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Prüfungen Zwei-Fach Bachelor & Bachelor Berufskolleg:
Klausur am 27. Juli
Bachelor of Science:
Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, 20-30 Min
Prüfer Botanik:
Finkemeyer, Kudla, von Schaewen
Prüfer Mikrobiologie:
Fetzner, Meinhardt, Philipp, Steinbüchel
Prüfer Zoologie:
Klämbt, Lammel, Paul, Weber, Zeis
Prüfungen Bachelor of Science:
Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, 20-30 Min
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- mit Tauschpartner
- bis Mitte Juni
Prüfungsunterlagen 2 Wochen vor Ihrem ersten
Prüfungstermin im Dekanat abholen
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Zellbiologie und Physiologie
Woche 3
(4.5.-8.5.2015)
Bettina Zeis Institut für Zoophysiologie
Eva Klumpen, Christian Lischka, Chrishanti Lowe, Toni Weinhage
Enzymatische Metabolitbestimmung
Enzymatische Laktatbestimmung
1. Der biologische Hintergrund
funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation
Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel
2. Der methodische Hintergrund
Lambert-Beer‘sches Gesetz & Photometrie
enzymatische Metabolitbestimmung
Energiestoffwechsel
Kohlenhydrate
Glykolyse
Pyruvat
Proteine
Aminosäuren
NH3 Alanin
Harnstoff
cyclus
Fette
Glycerin, Fettsäuren
ß-Oxidation
Acetyl-CoA
Citratcyclus
Atmungskette
NADH O2
ADP ATP
Glykolyse
Voet & Voet: Biochemie VCH 1994
Glucose
Pyruvat
NAD+
NADH+H+
2 ADP
+Pi
2ATP
Substratketten-
Phosphorylierung
Atmungskette = oxidative Phosphorylierung
I NADH-Ubichinon-Reduktase
II Succinat-Ubichinon-Reduktase
III Ubichinon-Cytochrom-c-Reduktase
IV Cytochrom-C-Oxidase
V ATP-Synthase, F0F1-ATPase
O2
Energieausbeute
Glycolyse + Citratcyclus +
Atmungskette:
38 (36) ATP je Glucose
Energiestoffwechsel Kohlenhydrate
Glucose
Glykolyse
Pyruvat
Acetyl-CoA
Citratcyclus
Atmungskette
NADH O2
ADP ATP
2 ADP
+Pi
2ATP
NAD+
NADH+H+
NAD
NADH
NAD
Pyruvat
NAD+
NADH
+H+
L-Laktat Laktatdehydrogenase
LDH
NAD+
Funktion der Milchsäuregärung
1. Entfernen des Glykolyse-Endproduktes Pyruvat
2. Oxidation von NADH zu NAD
(Regeneration des Elektronenakzeptors NAD)
Ablauf der Glykolyse unter
anaeroben Bedingungen, ATP-Gewinnung
Laktatdehydrogenase
Voet & Voet:
Biochemie VCH 1994
Nativ als
Tetramer
Je UE ca.
