Untersuchung des Einflusses von Metformin und EMD 387008 ... · Aus dem Pathologischen Institut der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Leiter: Prof. Dr. med. Hartmann

Aus dem

Pathologischen Institut

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Leiter:

Prof. Dr. med. Hartmann

Untersuchung des Einflusses von Metformin und EMD 387008 auf

kardiovaskuläre Strukturen sowie laborchemische und physiologische Parameter im

tierexperimentellen Modell der diabetogenen ZDF-Ratte

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Vorgelegt von

Ulrike Götze

aus

Leisnig

2009

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. Dr. med. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. med. K. Amann Korreferent: Prof. Dr. med. K. F. Hilgers Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2010

Inhaltsverzeichnis 1.a Zusammenfassung............................................................................................ 1

1.a.1 Hintergrund und Ziele .................................................................................. 1 1.a.2 Methoden ..................................................................................................... 1 1.a.3 Ergebnisse .................................................................................................... 1 1.a.4 Schlussfolgerung .......................................................................................... 2

1.b Abstract ............................................................................................................ 3 1.b.1 Purpose..................................................................................................... 3 1.b.2 Methods.................................................................................................... 3 1.b.3 Results ...................................................................................................... 3 1.b.4 Conclusions .............................................................................................. 4

2. Einleitung ............................................................................................................. 5 2.1 Diabetes mellitus.......................................................................................... 5

2.1.1 Definition ............................................................................................. 5 2.1.2 Epidemiologie ...................................................................................... 5 2.1.3 Klassifikation: ...................................................................................... 7 2.1.4 Diabetes mellitus Typ II....................................................................... 9 2.1.5 Kardiovaskuläre Komplikationen ...................................................... 10

2.1.5.1 Makroangiopathie .......................................................................... 10 2.1.5.2 Mikroangiopathie ........................................................................... 12

2.1.6 Antihyperglykämische Behandlung des Diabetes mellitus Typ II mit Metformin .......................................................................................................... 13

2.1.6.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik ...................................... 13 2.1.6.2 Indikation ....................................................................................... 14 2.1.6.3 Unerwünschte Wirkungen und Kontraindikationen ...................... 15

3. Material und Methoden ...................................................................................... 17 3.1 Versuchstiere.............................................................................................. 17 3.2 Tiermodell .................................................................................................. 17 3.3 Studiendesign ............................................................................................. 18 3.4 Perfusionsfixation ...................................................................................... 20 3.5 Gewebeaufbereitung .................................................................................. 21

3.5.1 Orientator ........................................................................................... 21 3.5.2 Herstellung mikroskopische Präparate............................................... 22

3.5.2.1 Aufbereitung Herz.......................................................................... 22 3.5.2.2 Zuschnitt Präparate......................................................................... 22 3.5.2.3 Herstellung mikroskopischer Präparate - Semidünnschnitttechnik22 3.5.2.4 Aufbereitung der Aorten ................................................................ 23

3.6 Morphometrie und Stereologie .................................................................. 23 3.6.1 Messverfahren .................................................................................... 23

3.6.1.1 Integrationsplatte............................................................................ 23 3.6.1.2 Bildanalyseverfahren...................................................................... 25

3.6.2 Volumendichte (Vv)........................................................................... 26 3.6.3 Längendichte (Lv).............................................................................. 26 3.6.4 Interkapilläre Distanz (ICD) .............................................................. 27 3.6.5 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Parameter ............................ 27 3.6.6 Intramyokardiale Arteriolen – relative Parameter.............................. 28 3.6.7 Aorta – absolute und relative Parameter ............................................ 28

3.7 Statistik....................................................................................................... 30 4. Ergebnisse .......................................................................................................... 31

4.1 Allgemeine Parameter................................................................................ 31

4.1.1 Körper- und Herzgewicht, Körperlänge............................................. 31 4.1.2 Parameter des Glucosestoffwechsels ................................................. 35 4.1.3 Blutfette und Laktat............................................................................ 38 4.1.4 Parameter der Nierenfunktion ............................................................ 41 4.1.5 Elektrolyte .......................................................................................... 47 4.1.6 Nahrungs- und Trinkmenge ............................................................... 49

4.2 Intramyokardiale Parameter ....................................................................... 50 4.2.1 Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums ............................ 50 4.2.2 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte ........................... 53 4.2.3 Intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte ............................ 54 4.2.4 Kapillarisierung des Myokards .......................................................... 56

4.3 Veränderungen der Aorta........................................................................... 59 4.3.1 Wandveränderungen der Aorta – absolute Werte .............................. 59

5. Fotodokumentation ............................................................................................ 61 5.1 Intramyokardiale Arteriolen....................................................................... 61 5.2 Intramyokardiale Kapillarisierung ............................................................. 62

6. Diskussion.......................................................................................................... 63 6.1 Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 auf kardiovaskuläre Strukturen unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse .......................................................... 63

6.1.1 Auswirkungen einer Hyperglykämie auf kardiovaskuläre Strukturen63 6.1.2 Auswirkungen einer Dyslipidämie und Insulinresistenz auf kardiovaskuläre Strukturen ................................................................................ 65 6.1.3 Mikroalbuminurie und kardiovaskuläre Schäden .............................. 67 6.1.4 Endotheliale Dysfunktion und kardiovaskuläre Schäden .................. 68 6.1.5 Linksventrikuläre Hypertrophie ......................................................... 69

6.2 Vergleich von Metformin und EMD bezüglich ihrer Wirkung auf Symptome des Diabetes mellitus Typ 2 unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse .............................................................................................................. 70

6.2.1 Metformin und EMD in der Therapie der Insulinresistenz................ 70 6.2.2 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Hyperglykämie ........ 71 6.2.3 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Dyslipidämie ........... 72 6.2.4 Metformin – Auswirkungen auf die endotheliale Dysfunktion ......... 72 6.2.5 Metformin und EMD – Risiko einer Laktatazidose........................... 73 6.2.6 Metformin und EMD – Auswirkungen auf das Körpergewicht ........ 74 6.2.7 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die arterielle Wandstruktur und Kapillarisierung des Myokards ................................................................... 75

6.3 Schlussfolgerung ........................................................................................ 77 7. Literaturverzeichnis............................................................................................ 78 8. Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... 85 9. Danksagung........................................................................................................ 86 10. Lebenslauf ...................................................................................................... 87

1

1.a Zusammenfassung

1.a.1 Hintergrund und Ziele

Diabetes mellitus Typ 2 ist die vierthäufigste Todesursache in den Industrieländern.

Durch den Einsatz von Metformin in der antihyperglykämischen Therapie ist es

möglich, die Häufigkeit der mikrovaskulären als auch makrovaskulären

Komplikationen signifikant zu senken. Darüber hinaus werden durch Metformin

auch andere Risikofaktoren für die Entwicklung einer Atherosklerose günstig

beeinflusst (z.B. Hyperglykämie, Dyslipidämie, endotheliale Dysfunktion). In der

vorliegenden Studie sollen mit Hilfe eines tierexperimentellen Modells die

Auswirkungen einer Behandlung mit Metformin mit der eines neuen Wirkstoffs,

EMD 387008, auf kardiovaskuläre Strukturen verglichen werden

1.a.2 Methoden

In dieser Versuchsreihe wurde das diabetogene Modell der ZDF-Ratten verwendet,

wobei der fatty-Typ Merkmale eines Diabetes mellitus Typ 2 aufweist, der Wildtyp

(lean) nicht. Die 6 randomisierten Versuchsgruppen wurden wie folgt eingeteilt: 2

unbehandelte Gruppen (lean und fatty), die nach 10 Wochen untersucht wurden, die

restlichen 4 Gruppen (lean + Placebo-Präparat, fatty + Placebo-Präparat, fatty +

Metformin, fatty + EMD 387008) wurden nach weiteren 16 Wochen analysiert. Die

Rattenherzen und die Aorten wurden mittels morphometrischer Verfahren und

halbautomatischer Bildanalyse hinsichtlich histologischer Parameter ausgewertet.

Zusätzlich wurden laborchemische und physiologische Parameter bestimmt.

1.a.3 Ergebnisse

Die direkte Auswirkung des Diabetes mellitus Typ 2 auf eine verstärkte

linksventrikuläre Hypertrophie konnte, wenn auch nicht signifikant, so doch von der

Tendenz her in dieser Arbeit gezeigt werden. Eine myokardiale Fibrose und

Kollagenablagerung als frühe myokardiale Schäden infolge der Hyperglykämie

können in der vorliegenden Arbeit nicht signifikant gezeigt werden.

2

Es zeigt sich tendentiell (nicht signifikant) eine geringere Dickenzunahme der

arteriellen Gefäßwand bei den mit Metformin behandelten Tieren, verglichen mit der

Kontrollgruppe, die mit Placebo behandelt wurde. Die mit EMD behandelten Tiere

zeigen eine signifikant (p<0,05) dickere Gefäßwand, bezogen auf das Lumen der

intramyokardialen Arteriolen.

Die Tiere, die mit EMD behandelt wurden, zeigen eine signifikant (p<0,001)

geringere Kapillarisierung des Myokards, verglichen mit der ZDF-F-P-Gruppe. Auch

im Vergleich mit der Metformin-Gruppe ist die Kapillarisierung der mit EMD

behandelten Tiere tendenziell niedriger, aber nicht signifikant.

1.a.4 Schlussfolgerung

Zusammenfassend spiegeln die laborchemischen Ergebnisse dieser Arbeit nur

teilweise die aktuelle Studienlage wider. Die morphologischen Ergebnisse dieser

Arbeit lassen sich anhand der aktuellen Literatur in vielen Teilen nachvollziehen. Es

ergeben sich Nachteile des Medikamentes EMD, verglichen mit Metformin, vor

allem bezüglich der kapillären Versorgung des Myokards sowie der Veränderung der

arteriellen Wandstruktur. Auch im Bereich der unerwünschten Begleiterscheinungen

kann EMD, z.B. im Bereich der Zunahme des Körpergewichtes oder der

Laktatazidose, keine Vorteile gegenüber Metformin aufweisen.

Daher ist es aufgrund der vorliegenden tierexperimentellen Daten zunächst nicht

naheliegend, EMD als adäquate Alternative zu Metformin in der antidiabetischen

Therapie zu sehen.

3

1.b Abstract

1.b.1 Purpose

Type 2 diabetes is the fourth commonest cause of death in the industrialised

countries. The use of Metformin in the antihyperglycaemic therapy makes is possible

to reduce the incidence of microvascular as well as macrovascascular complications

significantly. Furthermore Metformin has a beneficial effect on other risk factors for

the development of atherosclerosis (e.g. hyperglycaemia, dyslipidaemia, endothelial

dysfunction). The aim of this study is to compare the effects of Metformin and EMD

387008 treatment on cardiovascular structures using an animal experiment.

1.b.2 Methods

In this test series diabetogenic ZDF-rats were used. The fatty type is characterized by

having type 2 diabetes as opposed to the “healthy” wild (lean) type. The six

experimental groups were randomised and arranged as follows: two groups (lean and

fatty respectively) remained untreated and were investigated after ten weeks, the

other 4 groups (lean + Placebo, fatty + Placebo, fatty + Metformin, fatty + EMD

387008) were analysed after further 16 weeks. Semi-thin-sections of the rats´ cardiac

tissue and aorta were analysed regarding histological parameters, applying

morphological methods and semiautomatic image analysis. Additionally, laboratory-

and physiological parameters were defined.

1.b.3 Results

This study illustrates, though not significantly, the primary effect of type 2 diabetes

on an increased left-ventricular hypertrophy, while myocardial fibrosis and

collagenous deposit as early myocardial damages due to hyperglycemia could not be

shown. In the group treated with Metformin it was found that the vascular walls had

not as much increased in thickness as in those belonging to the Placebo-group,

whereas the EMD-group showed a significant increase (p<0,05) in vascular wall-

thickness in relation to the lumen of the intramyocardial arterioles.

This can be taken as indication, that EMD is not as effective in reducing vascular

wall-thickness as Metformin and the used Placebo compound respectively.

4

Myocardial capillarisation was significantly lower (p<0,001) in the EMD-group than

in the ZDF-F-P-group. Thus, taking into account the figures of intercapillary

distance, it becomes clear that the myocardial capillary supply of the EMD-group is

lower than that of the group under treatment with Metformin, but not significantly.

1.b.4 Conclusions

In summary, the laboratory results of this study only partly confirm those of the

currently available literature on the subject. The morphological results can be

explained to a wide extent with the aid of existing studies. Some disadvantages of

EMD compared with Metformin are illustrated, especially concerning the myocardial

capillary supply and changes of the arterial wall structure. With regard to adverse

effects, as well, EMD does not present any advantages over Metformin, e.g. in

increase of bodyweight or lactate acidosis.

Because of the present data from this animal experiment, at the moment EMD should

not be considered as an alternative to Metformin in the area of antidiabetic therapy.

5

2. Einleitung

2.1 Diabetes mellitus

2.1.1 Definition

Das Wort Diabetes mellitus leitet sich aus dem Altgriechischen ab und bedeutet

soviel wie „honigsüßer Durchfluss“. Es bezeichnet eine durch den Leitbefund

chronische Hyperglykämie charakterisierte Stoffwechselerkrankung, die auf

einem relativen (verminderte Insulinwirkung) oder absoluten Insulinmangel

(gestörte Insulinsekretion) beruht. Nach längerer Krankheitsdauer kann die

chronische Hyperglykämie über die diabetesspezifische Mikroangiopathie zu

Folgeerkrankungen, insbesondere an Augen, Nieren, Herz, Nervensystem sowie

über die diabetesassoziierte Makroangiopathie zu Folgeschäden an Herz, Gehirn

und peripheren Arterien führen ([25], [28]).

2.1.2 Epidemiologie

Vom Robert-Koch-Institut [56] wurde eine repräsentative Stichprobe der 18-

79jährigen Wohnbevölkerung in Deutschland sowohl mittels eines

Selbstausfüllfragebogens sowie durch einen Arzt nach ihren bisherigen

Erkrankungen gefragt. Unter Zugrundelegung der Ergebnisse der ärztlichen

Befragung ergibt sich eine Diabetesprävalenz von 4,7% für Männer und 5,6% für

Frauen in der untersuchten Altersgruppe. Die Befundhäufigkeit steigt mit dem

Alter steil an. Nahezu jede fünfte Frau im Alter von 70 bis 79 Jahren hat nach

den vorliegenden Daten einen Diabetes mellitus.

Die Krankheit ist in den neuen Bundesländern deutlich häufiger als in den alten

Ländern. Etwa ein Viertel der Diabetiker benutzt Insulin, weit über 40% werden

mit oralen Antidiabetika therapiert. Bei etwa der Hälfte der nicht medikamentös

behandelten Diabetiker wurde aus Sicht der befragenden Ärzte keine Diät

eingehalten (ca. 15%). Der Anteil an unerkannten Diabetikern in der betrachteten

Population wird aufgrund von Blut- und Urinmeßwerten (Serum- und

Uringlukose, Fructosamin, HbA1c) auf etwa 1% geschätzt.

6

Tabelle 2-1: Anteil der Behandlungsformen (%) bei den im Bundes-Gesundheitssurvey vom

befragenden Arzt als Diabetiker eingestuften 18- bis 79jährigen Teilnehmern. N=369, gewichtet

entsprechend der Bevölkerungsstruktur des Jahres 1998 [56]

Nach Schätzungen der WHO steigt die globale Diabetes-Prävalenz, auch wenn das

Ausmaß an Übergewicht in der Weltbevölkerung konstant bliebe [61]. Die Daten der

WHO zeigen zudem, dass die globale Prävalenz für alle Altersgruppen im Jahre 2000

bei 2,8% lag und 2030 schätzungsweise 4,4% betragen wird. Das bedeutet, dass die

Anzahl von weltweit 171 Millionen Diabetes-Erkrankten im Jahre 2000 auf

vermutlich 366 Millionen im Jahre 2030 ansteigen wird (s.Tab.2-2). Den größten

Anteil an Diabetikern wird, nach weltweiten demographischen Schätzungen, die

Gruppe der 45- bis 64-Jährigen stellen. Da die Typ II-Diabetiker mit 90% den

größten Anteil ausmachen und 80% dieser Gruppe zusätzlich adipös sind [25], liegt

es nahe, diesen Umstand auf die veränderten Lebensgewohnheiten, die sich in

Überernährung bei gleichzeitigem Bewegungsmangel manifestieren, zurückzuführen.

Beide gelten als Hochrisiko-Faktoren für den Diabetes mellitus Typ II. Mit der

zukünftig höheren Lebenserwartung führt dieser Umstand demnach zu einer

vermutlich kontinuierlich steigenden Inzidenz dieser Erkrankung.

