Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen
Animalviren Bakteriophagen Pflanzenviren
Vektorvermittelt (Insekt)Mechanisch (Verletzung)Rezeptor Rezeptor
nackte NukleinsäureNukleinsäure mitProteinhülle
Meist nackte Nukleinsäure(Hershey/Chase Experiment)
Die Architektur der Viren aus den verschiedenen Reichen belebterMaterie spiegelt den äußeren Aufbau fundamentaler zellulärer Strukturen
Ihrer Wirtszellen wider
Die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Animalviren
1. Virusbindung (attachment), oft hoch spezifisch, energieunabhängig
2. Viruspenetration (Zytoplasmazugang), energieaufwändig
Definitionen:Virusrezeptor: Zelluläre Struktur die bei permissiven Zelleneine produktive Infektion vermitteln kann
Permissivität: Permissive Zellen ermöglichen die ReplikationViraler Genome. Suszeptibilität: Fähigkeit einer Zelle ein bestimmtes Virus über Rezeptoren zu binden und aufzunehmen. ⇒Rezeptoren sind nicht primär Virusrezeptoren, sondern haben wichtige zelluläre Funktionen. Viren „missbrauchen“ zelluläre Transport und Rezeptorproteine um sich Eingang in die Zelle zu verschaffen. Die hohe Spezifität dieser Erkennung ist auf eine enge Coevolution viralerRezeptorbindedomänen auf Strukturelemente zellulärer Oberflächenproteine zurückzuführen.
Beispiele zellulärer Virusrezeptoren
PVR
CD4 ICAM-1LDLR
VLA-2 Amin
opep
tidas
eN
Sial
insä
ure
Kat.
Amin
osäu
retra
nspo
rter
Phos
phat
trans
porte
r
Strategien zur Identifikation zellulärer Virusrezeptoren
1. Generierung monoklonaler Antikörper gegen Zelloberflächenstrukturen
2. Kompetitionsanalyse mit löslichen viralen und zellulären Komponenten
3. Affinitätschromatographie –biochemische Methoden
4. Genetischer Ansatz: Transfektion permissiver, nicht-suszeptibler Zellenmit cDNA Bank aus einer infizierbaren Zelllinie
Experimenteller Rezeptornachweis: Transfektion des klonierten RezeptorsIn nicht infizierbare aber permissive Zielzelle unter Rekonstitution der Infizierbarkeit
z.B. CD4 in HeLa führt zur Infizierbarkeit mit HIV
Interaktion des Poliovirusrezeptors am Fuß des „Canyons“
Worin liegt der Vorteil der gewissermaßen versteckten Rezeptorinteraktion am Boden des Canyon???
Beispiele für Virus-Rezeptorinteraktionen: 2. Influenza A
Struktur des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A
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Struktur und Geometrie des Influenza Hämagglutinin (HA) und der Neuraminidase NA)
HA Struktur: Spaltung von HA0 in HA1 und HA2
Schematische Darstellung der HA Sequenz und der3D Struktur bei neutralem pH
135 A
pH-induzierte Konformationsänderung von HA
Modell der pH-induzierten Konformationsänderungim Zuge des Fusionsprozesses
Der Membranfusionsprozess verläuft in mehreren Schritten
1. Verbrückung der beiden Membranen durch das virale Fusionsprotein
2. Annäherung beider Membranen durch Konformationsänderung
3. Ausbildung eines six helix bundle
4. Verschmelzung der beiden äußeren „leaflets“ (Hemifusion)
5. Ausbildung einer frühen Fusionspore
6. Ausbildung einer späten Fusionspore
7. Komplette Fusion beider Membranen, Freisetzung des Kapsids
Penetration und „uncoating“ an der Plasmamembran
Mechanismus der retroviralen Fusion mit der Plasmamembran
Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechendIhrer Genomorganisation
einzelsträngig
doppelsträngig circulär
(+)-Polarität (-)-Polarität ambisense
nicht segmentiert
ArenavirusPoliovirussegmentiert
Influenza A Virus
vesicular stomatitis virua (VSV)
Hepatitis δ-VirusReovirus
Prinzipien der Replikation und mRNA-Synthesenicht-retroviraler RNA-Viren
RNA Genom(+),(-), dsSynthese von mRNA
(+)Kopie des RNA Genoms
(+),(-), ds
„Transkription“mRNA-Sysnthese
Replikation
Translation in virale Proteine(Strukturproteine, regulatorische Proteine)
Verpackung in neue Virionen(Verpackungssequenzen, Strukturproteine)
RNA-abhängige RNA SyntheseRNA RNA
Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs) !!Ausnahme: Retroviren (RdDP)
RNA-abhängige RNA-Polymerasen
Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert
Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D
Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden
Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden
Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen)
Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig
Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen aufeinen gemeinsamen „Vorfahren“ hin
Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viralerund zellulärer Polymerasen
Poliovirus 3Dpol
HIV-I RT
Pol I KlenowRNA Pol T7
Metallbindung
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Tertiärstruktur der Poliovirus 3Dpol-Polymerase und generelle Strukturhomologien von Polymerasen
