Zentrum für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie
Universitätsklinikum Gießen und Marburg Standort Marburg
Praktikum der Medizinischen Mikrobiologie
für Studierende der Zahnmedizin
Altes Hygieneinstitut am Pilgrimstein
Wintersemester 2019/ 2020
Kursleitung: Dr. Claudia Nonnenmacher
Kursorganisation: Claudia Trier ([email protected])
Nadine Buschmann ([email protected])
2
Inhaltsverzeichnis
Seite
Kursplan 3
Verhaltensregeln 4
Händedesinfektion 5
Abschnitt I: Bakteriologie
A. Mikroskopieren, Kultivieren Färben und Identifizieren von Bakterien
Übung 1: Mikroskopie (Lebendbeobachtung) von Bakterien 6
Übung 2: Kultivierung von Bakterien 8
Übung 3: Färben und Differenzieren von Bakterien 10
B. Bakterienflora der Umwelt
Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld 16
Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens 18
C. Normale Bakterienflora des Menschen/Testung von Antibiotika
Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel 20
Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque 22
Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen 24
Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber anderen Mikrokokken 26
Übung 10: Technik der Neisser-Färbung 28
Übung 11: Technik der Kinyoun-Färbung 29
Übung 12: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) 30
Übung 13: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (MHK) 32
Abschnitt II: Hygiene
Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen 32
Übung 15: Nachweis von Keimen im Wasser 34
Übung 16: Mikrobiologische Besiedlung der Hände 38
Übung 17: Übertragbarkeit von Mikroorganismen 40
Abschnitt III: Mykologie
Übung 18: Auseinandersetzung mit Sprosspilzen 41
Übung 19: Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen 43
Abschnitt IV: Parasitologie
Übung 20: Mikroskopieren von parasitologischen Fertigpräparaten 48
Anhang 50
Sicherheitsbelehrung nach UVV Biotechnologie, Arbeitssicherheit, Unfallverhütung
und Hygieneunterweisung
Der/die Beschäftigte bestätigt mit seiner/ihrer Unterschrift auf der Anwesenheitsliste die
Teilnahme an der Unterweisung
3
Kursplan/Übersicht
Kursteil 1:
Abschnitt I: Bakteriologie
Händedesinfektion
Übung 1: Lebendbeobachtung von Bakterien
Übung 2: Kultivierung von Bakterien (Testkeim)
Kursteil 2:
Übung 3: Färben und Differenzieren von Bakterien
Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld
Übung 5: Anzucht von Bakterien aus dem Erdboden
Kursteil 3:
Übung 3: Auswertung Differenzierung + Identifizierung des Testkeims
Übung 4: Auswertung von Bakterien aus dem direkten Umfeld
Übung 5: Auswertung von Bakterien aus dem Erdboden
Kursteil 4:
Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel
Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque
Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen
Kursteil 5:
Übung 6: Auswertung Keimzahlbestimmung im Speichel
Übung 7: Auswertung von Bakterien aus dentaler Plaque
Übung 8: Auswertung von Bakterien aus dem Rachen
Übung 9: Abgrenzung von S. aureus von anderen Micrococcaceae
Kursteil 6:
Übung 8: evtl. weitere Auswertungen von Bakterien aus dem Rachen
Übung 10: Neisser-Färbung
Übung 11: Kinyoun-Färbung
Übung 12: Resistenzbestimmung I (Antibiogramm)
Übung 13: Resistenzbestimmung II (MHK mit Penicillin)
Kursteil 7:
Übung 12: Auswertung Resistenzbestimmung I (Antibiogramm)
Übung 13: Auswertung Resistenzbestimmung II (MHK mit Penicillin)
Abschnitt II: Hygiene
Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien
Übung 15: Nachweis von Keimen im Wasser
Übung 16: Mikrobiologische Besiedlung der Hände
Übung 17: Übertragbarkeit von Mikroorganismen
Kursteil 8:
Übung 14: Auswertung Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterientypen
Übung 15: Auswertung Nachweis von Keimen im Wasser
Übung 16: Auswertung Mikrobiologische Besiedlung der Hände
Abschnitt III: Mykologie
Übung 18: Auseinandersetzung mit Sprosspilzen
Übung 19: Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen
Kursteil 9:
Abschnitt IV: Parasitologie
Übung 20: Mikroskopieren von parasitologischen Fertigpräparaten
4
Verhaltensregeln zum Schutz vor Infektionen
Während des Kurses besteht eine nicht vollständig vermeidbare, geringe Infektionsge-
fahr. Um ein unnötiges Risiko zu vermeiden ist deshalb jeder zu peinlichster Sauberkeit
und Ordnung am Arbeitsplatz verpflichtet. (Es bestehen gesetzliche Vorschriften über das
Arbeiten mit Krankheitserregern; siehe Infektionsschutzgesetz vom Juli 2000).
Während der Kursstunde ist ein Kittel zu tragen. Für die Oberkleidung stehen Spinde zur
Verfügung. Hautwunden an den Fingern sind durch einen Verband (Pflaster) zu
schützen.
Essen, Trinken und Rauchen sind im Kurssaal zu unterlassen. Lebensmittel sollen
nicht mit in den Kurssaal genommen werden.
Vor und unmittelbar nach Gebrauch ist die Öse abzuflammen. Verunreinigte und infi-
zierte Objektträger, Pipetten und sonstige Materialien sind ohne Verzug in die Glasbehäl-
ter mit Desinfektionsmittel zu legen.
Verunreinigungen der Hände, Kleidung oder des Arbeitsplatzes mit Erregern müssen so-
fort einem(r) Kursassistenten(in) zur Einleitung der Desinfektion gemeldet werden. Be-
sondere Desinfektionsmaßnahmen sind unverzüglich einzuleiten, wenn Erreger in
Hautwunden, den Mund oder das Auge eingebracht wurden.
Vor Verlassen des Kurssaales muss eine sorgfältige Händedesinfektion erfolgen: Die
Hände sind 2-3 min mit 5-8 ml Schnelldesinfektionsmittel aus den Wandspendern bis zur
Trocknung einzureiben (Nagelspalte nicht vergessen), danach unter steter Zufuhr von
warmen Wasser einzuschäumen und abzuspülen.
Die Teilnahme am Mikrobiologischen Praktikum, zu dem auch die theoretische Ein-
führung gehört, wird durch Anwesenheitskontrolle überprüft. Bei unentschuldig-
tem Fehlen ist die Scheinvergabe in Frage gestellt.
Technische Hinweise
Die Grundausstattung jedes Arbeitsplatzes umfasst ein Mikroskop mit Okular (8-10x)
und mehreren Objektiven, darunter ein schwächeres (10x) und ein stärkeres (45x) Tro-
ckensystem sowie ein Immersionsobjektiv (90-100x), ferner eine Flasche mit Immersi-
onsöl, einen Halter mit Platinöse, Platinnadel und Pinzette, plane und Hohlgeschliffene
Objektträger sowie Deckgläser (18 x 18mm2), einen Bunsenbrenner, ein Glasgefäß mit
Desinfektionslösung, ein Färbegestell über dem Abguss sowie Farblösungen, einem Re-
agenzglasständer und einem Filzstift. Für besondere Übungen werden die jeweils erfor-
derlichen Geräte und Materialien ausgegeben.
Jeder Kursteilnehmer ist für das ihm an seinem Arbeitsplatz überlassene Arbeitsgerät
verantwortlich; dessen Verlust oder Beschädigung ist sofort der Kursleitung zu melden.
Präparate und Kulturen dürfen auf keinen Fall aus dem Kurssaal entfernt werden.
Die Kittel sind für die Kursdauer im BMFZ zu belassen; Wertgegenstände sind heraus-
zunehmen. Im Erd-/ Untergeschoß stehen zu diesem Zweck Spinde zur Verfügung, diese
werden am Ende des Semesters geöffnet und der Inhalt nicht länger als 3 Monate aufbe-
wahrt.
Es ist darauf zu achten, dass die Bunsenflamme zum Gebrauch entleuchtet wird. Nach
Gebrauch ist sofort auf Sparflamme umzustellen. Der Hahn muss rasch geschlossen
werden, da sonst ein Rückschlag der Flamme eintritt. Achte auf die offene Flamme (La-
bormäntel, offenes Haar)!
Ein Verschütten von Farblösungen ist tunlichst zu vermeiden. Farbflecke an den Händen
lassen sich mit Desinfektionslösung entfernen.
Nach Beendigung der Kursstunde sind die Arbeitsplätze wieder aufzuräumen. Das
Immersionsobjektiv ist mit einem Papierhandtuch vom Immersionsöl zu säubern, Farb-
stoff-Flaschen und Schalen sind zu schließen. Abfälle, wie Streichhölzer, Papierschnip-
sel, Glasscherben usw. gehören nicht in die Färbebecken, sondern in die Abfalleimer.
Vor Verlassen der Arbeitsplätze müssen Bunsenbrenner, Mikroskoplampen und Wasser-
hähne ausgestellt werden.
5
Händedesinfektion Begriffserklärung:
Ziel der Klinikhygiene ist die Verhinderung nosokomialer Infektionen. Dies sind Infektionen, die
im Rahmen der stationären oder auch ambulanten Behandlung im Krankenhaus selbst erworben
werden.
Unter Desinfektion versteht man die Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung von Krankheitserre-
genden Mikroorganismen (DIN 58 949) an und in kontaminierten Objekten. Erfasst werden vege-
tative Keime einschließlich Mykobakterien sowie Pilze (Wirkbereich A), Viren (Wirkbereich B)
und Milzbrandsporen (Wirkbereich C). In der Regel wird eine Keimreduktion um 3-5 Log-Stufen
(99,9 – 99,999%) erreicht.
Zur Abtötung von Sporen der Erreger von Gasbrand oder Wundstarrkrampf (Wirkbereich D)
müssen Sterilisationsverfahren angewandt werden.
Sterilisation bedeutet das Abtöten bzw. das irreversible Inaktivieren aller vermehrungsfähigen
Mikroorganismen (DIN 58 900). Bei der Sterilisation werden auch Bakteriensporen erfasst.
Dies ist nicht gleichbedeutend mit Keimfreiheit, da tote Keime bzw. Bestandteile von Keimen vor-
handen sein können:
Toxine
Polysaccharide
Lipopolysaccharide (LPS)
Bakterielle DNA
Die hygienische Händedesinfektion dient der Keimverminderung und soll das Personal vor
Infektionen schützen, sowie eine Weiterverbreitung von Krankheitserregern entgegenwirken.
Erfasst wird die transiente Flora.
Um die Keimverbreitung kontaminierter Hände zu verhindern, wird vor dem Waschen desinfiziert.
Vorschrift Händedesinfektion:
Entnahme des Desinfektionsmittels aus dem Spender durch Betätigung des Hebels mit dem Ell-
bogen, um Kontamination des Spenders zu vermeiden.
- Nur trockene Hände desinfizieren! (Verdünnungseffekt)
- Mindestens 3 ml (1-2 Hübe) Desinfektionsmittel bis zur Antrocknung in die Hände einreiben.
- Hände waschen, abtrocknen (Einmalhandtuch), eincremen (Hautschutz)
Die chirurgische Händedesinfektion soll Keime der Hautoberfläche und solche, die in der Haut
angesiedelt sind, abtöten. Nicht kontaminierte Hände werden nach dem Waschen desinfiziert.
Nicht selten kommt es bei Handschuhen zu Mikroperforationen, deshalb ist nach dem Tragen der
Handschuhe eine Händedesinfektion sinnvoll.
Händedesinfektion muss im mikrobiologischen Labor immer durchgeführt werden!
Aufgabe:
Kontrolle der hygienischen Händedesinfektion
- Durchführung der hygienischen Händedesinfektion mit einem speziell präparierten Mittel
- Betrachtung und Beurteilung der Verbreitung des Desinfektionsmittels unter einer
Fluoreszenzlampe
- Abwaschen der Farbstoffreste mit Seife und Wasser
- Eincremen der Hände
6
Abschnitt I: Bakteriologie A. Mikroskopie, Kultivierung, Färben und Identifizierung von Bakterien
Kursteil 1 Übung 1: Mikroskopieren von Bakterien im ungefärbten Präparat Die lichtmikroskopische Untersuchung steht am Anfang jeder bakteriologischen Untersuchung,
sie ist, auch für Reinheitskontrollen, unentbehrlich. Form und Größe sowie Eigenbeweglichkeit
der Bakterien können einfach beurteilt werden. Die Größe der Bakterien bewegt sich im Bereich
des Auflösungsvermögens eines Lichtmikroskops, deshalb ist immer zur exakten Beurteilung die
Ölimmersionstechnik notwendig.
Die direkte Mikroskopie lebender, unfixierter Keime hat vor allem die Kontrastarmut der Objekte
(Bakterien) zu überwinden. Dies kann durch spezielle Beleuchtungstechniken (Phasenkontrast,
Dunkelfeldmikroskopie) erreicht werden. Aber auch im normalen Durchlichtmikroskop können
ungefärbte Objekte beurteilt werden.
Dazu stehen zwei Methoden zur Verfügung:
Deckglaspräparat
„Hängender Tropfen“.
Ungefärbte Lebendpräparate werden bei gesenktem Kondensor und geschlossener Kondensor-
blende beobachtet. Zuerst wird mit einer schwachen Vergrößerung (10er Objektiv) der Tropfen-
rand gesucht und scharf eingestellt. Danach schwenkt man das 40er Objektiv ein.
Den hängenden Tropfen betrachtet man mit dem 100er Ölimmersionsobjektiv und mit geschlosse-
ner Blende.
5 µm
Erythrozyt
Hefezellen
Kokken
in Haufen
in Ketten
Diplokokken
Stäbchen
Keulen
Schrauben
Stäbchen mit zentraler Endospore
Form und Größe
7
Technische Durchführung
Sterile Materialentnahme aus einem Kulturröhrchen
Durchführung:
Vor Entnahme der Probe das Kulturröhrchen aufschütteln!
Öse schräg halten, in der Gasflamme ausglühen, erkalten lassen
Verschluss des Röhrchens mit dem kleinen Finger der rechten Hand
abnehmen, nicht in offenes Röhrchen atmen!
