Praktikum Instrumentelle Analytik Seite 1
Gaschromatographie mit Massendetektion GC-MS
1 Lernziele Aufbau und Bedienung eines Gaschromatographen, Detektorarten und Einsatzmöglichkeiten, Ursachen
der Retention in der GC, Charakterisierung der Retention über Retentionsindices, Charakterisierung der
Polarität stationärer Phasen über Index-Differenzen, Unterschied zwischen apolaren und polaren
stationären Phasen, Temperaturgradient, Optimierungsparameter in der Kapillar-GC,
massenspektrometrische Detektion mit EI+-Ionisation, Identifizierung von Substanzen durch MS,
Interpretation einfacher Massenspektren, Quantifizierung durch Standardaddition, Anwendung eines
internen Standards
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Inhalt
1 Lernziele ........................................................................................................................................... 1
2 Vorausgesetzte Grundkenntnisse .................................................................................................... 3
3 Theoretische Grundlagen ................................................................................................................. 3
3.1 Retention in Relation zur chemischen Struktur der Probe und der stationären Phase ........... 4
3.2 Grundlagen der massenspektrometrischen Detektion ............................................................ 4
3.3 Ionisationsmethoden ............................................................................................................... 4
3.3.1 Elektronen(stoß)-Ionisation ................................................................................................. 4
3.3.2 Chemische Ionisation .......................................................................................................... 4
3.4 Wichtige Fragmentierungsreaktionen organischer Ionen ........................................................ 5
3.4.1 C-C Bindungsspaltung in gesättigten Kohlenwasserstoffen:............................................... 5
3.4.2 Allylische Spaltung:.............................................................................................................. 6
3.4.3 Benzylische Spaltung: ......................................................................................................... 6
3.4.4 α-Spaltung in Carbonylverbindungen: ................................................................................. 7
3.4.5 α-Spaltung bei Halogenverbindungen: ................................................................................ 7
3.4.6 Retro-Diels-Alder-Spaltung: ................................................................................................. 7
3.4.7 Oniumfolgewanderung (sekundäre Fragmentierung): ......................................................... 7
3.4.8 McLafferty-Umlagerung: ...................................................................................................... 8
4 Analyse umweltrelevanter Phenole .................................................................................................. 8
5 Gaschromatographie (GC-MS) Versuch 2: ...................................................................................... 9
5.1 Analytik von Phenolen nach der internen Standard-Methode ................................................. 9
5.2 Messziele und Arbeitsvorschriften ........................................................................................... 9
5.3 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 1: .................................................... 10
5.4 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 2: .................................................... 10
6 Datenblatt für GC-MS-Messungen ................................................................................................. 11
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2 Vorausgesetzte Grundkenntnisse Definition der Gaschromatographie, Theorie der Chromatographie (kinetische Theorie, Theorie der
Böden, dynamische Theorie), Definition und Berechnung chromatographischer Kenngrößen, Aufbau
eines GC-Systems, Detektionsmöglichkeiten in der GC, stationäre Phasen in der GC, gepackte GC-
Säulen, offene Kapillarsäulen, Temperatureinfluss auf die Retention in der GC, Beeinflussung der
Auflösung chromatographischer Peaks, Datenanalyse (Berechnung von Mittelwert,
Standardabweichung und Vertrauensbereich), -Spaltung als Fragmentierungsreaktion von
Halogenverbindungen
Vorzubereitende Fragen:
Für GC-MS:
Wie funktioniert die Elektronenstoßionisation? Schreiben Sie die allgemeine Reaktionsgleichung auf!
Warum fragmentieren Ionen üblicherweise nach Elektronenstoßionisation? Warum fragmentieren Ionen
kaum nach chemischer Ionisation?
Wie wird die Masse der Ionen bestimmt? Wie werden die gebildeten Ionen detektiert?
Was kann man aus dem Fragmentierungsmuster aussagen? Wie wird die Fragmentierung zur
Identifizierung verwendet?
Zeichnen Sie die Strukturformel von 2-Chlorphenol, 2,4-Dinitrophenol und 2,4-Dimethylphenol!
