Aus dem
Pathologischen Institut
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Leiter:
Prof. Dr. med. Hartmann
Untersuchung des Einflusses von Metformin und EMD 387008 auf
kardiovaskuläre Strukturen sowie laborchemische und physiologische Parameter im
tierexperimentellen Modell der diabetogenen ZDF-Ratte
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorgelegt von
Ulrike Götze
aus
Leisnig
2009
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. Dr. med. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. med. K. Amann Korreferent: Prof. Dr. med. K. F. Hilgers Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2010
Inhaltsverzeichnis 1.a Zusammenfassung............................................................................................ 1
1.a.1 Hintergrund und Ziele .................................................................................. 1 1.a.2 Methoden ..................................................................................................... 1 1.a.3 Ergebnisse .................................................................................................... 1 1.a.4 Schlussfolgerung .......................................................................................... 2
1.b Abstract ............................................................................................................ 3 1.b.1 Purpose..................................................................................................... 3 1.b.2 Methods.................................................................................................... 3 1.b.3 Results ...................................................................................................... 3 1.b.4 Conclusions .............................................................................................. 4
2. Einleitung ............................................................................................................. 5 2.1 Diabetes mellitus.......................................................................................... 5
2.1.1 Definition ............................................................................................. 5 2.1.2 Epidemiologie ...................................................................................... 5 2.1.3 Klassifikation: ...................................................................................... 7 2.1.4 Diabetes mellitus Typ II....................................................................... 9 2.1.5 Kardiovaskuläre Komplikationen ...................................................... 10
2.1.5.1 Makroangiopathie .......................................................................... 10 2.1.5.2 Mikroangiopathie ........................................................................... 12
2.1.6 Antihyperglykämische Behandlung des Diabetes mellitus Typ II mit Metformin .......................................................................................................... 13
2.1.6.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik ...................................... 13 2.1.6.2 Indikation ....................................................................................... 14 2.1.6.3 Unerwünschte Wirkungen und Kontraindikationen ...................... 15
3. Material und Methoden ...................................................................................... 17 3.1 Versuchstiere.............................................................................................. 17 3.2 Tiermodell .................................................................................................. 17 3.3 Studiendesign ............................................................................................. 18 3.4 Perfusionsfixation ...................................................................................... 20 3.5 Gewebeaufbereitung .................................................................................. 21
3.5.1 Orientator ........................................................................................... 21 3.5.2 Herstellung mikroskopische Präparate............................................... 22
3.5.2.1 Aufbereitung Herz.......................................................................... 22 3.5.2.2 Zuschnitt Präparate......................................................................... 22 3.5.2.3 Herstellung mikroskopischer Präparate - Semidünnschnitttechnik22 3.5.2.4 Aufbereitung der Aorten ................................................................ 23
3.6 Morphometrie und Stereologie .................................................................. 23 3.6.1 Messverfahren .................................................................................... 23
3.6.1.1 Integrationsplatte............................................................................ 23 3.6.1.2 Bildanalyseverfahren...................................................................... 25
3.6.2 Volumendichte (Vv)........................................................................... 26 3.6.3 Längendichte (Lv).............................................................................. 26 3.6.4 Interkapilläre Distanz (ICD) .............................................................. 27 3.6.5 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Parameter ............................ 27 3.6.6 Intramyokardiale Arteriolen – relative Parameter.............................. 28 3.6.7 Aorta – absolute und relative Parameter ............................................ 28
3.7 Statistik....................................................................................................... 30 4. Ergebnisse .......................................................................................................... 31
4.1 Allgemeine Parameter................................................................................ 31
4.1.1 Körper- und Herzgewicht, Körperlänge............................................. 31 4.1.2 Parameter des Glucosestoffwechsels ................................................. 35 4.1.3 Blutfette und Laktat............................................................................ 38 4.1.4 Parameter der Nierenfunktion ............................................................ 41 4.1.5 Elektrolyte .......................................................................................... 47 4.1.6 Nahrungs- und Trinkmenge ............................................................... 49
4.2 Intramyokardiale Parameter ....................................................................... 50 4.2.1 Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums ............................ 50 4.2.2 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte ........................... 53 4.2.3 Intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte ............................ 54 4.2.4 Kapillarisierung des Myokards .......................................................... 56
4.3 Veränderungen der Aorta........................................................................... 59 4.3.1 Wandveränderungen der Aorta – absolute Werte .............................. 59
5. Fotodokumentation ............................................................................................ 61 5.1 Intramyokardiale Arteriolen....................................................................... 61 5.2 Intramyokardiale Kapillarisierung ............................................................. 62
6. Diskussion.......................................................................................................... 63 6.1 Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 auf kardiovaskuläre Strukturen unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse .......................................................... 63
6.1.1 Auswirkungen einer Hyperglykämie auf kardiovaskuläre Strukturen63 6.1.2 Auswirkungen einer Dyslipidämie und Insulinresistenz auf kardiovaskuläre Strukturen ................................................................................ 65 6.1.3 Mikroalbuminurie und kardiovaskuläre Schäden .............................. 67 6.1.4 Endotheliale Dysfunktion und kardiovaskuläre Schäden .................. 68 6.1.5 Linksventrikuläre Hypertrophie ......................................................... 69
6.2 Vergleich von Metformin und EMD bezüglich ihrer Wirkung auf Symptome des Diabetes mellitus Typ 2 unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse .............................................................................................................. 70
6.2.1 Metformin und EMD in der Therapie der Insulinresistenz................ 70 6.2.2 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Hyperglykämie ........ 71 6.2.3 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Dyslipidämie ........... 72 6.2.4 Metformin – Auswirkungen auf die endotheliale Dysfunktion ......... 72 6.2.5 Metformin und EMD – Risiko einer Laktatazidose........................... 73 6.2.6 Metformin und EMD – Auswirkungen auf das Körpergewicht ........ 74 6.2.7 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die arterielle Wandstruktur und Kapillarisierung des Myokards ................................................................... 75
6.3 Schlussfolgerung ........................................................................................ 77 7. Literaturverzeichnis............................................................................................ 78 8. Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... 85 9. Danksagung........................................................................................................ 86 10. Lebenslauf ...................................................................................................... 87
1
1.a Zusammenfassung
1.a.1 Hintergrund und Ziele
Diabetes mellitus Typ 2 ist die vierthäufigste Todesursache in den Industrieländern.
Durch den Einsatz von Metformin in der antihyperglykämischen Therapie ist es
möglich, die Häufigkeit der mikrovaskulären als auch makrovaskulären
Komplikationen signifikant zu senken. Darüber hinaus werden durch Metformin
auch andere Risikofaktoren für die Entwicklung einer Atherosklerose günstig
beeinflusst (z.B. Hyperglykämie, Dyslipidämie, endotheliale Dysfunktion). In der
vorliegenden Studie sollen mit Hilfe eines tierexperimentellen Modells die
Auswirkungen einer Behandlung mit Metformin mit der eines neuen Wirkstoffs,
EMD 387008, auf kardiovaskuläre Strukturen verglichen werden
1.a.2 Methoden
In dieser Versuchsreihe wurde das diabetogene Modell der ZDF-Ratten verwendet,
wobei der fatty-Typ Merkmale eines Diabetes mellitus Typ 2 aufweist, der Wildtyp
(lean) nicht. Die 6 randomisierten Versuchsgruppen wurden wie folgt eingeteilt: 2
unbehandelte Gruppen (lean und fatty), die nach 10 Wochen untersucht wurden, die
restlichen 4 Gruppen (lean + Placebo-Präparat, fatty + Placebo-Präparat, fatty +
Metformin, fatty + EMD 387008) wurden nach weiteren 16 Wochen analysiert. Die
Rattenherzen und die Aorten wurden mittels morphometrischer Verfahren und
halbautomatischer Bildanalyse hinsichtlich histologischer Parameter ausgewertet.
Zusätzlich wurden laborchemische und physiologische Parameter bestimmt.
1.a.3 Ergebnisse
Die direkte Auswirkung des Diabetes mellitus Typ 2 auf eine verstärkte
linksventrikuläre Hypertrophie konnte, wenn auch nicht signifikant, so doch von der
Tendenz her in dieser Arbeit gezeigt werden. Eine myokardiale Fibrose und
Kollagenablagerung als frühe myokardiale Schäden infolge der Hyperglykämie
können in der vorliegenden Arbeit nicht signifikant gezeigt werden.
2
Es zeigt sich tendentiell (nicht signifikant) eine geringere Dickenzunahme der
arteriellen Gefäßwand bei den mit Metformin behandelten Tieren, verglichen mit der
Kontrollgruppe, die mit Placebo behandelt wurde. Die mit EMD behandelten Tiere
zeigen eine signifikant (p<0,05) dickere Gefäßwand, bezogen auf das Lumen der
intramyokardialen Arteriolen.
Die Tiere, die mit EMD behandelt wurden, zeigen eine signifikant (p<0,001)
geringere Kapillarisierung des Myokards, verglichen mit der ZDF-F-P-Gruppe. Auch
im Vergleich mit der Metformin-Gruppe ist die Kapillarisierung der mit EMD
behandelten Tiere tendenziell niedriger, aber nicht signifikant.
1.a.4 Schlussfolgerung
Zusammenfassend spiegeln die laborchemischen Ergebnisse dieser Arbeit nur
teilweise die aktuelle Studienlage wider. Die morphologischen Ergebnisse dieser
Arbeit lassen sich anhand der aktuellen Literatur in vielen Teilen nachvollziehen. Es
ergeben sich Nachteile des Medikamentes EMD, verglichen mit Metformin, vor
allem bezüglich der kapillären Versorgung des Myokards sowie der Veränderung der
arteriellen Wandstruktur. Auch im Bereich der unerwünschten Begleiterscheinungen
kann EMD, z.B. im Bereich der Zunahme des Körpergewichtes oder der
Laktatazidose, keine Vorteile gegenüber Metformin aufweisen.
Daher ist es aufgrund der vorliegenden tierexperimentellen Daten zunächst nicht
naheliegend, EMD als adäquate Alternative zu Metformin in der antidiabetischen
Therapie zu sehen.
3
1.b Abstract
1.b.1 Purpose
Type 2 diabetes is the fourth commonest cause of death in the industrialised
countries. The use of Metformin in the antihyperglycaemic therapy makes is possible
to reduce the incidence of microvascular as well as macrovascascular complications
significantly. Furthermore Metformin has a beneficial effect on other risk factors for
the development of atherosclerosis (e.g. hyperglycaemia, dyslipidaemia, endothelial
dysfunction). The aim of this study is to compare the effects of Metformin and EMD
387008 treatment on cardiovascular structures using an animal experiment.
1.b.2 Methods
In this test series diabetogenic ZDF-rats were used. The fatty type is characterized by
having type 2 diabetes as opposed to the “healthy” wild (lean) type. The six
experimental groups were randomised and arranged as follows: two groups (lean and
fatty respectively) remained untreated and were investigated after ten weeks, the
other 4 groups (lean + Placebo, fatty + Placebo, fatty + Metformin, fatty + EMD
387008) were analysed after further 16 weeks. Semi-thin-sections of the rats´ cardiac
tissue and aorta were analysed regarding histological parameters, applying
morphological methods and semiautomatic image analysis. Additionally, laboratory-
and physiological parameters were defined.
1.b.3 Results
This study illustrates, though not significantly, the primary effect of type 2 diabetes
on an increased left-ventricular hypertrophy, while myocardial fibrosis and
collagenous deposit as early myocardial damages due to hyperglycemia could not be
shown. In the group treated with Metformin it was found that the vascular walls had
not as much increased in thickness as in those belonging to the Placebo-group,
whereas the EMD-group showed a significant increase (p<0,05) in vascular wall-
thickness in relation to the lumen of the intramyocardial arterioles.
This can be taken as indication, that EMD is not as effective in reducing vascular
wall-thickness as Metformin and the used Placebo compound respectively.
4
Myocardial capillarisation was significantly lower (p<0,001) in the EMD-group than
in the ZDF-F-P-group. Thus, taking into account the figures of intercapillary
distance, it becomes clear that the myocardial capillary supply of the EMD-group is
lower than that of the group under treatment with Metformin, but not significantly.
1.b.4 Conclusions
In summary, the laboratory results of this study only partly confirm those of the
currently available literature on the subject. The morphological results can be
explained to a wide extent with the aid of existing studies. Some disadvantages of
EMD compared with Metformin are illustrated, especially concerning the myocardial
capillary supply and changes of the arterial wall structure. With regard to adverse
effects, as well, EMD does not present any advantages over Metformin, e.g. in
increase of bodyweight or lactate acidosis.
Because of the present data from this animal experiment, at the moment EMD should
not be considered as an alternative to Metformin in the area of antidiabetic therapy.
5
2. Einleitung
2.1 Diabetes mellitus
2.1.1 Definition
Das Wort Diabetes mellitus leitet sich aus dem Altgriechischen ab und bedeutet
soviel wie „honigsüßer Durchfluss“. Es bezeichnet eine durch den Leitbefund
chronische Hyperglykämie charakterisierte Stoffwechselerkrankung, die auf
einem relativen (verminderte Insulinwirkung) oder absoluten Insulinmangel
(gestörte Insulinsekretion) beruht. Nach längerer Krankheitsdauer kann die
chronische Hyperglykämie über die diabetesspezifische Mikroangiopathie zu
Folgeerkrankungen, insbesondere an Augen, Nieren, Herz, Nervensystem sowie
über die diabetesassoziierte Makroangiopathie zu Folgeschäden an Herz, Gehirn
und peripheren Arterien führen ([25], [28]).
2.1.2 Epidemiologie
Vom Robert-Koch-Institut [56] wurde eine repräsentative Stichprobe der 18-
79jährigen Wohnbevölkerung in Deutschland sowohl mittels eines
Selbstausfüllfragebogens sowie durch einen Arzt nach ihren bisherigen
Erkrankungen gefragt. Unter Zugrundelegung der Ergebnisse der ärztlichen
Befragung ergibt sich eine Diabetesprävalenz von 4,7% für Männer und 5,6% für
Frauen in der untersuchten Altersgruppe. Die Befundhäufigkeit steigt mit dem
Alter steil an. Nahezu jede fünfte Frau im Alter von 70 bis 79 Jahren hat nach
den vorliegenden Daten einen Diabetes mellitus.
Die Krankheit ist in den neuen Bundesländern deutlich häufiger als in den alten
Ländern. Etwa ein Viertel der Diabetiker benutzt Insulin, weit über 40% werden
mit oralen Antidiabetika therapiert. Bei etwa der Hälfte der nicht medikamentös
behandelten Diabetiker wurde aus Sicht der befragenden Ärzte keine Diät
eingehalten (ca. 15%). Der Anteil an unerkannten Diabetikern in der betrachteten
Population wird aufgrund von Blut- und Urinmeßwerten (Serum- und
Uringlukose, Fructosamin, HbA1c) auf etwa 1% geschätzt.
6
Tabelle 2-1: Anteil der Behandlungsformen (%) bei den im Bundes-Gesundheitssurvey vom
befragenden Arzt als Diabetiker eingestuften 18- bis 79jährigen Teilnehmern. N=369, gewichtet
entsprechend der Bevölkerungsstruktur des Jahres 1998 [56]
Nach Schätzungen der WHO steigt die globale Diabetes-Prävalenz, auch wenn das
Ausmaß an Übergewicht in der Weltbevölkerung konstant bliebe [61]. Die Daten der
WHO zeigen zudem, dass die globale Prävalenz für alle Altersgruppen im Jahre 2000
bei 2,8% lag und 2030 schätzungsweise 4,4% betragen wird. Das bedeutet, dass die
Anzahl von weltweit 171 Millionen Diabetes-Erkrankten im Jahre 2000 auf
vermutlich 366 Millionen im Jahre 2030 ansteigen wird (s.Tab.2-2). Den größten
Anteil an Diabetikern wird, nach weltweiten demographischen Schätzungen, die
Gruppe der 45- bis 64-Jährigen stellen. Da die Typ II-Diabetiker mit 90% den
größten Anteil ausmachen und 80% dieser Gruppe zusätzlich adipös sind [25], liegt
es nahe, diesen Umstand auf die veränderten Lebensgewohnheiten, die sich in
Überernährung bei gleichzeitigem Bewegungsmangel manifestieren, zurückzuführen.
Beide gelten als Hochrisiko-Faktoren für den Diabetes mellitus Typ II. Mit der
zukünftig höheren Lebenserwartung führt dieser Umstand demnach zu einer
vermutlich kontinuierlich steigenden Inzidenz dieser Erkrankung.