Röhrchenrand abflammen
Mit der Öse Material entnehmen
Röhrchenrand abflammen
Röhrchen verschließen
Das in der Öse enthaltene Material auf Objektträger aufbringen
Öse ausglühen
Herstellung eines "Deckglaspräparates" für Nativ- oder Lebendpräparate:
Durchführung:
Mit der Öse aus dem Kulturröhrchen die Probe entnehmen und auf den Objektträger
bringen
Tropfen mit einem Deckglas bedecken
Mikroskopie: 40er Objektiv, Blende schließen
Aufgabe Übung 1:
Mikroskopieren (Lebendbeobachtung) von Bakterien
1. Herstellen eines Deckglaspräparates aus den Bouillonkulturen:
Röhrchen a = Hefezellen
Röhrchen b = Erythrozyten
Röhrchen c = Pseudomonas fluorescens (gramneg. Stäbchen)
Röhrchen d = Staphylococcus epidermidis (grampos. Kokken)
Testkeim = X
Mikroskopie: 10er und 40er Objektiv
Protokoll Übung 1: Lebendbeobachtung von Bakterien
Form, Größe
Deckglaspräparat von a
Deckglaspräparat von b
Deckglaspräparat von c
Deckglaspräparat von d
Deckglaspräparat vom Testkeim
Ausglühen der
Impföse
8
Übung 2: Kultivieren von Bakterien Bakterien können in Flüssigkulturen und in semisoliden Agarnährmedien kultiviert werden. Die
Anzüchtung auf Agarnährmedien bietet den Vorteil, einzelne Kolonien zu erhalten. Damit kann
eine Keimisolierung aus einem Keimgemisch erreicht werden. Man unterscheidet Optimal-, Se-
lektiv- und Differentialnährmedien. Ein Optimalnährboden bietet für sehr viele unterschiedliche
Bakterien gute Wachstumsbedingungen (Beispiel: Blutagar). Ein Selektivnährboden lässt auf-
grund von Zusätzen nur das Wachstum einiger Bakterienspezies zu (z.B. McConkey Agar zum
selektiven Wachstum von gram-negativen Enterobacteriaceae). Ein Differentialnährboden macht
bestimmte Stoffwechselleistungen oder Produkte von Bakterien sichtbar (z.B. Hämolyse auf Blut-
agar, Laktoseverstoffwechslung auf McConkey Agar). Darüber hinaus sind viele Bakter ien durch
ihre typische Koloniemorphologie erkennbar (z.B. schleimiges Wachstum von Klebsiella,
schwärmendes Wachstum von Proteus, raues Wachstum von Bazillus).
Technische Durchführung
Beimpfung von Flüssigkulturen
Durchführung:
Mit ausgeglühter und wieder erkalteter Öse die Bakterien
aufnehmen
Durch Schräghalten der Flüssigkulturen werden die Bakterien
in den oberen
Bereich der Flüssigkeit gebracht und dort verteilt
Öse wieder ausglühen.
Fraktionierte Beimpfung der Nährbodenoberfläche mit der Öse Durchführung:
Nach dem Ausglühen und Abkühlen der Öse wird ein Tropfen aus einem flüssigen Nähr-
medium, bzw. eine Kolonie von einer Bakterienkultur entnommen und auf der Hälfte der
Agaroberfläche in engen, serpentinenartigen Impfstrichen verteilt. Anschließend wird die Öse
wieder ausgeglüht. Mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse berührt man das
bereits vorher beimpfte Feld und streicht dann ein Viertel der Agaroberfläche aus. Das
gleiche wird noch ein zweites Mal durchgeführt.
Beim Beimpfen der Agaroberfläche ist zu beachten, dass die Öse nur ganz leicht und locker
auf dem geleeartigen Nährboden gleiten und die Agaroberfläche nicht verletzen wird. Die be-
impften Agarplatten sind mit dem Deckel nach unten auf den Arbeitsplatz abzulegen.
Durch diese sog. „fraktionierte Aussaat“ erreicht man verschiedene Bakterienkonzentrationen
auf der Agaroberfläche und damit auch unterschiedlich dichtes Bakterienwachstum, was die
Voraussetzung für das Anlegen von Reinkulturen ist.
Aufgabe Übung 2:
Kultivieren von Bakterien
Ausstreichen des Testkeims auf:
- Blutagar
- MacConkey-Agar
- Peptonagar
Kulturen mit der Platznummer beschriften!
Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag weiter bearbeitet
an der W and
einreiben
A
Beim pfen flüssiger
Medien
1 . A u s s tr ic h -
Ö s e w e c h s e ln
2 . A u s s tr ic h -
Ö s e w e c h s e ln
3 . A u s s tr ic h S c h rä g h a lte n d e r A g a rp la tte
B e s c h r iftu n g a u f d e r
N ä h rb o d e n s e ite !
3 Ö s e n a u s s tr ic h
9
Kursteil 2
Übung 3: Färben und Identifizieren von Bakterien Färben von Bakterien Die Anfertigung und Beurteilung gefärbter Präparate gehört zu den wichtigsten Fertigkeiten, die
in diesem Kurs vermittelt werden sollen. Ein Präparat ist die schnellste und kostengünstigste Me-
thode eines Keimnachweises. Die Unterscheidung von grampositiv und gramnegativ hat nicht nur
systematische Bedeutung, sondern ist auch ganz entscheidend für die Auswahl von Antibiotika
für eine initiale Therapie.
Bakteriologische Färbungen:
Für Färbungen stehen unterschiedliche Methoden zur Verfügung. Man unterscheidet Einfachfär-
bungen, die zur Kontrastverstärkung dienen, von Differentialfärbungen, die besondere Eigen-
schaften von Bakterien nachweisen.
Beispiel von Einfachfärbungen ist die Methylenblaufärbung, für Differentialfärbungen die Gram-
Färbung, die Kinyoun-Färbung (Ziehl-Neelsen-Färbung) und die Neisserfärbung.
Beim Mikroskopieren von gefärbtem Untersuchungsmaterial sind ggf. weitere Punkte zu berück-
sichtigen wie z. B.: sonstige Gebilde (Zellkerne, Epithelien, Leukozyten, Zelldetritus), die Lage-
rung von Bakterien und Körperzellen zueinander, die ungefähre Menge der Bakterien pro Blick-
feld (vereinzelt, mäßig viel, reichlich, massenhaft).
Technische Durchführung
Herstellen eines Färbepräparates
Durchführung:
Von Bakterienkolonien auf der Agarplatte:
Auf einem sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und wieder abgekühlten Öse ein
Wassertröpfchen bringen.
Mit einer in gleicher Weise sterilisierten Öse sehr wenig Bakterienmasse aus einer
Kolonie aufnehmen. Die Bakterienmasse an den Rand des Wassertröpfchens
aufbringen und von dort in dieses homogen einreiben und das Tröpfchen ausbreiten.
Von Suspensionskultur (Flüssigkultur):
Flüssigkultur aufschütteln, auf einen sauberen Objektträger mit der ausgeglühten und
wieder abgekühlten Öse einen Tropfen Kulturmaterial bringen und verteilen.
Präparat lufttrocknen lassen (Keine Trocknung in der Flamme!)
Hitzefixierung:
Objektträger (Schichtseite nach oben) 3x durch die blaue Flamme des Brenners ziehen
Gramfärbung (Differenzialfärbung)
Durchführung:
Präparat Hitzefixieren
Karbol-Gentianaviolett-Lösung 3 Minuten
Lugolsche Lösung 2 Minuten
Entfärben mit 96%igem Alkohol einige Sekunden
Abspülen mit Leitungswasser
Gegenfärbung Safraninlösung 1 - 2 Minuten
Abspülen mit Leitungswasser
Trocknen zwischen Filterpapier
Mikrokopie: 100er Objektiv, Ölimmersion
Beurteilung: Grampositive Bakterien = blauschwarz, Gramnegative Bakterien = rot
10
Identifizieren von Bakterien Identifizierung von Bakterien durch Bestimmung biochemischer Merkmale
Biochemische Leistungen von Enzymen des Kohlehydrat- (Zuckerspaltung) und Aminosäu-
restoffwechsels (z.B. Decarboxylasen, Desaminasen) können durch Farbumschläge spezieller
Indikatoren in sichtbar gemacht werden. Indikatoren sind entweder bereits in den Wachstums-
medien enthalten oder werden nachträglich zugegeben. Einige Teste können auch direkt mit iso-
lierten Bakterienkolonien durchgeführt werden:
Technische Durchführungen und Beurteilung der Reaktionen
Beurteilung der Primärkulturen:
Beschreibung des Wachstums auf den Kulturen von Pepton-, Blut-, MacConkey-Agar
(Vorschläge dazu im Protokoll „Ergebnisse der kulturellen und biochemischen Prüfung“)
Oxidase-Reaktion (Nadi-Oxidase):
Die Chromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette. Die positive Oxidase-Reaktion korreliert mit
einem relativ hohen Gehalt an c-typischen Cytochromen.
Durchführung:
Eine Kolonie wird mit der Öse auf einem farblosen Oxidase-Testfeld verrieben.
Positiv: Intensive Blaufärbung nach wenigen Sekunden.
Katalase-Reaktion:
Katalasebildende Bakterien spalten Wasserstoff, wobei der freiwerdende Sauerstoff zu einer
Bläschenbildung führt. Katalase-positive Keime besitzen stets auch andere Hämenzyme, insbe-
sondere ein Cytochrom-System, katalase-negative Keime sind meist cytochromlos.
Durchführung:
Einige Kolonien werden auf einen Objektträger übertragen, anschl. 2-3 Tropfen Katalase-
Reagenz (3%ige H2O2) dazugeben.
Positiv: Sofortige Bläschenbildung
Glucose-Medium: Säurebildung nach Kohlehydratabbau
Es wird geprüft, ob Glucose unter aeroben Bedingungen, wie sie im flüssigen Glucosemedium
herrschen (oxydativ), abgebaut werden kann. Der Indikator Bromthymolblau zeigt im positiven
Fall einen Farbumschlag an. Das Glucosemedium enthält ferner ein DURHAM-Röhrchen zum
Auffangen von Gas, das während des fermentativen Kohlenhydratabbaues entstehen kann.
Durchführung:
Glucose-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten.
Beurteilung:
Säurebildung positiv: Umschlagen des Indikators von blau nach gelb
Gasbildung positiv: Gasblase im Durhamröhrchen
Zitrat Verwertung:
Das Substrat enthält als alleinige Kohlenstoffquelle Zitrat und als alleinige Stickstoffquelle ein Am-
moniumsalz. Keime, die mit beiden Substanzen ihren Stoffwechsel bestreiten können, wachsen in
diesem Medium. Die entstehende Alkalisierung führt zur Trübung des Mediums.
Durchführung:
Zitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten
Positiv: Wachstum und Indikatorfarbumschlag nach blau
11
Nitratreduktionstest:
Bei Vorhandensein des Enzyms Nitratreduktase wird Nitrat zu Nitrit und ggf. weiter zu Ammoniak
oder molekularem Stickstoff reduziert. Entstandenes Nitrit kann durch das Griess-Reagenz (Sul-
fanilsäure + Alpha-Naphthalin) nachgewiesen werden.
Wird Nitrat nur bis Nitrit reduziert, wird die Reaktion mit dem Griess-Reagenz positiv (Rotfär-
bung). Erfolgt eine weitergehende Reduktion, wird Nitrit vollständig zu Ammoniak und N2 redu-
ziert, als Folge wird die Griess-Reaktion negativ. Eine negative Griess-Reaktion kann daher durch
ein Fehlen der Nitratreduktase (keine Nitratreduktion) oder durch eine vollständige Reduktion von
Nitrat zu Ammoniak oder elementaren Stickstoff verursacht werden. Um zwischen diesen Mög-
lichkeiten zu unterscheiden, wird Zinkstaub zu der Reaktion hinzu gegeben. Zinkstaub reduziert
Nitrat ebenfalls zu Nitrit. Tritt nach Zugabe von Zinkstaub eine Rotfärbung auf heißt dies, dass
Nitrat noch vorhanden war, als keine bakterielle Nitratreduktase vorlag (Negative Reaktion). Erfolgt
nach Zinkstaubzugabe keine Rotverfärbung, bedeutet dies, dass das Nitrat vollständig reduziert
wurde (Positive Reaktion).
Prinzip: Nitratreduktase
Nitrat → Nitrit → Ammoniak, Stickstoff
Zinkstaub
↑
Nachweis durch Griess-Reagenz
Durchführung:
Nitrat-Medium beimpfen und für 16-24h bei 37°C bebrüten
Beurteilung Nitratreduktionstest:
Gasbildung: Gasblase im Durham-Röhrchen
Griess-Reagenz: ca. 5 Tropfen hinzufügen, einige Minuten warten
Rotfärbung: Ergebnis positiv
Farblos: → Zugabe von etwas Zinkstaub
Farblosigkeit bleibt nach Zugabe von Zinkstaub: Ergebnis positiv
Rotfärbung nach Zugabe von Zinkstaub: Ergebnis negativ
Kligler-Agar (Zwei-Zucker-Eisen-Agar):
Durch den Gehalt an Glukose (0,1%), Laktose (1%), Phenolrot und Eisen-II-Sulfat ermöglicht der
Kligler-Agar die gleichzeitige Erkennung mehrerer biochemischer Leistungen. Bei alleinigem
Abbau der in limitierten Mengen vorhandenen Glukose kommt es nach 6 Stunden zur Säuerung
(fermantativ) und zum Indikatorfarbumschlag (von rot nach gelb) der Agarschrägfläche und der
Hochschicht. Durch aeroben Abbau von Proteinen wird bei weiterer Bebrütung im Schräganteil
eine Realkalisierung bewirkt, in deren Folge der Indikator wieder umschlägt (von gelb nach rot).
Bei Abbau der in großen Mengen vorhandenen Laktose findet die Realkalisierung nicht statt.
Durchführung:
- Impfnadel ausglühen und erkalten lassen
- Mit Impfnadel Bakterienkolonie aufnehmen
- Impfnadel tief in den Agar einstechen
- Impfnadel aus der tiefen Agarschicht ziehen und dabei
zickzackförmig auf der Agarschrägfläche ausstreichen
- Impfnadel ausglühen
16-24h bei 37°C bebrüten.
Beurteilung:
Schrägfläche rot, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose
Schrägfläche gelb, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose und Laktose
Schrägfläche rot, Hochschicht rot: kein Abbau von Glukose und Laktose
Schwarzfärbung der Hochschicht: Bildung von H2S (Eisensulfid)
Blasen- und Rissbildung: Gasbildung beim Glukoseabbau
C
Beim pfen Schräg-
Stichagarm edien
(Kligler)
1.
2.
3.
12
SIM-Agar (Schwefelwasserstoffbildung-Indol-Motilität):
Beim SIM-Agar handelt sich es um einen komplexen Agar, der mehrere Leistungen überprüft. Die
Agarkonzentration ist so gewählt, dass gerade keine Verflüssigung eintritt.
Bewegliche Bakterien beschwärmen diesen Leicht-Agar vollständig, während unbewegliche Bak-
terien nur am Impfstrich wachsen.
Außerdem wird Bildung von H2S und Indol nachgewiesen.
Durchführung:
- Impfnadel ausglühen und erkalten lassen
- Mit Impfnadel eine Bakterienkolonie aufnehmen
- Impfnadel tief in den Agar einstechen
- Impfnadel rausziehen und ausglühen
16-24h bei 37°C bebrüten
Beurteilung:
Schwefelwasserstoffbildung (H2S):
Positiv: Schwarzfärbung
Indol-Bildung: Einige Tropfen Indol-Reagenz (Kovacs Reagenz) zusetzen
Positiv: Roter Ring
Motilität:
Positiv: Homogenes Wachstum = beweglich
Negativ: Wachstum nur am Impfstrich = unbeweglich
Aufgabe Übung 3:
Färben und Identifizieren von Bakterien
Färben:
1. Von der Bakterienkultur 1 Färbepräparate herstellen, lufttrocknen, hitzefixieren
2. Präparat nach Gram färben
3. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3
Mikroskopie: Objektiv 100er, Blende geöffnet, ohne Deckglas, mit Immersionsöl
Identifizieren:
1. Beurteilung der Kulturen und Durchführung der biochemischen Tests (siehe Protokoll)
2. Protokollieren im Protokollblatt Übungen 1-3:
3. Beimpfen einer „Bunten Reihe“
Die Kulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet, am nächsten Kurstag ausgewertet und der
Keim identifiziert.
1.
2.
B
Beimpfen
Stichagarmedium
13
Protokoll Übungen 1-3:
Ergebnisse der mikroskopischen, kulturellen und biochemischen Prüfungen
Gramverhalten:
positiv / negativ
Morphologie:
Kokken / Stäbchen
Kolonieform: (auf Blutagar)
Größe:
Kontur:
Profil:
Oberfläche:
mm im Durchmesser……….
rund / unregelmäßig / gekerbt / rhizoid /….
flach / erhaben / konvex / hochkonvex /….
glatt / glänzend / matt / rau / gestreift/….
Konsistenz (Prüfung mit der Öse):
salbenartig / membranös / schleimig
Pigmentierung (auf Peptonagar):
Bildung löslicher Farbstoffe:
positiv / negativ
positiv / negativ
Katalase (auf Objektträger):
positiv / negativ
Oxidase (auf Oxidase Testfeld):
positiv / negativ
Hämolyse (auf Blutagar):
positiv / negativ
Wachstum auf MacConkey-Agar:
positiv / negativ
Laktosespaltung (auf MacConkey-Agar)
positiv / negativ
Kligler-Medium: (Anaerobe Säurebildung)
Glukose:
Gasbildung:
positiv / negativ
positiv / negativ
Dextrose-Medium: (Aerobe Säurebildung)
Glukose:
Gasbildung:
positiv / negativ
positiv / negativ
Nitrat-Medium: (Nitrit aus Nitrat)
Gasbildung:
Alkalisierung:
Nitritreduktion:
positiv / negativ
positiv / negativ
positiv / negativ
SIM-Agar:
Schwefelwasserstoffbildung: (H2S)
Indol-Bildung:
Motilität:
positiv / negativ
positiv / negativ
positiv / negativ
Zitrat-Medium:
positiv / negativ
14
Identifizierungsschlüssel für grampositive und gramnegative Bakterien:
Wahrscheinlichste taxonomische Gruppe
Biochemische
Leistungen
Mic
roco
ccu
s
Sta
ph
ylo
co
ccu
s
Str
ep
toco
ccu
s
En
tero
co
ccu
s
Bacil
lus
sp
.
Vib
rio
, A
ero
mo
nas
Pseu
do
mo
nas
Esch
eri
ch
ia c
oli
Serr
ati
a
marc
escen
s
Kle
bsie
lla p
neu
-m
on
iae
Pro
teu
s v
ulg
ari
s
Neis
seri
a
Bacte
roid
aceae
Gramverhalten + + + + + - - - - - - - -
Morphologie 1 1 1 1 2 2,4,5 2 2 2 2 2 1 1,2,3,4
Sporenbildung - - - - + - - - - - - - +
Aerobes
Wachstum + + + + + + + + + + + + -
Wachstum auf
MacConkey - - - - - - + + + + + + (+)
Laktosespaltung
(auf MacConkey) - - - - (+) + - + - + - -
Pigmentierung gelb weiß - - - - - - rot - - gelb schwarz
Oxidase v - - - v + + - - - - + v
Katalase + + - - + + + + + + + v
Kligler/Säure - - - + V + - + + + + - +
Kligler/Gas - - - - - - + - + -
Dextrose/Säure V - + + V + V + + + + V -
Dextrose/Gas - - - - - V - + V + -
Nitrat-Medium V - + - V - + + + + + V -
SIM-Agar/H2S - - - - V - - V V V + - V
SIM-Agar/Indol - - - V - - - V V V + - V
SIM-Agar/ Motilität - - - - - V + V V V + - V
Zitrat-Medium - - - - V V + - + + V
Zeichenerklärung:
+ = positiv
- = negativ
v = variabel
1 = Kokken
2 = Stäbchen
3 = Keulenform
4 = Fadenform
5 = Schraubenform
Schlussfolgerung aus den Ergebnissen der Übungen 1 und 2:
Welcher der in der Tabelle aufgeführten taxonomischen Gruppe ist der untersuchte Keim
zuzuordnen? ................................................. ...............................
15
Kursteil 3
B. Bakterienflora der Umwelt
Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld Die atmosphärische Luft hat im Gegensatz zum Erdboden und Wasser keine endogene Bakteri-
enflora. Bakterielle Luftkontaminanten sind an schwebende Staubpartikel oder Flüssigkeitströpf-
chen gebundene Keime des Erdbodens oder stammen aus der endogenen physiologischen oder
pathologischen tierischen Flora (Raumluft). Entsprechendes gilt für die meisten Gebrauchsge-
genstände und mit Einschränkung für die äußere Haut des Menschen. Von primären Reservoirs
über das Vehikel Luft (aerogene Infektion) oder durch kontaminierte Gegenstände (Schmierinfek-
tion) übertragene Krankheitserreger, spielen in der medizinischen Praxis eine erhebliche Rolle.
Die Anzahl der übertragenen Keime steht dabei in der Regel in einem direkten Verhältnis zu der
Wahrscheinlichkeit einer Infektion.
Es gibt eine große Anzahl von Verfahren zur Luftkeimzahlbestimmung nebst unzähligen Modif ika-
tionen, die insbesondere von Krankenhaushygienikern verwendet werden (Operationssäle). Eine
100%ige Keimerfassung gibt es nicht. Dagegen lässt sich natürlich eine praktisch 100%ige Ent-
fernung von Luftkeimen z.B. durch Luftfilter erreichen.
Bei Luftkeimbestimmungen müssen theoretisch folgende 2 Vorraussetzungen gegeben sein:
Schonender und umfassender Keimeinfang
Optimale Kulturbedingungen
Einige der gebräuchlichsten Verfahren sind:
A: Keimeinfang (über Druck- oder Saugluft)
B: Kultivierung
1. Wasserlöslicher Filter
(Algen-, Gelatinetrockenfilter u.a.)
nach Auflösung der Filter in Nährflüssigkeit
→ Membranfiltrierung wie A-2
2. Membran-Filter(Cellulose-Acetat)
nach Auflegen der Filter auf Agarplatten
3. Schlitzsammler auf Agarplatten
der Keimeinfangagarplatten
4. Porensammler
(z.B. 6-Stufensammler auf Agarplatten)
wie A-3
5. Waschflaschen (mit Phosphatpuffer)
a) als Luftdurchperler (geringer Durchfluss)
b) als sog. Impinger (Flüssigkeitszerstäuber;
to impinge = aufprallen)
siehe unter A-1
siehe unter A-1
6. Als grobquantitativer Sedimentationsver-
fahren
auf Agarplatten
16
Aufgabe Übung 4:
Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld
1 = Raumluft
2 = Fußboden
3 = Arbeitstisch
4 = Gegenstand nach Wahl
5 = Gegenstand nach Wahl
6 = Gegenstand nach Wahl
7 = Gegenstand nach Wahl
8 = Gegenstand nach Wahl
- für die Raumluftuntersuchung wird die Agarplatte für die Dauer von 1 Stunde
offen auf dem Arbeitstisch gelegt und anschließend mit dem Deckel verschlossen
- zur Untersuchung des Fußbodens und des Arbeitstisches (2 und 3) wird mit einem an-
gefeuchteten Watteträger ein Abstrich genommen und das Material auf Agarplatte
ausgestrichen
- Platten mit der Platz-Nr. und zusätzlich mit dem Buchstaben oder der Zahl des gewählten
Untersuchungsmaterials beschriften
- Die Kulturen werden eingesammelt und 16 – 24 h bei 37°C bebrütet
Aufgabe Übung 4 am nächsten Kurstag:
Auswertung der Kulturen „Bakterien aus dem direkten Umfeld“
- Makroskopische Beschreibung von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten
(Morphologie, Nährbodenveränderung)
- Präparate herstellen
- Präparate nach Gram färben
- Protokollieren in nachfolgender Tabelle
Protokoll Übung 4: Anzucht von Bakterien aus dem direkten Umfeld:
Keim
Nr.
Kolonie-
morphologie
a. d. Nährboden
Nährboden-
veränderung
Gramreaktion/
Morphologie
Vermutete
Gattung
1
2
3
Welche Bakteriengattungen bzw. -spezies werden typischerweise nachgewiesen?
in der Raum-
luft:...................................................... ..........................................................................
auf dem Fußbo-
den:........................................................................................................ ..................
auf dem Arbeits-
tisch:........................................................................................................................
auf den Gegenständen nach
Wahl……………………………………………………………………….
17
Übung 5: Anzucht von Bakterien des Erdbodens Abbildung und Tabelle geben einige Hinweise auf die ökologische Bedeutung und die Gattungen
der im Erdboden vorkommenden Bakterien. Einige Vertreter mit medizinischer Bedeutung sind in
der Tabelle unterstrichen.
Ungefähre Zusammensetzung der Mikroorganismen im Erdboden
Biomasse des Erdbodens (Bakterien-Gattungen mit med. Bedeutung sind fett gedruckt)
Symbiotische
Frei lebende
Bakterien Algen Hefen
Rhizobium sp.
Klebsiella sp.
Actinomyceten
und
Pilze
Azotobacter sp.
Azotomonas sp.
Spirillum sp.
Bacillus sp.
Enterobacter sp.
Nocardia sp.
Pseudomonas sp.
Clostridium sp.
etc.
Anabaena
Calothrix
Nostoc
Stigonema
Chlorogloea
etc.
Pullularia
Rhodotorula
18
Aufgabe Übung 5:
Anzucht von Bakterien des Erdbodens
- Eine Suspension von Gartenerde wird auf einem Blutagar fraktioniert ausgestrichen
- Platten mit ungeraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C aerob bebrütet
- Platten mit geraden Platznummern werden 16 – 24 h bei 37°C anaerob bebrütet
Auswertung der Kulturen „Bakterien des Erdbodens“ am Kurstag 3:
Aerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse)
3 verschiedener Kolonien
Präparate herstellen und nach Gram färben
Anaerobe Platte: Beschreibung von Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse)
3 verschiedener Kolonien
Präparate herstellen und nach Gram färben
Protokollieren in nachfolgender Tabelle
Aerobe
Keime
Wachstum a. d. Nährboden:
(Form, Größe, Hämolyse)
Gramfärbung:
(Morphologie, Gramverhalten)
Vermutete
Gattung
1.
2.
3.
Anaerobe
Keime
Wachstum a. d. Nährboden:
(Form, Größe, Hämolyse)
Gramfärbung:
(Morphologie, Gramverhalten)
Vermutete
Gattung
1.
2.
3.
19
Kursteil 4
C. Normale Bakterienflora des Menschen
Übung 6: Keimzahlbestimmung im Speichel Die Mundhöhle des Erwachsenen beherbergt im Vergleich zu anderen Körperarealen eine große
Zahl und Vielfalt an aeroben und anaeroben Mikroorganismen (ca. 30-50% sind Anaerobier). Die
folgenden Tabellen geben Aufschluss über Zahl, Verteilung und Art der Mikroorganismen.
Aufgabe Übung 6:
Keimzahlbestimmung im Speichel
1. Verdünnungsreihe nach Pipettierschema herstellen:
- 10,0ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 1 - 3 pipettieren
- 4,5ml Glucosebouillon in die Reagenzgläser 4 - 7 pipettieren (s. Schema)
- 0,1ml eigener Speichel mit der Glucosebouillon in Reagenzglas 1 vermischen, bitte hier nach
jedem Pipettierschritt die Glaspipette wechseln!!
Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet
Auswertung: es wird beurteilt bis zu welcher Verdünnungsstufe Wachstum vorhanden ist
Protokoll: siehe Kursteil 5
2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml:
- aus Reagenzglas 5, 6, 7 je 1,0 ml auf je einen Peptonagar geben, mit einem Spatel verteilen
- Platten mit Platznummer und Verdünnungsstufe beschriften
Kulturen werden 16 - 24 h bei 37°C bebrütet
Auswertung: es werden auf jeder Agarplatte alle Kolonien gezählt
Protokoll: siehe Kursteil 5
20
Pipettierschema:
Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels
1. Verdünnungsreihe:
Verdünnungsstufen: 10-2 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10
Wachstum:
(=Trübung)
Protokoll Übung 6: Keimzahlbestimmung des Speichels
2. Bestimmung der Anzahl aerober Keime pro ml Speichel mit Hilfe des arithmetischen
Mittels:
Beispiel:
Anzahl gezählter Kolonien:
Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: 150 Kolonien →150 Kolonien
Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: 10 Kolonien →100 Kolonien
Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: 5 Kolonien → 500 Kolonien
Summe =750 Kolonien
750 : 3 = 250 Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10)
Errechnen der ungefähren Keimzahl des eigenen Speichels:
Anzahl gezählter Kolonien:
Bei einer Verdünnung von 10-8 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien
Bei einer Verdünnung von 10-9 ml: ……. Kolonien → ……. Kolonien
Bei einer Verdünnung von 10-10 ml: ……. Kolonien →……. Kolonien
Summe = Kolonien
……. : 3 = ……. Kolonien pro 10-8 ml Speichel (oder pro 1 ml Speichel: 2,5 x 10-10)
21
Übung 7: Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque Der als "Plaque" bezeichnete Zahnbelag, der eine Vielzahl aerober und anaerober Bakterien
enthält (s. Tabelle), soll in dieser Übung mikrobiologisch untersucht werden.
