Einteilung
1.) Restriktion- Restriktionsenzyme
- Southern Blotting
2.)Gentechnik- sticky ends
- blunt ends
Restriktion
Grundwerkzeuge der Gentechnik- Restriktionsenzymanalyse
- Blottingtechniken
- DNA-Sequenzierung
- Polymerasenkettenreaktion (PCR)
Restriktionsenzyme
- Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen
- präzise molekulare „Skalpelle“
sie schneiden die DNA-Doppelhelix an spezifischen Stellen
Nutzen von Restriktionsenzymen
- Chromosomenstruckturanalyse
- Sequenzierung von DNA-Molekülen
- Isolierung von Genen
- Erzeugung neuer DNA-Moleküle
(anschließende Klonierung)
Wo findet man Restriktionsenzyme?
- Sie sind in vielen Prokaryonten vorhanden
- Ihre Aufgabe ist das spalten fremder DNA
(eigene DNA ist durch Methylierung der Erkennungsstellen geschützt)
Funktionsweise von Restriktionsenzymen
- Erkennen spezifischer Sequenzen aus 4 bis 8 bp
- Spaltung der Phosphodiesterbindung bei jedem Strang
- Sequenzen sind häufig Palindrome
(Madam, I‘m Adam)
Trennung von Restriktionsfragmenten
Trennung durch Gelelektrophorese
- Laufstrecke ist umgkehrt proportional zum log der Basenpaare
- Trennung ähnlicher DNA-Moleküle
- Polyacrylamidgele (bis 1000bp), Agarosegele
Fingerprint eines DNA-Moleküls
Durch die Nutzung mehrerer Restriktionsenzyme können ganze Chromosomen in kleine Fragmente gespalten werden und anschließend kartiert werden
Sichtbar machen von Banden
- Autoradiographie bei radioaktiv markierter DNA
- Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid
(DNA fluoresziert orange)
Southern Blotting
- DNA Blotting
- Methode, um ein bestimmtes Fragment unter vielen aufzuspüren
- analoges Verfahren mit RNA-Molekülen nennt sich Northern Blotting
Southern Blotting 2
- Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese trennen
- denaturieren der DNA zu Einzelsträngen
- überführen auf Nitrocellulosemembran
- mittels 32P-markierter Sonde komplementäre Sequenzen hybridisieren
- gesuchtes Fragment ist autoradiographisch sichtbar
RFLP-Analyse
Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus
- Vererbung ausgewählter Genen kann verfolgt werden
- Mutationen an Restriktionsstellen verändern die Länge der Restriktionsfragmente
-Nachweis von Erbkrankheiten (Sichelzellanämie, cystische Fibrose)
Gentechnik
- Herstellung neuer Kombinationen nicht verwandter Gene im Labor
- dauerhafte Veränderung der genetischen Ausstattung eines Wirtes
Klonieren
- Bedeutet: in hoher Anzahl vervielfältigen
-Einbringen von Genen in passende Zellen, wo sie vom DNA-Syntheseapparat des Wirtes repliziert werden
Neue DNA-Moleküle im Labor
- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden
- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden
- DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknüpfen
Vektoren
- Vektoren haben die Eigenschaft sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren.
- Besonders geeignet sind Plasmide und der Bakteriophage λ
Neue DNA-Moleküle im Labor
- Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden
- Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden
- DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA-Ligase verknüpfen
Kohäsive Enden (sticky ends)
- Durch versetzte Schnittstellen entstehen zueinander komplementäre Einzelstränge mit spezifischer Affinität zueinander
- Man erhält die gleichen kohäsiven Enden durch Verwendung gleicher Restriktionsenzyme bei Vektor und DNA-Fragment
Glatte Enden (blunt ends)
- Auf diese Weise lassen sich an nahezu jedes
DNA-Molekül kohäsive Enden anfügen
- Einen DNA-Linker (chemische synthetisiertes Verbindungsstück) kovalent mit den Enden des DNA-Fragmentes verknüpfen
- kohäsive Enden durch Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme