Standardisierung der dfinnschichtchromatographischen Trennungen von Flechtensiiuren zur Chemotaxonomie von Flechten

A. Jangen/W. Scharf

Fachbereich Chemie-lngenieurwesen der Fachhochschule MiJnster, Abt. Steinfurt, D-4400 MiJnster, Bundesrepublik Deutschland

Key Words

Thin-layer chromatography Chemotaxonomy Vario-KS tank Lichen acid

Summary

Standardisation of the Thin-Layer Chromatographic Separation of Lichen Acids for the Chemotaxonomy of Lichens

The thin-layer chromatography of lichen extracts for taxonomic studies has been optimized in relation to se- paration and to reproducibility. Especially good separa- tions were found with benzene : dioxane: acetic acid (90:25:4) developer and silica gel thin-layer plates, whose activity was fixed by an ambient moisture con- tent of 70 %, and with methylene chloride developer and silica gel plates impregnated with oxalic acid and antiparallel activity gradient. High reproducibility of separation was obtained using the Geiss Vario-KS tank, which allows the activity of the plates or the activity gradient to be adjusted and which also allows repro- ducible exposure of plates to the vapour of developing solvents. By different chromatographic separations of the same extracts and by using different colour reactions the accuracy of identification for taxonomic studies has been improved.

Zusam menfassung

Die dtinnschichtchromatographische Trennung von Flech- tenextrakten zur Unterstiitzung der Taxonomie wurde in Bezug auf die Trennleistung und auf die Reproduzierbar- keit optimiert, Dabei wurden besonders gute Trennlei- stungen erhalten mit dem Flie6mittelgemisch Benzol: Di- oxan: Eisessig = 90: 25 : 4 bei Verwendung yon Kieselgel, dessen Aktivit/it durch eine Umgebung mit relativer Feuchte yon 70 % festgelegt wurde, und mit Methylen- chlorid als Eluiermittel bei Verwendung yon mit Oxal- s~iure impr~igniertem Kieselgel und antiparaIlelem Aktivi- t~itsgradienten. Eine hohe Reproduzierbarkeit der Tren-

nungen wurde erreicht durch Verwendung der Vari0. KS-Kammer nach Geiss, die die Einstellung einer deft- nierten Schichtaktivit~it bzwl eines de finierte n Aktivit~its. gradienten und eine: reproduzierbare Vo~bedampfung der Schicht mi{ Flie6mittel erm6glichti Es konnte gezeigt werden~ daf~ dutch Unterschie dliche chromat0graphische Trennungen der gleiChen Extrakte und dutch die Ver- wendung verschiedener Anf;irbereagenzien die Identifi. zierung und damit?die Aussage~aft ~ r taxonomische

Flechten treten in einer grofen Zahl von Formen mit teil- weise sehr geringen morphologischen Unterschieden auf, so da6 ihre Artdiagnose Niufig Schwierigkeiten bereitet. Bedenkt man au6erdem, dag einzelne Arten sehr unter- schiedliche Stoffwechselprodukte in Abh~ngigkeit v0rn Standort enthalten [1], dann ist es nicht verwunderlich, warum es bei der Taxonomie einzelner Flechten imrner wieder zu Differenzen kommt.

Schon bald nach der Entwicklung der schichtchromate graphischen Analysenverfahren wurden dann auch Be- stimmungen der Inhaltsstoffe mit den morphologischen Untersuchungen kornbiniert und so durch die Chemotax0- nomie sicherere Ergebnisse erzielt. Die zuNichst eingesetz- ten papierchromatographischen Untersuchungen [2-4] wiesen jedoch einen relativ grogen Zeitaufwand auf, so dag erst mit der Entwicklung geeigneter Verfahren [5-8] die Chemotaxonomie eine gute Leistungsf~ihigkeit erreichte.