Behandlung Männer

Frauen

gesamt West Ost gesamt

West Ost

Insulin auch kombiniert 24,5 21,8 31,5 24,6 25,9

20,7

orale Antidiabetika* 46,0 47,9 41,0 43,4 41,6 48,7

Diät 12,9 12,9 13,1 17,3 17,5 16,8

keine Behandlung 16,6 17,4 14,4 14,7 15,0 13,8

* auch mit Diät

7

Tabelle 2-2: Geschätzte Anzahl Erwachsener mit Diabetes, aufgeführt nach Altersgruppen,

Jahreszahl und Länderkategorien (Entwickelte Länder, Entwicklungsländer und

zusammengefasst als „world“) [58]

2.1.3 Klassifikation:

Die aktuelle Klassifikation beruht auf der nosologischen Klassifikation des

Diabetes mellitus der Amerikanischen Diabetes Gesellschaft [28], die auf

Empfehlungen der WHO von 1965 basieren. Diese ätiologische Einteilung

beinhaltet zum einen den Diabetes mellitus Typ I, der wiederum in einen

immunologisch bedingten und einen (in Europa seltenen) idiopathischen Typ

unterteilt wird und durch beta-Zelldestruktion zu einem absoluten Insulinmangel

führt. Zum anderen spricht man vom Diabetes mellitus Typ II, der sich von einer

vorwiegenden Insulinresistenz mit relativem Insulinmangel bis zu einem

vorwiegend sekretorischen Defekt mit Insulinresistenz erstrecken kann. Zuletzt

8

werden alle anderen spezifischen Diabetes-Typen in einer eigenständigen Gruppe

zusammengefasst (s.Tab. 2-3)

Tabelle 2-3: Nosologische Klassifikation des Diabetes mellitus [26]

I. Typ 1 Diabetes

A. Immunologisch vermittelt

B. Idiopathisch

II. Typ 2 Diabetes

III. Andere spezifische Diabetes-Typen

A. Genetische Defekte der B-Zell-Funktion

B. Genetische Defekte der Insulinwirkung

C. Erkrankungen des exokrinen Pankreas

D. Endokrinopathien

E. Medikamenten- oder chemikalieninduziert

F. Infektionen

G. Seltene Formen des immunvermittelten Diabetes,

H. Andere, gelegentlich mit Diabetes assoziierte genetische Syndrome

IV. Gestationsdiabetes

Als Kriterien für die Diagnosestellung „Diabetes mellitus“ sind festgelegt:

1. Plasma-Glucosekonzentrationen von ≥ 200mg/dl (≥11,1mmol/l) mit

Symptomen des

Diabetes mellitus (z.B. Polyurie, Polydipsie) im Rahmen einer Gelegenheits-

Blutzuckerkontrolle (zu jeder Tageszeit ohne Beziehung zu Mahlzeiten)

2. Nüchterne Plasma-Glucosekonzentrationen (keine Nahrungsaufnahme ≥ 8

Stunden) ≥126mg/dl (≥7,0 mmol/l)

9

3. Plasma-Glucosekonzentrationen ≥ 200mg/dl (≥11,1mmol/l) während eines

oralen Glucosetoleranztests (OGTT) 2 Stunden nach der Gabe von 75mg

Glucose [25]

2.1.4 Diabetes mellitus Typ II

Der Diabetes mellitus Typ II lässt sich auf zwei pathogenetische Mechanismen

zurückführen: zum einen ist die frühe postprandiale Insulinsekretion gestört [44],

was zu einer postprandialen Hyperglykämie führt. Zum anderen weisen die Patienten

eine herabgesetzte Insulinwirkung (Insulinresistenz) auf, die sowohl auf einen Prä-

Insulinrezeptordefekt, als auch auf einen Rezeptordefekt mit konsekutiver

Herabregulierung als auch auf einen Post-Rezeptordefekt mit einer gestörten

Signaltransduktion (z.B. Tyrosinkinasen) zurückgeführt werden kann ([29], [63]).

Manifestationsfaktoren für den Typ II-Diabetes können das metabolische Syndrom,

genetische Faktoren, Stressfaktoren (z.B. Traumen, Infektionen, Operationen), aber

auch Endokrinopathien oder Medikamente (s.Tab. 2-3) sein. Das metabolische

Syndrom bezeichnet das Zusammentreffen der Risikofaktoren

- stammbetonte Adipositas

- Dyslipoproteinämie

- Essentielle Hypertonie

- Glucosetoleranzstörung/D.m. Typ II [25]

Der circulus vitiosus dabei besteht zunächst in einer Insulinresistenz der

insulinabhängigen Gewebe (z.B. Myozyten), sodass erhöhte Insulinspiegel für die

Glucoseverwertung benötigt werden. Da eine Hyperinsulinämie zu einem verstärkten

Hungergefühl führt, kann dieses wiederum zu Adipositas mit einem erhöhten Risiko

für Atherosklerose führen.

Außerdem vermindert ein zu hoher Insulinspiegel die Sensibilität und Dichte der

Insulinrezeptoren (Herabregulierung) und damit auch der Insulinwirkung. Dieses

Phänomen führt in der Endstrecke wiederum zu einer erhöhten Insulinausschüttung.

Dieser Umstand erklärt, warum in der Therapie des Typ II-Diabetes (im Gegensatz

zum Typ I) weniger die Insulinsubstitution als vielmehr eine Ernährungsumstellung,

körperliche Aktivität sowie die orale antidiabetische Therapie im Vordergrund

stehen.

10

Die Vererbung des Diabetes mellitus erfolgt polygen-multifaktoriell. Die zugrunde

liegenden genetischen Faktoren sind im Detail noch unbekannt. In Untersuchungen

an eineiigen Zwillingen kann beobachtet werden, dass zu ca. 90 % beide Geschwister

an einem Typ 2 Diabetes erkranken [28]. Die genetische Penetranz ist also sehr hoch.

Ein Typ 2 Diabetes kann in seltenen Fällen auch bei Jugendlichen auftreten [26].

International wird in den letzten Jahren eine Zunahme dieser Fälle beschrieben.

2.1.5 Kardiovaskuläre Komplikationen

Man unterscheidet bei den diabetischen Gefäßschäden zwischen einer unspezifischen

Makroangiopathie und einer diabetesspezifischen Mikroangiopathie mit Verdickung

der kapillären Basalmembranen. Diese Basalmembranverdickung ist abhängig von

der Dauer des Diabetes und der Güte der Stoffwechseleinstellung. Dabei führt die

langfristig erhöhte Glucose-Konzentration zu einer nicht-enzymatischen

Glykosilierung von Proteinen und Kollagenen sowie zu einer Lamininvermehrung.

Als Folge dieser nicht-reversiblen Proteinglykosilierung wird die

Kollagenvernetzung in den Basalmembranen der kleinen Gefäße beeinträchtigt ([25],

[47]).

2.1.5.1 Makroangiopathie

Die diabetische Makroangiopathie gleicht im Wesentlichen der Atherosklerose des

Nicht-Diabetikers. Die wichtigsten Folgezustände sind Koronarsklerose (Risiko des

Myokardinfarkts), Zerebralsklerose (arterielle Verschlusskrankheit der Hirnarterien

und Risiko des ischämischen Hirninfarkts) und periphere Dirchblutungsstörungen

(periphere arterielle Verschlusskrankheit [pAVK], diabetische Gangrän) [47]. Die

Makroangiopathie manifestiert sich auch bei Diabetikern überwiegend als koronare

Herzkrankheit (KHK), periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) und

zerebrovaskuläre Insuffizienz [17].

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigsten Folgeschäden bei Diabetikern

und erklären die hohe Morbidität und Mortalität dieser Patienten [57]. Typ 2

Diabetes erhöht das kardiovaskuläre Risiko um einen Faktor von zwei bis vier. In

den Industrieländern ist der Diabetes mellitus die viert häufigste Todesursache,

wobei kardiovaskuläre Erkrankungen bei Diabetikern für 75 Prozent der

11

Gesamtmortalität verantwortlich sind [16]. Die KHK liegt mit großem Abstand an

erster Stelle der Todesursachen. Aufgrund von Herzkrankheiten beträgt die jährliche

Durchschnittsmortalität bei Personen mit Typ 2 Diabetes 5,4 Prozent und ist doppelt

so hoch wie bei altersgleichen Nichtdiabetikern. Die Lebenserwartung für Typ 2

Diabetiker ist deshalb im Schnitt um 5 bis 10 Jahre vermindert.

Nach den Daten der Augsburger MONICA-Studie [17] ist die Inzidenz des

Myokardinfarktes bei Männern mit Diabetes mellitus 3,7fach (95 Prozent CI 3,5 bis

3,9) und bei diabetischen

Frauen 5,9fach (95 Prozent CI 5,5 bis 6,4) erhöht im Vergleich zu Nichtdiabetikern.

In der Paris Prospective Study [17] betrug die Prävalenz der koronaren

Herzerkrankung bei Typ 2 Diabetikern ca. 40 Prozent für Männer und ca. 45 Prozent

für Frauen. Das Risiko für eine koronare Herzerkrankung nimmt sowohl bei

Patienten mit Typ 1 als auch mit Typ 2 Diabetes mit der Länge der Diabetesdauer zu.

Die Prävalenz einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK), definiert als

Knöchel-Arm-Dopplerindex weniger als 0,9, beträgt bei Patienten mit Diabetes

mellitus

20,9 Prozent, bei Personen ohne Diabetes mellitus 7,0 Prozent [17]. In einer

deutschen Studie liegt die Prävalenz bei Patienten mit Diabetes mellitus aller

Altersklassen bei 15,9 Prozent, wobei ein eindeutiger Alterstrend besteht [17]. Bei

asymptomatischen Diabetikern nach dem 40. Lebensjahr beträgt die Prävalenz über

20 Prozent. Die Inzidenz liegt zwischen 12,6 und 21,3 pro 1000 Patientenjahre für

Männer und zwischen 8,4 und 17,6 pro 1000 Patientenjahre für Frauen [17].

Nach den Ergebnissen der Framingham und der Honolulu Heart Study ist die

Inzidenz von Schlaganfällen bei Diabetikern um den Faktor zwei bis drei gesteigert

[48].

Die Apoplexinzidenz liegt für Männer bei 62,3 pro 1000 Patienten mit Diabetes

mellitus. Bei Patienten mit entweder Typ 2 Diabetes oder erhöhtem

Nüchternblutzucker liegt die Prävalenz hochgradiger Karotisstenosen bei 8,2 Prozent

[17].

12

2.1.5.2 Mikroangiopathie

Zu den mikroangiopathischen Veränderungen werden folgende

Erkrankungen/Symptomenkomplexe gezählt:

- Glomerulosklerose

- Retinopathie

- Neuropathie

- Mikroangiopathie der intramuralen kleinen Koronararterienäste (small vessel

disease)

Als diabetische Mikroangiopathie bezeichnet man das weitgehend

diabetesspezifische,

sogenannte renale-retinale Syndrom [17]. Prinzipiell ist aber kein Kapillargebiet

ausgespart. An den Folgen gemessen dominieren jedoch die Kapillargebiete im

Augenhintergrund und in den Nierenglomerula. Die Mikroangiopathie wird auch bei

der Neuropathie des vegetativen Nervensystems als ein ätiopathogenetischer Faktor

diskutiert. So tritt die autonome diabetische Neuropathie (ADN) neben dem

Gastrointestinaltrakt, dem Urogenitalsystem und der Thermoregulation auch im

kardiovaskulären System auf. Kardiovaskuläre ADN sind bei ca. 15% der Diabetiker

zum Zeitpunkt der Diagnosestellung zu beobachten, nach 20jähriger Krankheitsdauer

sogar bei >50%. Die ADN können sich in einer stummen Myokardischämie sowie

schmerzlosen Myokardinfarkten äußern, die in diesem Zusammenhang zu einer

erhöhten Mortalität führen können. Weiterhin lässt sich bei Patienten, die von einer

kardiovaskulären ADN betroffen sind, eine verminderte Herzfrequenzvariabilität bis

hin zur Frequenzstarre beobachten (z.B. im EKG, während max. In- und Exspiration

während Valsalva-Pressversuch, während eines Orthostasetests). Darüber hinaus

können die Patienten sowohl eine Ruhetachykardie als Ausdruck einer

Vagusschädingung durch die ADN als auch eine asympathikotone orthostatische

Hypotonie als Ausdruck einer Sympathikusschädigung aufweisen. In diesem Fall

sinkt der systolische bzw. diastolische Blutdruck bei einer Stehbelastung ab, wobei

zusätzlich die reflektorische Tachykardie ausbleiben kann. Zuletzt kann auch eine

aufgehobene oder umgekehrte zirkadiane Blutdruckkurve mit erhöhten nächtlichen

Werten ein Hinweis auf die ADN sein ([25], [28]).

13

2.1.6 Antihyperglykämische Behandlung des Diabetes mellitus Typ II mit Metformin

Neben den nicht-pharmakologischen Therapiemaßnahmen (Ernährungs- und

Bewegungstherapie), die in jeder Phase der Erkrankung eine große Rolle spielen,

kommen in der Behandlung des Diabetes mellitus Typ II medikamentöse

antihyperglykämische Therapiemaßnahmen zum Einsatz. Diese werden je nach

pathophysiologischem Stadium der Erkrankung ausgewählt. In den Leitlinien der der

Deutschen Diabetes Gesellschaft wird ein HbA1c-Zielwert von <6,5% angestrebt, als

Interventionsgrenze wird ein Wert von >7% vorgeschlagen [22].

Der HbA1c-Wert sollte in der Regel einmal pro Quartal bestimmt werden, um eine

mittel- bis langfristige Therapie-Überwachung zu gewährleisten [1]

2.1.6.1 Pharmakodynamik und Pharmakokinetik

Metformin ist das einzige Biguanid, das in Deutschland als orales Antidiabetikum

eingesetzt wird [1] und wurde schon vor mehr als 40 Jahren in die Diabetestherapie

eingeführt. Es wirkt nur bei Diabetikern blutglukosesenkend, nicht bei

Stoffwechselgesunden.

Metformin verbessert die Diabeteseinstellung durch Verminderung der

Insulinresistenz vorwiegend an der Leber und zusätzlich im Bereich der Muskulatur,

während die pankreatische Betazellsekretion nicht gesteigert wird [38]. Daher kann

es nur wirken, wenn Insulin vorhanden ist. Es ist allerdings unklar, ob die Reduktion

der hepatischen Glukoseproduktion durch Metformin - v.a. durch die Hemmung der

Gluconeogenese bedingt – oder der erhöhte Glucoseverbrauch in der

Skelettmuskulatur zum blutglucosesenkenden Effekt beitragen.

Metformin hat aber nicht nur einen antihyperglykämischen Effekt. Bei Diabetikern

und adipösen Nicht-Diabetikern führt es zu einer Reduktion der freien Fettsäuren und

der Lipidoxidationsrate [38]. Zusätzlich hat Metformin einen antithrombotischen

Effekt durch einen Abfall von PAI-1 im Plasma.

In den Hepatocyten wirkt Metformin als Kation, das die Plasmamembran und die

innere Mitochondrienmembran passiert. Dort bewirkt es eine mäßige Hemmung der

Atmungskette, was zu einem Anstieg der AMP-Konzentration im Zytosol führt.

AMP stimuliert in der Folge die AMP-aktivierte Protein-Kinase, die Enzyme hemmt,

14

die an der Produktion von Glucose und Triglyceriden beteiligt sind. Darüber hinaus

wird die Expression von Genen gehemmt, die bei der Lipidsynthese eine Rolle

spielen. Durch diese Produktonshemmung werden die Glucose- und

Triglyceridspiegel im Plasma gesenkt.

Metformin wird langsam und vollständig resorbiert. Es zeigt eine Bioverfügbarkeit

von 50-60%, da es nicht metabolisiert und unverändert renal eliminiert wird. Die

Plasma-Halbwertzeit beträgt 1,5-4 Stunden. Akkumulationen werden für die

Speicheldrüsen, den Darm, die Leber und die Nieren beschrieben. Im Gegensatz zur

sofortigen Wirkung von Sulfonylharnstoffen setzt der blutzuckersenkende Effekt von

Metformin erst nach einigen Applikationstagen ein.

2.1.6.2 Indikation

Eine Indikation für die Gabe von Metformin besteht bei übergewichtigen Patienten

(BMI >25 bis 27 kg/m²) mit Diabetes mellitus Typ 2, bei denen ein Therapieversuch

mit Gewichtsabnahme und Diät nicht zum Erreichen der HbA1c-Zielwerte führt [58].

