABDEmrALDENS Lehrbueh ist das Kalium im Knochen nur zu 0,2 und das Natr ium zu 0,6 vH. enthalten. Von den bisherigen Untersuchern der Verkalkungsvorgii.nge sind diese Substanzen info]gedessen meist vollsthndig vernachl/issigt worden, wohl mit Unrecht.

Beim Nachweis des Kaliums nach I~[ACALLL'.~I entsteht durch dell Zusatz yon Koba]tnatr iumhexani t r i t ein Kobaltkal iumhexanitr i t , durch Zusatz yon Glycerin und Schwefelammonium bildet sich ein dunkel- braunes Kobaltsulfid. Bei der Untersuchung der Knochenentwicklung des Schgdels auf Kalium erhielt ich konstant Iolgende Bilder: Die Bindegewebsfasern und die Bindegewebszellen geben, wie eine leiehte sehwarzbraune Fgtrbung auzeigt, eine mttBig positive Reaktion. Wiihrend sich die Knochenb~ilkchen tief dunkclbraun-sehwarz darstellen, und auch die periphere Osteoblastentapete eine s tark positive t{eaktion zeigt, bleibt der dazwischen gelegene osteoide Randsaum so hell (ganz lcicht gelb- braun), dab man im Vergleich zu den anderen Elemenben desselben Schnittes, z .B. den kollagenen Bindcgewebsfasern, kaum von einer positiven Reakt ion sprechen kann. So ist also die fertig ausdifferenzierte, , ,verkalkte", Knoehengrundsubstanz gegeniiber den osteoiden Rand- siiumen dureh ihren relativ hohen Kaliumgehalt ausgezeiehnet (Abb. 4). Wie Untersuchungen an Siebbeinpl/ittchen und anderen Schgdel- knochen der Maus zcigten, gibg nicht nur der embryonale Knochen, sondern auch der Knochen dee erwaehsenen Tieres eine s tark positive Kaliumreaktion. Wenn wir uns fragen, welche Bedcutung der oben geschilderte Kaliumbefund fiir den Verkalkungsvorgang bei der Knochen- entwicklung besitzt, so will ieh hier erst andere Untersuchungsbefunde meiner Experimente erwghnen.

Nach LIESEGANG U.a. zeigt der embryonale Knochen eine saure t leaktion. Ich habe das durch f o l g e n d e - wie ich weiB, ]eider nicht ganz unangreifbare --- Methode nachgepriift. Ich bedeckte Spgne, die ich von den Extremit~ttenanlagen lebendfrischer, 10- bis 14tggiger Hiihnerembryonen abschnitt, mit versehiedenenIndikatorl6sungen, und bekam dabei jedesmal Iolgenden Befund: Der embryonale Knochen zeigte bei Zusatz des Indikators Bromphcnolblau (Farbumschlag bei p s =--3,0--4,6; Angaben naeh MICgAELIS) nach einigen wenigen Se- kunden einen starken Farbumschlag. Wenn man annehmen will, dag die Xnoehcngrundsubstanz wirklich so stark sauer reagiert, wic die Indikatorenuntersuchung anzuzeigen scheint, so muB man sich fragen, wie sich die Eiweil3k6rper verhalten, da die moisten dcr bckanntcu EiweiBk6rper bei PH 4,0 schon als Si~urceiweig vorhanden sind. Bisher ist nur ein Eiweigk6rper bekannt, der bei so stark saurer Reaktion der