Behandlung Männer
Frauen
gesamt West Ost gesamt
West Ost
Insulin auch kombiniert 24,5 21,8 31,5 24,6 25,9
20,7
orale Antidiabetika* 46,0 47,9 41,0 43,4 41,6 48,7
Diät 12,9 12,9 13,1 17,3 17,5 16,8
keine Behandlung 16,6 17,4 14,4 14,7 15,0 13,8
* auch mit Diät
7
Tabelle 2-2: Geschätzte Anzahl Erwachsener mit Diabetes, aufgeführt nach Altersgruppen,
Jahreszahl und Länderkategorien (Entwickelte Länder, Entwicklungsländer und
zusammengefasst als „world“) [58]
2.1.3 Klassifikation:
Die aktuelle Klassifikation beruht auf der nosologischen Klassifikation des
Diabetes mellitus der Amerikanischen Diabetes Gesellschaft [28], die auf
Empfehlungen der WHO von 1965 basieren. Diese ätiologische Einteilung
beinhaltet zum einen den Diabetes mellitus Typ I, der wiederum in einen
immunologisch bedingten und einen (in Europa seltenen) idiopathischen Typ
unterteilt wird und durch beta-Zelldestruktion zu einem absoluten Insulinmangel
führt. Zum anderen spricht man vom Diabetes mellitus Typ II, der sich von einer
vorwiegenden Insulinresistenz mit relativem Insulinmangel bis zu einem
vorwiegend sekretorischen Defekt mit Insulinresistenz erstrecken kann. Zuletzt
8
werden alle anderen spezifischen Diabetes-Typen in einer eigenständigen Gruppe
zusammengefasst (s.Tab. 2-3)
Tabelle 2-3: Nosologische Klassifikation des Diabetes mellitus [26]
I. Typ 1 Diabetes
A. Immunologisch vermittelt
B. Idiopathisch
II. Typ 2 Diabetes
III. Andere spezifische Diabetes-Typen
A. Genetische Defekte der B-Zell-Funktion
B. Genetische Defekte der Insulinwirkung
C. Erkrankungen des exokrinen Pankreas
D. Endokrinopathien
E. Medikamenten- oder chemikalieninduziert
F. Infektionen
G. Seltene Formen des immunvermittelten Diabetes,
H. Andere, gelegentlich mit Diabetes assoziierte genetische Syndrome
IV. Gestationsdiabetes
Als Kriterien für die Diagnosestellung „Diabetes mellitus“ sind festgelegt:
1. Plasma-Glucosekonzentrationen von ≥ 200mg/dl (≥11,1mmol/l) mit
Symptomen des
Diabetes mellitus (z.B. Polyurie, Polydipsie) im Rahmen einer Gelegenheits-
Blutzuckerkontrolle (zu jeder Tageszeit ohne Beziehung zu Mahlzeiten)
2. Nüchterne Plasma-Glucosekonzentrationen (keine Nahrungsaufnahme ≥ 8
Stunden) ≥126mg/dl (≥7,0 mmol/l)
9
3. Plasma-Glucosekonzentrationen ≥ 200mg/dl (≥11,1mmol/l) während eines
oralen Glucosetoleranztests (OGTT) 2 Stunden nach der Gabe von 75mg
Glucose [25]
2.1.4 Diabetes mellitus Typ II
Der Diabetes mellitus Typ II lässt sich auf zwei pathogenetische Mechanismen
zurückführen: zum einen ist die frühe postprandiale Insulinsekretion gestört [44],
was zu einer postprandialen Hyperglykämie führt. Zum anderen weisen die Patienten
eine herabgesetzte Insulinwirkung (Insulinresistenz) auf, die sowohl auf einen Prä-
Insulinrezeptordefekt, als auch auf einen Rezeptordefekt mit konsekutiver
Herabregulierung als auch auf einen Post-Rezeptordefekt mit einer gestörten
Signaltransduktion (z.B. Tyrosinkinasen) zurückgeführt werden kann ([29], [63]).
Manifestationsfaktoren für den Typ II-Diabetes können das metabolische Syndrom,
genetische Faktoren, Stressfaktoren (z.B. Traumen, Infektionen, Operationen), aber
auch Endokrinopathien oder Medikamente (s.Tab. 2-3) sein. Das metabolische
Syndrom bezeichnet das Zusammentreffen der Risikofaktoren
- stammbetonte Adipositas
- Dyslipoproteinämie
- Essentielle Hypertonie
- Glucosetoleranzstörung/D.m. Typ II [25]
Der circulus vitiosus dabei besteht zunächst in einer Insulinresistenz der
insulinabhängigen Gewebe (z.B. Myozyten), sodass erhöhte Insulinspiegel für die
Glucoseverwertung benötigt werden. Da eine Hyperinsulinämie zu einem verstärkten
Hungergefühl führt, kann dieses wiederum zu Adipositas mit einem erhöhten Risiko
für Atherosklerose führen.
Außerdem vermindert ein zu hoher Insulinspiegel die Sensibilität und Dichte der
Insulinrezeptoren (Herabregulierung) und damit auch der Insulinwirkung. Dieses
Phänomen führt in der Endstrecke wiederum zu einer erhöhten Insulinausschüttung.
Dieser Umstand erklärt, warum in der Therapie des Typ II-Diabetes (im Gegensatz
zum Typ I) weniger die Insulinsubstitution als vielmehr eine Ernährungsumstellung,
körperliche Aktivität sowie die orale antidiabetische Therapie im Vordergrund
stehen.
10
Die Vererbung des Diabetes mellitus erfolgt polygen-multifaktoriell. Die zugrunde
liegenden genetischen Faktoren sind im Detail noch unbekannt. In Untersuchungen
an eineiigen Zwillingen kann beobachtet werden, dass zu ca. 90 % beide Geschwister
an einem Typ 2 Diabetes erkranken [28]. Die genetische Penetranz ist also sehr hoch.
Ein Typ 2 Diabetes kann in seltenen Fällen auch bei Jugendlichen auftreten [26].
International wird in den letzten Jahren eine Zunahme dieser Fälle beschrieben.
2.1.5 Kardiovaskuläre Komplikationen
Man unterscheidet bei den diabetischen Gefäßschäden zwischen einer unspezifischen
Makroangiopathie und einer diabetesspezifischen Mikroangiopathie mit Verdickung
der kapillären Basalmembranen. Diese Basalmembranverdickung ist abhängig von
der Dauer des Diabetes und der Güte der Stoffwechseleinstellung. Dabei führt die
langfristig erhöhte Glucose-Konzentration zu einer nicht-enzymatischen
Glykosilierung von Proteinen und Kollagenen sowie zu einer Lamininvermehrung.
Als Folge dieser nicht-reversiblen Proteinglykosilierung wird die
Kollagenvernetzung in den Basalmembranen der kleinen Gefäße beeinträchtigt ([25],
[47]).
2.1.5.1 Makroangiopathie
Die diabetische Makroangiopathie gleicht im Wesentlichen der Atherosklerose des
Nicht-Diabetikers. Die wichtigsten Folgezustände sind Koronarsklerose (Risiko des
Myokardinfarkts), Zerebralsklerose (arterielle Verschlusskrankheit der Hirnarterien
und Risiko des ischämischen Hirninfarkts) und periphere Dirchblutungsstörungen
(periphere arterielle Verschlusskrankheit [pAVK], diabetische Gangrän) [47]. Die
Makroangiopathie manifestiert sich auch bei Diabetikern überwiegend als koronare
Herzkrankheit (KHK), periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) und
zerebrovaskuläre Insuffizienz [17].
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigsten Folgeschäden bei Diabetikern
und erklären die hohe Morbidität und Mortalität dieser Patienten [57]. Typ 2
Diabetes erhöht das kardiovaskuläre Risiko um einen Faktor von zwei bis vier. In
den Industrieländern ist der Diabetes mellitus die viert häufigste Todesursache,
wobei kardiovaskuläre Erkrankungen bei Diabetikern für 75 Prozent der
11
Gesamtmortalität verantwortlich sind [16]. Die KHK liegt mit großem Abstand an
erster Stelle der Todesursachen. Aufgrund von Herzkrankheiten beträgt die jährliche
Durchschnittsmortalität bei Personen mit Typ 2 Diabetes 5,4 Prozent und ist doppelt
so hoch wie bei altersgleichen Nichtdiabetikern. Die Lebenserwartung für Typ 2
Diabetiker ist deshalb im Schnitt um 5 bis 10 Jahre vermindert.
Nach den Daten der Augsburger MONICA-Studie [17] ist die Inzidenz des
Myokardinfarktes bei Männern mit Diabetes mellitus 3,7fach (95 Prozent CI 3,5 bis
3,9) und bei diabetischen
Frauen 5,9fach (95 Prozent CI 5,5 bis 6,4) erhöht im Vergleich zu Nichtdiabetikern.
In der Paris Prospective Study [17] betrug die Prävalenz der koronaren
Herzerkrankung bei Typ 2 Diabetikern ca. 40 Prozent für Männer und ca. 45 Prozent
für Frauen. Das Risiko für eine koronare Herzerkrankung nimmt sowohl bei
Patienten mit Typ 1 als auch mit Typ 2 Diabetes mit der Länge der Diabetesdauer zu.
Die Prävalenz einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK), definiert als
Knöchel-Arm-Dopplerindex weniger als 0,9, beträgt bei Patienten mit Diabetes
mellitus
20,9 Prozent, bei Personen ohne Diabetes mellitus 7,0 Prozent [17]. In einer
deutschen Studie liegt die Prävalenz bei Patienten mit Diabetes mellitus aller
Altersklassen bei 15,9 Prozent, wobei ein eindeutiger Alterstrend besteht [17]. Bei
asymptomatischen Diabetikern nach dem 40. Lebensjahr beträgt die Prävalenz über
20 Prozent. Die Inzidenz liegt zwischen 12,6 und 21,3 pro 1000 Patientenjahre für
Männer und zwischen 8,4 und 17,6 pro 1000 Patientenjahre für Frauen [17].
Nach den Ergebnissen der Framingham und der Honolulu Heart Study ist die
Inzidenz von Schlaganfällen bei Diabetikern um den Faktor zwei bis drei gesteigert
[48].
Die Apoplexinzidenz liegt für Männer bei 62,3 pro 1000 Patienten mit Diabetes
mellitus. Bei Patienten mit entweder Typ 2 Diabetes oder erhöhtem
Nüchternblutzucker liegt die Prävalenz hochgradiger Karotisstenosen bei 8,2 Prozent
[17].
12
2.1.5.2 Mikroangiopathie
Zu den mikroangiopathischen Veränderungen werden folgende
Erkrankungen/Symptomenkomplexe gezählt:
- Glomerulosklerose
- Retinopathie
- Neuropathie
- Mikroangiopathie der intramuralen kleinen Koronararterienäste (small vessel
disease)
Als diabetische Mikroangiopathie bezeichnet man das weitgehend
diabetesspezifische,
sogenannte renale-retinale Syndrom [17]. Prinzipiell ist aber kein Kapillargebiet
ausgespart. An den Folgen gemessen dominieren jedoch die Kapillargebiete im
Augenhintergrund und in den Nierenglomerula. Die Mikroangiopathie wird auch bei
der Neuropathie des vegetativen Nervensystems als ein ätiopathogenetischer Faktor
diskutiert. So tritt die autonome diabetische Neuropathie (ADN) neben dem
Gastrointestinaltrakt, dem Urogenitalsystem und der Thermoregulation auch im
kardiovaskulären System auf. Kardiovaskuläre ADN sind bei ca. 15% der Diabetiker
zum Zeitpunkt der Diagnosestellung zu beobachten, nach 20jähriger Krankheitsdauer
sogar bei >50%. Die ADN können sich in einer stummen Myokardischämie sowie
schmerzlosen Myokardinfarkten äußern, die in diesem Zusammenhang zu einer
erhöhten Mortalität führen können. Weiterhin lässt sich bei Patienten, die von einer
kardiovaskulären ADN betroffen sind, eine verminderte Herzfrequenzvariabilität bis
hin zur Frequenzstarre beobachten (z.B. im EKG, während max. In- und Exspiration
während Valsalva-Pressversuch, während eines Orthostasetests). Darüber hinaus
können die Patienten sowohl eine Ruhetachykardie als Ausdruck einer
Vagusschädingung durch die ADN als auch eine asympathikotone orthostatische
Hypotonie als Ausdruck einer Sympathikusschädigung aufweisen. In diesem Fall
sinkt der systolische bzw. diastolische Blutdruck bei einer Stehbelastung ab, wobei
zusätzlich die reflektorische Tachykardie ausbleiben kann. Zuletzt kann auch eine
aufgehobene oder umgekehrte zirkadiane Blutdruckkurve mit erhöhten nächtlichen
Werten ein Hinweis auf die ADN sein ([25], [28]).
13
2.1.6 Antihyperglykämische Behandlung des Diabetes mellitus Typ II mit Metformin
Neben den nicht-pharmakologischen Therapiemaßnahmen (Ernährungs- und
Bewegungstherapie), die in jeder Phase der Erkrankung eine große Rolle spielen,
kommen in der Behandlung des Diabetes mellitus Typ II medikamentöse
antihyperglykämische Therapiemaßnahmen zum Einsatz. Diese werden je nach
pathophysiologischem Stadium der Erkrankung ausgewählt. In den Leitlinien der der
Deutschen Diabetes Gesellschaft wird ein HbA1c-Zielwert von <6,5% angestrebt, als
Interventionsgrenze wird ein Wert von >7% vorgeschlagen [22].
Der HbA1c-Wert sollte in der Regel einmal pro Quartal bestimmt werden, um eine
mittel- bis langfristige Therapie-Überwachung zu gewährleisten [1]
2.1.6.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik
Metformin ist das einzige Biguanid, das in Deutschland als orales Antidiabetikum
eingesetzt wird [1] und wurde schon vor mehr als 40 Jahren in die Diabetestherapie
eingeführt. Es wirkt nur bei Diabetikern blutglukosesenkend, nicht bei
Stoffwechselgesunden.
Metformin verbessert die Diabeteseinstellung durch Verminderung der
Insulinresistenz vorwiegend an der Leber und zusätzlich im Bereich der Muskulatur,
während die pankreatische Betazellsekretion nicht gesteigert wird [38]. Daher kann
es nur wirken, wenn Insulin vorhanden ist. Es ist allerdings unklar, ob die Reduktion
der hepatischen Glukoseproduktion durch Metformin - v.a. durch die Hemmung der
Gluconeogenese bedingt – oder der erhöhte Glucoseverbrauch in der
Skelettmuskulatur zum blutglucosesenkenden Effekt beitragen.
Metformin hat aber nicht nur einen antihyperglykämischen Effekt. Bei Diabetikern
und adipösen Nicht-Diabetikern führt es zu einer Reduktion der freien Fettsäuren und
der Lipidoxidationsrate [38]. Zusätzlich hat Metformin einen antithrombotischen
Effekt durch einen Abfall von PAI-1 im Plasma.
In den Hepatocyten wirkt Metformin als Kation, das die Plasmamembran und die
innere Mitochondrienmembran passiert. Dort bewirkt es eine mäßige Hemmung der
Atmungskette, was zu einem Anstieg der AMP-Konzentration im Zytosol führt.
AMP stimuliert in der Folge die AMP-aktivierte Protein-Kinase, die Enzyme hemmt,
14
die an der Produktion von Glucose und Triglyceriden beteiligt sind. Darüber hinaus
wird die Expression von Genen gehemmt, die bei der Lipidsynthese eine Rolle
spielen. Durch diese Produktonshemmung werden die Glucose- und
Triglyceridspiegel im Plasma gesenkt.
Metformin wird langsam und vollständig resorbiert. Es zeigt eine Bioverfügbarkeit
von 50-60%, da es nicht metabolisiert und unverändert renal eliminiert wird. Die
Plasma-Halbwertzeit beträgt 1,5-4 Stunden. Akkumulationen werden für die
Speicheldrüsen, den Darm, die Leber und die Nieren beschrieben. Im Gegensatz zur
sofortigen Wirkung von Sulfonylharnstoffen setzt der blutzuckersenkende Effekt von
Metformin erst nach einigen Applikationstagen ein.
2.1.6.2 Indikation
Eine Indikation für die Gabe von Metformin besteht bei übergewichtigen Patienten
(BMI >25 bis 27 kg/m²) mit Diabetes mellitus Typ 2, bei denen ein Therapieversuch
mit Gewichtsabnahme und Diät nicht zum Erreichen der HbA1c-Zielwerte führt [58].
Die durchschnittliche Blutglukosesenkung um 20% ist allerdings nicht auf
übergewichtige Patienten beschränkt, sondern wird auch bei Patienten mit normalem
Körpergewicht (BMI 24 bis 25 kg/m²) beobachtet.
Darüber hinaus zeigt die UKPDS, dass Metformin sowohl die Häufigkeit
mikrovaskulärer als auch (im Gegensatz zu Glibenclamid) makrovaskulärer
Komplikationen signifikant senkt [1]. Dazu gehören Ereignisse wie Apoplex,
koronare Ereignisse und diabetesbezogener Tod. Dem gegenüber senken
Glibenclamid und Metformin den HbA1c-Wert in vergleichbarer Weise. Daraus
kann der Schluss gezogen werden, dass der Effekt von Metformin auf die
Entwicklung makrovaskulärer Komplikationen nicht mit der Blutglucosesenkung
erklärt werden kann. Die vorteilhafte Änderung der Blutlipide sowie der
antithrombotische Effekt von Metformin treten bei dieser Fragestellung daher in den
Vordergrund.