Die durchschnittliche Blutglukosesenkung um 20% ist allerdings nicht auf

übergewichtige Patienten beschränkt, sondern wird auch bei Patienten mit normalem

Körpergewicht (BMI 24 bis 25 kg/m²) beobachtet.

Darüber hinaus zeigt die UKPDS, dass Metformin sowohl die Häufigkeit

mikrovaskulärer als auch (im Gegensatz zu Glibenclamid) makrovaskulärer

Komplikationen signifikant senkt [1]. Dazu gehören Ereignisse wie Apoplex,

koronare Ereignisse und diabetesbezogener Tod. Dem gegenüber senken

Glibenclamid und Metformin den HbA1c-Wert in vergleichbarer Weise. Daraus

kann der Schluss gezogen werden, dass der Effekt von Metformin auf die

Entwicklung makrovaskulärer Komplikationen nicht mit der Blutglucosesenkung

erklärt werden kann. Die vorteilhafte Änderung der Blutlipide sowie der

antithrombotische Effekt von Metformin treten bei dieser Fragestellung daher in den

Vordergrund.

Zusammenfassend dürfte der in der UKPDS nachgewiesene vasoprotektive Effekt

von Metformin darauf zurückzuführen sein, dass diese Substanz mehrere der

bekannten Risikofaktoren für Arteriosklerose günstig beeinflusst:

1) Hyperglykämie

15

2) Dyslipidämie

3) Gerinnungsstörungen

4) endotheliale Dysfunktion [32]

Tabelle 2-4: Effekte von Metformin auf Komponenten des Insulinresistenzsyndroms [22]

Berichtete Effekte Änderung gegenüber Ausgangswert Bereich

%

Effekt auf die Diabeteseinstellung Nüchternblutglukose (mmol/l) � 2-4 � 20-30 Postprandiale Blutglukose (mmol/l)

� 3-6 � 30-40

HbA1c (%) � 1-2 � 10-25 Effekte auf Insulinspiegel

Nüchternplasmainsulinspiegel (µU/ml)

� 0-3,5 � 0-20

Effekte auf Lipidstoffwechsel Serumtriglyceride (mmol/l) � 0-0,10 � 0-30 Serumcholesterin (mmol/l) � 0-0,35 � 0-10 Serum-LDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-1,00 �0-25 Serum-VLDL-Cholesterin (mmol/l)

� 0-0,60 �0-39

Serum-HDL-Cholesterin (mmol/l) � 0-0,16 � 0-17 Freie Fettsäuren (mmol/l) �0-0,15 �0-14 Effekt auf vaskuläre und Hämostaseparameter

Blutdruck (mmHg) Keine Änderung Keine Änderung PAI-1-Spiegel (ng/ml) � 10-15 � 10-45 Peripherer Blutfluss ml/100ml Gewebe /min

� 0-1,0 � 0-25

Effekt auf das Körpergewicht (kg) � 0-4 � 0-6 Schwere hypoglykämische Episoden Monotherapie

Vernachlässigbar Vernachlässigbar

2.1.6.3 Unerwünschte Wirkungen und Kontraindikationen

Am Anfang einer Behandlung mit Metformin treten nicht selten gastrointestinale

Nebenwirkungen (Übelkeit, Magendruck, Flatulenz, Diarrhoe, metallischer

Mundgeschmack) auf [22]. Die gefährlichste unerwünschte Wirkung von Metformin

ist allerdings die Lactatazidose. Die Inzidenz beträgt nach DDG-Leitlinie 0-

0,084/1000 Patientenjahre, wobei die meisten Beroffenen eindeutige

16

Kontraindikationen für Metformin aufweisen. Die Letalität dagegen ist dreifach

geringer [22].

Kontraindiziert ist Metformin bei Patienten mit [1]

- eingeschränkter Nieren- und Leberfunktion (Grenzwert Serumkreatinin: 1,2

mg/dl)

- Pankreatitis

- Alkoholismus

- Azidotischer Stoffwechselstörung

- Hypoxischen Zuständen

- Schwerer kardiovaskulärer Funktionseinschränkung

- Konsumierenden und fieberhaften Erkrankungen

- Reduktionsdiät (< 1000kcal/d)

- Zustand vor, während oder nach einer Operation

- Bevorstehender Röntgenuntersuchung (mit i.v. Kontrastmittel)

- Hohem Lebensalter

- Schwangerschaft [1]

Zusammenfassend lässt sich anführen, dass Metformin trotz der relativ großen

Anzahl an Kontraindikationen verschiedene Vorteile aufweist. Als nicht-beta-

zytotrop wirkendes Medikament führt es in geringem Maß zu hypoglykämischen

Zuständen und kann eine Gewichtszunahme (besonders relevant für adipöse

Patienten) verhindern. Auch andere Komponenten des metabolischen Syndroms (z.B.

Lipidparameter) werden können durch Metformin günstig beeinflusst werden.

17

3. Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

In der nachfolgend beschriebenen Versuchsreihe wird das Modell der „Zucker-

Diabetic-Fatty“-Ratte (ZDF-Ratte) verwendet. Die bei Versuchsbeginn vier Monate

alten Tiere hatten zu Beginn der Versuchsreihe ein Körpergewicht zwischen 230 und

620g. Sie waren einer Raumtemperatur zwischen 21 und 24 °C ausgesetzt. Die

relative Luftfeuchtigkeit betrug in der Tierversuchsanlage betrug zwischen 45 und

60%. Aufgrund einer automatischen Lichtanlage konnte den Tieren ein künstlicher

Tag-Nacht-Rhythmus auferlegt werden (Licht an: 6 Uhr, Licht aus: 18 Uhr). Wasser

und Futter in Form eine Niedrigfett-Diät (4,5g/100g der Provimi Kliba/Nafag

Nr.3433, Kaiseraugst, Schweiz) erhielten die Versuchstiere ad libitum [6].

3.2 Tiermodell

Die männliche ZDF-Ratte stellt ein klinisch relevantes Tiermodell für die

Untersuchung des nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) des

Menschen dar. Demnach weisen alle männlichen Ratten, die über neun Wochen alt

sind, Blutzuckerwerte von 200-400mg/dl auf und erfüllen damit die Kriterien für

einen Diabetes mellitus Typ 2 [43].

Die ZDF-Ratte wurde durch partielle Inzucht aus dem Stamm der Zucker-Ratten

(fa/fa) herausgezüchtet. Diese fa-Mutation wurde 1965 vom Ehepaar Zucker

beschrieben. Die autosomal-rezessiv vererbte Mutation beruht auf einer Veränderung

des Leptin-Rezeptors (fa), die bei homozygoten männlichen Tieren (fa/fa) zu

Hyperphagie, Hyperlipidiämie, Adipositas und nur leicht verminderter

Glucosetoleranz führt [43]. Die fa-Mutation des Leptinrezeptors bewirkt eine

Verkürzung des Rezeptors und in der Folge dessen ungenügende

Interaktionsmöglichkeit mit Leptin. Die daraus resultierenden erhöhten Leptinspiegel

im Blut verursachen die oben beschriebene Adipositas der fa/fa-mutierten

männlichen Ratten. Immer wieder trat jedoch auch ein männlicher Phänotyp mit

stark übergewichtigen männlichen Ratten auf, die sowohl sehr hohe Glukosespiegel

als auch eine gestörten Glukosetoleranz aufwiesen. Diese, ausschließlich männliche

18

Tiere betreffende Spontamuntation, wurde mit normalgewichtigen Zucker Ratten

(+/fa) gepaart, die ein hohes diabetisches Potential in sich trugen. Es handelte sich

dabei fast ausschließlich um Bruder x Schwester Inzucht. Bereits ab der zweiten

Generation konnte ein konstanter Phänotyp herausgezüchtet werden, bei dem der

Diabetes monogenetisch determiniert ist und autosomal nur an männliche

Nachkommmen weitervererbt wird. In der Folge zeigten diese Tiere neben erhöhten

HbA1c-Plasmaspiegeln eine Proteinurie, Hypercholesterinämie,

Hypertriglycerinämie sowie vermehrt freie Fettsäuren im Blut. Weitere Merkmale

dieser männlichen Rattengeneration waren eine Neuropathie und diabetische

Nephropathie sowie Hinweise auf ein gestörte Wundheilung und einen milden

Hypertonus ([43], [8]).

Die weiblichen Nachkommen bilden trotz Fettleibigkeit und Insulinresistenz keinen

Diabetes aus [8]. Bei einer speziellen Diät (RD 13004 von Research Diets)

entwickeln jedoch auch weibliche Tiere einen Diabetes mellitus im Alter von sechs

bis 25 Wochen.

Tiere, die heterozygot für die Mutation im fa-Gen (ZDF-lean fa/+) sind oder dem

Wildtyp entsprechen, entwickeln keinen Diabetes und stellen in diesem Versuch die

Kontrollgruppe dar.

3.3 Studiendesign

Die Tiere wurden randomisiert in sechs Versuchsgruppen aufgeteilt.

Um Aussagen über den Zustand der Tiere vor einer Behandlung (bezüglich der

histologischen Parameter im Myokard und der Aorten) treffen zu können, wurden

jeweils 10 Tiere der ZDF-fatty- und ZDF-lean-Gruppe in ihrer 10. Lebenswoche

untersucht. Die verbleibenden ZDF-fatty-Tiere wurden anschließend randomisiert in

drei Gruppen aufeteilt. Eine Gruppe à 10 Tiere erhielt im Laufe der nächsten 16

Wochen ein Placebo-Präparat, die zweite Gruppe à 10 Tiere wurde auf Metformin

(Dosis: 150 mg/kg/24Std. im Futter) eingestellt. Der dritten Gruppe à 10 Tiere wurde

EMD387008 (Dosis: 200 mg/kg/24Std.) verabreicht.

Es ergibt sich die folgende Aufteilung der Gruppen:

19

1. ZDF-lean, unbehandelt, Versuchsende nach 10 Wochen (n=10)

2. ZDF-fatty, unbehandelt, Versuchsende nach 10 Wochen (n=10)

3. ZDF-L-P, behandelt mit Placebo-Präparat Woche 10-26, Verauchsende nach

26 Wochen (n=9)

4. ZDF-F-P, behandelt mit Placebo-Präparat Woche 10-26, Versuchsende nach

26 Wochen (n=9)

5. ZDF-F-Met, behandelt mit Metformin Woche 10-26, Versuchsende nach 26

Wochen (n=10)

6. ZDF-F-EMD, behandelt mit EMD387008 Woche 10-26, Versuchsende nach

26 Wochen (n=10)

Für die biochemischen Parameter und Größen-/Gewichtangaben der Tiere waren die

Gruppen zumeist vollzählig (10/Gruppe). Allerdings ist anzumerken, dass die

Gruppe ZDF-L-P durchgehend Werte von neun Tieren enthält. Standen für die

Statistik bei einzelnen Parametern in verschiedenen Gruppen weniger Tiere zur

Verfügung, so wird dies im Ergebnisteil in den jeweiligen Wertetabellen gesondert

vermerkt.

Nach zehnwöchiger Versuchsdauer wurden jeweils 10 Tiere der Gruppen ZDF-fatty

und ZDF-lean einer retrograden Perfusionsbehandlung unterzogen und die Herzen

zur späteren Untersuchung entnommen. Für die restlichen Gruppen endete das

Experiment nach einer 16-wöchigen Behandlung im Alter von 26 Wochen mit der

retrograden Perfusionsfixation der Organe.

Ziel des Versuchsaufbaus ist ein Vergleich der kardialen Schädigungen der mit EMD

387008 behandelten ZDF-fatty-Rats mit

- der ZDF-F-Met-Gruppe

- der placebokontrollierten ZDF-F-P-Gruppe

20

bezüglich ihrer physiologischen, biochemischen und histologischen Parameter.

Darüber hinaus werden in der vorliegenden Arbeit die ZDF-lean-Gruppe mit der

ZDF-L-P-Gruppe sowie die ZDF-fatty-Tiere mit den ZDF-F-P-Tieren verglichen, um

eine Verlaufsbeurteilung möglich zu machen. Schließlich werden die ZDF-F-P-Tiere

mit der ZDF-F-Met-Gruppe im Hinblick auf ihre physiologischen, biochemischen

und histologischen Parameter verglichen.

Die unbehandelten Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty wurden ausschließlich

histologisch untersucht.

3.4 Perfusionsfixation

Die retrograde Perfusion über die Aorta abdominalis wird nach einem

Standardverfahren durchgeführt ([2], [31], [36]). Durch dieses Verfahren ist

gewährleistet, dass auch die sehr kleinen Gefäße in ihrem in vivo existenten

Füllzustand fixiert werden. Somit erscheinen die Gefäße im histologisch

aufgearbeiteten Gewebe nicht kollabiert oder dilatiert.

Die Vollnarkose der Tiere erfolgt hierbei nach einer Vornarkotisierung (Äther) mit

einem Gemisch aus 0,4ml Rompun® 2% und Ketavet® (Konzentration: 100mg/kg).

Dazu werden die beiden Medikamente mit 2 ml NaCl 0,9% verdünnt und den Tieren

pro 10g Körpergewicht ca. 0,1 ml dieser Lösung i.m. injiziert. Danach werden die

Abdominalhöhle und der Retroperitonealraum eröffnet sowie die Aorta abdominalis

dargestellt und katheterisiert. Nach Abklemmung des proximalen Abschnitts der

Aorta abdominalis und einer Längsinzision des Gefäßes erfolgt die Spülung des

Gefäßsystems (2min) mittels einer Dextranlösung (Rheomacrodex®, 40%ig) unter

Zusatz von 2%igem Novocain. Dextran verhindert hierbei die Ausbildung eines

interstitiellen Ödems und intravasaler Thromben [51].

Nach 10 sec. erfolgt schließlich eine Inzision der Vena cava inferior mit dem Zweck

der Blutdrainage. Das Gefäßsystem wird danach zunächst mit 0,9% NaCl gespült,

anschließend bei einem Perfusionsdruck von 110 mmHg mit 3%igem Glutaraldehyd

in 0,2 molarer Phosphatpufferlösung perfundiert und damit fixiert.

Die daraufhin in 3%igem Glutaraldehyd und 0,2 molarer Phosphatpufferlösung

gelagerten Herzen werden gewogen und im Pathologischen Institut der FAU

Erlangen-Nürnberg weiter aufgearbeitet (vgl. Kap.3.5.2.1)

21

3.5 Gewebeaufbereitung

3.5.1 Orientator

Die Struktur von Gewebe oder Organen zeigt einen unterschiedlichen Aufbau.

Anisotropes Gewebe (z.B. Skelettmuskulatur, Nervenfasern) zeichnet sich dadurch

aus, dass darin enthaltene Strukturn (z.B. Fasern oder Zellen) eine bestimmte

Vorzugsrichtung aufweisen. Isotropes Gewebe (z.B. Leber oder Lunge) besitzt im

Gegensatz dazu keinerlei festgelegte Ausrichtung oder Orientierung. Die Struktur

des Myokards ordnet man zwischen den Extremen Isotropie und Anisotropie ein und

bezeichnet es als partiell anisotropes Gewebe ([35], [36], [37]). Somit sind die

Strukturen des Herzmuskels einerseits gerichtet angeordnet, andererseits verändert

sich die Richtung der Hauptanordnung (z.B. der Herzmuskelzellen oder –fasern) im

räumlichen Gefüge.

Das Orientatorverfahren stellt nun eine Möglichkeit dar, aus partiell anisotropem

Gewebe zufällige, streng isotrope Schnitte zu gewinnen. Damit entstehen

mathematisch exakte, reproduzierbare Ergebnisse ([35], [36]). Die Schnittführung

der mit dem Orientator gewonnenen histologischen Präparate ist in Bezug auf alle

drei Freiheitsgrade des Raumes absolut zufällig (s. Abbildung 3-1)

Abbildung 3-1: Freiheitsgrade der Orientatormethode zur Gewährleistung einer zufälligen

Schnittführung [17]

22

3.5.2 Herstellung mikroskopische Präparate

3.5.2.1 Aufbereitung Herz

Die Präparation des Herzens erfolgt nach dem sog. systematic random sampling [37].

Zunächst werden die Ventrikel von den Vorhöfen und anschließend der rechte vom

linken Ventrikel getrennt. Daraufhin wird das linksventrikuläre Gewicht bestimmt.