Welche Probenvorbereitungsmethode kann man zur Isolierung und Anreicherung von Phenolen aus
wässrigen Lösungen anwenden? Geben Sie ein Beispiel für ein Trennsystem!
Warum wird in der GC für die Quantifizierung ein interner Standard verwendet?
Skizzieren Sie einen Kalibriergraphen für Standardaddition (inkl. Achsenbeschriftungen) und zeichnen
Sie den Analysenwert im Graphen ein!
Was sind die Vorteile (mind. 2) der Standardadditionsmethode gegenüber der Methode des externen
Standards?
Was sind die Nachteile (mind. 2) der Standardadditionsmethode gegenüber der Methode des externen
Standards?
3 Theoretische Grundlagen
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3.1 Retention in Relation zur chemischen Struktur der Probe und der stationären Phase
Es gibt eine Vielzahl chemisch unterschiedlicher stationärer Phasen, die einen breiten Polaritätsbereich
abdecken (z.B. Squalan bis Polyethylenglycol). Für die Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass die meisten
Trennungen auf unpolaren Polymethylsiloxanphasen mit unterschiedlichem Phenylgruppengehalt
durchgeführt werden können. Die Polarität nimmt dabei mit steigendem Phenylgehalt zu. Weitere
chemische Gruppen können zusätzlich eingefügt sein (z.B.: Cyanopropylgruppen wie bei der
vorliegenden Trennsäule). Als gängige polare stationäre Phasen sind Polyethylenglycolphasen im
Einsatz. Oft ist es auch von Interesse, das Retentionsverhalten chemischer Verbindungen in
Abhängigkeit von deren Struktur und der Art der verwendeten stationären Phase zu verstehen und zu
interpretieren.
3.2 Grundlagen der massenspektrometrischen Detektion
3.3 Ionisationsmethoden
3.3.1 Elektronen(stoß)-Ionisation
Elektronen werden aus einem Wolfram- oder Rheniumfilament emittiert und im elektrischen Feld (ca.
70 eV) beschleunigt.
Etwa jedes tausendste Molekül wird ionisiert.
Die kinetische Energie des Elektrons e- reicht aus, bei einem Zusammenstoß mit einem
Substanzmolekül ein weiteres Elektron herauszuschlagen. Es entsteht dadurch ein radikalisches
Molekülion M+.
e2MeM Stoß
Die geringe Masse und die hohe Energie der beschleunigten Elektronen führen zu hoher Rotations- und
Schwingungsanregung der Molekülion-Radikale. Die Radikalionen zerbrechen in Einzelfragmente, den
so genannten Fragmentionen.
Vorteile:
Fragmentierungsreaktionen können wichtige Daten zur Struktur der Substanz liefern.
Ionisation ist technisch einfach durchführbar und erzeugt einen recht starken Ionenstrom.
Nachteile:
Fragmentierung kann manchmal so stark sein, dass eine Zuordnung zum Molmassenpeak (M+.) nicht
mehr möglich ist.
Überführung in Gasphase zuvor notwendig (Probleme bei thermisch instabilen Proben)
3.3.2 Chemische Ionisation
Zur Ionisation wird ein Reaktionsgas, z. B. Methan, verwendet, welches dem Trägergas, z. B. Helium,
zu X% beigemischt wird. Dieses wird durch Elektronenstoß ionisiert.
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Die gasförmigen Analytmoleküle werden dann durch Zusammenstoß mit den im Überschuss
vorliegenden Reaktionsgasionen ionisiert. Mit Methan als Reaktionsgas laufen folgende Reaktionen ab:
daneben auch
53523 HC,HC,CH etc.:
Mögliche Reaktionen mit dem Analyten sind Protonenübertragungen in der Gasphase:
Dabei erhöht sich die Masse des Analyten um 1 bei den ersten zwei Reaktionen und erniedrigt sich um
1 bei der letzten Reaktion.
Vorteile:
Milde Ionisation, da energetische Anregung über indirekten Weg gemindert
kaum Fragmentierung
Nachteile:
größerer technischer Aufwand, da Druck in der Ionisationskammer höher ist als im Massenspektrometer
(ca. 1 Torr notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Zusammenstößen zu erzeugen).
Kein Molpeak wird erhalten, entweder (M+1)+ oder (M-1)--Peak.