Zusammenfassend dürfte der in der UKPDS nachgewiesene vasoprotektive Effekt
von Metformin darauf zurückzuführen sein, dass diese Substanz mehrere der
bekannten Risikofaktoren für Arteriosklerose günstig beeinflusst:
1) Hyperglykämie
15
2) Dyslipidämie
3) Gerinnungsstörungen
4) endotheliale Dysfunktion [32]
Tabelle 2-4: Effekte von Metformin auf Komponenten des Insulinresistenzsyndroms [22]
Berichtete Effekte Änderung gegenüber Ausgangswert Bereich
%
Effekt auf die Diabeteseinstellung Nüchternblutglukose (mmol/l) � 2-4 � 20-30 Postprandiale Blutglukose (mmol/l)
� 3-6 � 30-40
HbA1c (%) � 1-2 � 10-25 Effekte auf Insulinspiegel
Nüchternplasmainsulinspiegel (µU/ml)
� 0-3,5 � 0-20
Effekte auf Lipidstoffwechsel Serumtriglyceride (mmol/l) � 0-0,10 � 0-30 Serumcholesterin (mmol/l) � 0-0,35 � 0-10 Serum-LDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-1,00 �0-25 Serum-VLDL-Cholesterin (mmol/l)
� 0-0,60 �0-39
Serum-HDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-0,16 � 0-17 Freie Fettsäuren (mmol/l) �0-0,15 �0-14 Effekt auf vaskuläre und Hämostaseparameter
Blutdruck (mmHg) Keine Änderung Keine Änderung PAI-1-Spiegel (ng/ml) � 10-15 � 10-45 Peripherer Blutfluss ml/100ml Gewebe /min
� 0-1,0 � 0-25
Effekt auf das Körpergewicht (kg) � 0-4 � 0-6 Schwere hypoglykämische Episoden Monotherapie
Vernachlässigbar Vernachlässigbar
2.1.6.3 Unerwünschte Wirkungen und Kontraindikationen
Am Anfang einer Behandlung mit Metformin treten nicht selten gastrointestinale
Nebenwirkungen (Übelkeit, Magendruck, Flatulenz, Diarrhoe, metallischer
Mundgeschmack) auf [22]. Die gefährlichste unerwünschte Wirkung von Metformin
ist allerdings die Lactatazidose. Die Inzidenz beträgt nach DDG-Leitlinie 0-
0,084/1000 Patientenjahre, wobei die meisten Beroffenen eindeutige
16
Kontraindikationen für Metformin aufweisen. Die Letalität dagegen ist dreifach
geringer [22].
Kontraindiziert ist Metformin bei Patienten mit [1]
- eingeschränkter Nieren- und Leberfunktion (Grenzwert Serumkreatinin: 1,2
mg/dl)
- Pankreatitis
- Alkoholismus
- Azidotischer Stoffwechselstörung
- Hypoxischen Zuständen
- Schwerer kardiovaskulärer Funktionseinschränkung
- Konsumierenden und fieberhaften Erkrankungen
- Reduktionsdiät (< 1000kcal/d)
- Zustand vor, während oder nach einer Operation
- Bevorstehender Röntgenuntersuchung (mit i.v. Kontrastmittel)
- Hohem Lebensalter
- Schwangerschaft [1]
Zusammenfassend lässt sich anführen, dass Metformin trotz der relativ großen
Anzahl an Kontraindikationen verschiedene Vorteile aufweist. Als nicht-beta-
zytotrop wirkendes Medikament führt es in geringem Maß zu hypoglykämischen
Zuständen und kann eine Gewichtszunahme (besonders relevant für adipöse
Patienten) verhindern. Auch andere Komponenten des metabolischen Syndroms (z.B.
Lipidparameter) werden können durch Metformin günstig beeinflusst werden.
17
3. Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
In der nachfolgend beschriebenen Versuchsreihe wird das Modell der „Zucker-
Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte) verwendet. Die bei Versuchsbeginn vier Monate
alten Tiere hatten zu Beginn der Versuchsreihe ein Körpergewicht zwischen 230 und
620g. Sie waren einer Raumtemperatur zwischen 21 und 24 °C ausgesetzt. Die
relative Luftfeuchtigkeit betrug in der Tierversuchsanlage betrug zwischen 45 und
60%. Aufgrund einer automatischen Lichtanlage konnte den Tieren ein künstlicher
Tag-Nacht-Rhythmus auferlegt werden (Licht an: 6 Uhr, Licht aus: 18 Uhr). Wasser
und Futter in Form eine Niedrigfett-Diät (4,5g/100g der Provimi Kliba/Nafag
Nr.3433, Kaiseraugst, Schweiz) erhielten die Versuchstiere ad libitum [6].
3.2 Tiermodell
Die männliche ZDF-Ratte stellt ein klinisch relevantes Tiermodell für die
Untersuchung des nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) des
Menschen dar. Demnach weisen alle männlichen Ratten, die über neun Wochen alt
sind, Blutzuckerwerte von 200-400mg/dl auf und erfüllen damit die Kriterien für
einen Diabetes mellitus Typ 2 [43].
Die ZDF-Ratte wurde durch partielle Inzucht aus dem Stamm der Zucker-Ratten
(fa/fa) herausgezüchtet. Diese fa-Mutation wurde 1965 vom Ehepaar Zucker
beschrieben. Die autosomal-rezessiv vererbte Mutation beruht auf einer Veränderung
des Leptin-Rezeptors (fa), die bei homozygoten männlichen Tieren (fa/fa) zu
Hyperphagie, Hyperlipidiämie, Adipositas und nur leicht verminderter
Glucosetoleranz führt [43]. Die fa-Mutation des Leptinrezeptors bewirkt eine
Verkürzung des Rezeptors und in der Folge dessen ungenügende
Interaktionsmöglichkeit mit Leptin. Die daraus resultierenden erhöhten Leptinspiegel
im Blut verursachen die oben beschriebene Adipositas der fa/fa-mutierten
männlichen Ratten. Immer wieder trat jedoch auch ein männlicher Phänotyp mit
stark übergewichtigen männlichen Ratten auf, die sowohl sehr hohe Glukosespiegel
als auch eine gestörten Glukosetoleranz aufwiesen. Diese, ausschließlich männliche
18
Tiere betreffende Spontamuntation, wurde mit normalgewichtigen Zucker Ratten
(+/fa) gepaart, die ein hohes diabetisches Potential in sich trugen. Es handelte sich
dabei fast ausschließlich um Bruder x Schwester Inzucht. Bereits ab der zweiten
Generation konnte ein konstanter Phänotyp herausgezüchtet werden, bei dem der
Diabetes monogenetisch determiniert ist und autosomal nur an männliche
Nachkommmen weitervererbt wird. In der Folge zeigten diese Tiere neben erhöhten
HbA1c-Plasmaspiegeln eine Proteinurie, Hypercholesterinämie,
Hypertriglycerinämie sowie vermehrt freie Fettsäuren im Blut. Weitere Merkmale
dieser männlichen Rattengeneration waren eine Neuropathie und diabetische
Nephropathie sowie Hinweise auf ein gestörte Wundheilung und einen milden
Hypertonus ([43], [8]).
Die weiblichen Nachkommen bilden trotz Fettleibigkeit und Insulinresistenz keinen
Diabetes aus [8]. Bei einer speziellen Diät (RD 13004 von Research Diets)
entwickeln jedoch auch weibliche Tiere einen Diabetes mellitus im Alter von sechs
bis 25 Wochen.
Tiere, die heterozygot für die Mutation im fa-Gen (ZDF-lean fa/+) sind oder dem
Wildtyp entsprechen, entwickeln keinen Diabetes und stellen in diesem Versuch die
Kontrollgruppe dar.
3.3 Studiendesign
Die Tiere wurden randomisiert in sechs Versuchsgruppen aufgeteilt.
Um Aussagen über den Zustand der Tiere vor einer Behandlung (bezüglich der
histologischen Parameter im Myokard und der Aorten) treffen zu können, wurden
jeweils 10 Tiere der ZDF-fatty- und ZDF-lean-Gruppe in ihrer 10. Lebenswoche
untersucht. Die verbleibenden ZDF-fatty-Tiere wurden anschließend randomisiert in
drei Gruppen aufeteilt. Eine Gruppe à 10 Tiere erhielt im Laufe der nächsten 16
Wochen ein Placebo-Präparat, die zweite Gruppe à 10 Tiere wurde auf Metformin
(Dosis: 150 mg/kg/24Std. im Futter) eingestellt. Der dritten Gruppe à 10 Tiere wurde
EMD387008 (Dosis: 200 mg/kg/24Std.) verabreicht.
Es ergibt sich die folgende Aufteilung der Gruppen:
19
1. ZDF-lean, unbehandelt, Versuchsende nach 10 Wochen (n=10)
2. ZDF-fatty, unbehandelt, Versuchsende nach 10 Wochen (n=10)
3. ZDF-L-P, behandelt mit Placebo-Präparat Woche 10-26, Verauchsende nach
26 Wochen (n=9)
4. ZDF-F-P, behandelt mit Placebo-Präparat Woche 10-26, Versuchsende nach
26 Wochen (n=9)
5. ZDF-F-Met, behandelt mit Metformin Woche 10-26, Versuchsende nach 26
Wochen (n=10)
6. ZDF-F-EMD, behandelt mit EMD387008 Woche 10-26, Versuchsende nach
26 Wochen (n=10)
Für die biochemischen Parameter und Größen-/Gewichtangaben der Tiere waren die
Gruppen zumeist vollzählig (10/Gruppe). Allerdings ist anzumerken, dass die
Gruppe ZDF-L-P durchgehend Werte von neun Tieren enthält. Standen für die
Statistik bei einzelnen Parametern in verschiedenen Gruppen weniger Tiere zur
Verfügung, so wird dies im Ergebnisteil in den jeweiligen Wertetabellen gesondert
vermerkt.
Nach zehnwöchiger Versuchsdauer wurden jeweils 10 Tiere der Gruppen ZDF-fatty
und ZDF-lean einer retrograden Perfusionsbehandlung unterzogen und die Herzen
zur späteren Untersuchung entnommen. Für die restlichen Gruppen endete das
Experiment nach einer 16-wöchigen Behandlung im Alter von 26 Wochen mit der
retrograden Perfusionsfixation der Organe.
Ziel des Versuchsaufbaus ist ein Vergleich der kardialen Schädigungen der mit EMD
387008 behandelten ZDF-fatty-Rats mit
- der ZDF-F-Met-Gruppe
- der placebokontrollierten ZDF-F-P-Gruppe
20
bezüglich ihrer physiologischen, biochemischen und histologischen Parameter.
Darüber hinaus werden in der vorliegenden Arbeit die ZDF-lean-Gruppe mit der
ZDF-L-P-Gruppe sowie die ZDF-fatty-Tiere mit den ZDF-F-P-Tieren verglichen, um
eine Verlaufsbeurteilung möglich zu machen. Schließlich werden die ZDF-F-P-Tiere
mit der ZDF-F-Met-Gruppe im Hinblick auf ihre physiologischen, biochemischen
und histologischen Parameter verglichen.
Die unbehandelten Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty wurden ausschließlich
histologisch untersucht.
3.4 Perfusionsfixation
Die retrograde Perfusion über die Aorta abdominalis wird nach einem
Standardverfahren durchgeführt ([2], [31], [36]). Durch dieses Verfahren ist
gewährleistet, dass auch die sehr kleinen Gefäße in ihrem in vivo existenten
Füllzustand fixiert werden. Somit erscheinen die Gefäße im histologisch
aufgearbeiteten Gewebe nicht kollabiert oder dilatiert.
Die Vollnarkose der Tiere erfolgt hierbei nach einer Vornarkotisierung (Äther) mit
einem Gemisch aus 0,4ml Rompun® 2% und Ketavet® (Konzentration: 100mg/kg).
Dazu werden die beiden Medikamente mit 2 ml NaCl 0,9% verdünnt und den Tieren
pro 10g Körpergewicht ca. 0,1 ml dieser Lösung i.m. injiziert. Danach werden die
Abdominalhöhle und der Retroperitonealraum eröffnet sowie die Aorta abdominalis
dargestellt und katheterisiert. Nach Abklemmung des proximalen Abschnitts der
Aorta abdominalis und einer Längsinzision des Gefäßes erfolgt die Spülung des
Gefäßsystems (2min) mittels einer Dextranlösung (Rheomacrodex®, 40%ig) unter
Zusatz von 2%igem Novocain. Dextran verhindert hierbei die Ausbildung eines
interstitiellen Ödems und intravasaler Thromben [51].
Nach 10 sec. erfolgt schließlich eine Inzision der Vena cava inferior mit dem Zweck
der Blutdrainage. Das Gefäßsystem wird danach zunächst mit 0,9% NaCl gespült,
anschließend bei einem Perfusionsdruck von 110 mmHg mit 3%igem Glutaraldehyd
in 0,2 molarer Phosphatpufferlösung perfundiert und damit fixiert.
Die daraufhin in 3%igem Glutaraldehyd und 0,2 molarer Phosphatpufferlösung
gelagerten Herzen werden gewogen und im Pathologischen Institut der FAU
Erlangen-Nürnberg weiter aufgearbeitet (vgl. Kap.3.5.2.1)
21
3.5 Gewebeaufbereitung
3.5.1 Orientator
Die Struktur von Gewebe oder Organen zeigt einen unterschiedlichen Aufbau.
Anisotropes Gewebe (z.B. Skelettmuskulatur, Nervenfasern) zeichnet sich dadurch
aus, dass darin enthaltene Strukturn (z.B. Fasern oder Zellen) eine bestimmte
Vorzugsrichtung aufweisen. Isotropes Gewebe (z.B. Leber oder Lunge) besitzt im
Gegensatz dazu keinerlei festgelegte Ausrichtung oder Orientierung. Die Struktur
des Myokards ordnet man zwischen den Extremen Isotropie und Anisotropie ein und
bezeichnet es als partiell anisotropes Gewebe ([35], [36], [37]). Somit sind die
Strukturen des Herzmuskels einerseits gerichtet angeordnet, andererseits verändert
sich die Richtung der Hauptanordnung (z.B. der Herzmuskelzellen oder –fasern) im
räumlichen Gefüge.
Das Orientatorverfahren stellt nun eine Möglichkeit dar, aus partiell anisotropem
Gewebe zufällige, streng isotrope Schnitte zu gewinnen. Damit entstehen
mathematisch exakte, reproduzierbare Ergebnisse ([35], [36]). Die Schnittführung
der mit dem Orientator gewonnenen histologischen Präparate ist in Bezug auf alle
drei Freiheitsgrade des Raumes absolut zufällig (s. Abbildung 3-1)
Abbildung 3-1: Freiheitsgrade der Orientatormethode zur Gewährleistung einer zufälligen
Schnittführung [17]
22
3.5.2 Herstellung mikroskopische Präparate
3.5.2.1 Aufbereitung Herz
Die Präparation des Herzens erfolgt nach dem sog. systematic random sampling [37].
Zunächst werden die Ventrikel von den Vorhöfen und anschließend der rechte vom
linken Ventrikel getrennt. Daraufhin wird das linksventrikuläre Gewicht bestimmt.
Nach dem Wiegen wird der linke Ventrikel in longitudinaler Richtung durchtrennt
und eine der beiden entstandenen Hälften zufällig ausgewählt. Diese wird nun in
Querrichtung (Schnittrichtung parallel zur Ebene der Herzklappen) in 1-2 mm dicke
Streifen gestückelt. Zwei von den so entstandenen Streifen werden wiederum zufällig
ausgewählt und im Orientatorverfahren weiter verwendet.
3.5.2.2 Zuschnitt Präparate
Die beiden so gewonnenen Streifen werden frei in einem durchsichtigen
Agarzylinder (0,3mg Agar auf 100ml Aqua dest.) eingebettet. Durch die zufällige
Lagerung des Gewebestreifens im Agar bestimmt man den ersten Freiheitsgrad. Der
zweite Freiheitsgrad ergibt sich durch die zufällige Lagerung des Agarzylinders auf
der Schnittunterlage (Polarkoordinatenpapier). Den dritten Freiheitsgrad erhält man,
indem man vier Schnitte durch den Myokardstreifen vornimmt. Der Agarzylinder
wird dabei zentral auf einen Winkelkreis aufgelegt und der Myokardstreifen nach
zufälligen Winkeln zugeschnitten. Durch dieses Vorgehen erhält man pro
Myokardstreifen je vier und damit insgesamt acht etwa 0,5 mm dicke
Myokardproben pro Tier. Gelagert werden die Proben wiederum in Glutaraldehyd.
3.5.2.3 Herstellung mikroskopischer Präparate - Semidünnschnitttechnik
Die Gewebeproben werden, nachdem sie vom restlichen Glutaraldehyd befreit sind,
in Sörensenpuffer (pH 7,2-7,4), gewaschen und danach in 1%iger
Osmiumtetroxidlösung nachfixiert. Daraufhin erfolgt die stufenweise Dehydrierung
23
des Gewebes in einer aufsteigenden Isopropanolreihe. Nach Einbettung des Gewebes
für einige Stunden in Epon-Araldit folgt die Aushärtungsperiode (18-20 Stunden bei
70 °C im Brutschrank). Schließlich werden die Eponblöcke angetrimmt und
semidünn (ca. 0,25µm) geschnitten (Rotations-Mikrotom, Leica RM 2145, Wetzlar,
Deutschland). Nach einer Hitzefixierung erfolgt letztlich die Färbung der Schnitte
mit basischem Fuchsin und Methylenblau.
3.5.2.4 Aufbereitung der Aorten
Die Aorten der jeweiligen Tiere werden aus ihrem Ursprung am linken Vorhof
vorsichtig frei präpariert, um in einem definierten Abstand (1cm Entfernung vom
Aortenkopf) senkrecht zur Longitudinalachse ein ca. 1mm dickes Stück entnehmen
zu können. Dieses wird entsprechend den Myokardproben dehydriert, in Epoxidharz
eingebettet, zu ca. 1µm dicken Semidünnschnitten verarbeitet sowie mit
Methylenblau und Fuchsin gefärbt.
3.6 Morphometrie und Stereologie
Unter Morphometrie (griech.: Messung der Gestalt) und Stereologie (griech.:
Messung des Raumes) versteht man ein Verfahren, um Gewebsveränderungen
quantitativ und möglichst unabhängig vom individuellen Betrachter zu erfassen. Mit
diesen Methoden ist es möglich, Rückschlüsse auf die räumliche Verteilung im
dreidimensionalen Raum nach einer Untersuchung der Strukturen im
zweidimensionalen Raum (z.B. im Semidünnschnitt) zu ziehen.