Nach dem Wiegen wird der linke Ventrikel in longitudinaler Richtung durchtrennt

und eine der beiden entstandenen Hälften zufällig ausgewählt. Diese wird nun in

Querrichtung (Schnittrichtung parallel zur Ebene der Herzklappen) in 1-2 mm dicke

Streifen gestückelt. Zwei von den so entstandenen Streifen werden wiederum zufällig

ausgewählt und im Orientatorverfahren weiter verwendet.

3.5.2.2 Zuschnitt Präparate

Die beiden so gewonnenen Streifen werden frei in einem durchsichtigen

Agarzylinder (0,3mg Agar auf 100ml Aqua dest.) eingebettet. Durch die zufällige

Lagerung des Gewebestreifens im Agar bestimmt man den ersten Freiheitsgrad. Der

zweite Freiheitsgrad ergibt sich durch die zufällige Lagerung des Agarzylinders auf

der Schnittunterlage (Polarkoordinatenpapier). Den dritten Freiheitsgrad erhält man,

indem man vier Schnitte durch den Myokardstreifen vornimmt. Der Agarzylinder

wird dabei zentral auf einen Winkelkreis aufgelegt und der Myokardstreifen nach

zufälligen Winkeln zugeschnitten. Durch dieses Vorgehen erhält man pro

Myokardstreifen je vier und damit insgesamt acht etwa 0,5 mm dicke

Myokardproben pro Tier. Gelagert werden die Proben wiederum in Glutaraldehyd.

3.5.2.3 Herstellung mikroskopischer Präparate - Semidünnschnitttechnik

Die Gewebeproben werden, nachdem sie vom restlichen Glutaraldehyd befreit sind,

in Sörensenpuffer (pH 7,2-7,4), gewaschen und danach in 1%iger

Osmiumtetroxidlösung nachfixiert. Daraufhin erfolgt die stufenweise Dehydrierung

23

des Gewebes in einer aufsteigenden Isopropanolreihe. Nach Einbettung des Gewebes

für einige Stunden in Epon-Araldit folgt die Aushärtungsperiode (18-20 Stunden bei

70 °C im Brutschrank). Schließlich werden die Eponblöcke angetrimmt und

semidünn (ca. 0,25µm) geschnitten (Rotations-Mikrotom, Leica RM 2145, Wetzlar,

Deutschland). Nach einer Hitzefixierung erfolgt letztlich die Färbung der Schnitte

mit basischem Fuchsin und Methylenblau.

3.5.2.4 Aufbereitung der Aorten

Die Aorten der jeweiligen Tiere werden aus ihrem Ursprung am linken Vorhof

vorsichtig frei präpariert, um in einem definierten Abstand (1cm Entfernung vom

Aortenkopf) senkrecht zur Longitudinalachse ein ca. 1mm dickes Stück entnehmen

zu können. Dieses wird entsprechend den Myokardproben dehydriert, in Epoxidharz

eingebettet, zu ca. 1µm dicken Semidünnschnitten verarbeitet sowie mit

Methylenblau und Fuchsin gefärbt.

3.6 Morphometrie und Stereologie

Unter Morphometrie (griech.: Messung der Gestalt) und Stereologie (griech.:

Messung des Raumes) versteht man ein Verfahren, um Gewebsveränderungen

quantitativ und möglichst unabhängig vom individuellen Betrachter zu erfassen. Mit

diesen Methoden ist es möglich, Rückschlüsse auf die räumliche Verteilung im

dreidimensionalen Raum nach einer Untersuchung der Strukturen im

zweidimensionalen Raum (z.B. im Semidünnschnitt) zu ziehen.

3.6.1 Messverfahren

3.6.1.1 Integrationsplatte

Um die Punktedichte der myokardialen Strukturen bestimmen zu können, wird eine

Integrationsplatte (Firma Zeiss, Hamburg, Deutschland) verwendet. Die

24

Integrationsplatte ist ein quadratisches Gitter mit 121 Schnittpunkten, welches als

Bestandteil des Okulars in einem binokularen Mikroskop (BH-2, Fa. Olympus,

Hamburg, Deutschland) in den Strahlengang eingebracht wird. Das hat zur Folge,

dass die Gitterpunkte auf den Objektträger mit dem mikroskopischen Präparat

projiziert werden können. Bei einer Endvergrößerung von 1:000 werden die

Semidünnschnitte unter Verwendung von Immersionsöl mäanderförmig abgefahren.

Es wird nach dem sog. Punktezählverfahren vorgegangen. In jedem fünften

Gesichtsfeld werden die interessierenden Strukturen gezählt, die genau unter einem

Schnittpunkt liegen. Dabei durften nur die Strukturen in die Zählung eingehen, die

von der oberen rechten Seite eines Gitterpunktkreuzes getroffen werden (s.

Abbildung 3-2).

Abbildung 3-2: Detailvergrößerung aus der Integrationsplatte. Nur graue Kapillaren dürfen

gezählt werden; schwarze Kapillaren gehen nicht in die Berechnung ein [17].

Insgesamt werden 8 Gesichtsfelder pro Semidünnschnitt ausgezählt.

Fällt einer der 100 Gesamtpunkte auf eine zu untersuchende Struktur, so ergibt sich

für diese Struktur eine statistische Punktedichte von 1%. Die Punkte, welche nicht

auf dem Gewebe liegen, werden als sog. Artefakte von der Gesamtpunktezahl 100

abgezogen.

Durch die Anwendung der Regel nach Grundersen (1988) kann verhindert werden

dass Strukturen doppelt gezählt werden. Es werden von den Strukturen, die auf den

Rand der Integrationsplatte fallen, nur die der oberen und rechten Kante gezählt,

nicht aber die, die auf dem unteren oder linken Rand zum Liegen kommen (s.

Abbildung 3-3)

25

Abbildung 3-3: Abbildung der gesamten Integrationsplatte. Nur graue Kapillaren dürfen

gezählt werden; schwarze Kapillaren gehen nicht in die Berechnung ein [17].

Um die Längendichte Lv bestimmen zu können, muss die Größe der Fläche bekannt

sein, in der die gezählten Strukturen liegen. Dazu wird die Kantenlänge der

Integrationsplatte in der jeweiligen Mikroskopeinstellung mit einem

Messobjektträger der Firma Zeiss, Oberkochen bestimmt und daraus die Fläche des

Quadrates berechnet.

3.6.1.2 Bildanalyseverfahren

Die Auswertung der intramyokardialen Arteriolen und Aorten wird an einem

computergekoppelten binokularen Mikroskop (BX 60, Firma Olympus, Hamburg,

Deutschland) durchgeführt. Die Ausmessung der Arteriolen und Aorten erfolgt

mittels des halbautomatischen Bildanalysesystems Analysis (Firma Soft-Imaging,

Münster, Deutschland) und dessen Nachfolgeprogramm Cell P (Firma Soft-Imaging,

Münster, Deutschland). Dafür wird der mikroskopische Schnitt mit einer Kamera

(Colorview 12, Firma Olympus, Hamburg, Deutschland) in ein digitales Bild

umgewandelt. Anschließend können die Strukturen (Abstände, Flächen etc.) mittels

Mousecoursor bei einer 400fachen Vergrößerung histologisch vermessen werden.

26

3.6.2 Volumendichte (Vv)

Als Volumendichte wird der Volumenanteil einer bestimmten Gewebestruktur pro

Einheitsvolumen bezeichnet. Dabei gilt folgender Zusammenhang:

Pp (%) = Aa (%) ([21], [23])

Pp (%) = Aa (%) = Vv (%) [11]

Die Flächendichte Aa entspricht der Fläche der zu messenden Strukturen pro

Einheitsfläche.

Die Volumendichte (Vv) entspricht wiederum der Punktedichte (Pp) der

auszuwertenden Struktur. Letztere wird am mikroskopischen Schnitt mittels der

Integrationsplatte bestimmt. Sie ist die Anzahl der Punkte eines Messgitters, die sich

pro Anzahl der Gesamtpunkte auf die zu messenden Strukturen projizieren. Somit

werden Volumendichte (Vv) sowie Punktedichte (Pp) und Flächendichte (Aa) in

Prozent angegeben.

Die Volumendichte wird an den Myokard-Semidünnschnitten für Kapillaren,

Interstitium gesamt, Bindegewebe und Fibroblasten bestimmt

3.6.3 Längendichte (Lv)

Als Längendichte bezeichnet man die Gesamtlänge einer bestimmten Struktur in

einem definierten Myokardvolumen. Sie wird in [mm/mm³] angegeben. Indem

mittels Orientatorverfahren isotrope Schnitte aus dem partiell anisotropen

Myokardgewebe geschaffen werden, findet folgendes Prinzip hier seine Anwendung:

Lv = 2xQa ([59], [60])

Die Querschnittsdichte Qa (1/mm²) entspricht der Anzahl der Anschnitte bestimmter

Strukturen pro Einheitsfläche.

Die Längendichte wird an den Myokard-Semidünnschnitten für die Kapillaren

bestimmt.

27

3.6.4 Interkapilläre Distanz (ICD)

Die interkapilläre Distanz beschreibt den durchschnittlichen Abstand zwischen zwei

Kapillaren und wird in [µm] angegeben. Hierbei gilt folgender Zusammenhang nach

Henquell et Honig [24]:

3.6.5 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Parameter

Mittels der computergestützten Bildanalysesysteme Analysis und Cell P werden alle

in den Semidünnschnitten bei 400facher Vergrößerung auffindbaren Arteriolen

vermessen, die einen Innendurchmesser D(Lu) zwischen 10µm und 100µm

aufwiesen. Es werden folgende absolute Messwerte bestimmt (s. Abbildung 3-4):

- Lumendurchmesser D(Lu)

- Äußerer Gefäßdurchmesser D(G)

Da die Gefäße nie exakt orthograd angeschnitten werden und sich bei einem

schrägen Anschnitt die Mediadicke vergrößert, nimmt man als Lumendurchmesser

den kleinsten Innendurchmesser und als äußeren Gefäßdurchmesser den kleinsten

Außendurchmesser (s. Abbildung 3-4).

Aus diesen beiden Messgrößen lassen sich wiederum weitere Werte bestimmen:

Mediadicke D(M), wobei gilt: D(M) = (D(G) – D(Lu)) / 2

Lumenfläche A(Lu), wobei gilt: A(Lu) = π / 4 x D(Lu)²

Mediafläche A(M), wobei gilt: A(M) = A(G) – A(Lu) und

A(G) = π / 4 x D(G)²

28

Abbildung 3-4: Schematische Darstellung eines Gefäßanschnitts [17]

3.6.6 Intramyokardiale Arteriolen – relative Parameter

Aus den oben beschriebenen absoluten Parametern werden folgende relative

Parameter berechnet:

- Mediadicke / Lumendurchmesser

- Mediadicke / Lumenfläche

- Mediafläche / Lumenfläche

3.6.7 Aorta – absolute und relative Parameter

Ähnlich wie bei den intramyokardialen Arteriolen werden bei bestimmten Tieren aus

fünf Gruppen die Semidünnschnitte der Aorta thoracica untersucht:

ZDF-lean: n=4

ZDF-fatty: n=1

ZDF-L-P: n=4

ZDF-F-P: n=4

ZDF-F-Met n=2

29

Hier ist anzumerken, dass sich kein Semidünnschnitt aus der Gruppe ZDF-F-EMD

unter den ausgewerteten Schnitten befunden hat.

Als absolute Messwerte wurden wiederum bestimmt:

- Aortaler Lumendurchmesser aD(Lu)

- Aortaler Äußerer Gefäßdurchmesser aD(G)

Aus diesen beiden Parametern können folgende Werte bestimmt werden:

Aortale Mediadicke aD(M), wobei gilt: aD(M) = (aD(G) – aD(Lu)) / 2

Aortale Lumenfläche aA(Lu), wobei gilt: aA(Lu) = π / 4 x aD(Lu)²

Aortale Mediafläche aA(M), wobei gilt: aA(M) = aA(G) – aA(Lu) und

aA(G) = π / 4 x (aD(Lu) + 2 aD(M))²

Als relative Größen werden ermittelt:

Aortale Mediadicke / aortalen Lumendurchmesser

Aortale Mediafläche / aortale Lumenfläche

Aortale Lumenfläche / Körpergewicht

Aortale Mediafläche / Körpergewicht

30

3.7 Statistik

Die Statistik wird computergestützt mit dem Statistikprogramm SPSS (Version 15.0)

der Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.

Dabei werden die Messwerte auf Normalverteilung und Homogenität getestet. Als

normalverteilt und homogen gelten die Werte, wenn sie in der Darstellung als

Boxplots diesen Kriterien entsprechen.

Liegen weder Normalverteilung noch Homogenität vor, so wird für die

Mehrfachvergleiche zwischen den Gruppen der nicht-parametrische Test nach

KRUSKAL-WALLIS angewandt. Der Unterschied wird als signifikant betrachtet,

wenn der Wahrscheinlichkeitsfehler (p) kleiner als 0,05 ist. Sind die Werte, die in

diesem Test signifikante Unterschiede aufweisen, nach dem o.g. Kriterium

signifikant, werden die einzelnen Gruppen paarweise mit dem nicht-parametrischen

WILCOXON-RANGSUMMENTEST (=U-TEST) verglichen. Der Unterschied wird

auch hier als signifikant betrachtet, wenn der Wahrscheinlichkeitsfehler (p) kleiner

0,05 ist.

Auf signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen ZDF-lean und ZDF-fatty sowie

ZDF-L-P und ZDF-F-P wird in den Tabellen im Ergebnisteil verwiesen, sie werden

jedoch der Übersichtlichkeit halber nicht graphisch dargestellt.

Die Daten dieser Arbeit sind als Mittelwert±Standardabweichung angegeben.

31

4. Ergebnisse

Die Werte der im Folgenden aufgeführten Parameter wurden zum Teil selbst

ermittelt, zum Teil freundlicherweise von der Firma Merck® zur Verfügung gestellt.

Daneben ist zu bemerken, dass die histologischen Parameter von Tieren aller sechs

Gruppen bestimmt wurden, wohingegen die Laborparameter lediglich für die

behandelten vier Gruppen ZDF-L-P, ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD

vorliegen.

4.1 Allgemeine Parameter

4.1.1 Körper- und Herzgewicht, Körperlänge

Tabelle 4-1: Körper- und Herzgewicht, Körperlänge

ZDF-

lean

ZDF-

fatty

ZDF-L-P

ZDF-F-P

ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Körpergewicht

(g)

265±19,5 350±27

a)

386±22,2

a)

431±57,3

b)

467±92,1 461±110 p<0,001

Herzgewicht

(g)

1,2±0,2 1,3±0,2 1,3±0,1 1,4±0,2 1,5±0,2 1,6±0,3 P<0,05

Gewicht LV

(g)

0,8±0,1 0,9±0,1 0,99±0,1

c)

1,1±0,2 1,2±0,1 1,2±0,2 p<0,001

Gewicht

LV/KG

(mg/g)

3,1±0,5 2,7±0,3

d)

2,6±0,2

d)

2,4±0,3 2,6±0,4 2,6±0,3 P<0,05

Körperlänge

(cm)

21,6±0,6 21,8±0,6

[n=9]*)

23,5±0,4

a)

22,9±0,7

b)

23,3±0,5 22,8±0,4

e)

p<0,001

Werteangaben als Mittelwert ± Standardabweichung

*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-fatty-Gruppe, abweichend für den Parameter

Körperlänge (cm)

32

a) p<0,001 vs ZDF-lean

b) p<0,01 vs ZDF-fatty

c) p<0,01 vs ZDF-lean

d) p<0,05 vs ZDF-lean

e) p<0,05 vs ZDF-F-Met

Abbildung 4-1: Körpergewicht

0

100

200

300

400

500

600

700

ZDF-LEAN ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

Gruppe

Kö

rpe

rge

wic

ht

[g]

p<0,001

p<0,01

p<0,001

Zum Versuchsende ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den

Körpergewichten einzelner Gruppen. So weisen die ZDF-F-P- und ZDF-L-P-Tiere

im zeitlichen Verlauf (10.-26. Woche) ein signifikant höheres Körpergewicht auf als

die in der 10. Woche untersuchten fatty- und lean-Tiere. Weiterhin erreichen die mit

Placebo behandelten lean-Tiere ebenfalls ein signifikant höheres Körpergewicht als

die unbehandelten lean-Tiere. Auch zwischen den beiden unbehandelten Tiergruppen

ZDF-lean und ZDF-fatty, die im Vergleich zu den anderen Gruppen lediglich 10

Wochen gelebt haben, kann ein signifikanter Unterschied im Körpergewicht

gemessen werden. Demnach sind die fatty-Tiere signifikant schwerer als die lean-

Gruppe. Das höchste Körpergewicht kann in den beiden fatty-Gruppen gemessen

werden, die mit Metformin bzw. EMD behandelt worden sind, wobei sich hier kein

signifikanter Unterschied zu den ZDF-F-P-Tieren bzw. untereinander zeigt.

