Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen · Penetration und „uncoating“ an der Plasmamembran Mechanismus der retroviralen Fusion mit der Plasmamembran Kriterien

Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen

Animalviren Bakteriophagen Pflanzenviren

Vektorvermittelt (Insekt)Mechanisch (Verletzung)Rezeptor Rezeptor

nackte NukleinsäureNukleinsäure mitProteinhülle

Meist nackte Nukleinsäure(Hershey/Chase Experiment)

Die Architektur der Viren aus den verschiedenen Reichen belebterMaterie spiegelt den äußeren Aufbau fundamentaler zellulärer Strukturen

Ihrer Wirtszellen wider

Die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Animalviren

1. Virusbindung (attachment), oft hoch spezifisch, energieunabhängig

2. Viruspenetration (Zytoplasmazugang), energieaufwändig

Definitionen:Virusrezeptor: Zelluläre Struktur die bei permissiven Zelleneine produktive Infektion vermitteln kann

Permissivität: Permissive Zellen ermöglichen die ReplikationViraler Genome. Suszeptibilität: Fähigkeit einer Zelle ein bestimmtes Virus über Rezeptoren zu binden und aufzunehmen. ⇒Rezeptoren sind nicht primär Virusrezeptoren, sondern haben wichtige zelluläre Funktionen. Viren „missbrauchen“ zelluläre Transport und Rezeptorproteine um sich Eingang in die Zelle zu verschaffen. Die hohe Spezifität dieser Erkennung ist auf eine enge Coevolution viralerRezeptorbindedomänen auf Strukturelemente zellulärer Oberflächenproteine zurückzuführen.

Beispiele zellulärer Virusrezeptoren

PVR

CD4 ICAM-1LDLR

VLA-2 Amin

opep

tidas

eN

Sial

insä

ure

Kat.

Amin

osäu

retra

nspo

rter

Phos

phat

trans

porte

r

Strategien zur Identifikation zellulärer Virusrezeptoren

1. Generierung monoklonaler Antikörper gegen Zelloberflächenstrukturen

2. Kompetitionsanalyse mit löslichen viralen und zellulären Komponenten

3. Affinitätschromatographie –biochemische Methoden

4. Genetischer Ansatz: Transfektion permissiver, nicht-suszeptibler Zellenmit cDNA Bank aus einer infizierbaren Zelllinie

Experimenteller Rezeptornachweis: Transfektion des klonierten RezeptorsIn nicht infizierbare aber permissive Zielzelle unter Rekonstitution der Infizierbarkeit

z.B. CD4 in HeLa führt zur Infizierbarkeit mit HIV

Interaktion des Poliovirusrezeptors am Fuß des „Canyons“

Worin liegt der Vorteil der gewissermaßen versteckten Rezeptorinteraktion am Boden des Canyon???

Beispiele für Virus-Rezeptorinteraktionen: 2. Influenza A

Struktur des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A

© Flint et al. Principles of Virology

Struktur und Geometrie des Influenza Hämagglutinin (HA) und der Neuraminidase NA)

HA Struktur: Spaltung von HA0 in HA1 und HA2

Schematische Darstellung der HA Sequenz und der3D Struktur bei neutralem pH

135 A

pH-induzierte Konformationsänderung von HA

Modell der pH-induzierten Konformationsänderungim Zuge des Fusionsprozesses

Der Membranfusionsprozess verläuft in mehreren Schritten

1. Verbrückung der beiden Membranen durch das virale Fusionsprotein

2. Annäherung beider Membranen durch Konformationsänderung

3. Ausbildung eines six helix bundle

4. Verschmelzung der beiden äußeren „leaflets“ (Hemifusion)

5. Ausbildung einer frühen Fusionspore

6. Ausbildung einer späten Fusionspore

7. Komplette Fusion beider Membranen, Freisetzung des Kapsids

Penetration und „uncoating“ an der Plasmamembran

Mechanismus der retroviralen Fusion mit der Plasmamembran

Kriterien der Einteilung von RNA Viren entsprechendIhrer Genomorganisation

einzelsträngig

doppelsträngig circulär

(+)-Polarität (-)-Polarität ambisense

nicht segmentiert

ArenavirusPoliovirussegmentiert

Influenza A Virus

vesicular stomatitis virua (VSV)