(Tabelle aus: Sauerwein, Kariologie)
Aufgabe Übung 7:
Anzucht von Bakterien aus dentaler Plaque
1. Herstellen eines Direktpräparates von Plaque
- Mit Hilfe eines sterilen Zahnstochers wird vom Zahnbelag vorsichtig
Material abgeschabt und in einem winzigenTropfen Wasser auf einem Objektträger
suspendiert
- lufttrocknen, nach Gram färben
2. Aerobe und anaerobe Kultivierung von Plaque
- Identisch entnommene Proben des Plaquematerials werden zur Anzucht auf zwei
getrennte Blutplatten geimpft und fraktioniert ausgestrichen
- eine Kultur wird aerob, die andere wird anaerob 16 – 24 h bei 37°C bebrütet
Kurstag 5:
- von je 3 unterschiedlichen Kolonien auf den Agarplatten (aerobe und anaerobe Platte)
die Morphologie und Nährbodenveränderung (Hämolyse) beschrieben
- Von diesen Kolonien Präparate herstellen und nach Gram färben
Protokollieren in nachfolgender Tabelle
Protokoll Übung 7: Skizze vom Direktpräparat „dentale Plaque“ (Gramfärbung)
22
Protokoll Übung 7: Zahnbelag, aerobe und anaerobe Kultivierung
Aerobe
Keime
Wachstum a. d. Nährboden:
(Form, Größe, Hämolyse)
Gramfärbung:
(Morphologie, Gramverhalten)
Vermutete
Gattung
1.
2.
3.
Anaerobe
Keime
Wachstum a. d. Nährboden:
(Form, Größe, Hämolyse)
Gramfärbung:
(Morphologie, Gramverhalten
Vermutete
Gattung
1.
2.
3.
23
Übung 8: Anzucht von Bakterien aus dem Rachen Identifizierung des Trägerstatus für potentielle pathogene Keime:
Die nachfolgenden Tabellen geben einige Hinweise auf die Beteiligung der Gattung Streptococ-
cus an zahnmedizinisch relevanten Krankheitsprozessen in der Mundhöhle.
Normale Rachenflora (durchschnittliche Häufigkeit in der aufgeführten Reihenfolge
abnehmend)
Pathologische Rachenflora (im Erkrankungsfall und bei sog. Gesunden Trägern)
Vergrünende Streptokokken (~80%) Staphylococcus aureus (Koagulase positiv)
Anhämolysierende Streptokokken (~5%) Streptococcus pyogenes
Neisseria spp. (~5%) Streptococcus pneumoniae
Koagulase-neg. Mikrokokken (~5%) Neisseria meningitidis
Laktobakterien (~1%) Haemophilus influenzae (Kapseltyp b)
Corynebacterium sp. (~1%) Opportunistische Enterobacteriaceae
Candida sp. (~1%) Candida albicans
Borrelia sp. (~1%)
Fusobacterium sp. (~1%)
Aufgabe Übung 8:
Anzucht von Bakterien aus dem Rachen
Herstellen eines Grampräparates und einer Kultur von der eigenen Rachenflora
- Jeder Kursteilnehmer entnimmt bei seinem Nachbarn mit den Wattetupfern 2 Rachen-
abstriche
- Mit dem 1. Wattetupfer ein Objektträger-Präparat herstellen, dabei den Tupfer kräftig
auf dem Objektträger ausdrücken (kein Wasser zufügen!)
- Objektträger lufttrocknen, Hitzefixieren und nach Gram färben
- der 2. Rachenabstrich auf dem ersten Drittel einer Blutplatte ausstreichen,
die beiden anderen Drittel mit der Öse ausstreichen
- Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten
Mikroskopie:
- Zeichnen der verschiedenartig aussehenden Keime des Direktpräparates
(Neben Plattenepithelien, Schleimfäden, gelegentlich Nahrungsresten sieht man in der
Regel eine Vielzahl, z. T. sehr unterschiedlicher Bakterienformen)
24
Nächster Kurstag:
Beurteilung der Kultur von der eigenen Rachenflora
Ziel der Übung ist, in der Gruppe der Kursteilnehmerinnen die gesunden und kranken "Träger"
dieser Infektionserreger zu identifizieren (Trägerstatus, Durchseuchung)
- mit dem Filzstift verdächtige Kolonien markieren (auf dem Plattenboden) und deren Eigenart
protokollieren
- anlegen von Reinkulturen potentiell pathogener Erreger, insbesondere:
S. aureus, S. pyogene, S. pneumoniae, gramnegative Stäbchen = "Opportunisten"
- Kultur 16 – 24 h bei 37°C bebrüten
Übernächster Kurstag:
- Die Kultur wird beurteilt und falls erforderlich, eine weitere Keimdifferenzierung vorgenommen
(z. B. Plasmakoagulase, Streptex-Test Bacitracin-, Optochin-Test)
- herstellen von Grampräparat(en)
Protokoll Übung 8: Grampräparat vom Rachenabstrich
Protokoll Übung 8: Kultur der eigenen Rachenflora
Keim Wachstum a. d. Nährboden:
(Form, Größe, Hämolyse)
Gramfärbung
(Morphologie, Gramverhalten)
Vermutete Gattung
1
2
3
Protokoll Übung 8: Trägerstatus bei KursteilnehmerInnen
Keime
Anzahl potenziell
pathogener Keime
im Kurs
Gesamtzahl der
Rachenabstriche
Trägerstatus
(% positiv)
Positiv für S.aureus
Positiv für S.pyogenes
Positiv für S.pneumoniae
Sonstiges
25
Kursteil 5
Übung 9: Abgrenzung von S.aureus gegenüber anderen Micrococcaceae Grampositive Haufenkokken gehören zur Familie der Micrococcaceae mit den beiden wichtigsten
Genera Staphylococcus und Micrococcus. Bei letzteren handelt es sich meist um so genannte
Luftkokken.
Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Eiter- und Entzündungserreger beim Menschen.
Er bildet invitro u.a. Plasmakoagulase, deren Nachweis neben dem einer DNase seine sichere
Identifizierung ermöglicht. Dieses Enzym vermag Menschen- oder Kaninchenplasma (Citrat-,
Oxalat- oder Heparinplasma) auf nicht ganz geklärte Weise zu koagulieren (Ausfällung von Fib-
rin). (Herstellung von Citratplasma: Mischen von Vollblut mit 3,8% Na-Citrat (4 Teile + 1 Teil) zent-
rifugieren, Überstand = Plasma). S. aureus-Stämme bilden meist gelbes oder gelbweißliches
Pigment und auf Blutagar meist beta-Hämolyse.
S.epidermidis und S.saprophyticus sind normale Haut- und Schleimhautkeime, kommen aber
auch als opportunistische Infektions-Erreger (bei Abwehrschwäche, z.B. bei Immunsuppression
u. postoperativ) vor. Sie sind wie alle Micrococcaceae (mit Ausnahme von S. aureus) Plasmako-
agulase negativ.
Koagulase-Reaktion:
Durch das Enzym Koagulase wird das Fibrinogen im Zitratplasma von Menschen und Kaninchen
in Fibrin überführt. Die Koagulase ist ein Pathogenitätsfaktor von Staphylococcus aureus. Sus-
pendiert man Staphylococcus aureus in einen auf einem Objektträger befindlichen Zitratplas-
matropfen, so kommt es zur Ausfällung von Fibrin, in dessen Netzwerk die Staphylokokken ein-
gebettet sind. Makroskopisch erkennt man die Bildung kleiner Klümpchen in klarer Flüssigkeit
(positives Ergebnis), die eine Agglutination erkennen lassen. Im Gegensatz zu anderen Staphylo-
kokken besitzen fast alle Staphylococcus aureus-Stämme diesen "Clumping factor" an ihrer Zell-
oberfläche.
Durchführung:
Das verdächtige Keimmaterial wird mit einem sehr kleinen Wassertropfen auf einem Objektträger
bis zur Homogenität verrieben. Dann wird mit der Pasteurpipette ein Tropfen Zitratplasma mit dem
Keimmaterial vermischt.
Positiv: Plasma koaguliert (Flockenbildung)
Aufgabe Übung 9:
Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken
- Betrachtung der Blutagarkulturen (bei Auflicht sowie gegen das Licht) auf erkennbare
Unterschiede, z.B. Hämolyse etc.
- Herstellen von Gram-Präparaten (von allen 3 Kulturen auf einem Objektträger)
- Nachweis des Clumping-Faktors (Koagulase-Reaktion) im Objektträgertest
- Protokolliere die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Kriterien für die
Keime A, B und C zur Identifizierung von S. aureus
26
Protokoll Übung 9: Abgrenzung von S. aureus gegenüber sonstigen Mikrokokken
Kriterien:
Keim A
Keim B
Keim C
Koloniefarbe
Hämolyse (Blutagar)
Gramfärbung
Kokkenform
(Zeichnung)
Clumping-Faktor
Mutmaßliche
Beweglichkeit
Mutmaßliches
Wachstum auf
MacConkey-Agar
Diagnose:
27
Kursteil 6
Übung 10: Neisser-Färbung zum Nachweis von Corynebacterium Energiereiche Phosphatbindungen werden von zahlreichen Bakterienarten in Form von haupt-
sächlich aus Polyphosphat bestehenden Plasmaeinschlüssen als Reservestoffe gespeichert, z.B.
von Spirillum volutans ("Volutin"), Lactobacillus- u. Corynebacterium-Arten. Die Darstellung von
Polyphosphat (dunkelbraun bis schwarz bei gelbem Cytoplasma) mit Hilfe der Neisser-Färbung ist
keineswegs für Diphtheriebakterien spezifisch, aber als positives Merkmal zur Charakterisierung
von Diphtheriebakterien unerlässlich als frühester und schnellster diagnostischer Hinweis bei der
Untersuchung von Rachen- bzw. Wundsekret in Diphtherie-Verdachtsfällen.
(Endgültige Diagnose: Nachweis der Toxinbildung (z.B. Agardiffusionstest nach ELEK bei ver-
dächtigen Reinkulturen).
Neisser-Färbung (Differenzialfärbung)
- Präparat hitzefixieren
- Lösung "Neisser I", 30 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen!
- Lösung "Neisser II", 15 Sekunden, abgießen, nicht mit Wasser abspülen!
- zwischen Filterpapier trocknen
Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl
Aufgabe Übung 10:
Mikroskopie der ausliegenden Dauerpräparate:
mit 100er Objektiv, Immersionsöl
Protokollieren der Neisserfärbung: Reaktion von C. diphteriae oben und von C. pseudodipht
unten einzeichnen.
Protokoll Übung 10: (Farbskizzen!)
28
Übung 11: Kinyoun-Färbung zum Nachweis von Mykobakterien
Die Kinyoun-Färbung ist eine modifizierte Ziehl-Neelsen-Färbung.
Die Mykobakterien sind „säurefest“. Freie Mykolsäuren in der Zellwand gehen mit Karbolfuchsin
(Fuchsin + Phenol) eine Komplexbildung ein, die einer Entfärbung mit HCL-Alkohol standhält,
während die nicht-säurefesten Bakterienarten dadurch entfärbt werden.
Kinyoun-Färbung: (Differenzialfärbung)
- Präparat hitzefixieren (ist bereits geschehen)
- Karbolfuchsin → 4 Min.
- kurz mit Leitungswasser abspülen
- Salzsäurealkohol → 3-5 Sekunden
- kurz mit Leitungswasser abspülen
- Methylenblau → 30 Sekunden
- kurz mit Leitungswasser abspülen
- trocknen zwischen Filterpapier
Mikroskopie: 100er Objektiv, Immersionsöl
Aufgabe Übung 11:
Mikroskopie der ausliegenden Dauerpräparate:
mit 100er Objektiv, Immersionsöl
Da Mykobakterien in klinischen Materialien in geringer Konzentration vorhanden sein können,
müssen zahlreiche Gesichtsfelder durchmustert werden, wobei das Objektiv die Ausstrich-
fläche auf mäanderförmiger Bahn durchläuft.
Protokollieren
Protokoll Übung 11: Säurefeste Stäbchen (farbige Skizze!)
29
Übung 12: Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest) Die Resistenztestung von Bakterien gegenüber Antibiotika wird entweder mit dem Agardiffusions-
test auf festen Nährböden oder mit dem Reihenverdünnungstest in flüssigen Medien durchgeführt.
Mit dem Agardiffusionstest wird der Hemmhof ermittelt und mit dem Reihenverdünnungstest die
minimale Hemmstoffkonzentrationen.
Aufgabe Übung 12:
Antibiotika-Resistenzbestimmung I (Agardiffusionstest)
- Auf den Boden der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird die Platz-Nr. und der Name des zu
prüfenden Stammes geschrieben. (S .aureus, E. coli oder häm. Streptokokken)
- Mit der Öse wird von der zu testenden Kultur Material entnommen und in der Mineralbasis
zu einer deutlich trüben Suspension aufgeschwemmt.
- Die gesamte Oberfläche der beiden Müller-Hinton-Agarplatte wird unter Verwendung eines
Wattetupfers mit der Bakteriensuspension bestrichen.
- Anschließend werden mit den beiden Dispenser die Antibiotika-Plättchen auf den Agar
aufgebracht. Getestet werden 12 verschiedene Antibiotika (6 pro Platte)
- Kulturen (mit der Agarschicht nach oben) 16 - 24 h bei 37oC bebrüten
Am nächsten Kurstag:
Auswertung und Protokollierung nach folgendem Bewertungsmaßstab:
Hofdurchmesser von 14 mm und größer = empfindlich = ++
Hofdurchmesser von <11-13 mm = schwach empfindlich = +
kein Hemmhof <11 mm = resistent = -
Zur Therapie im Erkrankungsfall werden nur doppelt-wirksame (++) Antibiotika verwendet.
