Tumorspezifischer Wirkstofftransport

Peptid-PNA-Konjugate: gezielter Transport vonAntisense-Therapeutika in Tumoren**

Walter Mier,* Ramon Eritja, Ashour Mohammed,Uwe Haberkorn und Michael Eisenhut

Professor Harald zur Hausen gewidmet

Die systemische Toxizit�t ist eines der gr�ßten Probleme derChemotherapie. W�hrend die herk�mmlichen Cytostatikaauf alle proliferierenden Zellen wirken, ist mit neuartigenTherapieformen, insbesondere gentherapeutischen Verfah-ren, ein spezifischer Angriff auf Tumorzellen m�glich. Die indiesen Therapieformen eingesetzten Wirkstoffe zeigenjedoch wegen ihres hohenMolekulargewichts ein ung(nstigespharmakokinetisches Verhalten, was Probleme beim klini-schen Einsatz mit sich bringt. Daher h�ngt der Erfolg neuerBehandlungsmethoden von der Entwicklung der Vektorsys-teme zum Transport von hochmolekularen Substanzen wieAntisense-Oligonucleotiden ab. Fortschritte k�nnen hierbeiinsbesondere durch chemische Modifikationen erzieltwerden.[1]

Somatostatin-Rezeptoren (SSTRs) finden sich in einerVielzahl von Tumoren (z.B. Brusttumoren, kleinzelligesBronchialcarcinom). Da das nat(rliche Peptid Somatostatinim K�rper rasch enzymatisch abgebaut wird, wurden f(r denklinischen Einsatz stabilere Derivate entwickelt, von denendas erfolgreichste Octreotid ist.[2] Dieses Peptid kann durchBindung an die SSTRs Endocytose induzieren und dank derbreiten Substratspezifit�t dieser Rezeptoren ankonjugierteSubstanzen in das Zellinnere schleppen. Dass dies zumTransport von Tumortherapeutika genutzt werden kann,wurde in vitro bereits f(r Konjugate des Spindelgiftes Taxolbelegt.[3]

Da es bis heute nicht gelingt, Antisense-Oligonucleotidegezielt in Tumorzellen zu transportieren, stellte sich die Frage,ob sich SSTR-affine Peptide auch als Carrier f(r Oligonuc-leotide eignen. Als Oligonucleotid-Zielsequenz wurde eineAnti-bcl-2-Sequenz[4] ausgew�hlt.[5] Die f(r das Targetingben�tigten Peptid-Nucleins�ure-Konjugate sind mit denMethoden der Festphasensynthese relativ schwer zug�nglich.Die Standardmethoden zum Aufbau von Oligonucleotiden

[*] Dr. W. Mier, Dr. A. Mohammed, Prof. Dr. U. HaberkornUniversit�tsklinikum HeidelbergRadiologische Klinik, Abteilung NuklearmedizinIm Neuenheimer Feld 400, 69120 Heidelberg (Deutschland)Fax: (+49)6221-56-5473E-mail: walter_mier@med.uni-heidelberg.de

Prof. Dr. R. EritjaCentro de Investigaci;n y Desarrollo C.S.I.C.Jordi Girona 18–26, 08034 Barcelona (Spanien)

Prof. Dr. M. EisenhutDeutsches KrebsforschungszentrumIm Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland)

[**] Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft(Ei 130/15-1) gefErdert.

Zuschriften

2012 � 2003 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim DOI: 10.1002/ange.200219978 Angew. Chem. 2003, 115, 2012 – 2015

und Peptiden sind nicht kompatibel, folglich werdendiese Konjugate bevorzugt durch postsynthetischeKonjugation erhalten. Wir hatten k(rzlich (ber Phos-phorothioat-Oligonucleotide berichtet, die (ber eineThiolgruppe am 5’-Ende mit einem Maleimido-modi-fizierten SSTR-affinen Peptid verkn(pft waren.[6] DieKonjugate wiesen eine hohe Hybridisierungsaffinit�tund eine hohe Affinit�t zu SSTRs auf. Trotz dererfolgversprechenden Eigenschaften in vitro konntenwir nun im Tierversuch keine signifikante Anreiche-rung in Tumoren finden.[7]

Die Pharmakokinetik der Phosphorothioate wirdoffenbar durch starke unspezifische Wechselwirkun-gen beherrscht. Daher verwendeten wir nun in denhier beschriebenen Experimenten die metabolischstabilen Peptidnucleins�uren (PNAs).[8] Die Konvergenz vonPNA- und Peptidsynthese erm�glicht die schrittweise Syn-these von Peptid-PNA-Konjugaten am gleichen polymerenTr�ger. Sowohl die Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)- alsauch die tert-Butoxycarbonyl(Boc)-Chemie sind f(r die Syn-these von PNA-Oligomeren geeignet. Allerdings ist dieReinheit der mit Boc-Synthesechemie erhaltenen Produkteh�her, da insbesondere w�hrend der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe Nebenreaktionen auftreten. Um die Synthesedes Peptids mit der PNA-Synthese konvergent zu gestalten,musste der Peptidteil ebenfalls (ber Boc-Chemie aufgebautwerden. Die Synthese von PNA-Oligomeren gelingt mit Boc-Chemie in guten Ausbeuten, sodass diese Methode auch zurSynthese von PNA-Peptid-Konjugaten geeignet ist.[9]