Hepatitis δ-VirusReovirus

Prinzipien der Replikation und mRNA-Synthesenicht-retroviraler RNA-Viren

RNA Genom(+),(-), dsSynthese von mRNA

(+)Kopie des RNA Genoms

(+),(-), ds

„Transkription“mRNA-Sysnthese

Replikation

Translation in virale Proteine(Strukturproteine, regulatorische Proteine)

Verpackung in neue Virionen(Verpackungssequenzen, Strukturproteine)

RNA-abhängige RNA SyntheseRNA RNA

Virale RNA-abhängige RNA Polymerasen (RdRPs) !!Ausnahme: Retroviren (RdDP)

RNA-abhängige RNA-Polymerasen

Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert

Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D

Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden

Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden

Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen)

Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig

Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen aufeinen gemeinsamen „Vorfahren“ hin

Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viralerund zellulärer Polymerasen

Poliovirus 3Dpol

HIV-I RT

Pol I KlenowRNA Pol T7

Metallbindung


Tertiärstruktur der Poliovirus 3Dpol-Polymerase und generelle Strukturhomologien von Polymerasen

YGDD

Klenow T7 RNAP HIV-I RT 3Dpol

Nur in RdXPs


Einige repräsentative Viren mit RNA-Genomen


Funktionen akzessorischer Proteine bei derRNA-abhängigen RNA Synthese

1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment

RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt:(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteinsin den Kern dirigiert.(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD anein vesikuläres Kompartiment dirigiert.

2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize

Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen derPolymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die anspezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion.

3. Stimulation der Polymeraseaktivität

4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen

Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)

Strategien der Replikation und mRNA Synthese von RNA Virusgenomen


Zelluläre Orte viraler RNA Synthese

Cytoplasma:Die meisten RNA-Viren replizieren ihr Genom und synthetisieren ihre mRNAs im Cytoplasma

Synthese erfolgt nicht frei sondern ist an zelluläre Strukturen gebunden (Vesikel, Membranen, Cytoskelett)

Die hohe lokale Konzentration der für die Replikation notwendigen Komponenten erhöhtdie Effizienz der Replikation

Membranen stellen häufig den Ort der Verpackung neuer Virionen dar.

Problem: Alle normalerweise nukleären Aktivitäten des Wirtes müssen von viralen Proteinenbereitgestellt werden (z.B. capping von mRNAs).

Nukleus:Von den RNA Viren replizieren nur Influenza und Borna Viren im Nukleus

Vorteil besteht in der Möglichkeit der Ausnutzung des zellulären „splicing“-Apparates

Es müssen Mechanismen des Kerntransportes entwickelt werden. NP-Protein enthält Kernlokalisationssequenz.

Replikation und RNA-Synthese von (+) Strang RNA Viren

RNA von (+) Strang RNA Viren ist infektiös- (+) Strang genomische RNA kann als direkte Matrize für die Synthese von RdRP dienen

(+) Strang RNA Viren bedürfen keine aktive RdRP im Viruspartikel

Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (-) Strang Intermediat

Polivirus hat ein 5´VpG statt CAP

Struktur und Genomorganisation des (+) StrangPicornavirus: Poliovirus


Replikationszyklus des (+) StrangPicornavirus: Poliovirus

Bindung an PVR(Kapsidöffnung, RNA-Freisetzung)

Polyproteinsynthese(VPg-Entfernung, Ribosomenbindung

an IRES Element)

Polyproteinprozessierung(P1:Struktur; P2, P3: Proteasen und

RdRP)

Proteintransport in Vesikel(vesikuläre RNA-Synthese)

VPg (-) Strangsynthese

VPg (+) Strangsynthese

Zellkern

Membranvesikel


Struktur des 5´-Endes des Poliovirus (+) Strang RNA Genoms

22 AminosäurenVPg Peptid

Phosphosäureester mit Tyr 3 von VPg

5´-Uridylrest

Hydrolyse durch zelluläre Esterase(Generierung eines 5´-Up-Endes)

Kleeblattstruktur des 5´-Endes desPoliovirus RNA-Genoms


RNA Sekundärstrukturen „stem-loops“ und „Pseudoknoten“

„stem-loop“ Strukturen Pseudoknoten

Basenpaarungen im Stamm (stem),Keine Basenpaarungen innerhalbder Schleife (loop)

Basenpaarungen im Stamm,Basenpaarungen der Schleife mitNukleotiden außerhalb der Schleife


Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionenviraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet

Bindung von viralem 3CD und dem zellulären Poly (rC) Bindeprotein an „stem-loop“ D und B

Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexesan Membrangebundenes 3AB Protein

„Priming“ und proteolytische Abspaltung von VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von

3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität

Elongation und (-) Strang Synthese


„Priming“ Reaktion am 3´-Ende der Poliovirus RNA

Proteolytische Abspaltung vonVpG durch virale 3C Protease

Bindung von 3AB an Membranen(membranous web)

Uridylylierung von Tyr 3 des VPg-Teils in 3AB durch 3Dpol

Rekrutierung des polyadenylierten3´-Endes der Poliovirus RNA

Ausbildung eines „geprimten“Ribonukleoproteinkomplexesmit 2 Uriditylresten (VPgpUpU)

Elongation des (-) Stranges

Synthese eines vollständigenVPg gebundenen (-) Stranges


Translation viraler RNA in Proteine und RNA-Synthese sind koordinierte Prozesse


Replikation und RNA-Synthese von (-) Strang RNA Viren

RNA von (-) Strang RNA Viren ist nicht infektiös- (-) Strang kann durch zelluläre Enzyme weder kopiert noch translatiert werden.

(-) Strang RNA Viren enthalten aktive RdRP im Viruspartikel

Genomreplikation erfolgt über ein komplettes (+) Strang Intermediat


Struktur und Genomorganisation des nicht segmentierten (-) StrangRhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)

leader© Flint et al. Principles of Virology

Replikationszyklus des nicht segmentierten (-) StrangRhabdovirus: vesicular stomatitis virus (VSV)

Bindung und Fusion(Freisetzung des helicalen

viralen Nukleokapsids)

Synthese von 5 mRNAs(ausgehend von leader-Sequenz)

Translation viraler mRNAs(an freien und ER-gebundenen Ribosomen)

Prozessierung und Lokalisierung des G-Proteins

(+) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)

(-) Strang Synthese(unter Beteiligung von N-, P- und L-Protein)

Verpackung (unter Beteiligung von M-Protein)


Genomorganisation und mRNAs des vesicular stomatitis virus VSV

Genlokalisation korrespondiert zur mRNA Menge


Stop-Start Modell der VSV mRNA Synthese

Initiation der RNA Synthese am 3´-Ende des (-) StrangGenoms von VSV (Primerunabhängig)

Synthese einer 47 nt langen „leader“-Sequenz; Termination durch Ablösen der RNA von Polymerase

Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 1. Gens(N) (nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)

Synthese der N mRNA und Termination in der folgenden intergenischen Region.

Reinitiation der RNA-Synthese am 3´-Ende des 2. Gens (P)(nur ein Teil der Polymerasemoleküle reinitiieren)


Funktion der VSV RNA-Polymerase an der Intergenregion

Komplementärer Einbau von 7A-Resten an der U7 Sequenz der IR

Verrutschen des neusynthetisierten Stranges am Template„Stottern“ der viralen Polymerase

Termination nach Einbau von ca. 200 A Resten: Polyadenylierungdurch „stotternde“ Transkription einer U7 Sequenz

Reinitiation und „capping“ der nachfolgenden mRNA(„capping“ erfolgt im Zytoplasma durch virale Polymeraseund ähnelt der cap Struktur zellulärer mRNAs)


Die Umschaltung von mRNA-Synthese zur GenomreplikationBei VSV wird durch das virale N-Protein reguliert

Niedrige N-Proteinkonzentration favorisiert mRNA Synthese

Hohe N-Proteinkonzentration favorisiert (+) Strang Synthese© Flint et al. Principles of Virology

Struktur und Genomorganisation des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A


Replikationszyklus des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A

Bindung über HA an Sialinsäure(Endozytose)

pH-induzierte Fusion(Freisetzung der 8 Nukleokapsidsegmente)

Kerntransport des Nukleokapsids(NP/P/RNA-Komplex über NLS)

mRNA-Synthese/Export(cap-snatching)

mRNA-splicing(NS2/M2)

Synthese von HA, NA(am rER, Transport)

Synthese von PA, PB1, PB2(Kernimport)


Nukleäre RNA-Synthese bei dem Orthomyxovirus Influenza A

8 Segmente mit (-) Strang Polaritätals Nukleoproteinkomplex im Virion

Synthese gecappter und polyadenyliertermRNA aus (-) Strang Segmenten Inhibierbar

durch α-Amanitin und Actinomycin D !?