3.4 Wichtige Fragmentierungsreaktionen organischer Ionen
3.4.1 C-C Bindungsspaltung in gesättigten Kohlenwasserstoffen:
Die Carbeniumionen zeigen dieselbe Stabilitätsabstufung wie in Lösung, nämlich
tertiär > sekundär > primär. Infolgedessen ist eine Verzweigungsstelle in einem längeren Paraffin meist
mit Sicherheit zu erkennen.
Folgende Spaltung tritt nur als sekundärer Prozess auf:
C1 C2 C2C1+
+°
°
6252
42252
425
HCXXHHC
HCXHXHHC
CHXHXHCH
25243
3544
HHCCHCH
CHCHCHCH
eCHeCH 244
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3.4.2 Allylische Spaltung:
Die allylische Spaltung wird begünstigt, da die dabei entstehenden Allylkationen durch Mesomerie
stabilisiert werden.
3.4.3 Benzylische Spaltung:
-Spaltung an einem Kohlenstoffatom, das mit einem Heteroatom mit verfügbarem freiem
Elektronenpaar substituiert ist:
+ +C1 C2 C3 C1 C2 C3
+ °
+ °C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4
+C3C2C1
°+
m/z 91
CH2 C CH2 + + +
Tropylium-Ion
+
m/z 65
- °H3C
C2H2-
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3.4.4 α-Spaltung in Carbonylverbindungen:
3.4.5 α-Spaltung bei Halogenverbindungen:
3.4.6 Retro-Diels-Alder-Spaltung:
3.4.7 Oniumfolgewanderung (sekundäre Fragmentierung):
+
C
R
R R
X|
-RCR R
X|
+C
X
R R
+ °
°
°
C RR
O+
R C O+
C OR +
°R-
C X
+
C + X
°
°
+ ° °+
+
O,S,NHX=
C
H
C X C
R
-RC
H
C X C+ C
C
HX
C
+°
°
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3.4.8 McLafferty-Umlagerung:
4 Analyse umweltrelevanter Phenole Phenol (Carbolsäure) kommt natürlich z.B. in Kiefern und im Steinkohlenteer vor. Als Nebenprodukt fällt
es in Kokereien und Braunkohleschwelereien an, es ist ein luftverunreinigender Stoff und wirkt
cancerogen auf die Haut und die Atemorgane, chronische Vergiftungen zeigen sich durch
Nierenschäden. Phenol ist der Grundstoff für die substituierten Phenole. Typische Beispiele sind
Nitrophenole, Chlorphenole und Pentachlorphenol PCP. Die Strukturen von Phenol und einigen
substituierten Phenolen sind dargestellt.
In der Industrie sind Phenole vorrangig im Altöl, in Farben und Lacken, in Gießereien, in der
Holzverarbeitung, in der Kunststoffherstellung und in Schädlingsbekämpfungsmitteln zu finden. Die drei
Nitrophenole (2-Nitrophenol, 3-Nitrophenol und 4-Nitrophenol) sind giftig, wenn sie durch Einatmung
oder Hautkontakt in den Organismus gelangen. Zwei- und dreifach nitrierte Phenole sind zudem
explosionsgefährlich (Handling dieser Komponenten nur im feuchten Zustand!). 2,4,6-Trinitrophenol,
Trivialname Pikrinsäure, ist ein sehr potenter Sprengstoff und zudem eine starke Säure. (Warum?)
Chlorphenole sind in ihrer cancerogenen Wirkung meist nicht so stark wie natives Phenol. Werden aber
höher chlorierte Phenole erhitzt, können sich unter HCl-Abspaltung hochgefährliche, mehrfach
chlorierte Dioxine und Dibenzofurane bilden. Einfache Chlorphenole sind schwer in Wasser und leicht
in Alkohol löslich und reichern sich dadurch in Fettgeweben an. Die biologische Abbaubarkeit ist sehr
schlecht. Chlorphenole entstehen z.B. als Zwischenprodukt bei der Arzneimittelherstellung.