Elektrolytreaktionea auf das Verkalkungsproblem bei der Osteogenese. 71

Lage seines isoelektrischen Punktes nach noch negative Ladung auf- weisen wfirde; es ist das yon FttRTH entdeekte und yon W6ImIscg hier- auf untersuchte Myoproteid. Es beweist uns jcdcnfalls das Myo- proteid, dai] im lebenden K6rper Eiweiftk6rper vorkommen, die bei stgrker saurer Reakt ion noch negative Ladung besitzcn. Der Epit)hysen- knorpel gab mit Bromphenolblau keinen Farbumschlag, ebensowenig das anhaftende Bindegewebe sowie die BlutgefSl~e dcr Knochcnanlage. Mit aller dnrch die Unsichcrheit der Methode gcbotenen Reserve li~[.It sich dar ius folgern, daft die Knochensubstanz einc saurc l~eaktion besitzt, die um PH =: 4,0 anzusetzen ist. Diese Reaktion wird nicht von dem umgebenden Gewebe gegebcn. Fiir die , ,Verkalkung" scheint also eine gewisse Siiurespannung n6tig zu sein, bei der, falls alle iibrigen organischen und anorganischen Stoffwechselbedingungen erffillt sind, die Ents tehung jener l~{asse erfolgt, die wir als verkalkle Knochen- substanz bezeichnen. Die Notwendigkeit eincr best immten H-Konzen- t rat ion fiir die Entstehung , ,verkalkter" Knochensubstanz geht aus zahlreichen Literaturangaben hervor. Ich verweise auf LIESEGANG u/l([ M. B. SCI~MrDT, der in der oben angegebenen Arbeit betont, dal3 (lie Verkalkung bei der 0steogenese in einem saurcn Milieu crfolgt, l~A1m jr. ist zugunsten seiner Theorie der Verkalkungsvorgitnge zwar anderer Meinung, doch hat er die einschlSgigen Verhiiltnisse offcnbar nichC selbst am lebendfrischen Material untersucht. Die Modellversuehe PFAUND- L~Rs sowie FREUDENBERGS und GYORGYS fiber Kalkbindung (lurch Knorpel und andere Gewebe lassen sich natiirlich auch nicht gegen die tats/ichlichen Befunde, die man am verkn6ehernden Material selbst erhebt, auswerten. Es wird nun angenommen, daft die zum Fcstwerden der l~nochensubstanz nStige Siturespannung (lurch gcwisse inter- mediiire Stoffwechselprodukte des Eiweii~stoffwechsels hergestellt wird. Naeh den oben auseinandergesctzten Kaliumbefunden licgt es nahe, dem prim~rcn Kaliumphosphat , das bekanntlich naeh der sauren Rich- tung hiu dissoziiert, eine bedeutsame Rolle daftir zuzuschreiben, da[.I eine best immte H-Spannung am Orte der KnochenbSlkehenbihlung entsteht, bei der es im wcichen, osteoiden Gewebe zur Entstehung (ler verkalkten Knochensubstanz kommt. Wenn auch nicht direkt, so wiirde damit doch indirekt das Kal ium einer der ,,Kalk/~inger" sein. Ffir das primiire ~a t r iumphospha t , das sich leider bisher dem Nachweis ent- zieht, lhftt sich eine iihnliche Bedeutung wenigstcns vermuten. Die Osteoblasten tragen durch Kaliumspeicherung und spiitere Abgabe in die osteoide Substanz dazu bei, das Ionenmilieu zu schaffen, bei dem dann das Festwerden des Knochcns stattf inden kann. Es liegt mir ferne, die Bedeutung der intermediiiren Eiweiftstoffwechselprodukte fiir den Verkalkungsvorgang bei der Osteogenese leugnen zu wollen, wies ich doch schon eingangs darauf hin, wie wichtig ffir aUe solche Vorgimge


dic Ber~icksichtigung aller Teile des Gesamtstoffwechsels ist. Immerhin scheint mir durch die mikroehemische Analyse ein neuer und fruchtbarer Gesichtspunkt ftir unsere Anschauung veto Verkalkungsvorgange bei der Osteogenese gewonnen zu sein.

Der Vollsthndigkeit h~lber will ich erw~ihnen, dab dureh die Ber- linerblaureak~ion bei direkter Verarbeitung meines mSglichst lebendfrischen Materials sowohl die neugebildeten Knochenb51kchen, wie die osteoiden S~ume und die Osteoblasten eine vollst~indig negative Reakt ion g~ben. Ffir die bearbeiteten Ob]ekte scheint demnaeh das Eiseu bei dem Verkalkungsvorgange w~ihrend der Sch~idelentwicklung keine Rolle zu spielen.

Uber racine ~esul ta te bei der Untersuchung des Verkalkungsvor- ganges whhrend dcr peri- und enchondralen VerknScherung helle ich demn~ehst andernorts beriehten zu kSnnen.