3.6.1 Messverfahren
3.6.1.1 Integrationsplatte
Um die Punktedichte der myokardialen Strukturen bestimmen zu können, wird eine
Integrationsplatte (Firma Zeiss, Hamburg, Deutschland) verwendet. Die
24
Integrationsplatte ist ein quadratisches Gitter mit 121 Schnittpunkten, welches als
Bestandteil des Okulars in einem binokularen Mikroskop (BH-2, Fa. Olympus,
Hamburg, Deutschland) in den Strahlengang eingebracht wird. Das hat zur Folge,
dass die Gitterpunkte auf den Objektträger mit dem mikroskopischen Präparat
projiziert werden können. Bei einer Endvergrößerung von 1:000 werden die
Semidünnschnitte unter Verwendung von Immersionsöl mäanderförmig abgefahren.
Es wird nach dem sog. Punktezählverfahren vorgegangen. In jedem fünften
Gesichtsfeld werden die interessierenden Strukturen gezählt, die genau unter einem
Schnittpunkt liegen. Dabei durften nur die Strukturen in die Zählung eingehen, die
von der oberen rechten Seite eines Gitterpunktkreuzes getroffen werden (s.
Abbildung 3-2).
Abbildung 3-2: Detailvergrößerung aus der Integrationsplatte. Nur graue Kapillaren dürfen
gezählt werden; schwarze Kapillaren gehen nicht in die Berechnung ein [17].
Insgesamt werden 8 Gesichtsfelder pro Semidünnschnitt ausgezählt.
Fällt einer der 100 Gesamtpunkte auf eine zu untersuchende Struktur, so ergibt sich
für diese Struktur eine statistische Punktedichte von 1%. Die Punkte, welche nicht
auf dem Gewebe liegen, werden als sog. Artefakte von der Gesamtpunktezahl 100
abgezogen.
Durch die Anwendung der Regel nach Grundersen (1988) kann verhindert werden
dass Strukturen doppelt gezählt werden. Es werden von den Strukturen, die auf den
Rand der Integrationsplatte fallen, nur die der oberen und rechten Kante gezählt,
nicht aber die, die auf dem unteren oder linken Rand zum Liegen kommen (s.
Abbildung 3-3)
25
Abbildung 3-3: Abbildung der gesamten Integrationsplatte. Nur graue Kapillaren dürfen
gezählt werden; schwarze Kapillaren gehen nicht in die Berechnung ein [17].
Um die Längendichte Lv bestimmen zu können, muss die Größe der Fläche bekannt
sein, in der die gezählten Strukturen liegen. Dazu wird die Kantenlänge der
Integrationsplatte in der jeweiligen Mikroskopeinstellung mit einem
Messobjektträger der Firma Zeiss, Oberkochen bestimmt und daraus die Fläche des
Quadrates berechnet.
3.6.1.2 Bildanalyseverfahren
Die Auswertung der intramyokardialen Arteriolen und Aorten wird an einem
computergekoppelten binokularen Mikroskop (BX 60, Firma Olympus, Hamburg,
Deutschland) durchgeführt. Die Ausmessung der Arteriolen und Aorten erfolgt
mittels des halbautomatischen Bildanalysesystems Analysis (Firma Soft-Imaging,
Münster, Deutschland) und dessen Nachfolgeprogramm Cell P (Firma Soft-Imaging,
Münster, Deutschland). Dafür wird der mikroskopische Schnitt mit einer Kamera
(Colorview 12, Firma Olympus, Hamburg, Deutschland) in ein digitales Bild
umgewandelt. Anschließend können die Strukturen (Abstände, Flächen etc.) mittels
Mousecoursor bei einer 400fachen Vergrößerung histologisch vermessen werden.
26
3.6.2 Volumendichte (Vv)
Als Volumendichte wird der Volumenanteil einer bestimmten Gewebestruktur pro
Einheitsvolumen bezeichnet. Dabei gilt folgender Zusammenhang:
Pp (%) = Aa (%) ([21], [23])
Pp (%) = Aa (%) = Vv (%) [11]
Die Flächendichte Aa entspricht der Fläche der zu messenden Strukturen pro
Einheitsfläche.
Die Volumendichte (Vv) entspricht wiederum der Punktedichte (Pp) der
auszuwertenden Struktur. Letztere wird am mikroskopischen Schnitt mittels der
Integrationsplatte bestimmt. Sie ist die Anzahl der Punkte eines Messgitters, die sich
pro Anzahl der Gesamtpunkte auf die zu messenden Strukturen projizieren. Somit
werden Volumendichte (Vv) sowie Punktedichte (Pp) und Flächendichte (Aa) in
Prozent angegeben.
Die Volumendichte wird an den Myokard-Semidünnschnitten für Kapillaren,
Interstitium gesamt, Bindegewebe und Fibroblasten bestimmt
3.6.3 Längendichte (Lv)
Als Längendichte bezeichnet man die Gesamtlänge einer bestimmten Struktur in
einem definierten Myokardvolumen. Sie wird in [mm/mm³] angegeben. Indem
mittels Orientatorverfahren isotrope Schnitte aus dem partiell anisotropen
Myokardgewebe geschaffen werden, findet folgendes Prinzip hier seine Anwendung:
Lv = 2xQa ([59], [60])
Die Querschnittsdichte Qa (1/mm²) entspricht der Anzahl der Anschnitte bestimmter
Strukturen pro Einheitsfläche.
Die Längendichte wird an den Myokard-Semidünnschnitten für die Kapillaren
bestimmt.
27
3.6.4 Interkapilläre Distanz (ICD)
Die interkapilläre Distanz beschreibt den durchschnittlichen Abstand zwischen zwei
Kapillaren und wird in [µm] angegeben. Hierbei gilt folgender Zusammenhang nach
Henquell et Honig [24]:
3.6.5 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Parameter
Mittels der computergestützten Bildanalysesysteme Analysis und Cell P werden alle
in den Semidünnschnitten bei 400facher Vergrößerung auffindbaren Arteriolen
vermessen, die einen Innendurchmesser D(Lu) zwischen 10µm und 100µm
aufwiesen. Es werden folgende absolute Messwerte bestimmt (s. Abbildung 3-4):
- Lumendurchmesser D(Lu)
- Äußerer Gefäßdurchmesser D(G)
Da die Gefäße nie exakt orthograd angeschnitten werden und sich bei einem
schrägen Anschnitt die Mediadicke vergrößert, nimmt man als Lumendurchmesser
den kleinsten Innendurchmesser und als äußeren Gefäßdurchmesser den kleinsten
Außendurchmesser (s. Abbildung 3-4).
Aus diesen beiden Messgrößen lassen sich wiederum weitere Werte bestimmen:
Mediadicke D(M), wobei gilt: D(M) = (D(G) – D(Lu)) / 2
Lumenfläche A(Lu), wobei gilt: A(Lu) = π / 4 x D(Lu)²
Mediafläche A(M), wobei gilt: A(M) = A(G) – A(Lu) und
A(G) = π / 4 x D(G)²
28
Abbildung 3-4: Schematische Darstellung eines Gefäßanschnitts [17]
3.6.6 Intramyokardiale Arteriolen – relative Parameter
Aus den oben beschriebenen absoluten Parametern werden folgende relative
Parameter berechnet:
- Mediadicke / Lumendurchmesser
- Mediadicke / Lumenfläche
- Mediafläche / Lumenfläche
3.6.7 Aorta – absolute und relative Parameter
Ähnlich wie bei den intramyokardialen Arteriolen werden bei bestimmten Tieren aus
fünf Gruppen die Semidünnschnitte der Aorta thoracica untersucht:
ZDF-lean: n=4
ZDF-fatty: n=1
ZDF-L-P: n=4
ZDF-F-P: n=4
ZDF-F-Met n=2
29
Hier ist anzumerken, dass sich kein Semidünnschnitt aus der Gruppe ZDF-F-EMD
unter den ausgewerteten Schnitten befunden hat.
Als absolute Messwerte wurden wiederum bestimmt:
- Aortaler Lumendurchmesser aD(Lu)
- Aortaler Äußerer Gefäßdurchmesser aD(G)
Aus diesen beiden Parametern können folgende Werte bestimmt werden:
Aortale Mediadicke aD(M), wobei gilt: aD(M) = (aD(G) – aD(Lu)) / 2
Aortale Lumenfläche aA(Lu), wobei gilt: aA(Lu) = π / 4 x aD(Lu)²
Aortale Mediafläche aA(M), wobei gilt: aA(M) = aA(G) – aA(Lu) und
aA(G) = π / 4 x (aD(Lu) + 2 aD(M))²
Als relative Größen werden ermittelt:
Aortale Mediadicke / aortalen Lumendurchmesser
Aortale Mediafläche / aortale Lumenfläche
Aortale Lumenfläche / Körpergewicht
Aortale Mediafläche / Körpergewicht
30
3.7 Statistik
Die Statistik wird computergestützt mit dem Statistikprogramm SPSS (Version 15.0)
der Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.
Dabei werden die Messwerte auf Normalverteilung und Homogenität getestet. Als
normalverteilt und homogen gelten die Werte, wenn sie in der Darstellung als
Boxplots diesen Kriterien entsprechen.
Liegen weder Normalverteilung noch Homogenität vor, so wird für die
Mehrfachvergleiche zwischen den Gruppen der nicht-parametrische Test nach
KRUSKAL-WALLIS angewandt. Der Unterschied wird als signifikant betrachtet,
wenn der Wahrscheinlichkeitsfehler (p) kleiner als 0,05 ist. Sind die Werte, die in
diesem Test signifikante Unterschiede aufweisen, nach dem o.g. Kriterium
signifikant, werden die einzelnen Gruppen paarweise mit dem nicht-parametrischen
WILCOXON-RANGSUMMENTEST (=U-TEST) verglichen. Der Unterschied wird
auch hier als signifikant betrachtet, wenn der Wahrscheinlichkeitsfehler (p) kleiner
0,05 ist.
Auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty sowie
ZDF-L-P und ZDF-F-P wird in den Tabellen im Ergebnisteil verwiesen, sie werden
jedoch der Übersichtlichkeit halber nicht graphisch dargestellt.
Die Daten dieser Arbeit sind als Mittelwert±Standardabweichung angegeben.
31
4. Ergebnisse
Die Werte der im Folgenden aufgeführten Parameter wurden zum Teil selbst
ermittelt, zum Teil freundlicherweise von der Firma Merck® zur Verfügung gestellt.
Daneben ist zu bemerken, dass die histologischen Parameter von Tieren aller sechs
Gruppen bestimmt wurden, wohingegen die Laborparameter lediglich für die
behandelten vier Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD
vorliegen.
4.1 Allgemeine Parameter
4.1.1 Körper- und Herzgewicht, Körperlänge
Tabelle 4-1: Körper- und Herzgewicht, Körperlänge
ZDF-
lean
ZDF-
fatty
ZDF-L-P
ZDF-F-P
ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Körpergewicht
(g)
265±19,5 350±27
a)
386±22,2
a)
431±57,3
b)
467±92,1 461±110 p<0,001
Herzgewicht
(g)
1,2±0,2 1,3±0,2 1,3±0,1 1,4±0,2 1,5±0,2 1,6±0,3 P<0,05
Gewicht LV
(g)
0,8±0,1 0,9±0,1 0,99±0,1
c)
1,1±0,2 1,2±0,1 1,2±0,2 p<0,001
Gewicht
LV/KG
(mg/g)
3,1±0,5 2,7±0,3
d)
2,6±0,2
d)
2,4±0,3 2,6±0,4 2,6±0,3 P<0,05
Körperlänge
(cm)
21,6±0,6 21,8±0,6
[n=9]*)
23,5±0,4
a)
22,9±0,7
b)
23,3±0,5 22,8±0,4
e)
p<0,001
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-fatty-Gruppe, abweichend für den Parameter
Körperlänge (cm)
32
a) p<0,001 vs ZDF-lean
b) p<0,01 vs ZDF-fatty
c) p<0,01 vs ZDF-lean
d) p<0,05 vs ZDF-lean
e) p<0,05 vs ZDF-F-Met
Abbildung 4-1: Körpergewicht
0
100
200
300
400
500
600
700
ZDF-LEAN ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Kö
rpe
rge
wic
ht
[g]
p<0,001
p<0,01
p<0,001
Zum Versuchsende ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den
Körpergewichten einzelner Gruppen. So weisen die ZDF-F-P- und ZDF-L-P-Tiere
im zeitlichen Verlauf (10.-26. Woche) ein signifikant höheres Körpergewicht auf als
die in der 10. Woche untersuchten fatty- und lean-Tiere. Weiterhin erreichen die mit
Placebo behandelten lean-Tiere ebenfalls ein signifikant höheres Körpergewicht als
die unbehandelten lean-Tiere. Auch zwischen den beiden unbehandelten Tiergruppen
ZDF-lean und ZDF-fatty, die im Vergleich zu den anderen Gruppen lediglich 10
Wochen gelebt haben, kann ein signifikanter Unterschied im Körpergewicht
gemessen werden. Demnach sind die fatty-Tiere signifikant schwerer als die lean-
Gruppe. Das höchste Körpergewicht kann in den beiden fatty-Gruppen gemessen
werden, die mit Metformin bzw. EMD behandelt worden sind, wobei sich hier kein
signifikanter Unterschied zu den ZDF-F-P-Tieren bzw. untereinander zeigt.
33
Abbildung 4-2: relatives linksventrikuläres Gewicht (Gewicht LV/KG)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Ge
wic
ht
LV
+ R
V [
g]
p<0,01
p<0,01
Das auf das Körpergewicht bezogene und damit aussagekräftigere relative
linksventrikuläre Gewicht ist in der Placebo-behandelten lean-Gruppe und in der
unbehandelten fatty-Gruppe signifikant niedriger als bei den unbehandelten lean-
Tieren, die den höchsten Anteil an linksventrikulärem Gewicht bezogen auf das
Körpergewicht tragen.
Abbildung 4-3: absolutes linksventrikuläres Gewicht
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Gew
ich
t L
V [
g]
p<0,01
34
Das absolute linksventrikuläre Gewicht ist in der ZDF-L-P-Gruppe (Woche 26)
signifikant höher als in der lean-Gruppe (Woche 10). Die höchsten Werte können bei
den Tieren festgestellt werden, die mit Metformin bzw. EMD behandelt wurden.
Abbildung 4-4: Körperlänge
20,0
20,5
21,0
21,5
22,0
22,5
23,0
23,5
24,0
24,5
ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Kö
rpe
rlä
ng
e [
cm
]
p<0,001p<0,01
p<0,05
Bei der Messung der Körperlänge der Tiere zeigen die ZDF-L-P-Tiere im zeitlichen
Verlauf signifikant höhere Werte als die lean-Tiere. Auch die ZDF-F-P-Tiere sind
signifikant größer als die früher getöteten fatty-Tiere. Dabei ist zu bemerken, dass
die Placebo-behandelten Tiere 16 Wochen länger gelebt haben als die unbehandelten
Gruppen. Die mit EMD behandelten Tiere sind signifikant größer als die mit
Metformin behandelten, wohingegen das Körpergewicht dieser beiden Gruppen
keinen signifikanten Unterschied aufweist.
35
4.1.2 Parameter des Glucosestoffwechsels
Tabelle 4-2: Parameter des Glucosestoffwechsels
ZDF-L-P ZDF-F-P
ZDF-F-Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Urin-
Glucose
(mg/dl)
34,7±16,2 10144±1367
a)
10226±3225 7834±4222
b)
p<0,001
Serum-
Glucose
(mg/dl)
118±10,2 509±167
a)
436±126 428±164 p<0,001
Serum-
Insulin
(ng/ml)
0,79±0,17 2,58±1,19
a)
5,23±6,7 4,49±3,66
[n=9]*)
p<0,001
HbA1c
(%)
2,23±0,39 5,59±2,07
c)
5,07±1,12 6,06±2,42 p<0,001
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-EMD-Gruppe, abweichend für den Parameter
Serum-Insulin (ng/ml)
a) p<0,001 vs ZDF-L-P
b) p<0,05 vs ZDF-F-Met
c) p<0,01 vs ZDF-L-P
36
Abbildung 4-5: Urin-Glucose-Konzentration
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Uri
n-G
luco
se-K
on
ze
ntr
ati
on
[m
g/d
l]
p<0,05
p<0,001
Bei Versuchsende zeigen sich signifikant niedrigere Urin-Glucose-Spiegel bei den
mit EMD behandelten Tieren im Vergleich zu den Tieren, die mit Metformin
behandelt worden sind. Die mit Placebo behandelten lean-Tiere haben einen – wie
erwartet – signifikant niedrigeren Urin-Glucose-Spiegel als die Placebo-behandelten
fatty-Tiere.
Abbildung 4-6: Serum-Glucose
0
100
200
300
400
500
600
700
800
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Seru
m-G
luco
se-K
on
zen
trati
on
[m
g/d
l]
p<0,001
37
Die Serum-Glucose-Were der Placebo-behandelten lean-Tiere sind erwartungsgemäß
signifikant niedriger als bei den Placebo-behandelten fatty-Tieren. Allerdings kann
hier kein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren, die EMD und denen, die
Metformin erhalten haben, nachgewiesen werden. Man kann jedoch feststellen, dass
im Mittel alle diabetogenen Gruppen (ZDF-F-P, ZDF-F-Met, ZDF-F-EMD) deutlich
über dem Normwert für Glucose im Serum liegen (> 126mg/dl). Die ZDF-L-P-
Gruppe weist im Mittel Werte um 118mg/dl auf, was für eine gestörte
Glucosetoleranz spricht, aber noch nicht für einen manifesten Diabetes.