YGDD
Klenow T7 RNAP HIV-I RT 3Dpol
Nur in RdXPs
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Einige repräsentative Viren mit RNA-Genomen
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Funktionen akzessorischer Proteine bei derRNA-abhängigen RNA Synthese
1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment
RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt:(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteinsin den Kern dirigiert.(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD anein vesikuläres Kompartiment dirigiert.
2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize
Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen derPolymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die anspezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion.
3. Stimulation der Polymeraseaktivität
4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen
Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)
Strategien der Replikation und mRNA Synthese von RNA Virusgenomen
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Zelluläre Orte viraler RNA Synthese
Cytoplasma:Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mRNAs im Cytoplasma
Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen, Cytoskelett)
Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöhtdie Effizienz der Replikation
Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar.
Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinenbereitgestellt werden (z.B. capping von mRNAs).
Nukleus:Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus
Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären „splicing“-Apparates
Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält Kernlokalisationssequenz.
Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren
RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös- (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen
(+) Strang RNA Viren bedürfen keine aktive RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat
Polivirus hat ein 5´VpG statt CAP
Struktur und Genomorganisation des (+) StrangPicornavirus: Poliovirus
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Replikationszyklus des (+) StrangPicornavirus: Poliovirus
Bindung an PVR(Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung)
Polyproteinsynthese(VPg-Entfernung, Ribosomenbindung
an IRES Element)
Polyproteinprozessierung(P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und
RdRP)
Proteintransport in Vesikel(vesikuläre RNA-Synthese)
VPg (-) Strangsynthese
VPg (+) Strangsynthese
Zellkern
Membranvesikel
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Struktur des 5´-Endes des Poliovirus (+) Strang RNA Genoms
22 AminosäurenVPg Peptid
Phosphosäureester mit Tyr 3 von VPg
5´-Uridylrest
Hydrolyse durch zelluläre Esterase(Generierung eines 5´-Up-Endes)
Kleeblattstruktur des 5´-Endes desPoliovirus RNA-Genoms
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RNA Sekundärstrukturen „stem-loops“ und „Pseudoknoten“
„stem-loop“ Strukturen Pseudoknoten
Basenpaarungen im Stamm (stem),Keine Basenpaarungen innerhalbder Schleife (loop)
Basenpaarungen im Stamm,Basenpaarungen der Schleife mitNukleotiden außerhalb der Schleife
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Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionenviraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet
Bindung von viralem 3CD und dem zellulären Poly (rC) Bindeprotein an „stem-loop“ D und B
Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexesan Membrangebundenes 3AB Protein
„Priming“ und proteolytische Abspaltung von VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von
3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität
Elongation und (-) Strang Synthese
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„Priming“ Reaktion am 3´-Ende der Poliovirus RNA
Proteolytische Abspaltung vonVpG durch virale 3C Protease
Bindung von 3AB an Membranen(membranous web)
Uridylylierung von Tyr 3 des VPg-Teils in 3AB durch 3Dpol
Rekrutierung des polyadenylierten3´-Endes der Poliovirus RNA
Ausbildung eines „geprimten“Ribonukleoproteinkomplexesmit 2 Uriditylresten (VPgpUpU)
Elongation des (-) Stranges
Synthese eines vollständigenVPg gebundenen (-) Stranges
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Translation viraler RNA in Proteine und RNA-Synthese sind koordinierte Prozesse
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Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren
RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös- (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden.