33

Abbildung 4-2: relatives linksventrikuläres Gewicht (Gewicht LV/KG)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

ZDF-Lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

Gruppe

Ge

wic

ht

LV

+ R

V [

g]

p<0,01

p<0,01

Das auf das Körpergewicht bezogene und damit aussagekräftigere relative

linksventrikuläre Gewicht ist in der Placebo-behandelten lean-Gruppe und in der

unbehandelten fatty-Gruppe signifikant niedriger als bei den unbehandelten lean-

Tieren, die den höchsten Anteil an linksventrikulärem Gewicht bezogen auf das

Körpergewicht tragen.

Abbildung 4-3: absolutes linksventrikuläres Gewicht

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6


Gruppe

Gew

ich

t L

V [

g]

p<0,01

34

Das absolute linksventrikuläre Gewicht ist in der ZDF-L-P-Gruppe (Woche 26)

signifikant höher als in der lean-Gruppe (Woche 10). Die höchsten Werte können bei

den Tieren festgestellt werden, die mit Metformin bzw. EMD behandelt wurden.

Abbildung 4-4: Körperlänge

20,0

20,5

21,0

21,5

22,0

22,5

23,0

23,5

24,0

24,5


Gruppe

Kö

rpe

rlä

ng

e [

cm

]

p<0,001p<0,01

p<0,05

Bei der Messung der Körperlänge der Tiere zeigen die ZDF-L-P-Tiere im zeitlichen

Verlauf signifikant höhere Werte als die lean-Tiere. Auch die ZDF-F-P-Tiere sind

signifikant größer als die früher getöteten fatty-Tiere. Dabei ist zu bemerken, dass

die Placebo-behandelten Tiere 16 Wochen länger gelebt haben als die unbehandelten

Gruppen. Die mit EMD behandelten Tiere sind signifikant größer als die mit

Metformin behandelten, wohingegen das Körpergewicht dieser beiden Gruppen

keinen signifikanten Unterschied aufweist.

35

4.1.2 Parameter des Glucosestoffwechsels

Tabelle 4-2: Parameter des Glucosestoffwechsels

ZDF-L-P ZDF-F-P

ZDF-F-Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Urin-

Glucose

(mg/dl)

34,7±16,2 10144±1367

a)

10226±3225 7834±4222

b)

p<0,001

Serum-

Glucose

(mg/dl)

118±10,2 509±167

a)

436±126 428±164 p<0,001

Serum-

Insulin

(ng/ml)

0,79±0,17 2,58±1,19

a)

5,23±6,7 4,49±3,66

[n=9]*)

p<0,001

HbA1c

(%)

2,23±0,39 5,59±2,07

c)

5,07±1,12 6,06±2,42 p<0,001


*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-EMD-Gruppe, abweichend für den Parameter

Serum-Insulin (ng/ml)

a) p<0,001 vs ZDF-L-P

b) p<0,05 vs ZDF-F-Met

c) p<0,01 vs ZDF-L-P

36

Abbildung 4-5: Urin-Glucose-Konzentration

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

Gruppe

Uri

n-G

luco

se-K

on

ze

ntr

ati

on

[m

g/d

l]

p<0,05

p<0,001

Bei Versuchsende zeigen sich signifikant niedrigere Urin-Glucose-Spiegel bei den

mit EMD behandelten Tieren im Vergleich zu den Tieren, die mit Metformin

behandelt worden sind. Die mit Placebo behandelten lean-Tiere haben einen – wie

erwartet – signifikant niedrigeren Urin-Glucose-Spiegel als die Placebo-behandelten

fatty-Tiere.

Abbildung 4-6: Serum-Glucose

0

100

200

300

400

500

600

700

800


Gruppe

Seru

m-G

luco

se-K

on

zen

trati

on

[m

g/d

l]

p<0,001

37

Die Serum-Glucose-Were der Placebo-behandelten lean-Tiere sind erwartungsgemäß

signifikant niedriger als bei den Placebo-behandelten fatty-Tieren. Allerdings kann

hier kein signifikanter Unterschied zwischen den Tieren, die EMD und denen, die

Metformin erhalten haben, nachgewiesen werden. Man kann jedoch feststellen, dass

im Mittel alle diabetogenen Gruppen (ZDF-F-P, ZDF-F-Met, ZDF-F-EMD) deutlich

über dem Normwert für Glucose im Serum liegen (> 126mg/dl). Die ZDF-L-P-

Gruppe weist im Mittel Werte um 118mg/dl auf, was für eine gestörte

Glucosetoleranz spricht, aber noch nicht für einen manifesten Diabetes.

Abbildung 4-7: Serum-Insulin

0

2

4

6

8

10

12

14


Gruppe

Seru

m-I

ns

ulin

[n

g/m

l]

p<0,001

Der Serum-Insulin-Spiegel der Placebo-behandelten fatty-Tiere ist signifikant höher

als bei der ZDF-L-P-Gruppe. Der Grund dafür kann die Insulinresistenz der fatty-

Tiere sein, die bei den nicht-diabetogenen lean-Tieren unwahrscheinlich ist.

Zwischen den behandelt Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD gibt es

keine signifikanten Unterschiede.

38

Abbildung 4-8: HbA1c

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


Gruppe

Hb

A1

c [

%]

p<0,01

Der HbA1c-Wert als Indikator für einen chronisch erhöhten Blutzucker ist ebenfalls

in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant höher als in der ZDF-L-P-Gruppe. Die Werte

bewegten sich auch in den diabetogenen Gruppen (ZDF-F-P, ZDF-F-Met, ZDF-F-

EMD) im Durchschnitt nicht über der Obergrenze von 6,5%.

4.1.3 Blutfette und Laktat

Tabelle 4-3: Blutfette und Laktat

ZDF-L-P

ZDF-F-P

ZDF-F-Met ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Serum-

Cholesterin

(mg/dl)

126±13,1 224±59,4

a)

270±63,2 243±45,8 p<0,001

Serum-LDL

(mg/dl)

31,5±15,9 39,5±15,3 34,3±13,6 37,8±16,4 n.s.

Serum-HDL

(mg/dl)

43,9±10,6 90,1±23,0

b)

108,3±39,27 97,9±24,0 p<0,001

Serum-

Lactat

(mmol/l)

2,9±0,48 3,95±0,53

a)

5,3±0,63

c)

[n=8]*)

5,39±0,8

c)

p<0,001

39


*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-Met-Gruppe, abweichend für den Parameter

Serum-Lactat (mmol/l)


b) p<0,001 vs ZDF-L-P

c) p<0,001 vs ZDF-F-P

Abbildung 4-9: Serum-Cholesterin

0

50

100

150

200

250

300

350


Gruppe

Seru

m-C

ho

les

teri

n [

mg

/dl]

p<0,01

Der Serum-Cholesterin-Spiegel ist signifikant höher in der ZDF-F-P-Gruppe als in

der ZDF-L-P-Gruppe. Die fatty-Tiere, die mit EMD behandelt worden sind, zeigen

tendentiell niedrigere Serum-Cholesterinwerte als die mit Metformin behandelten

Tiere. Dieser Unterschied ist nicht signifikant. Jedoch haben alle fatty-Tiere höhere

Cholesterin-Werte als die lean-Gruppe, die als einzige unter dem Normwert von 200

mg/dl blieb.

40

Abbildung 4-10: Serum-HDL

0

20

40

60

80

100

120

140

160


Gruppe

Se

rum

-HD

L [

mg

/dl]

p<0,001

Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Serum-LDL-Werten der

einzelnen Tiergruppen. Der Serum-HDL-Spiegel ist bei den Placebo-behandelten

fatty-Tieren allerdings signifikant höher als bei den Placebo-behandelten lean-Tieren.

Die höchsten Serum-HDL-Spiegel können bei den Tieren gemessen werden, die mit

Metformin behandelt worden sind. Über dem unteren Grenzwert von 40 mg/dl lagen

im Mittel alle Gruppen.

Abbildung 4-11: Serum-Laktat

0

1

2

3

4

5

6

7


Gruppe

Se

rum

-La

kta

t [m

mo

l/l]

p<0,001

p<0,001

p<0,01

41

Der Serum-Lactat-Spiegel ist in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant höher als in der

ZDF-L-P-Gruppe. Darüber hinaus können signifikant höhere Serum-Lactat-Werte in

den Gruppen gemessen werden, die mit EMD bzw. Metformin behandelt worden

sind – verglichen mit den placebokontrollierten fatty-Tieren.

4.1.4 Parameter der Nierenfunktion

Tabelle 4-4: Parameter der Nierenfunktion

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Diurese

(ml/24h)

8,76±3,06 125±38,9

a)

85,1±40,7

b)

101±51,5 p<0,001

Urin-Albumin-

Konz. (µg/ml)

61,1±46,2 1914±1221

a)

2271±2480 2973±4099 p<0,001

Urin-Albumin-

Exkretion

(mg/24h)

0,48±0,35 209±106

a)

186±171 233±335 p<0,001

Urin-Crea-

Konz. (µmol/l)

11377±3411 784±284

a)

1631±1444

b)

1813±2246 p<0,001

Urin-Crea-

Ausscheidung

(µmol/24h)

94,6±32,5 89,3±14,3

[n=6]*)

96,2±16,3 92,1±12,2

[n=9]*)

n.s.

Serum-Crea

(µmol/l)

35,7±8,6 28,3±14,3

[n=9]**)

17,4±9,5

[n=9]**)

23,7±13

[n=9]**)

p<0,05

Crea-

Clearance

(ml/min)

2,1±1,3 3±2,5 4,9±2,7

b)

4,1±3,9 p<0,05

Urin-

Albumin/Crea-

Ratio (µg/µg)

0,05±0,02 20,7±9,8

a)

17,2±14,8 25,6±41,6

[n=9]***)

p<0,001

U-Harnstoff-

Ausscheidung

(µmol/24h)

654±200 604±202 664±372 539±423 n.s.

42


*) n: Anzahl der Tiere der Gruppen ZDF-F-P und ZDF-F-EMD, abweichend für den

Urin-Crea-Exkretion (µmol/24h)

**) n: Anzahl der Tiere der Gruppen ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD,

abweichend für den Parameter Serum-Crea (µmol/l)

***) n: Anzahl der Tiere der Gruppe ZDF-F-EMD, abweichend für den Paramater

Urin-Albumin/Crea-Ratio (µg/µg)


b) p<0,05 vs ZDF-F-P

Die abschließenden Messungen der Urin-Creatinin-Exkretion sowie der Urin-

Harnstoffexkretion ergeben keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Gruppen.

Abbildung 4-12: Diurese

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


Gruppe

Diu

rese [

ml/

24h

]

p<0,05

p<0,001

Zum Versuchsende scheiden die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe signifikant mehr

Urin/24h aus als die vergleichbare ZDF-L-P-Gruppe. Dagegen scheidet die

Metformin-behandelte Gruppe signifikant weniger aus als die placebokontrollierte

ZDF-F-P-Gruppe.

43

Abbildung 4-13: Urin-Albumin-Konzentration

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000


Gruppe

Uri

n-A

lbu

min

-Ko

nze

ntr

ati

on

[µ

g/m

l]

p<0,01

Die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe haben eine signifikant höhere Urin-Albumin-

Konzentration als die vergleichbare ZDF-L-P-Gruppe. Die höchsten Urin-Albumin-

Konzentrationen kann in der mit EMD behandelten Gruppe gemessen werden.

Abbildung 4-14: Urin-Albumin-Ausscheidung

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000


Gruppe

Uri

n-A

lbu

min

-Exk

reti

on

[µ

g/m

l]

p<0,001

Die Tiere der ZDF-F-P-Gruppe scheiden signifikant mehr Albumin im Urin aus als

die ZDF-L-P-Gruppe. Die größte Albumin-Ausscheidung im Urin zeigt sich bei den

Tieren, die mit EMD behandelt worden sind. Ein signifikanter Unterschied

44

hinsichtlich der Albuminausscheidung ergibt sich bei den behandelten Gruppen

ZDF-F-P, ZDF-F-Met und ZDF-F-EMD nicht.

Abbildung 4-15: Urin-Creatinin-Konzentration

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000


Gruppe

Uri

n-C

rea-K

on

ze

ntr

ati

on

[µ

mo

l/l]

p<0,05

p<0,001

Die höchste Konzentration von Creatinin im Urin wird bei den Placebo-behandelten

lean-Tieren gemessen. Diese Werte sind signifikant höher als bei der Placebo-

behandelten fatty-Gruppe. Darüber hinaus weisen die Tiere, die mit Metformin

behandelt sind, eine sinifikant höhere Urin-Creatinin-Konzentration auf als die

placebokontrollierten fatty-Tiere.

45

Abbildung 4-16: Serum-Creatinin

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


Gruppe

Seru

m-C

reati

nin

[µ

mo

l/l]

Der höchste Serum-Creatinin-Spiegel als Retentionsparameter werden bei den Tieren

der ZDF-L-P-Gruppe gemessen. Der niedrigste Serum-Creatinin-Spiegel zeigt sich

bei den Tieren, die mit Metformin behandelt wurden. Es gibt keine signifikanten

Unterschiede zu anderen einzelnen Gruppen.

Abbildung 4-17: Creatinin-Clearance

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9


Gruppe

Cre

ati

nin

-Cle

ara

nce

[m

l/m

in]

p<0,05

Bei der Messung der Creatinin-Clearance ergibt sich ein signifikanter Unterschied

zwischen den Tieren der ZDF-F-P-Gruppe und der ZDF-F-Met-Gruppe. Demzufolge

46

weisen die mit Metformin Behandelten eine signifikant höhere Creatinin-Clearance

auf.

Abbildung 4-18: Urin-Albumin/Creatinin-Ratio

0

10

20

30

40

50

60

70

80


Gruppe

Uri

n-A

lbu

min

/Cre

a-R

ati

o [

µg

/µg

]

p<0,001

Bei den Tieren der ZDF-F-P-Gruppe kann ein signifikant höheres Verhältnis

zwischen Albumin und Creatinin im Urin nachgewiesen werden. Dieses ergibt sich

aus den bereits erläuterten Werten der Urin-Albumin-Konzentration sowie der Urin-

Creatinin-Konzentration.

47

4.1.5 Elektrolyte

Tabelle 4-5: Elektrolyte

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Serum-

Natrium

(mmol/l)

151±1,6 144±3,4

a)

144±3,7

[n=8]*)

145±3,5 P<0,01

Serum-

Kalium

(mmol/l)

4,68±0,21 4,88±0,41 4,63±0,28

[n=8]*)

4,65±0,26 n.s.

Serum-

Calcium

(mmol/l)

2,72±0,08 2,69±0,11 2,75±0,16

[n=8]*)

2,84±0,11 n.s.

Serum-

Chlorid

(mmol/l)

97,8±1,09 89,5±3,91

a)

88,5±2,51

[n=8]*)

88,9±2,78 P<0,01


*) n: Anzahl der Tiere der ZDF-F-Met-Gruppe, abweichend für die Parameter

Serum-Natrium, Serum-Kalium, Serum-Calcium und Serum-Chlorid (mmol/l)


Bei Versuchsende können sowohl bei den Serum-Kalium-Werten als auch den

Serum-Calcium-Werten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Gruppen festgestellt werden.

48

Abbildung 4-19: Serum-Natrium

138

140

142

144

146

148

150

152

154


Gruppe

Seru

m-N

atr

ium

[m

mo

l/l]

p<0,01

Der Natrium-Spiegel im Serum ist bei der ZDF-F-P-Gruppe signifikant niedriger als

bei der ZDF-L-P-Gruppe, die die höchsten Natrium-Spiegel bei Versuchsende

aufweist.

Die EMD-behandelten Tiere haben im Vergleich zu den Metformin-behandelten

Tieren höhere Natrium-Spiegel im Serum. Dieser Unterschied ist nicht signifikant.

Im Schnitt haben die behandelten fatty-Tiere allesamt Natrium-Werte im Serum, die

im Normbereich liegen. In der ZDF-L-P-Gruppe sind die Werte mit durchschnittlich

150,7 mmol/l leicht erhöht.

49

Abbildung 4-20: Serum-Chlorid

82

84

86

88

90

92

94

96

98

100


Gruppe

Se

rum

-Ch

lori

d [

mm

ol/

l]

p<0,01

Auch die Serum-Chlorid-Spiegel sind in der ZDF-F-P-Gruppe signifikant niedriger

als bei den Tieren der ZDF-L-P-Gruppe, die die höchsten Serum-Chloridspiegel bei

Versuchsende aufweist. In allen Gruppen liegen die Werte im Normbereich.