Besonders ausftihdich haben sich Culberson und Kristins. son [8] mit der diinnschichtchromatographischen Unter. suchung von Flechteninhaltsstoffen besch~iftigt und die re. lativen Rr-Werte s eine grofie Zahl yon sogenannten Flechtens~iuren s diinnschichtchromatographische Tren- nungen mittels Kieselgel F2s4-Platten und drei verschiede- hen Eluiermitteln bestimmt. Identifizierungen einzelner Flechtensauren nach der Methode von Culberson und Kristinsson [8] gelingen jedoch nur beim Vorhandensein yon zahlreichen Vergleichssubstanzen, da keine Angaben iiber die wirkliche Aktivit~it der Adsorptionsmittelschicht gemacht werden bzw. keine Angaben dariiber, wie eine

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0009-6893/79/02 0106-05 S 02.00/0

Chromatographia Vol. 12 No. 2, February 1979

�9 1979 Friedr. Vieweg & Sohn Vedagsgeseilschaft mbH

Originals

reproduzierbare Schichtaktivitiit erreicht werden kann. Anderserseits sind reproduzierbare Rf-Werte und auch re- produzierbare relative Rf-Werte, bezogen auf wenige Ver- gleichssubstanzen, nur zu erhalten, wenn sowohl die Akti- vitiit der Schicht, bestimmt durch die relative Luftfeuchtig- keit, mit der die Schicht ins adsorptive Gleichgewicht ge. bracht wurde, als auch das Flie6mittel experimentell ein- deutig festgelegt sind [9].

Um nun dtinnschichtchromatographische Trennungen mit hoher Reproduzierbarkeit zu erhalten, wurden einmal Misehungen aus im Handel erhgltlichen Flechtensiiuren und auch Extrakte aus verschiedenen Flechtenarten auf oxal- s~ureimpriignierten Kieselgelplatten mit Einkomponenten- eluiermitteln chromatographiert. Und zum anderen wurden Mischungen yon Flechtens~iuren und Flechtenextrakte auf neutralen Kieselgelplatten mit Mehrkomponentenflie6- mitteln chromatographiert, die AmeisenNure oder Essig- s~ure enthielten. Der Zusatz einer Siiure zur stationiiren oder zur mobilen Phase des chromatographischen Systems ist notwendig, um sicherzustellen, da6 die Verteilung der Substanzen zwisetlen mobiler und stationiirer Phase nur durch das Verteilungsgleichgewicht der undissoziierten Flechtensiiuremoleldile bestimmt wird und dieses Gleich- gewicht nicht auch noeh durch das Dissoziationsgleich- gewicht der phenolischen OH- oder Carboxylgruppen der verschiedenen Flechtensiiuren beeinflugt wird. Zudem wur- de stets mit definierter Aktivitiit der stationiiren Phase gearbeitet.

Experimenteller Teil

Es wurden chromatographiert eine Mischung folgender Flechten~uren:

Atranorin, Evernsiiure, Fumarprotocetrarsiiure und (+)- Usninsiiure der Firma Serva, Heidelberg, und die Extrakte folgender Flechtenarten:

Art

Cladonia alpestris (L.) Rabenh. Cladonis alpestris (L.) Rabenh. Cladonia cornuta (L.) Schaer Cladonia pyxidata (L.) Fr. Cladonia uncialis (L.) Hoffmann Comicularia aculeata (Schreb.) Th.Fr. Cetraria islandica (L.) Ach. Hypogymnia physodes (L.) Nyl. Umbilicaria pustulata (L.) Hoffmann unbekannte Krustenflechte

Fundort

Finnisch Lappland Bucholtwelmen (Wesel) Bucholtwelmen (Wesel) Bucholtwelmen (Wesel) Bucholtwelmen (Wesel) Bucholtwelmen (Wesel) unbekannt (Apotheke) Emsdettener Venn Saarland Finnisch Lappiand

Die Extrakte wurden gewonnen, indem etwa 2,5 g rein pulverisiertes Flechtenmaterial im Soxhlet zuniichst 30 rain mit 100 cm 3 Benzol und dann 30 rain mit 100 cm 3 Aceton extrahiert wurden. Der Benzol- und der Acetonextrakt wurden jeweils vereinigt und im Vakuumrotationsverdamp- fer bei 30 ~ auf 20 cm 3 eingeengt.