Zusammenfassend zcigt sieh ~lso, dab bei der 0steogenese offenbar (lie Osteoblasten die Aufgabe haben, durch Speicherung und Abgabe yon Calcium, Phosphaten, Kal ium und w~hrscheinlich auch anderen Elektrolyten ein best immtes ]:onenmilieu zu schaffen, das dann auBer- ha]b der Ze]len selbst den yon den Osteoblasten abgesonderten EiweiL~- kSrper (vgl. ~IAXIMOW, WEIDENI~EICK U. a.) mi t samt den angereieherten Ionen automatiseh festwerden l~iBt. Das eigentliehc Festwerden findet ~ber ohne Mitwirkung der Zellen in der Zwischensubstanz start, und cs zeigt sich die interess~ntc T~tsache, da~ diese VorgSnge, die in der Zwischcnsubstanz automatisch erfolgen und nieht eigentlich als Lebens- vorg~inge aufzufassen sind (vgl. USXKE-T.L), der chemischen und physikalisch-chemischen Analyse zug~i.nglich sind, wfihrend xvir bei der Auf- 16sung der cigentlichen ,,Lebcns"erscheinungen an den Zellen selbst auf dicsem Wcge stets schlieBlich auf uniiberwindbare Widerstgnde stoBen. Wie man zur Zeit wohl fiberwiegend glaubt, sind im fertigen Knochen die anorganischen Substanzen in der Kit tsubstanz, nicht in den Fibrillen, lokalisiert. Nach v. EBN):g und W.aLTER GERHARDT ist anzunehmen, dab sic ,nit der Eiweif~komponente der Ki t t substanz eine Komplexverbindung bilden, die sich in kolloid~lem Zerteilungszustand befindet. ])iese Annahme wird auch yon F~EUDENBERO und G:~'6Ray vertreten. ~tABL jr. spricht in seincr neuesten Arbeit 1924 im VmCHOW- schen Archly wieder yon , ,Knochencrden" und fiihrt TANAK.~ an, nach dessen Untersuchungen oft im K5rper , ,Verkalkung" bei gleichzeitiger Verarmung der EiweillkSrper an diesen Stcllen vorkommt. Wenn R_~nL jr. das in diesem Zusammenhang auf den Knochen wiihrend und nach Vollcndm~g der Verkalkung bei der Osteogenese beziehen will, so ist das sicher falsch. Wie jcdes gewShnliche, etw~ mi t H~m~toxylin- Eosin gefgrbte Schnittpr~iparat des entkalkten jungen Knochens uns zeigt, ist die Eiwei[lkomponente der ~lteren, festeren Knochensubstanz

Elektrolyt reakt ionen auf das Verkalkungsproblcm bei der Osteogencsc. 73

t i e f e r r o t g c f i i r b t u n d dami i ) a ls d i c h t c r a n z u s c h c n Ms d ic G r u n d s u b s t a n z

j i i n g e r e r P a r t i e n u n d d e r o s t e o i d c n S/ fume, (lie s ich n u r 1 ) lagro t auf -

f i i rben . E s h a n d e l ( s i ch a l so o f f e n s i c h t l i c h b e i m F e s t w e r ( l c n d c r K n o c h c n -

g r u n d s u b s t a n z u m Z u s t a n d s v e r / t n d e r u n g e n e ines Kol lo ids , w e n n d a s

g e e i g n e t e I o n e n - u n d s o n s t i g e Mi l i eu c n t s t a n d c n ist , n i c h t u m A b l a g e -

r u n g y o n K n o c h e n e r d e n , wie sic m i t e r a n d e r c n B e d i n g u n g e n , r ac i s t woh[

p a t h o l o g i s c h e n , i m K S r p e r a ls e c h t e , , V e r k a l k u n g " v o r k o m m e n m a g .

t - I c r rn Geh . R a t M. ]3. SCH),IIDT sowie H e r r n P r o f e s s o r ACKER~tANN

u n d H e r r n P r o f e s s o r WEINLANI) b i n i ch f i i r m a n c h e n g u t c n R a t wiih-

r e n d m e i n e r A r b e i t zu g r o B e m D a n k v e r p f I i c h t e t .

Die Bilder diescr Arbei t sind yon dem Laboran ten unseres Insti tutes, He r rn Kuns tmale r H~R)IA?CSr PFEIFFER, gczeiehnet.

L i t e r a t u r v e r z e i c h n i s .

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