Abbildung 4-7: Serum-Insulin
0
2
4
6
8
10
12
14
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Seru
m-I
ns
ulin
[n
g/m
l]
p<0,001
Der Serum-Insulin-Spiegel der Placebo-behandelten fatty-Tiere ist signifikant höher
als bei der ZDF-L-P-Gruppe. Der Grund dafür kann die Insulinresistenz der fatty-
Tiere sein, die bei den nicht-diabetogenen lean-Tieren unwahrscheinlich ist.
Zwischen den behandelt Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD gibt es
keine signifikanten Unterschiede.
38
Abbildung 4-8: HbA1c
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Hb
A1
c [
%]
p<0,01
Der HbA1c-Wert als Indikator für einen chronisch erhöhten Blutzucker ist ebenfalls
in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant höher als in der ZDF-L-P-Gruppe. Die Werte
bewegten sich auch in den diabetogenen Gruppen (ZDF-F-P, ZDF-F-Met, ZDF-F-
EMD) im Durchschnitt nicht über der Obergrenze von 6,5%.
4.1.3 Blutfette und Laktat
Tabelle 4-3: Blutfette und Laktat
ZDF-L-P
ZDF-F-P
ZDF-F-Met ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Serum-
Cholesterin
(mg/dl)
126±13,1 224±59,4
a)
270±63,2 243±45,8 p<0,001
Serum-LDL
(mg/dl)
31,5±15,9 39,5±15,3 34,3±13,6 37,8±16,4 n.s.
Serum-HDL
(mg/dl)
43,9±10,6 90,1±23,0
b)
108,3±39,27 97,9±24,0 p<0,001
Serum-
Lactat
(mmol/l)
2,9±0,48 3,95±0,53
a)
5,3±0,63
c)
[n=8]*)
5,39±0,8
c)
p<0,001
39
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-Met-Gruppe, abweichend für den Parameter
Serum-Lactat (mmol/l)
a) p<0,01 vs ZDF-L-P
b) p<0,001 vs ZDF-L-P
c) p<0,001 vs ZDF-F-P
Abbildung 4-9: Serum-Cholesterin
0
50
100
150
200
250
300
350
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Seru
m-C
ho
les
teri
n [
mg
/dl]
p<0,01
Der Serum-Cholesterin-Spiegel ist signifikant höher in der ZDF-F-P-Gruppe als in
der ZDF-L-P-Gruppe. Die fatty-Tiere, die mit EMD behandelt worden sind, zeigen
tendentiell niedrigere Serum-Cholesterinwerte als die mit Metformin behandelten
Tiere. Dieser Unterschied ist nicht signifikant. Jedoch haben alle fatty-Tiere höhere
Cholesterin-Werte als die lean-Gruppe, die als einzige unter dem Normwert von 200
mg/dl blieb.
40
Abbildung 4-10: Serum-HDL
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Se
rum
-HD
L [
mg
/dl]
p<0,001
Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Serum-LDL-Werten der
einzelnen Tiergruppen. Der Serum-HDL-Spiegel ist bei den Placebo-behandelten
fatty-Tieren allerdings signifikant höher als bei den Placebo-behandelten lean-Tieren.
Die höchsten Serum-HDL-Spiegel können bei den Tieren gemessen werden, die mit
Metformin behandelt worden sind. Über dem unteren Grenzwert von 40 mg/dl lagen
im Mittel alle Gruppen.
Abbildung 4-11: Serum-Laktat
0
1
2
3
4
5
6
7
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Se
rum
-La
kta
t [m
mo
l/l]
p<0,001
p<0,001
p<0,01
41
Der Serum-Lactat-Spiegel ist in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant höher als in der
ZDF-L-P-Gruppe. Darüber hinaus können signifikant höhere Serum-Lactat-Werte in
den Gruppen gemessen werden, die mit EMD bzw. Metformin behandelt worden
sind – verglichen mit den placebokontrollierten fatty-Tieren.
4.1.4 Parameter der Nierenfunktion
Tabelle 4-4: Parameter der Nierenfunktion
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Diurese
(ml/24h)
8,76±3,06 125±38,9
a)
85,1±40,7
b)
101±51,5 p<0,001
Urin-Albumin-
Konz. (µg/ml)
61,1±46,2 1914±1221
a)
2271±2480 2973±4099 p<0,001
Urin-Albumin-
Exkretion
(mg/24h)
0,48±0,35 209±106
a)
186±171 233±335 p<0,001
Urin-Crea-
Konz. (µmol/l)
11377±3411 784±284
a)
1631±1444
b)
1813±2246 p<0,001
Urin-Crea-
Ausscheidung
(µmol/24h)
94,6±32,5 89,3±14,3
[n=6]*)
96,2±16,3 92,1±12,2
[n=9]*)
n.s.
Serum-Crea
(µmol/l)
35,7±8,6 28,3±14,3
[n=9]**)
17,4±9,5
[n=9]**)
23,7±13
[n=9]**)
p<0,05
Crea-
Clearance
(ml/min)
2,1±1,3 3±2,5 4,9±2,7
b)
4,1±3,9 p<0,05
Urin-
Albumin/Crea-
Ratio (µg/µg)
0,05±0,02 20,7±9,8
a)
17,2±14,8 25,6±41,6
[n=9]***)
p<0,001
U-Harnstoff-
Ausscheidung
(µmol/24h)
654±200 604±202 664±372 539±423 n.s.
42
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
*) n: Anzahl der Tiere der Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-EMD, abweichend für den
Urin-Crea-Exkretion (µmol/24h)
**) n: Anzahl der Tiere der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD,
abweichend für den Parameter Serum-Crea (µmol/l)
***) n: Anzahl der Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD, abweichend für den Paramater
Urin-Albumin/Crea-Ratio (µg/µg)
a) p<0,001 vs ZDF-L-P
b) p<0,05 vs ZDF-F-P
Die abschließenden Messungen der Urin-Creatinin-Exkretion sowie der Urin-
Harnstoffexkretion ergeben keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen
Gruppen.
Abbildung 4-12: Diurese
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Diu
rese [
ml/
24h
]
p<0,05
p<0,001
Zum Versuchsende scheiden die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe signifikant mehr
Urin/24h aus als die vergleichbare ZDF-L-P-Gruppe. Dagegen scheidet die
Metformin-behandelte Gruppe signifikant weniger aus als die placebokontrollierte
ZDF-F-P-Gruppe.
43
Abbildung 4-13: Urin-Albumin-Konzentration
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Uri
n-A
lbu
min
-Ko
nze
ntr
ati
on
[µ
g/m
l]
p<0,01
Die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe haben eine signifikant höhere Urin-Albumin-
Konzentration als die vergleichbare ZDF-L-P-Gruppe. Die höchsten Urin-Albumin-
Konzentrationen kann in der mit EMD behandelten Gruppe gemessen werden.
Abbildung 4-14: Urin-Albumin-Ausscheidung
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Uri
n-A
lbu
min
-Exk
reti
on
[µ
g/m
l]
p<0,001
Die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe scheiden signifikant mehr Albumin im Urin aus als
die ZDF-L-P-Gruppe. Die größte Albumin-Ausscheidung im Urin zeigt sich bei den
Tieren, die mit EMD behandelt worden sind. Ein signifikanter Unterschied
44
hinsichtlich der Albuminausscheidung ergibt sich bei den behandelten Gruppen
ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD nicht.
Abbildung 4-15: Urin-Creatinin-Konzentration
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Uri
n-C
rea-K
on
ze
ntr
ati
on
[µ
mo
l/l]
p<0,05
p<0,001
Die höchste Konzentration von Creatinin im Urin wird bei den Placebo-behandelten
lean-Tieren gemessen. Diese Werte sind signifikant höher als bei der Placebo-
behandelten fatty-Gruppe. Darüber hinaus weisen die Tiere, die mit Metformin
behandelt sind, eine sinifikant höhere Urin-Creatinin-Konzentration auf als die
placebokontrollierten fatty-Tiere.
45
Abbildung 4-16: Serum-Creatinin
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Seru
m-C
reati
nin
[µ
mo
l/l]
Der höchste Serum-Creatinin-Spiegel als Retentionsparameter werden bei den Tieren
der ZDF-L-P-Gruppe gemessen. Der niedrigste Serum-Creatinin-Spiegel zeigt sich
bei den Tieren, die mit Metformin behandelt wurden. Es gibt keine signifikanten
Unterschiede zu anderen einzelnen Gruppen.
Abbildung 4-17: Creatinin-Clearance
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Cre
ati
nin
-Cle
ara
nce
[m
l/m
in]
p<0,05
Bei der Messung der Creatinin-Clearance ergibt sich ein signifikanter Unterschied
zwischen den Tieren der ZDF-F-P-Gruppe und der ZDF-F-Met-Gruppe. Demzufolge
46
weisen die mit Metformin Behandelten eine signifikant höhere Creatinin-Clearance
auf.
Abbildung 4-18: Urin-Albumin/Creatinin-Ratio
0
10
20
30
40
50
60
70
80
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Uri
n-A
lbu
min
/Cre
a-R
ati
o [
µg
/µg
]
p<0,001
Bei den Tieren der ZDF-F-P-Gruppe kann ein signifikant höheres Verhältnis
zwischen Albumin und Creatinin im Urin nachgewiesen werden. Dieses ergibt sich
aus den bereits erläuterten Werten der Urin-Albumin-Konzentration sowie der Urin-
Creatinin-Konzentration.
47
4.1.5 Elektrolyte
Tabelle 4-5: Elektrolyte
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Serum-
Natrium
(mmol/l)
151±1,6 144±3,4
a)
144±3,7
[n=8]*)
145±3,5 P<0,01
Serum-
Kalium
(mmol/l)
4,68±0,21 4,88±0,41 4,63±0,28
[n=8]*)
4,65±0,26 n.s.
Serum-
Calcium
(mmol/l)
2,72±0,08 2,69±0,11 2,75±0,16
[n=8]*)
2,84±0,11 n.s.
Serum-
Chlorid
(mmol/l)
97,8±1,09 89,5±3,91
a)
88,5±2,51
[n=8]*)
88,9±2,78 P<0,01
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-Met-Gruppe, abweichend für die Parameter
Serum-Natrium, Serum-Kalium, Serum-Calcium und Serum-Chlorid (mmol/l)
a) p<0,01 vs ZDF-L-P
Bei Versuchsende können sowohl bei den Serum-Kalium-Werten als auch den
Serum-Calcium-Werten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen
Gruppen festgestellt werden.
48
Abbildung 4-19: Serum-Natrium
138
140
142
144
146
148
150
152
154
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Seru
m-N
atr
ium
[m
mo
l/l]
p<0,01
Der Natrium-Spiegel im Serum ist bei der ZDF-F-P-Gruppe signifikant niedriger als
bei der ZDF-L-P-Gruppe, die die höchsten Natrium-Spiegel bei Versuchsende
aufweist.
Die EMD-behandelten Tiere haben im Vergleich zu den Metformin-behandelten
Tieren höhere Natrium-Spiegel im Serum. Dieser Unterschied ist nicht signifikant.
Im Schnitt haben die behandelten fatty-Tiere allesamt Natrium-Werte im Serum, die
im Normbereich liegen. In der ZDF-L-P-Gruppe sind die Werte mit durchschnittlich
150,7 mmol/l leicht erhöht.
49
Abbildung 4-20: Serum-Chlorid
82
84
86
88
90
92
94
96
98
100
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Se
rum
-Ch
lori
d [
mm
ol/
l]
p<0,01
Auch die Serum-Chlorid-Spiegel sind in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant niedriger
als bei den Tieren der ZDF-L-P-Gruppe, die die höchsten Serum-Chloridspiegel bei
Versuchsende aufweist. In allen Gruppen liegen die Werte im Normbereich.
4.1.6 Nahrungs- und Trinkmenge
Tabelle 4-6: Nahrungs- und Trinkmenge
ZDF-L-P ZDF-F-P
ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Nahrungsmenge
(g/24h)
12,5±4,58 32,5±10,4
a)
31,6±4,67 34,4±5,21 P<0,001
Wassermenge
(ml/24h)
16,3±4,88 127±43,4
b)
86,5±37,8 107±51,3 P<0,001
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
a) p<0,01 vs ZDF-L-P
b) p<0,001 vs ZDF-L-P
50
4.2 Intramyokardiale Parameter
4.2.1 Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums
Tabelle 4-7: Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums
ZDF-lean ZDF-
fatty ZDF-L-P ZDF-F-P
ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Volumendichte
Fibroblasten
(%)
0,56±0,19
0,41±0,16
0,26±0,04
a)
0,23±0,05
b)
0,31±0,01
0,35±0,03
P<0,01
Volumendichte
Bindegewebe
(%)
2,38±0,26
1,61±0,55
1,05±0,36
c)
0,78±0,25
d)
1,0±0,2
3,17±2,96
e) P<0,001
Volumendichte
Interstitium
gesamt (%)
2,95±0,07
2,02±0,39
1,32±0,41
c)
1,01±0,3
f)
1,31±0,19
1,41±0,01
p<0,001
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
a) p<0,01 vs ZDF-lean
b) p<0,05 vs ZDF-fatty
c) p<0,001 vs ZDF-lean
d) p<0,01 vs ZDF-fatty
e) p<0,05 vs ZDF-F-P
f) p<0,001 vs ZDF-fatty
51
Abbildung 4-21: Volumendichte Fibroblasten
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Vo
lum
en
dic
hte
[%
]p<0,01
p<0,05
Die Volumendichte der Fibroblasten als Marker für Myokardfibrose ist in den
Gruppen, die mit Metformin bzw. EMD behandelt worden sind, nicht signifikant
höher als in den placebokontrollierten bzw. in den unbehandelten Gruppen. Eine
signifikant geringere Volumendichte der Fibroblasten weisen die in der 26. Woche
getöteten ZDF-F-P-Tiere bzw. ZDF-L-P-Tiere im Vergleich mit den ZDF-fatty-
Tieren bzw. ZDF-lean-Tieren (getötet in der 10. Woche) auf. Demnach zeigt die
Gabe von Metformin bzw. EMD keinen signifikanten Effekt auf die
Myokardfibroblasten.
Abbildung 4-22: Volumendichte Bindegewebe
0
1
2
3
4
5
6
7
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Vo
lum
en
dic
hte
[%
] p<0,001
p<0,01
p<0,05
52
Die Volumendichte des Bindegewebes ist in der mit EMD behandelten Gruppe
signifikant höher als in der placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Dies kann ein
Hinweis darauf sein, dass EMD einen Einfluss auf den bindegewebigen Umbau des
Myokards haben kann. Dieser signifikante Unterschied zeigt sich dagegen nicht in
der mit Metformin behandelten Gruppe im Vergleich zur placebobehandelten
Vergleichsgruppe. Die ZDF-F-P-Tiere haben auch hier eine signifikant geringere
Volumendichte des Bindegewebes als die bereits früher getöteten fatty-Tiere. Ebenso
kann eine signifikant geringere Volumendichte des Bindegewebes bei den ZDF-L-P-
Tieren verglichen mit den ZDF-lean-Tieren nachgewiesen werden.
Abbildung 4-23: Volumendichte Interstitium
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Vo
lum
en
dic
hte
[%
]
p<0,001
p<0,001
Die Volumendichte des nichtvaskulären Interstitiums insgesamt zeigt sich in der
Tendenz ähnlich zu der Volumendichte von Fibroblasten und Bindegewebe. Hier
haben die ZDF-F-P-Tiere im zeitlichen Verlauf eine signifikant geringere
Volumendichte des nichtvaskulären Interstitiums als die ZDF-fatty-Tiere. Die ZDF-
L-P-Tiere weisen im zeitlichen Verlauf eine signifikant geringere Volumendichte des
Interstitiums im Vergleich mit den ZDF-lean-Tieren auf. Weiterhin lässt sich
beobachten, dass die ZDF-fatty Tiere tendentiell weniger Zeichen für eine
Myokardfibrosierung aufweisen als die lean-Tiere.
53
4.2.2 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte
Die absolute Anzahl der intramyokardialen Arteriolen ist in den sechs Gruppen sehr
unterschiedlich. Sie liegt zwischen 474 bei der ZDF-lean-Gruppe (n=10) und 294 in
der ZDF-F-Met-Gruppe (n=10). Die Zahl der gezählten intramyokardialen Arteriolen
pro Tier ist ebenfalls sehr unterschiedlich und schwankt in allen sechs Gruppen
zwischen 2 und 89 Arteriolen pro Tier (8 Schnitte/Tier ausgewertet).
Tabelle 4-8: intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte
ZDF-
lean
ZDF-
fatty
ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Wand-
dicke
(µm)
2,31±0,9 3,10±2,76 1,91±0,63 2,39±0,76 1,93±0,61 2,5±0,91 n.s.
Wand-
fläche
(µm²)
222±109 298±402 184±64 254±85,3 193±85,7 217±76,4 n.s.
Lumen-
fläche
(µm²)
626±253 592±204 648±210 774±272 700±416 496,5±187 n.s.
Lumen-
diameter
(µm)
28,2±4,1 25,2±3,26 25,8±2,39 28,8±4,58 27,4±7,11 23,2±3,94 n.s.
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
Es können bei den absoluten Messwerten der intramyokardialen Arteriolen keine
signifikanten Unterschiede gemessen werden.