4.1.6 Nahrungs- und Trinkmenge

Tabelle 4-6: Nahrungs- und Trinkmenge

ZDF-L-P ZDF-F-P

ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Nahrungsmenge

(g/24h)

12,5±4,58 32,5±10,4

a)

31,6±4,67 34,4±5,21 P<0,001

Wassermenge

(ml/24h)

16,3±4,88 127±43,4

b)

86,5±37,8 107±51,3 P<0,001



b) p<0,001 vs ZDF-L-P

50

4.2 Intramyokardiale Parameter

4.2.1 Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums

Tabelle 4-7: Volumendichte des nicht vaskulären Interstitiums

ZDF-lean ZDF-

fatty ZDF-L-P ZDF-F-P

ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Volumendichte

Fibroblasten

(%)

0,56±0,19

0,41±0,16

0,26±0,04

a)

0,23±0,05

b)

0,31±0,01

0,35±0,03

P<0,01

Volumendichte

Bindegewebe

(%)

2,38±0,26

1,61±0,55

1,05±0,36

c)

0,78±0,25

d)

1,0±0,2

3,17±2,96

e) P<0,001

Volumendichte

Interstitium

gesamt (%)

2,95±0,07

2,02±0,39

1,32±0,41

c)

1,01±0,3

f)

1,31±0,19

1,41±0,01

p<0,001



b) p<0,05 vs ZDF-fatty

c) p<0,001 vs ZDF-lean

d) p<0,01 vs ZDF-fatty

e) p<0,05 vs ZDF-F-P

f) p<0,001 vs ZDF-fatty

51

Abbildung 4-21: Volumendichte Fibroblasten

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-Met ZDF-F-EMD

Gruppe

Vo

lum

en

dic

hte

[%

]p<0,01

p<0,05

Die Volumendichte der Fibroblasten als Marker für Myokardfibrose ist in den

Gruppen, die mit Metformin bzw. EMD behandelt worden sind, nicht signifikant

höher als in den placebokontrollierten bzw. in den unbehandelten Gruppen. Eine

signifikant geringere Volumendichte der Fibroblasten weisen die in der 26. Woche

getöteten ZDF-F-P-Tiere bzw. ZDF-L-P-Tiere im Vergleich mit den ZDF-fatty-

Tieren bzw. ZDF-lean-Tieren (getötet in der 10. Woche) auf. Demnach zeigt die

Gabe von Metformin bzw. EMD keinen signifikanten Effekt auf die

Myokardfibroblasten.

Abbildung 4-22: Volumendichte Bindegewebe

0

1

2

3

4

5

6

7


Gruppe

Vo

lum

en

dic

hte

[%

] p<0,001

p<0,01

p<0,05

52

Die Volumendichte des Bindegewebes ist in der mit EMD behandelten Gruppe

signifikant höher als in der placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Dies kann ein

Hinweis darauf sein, dass EMD einen Einfluss auf den bindegewebigen Umbau des

Myokards haben kann. Dieser signifikante Unterschied zeigt sich dagegen nicht in

der mit Metformin behandelten Gruppe im Vergleich zur placebobehandelten

Vergleichsgruppe. Die ZDF-F-P-Tiere haben auch hier eine signifikant geringere

Volumendichte des Bindegewebes als die bereits früher getöteten fatty-Tiere. Ebenso

kann eine signifikant geringere Volumendichte des Bindegewebes bei den ZDF-L-P-

Tieren verglichen mit den ZDF-lean-Tieren nachgewiesen werden.

Abbildung 4-23: Volumendichte Interstitium

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5


Gruppe

Vo

lum

en

dic

hte

[%

]

p<0,001

p<0,001

Die Volumendichte des nichtvaskulären Interstitiums insgesamt zeigt sich in der

Tendenz ähnlich zu der Volumendichte von Fibroblasten und Bindegewebe. Hier

haben die ZDF-F-P-Tiere im zeitlichen Verlauf eine signifikant geringere

Volumendichte des nichtvaskulären Interstitiums als die ZDF-fatty-Tiere. Die ZDF-

L-P-Tiere weisen im zeitlichen Verlauf eine signifikant geringere Volumendichte des

Interstitiums im Vergleich mit den ZDF-lean-Tieren auf. Weiterhin lässt sich

beobachten, dass die ZDF-fatty Tiere tendentiell weniger Zeichen für eine

Myokardfibrosierung aufweisen als die lean-Tiere.

53

4.2.2 Intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte

Die absolute Anzahl der intramyokardialen Arteriolen ist in den sechs Gruppen sehr

unterschiedlich. Sie liegt zwischen 474 bei der ZDF-lean-Gruppe (n=10) und 294 in

der ZDF-F-Met-Gruppe (n=10). Die Zahl der gezählten intramyokardialen Arteriolen

pro Tier ist ebenfalls sehr unterschiedlich und schwankt in allen sechs Gruppen

zwischen 2 und 89 Arteriolen pro Tier (8 Schnitte/Tier ausgewertet).

Tabelle 4-8: intramyokardiale Arteriolen – absolute Messwerte

ZDF-

lean

ZDF-

fatty

ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Wand-

dicke

(µm)

2,31±0,9 3,10±2,76 1,91±0,63 2,39±0,76 1,93±0,61 2,5±0,91 n.s.

Wand-

fläche

(µm²)

222±109 298±402 184±64 254±85,3 193±85,7 217±76,4 n.s.

Lumen-

fläche

(µm²)

626±253 592±204 648±210 774±272 700±416 496,5±187 n.s.

Lumen-

diameter

(µm)

28,2±4,1 25,2±3,26 25,8±2,39 28,8±4,58 27,4±7,11 23,2±3,94 n.s.


Es können bei den absoluten Messwerten der intramyokardialen Arteriolen keine

signifikanten Unterschiede gemessen werden.

In der Tendenz haben die unbehandelten ZDF-fatty-Tiere die höchsten Werte bei

Messung der Wanddicke und –fläche. Bei allen behandelten Tieren (Placebo, EMD,

54

Metformin) werden im Schnitt geringere Werte bei bezüglich der Wanddicke und -

fläche gemessen. Die Standardabweichung ist bei den Werten Wanddicke und –

fläche der ZDF-fatty-Gruppe auffallend groß. Das kann damit begründet werden,

dass in dieser Gruppe einzelne Arteriolen mit einer deutlich verdickten Gefäßwand

(verglichen mit der durchschnittlichen Gefäßwand-Dicke der fatty-Tiere) gemessen

wurden. Die dadurch bedingte große Streuung der Werte lässt sich ebenfalls auf die

relativen Messwerte Wanddicke/Lumendurchmesser, Wanddicke/Lumenfläche sowie

Wandfläche/Lumenfläche der ZDF-fatty-Gruppe übertragen (s. S. 64-65).

Lumendiameter und –fläche sind bei den mit EMD behandelten Tieren tendentiell

geringer als bei den anderen Gruppen, was auf eine vergleichsweise starke

Wandverdickung schließen lässt.

4.2.3 Intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte

Tabelle 4-9: intramyokardiale Arteriolen – relative Messwerte

ZDF-

lean

ZDF-

fatty

ZDF-L-

P

ZDF-F-

P

ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Wanddicke/

Lumendiameter

(µm/µm) x 10²

8,2±2,9

11,3±8,5

6,7±2,1

a)

7,6±2,5

6,5±2,0

9,95±4,8

b)

P<0,05

Wanddicke/

Lumenfläche

[µm/µm²] x 10³

3,7±0,8

5,1±3,5

3,0±0,6

a)

3,3±1,1

2,98±0,9

5,7±3,5

P<0,05

Wandfläche/

Lumenfläche

(µm²/µm²) x

10²

35,4±8,8

51,8±51,0

28,6±4,0

a)

33,7±7,9

28,3±4,8

46,9±23,1

b)

P<0,05



b) p<0,05 vs ZDF-F-Met

55

Bezieht man die Wanddicke auf den Lumendurchmesser bzw. die Wandfläche auf

die Lumenfläche, so ergeben sich signifikant höhere Werte für die mit EMD

behandelten Tiere als für die, die Metformin bekommen haben. Dies spricht für eine

in der Relation stärkere Verdickung der Gefäßwand bei den ZDF-F-EMD-Tieren als

bei der ZDF-F-Met-Gruppe.

Die ZDF-L-P-Tiere haben im zeitlichen Verlauf signifikant niedrigere Werte als die

ZDF-lean-Tiere, wenn man die Wanddicke auf den Lumendiameter, die Wanddicke

auf die Lumenfläche oder die Wandfläche auf die Lumenfläche bezieht.

Abbildung 4-23: Wanddicke / Lumendurchmesser intramyokardiale Arteriolen

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25


Gruppe

Wan

dd

icke/L

um

en

du

rch

me

sse

r [µ

m/µ

m]

p<0,05 p<0,05

Abbildung 4-24: Wanddicke / Lumenfläche intramyokardiale Arteriolen

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

0,01


Gruppe

Wan

dd

icke/L

um

en

fläc

he [

µm

/µm

²]

p<0,05

56

Abbildung 4-25: Wandfläche / Lumenfläche

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Gruppe

Wan

dfl

äch

e/L

um

en

fläch

e [

µm

²/µ

m²]

p<0,05

p<0,05

4.2.4 Kapillarisierung des Myokards

Tabelle 4-10: Kapillarisierung des Myokards

ZDF-lean ZDF-fatty ZDF-L-P ZDF-F-P ZDF-F-

Met

ZDF-F-

EMD

Kruskal-

Wallis

Längendichte

Kapillaren

(mm/mm³)

2413±31,9

1912±84,1

b)

2627±21,2

2264±73,0

2122±93,9

1613±142

a)

p<0,01

Volumendichte

Kapillaren (%)

10,9±1,1

7,2±1,2

e)

8,5±0,77

b)

7,8±0,8

7,6±1,2

5,8±0,19

c),d)

p<0,001

ICD (µm) 22,2±0,05

24,95±0,71

b)

21,2±0,002

22,8±0,31

24,4±1,63

26,9±1,09

a)

p<0,01


a) p<0,001 vs ZDF-F-P

b) p<0,05 vs ZDF-lean

c) p<0,05 vs ZDF-F-P

d) p<0,05 vs ZDF-F-Met

e) p<0,01 vs ZDF-lean

57

Abbildung 4-26: Längendichte Kapillaren

0

500

1000

1500

2000

2500

3000


Gruppe

Lä

ng

en

dic

hte

[m

m/m

m³]

p<0,001p<0,05

Die Längendichte der myokardialen Kapillaren als Maß für die Versorgung des

Herzgewebes ist in der mit EMD behandelten Tiergruppe signifikant niedriger als in

der placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Die Längendichte der myokardialen

Kapillaren ist bei den ZDF-fatty-Tieren signifikant geringer als bei den ZDF-lean-

Tieren.

Abbildung 4-27: Volumendichte Kapillaren

0

2

4

6

8

10

12

14


Gruppe

Vo

lum

en

dic

hte

[%

]

p<0,05

p<0,05

p<0,05

p<0,01

Bei der Volumendichte der Kapillaren, die den prozentualen Anteil des

Kapillarvolumens widerspiegelt, zeigen die mit EMD behandelten Tiere wiederum

signifikant niedrigere Werte als die placebokontrollierte Vergleichsgruppe. Jedoch

58

sind die Werte signifikant niedriger als bei den mit Metformin behandelten Tieren.

Im zeitlichen Verlauf weisen die ZDF-L-P-Tiere eine signifikant geringere

Volumendichte der Kapillaren auf als die früher getöteten ZDF-lean Tiere. Die ZDF-

fatty Tiere zeigen einen signifikant geringeren Anteil des Kapillarvolumens als die

ZDF-lean-Gruppe.

Abbildung 4-28: interkapilläre Distanz (ICD)

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03


Gruppe

ICD

[m

m]

p<0,001p<0,05

Bei der interkapillären Distanz werden die höchsten Werte bei den EMD-Tieren

gemessen. Diese zeigen auch einen signifikanten Unterschied zu der

placebokontrollierten Vergleichsgruppe. Dies bestätigt die geringere

Kapillarversorgung bei den EMD-Tieren.

59

4.3 Veränderungen der Aorta

4.3.1 Wandveränderungen der Aorta – absolute Werte

Tabelle 4-11: Wandveränderungen Aorta – absolute Werte

ZDF-lean

(n=4)

ZDF-

fatty

(n=1)

ZDF-L-P

(n=4)

ZDF-F-P

(n=4)

ZDF-F-

Met

(n=2)

Kruskal-

Wallis

Wanddicke

(µm) 66,7±4,97 91,4±0,0 78,0±22,9 92,3±13,7 101±8,01 n.s.

Wandfläche

(mm²) 0,17±0,07 0,20±0,0 0,20±0,07 0,19±0,04 0,24±0,10 n.s.

Lumenfläche

(mm²) 0,45±0,32 0,30±0,0 0,47±0,23 0,25±0,14 0,35±0,27 n.s.

Lumendiameter

(µm) 713±295 620±0,0 756±199 552±157 643±263 n.s.


Die absoluten Messwerte für die Wandveränderungen der Aorten weisen zwischen

den einzelnen Tiergruppen keine signifikanten Unterschiede auf. Dabei ist darauf hin

zu weisen, dass in der ZDF-F-EMD-Gruppe keine Aorten zur Auswertung vorliegen.

In den anderen Gruppen differiert die Gruppenstärke sehr stark (s. Angaben in

Tabelle 4-11)

Tendentiell sind die Mediadicke und –fläche –wie zu erwarten- in der ZDF-fatty-

Gruppe höher als in der ZDF-lean-Gruppe. In der mit Metformin behandelten

Gruppe kann kein positiver Einfluss des Medikaments auf die Mediadicke bzw. –

fläche festgestellt werden.

Der Lumendurchmesser und die Lumenfläche zeigen in der Tendenz in der ZDF-

fatty-Gruppe geringere Werte als in der ZDF-lean-Gruppe. Die mit Metformin

behandelte Gruppe hat tendentiell höhere Werte im Lumendiameter bzw.

Lumenfläche als die placebokontrollierte Vergleichsgruppe.

60

Wandveränderungen der Aorta – relative Werte

Tabelle 4-12: Wandveränderungen Aorta - relative Werte

ZDF-lean

(n=4)

ZDF-fatty (n=1)

ZDF-L-P (n=4)

ZDF-F-P (n=4)

ZDF-F-Met

(n=2)

Kruskal-Wallis

Wanddicke/ Lumendiameter (µm/µm)

0,11±0,05 0,15±0,0 0,10±0,05 0,17±0,06 0,16±0,06 n.s.

Wandfläche/ Lumenfläche (µm²/µm²) x 10²

49,1±26,6 67,7±0,0 49,3±22,4 86±32,7 79,4±30,2 n.s.

Lumenfläche/ Körpergewicht (mm²/kg)

1,72±1,23 1,0±0,0 1,24±0,6 0,64±0,41 0,78±0,40 n.s.

Wandfläche/ Körpergewicht (mm²/kg)

0,64±0,27 0,68±0,0 0,54±0,21 0,45±0,12 0,56±0,08 n.s.


Bei den relativen Werten zur Wandveränderung der Aorten ergeben sich ebenfalls

keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Tiergruppen.

Die Wanddicke bezogen auf den Lumendurchmesser ist in der Metformin-Gruppe

tendentiell niedriger als in der placebokontrollierten Vergleichsgruppe.

Das Verhältnis der Mediafläche zur Lumenfläche ist tendentiell geringer bei den mit

Metformin behandelten Tieren, verglichen mit der placebolontrollierten

Vergleichsgruppe.

Die Lumenfläche und Mediafläche bezogen auf das Körpergewicht der Tiere zeigen

Tendenzen, die jedoch nicht statistisch signifikant sind. So steigen beide Parameter

bei den mit Metformin behandelten Tieren im Vergleich zur placebobehandelten

Kontrollgruppe leicht an und werden somit durch die Metformingabe nicht positiv

regressiv beeinflusst.

61

5. Fotodokumentation

Eindrückliche morphologische Strukturen dieser Arbeit sollen hier abschließend

gezeigt werden. Aufgrund der Übersichtlichkeit wird auf die Abbildung der

verschiedenen Gewebe aus allen sechs Tiergruppen verzichtet. Es werden die

Gruppe, die mit EMD behandelt wurde, und die Placebo-Gruppe gezeigt. Die mit

Metformin behandelten Tiere wiesen kaum eindrückliche morphologische

Veränderungen auf.