Pentachlorphenol (PCP) ist hochtoxisch für Mikroorganismen, Pflanzen, Insekten, Weichtiere und
Fische. Nachdem sein toxisches Potential auf Menschen längere Zeit bestritten worden war und dieses
Toxin in fungizid wirkenden Holzlasuren selbst in hohen Konzentrationen frei verkäuflich gewesen war,
besteht mittlerweile ein totales Umgangsverbot für PCP. Viele Phenole sind stark gewässerschädigend
und beeinträchtigen schon in geringen Konzentrationen den Geschmack von Wasser und Fischen.
Chlorhaltige Reinigungsmittel, bzw. Fungizide können durch Schimmelpilze in Trichloranisol umgesetzt
werden, das schon in Spuren dafür sorgt, dass Wein „korkt“ und ungenießbar wird (Adaptiert aus:
Wasser-Wissen, Institut für Umweltverfahrenstechnik, Universität Bremen, www.wasser-wissen.de).
HX
R + R +X
H
X= CH2,O,S
° °+X
H
°
+
+
R X
H
°
+
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Phenol, 2-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4-
Dimethylphenol
Der Nachweis von Phenolen in Böden, Oberflächengewässern und Abwässern erfordert neben
zuverlässigen Extraktionsmethoden auch effektive Anreicherungs- und clean-up-Verfahren zur
Abtrennung der reichlich vorhandenen Störsubstanzen. Wichtig für eine genügend genaue und auch
rechtlich abgesicherte Identifizierung mittels GC sind mehrere Aspekte: Einsatz spezifischer Detektoren
(welche?) und optimierter Temperaturprogramme, Verwendung von Surrogat-Standards
(Modellsubstanz, die stellvertretend für alle Analyten der Probe vor der Aufarbeitung zugesetzt wird) zur
Kontrolle der Quantifizierung und Verbesserung der Identifizierung, Absicherung der Analyse auf einer
zweiten Säule unterschiedlicher Polarität, zusätzliche Verifizierung mit massenspektrometrischer
Detektion. Im Rahmen dieser Aufgabe sollen einige Phenole qualitativ und quantitativ analysiert werden.
In der Wasser- und Bodenanalytik hat sich zur Probenvorbereitung die Festphasenextraktion
durchgesetzt. Ihr Vorteil ist die Vielzahl der nutzbaren Wechselwirkungen, der geringe
Lösungsmittelverbrauch und der relativ geringe Zeitaufwand. Für Phenole hat sich die Verwendung
einer Octyl-Umkehrphase (RP C8-Phase) als Festphase der GC-Analytik bewährt.
5 Gaschromatographie (GC-MS) Versuch 2:
5.1 Analytik von Phenolen nach der internen Standard-Methode
Laborplatzliste und Chemikalien
Apparatur
Gaschromatograph Thermo Scientific Focus GC, massenselektiver Detektor Thermo Scientific DSQ II,
Kapillarsäule: Varian DB-624 analog, mittelpolare Phase (3,5% Cyanopropyl-, 3,5% Phenyl-, 93 %
Methylpolysiloxan, L=30 m; I.D.= 320 m, Filmdicke = 0.25 m)
Chemikalien
Phenollösungen, bestehend aus Phenol, 2-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 4-Nitrophenol, 2,4,6-
Trichlorphenol, 2,4-Dimethylphenol (interner Standard I.S.), je 10-40 mg in 100-400 mL Acetonitril (100-
400 mg/L)
5.2 Messziele und Arbeitsvorschriften
Messziel 1: Qualitative Analyse einer Phenol-Mischung
1 µL einer Mischung aus 5 Phenolen plus internem Standard (je ca. 100-400 mg/L in Acetonitril –
Mischung wird bereitgestellt) werden in ein Vial mit Durchstech-Septum gegeben und automatisch
injiziert (splitless mode) und mit folgendem Temperaturgradienten getrennt: 2 min auf 77 °C, auf 79 °C
mit 1°C/min, auf 260°C mit 50°C/min, 260°C für 2 min. Trägergas ist He mit 54 kPa; Injektor-
OH OH
Cl
OH
CH3
CH3
OH
NO2
NO2
OH
NO2
OH
Cl
Cl
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Temperatur: 240°C, Detektor-Temperatur: 240 °C, Interface-Temperatur: 260°C, Scanbereich 45-400
Da.