In der Tendenz haben die unbehandelten ZDF-fatty-Tiere die höchsten Werte bei
Messung der Wanddicke und –fläche. Bei allen behandelten Tieren (Placebo, EMD,
54
Metformin) werden im Schnitt geringere Werte bei bezüglich der Wanddicke und -
fläche gemessen. Die Standardabweichung ist bei den Werten Wanddicke und –
fläche der ZDF-fatty-Gruppe auffallend groß. Das kann damit begründet werden,
dass in dieser Gruppe einzelne Arteriolen mit einer deutlich verdickten Gefäßwand
(verglichen mit der durchschnittlichen Gefäßwand-Dicke der fatty-Tiere) gemessen
wurden. Die dadurch bedingte große Streuung der Werte lässt sich ebenfalls auf die
relativen Messwerte Wanddicke/Lumendurchmesser, Wanddicke/Lumenfläche sowie
Wandfläche/Lumenfläche der ZDF-fatty-Gruppe übertragen (s. S. 64-65).
Lumendiameter und –fläche sind bei den mit EMD behandelten Tieren tendentiell
geringer als bei den anderen Gruppen, was auf eine vergleichsweise starke
Wandverdickung schließen lässt.
4.2.3 Intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte
Tabelle 4-9: intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte
ZDF-
lean
ZDF-
fatty
ZDF-L-
P
ZDF-F-
P
ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Wanddicke/
Lumendiameter
(µm/µm) x 10²
8,2±2,9
11,3±8,5
6,7±2,1
a)
7,6±2,5
6,5±2,0
9,95±4,8
b)
P<0,05
Wanddicke/
Lumenfläche
[µm/µm²] x 10³
3,7±0,8
5,1±3,5
3,0±0,6
a)
3,3±1,1
2,98±0,9
5,7±3,5
P<0,05
Wandfläche/
Lumenfläche
(µm²/µm²) x
10²
35,4±8,8
51,8±51,0
28,6±4,0
a)
33,7±7,9
28,3±4,8
46,9±23,1
b)
P<0,05
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
a) p<0,05 vs ZDF-lean
b) p<0,05 vs ZDF-F-Met
55
Bezieht man die Wanddicke auf den Lumendurchmesser bzw. die Wandfläche auf
die Lumenfläche, so ergeben sich signifikant höhere Werte für die mit EMD
behandelten Tiere als für die, die Metformin bekommen haben. Dies spricht für eine
in der Relation stärkere Verdickung der Gefäßwand bei den ZDF-F-EMD-Tieren als
bei der ZDF-F-Met-Gruppe.
Die ZDF-L-P-Tiere haben im zeitlichen Verlauf signifikant niedrigere Werte als die
ZDF-lean-Tiere, wenn man die Wanddicke auf den Lumendiameter, die Wanddicke
auf die Lumenfläche oder die Wandfläche auf die Lumenfläche bezieht.
Abbildung 4-23: Wanddicke / Lumendurchmesser intramyokardiale Arteriolen
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Wan
dd
icke/L
um
en
du
rch
me
sse
r [µ
m/µ
m]
p<0,05 p<0,05
Abbildung 4-24: Wanddicke / Lumenfläche intramyokardiale Arteriolen
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
0,01
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Wan
dd
icke/L
um
en
fläc
he [
µm
/µm
²]
p<0,05
56
Abbildung 4-25: Wandfläche / Lumenfläche
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Wan
dfl
äch
e/L
um
en
fläch
e [
µm
²/µ
m²]
p<0,05
p<0,05
4.2.4 Kapillarisierung des Myokards
Tabelle 4-10: Kapillarisierung des Myokards
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-
Met
ZDF-F-
EMD
Kruskal-
Wallis
Längendichte
Kapillaren
(mm/mm³)
2413±31,9
1912±84,1
b)
2627±21,2
2264±73,0
2122±93,9
1613±142
a)
p<0,01
Volumendichte
Kapillaren (%)
10,9±1,1
7,2±1,2
e)
8,5±0,77
b)
7,8±0,8
7,6±1,2
5,8±0,19
c),d)
p<0,001
ICD (µm) 22,2±0,05
24,95±0,71
b)
21,2±0,002
22,8±0,31
24,4±1,63
26,9±1,09
a)
p<0,01
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
a) p<0,001 vs ZDF-F-P
b) p<0,05 vs ZDF-lean
c) p<0,05 vs ZDF-F-P
d) p<0,05 vs ZDF-F-Met
e) p<0,01 vs ZDF-lean
57
Abbildung 4-26: Längendichte Kapillaren
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Lä
ng
en
dic
hte
[m
m/m
m³]
p<0,001p<0,05
Die Längendichte der myokardialen Kapillaren als Maß für die Versorgung des
Herzgewebes ist in der mit EMD behandelten Tiergruppe signifikant niedriger als in
der placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Die Längendichte der myokardialen
Kapillaren ist bei den ZDF-fatty-Tieren signifikant geringer als bei den ZDF-lean-
Tieren.
Abbildung 4-27: Volumendichte Kapillaren
0
2
4
6
8
10
12
14
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
Vo
lum
en
dic
hte
[%
]
p<0,05
p<0,05
p<0,05
p<0,01
Bei der Volumendichte der Kapillaren, die den prozentualen Anteil des
Kapillarvolumens widerspiegelt, zeigen die mit EMD behandelten Tiere wiederum
signifikant niedrigere Werte als die placebokontrollierte Vergleichsgruppe. Jedoch
58
sind die Werte signifikant niedriger als bei den mit Metformin behandelten Tieren.
Im zeitlichen Verlauf weisen die ZDF-L-P-Tiere eine signifikant geringere
Volumendichte der Kapillaren auf als die früher getöteten ZDF-lean Tiere. Die ZDF-
fatty Tiere zeigen einen signifikant geringeren Anteil des Kapillarvolumens als die
ZDF-lean-Gruppe.
Abbildung 4-28: interkapilläre Distanz (ICD)
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD
Gruppe
ICD
[m
m]
p<0,001p<0,05
Bei der interkapillären Distanz werden die höchsten Werte bei den EMD-Tieren
gemessen. Diese zeigen auch einen signifikanten Unterschied zu der
placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Dies bestätigt die geringere
Kapillarversorgung bei den EMD-Tieren.
59
4.3 Veränderungen der Aorta
4.3.1 Wandveränderungen der Aorta – absolute Werte
Tabelle 4-11: Wandveränderungen Aorta – absolute Werte
ZDF-lean
(n=4)
ZDF-
fatty
(n=1)
ZDF-L-P
(n=4)
ZDF-F-P
(n=4)
ZDF-F-
Met
(n=2)
Kruskal-
Wallis
Wanddicke
(µm) 66,7±4,97 91,4±0,0 78,0±22,9 92,3±13,7 101±8,01 n.s.
Wandfläche
(mm²) 0,17±0,07 0,20±0,0 0,20±0,07 0,19±0,04 0,24±0,10 n.s.
Lumenfläche
(mm²) 0,45±0,32 0,30±0,0 0,47±0,23 0,25±0,14 0,35±0,27 n.s.
Lumendiameter
(µm) 713±295 620±0,0 756±199 552±157 643±263 n.s.
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
Die absoluten Messwerte für die Wandveränderungen der Aorten weisen zwischen
den einzelnen Tiergruppen keine signifikanten Unterschiede auf. Dabei ist darauf hin
zu weisen, dass in der ZDF-F-EMD-Gruppe keine Aorten zur Auswertung vorliegen.
In den anderen Gruppen differiert die Gruppenstärke sehr stark (s. Angaben in
Tabelle 4-11)
Tendentiell sind die Mediadicke und –fläche –wie zu erwarten- in der ZDF-fatty-
Gruppe höher als in der ZDF-lean-Gruppe. In der mit Metformin behandelten
Gruppe kann kein positiver Einfluss des Medikaments auf die Mediadicke bzw. –
fläche festgestellt werden.
Der Lumendurchmesser und die Lumenfläche zeigen in der Tendenz in der ZDF-
fatty-Gruppe geringere Werte als in der ZDF-lean-Gruppe. Die mit Metformin
behandelte Gruppe hat tendentiell höhere Werte im Lumendiameter bzw.
Lumenfläche als die placebokontrollierte Vergleichsgruppe.
60
Wandveränderungen der Aorta – relative Werte
Tabelle 4-12: Wandveränderungen Aorta - relative Werte
ZDF-lean
(n=4)
ZDF-fatty (n=1)
ZDF-L-P (n=4)
ZDF-F-P (n=4)
ZDF-F-Met
(n=2)
Kruskal-Wallis
Wanddicke/ Lumendiameter (µm/µm)
0,11±0,05 0,15±0,0 0,10±0,05 0,17±0,06 0,16±0,06 n.s.
Wandfläche/ Lumenfläche (µm²/µm²) x 10²
49,1±26,6 67,7±0,0 49,3±22,4 86±32,7 79,4±30,2 n.s.
Lumenfläche/ Körpergewicht (mm²/kg)
1,72±1,23 1,0±0,0 1,24±0,6 0,64±0,41 0,78±0,40 n.s.
Wandfläche/ Körpergewicht (mm²/kg)
0,64±0,27 0,68±0,0 0,54±0,21 0,45±0,12 0,56±0,08 n.s.
Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung
Bei den relativen Werten zur Wandveränderung der Aorten ergeben sich ebenfalls
keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Tiergruppen.
Die Wanddicke bezogen auf den Lumendurchmesser ist in der Metformin-Gruppe
tendentiell niedriger als in der placebokontrollierten Vergleichsgruppe.
Das Verhältnis der Mediafläche zur Lumenfläche ist tendentiell geringer bei den mit
Metformin behandelten Tieren, verglichen mit der placebolontrollierten
Vergleichsgruppe.
Die Lumenfläche und Mediafläche bezogen auf das Körpergewicht der Tiere zeigen
Tendenzen, die jedoch nicht statistisch signifikant sind. So steigen beide Parameter
bei den mit Metformin behandelten Tieren im Vergleich zur placebobehandelten
Kontrollgruppe leicht an und werden somit durch die Metformingabe nicht positiv
regressiv beeinflusst.
61
5. Fotodokumentation
Eindrückliche morphologische Strukturen dieser Arbeit sollen hier abschließend
gezeigt werden. Aufgrund der Übersichtlichkeit wird auf die Abbildung der
verschiedenen Gewebe aus allen sechs Tiergruppen verzichtet. Es werden die
Gruppe, die mit EMD behandelt wurde, und die Placebo-Gruppe gezeigt. Die mit
Metformin behandelten Tiere wiesen kaum eindrückliche morphologische
Veränderungen auf.
5.1 Intramyokardiale Arteriolen
ZDF-F-P
ZDF-F-EMD
62
Die Arteriolenwand der ZDF-F-EMD-Gruppe ist im Vergleich zur Placebo-Gruppe
deutlich verdickt. Auch das periarterioläre Bindegewebe ist vermehrt.
5.2 Intramyokardiale Kapillarisierung
ZDF-F-P
ZDF-F-EMD
Die Anzahl an Kapillaren der ZDF_F-EMD-Gruppe ist im Vergleich zur Placebo-
Gruppe deutlich reduziert, die interkapilläre Diastanz dagegen erhöht.
63
6. Diskussion
Ziel dieser Arbeit ist es, die kardialen Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2
(repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-P) und deren Beeinflussung durch die
Medikamente Metformin (repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-Met) und EMD
387008 (repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-EMD) zu untersuchen und
miteinander zu vergleichen. Zu diesem Zweck wird in der Diskussion im Besonderen
auf die Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 und seiner Begleitsymptome auf
kardiovaskuläre Strukturen eingegangen. Im Folgenden werden die Veränderungen,
die durch Metformin bzw. EMD hervorgerufen werden können, erläutert.
6.1 Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 auf kardiovaskuläre
Strukturen unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse
6.1.1 Auswirkungen einer Hyperglykämie auf kardiovaskuläre Strukturen
In der vorliegenden Arbeit kann gezeigt werden, dass alle Tiergruppen mit Diabetes
mellitus Typ 2 durchweg Serum-Glucose-Werte aufweisen, die deutlich über dem
Normwert (126 mg/dl) liegen. Der HbA1c-Wert als Indikator für einen chronisch
erhöhten Blutzucker bewegt sich in allen Tiergruppen mit Diabetes im Durchschnitt
nicht über der Obergrenze von 6,5 %. Darüber hinaus kann in diesen Gruppen eine
deutliche Glukosurie, verglichen mit der nicht-diabetogenen Vergleichsgruppe,
nachgewiesen werden.
Eine chronische Hyperglykämie bei diabetischer Stoffwechsellage kann zu
verschiedenen Veränderungen des Herzmuskels führen. Bei der Entstehung einer
diabetischen Kardiopathie spielt die Hyperglykämie eine zentrale Rolle, indem eine
myokardiale Fibrose und Kollagenablagerung als früh auftretende myokardiale
Strukturveränderungen getriggert werden. [3]. Pathophysiologisch erklärt man sich
die Entstehung der kardiovaskulären Dysfunktion, bedingt durch die Hyperglykämie,
im Sinne einer Aktivierung des myokardialen Renin-Angiotensin-Aldosteron-
Systems, was zu einer verstärkten Nekrose und Fibrosierung der Myozyten führen
kann. Die Verteilung des abgelagerten Bindegewebes kann interstitiell oder
perivaskulär erfolgen sowie beide Lokalisationen umfassen. Darüber hinaus konnten
64
in verschiedenen Untersuchungen eine myokardiale Hypertrophie, Veränderungen
des Kapillarendothels sowie eine Verdickung der kapillären Basalmembran gezeigt
werden ([49], [9]).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben keinen Hinweis auf eine verstärkte
Fibrosierung bzw. Bindegewebszunahme bei den Tieren mit Diabetes mellitus Typ 2,
verglichen mit der nicht-diabetogenen Vergleichsgruppe.
Die Glucose kann durch nichtenzymatische Glykosilierung von extra- oder
intrazellulären Proteinen (u.a. Kollagen) über reversible Zwischenprodukte
(Amadori-Produkte) zur Entstehung irreversibler „advance glycation end products“
(AGE) führen [3]. Da die AGE mit anderen Proteinen kovalente Bindungen
eingehen, können sie sowohl in ihrer natürlichen Funktion gestört werden als auch
ein sogenanntes „cross-linking“ von Kollagen oder extrazellulären Proteinen (z.B.
LDL) induzieren und an Zellrezeptoren binden. Weiterhin könne AGE intrazellulär
oxidativen Stress fördern, der eine verstärkte Zellschädigung verursacht [3].
In der Konsequenz können die oben beschriebenen pathophysiologischen
Mechanismen zu myokardialer und endothelialer Dysfunktion führen [3].
Diabetes mellitus ist auch charakterisiert durch einen erniedrigten IGF-1-Spiegel
und erhöhte TGF-beta1-Spiegel [4]. Die Überexpression von TGF-beta1 im Gewebe
durch kardiale Fibroblasten ist bedingt durch die Hyperglykämie und
Hyperinsulinämie bei NIDDM. Dieser Umstand trägt ebenso zum bindegewebigen
Umbau des Myokards sowie zur daraus resultierenden myokardialen Dysfunktion bei
[3].
Der pathophysiologische Mechanismus der Zellapoptose bei NIDDM wird mit einer
Störung der Glucosetransporter GLUT 1 und 4 bei diabetischer Stoffwechsellage
erklärt [3]. Dieser Umstand führt dazu, dass sich der Hauptanteil der
Energiegewinnung für die Aufrechterhaltung der kardialen Kontraktilität vom
Glucose-Stoffwechsel hin zur Beta-Oxidation von freien Fettsäuren verschiebt, was
in der Konsequenz zu einer verstärkten Zellapoptose als Vorstufe zur
Kardiomyopathie führen kann. Dieser apoptotische Effekt der Hyperglykämie wird
durch die Glykosilierung und Phosphorylierung von p53 sowie durch die erhöhte
Synthese von AT-II hervorgerufen [13] [3].
Darüber hinaus können die bei der Beta-Oxidation anfallenden toxischen
Abbauprodukte den Calcium-Transport der myokardialen Zellen dahingehend
verändern, dass Kontraktion und Relaxation der Ventrikel beeinträchtigt werden [3].
65
Eine hohe Glucose-Konzentration im Blut aktiviert auch die Protein-Kinase C
(PKC). Dies führt in der Folge zur Ausschüttung verschiedener Zytokine und
Wachstumsfaktoren, wie z.B. „vascular endothelial growth factor“ (VEGF),
„plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1), „nuclear factor kappa-Beta“ (NF-kB)
[62] sowie dem oben beschriebenen TGF-beta-1. Eine erhöhte Kapillar-
Permeabilität, vermehrte Fibroseneigung sowie eine verstärkte Ausschüttung
proinflammatorischer Gene können eine unmittelbare Folge davon sein und zur
Schädigung kardiovaskulärer Strukturen beitragen [3].
6.1.2 Auswirkungen einer Dyslipidämie und Insulinresistenz auf kardiovaskuläre Strukturen
Bei Patienten mit Diabetes mellitus wird häufig eine Dyslipidämie beobachtet [41].
Dieser Zusammenhang kann in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Alle
Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2 zeigen signifikant (p<0,01) erhöhte Serum-
Cholesterinwerte, die im Durchschnitt alle über dem Normwert von 200 mg/dl
liegen. In diesen Gruppen kann auch eine Hyperinsulinämie (verständlich aufgrund
des Modells der Insulinresistenz bei Diabetes mellitus Typ 2) nachgewiesen werden.
Verschiedene Mechanismen können diesen Sachverhalt erklären:
Ein mit dem Krankheitsbild des Diabetes mellitus Typ 2 einher gehender
Insulinmangel bzw. Insulinresistenz im Gewebe (Skelettmuskulatur, Leber, Niere,
Fettgewebe) können zur Hyperlipidämie führen, entweder direkt oder indirekt über
die Hyperglykämie. Dies wird durch eine gesteigerte Aktivität der hormonsensitiven
Lipase des Fettgewebes verursacht. In der Folge kann es zu einer vermehrten
Lipolyse mit verstärkter Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) kommen [38].