Protokoll Übung 12: Agardiffusionstest
Wirkstoffe S. aureus E. coli Häm. Streptokokken
Dispenser Code Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Penicillin P 14 14 14
Ampicillin AM 14 14 14
Ampicillin/Sulbactam SAM 14 14 14
Piperacillin PIP 14 14 14
Cefazolin CZ 14 14 14
Cefotaxim CTX 14 14 14
Dispenser II Code Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Wildtyp
in mm
Isolat
in
mm
Imipenem IPM 14 14 14
Erythromycin E 14 Wird nicht
beurteilt 14
Ciprofloxacin CIP 14 14 14
Gentamicin GM 14 14 14
Co-Trimoxazol SXT 14 14 < 11
Tetracyclin TE 14 14 14
30
Protokoll Übung 12: Der Vergleich aller im Kurs untersuchten Kulturen ergibt:
Stämme Anzahl untersuchter
Stämme
Anzahl sekundär-
resistenter Stämme
Anzahl mehrfach-
resistenter Stämme
S. aureus
E. coli
Häm. Streptokokken
Hinweis auf Sekundärresistenz durch chromosomale Mutation oder plasmidgebundene
Resistenzfaktoren:
Streptococcus pyogenes (Gruppe A), Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae,
Treponema pallidum neigen nicht oder selten zur Ausbildung einer Resistenz gegen Penicillin.
Für die entsprechenden Krankheiten stellt Penicillin das Antibiotikum der Wahl dar. Bei beste-
hender Penicillin-Allergie muss allerdings ein anderes Antibiotikum genommen werden (Erythro-
mycin).
31
Übung 13: Antibiotika-Resistenzbestimmung II (MHK)
Aufgabe Übung 13:
Antibiotika-Resistenzbestimmung II (Minimale Hemmkonzentration, MHK)
Je 3 Kursteilnehmer bearbeiten einen Testkeim (Keim A, B oder C, auf Peptonagar)
1. Herstellen einer Testkeim-Suspension:
3-5 Kolonien des Testkeims in ein Röhrchen mit Mineralbasis suspendieren (leichte Trübung)
2. Beschriften der sterilen Glukosebouillonröhrchen mit:
Platznummer, 100 I.E., 10 I.E., 1 I.E., Kontrolle (I.E. = Internationale Einheiten Penicillin/ml)
In dem Glukosebouillonröhrchen das bereits 1000 I.E. beschriftet ist, befinden sich schon
1000 I.E. Penicillin
3. Herstellen einer Penicillin-Verdünnungsreihe nach unterem Schema
Verdünnungsreihe 16-24h bei 37°C bebrüten
Pipettierschema für die MHK
Beschriftung der Röhrchen 1000 I.E. 100 I.E. 10 I.E. 1 I.E. Kontrolle
Volumen im Röhrchen (ml) 5,0 4,5 4,5 4,5 4,5
Penicillin Konzentration I.E./ml 1000 0 0 0 0
Überpipettieren verwerfen
Überpipettiertes Volumen (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0
Endvolumen im Röhrchen (ml) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5
Endpenicillin-Konzentration I.E./ml 1000 100 10 1 0
Beimpfung mit der Testkeim-Suspension 1 Öse 1 Öse 1 Öse 1 Öse 1 Öse
Protokoll Übung 13: MHK
Internationale Einheiten Penicillin / ml (I.E. Pen.)
(Trübung = Bakterienwachstum)
Gattung od. Gruppe
1000 IE/ml
100 IE/ml
10 IE/ml
1 IE/ml
Kontrolle
A = Bacillus sp.
B = E. coli
C = S. aureus
Schlussfolgerung:
Hinsichtlich der wildtypischen Empfindlichkeit gegenüber Penicillin unterscheiden sich die unter-
suchten Spezies wie folgt:
………………………………………………………………………………………………………
32
Abschnitt III: Hygiene
Kursteil 7
Temperaturresistenz
Nachweis von Keimen im Trinkwasser
Abklatschuntersuchung der Hände
Mikrobielle Besiedlung der Hände
Temperaturresistenz Theoretischer Hintergrund:
Im Unterschied zur Desinfektion dient die Sterilisation der Abtötung aller auf einem Gegenstand
oder in einer Zubereitung befindlicher Mikroorganismen. Hierzu zählen auch Sporen von Bakte-
rien, die eine besondere Resistenz gegenüber thermischen oder chemischen Einflüssen aufwei-
sen. Dies begründet die meist aggressiveren Verfahren der Sterilisation im Unterschied zur Des-
infektion, die eine Teilentkeimung zur Sicherstellung der Unterbrechung von Infektketten als Auf-
gabe hat. Die Grenzen der heute angewendeten Sterilisationsverfahren (meist Dampfsterilisation
für thermostabile Medizinprodukte, Niedrig-Temperatur-Plasmasterilisation für beispielsweise
thermolabile Instrumente) werden beim Versuch der Zerstörung von Prionen erreicht. Hier sind in
Zukunft neue oder geänderte Verfahren zu erwarten. Im heutigen Versuch sollen die Resistenzen
einzelner Bakteriengruppen gegenüber ausgewählten Entkeimungsmaßnahmen geprüft werden
Aufgabe Übung 14:
Testen der Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien
Es sollen 2 verschiedene Bakteriensuspensionen und 3 unterschiedlich vorbehandelte Sporen-
streifen bearbeitet werden, um anschl. zu beurteilen wie sich Hitze auf das Wachstum von
Bakterien auswirken.
Untersuchungsmaterial:
1. A = S. aureus 30 Min. bei 60°C vorbehandelt
2. B = E. coli 30 Min. bei 60°C vorbehandelt
3. C = Sporenstreifen unbehandelt
4. D = Sporenstreifen bei 120°C sterilisiert
5. E = Sporenstreifen bei 160°C 2, Stunden im Heißluftsterilisator sterilisiert
Reagenzien und Werkzeug:
6 sterile Glukosebouillons
Sterile Pipetten (in den Metalldosen)
Holzklammern
Pipettierschema:
Die Suspensionen A + B gut aufschütteln! (Achtung: Deckel sind nicht dicht)
1. Suspension A → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A1
2. Suspension A, aufkochen → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit A2
3. Suspension B → 1Tropfen in ein steriles Bouillonröhrchen, beschriften mit B
4. Sporenstreifen C → ca. 2ml Leitungswasser zugeben, aufkochen,
anschl. den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
5. Sporenstreifen D → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
6. Sporenstreifen E → den Inhalt eines sterilen Bouillonröhrchens zugeben
Die 6 Bouillonkulturen werden 16-24 h bei 37°C bebrütet und am nächsten Kurstag
ausgewertet und protokolliert.
33
Protokoll Übung 14: Temperaturempfindlichkeit verschiedener Bakterien
Untersuchungsmaterial Behandlung Wachstum (+/-)
A1 = Staphylokokken-Bouillon
bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt
A2 = Staphylokokken-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt und
anschl. aufgekocht
B = E. coli-Bouillon bereits 30 Min. bei 60°C vorbehandelt
C = Sporenstreifen Aufgekocht mit Leitungswasser
(ca. 100°C)
D = Sporenstreifen bei 120°C, 2 bar Wasserdampf
autoklaviert
E = Sporenstreifen 2 Stunden bei 160°C
im Heißluftsterilisator sterilisiert
Schlussfolgerung:
34
Nachweis von Keimen im Trinkwasser Theoretischer Hintergrund:
Trinkwasser ist das wichtigste Lebensmittel, da es durch nichts anderes ersetzt werden kann.
Daher sind der Schutz des Wassers und der sparsame Umgang mit Trinkwasser eine der wich-
tigsten Aufgaben des Menschen.
Eine wichtige Grundlage zur Sicherung der Ressource Wasser ist die hygienische Überwachung
des Trinkwassers, gesichert im Infektionsschutzgesetz und darauf basierend, der Trinkwas-
serverordnung (TrinkwV oder auch TVO). Ziel dieser Verordnungen ist die Sicherstellung von
sauberem und hygienisch kontrolliertem Trinkwasser, das eine Gefährdung der menschlichen
Gesundheit ausschließt. Dieses wird vor allem durch die Einführung von Grenzwerten für ge-
sundheitsschädliche biologische und chemische Parameter erreicht.
Von zentraler Bedeutung ist dabei die mikrobiologische Überwachung des Wassers (Anlage 1
der TrinkwV) sind die sicherstellen soll, dass keine potenziell gesundheitsschädlichen Darmkeime
wie z.B. Escherichia coli und andere Enterobakterien im Wasser nachweisbar sind.
Krankheitserreger im Trinkwasser
Grundwasser aus ausreichender Tiefe enthält normalerweise nur wenige, unproblematische Kei-
me.Mikrobielle Verunreinigungen entstehen durch:
Unzureichende Filterwirkung des Bodens, v. a. bei Flachbrunnen
Undichtigkeiten des Brunnens (Regenwasser, Hochwasser)
Sekundärverkeimungen durch die Versorgungssysteme
Unzureichende Aufbereitung (Desinfektion)
Bildung von stabilen Biofilmen in Stagnationsbereichen
Infektionen durch Trinkwasser Beispiele: Bakterien:
- Salmonellen
- Kolibakterien: (E. coli: meist Enteritis)
- Shigellen, Campylobacter, Yersinia enterocolitica (Enteritis)
- Vibrio cholerae
- Chlamydien (C. trachomatis: Trachom, evtl. Erblindung)
- Staphylokokken (S. aureus: Wundinfektionen, Lebensmittelvergiftung)
- Clostridium perfringens (Lebensmittelvergifter)
- Pseudomonaden (P. aeruginosa: über Kontakt: Wundinfektionen, Ohrinfektionen, Pneumonie)
- Legionellen (L. pneumophila u.a.: indirekt über Aerosole: Pneumonie, Pontiac-Fieber),
Viren: z.B.
- Poliovirus (Polio: Kinderlähmung)
- Echovirus, Astroviren, Rotaviren, Noroviren
- Hepatitisvirus A und E (Hepatitis)
Protozoen:
- Entamoeba histolytica (Amöbenruhr)
- Giardia lamblia (Lambliasis: Enteritis)
Wurmkrankheiten:
- V. a. in den Tropen und häufig indirekte Infektionen über das Wasser
(z.B. Eindringen der Würmer oder Larven über die Haut: Schistosoma, Necator, Ancy-
lostoma,
Dracunculus, Strongyloides u.a.)
- Ascaris lumbricoides (Spulwurm: Aufnahme der Eier aus Abwasserkontaminationen)
- Enterobius vermicularis (v. a. bei Kindern. Infektion durch Wasser ist eine Ausnahme)
35
Der Infektionsweg ist normalerweise fäkaloral, aber auch aerogene Infektionen (z.B. Legionellen
über Aerosole) sowie Infektionen der Haut (Wunden, äußerer Gehörgang: Pseudomonas aerugi-
nosa) oder der Augen (Konjunktiva: Chlamydia trachomatis) sind möglich.
Einige Erreger verursachen Explosivepidemien (z.B. Cholera).
Die kritische Infektionsdosis ist äußerst unterschiedlich:
Vibrio cholerae 108 KBE
E. coli, Salmonella enteritidis 106 KBE
Salmonella typhi, Shigella dysenteriae 103 KBE
Legionella pneumophila, Yersinia enterocolitica 10 KBE
Enteroviren 1 - 10 PFU (plaque forming unit)
Giardia 1 Oozyste
Probleme der mikrobiologischen Überwachung des Trink- und Badewassers mittels bakte-
rieller Indikatoren:
Einige Mikroorganismen erreichen im Wasser und im Boden lange Überlebenszeiten (Tenazi-
tät),
die weit über 50 Tage („50-Tages-Linie“: Grundlage von Schutzmaßnahmen gegen mikrobielle
Beeinträchtigung der Wassers) hinausreichen können.
Der Indikator für mögliche fäkale Infektionserreger im Trinkwasser Escherichia coli und
Coliforme Keime nach der Trinkwasserverordnung ist nicht für alle Erreger anwendbar.
Auch im gechlorten Wasser ist der Indikatorwert von E. coli nur eingeschränkt anwendbar,
da E. coli im Vergleich zu einigen Krankheitserregern sehr chlorempfindlich ist.
Für Mikroorganismen, die nicht fäkal-oral übertragen werden (Pseudomonas aeruginosa,
Legionella pneumophila) sind die enterobakteriellen Indikatoren ebenfalls nicht sinnvoll.
Die bakteriellen Indikatoren gelten auch für Viren und Protozoen, die teilweise auch gegen
Desinfektionsmaßnahmen völlig anders reagieren.
Im Trinkwasser werden regelmäßig Bakterien mit unterschiedlicher Signifikanz nachge-
wiesen:
Potentielle Pathogene, d.h. Keime, die vor allem opportunistische Infektionen
z.B. im Krankenhaus oder bei Immungeschwächten verursachen können.
Weiterhin Bakterien, die Korrosionen, Färbungen oder Gerüche verursachen aber meist
unproblematisch sind (Umweltkeime).
Grenzwerte nach der Trinkwasserverordnung
Parameter (Anl.1) Grenzwert
Escherichia. coli 0/100ml
Enterokokken 0/100ml
Indikatorparameter (Anl. 3)
Clostridium perfringens: 0/100ml
Koloniezahl bei 22°C 100/ml am Zapfhahn
20/ml nach Abschluss der Aufbereitung
1000/ml bei Anlagen bis 1000m3/Jahr
Coliforme 0/100ml
Koloniezahl bei 36°C 100/ml Bei Koloniezahl „Grenzwert“:
Keine wesentlichen Änderungen
Legionellen (Anl. 3.2) Maßnahmewert: 100/100ml
Pseudomonas aeruginosa 0/100ml (Auf Anordnung des Gesundheitsamtes in „hy-
gienerelevanten“ Bereichen)
0/250ml in „abgepacktem Wasser in Behältern.
36
Nachweis von Mikroorganismen nach der Trinkwasserverordnung: Koloniezahl:
Als Koloniezahl (KBE: Koloniebildende Einheiten) wird die Zahl sichtbaren Kolonien def iniert, die
aus 1ml Wasser auf nährstoffreichen Agarnährböden bei einer Bebrütungstemperatur von 20°C
+ 2°C und 36°C + 1°C nach 44 + 4 Stunden gewachsen sind.