Genomisches RNA-Segment mit5únd 3´konservierten Regionen

(vRNA)

? „Gecappte“ mRNA mit 10-13 zellulärenNukteotiden und 3´-Poly A (mRNA)

Vollständige Kopie des (-) Segmentes(cRNA)


Capping eukaryontischer mRNAs

Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs

Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen

Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5Énde

Cap-Struktur stabilisiert mRNA

Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert

Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation derTranslation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations-Faktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.


mRNA-Synthese bei Influenza A Virus: „cap snatching“„Cap“-Raub im Nucleus der Wirtszelle

Hydrolyse einer beliebige zellulären mRNA(„capping“ erfolgte durch zelluläreTransferase) durch virales Protein

Initiation der (+) Strang Synthese durchEinbau eines komplementären GTP an

vorletztem C im (-) Strang Segment:Cap-primer-abhängige Initiation

Elongation durch sukkzessivem Einbaukomplementärer Nukleotide

CpG

G


Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes

3

51

42

1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2

2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)

3. Bindung des 3´-Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mRNA-Fragmentes zum 3Énde

4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).

5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.


Umschaltung von mRNA-Syntese auf Genomreplikation beiInfluenza A Virus durch Polymerasemodifikation

PB1 Polymerase wird durch die Bindungvon (-) Strang Bindung aktiviert.

Daraufhin bindet PB2 mRNAPA hat hier keine Funktion.

In Gegenwart des viralen NP Proteins erfolgt Bindung an PA. Die Polymerase PB1 wird primer-unabhängig und katalysiert eine

komplette cRNA-Synthese


Genetische Diversität bei Viren mit RNA-Genomen

Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden

RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlustdes Proteins zur Folge.Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10Mutationen in seinem Genom aufweist.Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“

Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen

Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver-Teilung der viralen Gensegmente.Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.

RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten

Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch SprungDer Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).

Mechanismen der Ausbreitung von PflanzenvirenSpezifisches Problem bei Pflanzenviren: Undurchdringliche Zellwand.

Eintritt von Viren in die Pflanzenzelle erfolgt durch Verletzung, d.h.- Es findet keine spezifische Erkennung des Wirts statt (Planzenviren nutzen keine Virusrezeptoren)- Pflanzenviren codieren keine Hüllproteine, die am Import und Export beteiligt sind.

1. Ausbreitung über SamenÄußerliche Kontamination von Samen mit Virionen.Infektion des Embryos, bzw. einzelner Setzlinge.

2. Vegetative Verbreitung durch PfropfungPfropfung stellt eine billige und effiziente Methode der Vermehrung von Pflanzen dar und bildet gleichzeitig ideale Voraussetzungen für die vom Menschen bedingte Verbreitung von Viren. Überschreitung von Speziesgrenzen.

3. Natürliche Verbreitung durch VektorenBakterien: z.B. Agrobakterium tumefaciens (auch als Vektor für die Erzeugung transgener Pflanzen geeignet). Pilze, Nematoden, Arthropoden (Insekten, Blattläuse, Heuhüpfer, Käfer ..), Arachniden (Milben...)

4. Mechanische Wege der Verbreitung von Virenhauptsächliche Methode für experimentelle Infektionen (Einreiben von Viruspartikel in Blätter)natürlicherweise durch starke Winde, Regen.

Zwei Formen der vektorvermittelten Verbreitung können unterschieden werden:a. Nicht propagative Übertragung von Viren durch Insekten: Das Insekt ist ausschließlich Träger des Virus.b. Propagative Übertragung: Vektor vermehrt sich im Insekt, was zu einer Virusamplifikation führt (z.B. Rhabdoviren).

Symptome pflanzlicher Virusinfektionen

-Zunächst lokale Nekrosen, danach erfolgt vektorunabhängige Ausbreitung a.) von Zelle zu Zelleb.) „long distance“ über das Gefäßsystem der Pflanze (systemisch).

- Ausbreitungsprozeß ist effektiv und führt über Plasmodemata:Plasmodemata (Cytoplasmabrücken) sind natürliche Verbindungen zwischen Pflanzenzellen. „Symplasma“. Struktur: pro Plasmodesmum 10-20 aus Zellproteinen gebildete Einzelkanäle von ca. 1,5 nm Durchmesser. Ausschlußgrenze: etwa 1000 Da.Funktion: Versorgung mit Aminosäuren, Kohlehydraten, Salzen. Signaltransduktion.

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