Ein weiterer ätiologischer Ansatz postuliert die Induktion einer Insulinresistenz
durch den vermehrten Anfall freier Fettsäuren (neben verschiedenen anderen
molekularen Mechanismen, die an der Entstehung einer Insulinresistenz beteiligt
sind). Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ 2 sind häufig verbunden mit
niedrigen HDL- und hohen Plasma-Triglycerid-Spiegeln als kardiovaskuläre
Risikofaktoren [5]. Durch übermäßige orale Zufuhr von Fetten gelangen Triglyceride
und FFAs vermehrt ins Blut und verursachen eine Insulinresistenz sowie
Hyperglykämie. Der erhöhte Blutzucker stimuliert in der Folge die pankreatischen
Beta-Zellen und verursacht eine Hyperinsulinämie, die wiederum den Anstieg von
66
Triglyceriden triggert und diesen „circulus vitiosus“ aufrecht erhält [39]. In dieser
Arbeit ist der HDL-Spiegel der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe allerdings signifikant
(p<0,001) höher als bei den ZDF-lean-Placebo-Tieren.
Für die FFAs konnte gezeigt werden, dass sie die Proteinkinase C θ (PKC θ)
aktivieren und über diese Kaskade an proatherogenen Mechanismen beteiligt sind
[39]. Zu diesen zählen endotheliale Dysfunktion, Wachstum, Migration und
Apoptose von glatten Muskelzellen der Gefässwand. Darüber hinaus können
Adhäsionsmoleküle sowie eine erhöhte Aufnahme von oxidiertem LDL in
Makrophagen bzw. Schaumzellen induziert werden [46].
Auch durch eine Aktivierung von Inhibitor κB-Kinase (IKK) und c-Jun N-terminal
Kinase (JNK) rufen FFAs eine Insulinresistenz hervor [39].
Nachdem nun in Ansätzen erklärt worden ist, wie Dyslipidämie und Insulinresistenz
bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 zusammenhängen, soll im folgenden
Abschnitt näher erläutert werden, welche Rolle die Insulinresistenz bei instabilen
atherosklerotischen Plaque spielt und damit das Risiko der Patienten mit KHK
beeinflusst.
Die Entstehung atherosklerotischer Plaque hängt von verschiedenen biochemischen
Prozessen ab [39]. Die Plaque-Ruptur und damit verbundene Gefäss-
Thrombosierung sind gefürchtete Komplikationen, die in der Konsequenz zu
ischämischen Ereignissen im Herzen, Gehirn oder der Peripherie führen können.
Laut aktuellem Stand der Forschung kann die Insulinresistenz zur Instabilität
atherosklerotischer Plaque beitragen, indem durch erhöhte Insulin-Konzentrationen
die proinflammatorische Aktivität von Leukozyten direkt verstärkt wird. In vitro
konnte beobachtet werden, dass Insulin die Migration von Neutrophilen und
Monozyten, abhängig von Chemokinen der atherosklerotischen Plaque beeinflussen
kann [39]. Zusätzlich kann Insulin Nekroseprozesse der atherosklerotischen Plaque
begünstigen sowie den Untergang von Makrophagen beschleunigen. In vivo konnte
gezeigt werden, dass Insulin die Produktion der Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-
9) induziert und damit unter anderem für die Instabilität und Ruptur der
atherosklerotischen Plaque verantwortlich ist. Auf der anderen Seite erhöht Insulin
die Widerstandsfähigkeit von Thrombozyten gegenüber Faktoren, die eine
Plättchenkoagulation verhindern können, und steigert die Produktion
prokoagulatorischer Faktoren wie PAI-1, Faktor VII, Faktor XII, Fibrinogen und
„tissue plasminogen activator“ [39].
67
6.1.3 Mikroalbuminurie und kardiovaskuläre Schäden
Die kardiovaskuläre Mortalität ist bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ohne
Myokardinfarkt in der Vorgeschichte 7,5-fach höher als in einer
Vergleichspopulation ohne Diabetes mellitus Typ 2. Das Vorliegen einer Proteinurie
erhöht die Wahrscheinlichkeit einer kardiovaskulären Todesursache bei diesen
Patienten [41].
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Tiere der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe
eine signifikant (p<0,001) höhere Urin-Albumin-Konzentration sowie eine
signifikant (p<0,001) höhere Urin-Albumin-Exkretion, verglichen mit der ZDF-lean-
Placebo-Gruppe als Kontrolle, aufweisen.
Eine veränderte Albuminausscheidung ist neben der Entwicklung bzw. Verstärkung
einer Hypertonie, Abnahme der glomerulären Filtrationsleistung sowie einer
Dyslipoproteinämie und weiteren diabetischen Komplikationen charakteristisch für
eine diabetische Nephropathie.
Es konnte gezeigt werden, dass die Prävalenz einer Mikroalbuminurie
(Albuminausscheidung von 20-200 mg/l [20]) bei Diabetikern (Typ 1 und 2) 17 %
beträgt (verglichen mit der Prävalenz von 4 % in der Kontrollgruppe) [41]. Als
unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen und vorzeitigen Tod
aufgrund kardiovaskulärer Schäden bei Diabetikern ist die Mikroalbuminurie laut
epidemiologischer Studien assoziiert mit endothelialer Dysfunktion, Insulinresistenz,
Adipositas, Salz-Empfindlichkeit und Dyslipidämie [41]. Auch eine erhöhte
Prävalenz für linksventrikuläre Hypertrophie und mikrovaskuläre Retinaläsionen
konnte für Patienten mit Mikroalbuminurie nachgewiesen werden [41]. In der
HOPE-Studie konnte bei 32,6 % der Studienteilnehmer mit Diabetes mellitus eine
Mikroalbuminurie nachgewiesen werden, in der Gruppe ohne Diabetes wiesen
lediglich 14,8 % eine Mikroalbuminurie auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass
das Risiko für ein kardiovaskuläres Ereignis bzw. für eine Hospitalisation wegen
Herzinsuffizienz bei nachgewiesener Mikroalbuminurie 2-3fach erhöht ist.
Aufgrund der Assoziation von Mikroalbuminurie, endothelialer Dysfunktion und
erhöhtem oxidativem Stress, ist es nicht verwunderlich, dass diabetische
Atherosklerose und diabetische Glomerulosklerose parallel auftreten. Es ist
allerdings unklar, ob die Mikroalbuminurie ein Prädiktor für Atherosklerose oder
aber atherosklerotische Prozesse ist, da noch nicht gezeigt werden konnte, ob eine
68
erhöhte Urin-Albumin-Exkretion vor, während oder nach der Entstehung
morphologischer Veränderungen im Prozess der Atherosklerose auftritt. Bei
Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ohne Mikroalbuminurie konnten ebenfalls
verschiedene Marker für eine endotheliale Dysfunktion nachgewiesen werden, was
ein Hinweis auf eine frühe diabetische Vaskulopathie vor der Manifestation einer
Mikroalbuminurie sein kann [41].
6.1.4 Endotheliale Dysfunktion und kardiovaskuläre Schäden
Man vermutet, dass die endotheliale Dysfunktion bei Diabetikern dem renalen bzw.
kardiovaskulären Organschaden zugrunde liegt [41]. Definiert als frühe Phase der
Atherosklerose ist die endotheliale Dysfunktion assoziiert mit den
Hauptrisikofaktoren für eine KHK: Hypertonie, Hyperlipidämie, Rauchen und
Diabetes mellitus. Eine mögliche Erklärung für den Zusammenhang endotheliale
Dysfunktion und Atherosklerose ist die der gesteigerten Penetration von atherogenen
Lipoproteinen durch die geschädigte Gefässwand [41].
Veränderungen des Gefäßsystems im Sinne von endothelialer Dysfunktion wurden
initial bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 gefunden. Neben der
Hyperglykämie, einem veränderten antioxidativen Gleichgewicht sowie
Veränderungen im Lipidstoffwechsel, eingeschlossen die freien Fettsäuren, wird
vermutet, dass die Insulinresistenz einen Beitrag zu vaskulären Schäden bei Patienten
mit Diabetes mellitus Typ 2 leistet [32]. Die Insulinresistenz hat demnach einen
direkten Einfluss auf die Endothelfunktion, neben den ungünstigen Effekten im
Lipidstoffwechsel und Blutdrucksystem (s. Abschnitt 5.1.2). Der Ansatz einer
Reduktion der Insulinresistenz als therapeutisches Ziel in der Diabetestherapie liegt
aufgrund dieser pathophysiologischen Zusammenhänge nahe und wird in einem
gesonderten Abschnitt abgehandelt.
Trotzdem bleibt die Datenlage bezüglich einer Beziehung zwischen Insulinresistenz
und endothelialer Dysfunktion kontrovers. In einigen Studien gibt es Hinweise, die
für eine Korrelation zwischen diesen beiden Parametern sprechen. In anderen
Studien konnte dieser Zusammenhang nicht bestätigt werden [32].
In neuesten Studien wurde an einem Modell für Ratten mit Diabetes mellitus Typ 2
(OLETF-rats: Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats) gezeigt, dass die Relaxation
69
der Mesenterialarterien, vermittelt über endothelium-derived hyperpolarizing factor
(EDHF), vermindert wird, wohingegen die Kontraktion der Mesenterialarterien,
vermittelt über endothelium-derived contracting factor (EDCF), verstärkt wird [34].
In verschiedenen tierexperimentellen Studien konnte nachgewiesen werden, dass
eine temporäre postprandiale Hyperglykämie und Hypertriglyceridämie eine
reversible endotheliale Dysfunktion hervorrufen können.
In einer aktuellen Studie zeigt sich, dass das Vermeiden einer postprandialen
Hyperglykämie mittels einer auf Fetten basierenden Diät das Fortschreiten einer
Atherosklerose nicht verhindern kann [40]. In anderen Studien wird die
Hyperglykämie als unabhängiger Faktor für die Entstehung von kardiovaskulären
Erkrankungen angesehen [41].
6.1.5 Linksventrikuläre Hypertrophie
In der vorliegenden Arbeit ist das absolute linksventrikuläre Gewicht in den
Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2 (ZDF-fatty) höher als in der unbehandelten
Vergleichsgruppe ohne Diabetes (ZDF-lean). Diese Unterschiede sind statistisch
nicht signifikant. Das auf das Körpergewicht bezogene relative linksventrikuläre
Gewicht ist in der fatty-Gruppe signifikant (p<0,05) niedriger als in der lean-Gruppe.
In der Literatur wird beschrieben, dass die Insulinresistenz, die – wie oben
beschrieben – häufig mit Diabetes mellitus Typ 2 assoziiert ist, mit einer
linksventrikulären Hypertrophie einhergehen kann [15]. In einer multiethnischen
Studie wird eine positive Korrelation zwischen Diabetes mellitus Typ 2 und einer
erhöhten linksventrikulären Hypertrophie gezeigt, die unabhängig von anderen
Begleitfaktoren (wie ethnische Zugehörigkeit, Bildung oder körperliche Aktivität) ist
(1,5fach erhöhtes Risiko für ein linksventrikuläres Gewicht über der 75. Perzentile
bezogen auf die Allgemeinbevölkerung) [12]. Darüber hinaus wird beschrieben, dass
der BMI an sich als Index für Adipositas nicht mit Diabetes mellitus Typ 2 und
linksventrikulärer Hypertrophie korreliert. Wenn aber der stammbetonte
Körperumfang als Index gewählt wird, gibt es eine signifikante Interaktion zwischen
Diabetes mellitus Typ 2 und dem Bauchumfang bezüglich der linksventrikulären
Hypertrophie [12]. Aufgrund dieses Zusammenhanges vermutet man, dass
70
verschiedene Arten von Adipozytokinen im viszeralen Fett einen direkten Einfluss
auf das linksventrikuläre Gewicht haben könnten [41].
In der vorliegenden Arbeit ist das Körpergewicht in der ZDF-fatty-Gruppe
signifikant (p<0,001) höher als in der nicht-diabetogenen ZDF-lean Gruppe. Der
Anteil an stammbetontem viszeralen Fett wurde nicht gemessen.
6.2 Vergleich von Metformin und EMD bezüglich ihrer Wirkung auf
Symptome des Diabetes mellitus Typ 2 unter Einbeziehung der
eigenen Ergebnisse
6.2.1 Metformin und EMD in der Therapie der Insulinresistenz
Die UKPDS 34 [58] zeigt, dass der Einsatz von Metformin besonders effektiv bei
adipösen Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ist, was unmittelbar im
Zusammenhang mit einer Insulinresistenz steht [58] und hauptsächlich durch
Adipositas und chronische Hyperglykämie bedingt ist [38]. In zahlreichen klinischen
Studien wurde gezeigt, dass eine Senkung des Blutzuckers durch Metformin
einhergeht mit unveränderten oder reduzierten Plasma-Insulinspiegeln [10]. Das lässt
darauf schließen, dass Metformin als Insulin-Sensitizer bzw. als Insulin-mimetisches
Medikament wirkt. In der vorliegenden experimentellen Arbeit sind die Serum-
Insulinspiegel in den beiden Gruppen, die mit Metformin bzw. EMD behandelt
wurden, höher als bei der Placebo-kontrollierten Vergleichsgruppe. Die EMD-
Gruppe weist im Mittel niedrigere Serum-Insulinwerte auf als die Metformin-
Gruppe. Dieser Unterschied ist nicht signifikant.
In diversen Studien kann gezeigt werden, dass Metformin die endogene
Glucoseproduktion bei Typ 2-Diabetikern verhindert, indem die Gluconeogenese
eingeschränkt wird [45].
In der Peripherie wirkt Metformin als Insulin-Sensitizer im Muskelgewebe, welches
eine große Rolle bei der Insulin-vermittelten Glucoseaufnahme in peripheren
Geweben spielt. Die „Entsorgung“ der Glucose erfolgt hauptsächlich über nicht-
oxidative Stoffwechselwege, worunter im Speziellen die Speicherung in Form von
71
Glycogen, Umwandlung in Laktat und der Einbau in Triglyceride gerechnet werden.
Die Glycogenspeicher spielen in diesem Zusammenhang die wohl grösste Rolle.
In anderen Studien wurden eine Metformin- und Insulintherapie kombiniert [19].
Hier konnte gezeigt werden, dass bei übergewichtigen Patienten mit Diabetes
mellitus Typ 2 eine exogene Insulinzufuhr durch die Gabe von Metformin um bis zu
30% reduziert werden konnte.
Weiterhin wird postuliert, dass ein Teil des Blutzucker senkenden Effekts von
Metformin durch die geringere Freisetzung freier Fettsäuren aus dem Fettgewebe
und/oder durch eine geringere Lipidoxidation bedingt ist [55]. Jedoch konnte nur in
einem Teil der Studien nachgewiesen werden, dass der Anteil freier Fettsäuren nach
der Gabe von Metformin sinkt. In vitro-Studien haben gezeigt, dass Metformin den
antilipolytischen Effekt von Insulin nicht verbessern kann [7]. Ein ursächlicher
Zusammenhang zwischen den eben beschriebenen Effekten von Metformin und der
endogenen Glucoseproduktion erscheint im Kontext eher unwahrscheinlich, da in
anderen Studien die Glucoseproduktion nicht vermindert werden konnte, auch wenn
die zirkulierenden freien Fettsäuren deutlicher gesenkt wurden (mittels Acipimox)
als mit Metformin.
6.2.2 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Hyperglykämie
In der vorliegenden Arbeit zeigen alle Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2
erhöhte Serum-Glucosewerte. Die Gruppen, die mit Meformin bzw. EMD behandlet
wurden, zeigen von der Tendenz her niedrigere Serum-Glucosewerte als die Placebo-
behandelte Vergleichsgruppe. Dieser Unterschied ist allerdings nicht signifikant. Die
durchschnittlichen Glucose-Spiegel sind in der Metformin-Gruppe nahezu identisch
zur EMD-Gruppe. Die Glucosurie, die in der Metformin-Gruppe wie auch in der
ZDF-fatty-Placebo-Gruppe in gleicher Weise nachweisbar ist, konnte durch EMD
signifikant (p<0.05) gesenkt werden.
In einer Metaanalyse aller kontrolliert randomisierten klinischen Studien, die
Metformin mit Placebo und Sulfonylharnstoffen vergleichen, kann Metformin bei
einer mittleren Behandlungsdauer von 4,5 Monaten im Vergleich zu Placebo-
72
Präperaten die Blut-Glucosekonzentration um 2,0 mM senken, den HbA1c-Wert um
0,9% [38]. Sulfonylharnstoffe und Metformin senken demnach bei einer
durchschnittlichen Behandlungsdauer von sechs Monaten die Blut-
Glucosekonzentration sowie den HbA1c-Wert in gleicher Weise. Unterschiede
zeigen sich hinsichtlich der Entwicklung des Körpergewichts (s. Abschnitt 5.2.6). Im
Rahmen der UKPDS-Studie zeigt Metformin, verglichen mit Chlorpropamid,
Glbenclamid und Insulin einen signifikant besseren Effekt bezüglich der
diabetesbedingten Endpunkte, der Gesamtmortalität als auch des Schlaganfall-
Risikos [58].
6.2.3 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Dyslipidämie
Zusätzlich zur Verbesserung einer Hyperglykämie kann Metformin die Lipidspiegel
im Serum verbessern. Bei Diabetikern sowie Nicht-Diabetikern kann Metformin die
Triglycerid-Spiegel um 10-20 % reduzieren [55]. Dieses wurde in Zusammenhang
mit einer reduzierten hepatischen VLDL-Synthese gebracht. Ein Rückgang von 5-10
% des Gesamt-Cholesterins wird ebenso beschrieben und in Zusammenhang mit
einem Rückgang des LDL gebracht. Die HDL-Spiegel sind in den ausgewerteten
Studien entweder angestiegen oder gleich geblieben [38].