Als Peptidteil verwendeten wir das mit Octreotid nahezuidentische Octreotat, welches am C-Terminus eine dieInternalisierung beg(nstigende Carboxygruppe tr�gt (Abbil-dung 1B). Boc-d-Phe-Cys(Acm)-Phe-d-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-PAM-Harz wurde mit einem modifizierten

In-situ-Neutralisationsverfahren[10] mit HATU als Aktivatorhergestellt. Die mit einem quantitativen Ninhydrintestbestimmte mittlere Kupplungsausbeute lag bei 99.1%.Radioaktives Iod (125I) wurde (ber einen Tyrosinrest am N-Terminus eingef(hrt, was zumZielmolek(l 1 f(hrte (Basense-quenz=Tyr-AGCGTGCGCCATCCC-Peptid).

In der Peptid- und PNA-Synthese k�nnen w�hrend derKettenverl�ngerung sowohl intra- als auch intermolekulareWechselwirkungen Aggregationen des wachsenden Oligo-merstrangs bewirken. Dies kann zum Kollabieren des Harzesund damit zu schlechten Kupplungsausbeuten f(hren. DieseTendenz nimmt mit steigender Oligomerl�nge zu. Folglich istbei Synthesen langer Peptid-PNA-Konjugate das Auftreten

von Sequenzen, die die Aggregationsgefahr erh�hen (difficultsequences), zunehmend wahrscheinlich. Die Anwendungbekannter Synthesevorschriften[11] f(hrte nicht zum erhofftenErfolg, weswegen L�sungsmittel, Kupplungszeiten, der Cap-pingschritt und die Reaktionsbedingungen f(r Mehrfach-kupplungen optimiert werden mussten. Die Verwendung vonAc2O/Pyridin in DMF beim Cappingschritt erwies sich alsessenziell. Zur Spaltung eventuell gebildeter Acetylesterwurde anschließend mit DMF/Piperidin gewaschen. DieKupplungszyklen wurden mit f(nf Hquivalenten der Boc-gesch(tzten PNA-Monomere unter Verwendung von HATUals Aktivierungsreagens durchgef(hrt. Die exocyclischenAminofunktionen der A-, C- und G-Monomere warenBenzyloxycarbonyl-gesch(tzt. Der Kupplungszyklus ist inAbbildung 2 schematisch dargestellt.

Ab einer kritischen Oligomerl�nge wurden bei derHPLC-Analyse von Aliquots stark abnehmende Kupplungs-ausbeuten beobachtet: Ab dem neunten Monomer, insbe-sondere bei Kupplungen von G-Monomeren, sanken sie aufetwa 50%. Durch eine Verl�ngerung der Reaktionszeitenund Mehrfachkupplung gelang es, auch an den kritischenStellen Kupplungsausbeuten > 95% zu erzielen. Unter denoptimierten Bedingungen wurde das gew(nschte Konjugatlaut HPLC-Analyse in einer Ausbeute von ca. 75% erhalten.Es gelang jedoch nicht, dieses Konjugat an der Festphase zucyclisieren, da die Tl3+-Ionen Nebenreaktionen mit den

Abbildung 1. Vergleich von nativem Somatostatin (A) mit einem Kon-jugat aus einer PNA und Tyr3-Octreotat (B). Die fIr die Rezeptorbin-dung essenziellen Aminos�uren sind grau unterlegt.

Abbildung 2. Synthesezyklus zur Konjugation des PNA-Teils unterAnwendung der Boc-Chemie. Die AbkIrzungen sind in Schema 1 er-kl�rt.

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2013Angew. Chem. 2003, 115, 2012 – 2015 www.angewandte.de � 2003 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Nucleobasen eingehen. Da der Verlauf der alternativenLuftoxidation, bedingt durch die Gr�ße des Molek(ls, nichtchromatographisch verfolgt werden kann, wurde das PNA-Oligomer am bereits cyclisierten Peptid aufgebaut. Schema 1zeigt die Synthese des Octreoat-PNA-Konjugats aus demdurch Boc-Chemie hergestellten und mit Tl(TFA)3 cyclisier-ten Peptid. Nach Konjugation der PNA-Monomere konnteein einheitliches Produkt erhalten werden, das mit TFMSA inTFA mit p-Kresol als Abfangreagens entsch(tzt wurde. NachF�llung mit Diethylether und Reinigung durch Umkehrpha-sen-HPLC wurde 1 in ca. 40% Ausbeute isoliert.

Bindungsstudien mit den PNA-Konjugaten und Ratten-Kortex-Membranen ergaben, dass die Konjugate mit �hnlichhoher Affinit�t an SSTRs binden wie Octreotid, was durchdie IC50-Werte belegt wird (Octreotat-PNA-Oligomer 1.52,Octreotid 1.98 nm). Die Bestimmung der Schmelztemperatu-ren ergab, dass die PNA-Konjugate mit hoher Affinit�t mitkomplement�ren Phosphodiester-DNA-Oligonucleotidenhybridisieren: Die Schmelztemperatur des Konjugats lagmit ca. 82 8C deutlich h�her als die eines Phosphodiesterdu-plex der gleichen Sequenz (Tm= 71.4 8C). Dies spricht daf(r,dass das PNA-Konjugat wegen seiner hohen Hybridisierungs-affinit�t als Antisense-Wirkstoff geeignet sein sollte.

Die Organverteilung wurde in Lewis-Ratten, die denSSTR-positiven Pankreastumor CA20948 trugen, untersucht(Abbildung 3). Das PNA-Konjugat und eine Kontroll-PNAmit der gleichen Sequenz wurden nach Entsch(tzen undAbspalten von der Festphase mit der Chloramin-T-Methode[12] selektiv am Tyrosinrest 125I-markiert. Im Gegen-satz zum Phosphorothioat-Konjugat wurde das 125I-markiertePNA-Peptidkonjugat selektiv im Tumorgewebe angereichert.Das Peptid-PNA-Konjugat hat andere physikochemischeEigenschaften als Tyr3-Octreotid, was Faktoren wie dieInteraktion mit Serumproteinen beeinflusst und durch dieunterschiedliche Organaufnahme insbesondere in denNieren, der Leber und den Lungen reflektiert wird. DieModifikation der PNA durch den Peptidteil f(hrte zu eineretwa zehnfach st�rkeren Anreicherung im Tumorgewebe.

Die Anreicherung des Octreotat-PNA-Konjugats ent-spricht in allen Organen, außer der Niere, der des freienPeptids. Dies deutet darauf hin, dass die Peptid-PNA-Kon-jugate im Serum weniger unspezifisch assoziiert vorliegen alsdie Phosphorothioat-Konjugate und infolgedessen an denRezeptor binden k�nnen. Die Spezifit�t der an der Aufnahmebeteiligten Rezeptoren wird zudem dadurch belegt, dassdurch Coinjektion von nichtmarkiertem Octreotid im Jber-schuss 79% der Aufnahme in den Tumor inhibiert werdenkonnte.

Obwohl es eine Reihe erfolgversprechender In-vitro-Studien mit PNA-Konjugaten gibt,[13] konnte bislang keineder beschriebenen Methoden auf das Targeting von Tumorenin vivo (bertragen werden. Durch den Einsatz SSTR-affinerCarriermolek(le gelingt es erstmals, Oligonucleotide gezielt

Schema 1. Fließdiagramm der Synthese des Octreotat-PNA-Konjugats mithilfe der Boc-Chemie: a) Kupplungszyklen mit HATU/DIPEA/Boc-Abspal-tung mit 5% p-Kresol in TFA; b) Tl(TFA)3; c) Kupplungszyklen entsprechend Abbildung 3; d) TFA/p-Kresol/TFMSA. Acm=Acetamidomethyl,2-Br-Z=2-Brombenzyloxycarbonyl, 2-Cl-Z=2-Chlorbenzyloxycarbonyl, Bzl=Benzyl, For=Formyl, Z=Benzyloxycarbonyl; TFA=Trifluoressigs�ure,TFMSA=Trifluormethansulfons�ure, DIPEA=N,N-Diisopropylethylamin, HATU=O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethyluronium-Hexa-fluorophosphat.

Abbildung 3. Organverteilungsdaten fIr tumortragende Lewis-Ratten,angegeben in Prozent der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe�Standardabweichung (% IDg�1) 1 h nach intravenEser Injektion(Mittelwerte aus drei oder sechs Tieren, alle Substanzen mit 125I mar-kiert). Die Konjugation des Peptidteils fIhrt zu einer deutlich hEherenAkkumulation des PNA-Oligomers im Tumorgewebe (statistischeSignifikanz im Student-t-Test: p=0.021).

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in Tumorgewebe zu transportieren. Dies zeigt, dass dasTargeting hochmolekularer Wirkstoffe mit rezeptorspezifischbindenden Peptiden m�glich ist.