Zur Chromatographic verwendete Reagenzien und Geriite:

Benzol, z.A. der Firma Merck, Darmstadt Dioxan, z.A. der Firma Merck, Darmstadt Eisessig, z.A. der Firma Merck, Darmstadt Methylenchlorid, z.A. der Firma Merck, Darmstadt

Anisaldehyd-Anfarbereagenz: 0,5 cm 3 Anisaldehyd wurden in 50 cm 3 Eisessig unter Zusatz yon 1 cm 3 konz. Schwefel- s~iure gel/Sst; die L/Ssung wurde tiiglich frisch angesetzt. p-Phenylendiamin-Anf~irbereagenz: 10mg p-Phenylendiamin wurden in 100 cm 3 Methanol gel6st. 0,5 n Oxalsiiurel6sung: 31,52 g Oxalsliure-dihydrat wurden in Wasser zu 1000 cm 3 L6sung gel/3st.

Kieselge160 F 2 s4-Fertigplatten der Firma Merck, Darmstadt, Standard-Trennkammer der Firma Desaga, Heidelberg. Vario-KS-Entwicklungskammer der Firma Camag, Mut- tenz/Schweiz, mit einem Konditioniertrog mit ftmf Unter- teilungen und einem ohne Unterteilungen.

10 mm3-Mikroapplikator nach Cordis der Firma Desaga, Heidelberg. Universal-Analysenlampe fiir UV 254 und 366 nm der Fir- ma Desaga, Heidelberg.

Zur Herstellung yon oxals~urehaltigen Adsorptionsmittel- schichten wurden Kieselgel-Fertigplatten 20 s in 0,5 n Oxal- siiurel6sung eingetaucht, danach die Oxalsiiurel6sung ab- tropfen gelassen und die Platten an der Luft getrocknet. Auf diesen Platten konnten allerdings keine Substanzen mehr unter einer UV-Lampe erkannt werden.

Zur chromatographischen Trennung wurden auflufttrocke- nen Platten jeweils 10 mm a der zu untersuchenden L6sung mit einem Mikroapplikator aufgetragen, und nach dem Ab- dunsten des L6sungsmittels, das mit einem F6hn beschleu- nigt wurde, wurden die Platten in die Vario-KS-Kammer auf den Konditioniertrog gelegt, dessen einzelne Kammern senkrecht zur Laufrichtung des Flie6mittels angeordnet waren; nur bei den Versuchen mit orthogonalem Aktivitiits- gradienten waren sic parallel zur Laufrichtung angeordnet. Die einzelnen Kammern des Konditioniertrogs enthielten Sehwefelsiiure in entsprechender Konzentration ffir die dartiber gewiinschte relative Luftfeuchtigkeit (siehe Lit. [9], S. 115). Nach 45 min hatte die Schieht sicher die tier eingestellten relativen Feuchte entsprechende Aktivit~it. In den Fiillen, bei denen danach noch eine Vorbedampfung mit dem Flie6mittel erfolgte, wurde der zur Aktivitiitsein- stellung verwendete Konditioniertrog gegen einen - mit dem Flie6mittel - eine entsprechende Zeit ausgewechselt. Erst dann erfolgte die Zufuhr des Fliet~mittels zur Schicht, die in allen Fallen nach 15 cm Laufstrecke in der Schicht beendet wurde.

Das Chromatogramm wurde danach aus der Kammer ab- gehoben und getrocknet. Bei nicht mit Oxalsiiure imprii- gnierten Platten waren die Flechtens~urenflecken gut unter der UV-Lampe sichtbar. Die impr~ignierten Platten dagegen wurden stets, die nicht impriignierten dagegen nur, wenn auf Grund der Farbreaktion mit den Anfiirbereagenzien weitere Informationen erwtinscht waren, mit einem der bei- den Anfarbereagenzien bespriiht bis zur Durchfeuchtung der Sehicht und bei Verwendung des Anisaldehyd-Anfarbe- reagenz noch 10 min bei ca. 105 ~ thermisch behandelt. - Mit dem p-Phenylendiamin reagieren nur die Flechten- siiuren, die eine Aldehydgruppe in o-Stellung zu einer phenolischen OH-Gruppe enthalten, und zwar unter inten- siver Gelbf~irbung [8]. Mit Anisaldehyd dagegen liefern die Flechtensliuren verschiedene Rot- bzw. Violett-Nirbungen, die jeweils flir bestimmte Flechtensiiuren charakteristisch sind.

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1,0

0,8

~ l 0,6

0,5

0,3

0,2

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0 I I III IV

Fig. 1

�9 Abh~ngiqkeit der Rf-Werte yon der Aktivi tgt derSchicht. Trennunq von Everns~ure (gr66erer Rf-Wert) und Fu- marprotocetrars~ure (kleinerer Rf-Wert) mit dem Ge- misch Benzol: Dioxan : Eisessig (90: 25:4) auf Kieselgel- platten mit orthoqonalem Aktivit~itsgradienten (rel. Feuchte: I 30%,11 40%,111 6 0 % u n d I V 80%).

�9 Dependence of R F on layer activity of plates. Separation of evernic acid (high R F value) and fumar- protocetraric acid (low R F) with benzene:dioxane: acetic acid (90:25:4) developer on silica gel plates and orthogonal activity gradient (ambient moisture I 30 %, 1140 %, l l160 % and lV 80 %).

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II III

Fig. 2

�9 Abh~ngigkeit der Rf-Werte yon der Vorbedampfung der Schicht mit Flie6mittel. Trennung yon Atranorin (1), Usnins~ure (2), Evern. s~ure (3) und Fumarprotocetrars~iure (4) mit dem Ge. misch Benzol: Dioxan :Eisessig (90:25:4) auf Kieselgel- platten; Vorbedampfungszeit: I 0 min, II 5 min und III 15 min.

�9 Dependence of R F on exposure of layers to developer vapour. Separation of atranorin (1), usnic acid (2), evernic acid (3) and fumarprotocetraric acid (4) with benzene:di- oxane:acetic acid (90:25:4) developer on silica gel plates; exposure time: I 0 min, II 5 min and III 15 min.

Ergebnisse

Von den von Culberson und Kristinsson [8] empfohlenen Flie6mittelgemischen erwies sich fiir das untersuchte Ma- terial am leistungsfahigsten das Gemisch aus Benzol:Dio- xan:Eisessig = 90:25:4 , das auch schon Bachmann [5] ver- wendet hat. Aus der Fig. 1 ist gut zu erkennen, da6 nur bei einer relativ geringen Aktivit~it entsprechend des Arbeitens bei relativ holler Feuchte auch Substanzen mit geringen Rf- Werten iiberhaupt wandem. Aus Fig. 2 erkennt man zudem, dag die Trennung weiterhin beeinflu6t wird durch eine eventuelle Vorbedampfung der Schicht mit dem Flie6- mittel in einem Konditioniertrog. Unter Berticksichtigung der Einfltisse der Schichtaktivit~it und der Vorbedampfung der Schicht mit Fliegmittel ergibt sich far das Gemisch Benzol : Dioxan: Eisessig = 90: 25 : 4 als Flie6mittel eine op- timale Trennung s das untersuchte Material, wenn die Schicht eine Aktivit~it entsprechend 70 % relativer Feuchte der Umgebung erh~ilt und 15 rain mit dem FliefSmittel vor- bedampft wird. Allerdings werden dann keine Flechten- s~iurenflecken im Chromatogramm erhalten mit Rr-Werten gr66er als 0,7 (siehe Fig. 4a), was mit den Ergebnissen yon Culberson und Kristinsson [8] tibereinstimmt. Dies resul-

tiert vor aUem daraus, da6 durch die Vorbedampfung ein Teil des in der trockenen Schicht vorhandenen freien V0. lumens durch Flie6mittelaufnahme aus der Gasphase bereits aufgeftillt wird, so dab w~ihrend des Chromatographierens nur noch ein geringeres Flie6mittelvolumen dutch die Schicht str6men kann; der Rf-Wert ist jedoch proportional des Flie6mitteldurchsatzes durch die Schicht. Da die opti- malen Bedingungen jedoch jederzeit reproduzierbar ein- gestellt werden k6nnen, ergibt sich eine sehr gute Repro- duzierbarkeit fiir die Rt-Werte. So ergab sich aus acht an verschiedenen Tagen hergestellten Chromatogrammen for den Re-Wert der Usninsaure (Rf-Wert = 0,60) nach

f = Abweichung des Einzelwertes vom Mittelwert n = Zahl der Megwerte

eine Standardabweichung von cr = 0,007 und damit ein Variationskoeffizient von 1,18 %.