In der vorliegenden Arbeit kann weder in der Tiergruppe, die mit Metformin
behandelt wurde, noch in der EMD-behandelten Gruppe ein niedrigeres Gesamt-
Cholesterins verzeichnet werden, verglichen mit der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe. Die
durchschnittlichen Serum-HDL-Werte sind in allen Gruppen mit Diabetes mellitus
signifikant (p<0,01) höher als in der Placebo-behandelten lean-Gruppe. Die mit
Metformin behandelten Tiere zeigen im Mittel die höchsten HDL-Werte. Der
Unterschied zur EMD-Gruppe und zur Placebo-behandelten fatty-Gruppe ist nicht
signifikant.
6.2.4 Metformin – Auswirkungen auf die endotheliale Dysfunktion
Aufgrund der in Abschnitt 5.1.4 geschilderten Zusammenhänge liegt es nahe,
Metformin in der Therapie der Insulinresistenz und endothelialen Dysfunktion im
Speziellen, aber auch in der Therapie der kardiovaskulären Erkrankungen im
Allgemeinen in Erwägung zu ziehen [32].
73
Mather et al. [32] zeigen in einer placebokontrollierten Studie, in die Patienten mit
Diabetes mellitus Typ 2 ohne weitere klassische Risikofaktoren des metabolischen
Syndroms eingeschlossen wurden, den Zusammenhang zwischen einer Behandlung
mit Metformin und der potentiellen Verbesserung der endothelialen Dysfunktion
mittels Unterarm-Plethysmographie. Ausschlusskriterien bei dieser Studie sind eine
bekannte koronare oder periphere Gefässerkrankung, arterielle Hypertonie,
Behandlung mit vasoaktiven Medikamenten, Hypercholesterinämie,
Hypertriglyceridämie, Raucheranamnese, Mikro- oder Makroalbuminurie,
diabetische Retinopathie, Alter <25 Jahren bei Diagnose des Diabetes. Nach
dreimonatiger Behandlung mit Metformin konnte eine Verbesserung der
endothelialen Dysfunktion sowie der Insulinresistenz im Vergleich mit der Placebo-
Gruppe festgestellt werden. Der Mechanismus dieses beobachteten Effekts bleibt
unklar. Neben der Hypothese der direkten Wirkung einer geringeren Insulinresistenz
auf die Endothelzellen [27] kann ein Zusammenspiel verschiedener Parameter
postuliert werden, die einen positiven Einfluss auf das Gefässendothel haben können
und ebenfalls positiv durch Metformin beeinflusst werden (Lipidstoffwechsel und
freie Fettsäuren). In neuesten Studien bestätigen sich Hinweise auf eine direkte
Wirkung von Metformin auf das Gefässendothel [34]. In Kapitel 5.1.4 wird erläutert,
dass vasokonstriktive Mediatoren bei der endothelialen Dysfunktion von Ratten mit
Diabetes mellitus Typ 2 eine Rolle spielen [34]. Nach diesen Untersuchungen
verbessert Metformin die EDHF-vermittelte Relaxation und reduziert die EDCF-
vermittelte Kontraktion der Mesenterialarterien dieser Tiere, indem die Produktion
von vasokonstriktiven Prostanoiden unterdrückt und oxidativer Stress verhindert
wird.
6.2.5 Metformin und EMD – Risiko einer Laktatazidose
Eine Laktatazidose wird definiert durch eine erhöhte Laktatkonzentration im Blut
(>45 mg/dl bzw. >5,0 mmol/l) sowie durch einen erniedrigten pH-Wert im Blut (<
7,35) und Elektrolytverschiebungen mit einer erhöhten Anionen-Lücke [51].
Insgesamt schätzt man die Laktatazidose als eine seltene Komplikation von
Metformin ein. Von 1980-1995 war die Inzidenz einer Laktatazidose unter
Metformin 9 pro 100.000 Patientenjahre [54]. Auch andere epidemiologische Studien
74
schätzen die Inzidenz auf 2 bis 9 Fälle pro 100.000 Patientenjahre, wobei die darin
publizierten Fälle Patienten mit akuten Begleiterkrankungen (z.B. akutes
Nierenversagen) einschlossen, die ebenfalls eine Laktatazidose verursachen können
[51]. Da die Inzidenz einer Laktatazidose bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2,
die nicht mit Metformin behandelt wurden, ebenfalls 9/100.000 Patientenjahre
beträgt, stellt sich die Frage, ob Diabetiker unter Metforminbehandlung ein höheres
Risiko für eine Laktatazidose entwickeln als unter einer alternativen antidiabetischen
Medikation. In den publizierten Metaanalysen ergibt sich kein erhöhtes Risiko durch
Metformin, verglichen mit alternativen Medikamenten [51].
Neuere Studien bestätigen, dass eine Metformin-assoziierte Laktatazidose zwar
selten, bei Auftreten aber mit einer Mortalitätsrate von 30-50 % verbunden sein kann
[50]. Runge [50] zeigt in seiner von 2003-2004 angelegten Studie, dass 4 von 67
Patienten (6 %) mit Laktatazidose die Diagnose einer Metformin-assoziierten
Laktatazidose hatten, da kein anderer Risikofaktor oder Trigger als eine
Niereninsuffizienz im kompensierten Stadium gefunden wurde. Diese Arbeit zeigt,
dass das Risiko einer Laktatazidose, die durch Metformin an sich bedingt ist,
vielleicht unterschätzt wird.
In einer Studie mit 9.875 Patienten wurde ein Fall einer Laktat-Azidose innerhalb 20
Behandlungsmonaten beobachtet [53].
In der vorliegenden Arbeit zeigen die diabetischen Ratten, die mit Placebo behandelt
wurden, signifikant (p<0,01) höhere Serum-Laktat-Werte als die lean-Ratten ohne
Diabetes mellitus Typ 2. Allerdings bewegen sich die Werte im Mittel unter der
Grenze von 5 mmol/l als Grenze für eine manifeste Laktat-Azidose. Die mit
Metformin bzw. EMD behandelten Gruppen zeigten durchschnittlich signifikant
(p<0,001) höhere Serum-Laktat-Spiegel als die Placebo-behandelten Tiere mit
Diabetes mellitus Typ 2. Zwischen der Metformin- und der EMD-Gruppe zeigt sich
kein signifikanter Unterschied.
6.2.6 Metformin und EMD – Auswirkungen auf das Körpergewicht
Anders als andere antidiabetische Medikamente (wie Sulfonylharnstoffe oder
Insulin), ist eine Behandlung mit Metformin nicht mit einer Gewichtszunahme
assoziiert. Klinische Studien zeigen konsequent, dass es unter Metformin entweder
75
zu einer signifikanten Gewichtsabnahme oder aber zu einer langsameren
Gewichtszunahme, verglichen mit anderen Medikamenten, kommt [10],[30].
Adipositas wird oft von Insulinresistenz und Hyperinsulinämie begleitet, was eine
große Rolle bei der Entwicklung einer Glucoseinstoleranz spielt. In einer
randomisierten, doppelblinden Studie bei Kindern konnte gezeigt werden, dass
Metformin, ohne eine Änderung der Essgewohnheiten, den BMI signifikant senkt,
wohingegen der BMI in der placebokontrollierten Kontrollgruppe anstieg [13]. Die
gleichzeitig niedrigeren Serum-Leptinwerte in der Metformin-Gruppe lassen
vermuten, dass der sinkende BMI mit einer Reduktion des Körperfetts erklärt werden
kann [13].
Auch in einer anderen Studie konnte der Zusammenhang zwischen einer
Gewichtsabnahme und dem Abbau von Fettgewebe gezeigt werden [55]. Metformin
verbessert die Insulin-Sensitivität des Muskelgewebes, nimmt aber keinen Einfluss
auf die antilipolytische Wirkung, die das Insulin auf Muskelgewebe ausübt.
Zusätzlich kann Metformin das Körpergewicht eher über eine reduzierte Zufuhr von
Kalorien beeinflussen als über einen höheren Energieverbrauch [38].
In der vorliegenden Arbeit haben die mit Metformin bzw. EMD behandelten Tiere
durchschnittlich ein höheres Körpergewicht als die Placebo-behandelte
Vergleichsgruppe. Dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant. Zwischen der
Metformin-Gruppe und der EMD-Gruppe gab es kaum einen Unterschied. Die
Körperlänge der mit EMD behandelten Tiere liegt im Mittel aber signifikant
(p<0,05) unter der Körperlänge der Tiere, die mit Metformin behandelt wurden.
6.2.7 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die arterielle Wandstruktur und Kapillarisierung des Myokards
Um den Einfluss von Metformin im Prozess der Atherosklerose zu analysieren,
wurden die Auswirkungen einer Metformin-Therapie auf die Dicke der Intima- und
Media-Schicht der Karotiden bei Typ 2 – Diabetikern untersucht [33]. Die Dicke der
jeweiligen Schichten wurde nach einem bzw. nach zwei Jahren einer Behandlung mit
Metformin gemessen. Zwei Jahre nach Metformin-Gabe war die Zunahme der
Intima- und Mediadicke signifikant (p<0,01) niedriger als bei den unbehandelten
Kontroll-Patienten. Da andere kardiovaskuläre Risikofaktoren (Körpergewicht,
Blutdruck, HbA1c und Serum-Lipide) in dieser Studie keine Änderungen durch
76
Metformin aufwiesen, wurde der Schluss gezogen, dass Metformin die Zunahme der
Media- und Intimadicke an den Karotiden verzögern kann. Verschiedene
Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, werden diskutiert, z.B. die
Verbesserung der Insulinresistenz und Verminderung von PAI-1.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Wanddicke von intramyokardialen Arteriolen
bezogen auf den Lumendiameter, die Wanddicke bezogen auf die Lumenfläche und
die Wandfläche bezogen auf die Lumenfläche bestimmt. Dabei zeigt sich, dass die
mit Metformin behandelten Tiere, verglichen mit der Kontrollgruppe, eine in der
Relation geringere Wanddickenzunahme aufweisen. Dieser Unterschied ist aber nicht
signifikant. Die mit EMD-behandelten Tiere zeigen eine signifikant (p<0,05) dickere
Gefäßwand, bezogen auf das Lumen der Gefässe. Die ZDF-fatty-Tiere zeigen eine in
der Relation größere Dickenzunahme der Gefäßwand, verglichen mit den ZDF-lean-
Tieren. Dieser Unterschied ist allerdings nicht signifikant.
Das kann ein Hinweis darauf sein, dass EMD nicht in gleichem Maße wie Metformin
bzw. das Placebo-Präparat zu einer reduzierten Gefäßwand –Dicke führt.
Die Längendichte der Kapillaren als Maß für die Blut- und Sauerstoffversorgung des
Myokards ist in der mit EMD behandelten Tiergruppe signifikant (p<0,001)
erniedrigt, verglichen mit der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe. Auch im Vergleich mit der
Metformin-Gruppe ist die Kapillarisierung der mit EMD behandelten Tiere
tendentiell niedriger. Dieser Unterschied ist nicht signifikant. Zudem zeigen die mit
EMD behandelten Tiere eine signifikant (p<0,05) geringere Volumendichte der
intramyokardialen Kapillaren, was bedeutet, dass der prozentuale Anteil des
Kapillarvolumens in der EMD-Gruppe signifikant erniedrigt ist. Hier ist der
Unterschied zur Metformin-behandelten Tiergruppe ebenfalls signifikant (p<0,05).
Auch die Werte der interkapillären Distanz ergeben eine ähnliche Tendenz. Die
höchsten Abstände zwischen den einzelnen Kapillaren konnten bei der EMD-
behandelten Gruppe gemessen werden. Im Vergleich dazu war die interkapilläre
Distanz bei den Placebo-behandelten fatty-Tieren signifikant niedriger (p<0,001).
Dieser Zusammenhang bekräftigt die geringere myokardiale Kapillarversorgung bei
den EMD-behandelten Tieren, verglichen mit der Placebo-behandelten Kontrolle und
den Tieren, die mit Metformin behandelt wurden.
77
6.3 Schlussfolgerung
Die allgemein bekannten Zusammenhänge, in welcher Form der Diabetes mellitus
Typ 2 sich auf Strukturen des kardiovaskulären Systems auswirkt, sind mittels
verschiedener Studien umfassend erforscht worden und finden sich in den aktuell
gültigen Therapieleitlinien wieder.
Zusammenfassend spiegeln die laborchemischen Ergebnisse der vorliegenden
tierexperimentellen Arbeit nur teilweise die aktuelle Studienlage wider. Dies mag
unter anderem daran liegen, dass viele der zitierten Studien randomisierte klinische
Studien sind und sich nur teilweise mit tierexperimentellen Studien korrelieren
lassen.
Die morphologischen Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich anhand der aktuellen
Literatur in vielen Teilen nachvollziehen. Hier ergeben sich deutliche Unterschiede
zwischen der EMD- und der Metformin-Behandlung, vor allem bezüglich der
kapillären Versorgung des Myokards sowie der Veränderung der arteriellen
Wandstruktur. Auch im Bereich der unerwünschten Begleiterscheinungen, z.B. der
Zunahme des Körpergewichtes oder der Laktatazidose, kann EMD keine Vorteile
gegenüber Metformin aufweisen.
Daher ist es aufgrund der vorliegenden tierexperimentellen Daten zunächst nicht
naheliegend, EMD als adäquate Alternative zu Metformin in der antidiabetischen
Therapie zu sehen.
78
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85
8. Abkürzungsverzeichnis
AMP Adenosinmonophosphat AT-II Angiotensin II BMI Body Mass Index DDG Deutsche Diabetes Gesellschaft D.m. Diabetes mellitus EKG Elektrokardiogramm FAU Friedrich-Alexander-Universität Erlangen/Nürnberg GLUT Glukose Transporter HDL High-Density-Lipoprotein HOPE Heart Outcomes Prevention Study IGF Insulin-like Growth Factor i.v. intravenös KG Körpergewicht KHK Koronare Herzkrankheit LDL Low-Densitiy-Lipoprotein LV Linker Ventrikel Met Metformin MONICA MONitoring CArdiovascular disease NIDDM Non-Insulin-Dependent Diabetes mellitus PAI-I plasminogen activator inhibitor I TGF Transforming Growth Factor UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study VLDL Very-Low-Density-Lipoprotein WHO World Health Organization ZDF Zucker Diabetic Fatty
86
9. Danksagung
Ich möchte mich bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann für die Überlassung
des Themas und die gute Betreuung während der gesamten Dauer dieser
Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. med. A. Hartmann, Direktor des Pathologisch-Anatomischen
Instituts der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, danke ich
für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und der personellen Kapazitäten,
sowie die Möglichkeit, am Pathologischen Institut zu promovieren.
Besonders bedanken möchte ich mich bei den Mitarbeitern der AG Amann,
allen voran Monika Klewer, Miriam Reutelshöfer und Stefan Söllner, die mir
in vielen Fragestellungen und bei der Einarbeitung in die notwendigen
Arbeitsschritte eine große Hilfe waren. Auch die Mitdoktoranden trugen durch
die gute Einweisung in die Methodik und ihre große Hilfsbereitschaft
maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.
Schließlich gilt mein Dank meiner Familie, die den Fortgang der Arbeit mit
großem Interesse verfolgt und mich während jeder Arbeitsphase in vielerlei
Hinsicht unterstützt hat.
87
10. Lebenslauf
Name: Ulrike Götze Geburtsdatum/-ort: 02. Oktober 1983 Eltern: Mutter: Kerstin Götze, geb. Deml, Gymnasiallehrerin Biologie, Chemie Vater: Hans-Ulrich Götze, Gymnasiallehrer Geographie, Sport Adresse: Hallstädter Weg 3 90425 Nürnberg Email: [email protected] Familienstand: ledig Schulbildung: 09/1990 - 08/1994 Grundschule: Dunant-Schule, Nürnberg 09/1994 - 06/2003 Melanchthon-Gymnasium, Nürnberg 06/2003 Abitur Hochschulstudium: Seit 09/2003 Studentin der Humanmedizin an der Friedrich-
Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
am 28/09/2005 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 12/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Famulaturen: 08/2006 Famulatur am Universitätsspital Basel (Schweiz),
Medizinische Klinik 1, Bettenstation mit Schwerpunkt Gastroenterologie und Hämatologie
02/2006-04/2006 Famulatur im Labor der klinisch-chemischen
Demenzdiagnostik in der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg
08/2007 Famulatur in der Dermatologischen Universitätsklinik
Erlangen-Nürnberg
88
03/2007 Praxisfamulatur in der Anästhesiologischen Gemeinschaftspraxis Dr. Schacher/Dr. Weber Erlangen
02/2008-03/2008 Famulatur in der Ambulanz der Kinder- und
Jugendabteilung für psychische Gesundheit der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg
Praktisches Jahr: 15/08/2008 – 05/12/2008 Erstes Tertial in den Medizinischen Kliniken 1 und 2 des Universitätsspitals Basel (Schweiz) 08/12/2008 – 27/03/2009 Wahltertial in der Kinder- und Jugendabteilung für
psychische Gesundheit der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg
04/2009 - 07/2009 Drittes Tertial in der Chirurgischen Klinik des
Klinkums Nürnberg (Allgemeinchirurgie und Unfallchirurgie)
Sprachkenntnisse: Englisch, Grundkenntnisse Französisch und Italienisch, großes Latinum, großes Graecum Nürnberg, 03.11.2009