ExperimentellesFestphasensynthesen wurden manuell im Batch-Verfahren mit Boc-gesch(tzten Aminos�uren (Bachem, Deutschland) sowie PNA-Monomeren (Applied Biosystems, Deutschland) an PAM-Harzdurchgef(hrt. Analytik und Reinigung durch Umkehrphasen-HPLCerfolgten an LiChrosorb-RP-selectB-S�ulen (Merck, Deutschland)mit Acetonitril/Wasser-Gradienten (0.1% TFA) und durch Elektro-spray-Ionisations(ESI)-Massenspektrometrie auf einem FinniganMAT TSQ 7000 System (Thermo Finnigan, USA). Das Radioisotop125I wurde von Amersham Pharmacia Biotech (Deutschland) bezo-gen.

Synthese des Peptid-PNA-Konjugats: Zun�chst wurde folgenderSynthesezyklus zumAufbau von H-d-Phe-cyclo[Cys-Phe-d-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Cys]-Thr(Bzl)-O-PAM durchlaufen: 100 mgHarz (initialer Beladungsgrad= 0.72 mmolg�1) wurden zweimal2 min mit 5% p-Kresol in TFA gesch(ttelt und mit DMF gewaschen.Danach wurde ein 2 min in DMSO vorinkubiertes Gemisch aus4 Hquiv. der Carbons�ure, 3.9 Hquiv. HATU und 10 Hquiv. Diiso-propylethylamin (DIPEA) zugegeben, 5 min gesch(ttelt und wiedermit DMF gewaschen. Der Synthesezyklus zur Konjugation der PNA-Monomere an dieses Harz verlief wie folgt: a) zweimal 2 minSch(tteln mit TFA/p-Kresol (95:5, v/v); b) 2 min Inkubation desPNA-Monomers mit 4.9 Hquiv. HATU und 10 Hquiv. DIPEA (End-konzentration 0.1m); c) Waschen mit DMF/CH2Cl2 (1:1, v/v), danachmit Pyridin; d) 15 min Sch(tteln mit dem pr�aktivierten PNA-Monomer; e) Waschen mit DMF/CH2Cl2 (1:1, v/v); f) 5 min Sch(ttelnmit Ac2O/Pyridin/DMF (1:10:10, v/v/v); g) Waschen mit DMF/CH2Cl2 (1:1, v/v); h) 2 min Sch(tteln mit DMF/Piperidin (95:5, v/v);i) Waschen mit DMF/CH2Cl2 (1:1, v/v). Nach Kupplung von Boc-Tyr(2-Br-Z) wurde das Harz gewaschen und getrocknet. 30 mg desbeladenen Harzes wurden mit 500 mL 5% p-Kresol in TFA versetzt.Nach Zugabe von 50 mL TFMSA wurde 2 h gesch(ttelt, das Harzabfiltriert und das Rohprodukt mit Diethylether ausgef�llt. Dieseswurde in Acetonitril/Wasser (1:1) aufgenommen und 24 h bei Raum-temperatur stehen gelassen. Die Reinigung erfolgte durch HPLC.Nach Lyophilisieren wurde H-Tyr-AGCGTGCGCCATCCC-d-Phe-cyclo[Cys-Phe-d-Trp-Lys-Thr-Cys]-Thr-OH als weißes Pulver in einerGesamtausbeute von 16.8 mg (ca. 40%) erhalten. Die Integrit�t undReinheit des Konjugats wurde mit ESI-MS (m/z f(r C216H270N96O58S2ber.: 5203 gmol�1, gef.: 5205 gmol�1 ([MþH]+) und analytischerHPLC (Reinheit > 95%) best�tigt. Die Kontroll-PNA (H-Tyr-AGCGTGCGCCATCCC-Lys-NH2) wurde analog dem Peptid-PNA-Konjugat hergestellt.

Organverteilungsstudien: Eine Zellsuspension des CA20948-Tumors wurde in einer N�hrl�sung subcutan in die Nackenfalte vonm�nnlichen Lewis-Ratten appliziert. Nach etwa 10 Tagen warenTumore mit einem Volumen von etwa 5 mL herangewachsen. DieTiere erhielten in Gruppen von jeweils drei Tieren eine Injektion der125I-markierten Verbindung in die Schwanzvene. Nach 1 h wurden dieTiere get�tet und die in den Organen enthaltene Aktivit�t im g-Z�hler bestimmt.

Eingegangen am 15. August 2002,ver�nderte Fassung am 17. Januar 2003 [Z19978]

.Stichw�rter: Antisense-Wirkstoffe · Festphasensynthesen ·Peptide · Peptidnucleins�uren · Wirkstoff-Transport

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[7] Die Aufnahme in den Tumor wurde unter den im Text beschrie-benen Bedingungen untersucht. Das 32P-markierte Konjugatreicherte sich wie ein Phosphorothioat ohne Peptidteil bevor-zugt in Leber, Nieren und Milz an.

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