Eine Verbesserung der Ausnutzung der Flie6mittellauf. strecke for die Trennung der verschiedenen Flechtens~iuren

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ergibt sich jedoch bei der Verwendung yon oxals~ureimpr~i- gnierten Kieselgelschichten und Methylenchlorid als Flieg- mittel. Andere Fliet~mittel, wie Benzol, Chloroform, Di- chlorathan, Methyl~ithylketon, Essigs~iure~thylester oder Arneisens~iureiithylester zeigten demgegentiber schlechtere Trennergebnisse. Bei der Verwendung yon Methylen- chlorid sind allerdings die experimentellen Bedingungen yon grot~em Einflug auf das Trennergebnis und auch auf die Laufstrecken der einzelnen Flechtensauren, wie Fig.3 deutlich zeigt. Hieraus ergibt sich aber auch, dal~ bei solch starker Abhiingigkeit die Gradiententechnik sich besonders Mstungsverbessemd auswirkt. Optimale Trennergebnisse mit dem chromatographischen System oxals~iureimprli- gnierte Kieselgelschicht/Methylenchlorid werden erhalten bei Anwendung eines antiparallelen Aktivit~itsgradienten mit relativen Feuchten yon 80 %, 70 %, 50 %, 30 % unter jeweils 4 cm der Platte yon der Seite der Fliet~mittelzufuhr her gesehen. Durch diesen antiparallelen Aktivit~itsgra- dienten erreicht man eine Vergr6gerung der Rf-Werte im unteren Bereich und eine Verkleinerung der Rf-Werte im oberen Bereich. Auf diese Weise konnte ftir das untersuchte Material eine optimale Ausnutzung der Trennstrecke er- reicht werden, wie Fig.4b zeigt, bei gleichzeitiger hoher Reproduzierbarkeit der Rf-Werte: Acht an verschiedenen Tagen hergestellte Chromatogramme ergaben ftir den Rf- Weft der Usnins~iure (Rf-Wert= 0,77) eine Standardab- weichung yon o = 0,010 und damit einen Variationskoeffi- zienten yon 1.35 %. Parallel dazu mittels einer Standard- Trennkammer hergestellte Chromatogramme wiesen dage- gen ftir den Rf-Wert tier UsninNure eine Standardabwei- chung von o = 0.05 und damit einen Variationskoeffizienten yon 6,64 % auf. Die Verwendung yon mit Oxals~iure im- pr~gnierten Kieselgelschichten fuhrte allerdings dazu, dat~ das Atranorin zwei Flecken lieferte mit geringem Rf-Wert- unterschied, was eventuell von einer Hydrolyse der Ester. gruppe des Depsids herriihren kann. Die Fig. 4 zeigt aber auch deutlich, dal~ die verschiedenen Flechtenextrakte sich in den beiden verwendeten chromato- graphischen Systemen recht unterschiedlich verhalten, so dal~ festgestellt werden kann, dab unterschiedlich herge- stellte Chromatogramme die Information erheblich ver- gr61~em.

~" 0,7

I 06 0,5

0,4

O.3

0,2

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0

1,0

0,9

I II III

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IV V

Fig. 3

�9 Abh~ingigkeit der Rf-Werte vonder Aktivit~t der Schicht. Trennung yon Usnins~ure (grff~erer Rf-Wert) und Evern- s~iure (kleinerer Rf-Wert) mit Methylenchlorid auf oxal- s~ureimpr~ignierten Kieselgelplatten mit orthogonalem Aktivit~tsgradienten (rel. Feuchte: I 20%, II 30%, III 40 %, IV 60 % und V 80 %).

�9 Dependence of R F on layer activity of plates. Separation of usnic acid (high R F) and evernic acid (low R F) using methylene chloride on silica gel plates impreqnated with oxalic acid and orthogonal activity gradient (ambient moisture: I 20%, II 30%, III 40%, IV 60%andV 80 %).

Diskussion der Ergebnisse

Die Untersuchungen haben gezeigt, daft die ftir die Chemo- taxonomie notwendige hohe Reproduzierbarkeit der dtinn- schichtchromatographischen Untersuchung yon Pflanzen- inhaltsstoffen nur erreicht wird, wenn nicht nur die Elu- tionsst~irke des Fliegmittels, sondern auch die Aktivit~it der Adsorptionsmittelschicht und deren Vorbedampfung mit Fliel~mittel oder anderen L6sungsmitteln reproduziert werden kann. Ferner haben sie ergeben, dafo optimale Trennergebnisse vor allem dann erhalten werden, wenn man die Aktivit~it der Schicht sorgt'altig auf die Elutionsst~irke der mobilen Phase einstellt unter besonderer Berticksichti- gung der Gradiententechnik, und wenn man durch entspre- chende pH-Werteinstellung der Schicht oder des Eluiermit- tels daftir sorgt, dat~ es nicht zu einer S~iure-Basen-Dissozia-