5.1 Intramyokardiale Arteriolen

ZDF-F-P

ZDF-F-EMD

62

Die Arteriolenwand der ZDF-F-EMD-Gruppe ist im Vergleich zur Placebo-Gruppe

deutlich verdickt. Auch das periarterioläre Bindegewebe ist vermehrt.

5.2 Intramyokardiale Kapillarisierung

ZDF-F-P

ZDF-F-EMD

Die Anzahl an Kapillaren der ZDF_F-EMD-Gruppe ist im Vergleich zur Placebo-

Gruppe deutlich reduziert, die interkapilläre Diastanz dagegen erhöht.

63

6. Diskussion

Ziel dieser Arbeit ist es, die kardialen Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2

(repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-P) und deren Beeinflussung durch die

Medikamente Metformin (repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-Met) und EMD

387008 (repräsentiert durch die Gruppe ZDF-F-EMD) zu untersuchen und

miteinander zu vergleichen. Zu diesem Zweck wird in der Diskussion im Besonderen

auf die Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 und seiner Begleitsymptome auf

kardiovaskuläre Strukturen eingegangen. Im Folgenden werden die Veränderungen,

die durch Metformin bzw. EMD hervorgerufen werden können, erläutert.

6.1 Auswirkungen des Diabetes mellitus Typ 2 auf kardiovaskuläre

Strukturen unter Einbeziehung der eigenen Ergebnisse

6.1.1 Auswirkungen einer Hyperglykämie auf kardiovaskuläre Strukturen

In der vorliegenden Arbeit kann gezeigt werden, dass alle Tiergruppen mit Diabetes

mellitus Typ 2 durchweg Serum-Glucose-Werte aufweisen, die deutlich über dem

Normwert (126 mg/dl) liegen. Der HbA1c-Wert als Indikator für einen chronisch

erhöhten Blutzucker bewegt sich in allen Tiergruppen mit Diabetes im Durchschnitt

nicht über der Obergrenze von 6,5 %. Darüber hinaus kann in diesen Gruppen eine

deutliche Glukosurie, verglichen mit der nicht-diabetogenen Vergleichsgruppe,

nachgewiesen werden.

Eine chronische Hyperglykämie bei diabetischer Stoffwechsellage kann zu

verschiedenen Veränderungen des Herzmuskels führen. Bei der Entstehung einer

diabetischen Kardiopathie spielt die Hyperglykämie eine zentrale Rolle, indem eine

myokardiale Fibrose und Kollagenablagerung als früh auftretende myokardiale

Strukturveränderungen getriggert werden. [3]. Pathophysiologisch erklärt man sich

die Entstehung der kardiovaskulären Dysfunktion, bedingt durch die Hyperglykämie,

im Sinne einer Aktivierung des myokardialen Renin-Angiotensin-Aldosteron-

Systems, was zu einer verstärkten Nekrose und Fibrosierung der Myozyten führen

kann. Die Verteilung des abgelagerten Bindegewebes kann interstitiell oder

perivaskulär erfolgen sowie beide Lokalisationen umfassen. Darüber hinaus konnten

64

in verschiedenen Untersuchungen eine myokardiale Hypertrophie, Veränderungen

des Kapillarendothels sowie eine Verdickung der kapillären Basalmembran gezeigt

werden ([49], [9]).

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben keinen Hinweis auf eine verstärkte

Fibrosierung bzw. Bindegewebszunahme bei den Tieren mit Diabetes mellitus Typ 2,

verglichen mit der nicht-diabetogenen Vergleichsgruppe.

Die Glucose kann durch nichtenzymatische Glykosilierung von extra- oder

intrazellulären Proteinen (u.a. Kollagen) über reversible Zwischenprodukte

(Amadori-Produkte) zur Entstehung irreversibler „advance glycation end products“

(AGE) führen [3]. Da die AGE mit anderen Proteinen kovalente Bindungen

eingehen, können sie sowohl in ihrer natürlichen Funktion gestört werden als auch

ein sogenanntes „cross-linking“ von Kollagen oder extrazellulären Proteinen (z.B.

LDL) induzieren und an Zellrezeptoren binden. Weiterhin könne AGE intrazellulär

oxidativen Stress fördern, der eine verstärkte Zellschädigung verursacht [3].

In der Konsequenz können die oben beschriebenen pathophysiologischen

Mechanismen zu myokardialer und endothelialer Dysfunktion führen [3].

Diabetes mellitus ist auch charakterisiert durch einen erniedrigten IGF-1-Spiegel

und erhöhte TGF-beta1-Spiegel [4]. Die Überexpression von TGF-beta1 im Gewebe

durch kardiale Fibroblasten ist bedingt durch die Hyperglykämie und

Hyperinsulinämie bei NIDDM. Dieser Umstand trägt ebenso zum bindegewebigen

Umbau des Myokards sowie zur daraus resultierenden myokardialen Dysfunktion bei

[3].

Der pathophysiologische Mechanismus der Zellapoptose bei NIDDM wird mit einer

Störung der Glucosetransporter GLUT 1 und 4 bei diabetischer Stoffwechsellage

erklärt [3]. Dieser Umstand führt dazu, dass sich der Hauptanteil der

Energiegewinnung für die Aufrechterhaltung der kardialen Kontraktilität vom

Glucose-Stoffwechsel hin zur Beta-Oxidation von freien Fettsäuren verschiebt, was

in der Konsequenz zu einer verstärkten Zellapoptose als Vorstufe zur

Kardiomyopathie führen kann. Dieser apoptotische Effekt der Hyperglykämie wird

durch die Glykosilierung und Phosphorylierung von p53 sowie durch die erhöhte

Synthese von AT-II hervorgerufen [13] [3].

Darüber hinaus können die bei der Beta-Oxidation anfallenden toxischen

Abbauprodukte den Calcium-Transport der myokardialen Zellen dahingehend

verändern, dass Kontraktion und Relaxation der Ventrikel beeinträchtigt werden [3].

65

Eine hohe Glucose-Konzentration im Blut aktiviert auch die Protein-Kinase C

(PKC). Dies führt in der Folge zur Ausschüttung verschiedener Zytokine und

Wachstumsfaktoren, wie z.B. „vascular endothelial growth factor“ (VEGF),

„plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1), „nuclear factor kappa-Beta“ (NF-kB)

[62] sowie dem oben beschriebenen TGF-beta-1. Eine erhöhte Kapillar-

Permeabilität, vermehrte Fibroseneigung sowie eine verstärkte Ausschüttung

proinflammatorischer Gene können eine unmittelbare Folge davon sein und zur

Schädigung kardiovaskulärer Strukturen beitragen [3].

6.1.2 Auswirkungen einer Dyslipidämie und Insulinresistenz auf kardiovaskuläre Strukturen

Bei Patienten mit Diabetes mellitus wird häufig eine Dyslipidämie beobachtet [41].

Dieser Zusammenhang kann in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Alle

Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2 zeigen signifikant (p<0,01) erhöhte Serum-

Cholesterinwerte, die im Durchschnitt alle über dem Normwert von 200 mg/dl

liegen. In diesen Gruppen kann auch eine Hyperinsulinämie (verständlich aufgrund

des Modells der Insulinresistenz bei Diabetes mellitus Typ 2) nachgewiesen werden.

Verschiedene Mechanismen können diesen Sachverhalt erklären:

Ein mit dem Krankheitsbild des Diabetes mellitus Typ 2 einher gehender

Insulinmangel bzw. Insulinresistenz im Gewebe (Skelettmuskulatur, Leber, Niere,

Fettgewebe) können zur Hyperlipidämie führen, entweder direkt oder indirekt über

die Hyperglykämie. Dies wird durch eine gesteigerte Aktivität der hormonsensitiven

Lipase des Fettgewebes verursacht. In der Folge kann es zu einer vermehrten

Lipolyse mit verstärkter Freisetzung freier Fettsäuren (FFAs) kommen [38].

Ein weiterer ätiologischer Ansatz postuliert die Induktion einer Insulinresistenz

durch den vermehrten Anfall freier Fettsäuren (neben verschiedenen anderen

molekularen Mechanismen, die an der Entstehung einer Insulinresistenz beteiligt

sind). Insulinresistenz und Diabetes mellitus Typ 2 sind häufig verbunden mit

niedrigen HDL- und hohen Plasma-Triglycerid-Spiegeln als kardiovaskuläre

Risikofaktoren [5]. Durch übermäßige orale Zufuhr von Fetten gelangen Triglyceride

und FFAs vermehrt ins Blut und verursachen eine Insulinresistenz sowie

Hyperglykämie. Der erhöhte Blutzucker stimuliert in der Folge die pankreatischen

Beta-Zellen und verursacht eine Hyperinsulinämie, die wiederum den Anstieg von

66

Triglyceriden triggert und diesen „circulus vitiosus“ aufrecht erhält [39]. In dieser

Arbeit ist der HDL-Spiegel der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe allerdings signifikant

(p<0,001) höher als bei den ZDF-lean-Placebo-Tieren.

Für die FFAs konnte gezeigt werden, dass sie die Proteinkinase C θ (PKC θ)

aktivieren und über diese Kaskade an proatherogenen Mechanismen beteiligt sind

[39]. Zu diesen zählen endotheliale Dysfunktion, Wachstum, Migration und

Apoptose von glatten Muskelzellen der Gefässwand. Darüber hinaus können

Adhäsionsmoleküle sowie eine erhöhte Aufnahme von oxidiertem LDL in

Makrophagen bzw. Schaumzellen induziert werden [46].

Auch durch eine Aktivierung von Inhibitor κB-Kinase (IKK) und c-Jun N-terminal

Kinase (JNK) rufen FFAs eine Insulinresistenz hervor [39].

Nachdem nun in Ansätzen erklärt worden ist, wie Dyslipidämie und Insulinresistenz

bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 zusammenhängen, soll im folgenden

Abschnitt näher erläutert werden, welche Rolle die Insulinresistenz bei instabilen

atherosklerotischen Plaque spielt und damit das Risiko der Patienten mit KHK

beeinflusst.

Die Entstehung atherosklerotischer Plaque hängt von verschiedenen biochemischen

Prozessen ab [39]. Die Plaque-Ruptur und damit verbundene Gefäss-

Thrombosierung sind gefürchtete Komplikationen, die in der Konsequenz zu

ischämischen Ereignissen im Herzen, Gehirn oder der Peripherie führen können.

Laut aktuellem Stand der Forschung kann die Insulinresistenz zur Instabilität

atherosklerotischer Plaque beitragen, indem durch erhöhte Insulin-Konzentrationen

die proinflammatorische Aktivität von Leukozyten direkt verstärkt wird. In vitro

konnte beobachtet werden, dass Insulin die Migration von Neutrophilen und

Monozyten, abhängig von Chemokinen der atherosklerotischen Plaque beeinflussen

kann [39]. Zusätzlich kann Insulin Nekroseprozesse der atherosklerotischen Plaque

begünstigen sowie den Untergang von Makrophagen beschleunigen. In vivo konnte

gezeigt werden, dass Insulin die Produktion der Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-

9) induziert und damit unter anderem für die Instabilität und Ruptur der

atherosklerotischen Plaque verantwortlich ist. Auf der anderen Seite erhöht Insulin

die Widerstandsfähigkeit von Thrombozyten gegenüber Faktoren, die eine

Plättchenkoagulation verhindern können, und steigert die Produktion

prokoagulatorischer Faktoren wie PAI-1, Faktor VII, Faktor XII, Fibrinogen und

„tissue plasminogen activator“ [39].

67

6.1.3 Mikroalbuminurie und kardiovaskuläre Schäden

Die kardiovaskuläre Mortalität ist bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ohne

Myokardinfarkt in der Vorgeschichte 7,5-fach höher als in einer

Vergleichspopulation ohne Diabetes mellitus Typ 2. Das Vorliegen einer Proteinurie

erhöht die Wahrscheinlichkeit einer kardiovaskulären Todesursache bei diesen

Patienten [41].

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Tiere der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe

eine signifikant (p<0,001) höhere Urin-Albumin-Konzentration sowie eine

signifikant (p<0,001) höhere Urin-Albumin-Exkretion, verglichen mit der ZDF-lean-

Placebo-Gruppe als Kontrolle, aufweisen.

Eine veränderte Albuminausscheidung ist neben der Entwicklung bzw. Verstärkung

einer Hypertonie, Abnahme der glomerulären Filtrationsleistung sowie einer

Dyslipoproteinämie und weiteren diabetischen Komplikationen charakteristisch für

eine diabetische Nephropathie.

Es konnte gezeigt werden, dass die Prävalenz einer Mikroalbuminurie

(Albuminausscheidung von 20-200 mg/l [20]) bei Diabetikern (Typ 1 und 2) 17 %

beträgt (verglichen mit der Prävalenz von 4 % in der Kontrollgruppe) [41]. Als

unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen und vorzeitigen Tod

aufgrund kardiovaskulärer Schäden bei Diabetikern ist die Mikroalbuminurie laut

epidemiologischer Studien assoziiert mit endothelialer Dysfunktion, Insulinresistenz,

Adipositas, Salz-Empfindlichkeit und Dyslipidämie [41]. Auch eine erhöhte

Prävalenz für linksventrikuläre Hypertrophie und mikrovaskuläre Retinaläsionen

konnte für Patienten mit Mikroalbuminurie nachgewiesen werden [41]. In der

HOPE-Studie konnte bei 32,6 % der Studienteilnehmer mit Diabetes mellitus eine

Mikroalbuminurie nachgewiesen werden, in der Gruppe ohne Diabetes wiesen

lediglich 14,8 % eine Mikroalbuminurie auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass

das Risiko für ein kardiovaskuläres Ereignis bzw. für eine Hospitalisation wegen

Herzinsuffizienz bei nachgewiesener Mikroalbuminurie 2-3fach erhöht ist.

Aufgrund der Assoziation von Mikroalbuminurie, endothelialer Dysfunktion und

erhöhtem oxidativem Stress, ist es nicht verwunderlich, dass diabetische

Atherosklerose und diabetische Glomerulosklerose parallel auftreten. Es ist

allerdings unklar, ob die Mikroalbuminurie ein Prädiktor für Atherosklerose oder

aber atherosklerotische Prozesse ist, da noch nicht gezeigt werden konnte, ob eine

68

erhöhte Urin-Albumin-Exkretion vor, während oder nach der Entstehung

morphologischer Veränderungen im Prozess der Atherosklerose auftritt. Bei

Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ohne Mikroalbuminurie konnten ebenfalls

verschiedene Marker für eine endotheliale Dysfunktion nachgewiesen werden, was

ein Hinweis auf eine frühe diabetische Vaskulopathie vor der Manifestation einer

Mikroalbuminurie sein kann [41].

6.1.4 Endotheliale Dysfunktion und kardiovaskuläre Schäden

Man vermutet, dass die endotheliale Dysfunktion bei Diabetikern dem renalen bzw.

kardiovaskulären Organschaden zugrunde liegt [41]. Definiert als frühe Phase der

Atherosklerose ist die endotheliale Dysfunktion assoziiert mit den

Hauptrisikofaktoren für eine KHK: Hypertonie, Hyperlipidämie, Rauchen und

Diabetes mellitus. Eine mögliche Erklärung für den Zusammenhang endotheliale

Dysfunktion und Atherosklerose ist die der gesteigerten Penetration von atherogenen

Lipoproteinen durch die geschädigte Gefässwand [41].

Veränderungen des Gefäßsystems im Sinne von endothelialer Dysfunktion wurden

initial bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 gefunden. Neben der

Hyperglykämie, einem veränderten antioxidativen Gleichgewicht sowie

Veränderungen im Lipidstoffwechsel, eingeschlossen die freien Fettsäuren, wird

vermutet, dass die Insulinresistenz einen Beitrag zu vaskulären Schäden bei Patienten

mit Diabetes mellitus Typ 2 leistet [32]. Die Insulinresistenz hat demnach einen

direkten Einfluss auf die Endothelfunktion, neben den ungünstigen Effekten im

Lipidstoffwechsel und Blutdrucksystem (s. Abschnitt 5.1.2). Der Ansatz einer

Reduktion der Insulinresistenz als therapeutisches Ziel in der Diabetestherapie liegt

aufgrund dieser pathophysiologischen Zusammenhänge nahe und wird in einem

gesonderten Abschnitt abgehandelt.

Trotzdem bleibt die Datenlage bezüglich einer Beziehung zwischen Insulinresistenz

und endothelialer Dysfunktion kontrovers. In einigen Studien gibt es Hinweise, die

für eine Korrelation zwischen diesen beiden Parametern sprechen. In anderen

Studien konnte dieser Zusammenhang nicht bestätigt werden [32].