330 aa
36 kDa
Stereospezifität
Laktatdehydrogenase
LDH
Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+
COO-
HO-C-H
CH3
COO-
C=O
CH3
Oxidation Reduktion
In der Zelle
Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel
1. Funktionsbedingte Anaerobiose
Exzessive Muskeltätigkeit (Endspurt bei Beutejagd, Fluchtreaktionen)
Sauerstoff ist vorhanden, reicht aber nicht aus
Atmungskette und Citratcyclus laufen auf Hochtouren
Kapazität der Atmungskette ist überschritten, Blutkreislauf kann trotz erhöhter Perfusion
nicht schnell genug Sauerstoff nachliefern
kurzfristige Bereitstellung von ATP durch zusätzliche Milchsäuregärung
2. Biotopbedingte Anaerobiose
Sauerstoffmangel im Umgebungsmedium (z.B. eutrophierte Gewässer, große Höhe)
Sauerstoff steht nicht zur Verfügung, Atmungskette und Citratcyclus kommen zum
Erliegen
Reaktion: Stoffwechselabsenkung (metabolic depression)
langfristig Energiegiegewinnung durch alternative Stoffwechselwege möglich
Akkumulation von Laktat, Succinat, Acetat, Propionat, Opinen
Enzymatische Laktatbestimmung
1. Der biologische Hintergrund
funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation
Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel
2. Der methodische Hintergrund
Lambert-Beer‘sches Gesetz & Photometrie
enzymatische Metabolitbestimmung
Laktatdehydrogenase
LDH
Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+
COO-
HO-C-H
CH3
COO-
C=O
CH3
Oxidation Reduktion Enzymatische
Laktatbestimmung
Lambert-Beer‘sches Gesetz
Licht h . n Lösung des Chromophors ankommendes
Wellenlänge g mit Konzentration c Licht
Io Schichtdicke (d) 1 cm I
I -2,303 e . c . d
= e Io
Extinktion E = log = e . c . d Io
I
Extinktionskoeffizient e
für NADH: e340 nm = 6,3 l . mmol-1 . cm-1 Transmission: 100 . I / Io
(Angabe in %)
Zeitverlauf enzymatischer Reaktionen
Zeit (min)
0 1 2 3 4
E
0,00
0,25
0,50
0,75
1,00
Enzym-
zugabe DE
DE
Dc =
e * d
Der Praktikumsversuch
Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose
Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der
Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender
Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer
GGruppe
Aktives Tier: Hämolymphentnahme nach
1 / 2
2 min
3 / 4
4 min
5 / 6
6 min
7 / 8
7 min
9 / 10
8 min
11/12
9 min
Je Gruppe:
1 Ruhewert ohne
Aktivität (0 min)
1 Wert nach Aktivität
vom gleichen Tier
Durchführung
- Hämolymphabnahme (Spritzen und Kanülen am Arbeitsplatz liegen lassen)
- Hitzedenaturierung der Proteine (Thermoblock 10 min)
- Zentrifugation (10 min 14000 rpm)
Pellet: denaturierte Eiweiße, Zellfraktionen
Überstand: niedermolekulare Metabolite
- enzymatische Laktatbestimmung
Photometrische Messung
1. Leerwert: Extinktionsänderung ohne Laktat
2. Standard, Kalibrierung (Messung bekannter
Laktatkonzentrationen)
3. Lösung unbekannter Laktatkonzentrationen
(Hämolymphproben)
Photometrische Messung
Leerwert Standard Probe
Puffer 860 µl 860 µl 860 µl
NAD 20 µl 20 µl 20 µl
Wasser 100 µl ad 100 µl ad 100 µl
Standard 10/20/30 µl
Probe 10/20 µl
E vorher
LDH 20 µl 20 µl 20 µl
1 h 37 °C
E nachher
Der Praktikumsversuch Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose
Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der
Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender
Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer
Je TISCH:
1 Ruhewert ohne
Aktivität (0 min)
1 Wert nach
Aktivität
vom gleichen Tier
Gruppe Ruhewert
Laktat
(mmol/l)
Null
Aktivität
Aktivitätsdauer
(Minuten)
Nach
Aktivität
Laktat
(mmol/l)
1/2 1
3/4 2
5/6 3
7/8 4
9/10 6
11/12 8
Protokoll:
1. Einleitung
2. Material und Methoden
3. Ergebnisse
Tabelle Original-Messwerte (eigene Gruppe)
Kalibrierungsgerade (Diagramm und Geradenfunktion, eigene Gruppe)
Berechnete Laktatkonzentration der Hämolymphproben (eigene Gruppe)
Tabelle der Ergebnisse aller Gruppen Grafik des Zeitverlaufs
Beschreibung der Ergebnisse in Textform
4. Diskussion
Standard für grafische Darstellungen:
• XY-Plot!
• Lineare Achsen!
• Achsenbeschriftung: Parameter und Einheit!
0
2
4
6
8
10
12
1 1,5 2 2,5 3 4 5 8 11 20
Lä
ng
e (
mm
)
Alter (Tage)
Alter (Tage)
0 5 10 15 20
Län
ge (
mm
)
0
2
4
6
8
10
Protokollstandards
Legenden
- befinden sich
oberhalb von Tabellen
unterhalb von Abbildungen
- fassen die Aussage der Abbildung (Tabelle) zusammen:
Welche Parameter wurden untersucht?
Was ist das Hauptergebnis?