Nach der neuen TrinkwV von 2001 wird die Koloniezahl nach Membranfiltration bestimmt. Über
den Indikatorparameter KBE wird nur ein geringer Teil der tatsächlichen bakteriellen Belastung
des Wassers erfasst.
Der Nachweis von Escherichia coli und eingeschränkt coliformen Keimen gilt als Indikator
einer fäkalen Verunreinigung des Wassers.
Coliforme Bakterien sind häufig „Umweltkeime“ und nur teilweise fäkalen Ursprungs. Neben der
Gattung Escherichia sind dies z.B. Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Klebsiella u.a.
Als weiterer Indikator für Darmkeime wurden in die TrinkwV die so genannten Enterokokken
eingeführt. In der alten TrinkwV von 1990 wurden sie als Fäkal-Streptokokken (D-Streptokokken)
bezeichnet. Der Parameter „Enterokokken“ zielt im Wesentlichen auf humane Fäkalindikatoren
wie Enterococcus faecalis, E. durans, E. faecium, aber auch Umweltkeime, die z.B. auf pflanzli-
chen Rückständen leben, werden erfasst.
Enterokokken sind wesentlich resistenter als coliforme Keime gegen chemische Desinfektionsmit-
tel wie Chlor.
Der Nachweis von Clostridium perfringens (früher nach der alten TrinkwV von 1990: Sulfit
reduzierende, sporenbildende Anaerobier) erfolgt über Membranfiltration (aus 100ml). Es ist ein
Indikatorparameter, der die möglich Beeinträchtigung des Trinkwassers durch Oberflächenwas-
ser anzeigen soll. Wegen der hohen Stabilität dieser Keime gegen Desinfektionsmaßnahmen
(Sporenbildner!) gilt Clostridium perfringens auch als Indikator für Chlor-resistente Organismen
wie beispielsweise Oozysten von Cryptosporidium parvum.
Die TrinkwV schreibt für spezielle Wasserversorgungssysteme und Anwendungen weitere bakte-
rielle Untersuchungen vor wie zum Beispiel Legionellen (z. B. L. pneumophila) in Warmwasser-
systemen und aerosolbildenden Einheiten) und Pseudomonas aeruginosa im Badewasser und
in Behälter abgefülltem Wasser, sowie auf Anordnung des Gesundheitsamtes in „Hygieneberei-
chen“. Seit der letzten Änderung der TrinkwV (seit 01. 2012 in Kraft) müssen Legionellen auch in
größeren Mietshäusern (mehr als 2 Parteien) mit entsprechenden Warmwasserspeichern (ab
4000 Liter) untersucht werden
Im Verdachtsfall kann das Gesundheitsamt zusätzliche Untersuchungen fordern, so zum Bei-
spiel: Darmpathogene Keime wie Salmonellen, Shigellen, Campylobacter, Yersinien, Parasiten
wie Cryptosporidien oder Lamblien oder Viren.
Nachweis und Differenzierung von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden
„Einfache“ Differenzierungsmöglichkeiten:
E. coli und Coliformen-Nachweis erfolgte früher in Laktosebouillon, heute (nach neuer TrinkwV)
über Membranfilterung und Auszählung
1. Blutagar:
Optimalnährboden, Hämolyse Nachweis
2. MacConkey-Agar:
Selektivnährboden für gramnegative Bakterien.
Laktoseverwertung-positiv: Bakterien bilden rötlich bis rötlich-violette Kolonien.
Laktoseverwertung-negativ: Bakterien bilden helle Kolonien.
3. Cytochromoxidase-Reaktion:
Cytochromoxidase ist ein Enzym der Atmungskette.
Oxidase-Reagenz wird im Bereich verdächtiger Kolonien aufgetropft.
Positive Reaktion: blauviolette Färbung der Kolonien nach 10-15 Sekunden
4. Laktose-Pepton-Bouillon (Vergärung von Laktose):
a) enthält einen Indikator zum Nachweis von Säurebildung.
Positiv: Farbumschlag von purpur nach gelb nach 24-44 h bei 36°C und 44°C
b) enthält ein Durham-Röhrchen zum Nachweis von Gasbildung:
Positiv: Deutlich sichtbare Gasblase im Durham-Röhrchen nach 24-44 h bei 36°C und 44°C
5. Weitere Differenzierungen:
„Bunte Reihe“, standardisierte Mikromethoden
37
Einige Merkmale von E. coli, coliformen Keimen und Pseudomonaden
Nachweis: Wie: E. coli Coliforme
Keime
Pseudo-
monaden
Hämolyse:
auf Blutagar +/- +/- +/-
Laktoseverwertung:
auf MacConkey-Agar + + -
Gas- und Säurebildung bei
36°C:
in Laktose-Pepton-
Bouillon
+ + -
Cytochromoxidase-Reaktion Test - - +
Aufgabe Übung 15: (3er Gruppe pro Tisch)
Nachweis und Differenzierung von Keimen im Wasser nach TrinkwV u.a.
Es werden folgende Wasserproben aus Wassersystemen untersucht:
- Trinkwasser aus Wasserhahn
- Wasser aus dem Duschschlauch einer Patientendusche
- Wasser aus einer lange nicht benutzten Augendusche
1.Von jeder Wasserprobe werden jeweils 0,5ml Wasser mit einer Pipette auf 2 Agarplatten
getropft
und mit einem Wattetupfer ausgestrichen:
- Blutagar = Optimalnährboden (hämolysierende Mikroorganismen)
- MacConkey-Agar = Selektivnährboden für gramnegative, insbesondere coliforme Keime in
Wasser und Lebensmittel
2. von jeder Wasserprobe werden jeweils 1ml Wasser in eine 1, 5-fach konzentrierter Laktose-
Pepton - Bouillon zum Nachweis Laktose-Abbauender Bakterien überführt.
Platten und Reagenzgläser mit Platznummer und Ort der Entnahmestelle beschriften,
Inkubation: über Nacht bei 36°C
Auswertung und Protokollierung am nächsten Kurstag.
Protokoll Übung 15: Nachweis von coliformen Keimen und Pseudomonaden
Entnahmestellen
Nachweis: Wie:
Augendusche
(Labor)
Duschschlauch
(Patientenzimmer)
Trinkwasser
(Wasserhahn)
Keimzahl
Hämolyse:
auf Blutagar
Laktoseverwertung:
auf MacConkey-
Agar
Gas- und Säurebildung
bei 36°C:
in Laktose-Pepton-
Bouillon
Gas:
Säure:
Gas:
Säure:
Gas:
Säure:
Oxidase-Reaktion Siehe Anleitung
Seite 10
Beurteilung:
38
Mikrobielle Besiedlung der Hände Theoretischer Hintergrund:
Die Übertragung von Mikroorganismen über die Hände der Mitarbeiter auf Patienten und die dar-
aus resultierenden infektiösen Komplikationen sind seit vielen Jahren bekannt (Semmelweis)
Auch heute werden die meisten nosokomialen Infektionen über die Hände übertragen, obwohl die
Maßnahmen zur Unterbrechung der Infektionskette bekannt sind. Ursache ist meist die niedrige
Compliance in der Händehygiene, seltener die Wirksamkeit der verwendeten Desinfektionsmittel.
Es mag aber auch an der (Re)Kontamination der Hände von unbelebten Flächen liegen.
Hände von Mitarbeitern im Gesundheitswesen tragen häufig Gram-positive, aber auch bisweilen
Gram-negative Bakterien als transiente Flora. In zahlreichen Ausbrüchen sind die Hände direkt
oder indirekt als Überträger von Bakterien auf die Patienten beschrieben. Bei Clostridium difficile
Erkrankungen sind bis zu 60% der Hände der Mitarbeiter mit diesem Erreger kontaminiert. Die
Übertragung von C. difficile auf bis zu 20% der Patienten über die Hände ist belegt. Die Über-
tragbarkeit verschiedener Viren über die Hände ist in verschiedenen Studien belegt. Hier stehen
vor allem die behüllten Viren (z.B. Hepatitis) im Vordergrund. Die Übertragung unbehüllter Viren
stellt nur in besonderen Bereichen ein Risiko dar.
Nosokomiale Infektionen lassen sich in endogene und exogene Infektionen unterscheiden. Exo-
gene Infektionen gehen von anderen Patienten, Mitarbeitern oder der unbelebten Umgebung aus.
Hier spielen die Hände der Mitarbeiter eine maßgebliche Rolle bei der Übertragung von der Quel-
le zum Patienten. Endogene Infektionen gehen von der patienteneigenen Flora aus. So ist die
Besiedlung eines Patienten mit Staphylococcus aureus im Nasen-Rachen-Bereich, bzw. der
Hand ein prädisponierender Faktor für eine postoperative Wundinfektion.
Um eine erfolgreiche Desinfektion der Hände zu gewährleisten wurden klare Vorgaben auf der
Basis von Studien entwickelt, die sowohl die Methode der „Hygienischen Händedesinfektion“ zur
Hospitalismus-Prophylaxe, als auch die „Chirurgische Händedesinfektion“ vor der OP regeln:
Ausschnitt aus den Hygieneplänen des Marburger Klinikums
Hygienische Händedesinfektion
Die Hände des Personals sind das wichtigste Übertragungsvehikel von Krankheitserregern. Des-
halb gehört die Händehygiene zu den wichtigsten Maßnahmen zur Verhütung von Krankenhaus-
infektionen.
Bei tatsächlicher wie auch fraglicher mikrobielle Kontamination der Hände muss eine hygienische
Händedesinfektion durchgeführt werden (Kategorie I A).
Bei mutmaßlicher oder wahrscheinlicher Viruskontamination muss ein gegen die entsprechenden
Viren wirksames Präparat, sofern dafür valide Prüfergebnisse vorliegen, verwendet werden (z.B.
Isoliereinheit, Kinderstation, Verdacht oder gesicherte übertragbare Virusinfektion; Kategorie I
B).
Die hygienische Händedesinfektion ist so durchzuführen, dass die Kontaminationsflora noch auf
den Händen weitgehend abgetötet wird (Kategorie I A)
Durchführung:
Desinfektionsmittel in die hohlen, trockenen Hände geben. Nach dem unten aufgeführten Verfah-
ren das Produkt 30 Sek. in die Hände bis zu den Handgelenken kräftig einreiben. Die Bewegun-
gen jedes Schrittes fünfmal durchführen. Nach Beendigung des 6. Schrittes werden einzelne
Schritte bis zur angegebenen Einreibedauer wiederholt. Im Bedarfsfall erneut Hände-
Desinfektionsmittel entnehmen. Darauf achten, dass die Hände die gesamte Einreibezeit feucht
bleiben.
1. Handfläche auf Handfläche
2. Rechte Handfläche über linkem Handrücken und linke Handfläche über rechten Handrücken.
3. Handfläche auf Handfläche mit verschränkten, gespreizten Fingern.
4. Außenseite der Finger auf gegenüberliegende Handflächen mit verschränkten Fingern.
5. Kreisendes Reiben des rechten Daumens in der geschlossenen li. Handfläche und umgekehrt.
6. Kreisendes Reiben hin und her mit geschlossenen Fingerkuppen der rechten Hand in der lin-
ken Handfläche und umgekehrt.
39
Wann ist eine hygienische Händedesinfektion vorgeschrieben?
vor invasiven Maßnahmen, auch wenn dabei Handschuhe getragen werden, z.B. Legen
eines Venen- oder Blasenkatheters, vor Endoskopie, Injektionen, Punktionen
vor Kontakt mit Patienten, die im besonderen Maße infektionsgefährdet sind, z.B.
Leukämie-, Verbrennungs-, polytraumatisierte, bestrahlte oder sonstige schwer
erkrankte Patienten
vor Tätigkeiten mit Kontaminationsgefahr, z.B. Bereitstellung von Infusionen, Aufziehen
von Medikamenten
vor und nach jeglichem Kontakt mit Wunden
vor und nach Kontakt mit dem Bereich der Einstichstellen von Kathetern,
Drainagen u. ä.
nach Kontakt mit potentiell oder definitiv infektiösem Material (Blut, Sekret oder
Exkremente) oder infizierte Körperregionen
nach Kontakt mit potentiell kontaminierten Gegenständen, Flüssigkeiten oder Flächen
(Urinsammelgefäße, Absaug-, Beatmungsgeräte u. -masken, Trachealtuben,
Drainagen, Schmutzwäsche, Abfälle u. ä.)
nach Kontakt mit Patienten, von denen Infektionen ausgehen können oder die mit Erre-
gern von besonderer krankenhaushygienischer Bedeutung besiedelt sind (z.B. MRSA)
nach Ablegen von Schutzhandschuhen
nach Toilettenbenutzung
nach Naseputzen
Aufgabe Übung 16:
Abklatschuntersuchung der Hände
Wir überprüfen die mikrobielle Kontamination der desinfizierten und nicht desinfizierten Hand.
Hierzu werden Kontaktproben sowohl von der desinfizierten als auch von der nicht
desinfizierten Hand genommen.
1. Jede/r Kursteilnehmer/in überprüft seine nicht desinfizierte Hand durch Aufdrücken und
leichtes Schieben des Kontakt-Nährbodens auf Handinnenfläche auf Keime.
2. Jede/r Kursteilnehmer/in überprüft seine desinfizierte Hand auf Keime durch Aufdrücken
und leichtes Schieben des Kontakt-Nährbodens auf Handinnenfläche.
3. Die Kontaktproben beschriften, sie werden eingesammelt und bei 36°C über Nacht bebrütet.
Auswertung am nächsten Kurstag!
Protokoll: Abklatschuntersuchung der Hände
Beurteilung: Keimzahl
desinfizierte Hand
Keimzahl
nicht desinfizierte Hand
40
Aufgabe Übung 17:
Übertragbarkeit von Mikroorganismen
Um die Übertragbarkeit von Erregern und damit das daraus resultierende Infektionsrisiko,
gerade bei nosokomialen Infektionen, abschätzen zu können, werden die Hände mit einem
Fluoreszenzfarbstoff als Simulation einer bakteriellen, bzw. viralen Kontamination markiert.
Tischreihe 1-10:
- Die erste Person der Tischreihe reibt sich die Hände mit dem Fluoreszenzfarbstoff ein.
- Schütteln Sie den anderen Kursteilnehmern in der Tischreihe die Hand.
- Im Anschluss können Sie unter der bereit gestellten UV-Lampe feststellen, ob eine
Kontaktübertragung stattgefunden hat.
- Abwaschen der Farbstoffreste mit Wasser und Seife.
- Eincremen der Hände
Im Falle einer Übertragung, z. B. von MRSA, bleibt ohne anschließende Händedesinfektion
ein unerkannt bleibender Vektor für die Verbreitung von MRSA im Krankenhaus bestehen.
41
Abschnitt III: Mykologie
Kursteil 8
Mykologie:
Sprosspilze
Schimmelpilze Einführung:
Pilze sind heterotrophe, eine Zellwand ausbildende Eukaryonten, die auf oder in organischem
Material einen Thallus ausbilden können und sich asexuell oder sexuell fortpflanzen. Sie kommen
in Form von Einzelzellen (z.B. Bäckerhefe) und Zellverbänden (z.B. Hutpilze) vor. Sie besitzen
kein Chlorophyll und sind somit nicht zur Photosynthese befähigt. Sie benötigen daher organi-
sche Kohlenstoff-Quellen (C-heterotroph) und können auch unter Lichtabschluss leben. Pilze sind
als Einzeller aufzufassen. Bei manchen Pilzarten können sich einzelne Zellen aber unterschied-
lich spezialisieren. Die einfachste, einzellige Form ist der Sprosspilz, heute als Hefe bezeichnet.
Um die lediglich durch Sprossung sich fortpflanzenden Hefen von den echten (perfekten) Hefen,
die zur Sexualsporenbildung befähigt sind (z.B. Ascomyceten) abzugrenzen, werden die Spross-
pilze auch als nicht sporenbildende Hefen bezeichnet.
Komplexere Strukturen kommen ebenfalls vor. Eine Pilzzelle kann sich verlängern, ohne sich zu
teilen. Es resultiert eine fadenförmige Hyphe. Verschachteln sich mehrere Hyphen, entsteht ein
Myzel. Bei einem Myzel dessen Hyphen alle von einer einzigen Zelle abstammen, handelt es sich
um einen Thallus. Ist ein derartiges Hyphengeflecht lose strukturiert, liegt eine Kolonie vor.
Bei einem Drittel der bislang bekannten Pilzarten ist der Entwicklungsgang der Hauptformen mit
sexueller Reproduktion, meist unter Sporenbildung nicht bekannt. Diese Pilze werden als Fungi
imperfecti (Deuteromycetes) zusammengefasst. Bei diesen Pilzen ist, da sich Haupt- und Neben-
fruchtformen an ganz unterschiedlichen Standorten entwickeln und zudem morphologisch sehr
unterschiedlich ausfallen, entweder die Zuordnung beider Formen nicht gelungen, oder die Pilze
haben die Möglichkeit zur Ausbildung einer sexuellen Fruktifikation verloren.
Die Gesamtzahl der Pilzarten wird auf 100.000 bis 250.000 geschätzt, lediglich ca. 180 Arten
stehen mit Erkrankungen von Mensch und Tier in Zusammenhang. Hier findet man häufig imper-
fekte Pilzarten, sowohl in der Hefeform als auch in Form von Schimmelpilzen. Bei den letzteren
spielen in der medizinischen Mykologie die charakteristischen Nebenfruchtformen, die asexuell
gebildeten Sporen (Konidien) und deren besondere Fruchtkörper, für die Identifizierung eine
wichtige Rolle.
Neben Pilzinfektionen sind Mykoallergien, Mykotoxikosen durch sekundäre Stoffwechselprodukte
und Myzetismus, die Pilzvergiftung durch Aufnahme von Strukturelementen von Pilzen, meist
Basidiomyzeten (Hut- und Ständerpilze), in der Humanmedizin von Bedeutung.
Im Kursabschnitt Mykologie werden an Hefen und Schimmelpilzen die wichtigsten klassischen
Untersuchungsmethoden aus der Routinediagnostik vorgestellt. Andere Verfahren wie Serologie,
Immunfluoreszenz, PCR etc. können nicht behandelt werden.
Begriffe:
Hyphe:
Pilzfaden, Myzel – Hyphengeflecht
Pseudomyzel:Ketten von Hefezellen, die hyphenartig verlängert sind
Vegetative Sporen:
Konidien = frei an Hyphen gebildete vegetative Ektosporen (Mikrokonidien sind einzellig, Mak-
rokonidien sind mehrzellig, gewöhnlich septiert)
Blastospore = Sprosszelle, Hefe im engeren Sinn, keine echte Spore im Sinne von Dauerfor-
men!
Chlamydospore = Hyphenabschnitte mit verdickter Zellwand
Arthrospore = Quader- oder walzenförmiges Hyphenfragment
Sexuelle Sporen:Ascosporen, Zygosporen, Basidiosporen = sexuelle Sporen, die in speziel-
len Sporenbehältern reifen.
42
In der medizinischen Mikrobiologie werden die Pilze ohne Rücksicht auf Klassenzugehörigkeit
nach praktischen und klinischen Gesichtspunkten in folgende Gruppen, dem DHSD-System, ein-
geteilt:
Dermatophyten
Hefen
Schimmelpilze
Dimorphe Pilze ( =DHSD-System) Von den Vertretern der anderen Gruppen unterscheiden sich die Dermatophyten, die Erreger
der Dermatophytosen dadurch, dass sie nur oberflächliche Mykosen verursachen. Sie befinden
sich auf der Haut und deren Anhangsgebilden und breiten sich gewöhnlich nicht über das Stra-
tum basale hinweg in die Tiefe aus.
Hefen lassen sich schon makroskopisch von den luftmyzelbildenden Schimmelpilzen unterschei-
den. Sie wachsen auf Nährmedien meist in weißlichen, glatten Kolonien, ähnlich Bakter ienkolo-
nien.
Für die Gruppe der dimorphen Pilze ist charakteristisch, dass sie im Organismus in der Hefe-
phase, aber in der freien Natur luftmyzelbildend (wie Schimmelpilze) vorkommen.
Orte, an denen Pilze Infektionen verursachen:
Lunge Cryptococcus, Pneumocystis jirovecii, Aspergillus,
Candida, Mucorales, (Blastomyces, Coccidioides,
Paracoccidioides, Histoplasma)*
Blut Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Histoplasma)*
Schleimhäute Candida, Cryptococcus, Fusarien, (Blastomyces)*
Liquor Cryptococcus
Harnwege Cryptococcus, Candida,
(Blastomyces, Coccidioides, Histoplasma)*
Nasennebenhöhlen Aspergillus, Mucorales, Fusarien (Sporothrix)*
Subkutanes Gewebe (Mycetoma-Erreger, Sporothrix, Chromoblastomyko-
se-Erreger)*
Haut Dermatophyten, Fusarien,
(Sporothrix, Chromoblastomykose-Erreger,
Coccidioides, Paracoccidioides, Blastomyces)*
Haare, Nägel Dermatophyten, Trichosporon*, Scopulariopsis
Verschiedene (Disseminierte Infektionen) Candida, Cryptococcus, Aspergillus
(Coccidioides, Paracoccidioides)*
*in Mitteleuropa nicht endemisch
43
Sprosspilze 1. Candida albicans:
Mit mehr als 150 Arten sind die Arten der Gattung Candida in der Umwelt weit verbreitet, 17 Arten
wurden bislang als Infektionserreger beschrieben. Die am häufigsten mit Hefemykosen assoziier-
te Art Candida albicans hat ihren natürlichen Standort am Menschen bzw. Warmblüter, aber nicht
in der Natur. Andere Arten wie Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida
parapsilosis lassen sich auch aus der Umwelt isolieren und spielen somit bisweilen auch eine
Rolle als Erreger von exogen übertragenen Hospitalinfektionen.
Etwa 30% der Gesunden sind oral oder gastrointestinal mit Candida besiedelt, wobei die Keim-
zahl meist gering ist. Bei hospitalisierten Patienten steigt die Kolonisierungsrate proportional zur
Aufenthaltsdauer im Krankenhaus an. Candida zählt zu den sog. opportunistischen Erregern.
Eine Infektion entwickelt sich erst dann, wenn lokale oder systemische Faktoren dafür disponie-
ren. So spielt die chronische Mazeration der Haut bei der Windeldermatitis des Säuglings oder
der Intertrigo bei Fettleibigen eine Rolle. Ist die zelluläre Immunabwehr kompromittiert, kann es
zur Ausbildung einer systemischen Organmykose mit anschließendem Multiorganversagen oder
einer Pilzsepsis kommen. Beispielhafte Risikofaktoren für invasive Mykosen sind: extreme Alters-
gruppen (Neugeborene, sehr alte Menschen), chronisches Nierenversagen, Diabetes, Neutrope-
nie, lymphoide Malignome, AIDS, Transplantation, Kortikosteroidtherapie, Polytraumata, Ver-
brennungen.
Diagnostik:
Die Anfertigung eines Nativ-, Methylenblau-, oder Grampräparates direkt vom Untersuchungsma-
terial ist eine sehr schnelle und hilfreiche orientierende Methode, die vor allem bei Haut- oder
Schleimhautinfektionen eine unmittelbare Erregerdiagnose ermöglicht. Mit der mikroskopischen
Untersuchung von Punktaten kann man sofort wichtige morphologische und quantitative Informa-
tionen über die Pilz-Ätiologie einer Infektion erhalten und somit unverzüglich mit einer unter Um-
ständen lebensrettenden antimykotischen Therapie beginnen.
Der Nachweis einer systemischen Candida-Infektion dagegen ist schwer. Ein Nachweis von Pilze
mittels Blutkulturflaschen ist nicht immer möglich. Der serologische Nachweis von Antikörpern
gegen Candida ist mit Hämagglutinationstests, Immunfluoreszenz und ELISA-Techniken möglich,
kann aber oft kaum zwischen einer Besiedlung und Infektion unterscheiden. Bei einer systemi-
schen Infektion ist zwar mit einem Titeranstieg beim immunkompetenten Patienten zu rechnen,
jedoch sind in der Regel die Betroffenen meist immunsupprimiert.
Die klassische Diagnostik setzt immer noch die Kultur voraus, wobei heute durch den
sog. CHROM-Agar eine Kultivierung mit gleichzeitiger Differenzierung durch verschiedene
Farben der Kolonien realisiert wurde.
44
Schimmelpilze Schimmelpilze sind in vielen Gattungen in der Natur verbreitet. Meist leben sie als Saprophyten
auf abgestorbener organischer Substanz (Topfpflanzen und Essensreste in Kliniken!). Da ihre
Bestandteile (Hyphenfragmente, Konidien) auch ständig in der Luft anzutreffen sind, werden sie
somit ständig inhaliert. Unter bestimmten Umständen können einige Arten humanmedizinische
Relevanz erlangen als:
Erreger opportunistischer Infektionen
Mykotoxinbildner
Allergene
Mit Zunahme der abwehrgeschwächten Patienten ist insbesondere die Häufigkeit von Aspergillus-
Infektionen kontinuierlich angestiegen. Neben dem häufigsten Erreger aus dieser Gattung, As-
pergillus fumigatus, werden auch andere Arten, wie Aspergillus niger nachgewiesen. Diese In-
fektionen sind immer lebensbedrohlich, da sie fast ausschließlich bei Patienten mit schweren
Grunderkrankungen auftreten. Betroffen sind Patienten mit hämatologischen Neoplasien, mit
Knochenmark- oder anderen Organtransplantationen. Gelegentlich finden sich auch beim immun-
kompetenten Patienten Aspergillus-Infektionen, die aber meist lokalisiert sind und in der Regel
vorgeschädigtes Gewebe betreffen.
Diagnostik:
Für den Therapieerfolg ist eine frühzeitige Diagnosestellung essentiell. Der mikroskopische
Nachweis von verzweigten Pilzfäden, z.B. im Sputum von Risikopatienten, ist diagnostisch hinwei-
send. Der negative mikroskopische Befund schließt eine Aspergillose nicht aus. Der kulturelle
Nachweis ist zuverlässiger, kann aber einige Tage in Anspruch nehmen. Generell ist für den mik-
roskopischen oder kulturellen Nachweis Material aus Biopsie- oder Punktionsmaterial aus
sterilen Körperregionen anzustreben. Bei der Interpretation der Befunde von Sputumproben von
nicht abwehrgeschwächten oder bei fehlender klinischer Symptomatik kann die Abgrenzung
einer Kolonisation von einer invasiven Infektion problematisch sein. Aus Blut, Liquor und Kno-
chenmark lassen sich Aspergillen nur selten isolieren. Der Nachweis von Aspergillus aus der
bronchoalveolären Lavage (BAL) ist zwar spezifisch, hat jedoch nur eine geringe Sensitivität.
Serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern finden Anwendung bei der allergischen pul-
monalen Aspergillose und beim Aspergillom. Ihre Wertigkeit in der Diagnostik der invasiven As-
pergillose ist unsicher. Aufgrund der fehlenden Immunantwort bei den meist erheblich abwehrge-
schwächten Patienten fallen die Tests in der Regel negativ aus und erweisen sich daher als wenig
brauchbar. Durch Nachweis zirkulierender Antigene konnte eine wesentliche Verbesserung der
Frühdiagnostik erreicht werden, obwohl die Sensitivität der momentan zur Verfügung stehenden
Tests häufig nicht ausreichend ist.
Grundsätzlich basiert die Diagnostik der Schimmelpilze heute in der Medizinischen Mykologie
und auch der Hygiene auf kulturellen und mikroskopischen Methoden. Wesentliche Merkmale
sind neben der Koloniemorphologie insbesondere die charakteristischen Nebenfruchtformen der
verschiedenen Spezies.
Die charakteristischen Nebenfruchtformen von Schimmelpilzen der Gattungen Absidia, Aspergil-
lus, Fusarium, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis werden vorgestellt. Zusätzlich zu den
vorgelegten mikroskopischen Fertigpräparaten werden die zugehörigen Pilzkulturen als Demonst-
ration aufgestellt.
Herstellung mikroskopischer Präparate von luftmyzelbildenden Pilzen:
Die Nebenfruchtformen luftmyzelbildender Pilze sind berührungsempfindlich und daher gelingt die
Darstellung intakter Nebenfruchtformen im mikroskopischen Präparat häufig erst nach mehrfa-
chem Versuch!