tion der zu untersuchenden Substanzen kommt. Derartig optimierte und reproduzierbar gestaltete dtinnschicht- chromatographische Untersuchungen sind dann aut~er- ordentlich gut dazu geeignet, die Taxonomie yon Pflanzen zu untersttitzen, denn die Schichtchromatographie ist eine relativ einfache Analysenmethode, die besonders hohe Leistungsfahigkeit erreicht, wenn man die gleichen Proben mit verschiedenen Kombinationen aus bestimmter Schicht- aktivit~it und bestimmter Elutionsst~irke des Fliegmittels untersucht und dann nach strichf6rmiger Auftragung Teil- bereiche der Substanzzonen mit verschiedenen Anf~irbe- reagenzien behandelt.

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I H III IV V VI VII

Fig, 4

�9 Trennungen des Flechtens~urengemisches (I) von Atrano- rin (1), Usnins~ure (2), Everns~ure (3) und Fumar- protocetrars~ure (4) sowie der E• der Flechten Cladonia alpestris (11), Cladonia uncialis (111), Cladonia cornuta (iV), Cladonia pyxidata (V), Cetraria islandica (Vl), Umbilicaria pustulata (VII), unbekannte Krusten- flechte (VIII), Cornicularia aculeata (IX) und Hypo- gymnia physodes (X): a) mit dem Gemisch Benzol: Dioxan: Eisessig (90: 25: 4) auf Kieselgelplatten, deren Aktivit~it durch 70 % rel. Feuchte einqestellt wurde und die 15min mit Flie6- mittel vorbedampft wurden; b) mit Methylenchlorid auf oxals~iureimpr~gnierten Kie- selplatten mit antiparallelem Aktividitsgradienten ent- sprechend rel. Feuchten yon 80%, 70%, 50% und 30%.

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I

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tX X

30%

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IX X

Separations of mixture (I) of lichen acids atranorin (1}, usnic acid (2), evernic acid (3) and fumarprotocetrari: acid (4) and of extracts of lichens Cladonia alpestris(ll}, Cladonia uncialis (111), Cladonia cornuta (IV), Cladonia pyxidata (V), Cetraria islandica (Vl), Umbilicaria pustu. lata (VIII), unknown crust lichen (VIII), Cornicularia aculeata (IX) and Hypoqymnia physodes (X): a) with benzene:dioxane:acetic acid (90:25:4) devel. oper on silica gel plates, activity adjusted by 70~ ambient moisture and exposed to solvent vapour for 15 min; b) with methylene chloride on silica gel plates impregnat. ed with oxalic acid and antiparallel activity gradient corresponding to 80 %, 70 %, 50 % and 30 % ambient moisture.

D a n k

Fiir die Artbestimmung einiger Flechten danken wir V. John

von der Universit~it des Saarlandes, Saarbrticken.

L i te ra tu r

[ll Ir Thies, in ,,Handbuch der Pflanzenarmlyse", G. Klein ed., Berlin, S. 429.

[21 D. Hess, Planta 52, 65 (1958). [3] J.L. Ramaut, Bull. de ta Soc. de Bot.de Belgique93, 25 (1961).

[4l C A. Wachtmeister, Botaniska Notiser 109, 313 (1956).

[5] O. Bachmann, Osterr. Bot. Zeitschr. 110, 103 (1963).

[61 J.L. Ramaut, Bull. Soc. Chim. Belg. 72, 316 (1963).

171 M. Nuno, Jour. Jap. Bot. 39, 97 (1963).

[81 Ch. F. Odbemon und H. Kristinsson, J. Chromatog. 46, 85 (1970).

[91 F. Geiss, ,,Die Parameter der Dtinnschichtchromatographie", Friedr. Vieweg & Sohn, Braunschweig 1972.

Received: Aug. 17, 1978

Accepted: Oct. 28, 1978

D

1 10 Chromatographia Vol. 12 No. 2, February 1979 Originals