(-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel
Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat
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Struktur und Genomorganisation des nicht segmentierten (-) StrangRhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)
leader© Flint et al. Principles of Virology
Replikationszyklus des nicht segmentierten (-) StrangRhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)
Bindung und Fusion(Freisetzung des helicalen
viralen Nukleokapsids)
Synthese von 5 mRNAs(ausgehend von leader-Sequenz)
Translation viraler mRNAs(an freien und ER-gebundenen Ribosomen)
Prozessierung und Lokalisierung des G-Proteins
(+) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)
(-) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)
Verpackung (unter Beteiligung von M-Protein)
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Genomorganisation und mRNAs des vesicular stomatitis virus VSV
Genlokalisation korrespondiert zur mRNA Menge
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Stop-Start Modell der VSV mRNA Synthese
Initiation der RNA Synthese am 3´-Ende des (-) StrangGenoms von VSV (Primerunabhängig)
Synthese einer 47 nt langen „leader“-Sequenz; Termination durch Ablösen der RNA von Polymerase
Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 1. Gens(N) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)
Synthese der N mRNA und Termination in der folgenden intergenischen Region.
Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 2. Gens (P)(nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)
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Funktion der VSV RNA-Polymerase an der Intergenregion
Komplementärer Einbau von 7A-Resten an der U7 Sequenz der IR
Verrutschen des neusynthetisierten Stranges am Template„Stottern“ der viralen Polymerase
Termination nach Einbau von ca. 200 A Resten: Polyadenylierungdurch „stotternde“ Transkription einer U7 Sequenz
Reinitiation und „capping“ der nachfolgenden mRNA(„capping“ erfolgt im Zytoplasma durch virale Polymeraseund ähnelt der cap Struktur zellulärer mRNAs)
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Die Umschaltung von mRNA-Synthese zur GenomreplikationBei VSV wird durch das virale N-Protein reguliert
Niedrige N-Proteinkonzentration favorisiert mRNA Synthese
Hohe N-Proteinkonzentration favorisiert (+) Strang Synthese© Flint et al. Principles of Virology
Struktur und Genomorganisation des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A
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Replikationszyklus des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A
Bindung über HA an Sialinsäure(Endozytose)
pH-induzierte Fusion(Freisetzung der 8 Nukleokapsidsegmente)
Kerntransport des Nukleokapsids(NP/P/RNA-Komplex über NLS)
mRNA-Synthese/Export(cap-snatching)
mRNA-splicing(NS2/M2)
Synthese von HA, NA(am rER, Transport)
Synthese von PA, PB1, PB2(Kernimport)
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Nukleäre RNA-Synthese bei dem Orthomyxovirus Influenza A
8 Segmente mit (-) Strang Polaritätals Nukleoproteinkomplex im Virion
Synthese gecappter und polyadenyliertermRNA aus (-) Strang Segmenten Inhibierbar
durch α-Amanitin und Actinomycin D !?
Genomisches RNA-Segment mit5´und 3´konservierten Regionen
(vRNA)
? „Gecappte“ mRNA mit 10-13 zellulärenNukteotiden und 3´-Poly A (mRNA)
Vollständige Kopie des (-) Segmentes(cRNA)
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Capping eukaryontischer mRNAs
Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs
Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen
Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5´Ende
Cap-Struktur stabilisiert mRNA
Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert
Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation derTranslation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations-Faktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.
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mRNA-Synthese bei Influenza A Virus: „cap snatching“„Cap“-Raub im Nucleus der Wirtszelle
Hydrolyse einer beliebige zellulären mRNA(„capping“ erfolgte durch zelluläreTransferase) durch virales Protein
Initiation der (+) Strang Synthese durchEinbau eines komplementären GTP an
vorletztem C im (-) Strang Segment:Cap-primer-abhängige Initiation
Elongation durch sukkzessivem Einbaukomplementärer Nukleotide
CpG
G
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Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes
3
51
42
1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2
2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)
3. Bindung des 3´-Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mRNA-Fragmentes zum 3´Ende
4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).
5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.
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Umschaltung von mRNA-Syntese auf Genomreplikation beiInfluenza A Virus durch Polymerasemodifikation
PB1 Polymerase wird durch die Bindungvon (-) Strang Bindung aktiviert.
Daraufhin bindet PB2 mRNAPA hat hier keine Funktion.
In Gegenwart des viralen NP Proteins erfolgt Bindung an PA. Die Polymerase PB1 wird primer-unabhängig und katalysiert eine
komplette cRNA-Synthese
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Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen
Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden
RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlustdes Proteins zur Folge.Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10Mutationen in seinem Genom aufweist.Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“
Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver-Teilung der viralen Gensegmente.Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.
RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch SprungDer Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).
Mechanismen der Ausbreitung von PflanzenvirenSpezifisches Problem bei Pflanzenviren: Undurchdringliche Zellwand.
Eintritt von Viren in die Pflanzenzelle erfolgt durch Verletzung, d.h.- Es findet keine spezifische Erkennung des Wirts statt (Planzenviren nutzen keine Virusrezeptoren)- Pflanzenviren codieren keine Hüllproteine, die am Import und Export beteiligt sind.
1. Ausbreitung über SamenÄußerliche Kontamination von Samen mit Virionen.Infektion des Embryos, bzw. einzelner Setzlinge.
2. Vegetative Verbreitung durch PfropfungPfropfung stellt eine billige und effiziente Methode der Vermehrung von Pflanzen dar und bildet gleichzeitig ideale Voraussetzungen für die vom Menschen bedingte Verbreitung von Viren. Überschreitung von Speziesgrenzen.
3. Natürliche Verbreitung durch VektorenBakterien: z.B. Agrobakterium tumefaciens (auch als Vektor für die Erzeugung transgener Pflanzen geeignet). Pilze, Nematoden, Arthropoden (Insekten, Blattläuse, Heuhüpfer, Käfer ..), Arachniden (Milben...)
4. Mechanische Wege der Verbreitung von Virenhauptsächliche Methode für experimentelle Infektionen (Einreiben von Viruspartikel in Blätter)natürlicherweise durch starke Winde, Regen.
Zwei Formen der vektorvermittelten Verbreitung können unterschieden werden:a. Nicht propagative Übertragung von Viren durch Insekten: Das Insekt ist ausschließlich Träger des Virus.b. Propagative Übertragung: Vektor vermehrt sich im Insekt, was zu einer Virusamplifikation führt (z.B. Rhabdoviren).
Symptome pflanzlicher Virusinfektionen
-Zunächst lokale Nekrosen, danach erfolgt vektorunabhängige Ausbreitung a.) von Zelle zu Zelleb.) „long distance“ über das Gefäßsystem der Pflanze (systemisch).
- Ausbreitungsprozeß ist effektiv und führt über Plasmodemata:Plasmodemata (Cytoplasmabrücken) sind natürliche Verbindungen zwischen Pflanzenzellen. „Symplasma“. Struktur: pro Plasmodesmum 10-20 aus Zellproteinen gebildete Einzelkanäle von ca. 1,5 nm Durchmesser. Ausschlußgrenze: etwa 1000 Da.Funktion: Versorgung mit Aminosäuren, Kohlehydraten, Salzen. Signaltransduktion.