Die Einzelsubstanzen werden über Datenbankvergleich und manuelle Massenspektren-Interpretationen
zugeordnet. Die jeweiligen Retentionszeiten werden ermittelt.
Messziel 2: Quantitative Analyse von 2,4-Dichlorphenol
Das in der Probe enthaltene 2,4-Dichlorphenol wird quantitativ nach der internen Standard- Methode
analysiert. Dazu werden 0.20-mL-Aliquote der Probe in ein 1.5-mL GC-Vial pipettiert und mit 0,10 mL
des internen Standards (Stammlösung 100 µg/L 2,4-Dimethylphenol) sowie variablen Volumina des 100
µg/mL 2,4-Dichlorphenol-Standards versetzt. Mit Acetonitril wird auf ein Gesamtvolumen von je 1,00 ml
aufgefüllt. Die Endkonzentrationen von 2,4-Dichlorphenol bezogen auf das Gesamtvolumen (1 mL)
sollen 0,0, 10,0, 20,0, 30 µg/mL betragen.
Jede Standardmischung wird dreifach (20 µg/L Mischung vierfach) im SIM-Modus (welche m/z-Werte?)
analysiert. Sonstige Bedingungen wie oben.
5.3 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 1:
Qualitative Analyse einer Phenol-Mischung
Beispielchromatogramm der Probe und 6-Phenol-Standard mit Peakidentifizierung und Angabe der
experimentellen Bedingungen erstellen. Tabellieren Sie die Retentionszeiten der einzelnen Substanzen
in der Standardmischung und in der Probe! Ordnen Sie den erhaltenen Massenspektren die jeweiligen
Substanzen zu und geben Sie die erhaltene Spektren-Übereinstimmung in die Tabelle ein! Erstellen Sie
Beispielspektren der sechs Phenole.
Tabelle:
Substanz tR der Standards tR der Probe Spektrum Nr. Spektrum-Match m/z für SIM
Entnehmen Sie aus den Massenspektren die m/z-Werte der Einzelsubstanzen, die für eine quantitative
Bestimmung im SIM-Modus für dieses Experiment geeignet wären! Begründen Sie die Auswahl!
Schlagen Sie für die drei intensivsten Fragmentionen im Massenspektrum von 2,4-Dichlorphenol
entsprechende Fragmentierungsreaktionen vor! Begründen Sie diese.
Ergebnis der qualitativen Analyse: Die Probe enthält …
5.4 Datenauswertung und Analysenreinschrift zu Messziel 2:
Quantitative Analyse von 2,4-Dichlorphenol
Warum werden alle Peakflächen auf die Peakfläche des internen Standards normiert (Anorm =
AProbe/AI.S.)? Auftragung der Kalibriergeraden Peakfläche Anorm = b . conc. [µg/mL] + a. Die
Konzentration der Probe ergibt sich grafisch nach Lotfällung zu X-Achse. Berechnen Sie die genaue
Konzentration aus der aktuellen Geradengleichung (b, a, R2, sy).
Tabelle:
File Konzentration der
Standards [mg/l]
normierte Peakfläche
AProbe/AI.S.
gemessene
Peakfläche AProbe
gemessene
Peakfläche AI.S.
Praktikum Instrumentelle Analytik Seite 11
Angabe der Analysenfunktion: Wie wird aus dem Messwert der Analysenwert erhalten? Wichtig: Hier
sind auch aliquoter Teil, Verdünnungs- bzw. Aufkonzentrierungsschritte zu berücksichtigen!
Ergebnis der quantitativen Analyse von 2,4-Dichlorphenol in Standardform:
Die Probe enthält: ……..µg/mL 2,4-Dichlorphenol
Anzugeben ist die Konzentration von 2,4-Dichlorphenol in der Probe in [µg/mL] ± T (P%, sy, sx^, N).
6 Datenblatt für GC-MS-Messungen
Datum:
Operator:
Gruppe: Seite:
Geräte:
Säule:
Injektor (°C):
Detektor (°C): Trägergas: Druck (kPa): Fluss (total):
Fluss (Septum):
Gradient:
Injektionsmodus: Injektion (µL):
Filename Probe MS-Bedingungen Bemerkungen
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