Eine einfache Technik zur Herstellung von Präparaten ist das Tesafilmpräparat
Tesafilmpräparat:
Durchführung:
- 1 Tropfen Lactophenolblau auf einen Objektträger geben
- einen ca. 6 cm langer Klebestreifen (an beiden Enden anfassen) auf den Pilzrasen der
unbekannten Pilzkultur leicht andrücken
- Klebestreifen auf den Objektträger mit dem Tropfen Lactophenolblau kleben
45
Aufgabe Übung 19:
Auseinandersetzung mit Schimmelpilzen
1. Makroskopische Betrachtung, Beschreibung und Skizzierung einer unbekannten
Schimmelpilzkultur
2. Herstellen eines Tesafilm-Präparates von einer unbekannten Schimmelpilzkultur,-
mikroskopieren und skizzieren,
3. Bestimmung der Gattung durch Vergleich mit den ausgestellten Schimmelpilzkulturen
und der mikroskopischen Bilder im Skript
Mikroskopie: 10er – 40er Objektiv, ohne Öl !
Protokoll: Unbekannte Schimmelpilzkultur
Beschreibung der Kultur: Skizze von der Kultur: Skizze des Tesafilmpräparates:
Höhe des Mycels:
Kontur:
Pigment:
Oberfläche:
Sonstiges:
Identifizierung:
Bei der unbekannten Schimmelpilzkultur handelt es sich um: ………………………………………
Skizzen einiger Schimmelpilze:
Rhizopus Alternaria Aspergillus fumigatus
Penicillium Cladosporium Scopulariopsis
46
Bilder einiger Schimmelpilze:
Aspergillus niger (Elektronenmikroskopie) Kultur von Aspergillus niger
Abbildung 1: Alternaria sp. Abbildung 2: Aspergillus sp.
Abbildung 3: Cladosporium sp. Abbildung 4: Fusarium sp.
47
Abbildung 5: Geotrichum candidum Abbildung 6: Mucor sp.
Abbildung 7: Penicillium sp. Abbildung 8: Scopular iopsis sp.
Abbildung 9: Rhizopus sp.
48
Abschnitt IV: Parasitologie
Kursteil 9
Übersicht über die wichtigsten humanpathogenen Parasiten
A. Protozoen: B. Vermes:
1. Apicomplexa: 1. Plathelminthes (Plattwürmer)
Toxoplasma gondii a) Trematoda (Saugwürmer)
Plasmodium sp. Fasciolopsis
Isospora Faciola hepatica
Pneumocystis carinii Opistorchis
Schistosoma mansoni
2. Mastigophora: b) Cestoda: (Bandwürmer)
Trichomonas vaginalis Taenia solium, saginata
Giardia lamblia Echinococcus multilocularis
Trypanosoma cruzi Diphyllobothrium latum
T. gambiense Hymenolepsis nana
Leishmania donovani
3. Rhizopoda: 2. Nemathelminthes (Fadenwürmer)
Entamöba histolytica Nematoda:
Trichuris trichiura
Ascaris lumbricoides
4. Ciliaten: Wuchereria bancrofti
Balantidium coli Trichinella spiralis
C. ARTHROPODEN
Krätzmilbe (Sarcoptes scabiei)
Insekten als Überträger und Zwischenwirte.
Aufgabe Übung 20:
Mikroskopie von parasitologischen Fertigpräparaten
1. Malaria
Die Diagnose einer akuten Malaria beruht auf dem mikroskopischen Nachweis der Plasmodien
(vivax, malariae, falciparum) und Gameten im Blut (Ausstrich und Dicker Tropen), am besten kurz
vor dem Schüttelfrost, gestellt. Die Entwicklungsformen liegen in Erythrozyten. Der Nachweis
erfolgt meist nach Giemsa-Färbung (Plasma blau, Chromatin rot) der Präparate.
Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Malariapräparate vom Menschen, fertigen Sie Zeich-
nungen verschiedener Parasitenformen an und stellen Sie eine Verdachtsdiagnose.
Die Präparate bitte auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben!
49
2. Trypanosoma brucei
Anstelle des Erregers der Schlafkrankheit Trypanosoma gambiense bzw. rhodesiense (15 -
30m) verteilen wir Tr. brucei, den für den Menschen ungefährlichen Erreger der Nagana (Tier-
seuche), der in Form und Bewegungsmodus dem Erreger der menschlichen Schlafkrankheit
gleicht und ebenfalls durch den Stich der Glossinen übertragen wird.
Mikroskopieren Sie die bereits gefärbten Präparate von Trypanosoma brucei und fertigen Sie
Zeichnungen an.
Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung geben!
Vermes:
Wichtig: Wurmeier-Präparate mit den Trockensystemen (10er und 40er Objektiv) und ohne Öl
mikroskopieren, Blende schließen.
Fertigen Sie Zeichnungen von Ascaris-, Trichuris- und Taenia-Eiern (Spul-, Peitschen- und
Bandwurm) an.
Präparate auf dem Tisch liegen lassen, nicht in die Desinfektionslösung!
Ascaris (Nematoda) Trichuris (Nematoda)
Taenia (Cestoda)
50
Anhang:
Zusammensetzung von Kulturmedien, Reagenzien und Farblösungen
Kulturmedien: 1. Flüssiges Thioglykolatmedium:
Universelles Anzüchtungsmedium für aerobe und anaerobe Bakterien
Tryptisch verdautes Casein 15,0(g/l)
1-Cystin 0,5
Dextrose 5,0
Hefeextrakt 5,0
NaCl 2,5
Natrium-Thioglycolat 0,5
Resazurin (Redoxindikator) 0,001
Agar 0,75
End-pH 7,1
in 8 ml-Mengen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120 oC sterilisieren, bei Zimmer-
temperatur lagern (Haltbarkeit etwa 6 Wochen, danach muss durch Erhitzen auf 100oC
erneut entgast werden).
2. Trypticase Soy Agar (Peptonagar für Anzüchtung und Stammhaltung):
Trypticase (Casein-Digest) 15,0(g/l)
Phytone (Soya-Pepton) 5,0
NaCl 5,0
Agar 15,0
In 200 ml-Portionen 20 min bei 120oC sterilisieren, auf 50oC abkühlen,
in Petrischalen gießen.
3. Blutagar:
Universelles Anzüchtungsmedium und Medium zum Nachweis von Veränderungen des
Erythrozytenstroma bzw. des Hämoglobins durch den bakteriellen Stoffwechsel.
Herstellung: durch Zusatz von 6 Vol% sterilen, defibrinierten Hammelbluts zu
dem sterilisierten und auf 50oC abgekühlten Peptonagar.
4. Kochblutagar:
Hochwertiges Anzüchtungsmedium, insbesondere für Neisseria und Haemophilus.
Herstellung: durch Zusatz von 5-10% sterilen defibrinierten Hammelbluts zu
dem sterilisierten und auf 80oC abgekühlten Peptonagar, Inkubation des
Gemisches für 15 min bei 80oC, Abkühlung auf 50oC und gießen.
5. Endo-Agar (Fuchsin-Laktoseagar):
Selektivmedium für gramnegative Bakterien und Indikatormedium für Laktosefermentation
Herstellung:
Pepton "Witte" 10,0(g/l)
Na2HPO4 2,0
NaCl 6,0
Hefeextrakt 1,0
Fleischextrakt 3,0
Agar 20,0
NaOH q.s. pH 7,4-7,6
Für 15 min bei 120oC sterilisieren, auf 100oC abkühlen.
Hitzeempfindliche Komponenten zusetzen:
Lactose 10,0(g/l)
gesättigte alkoholische Fuchsin Lösung (filtriert)
5 ml Natriumsulfitlösung, 10%ig, so viel, dass der in heißem Zustand rosa gefärbte Nähr-
boden nach dem Erkalten farblos wird (Probeplatte gießen!).
Da die grampositiven Kontaminanten aus der Luft durch Fuchsin gehemmt werden, erfordert
die Herstellung des Endoagars nicht die strengsten Sterilitätskautelen.
51
6. Polytropes Medium nach KLIGLER:
Indikatormedium für Glukose- und Laktose Fermentation einschl. Gasbildung,
H2S-Bildung sowie oxydativen Aminosäureabbau
Herstellung:
Pepton 15,0(g/l)
Fleischextrakt 3,0
Hefeextrakt 3,0
Proteose-Pepton 5,0
Lactose 10,0
Dextrose 1,0
FeSO4 0,2
NaCl 5,0
Na-Thiosulfat 0,3
Agar 12,0
Phenolrot, atoxische Charge 0,024
pH = 7,0
In 5 ml-Portionen in Kulturröhrchen abfüllen, 15 min bei 120oC sterilisieren, in Schräglage
erstarren lassen (Schrägfläche und Stichteil sollen etwa gleich groß sein)
7. Medium zum Nachweis der Säurebildung aus Kohlenhydraten,
Zuckeralkoholen und Glykosiden:
Herstellung:
Peptonwasser-Basis:
Liebigs Fleischextrakt 5,0 (g/l)
Pepton "Witte" 10,0
NaCl 3,0
Na2HPO4 x 12 H2O 2,0
Indikator-Stammlösung:
Bromthymolblau 1,0g
0,1 N NaOH 25,0ml
A. dest. Ad 500,0ml
12 ml der Bromthymolblau-Stammlösung/Liter Peptonwasserbasis zusetzen, 100 ml Portionen
abfüllen und mit 0,5 Gew. % der Substrate versetzen. Die zu 5 ml Portionen in entsprechend
gekennzeichnete Kulturröhrchen abgefüllten Medien werden fraktioniert sterilisiert, indem man
sie an drei aufeinander folgenden Tagen für jeweils 15 min im Koch‘schen Dampftopf auf
90-100°C erhitzt. Alternativ: Sterilisation durch Filtration.
8. Medium zum Nachweis der Nitratreduktion:
Herstellung:
KNO3(nitritfrei!) 0,2(g/l)
Pepton "Witte" 5,0
pH 7,4
DURHAM-Röhrchen zum Nachweis von Gas sind vor der Sterilisation blasenfrei
einzulegen
5 ml Portionen in Kulturröhrchen abfüllen und 15 min auf 120°C erhitzen
9. Trypsin Bouillon, Medium zum Nachweis der Indolbildung:
Herstellung:
Pepton "Witte" 10,0 (g/l)
Liebigs Fleischextrakt 5,0
Na2HPO4 2,0
NaCl 5,0
NaOH, qs., pH 7,2
Trypsin 0,2
Chloroform 10,0 ml
Gut durchschütteln, 24 Std. bei 37°C bebrüten, filtrieren, mit 2 Volumina physiologischer
Kochsalzlösung verdünnen, in Röhrchen abfüllen, im Koch'schen Dampftopf sterilisieren
52
10. Medium zum Nachweis von Urease:
Herstellung:
Pepton "Witte" 1,0 (g/l)
NaCl 5,0
KH2PO4 2,0
Phenolrot, 1:500 6,0 ml/l
pH: 6,8-6,9
Für 15 min bei 120oC sterilisieren
Glucose 1,0
Harnstoff 20,0
Durch Filtration sterilisieren und dem auf 60°C abgekühltem Medium zusetzen
Steril in 5 ml Portionen abfüllen und bei 4oC lagern
11. Definiertes Medium zum Nachweis der Utilisation einer einzigen organischen
Energie- und Kohlenstoffquelle
Herstellung:
Mineralbasis
NaCl 5,0(g/l)
MgSO4 x 7 H2O 0,2
(NH4)H2PO4
K2HPO4 1,0
pH 6,9
15min bei 120oC sterilisieren
Substrate (z.B. Monosaccaride, Natriumsalze, organischer Säuren) steril filtriert
zu einer Endkonzentration von 0,5Gew. % zusetzen. Steril in 0,5 ml Portionen abfüllen
Als pH-Indikator kann Bromphenolblau (12 ml/l der oben unter Nr. 7angegebenen
Stammlösung) vor der Hitzesterilisation zugesetzt werden.
Farblösungen 1. Alkalische Methylenblaulösung nach LÖFFLER:
Gesättigte alkohol. Lösung von Methylenblau 30 ml
KOH 0,01 % in Wasser 100 ml
2. Reagenzien für die Gram-Färbung:
a) Karbol-Gentianaviolettlösung:
Gesättigte alkohol. Lösung von Gentianaviolett 10 ml
Phenol 2,5 Gew. % in Wasser (frisch bereitet) 90 ml
Vor Gebrauch filtrieren!
b) Verdünnte LUGOLsche Lösung:
Jod 1 g
Kaliumjodid 2 g
im Mörser mit wenig Wasser lösen, mit Wasser auf 300 ml auffüllen
c) Safraninlösung:
5 Gew.% Safranin in 96% Äthanol 10 ml
H2O 90 ml
3. Reagenzien für die ZIEHL-NEELSEN-Färbung:
a) Karbol-Fuchsin Lösung:
gesättigte alkohol. Fuchsin Lösung 10,0 ml
Phenol 5,0 Gew. % in Wasser 90,0 ml
b) Salzsäure-Alkohol:
HCl 25% 3,0ml
Ethylalkohol 100,0ml
53
6. Reagenzien für die Polkörperchenfärbung nach Neisser:
a) Lösung A:
Methylenblau 1,0g
Äthanol 96% 20,0ml
Lösen
Eisessig 50,0ml
H2O 1000,0ml
b) Lösung B:
Kristallviolett 1,0g
Äthanol 10,0ml
Lösen
H2O 200,0ml
Gebrauchslösung:
2 Teile Lösung A + 1 Teil Lösung B = Neisser I
(Die Gebrauchslösung ist nur wenige Tage haltbar)
c) Lösung C: (für die Gegenfärbung):
Chrysoidin 1,0 g
Lösen in: 300,0 ml heißem Wasser = Neisser II
Reagenzien 1. TMPD-Oxydase Reagenz:
N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylen-diamin-dihydrochlorid,
1 Gew. %, wässrig, mit Ascorbinsäure partiell reduziert,
wöchentlich frisch hergestellt.
2. Indolreagenz (Mod. KOVACS-HOFFMANN):
p-Dimethyl-aminobenzaldehyd 5,0g
n-Butanol 75,0ml
HCl spez. Gew. 1,19 25,0ml
3. Nitritreagenz (GRIESS-ILOSVAY):
Lösung A: Sulfanilsäure 0,8 Gew.% in 5 N Essigsäure
Lösung B: alpha-Naphthylamin, 0,5 Gew.% in 5 N Essigsäure
Gebrauchslösung: Lösung A und B unmittelbar vor Gebrauch zu gleichen Teilen mischen.