In neuesten Studien wurde an einem Modell für Ratten mit Diabetes mellitus Typ 2

(OLETF-rats: Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats) gezeigt, dass die Relaxation

69

der Mesenterialarterien, vermittelt über endothelium-derived hyperpolarizing factor

(EDHF), vermindert wird, wohingegen die Kontraktion der Mesenterialarterien,

vermittelt über endothelium-derived contracting factor (EDCF), verstärkt wird [34].

In verschiedenen tierexperimentellen Studien konnte nachgewiesen werden, dass

eine temporäre postprandiale Hyperglykämie und Hypertriglyceridämie eine

reversible endotheliale Dysfunktion hervorrufen können.

In einer aktuellen Studie zeigt sich, dass das Vermeiden einer postprandialen

Hyperglykämie mittels einer auf Fetten basierenden Diät das Fortschreiten einer

Atherosklerose nicht verhindern kann [40]. In anderen Studien wird die

Hyperglykämie als unabhängiger Faktor für die Entstehung von kardiovaskulären

Erkrankungen angesehen [41].

6.1.5 Linksventrikuläre Hypertrophie

In der vorliegenden Arbeit ist das absolute linksventrikuläre Gewicht in den

Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2 (ZDF-fatty) höher als in der unbehandelten

Vergleichsgruppe ohne Diabetes (ZDF-lean). Diese Unterschiede sind statistisch

nicht signifikant. Das auf das Körpergewicht bezogene relative linksventrikuläre

Gewicht ist in der fatty-Gruppe signifikant (p<0,05) niedriger als in der lean-Gruppe.

In der Literatur wird beschrieben, dass die Insulinresistenz, die – wie oben

beschrieben – häufig mit Diabetes mellitus Typ 2 assoziiert ist, mit einer

linksventrikulären Hypertrophie einhergehen kann [15]. In einer multiethnischen

Studie wird eine positive Korrelation zwischen Diabetes mellitus Typ 2 und einer

erhöhten linksventrikulären Hypertrophie gezeigt, die unabhängig von anderen

Begleitfaktoren (wie ethnische Zugehörigkeit, Bildung oder körperliche Aktivität) ist

(1,5fach erhöhtes Risiko für ein linksventrikuläres Gewicht über der 75. Perzentile

bezogen auf die Allgemeinbevölkerung) [12]. Darüber hinaus wird beschrieben, dass

der BMI an sich als Index für Adipositas nicht mit Diabetes mellitus Typ 2 und

linksventrikulärer Hypertrophie korreliert. Wenn aber der stammbetonte

Körperumfang als Index gewählt wird, gibt es eine signifikante Interaktion zwischen

Diabetes mellitus Typ 2 und dem Bauchumfang bezüglich der linksventrikulären

Hypertrophie [12]. Aufgrund dieses Zusammenhanges vermutet man, dass

70

verschiedene Arten von Adipozytokinen im viszeralen Fett einen direkten Einfluss

auf das linksventrikuläre Gewicht haben könnten [41].

In der vorliegenden Arbeit ist das Körpergewicht in der ZDF-fatty-Gruppe

signifikant (p<0,001) höher als in der nicht-diabetogenen ZDF-lean Gruppe. Der

Anteil an stammbetontem viszeralen Fett wurde nicht gemessen.

6.2 Vergleich von Metformin und EMD bezüglich ihrer Wirkung auf

Symptome des Diabetes mellitus Typ 2 unter Einbeziehung der

eigenen Ergebnisse

6.2.1 Metformin und EMD in der Therapie der Insulinresistenz

Die UKPDS 34 [58] zeigt, dass der Einsatz von Metformin besonders effektiv bei

adipösen Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 ist, was unmittelbar im

Zusammenhang mit einer Insulinresistenz steht [58] und hauptsächlich durch

Adipositas und chronische Hyperglykämie bedingt ist [38]. In zahlreichen klinischen

Studien wurde gezeigt, dass eine Senkung des Blutzuckers durch Metformin

einhergeht mit unveränderten oder reduzierten Plasma-Insulinspiegeln [10]. Das lässt

darauf schließen, dass Metformin als Insulin-Sensitizer bzw. als Insulin-mimetisches

Medikament wirkt. In der vorliegenden experimentellen Arbeit sind die Serum-

Insulinspiegel in den beiden Gruppen, die mit Metformin bzw. EMD behandelt

wurden, höher als bei der Placebo-kontrollierten Vergleichsgruppe. Die EMD-

Gruppe weist im Mittel niedrigere Serum-Insulinwerte auf als die Metformin-

Gruppe. Dieser Unterschied ist nicht signifikant.

In diversen Studien kann gezeigt werden, dass Metformin die endogene

Glucoseproduktion bei Typ 2-Diabetikern verhindert, indem die Gluconeogenese

eingeschränkt wird [45].

In der Peripherie wirkt Metformin als Insulin-Sensitizer im Muskelgewebe, welches

eine große Rolle bei der Insulin-vermittelten Glucoseaufnahme in peripheren

Geweben spielt. Die „Entsorgung“ der Glucose erfolgt hauptsächlich über nicht-

oxidative Stoffwechselwege, worunter im Speziellen die Speicherung in Form von

71

Glycogen, Umwandlung in Laktat und der Einbau in Triglyceride gerechnet werden.

Die Glycogenspeicher spielen in diesem Zusammenhang die wohl grösste Rolle.

In anderen Studien wurden eine Metformin- und Insulintherapie kombiniert [19].

Hier konnte gezeigt werden, dass bei übergewichtigen Patienten mit Diabetes

mellitus Typ 2 eine exogene Insulinzufuhr durch die Gabe von Metformin um bis zu

30% reduziert werden konnte.

Weiterhin wird postuliert, dass ein Teil des Blutzucker senkenden Effekts von

Metformin durch die geringere Freisetzung freier Fettsäuren aus dem Fettgewebe

und/oder durch eine geringere Lipidoxidation bedingt ist [55]. Jedoch konnte nur in

einem Teil der Studien nachgewiesen werden, dass der Anteil freier Fettsäuren nach

der Gabe von Metformin sinkt. In vitro-Studien haben gezeigt, dass Metformin den

antilipolytischen Effekt von Insulin nicht verbessern kann [7]. Ein ursächlicher

Zusammenhang zwischen den eben beschriebenen Effekten von Metformin und der

endogenen Glucoseproduktion erscheint im Kontext eher unwahrscheinlich, da in

anderen Studien die Glucoseproduktion nicht vermindert werden konnte, auch wenn

die zirkulierenden freien Fettsäuren deutlicher gesenkt wurden (mittels Acipimox)

als mit Metformin.

6.2.2 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Hyperglykämie

In der vorliegenden Arbeit zeigen alle Tiergruppen mit Diabetes mellitus Typ 2

erhöhte Serum-Glucosewerte. Die Gruppen, die mit Meformin bzw. EMD behandlet

wurden, zeigen von der Tendenz her niedrigere Serum-Glucosewerte als die Placebo-

behandelte Vergleichsgruppe. Dieser Unterschied ist allerdings nicht signifikant. Die

durchschnittlichen Glucose-Spiegel sind in der Metformin-Gruppe nahezu identisch

zur EMD-Gruppe. Die Glucosurie, die in der Metformin-Gruppe wie auch in der

ZDF-fatty-Placebo-Gruppe in gleicher Weise nachweisbar ist, konnte durch EMD

signifikant (p<0.05) gesenkt werden.

In einer Metaanalyse aller kontrolliert randomisierten klinischen Studien, die

Metformin mit Placebo und Sulfonylharnstoffen vergleichen, kann Metformin bei

einer mittleren Behandlungsdauer von 4,5 Monaten im Vergleich zu Placebo-

72

Präperaten die Blut-Glucosekonzentration um 2,0 mM senken, den HbA1c-Wert um

0,9% [38]. Sulfonylharnstoffe und Metformin senken demnach bei einer

durchschnittlichen Behandlungsdauer von sechs Monaten die Blut-

Glucosekonzentration sowie den HbA1c-Wert in gleicher Weise. Unterschiede

zeigen sich hinsichtlich der Entwicklung des Körpergewichts (s. Abschnitt 5.2.6). Im

Rahmen der UKPDS-Studie zeigt Metformin, verglichen mit Chlorpropamid,

Glbenclamid und Insulin einen signifikant besseren Effekt bezüglich der

diabetesbedingten Endpunkte, der Gesamtmortalität als auch des Schlaganfall-

Risikos [58].

6.2.3 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die Dyslipidämie

Zusätzlich zur Verbesserung einer Hyperglykämie kann Metformin die Lipidspiegel

im Serum verbessern. Bei Diabetikern sowie Nicht-Diabetikern kann Metformin die

Triglycerid-Spiegel um 10-20 % reduzieren [55]. Dieses wurde in Zusammenhang

mit einer reduzierten hepatischen VLDL-Synthese gebracht. Ein Rückgang von 5-10

% des Gesamt-Cholesterins wird ebenso beschrieben und in Zusammenhang mit

einem Rückgang des LDL gebracht. Die HDL-Spiegel sind in den ausgewerteten

Studien entweder angestiegen oder gleich geblieben [38].

In der vorliegenden Arbeit kann weder in der Tiergruppe, die mit Metformin

behandelt wurde, noch in der EMD-behandelten Gruppe ein niedrigeres Gesamt-

Cholesterins verzeichnet werden, verglichen mit der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe. Die

durchschnittlichen Serum-HDL-Werte sind in allen Gruppen mit Diabetes mellitus

signifikant (p<0,01) höher als in der Placebo-behandelten lean-Gruppe. Die mit

Metformin behandelten Tiere zeigen im Mittel die höchsten HDL-Werte. Der

Unterschied zur EMD-Gruppe und zur Placebo-behandelten fatty-Gruppe ist nicht

signifikant.

6.2.4 Metformin – Auswirkungen auf die endotheliale Dysfunktion

Aufgrund der in Abschnitt 5.1.4 geschilderten Zusammenhänge liegt es nahe,

Metformin in der Therapie der Insulinresistenz und endothelialen Dysfunktion im

Speziellen, aber auch in der Therapie der kardiovaskulären Erkrankungen im

Allgemeinen in Erwägung zu ziehen [32].

73

Mather et al. [32] zeigen in einer placebokontrollierten Studie, in die Patienten mit

Diabetes mellitus Typ 2 ohne weitere klassische Risikofaktoren des metabolischen

Syndroms eingeschlossen wurden, den Zusammenhang zwischen einer Behandlung

mit Metformin und der potentiellen Verbesserung der endothelialen Dysfunktion

mittels Unterarm-Plethysmographie. Ausschlusskriterien bei dieser Studie sind eine

bekannte koronare oder periphere Gefässerkrankung, arterielle Hypertonie,

Behandlung mit vasoaktiven Medikamenten, Hypercholesterinämie,

Hypertriglyceridämie, Raucheranamnese, Mikro- oder Makroalbuminurie,

diabetische Retinopathie, Alter <25 Jahren bei Diagnose des Diabetes. Nach

dreimonatiger Behandlung mit Metformin konnte eine Verbesserung der

endothelialen Dysfunktion sowie der Insulinresistenz im Vergleich mit der Placebo-

Gruppe festgestellt werden. Der Mechanismus dieses beobachteten Effekts bleibt

unklar. Neben der Hypothese der direkten Wirkung einer geringeren Insulinresistenz

auf die Endothelzellen [27] kann ein Zusammenspiel verschiedener Parameter

postuliert werden, die einen positiven Einfluss auf das Gefässendothel haben können

und ebenfalls positiv durch Metformin beeinflusst werden (Lipidstoffwechsel und

freie Fettsäuren). In neuesten Studien bestätigen sich Hinweise auf eine direkte

Wirkung von Metformin auf das Gefässendothel [34]. In Kapitel 5.1.4 wird erläutert,

dass vasokonstriktive Mediatoren bei der endothelialen Dysfunktion von Ratten mit

Diabetes mellitus Typ 2 eine Rolle spielen [34]. Nach diesen Untersuchungen

verbessert Metformin die EDHF-vermittelte Relaxation und reduziert die EDCF-

vermittelte Kontraktion der Mesenterialarterien dieser Tiere, indem die Produktion

von vasokonstriktiven Prostanoiden unterdrückt und oxidativer Stress verhindert

wird.

6.2.5 Metformin und EMD – Risiko einer Laktatazidose

Eine Laktatazidose wird definiert durch eine erhöhte Laktatkonzentration im Blut

(>45 mg/dl bzw. >5,0 mmol/l) sowie durch einen erniedrigten pH-Wert im Blut (<

7,35) und Elektrolytverschiebungen mit einer erhöhten Anionen-Lücke [51].

Insgesamt schätzt man die Laktatazidose als eine seltene Komplikation von

Metformin ein. Von 1980-1995 war die Inzidenz einer Laktatazidose unter

Metformin 9 pro 100.000 Patientenjahre [54]. Auch andere epidemiologische Studien

74

schätzen die Inzidenz auf 2 bis 9 Fälle pro 100.000 Patientenjahre, wobei die darin

publizierten Fälle Patienten mit akuten Begleiterkrankungen (z.B. akutes

Nierenversagen) einschlossen, die ebenfalls eine Laktatazidose verursachen können

[51]. Da die Inzidenz einer Laktatazidose bei Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2,

die nicht mit Metformin behandelt wurden, ebenfalls 9/100.000 Patientenjahre

beträgt, stellt sich die Frage, ob Diabetiker unter Metforminbehandlung ein höheres

Risiko für eine Laktatazidose entwickeln als unter einer alternativen antidiabetischen

Medikation. In den publizierten Metaanalysen ergibt sich kein erhöhtes Risiko durch

Metformin, verglichen mit alternativen Medikamenten [51].

Neuere Studien bestätigen, dass eine Metformin-assoziierte Laktatazidose zwar

selten, bei Auftreten aber mit einer Mortalitätsrate von 30-50 % verbunden sein kann

[50]. Runge [50] zeigt in seiner von 2003-2004 angelegten Studie, dass 4 von 67

Patienten (6 %) mit Laktatazidose die Diagnose einer Metformin-assoziierten

Laktatazidose hatten, da kein anderer Risikofaktor oder Trigger als eine

Niereninsuffizienz im kompensierten Stadium gefunden wurde. Diese Arbeit zeigt,

dass das Risiko einer Laktatazidose, die durch Metformin an sich bedingt ist,

vielleicht unterschätzt wird.

In einer Studie mit 9.875 Patienten wurde ein Fall einer Laktat-Azidose innerhalb 20

Behandlungsmonaten beobachtet [53].

In der vorliegenden Arbeit zeigen die diabetischen Ratten, die mit Placebo behandelt

wurden, signifikant (p<0,01) höhere Serum-Laktat-Werte als die lean-Ratten ohne

Diabetes mellitus Typ 2. Allerdings bewegen sich die Werte im Mittel unter der

Grenze von 5 mmol/l als Grenze für eine manifeste Laktat-Azidose. Die mit

Metformin bzw. EMD behandelten Gruppen zeigten durchschnittlich signifikant

(p<0,001) höhere Serum-Laktat-Spiegel als die Placebo-behandelten Tiere mit

Diabetes mellitus Typ 2. Zwischen der Metformin- und der EMD-Gruppe zeigt sich

kein signifikanter Unterschied.

6.2.6 Metformin und EMD – Auswirkungen auf das Körpergewicht

Anders als andere antidiabetische Medikamente (wie Sulfonylharnstoffe oder

Insulin), ist eine Behandlung mit Metformin nicht mit einer Gewichtszunahme

assoziiert. Klinische Studien zeigen konsequent, dass es unter Metformin entweder

75

zu einer signifikanten Gewichtsabnahme oder aber zu einer langsameren

Gewichtszunahme, verglichen mit anderen Medikamenten, kommt [10],[30].

Adipositas wird oft von Insulinresistenz und Hyperinsulinämie begleitet, was eine

große Rolle bei der Entwicklung einer Glucoseinstoleranz spielt. In einer

randomisierten, doppelblinden Studie bei Kindern konnte gezeigt werden, dass

Metformin, ohne eine Änderung der Essgewohnheiten, den BMI signifikant senkt,

wohingegen der BMI in der placebokontrollierten Kontrollgruppe anstieg [13]. Die

gleichzeitig niedrigeren Serum-Leptinwerte in der Metformin-Gruppe lassen

vermuten, dass der sinkende BMI mit einer Reduktion des Körperfetts erklärt werden

kann [13].

Auch in einer anderen Studie konnte der Zusammenhang zwischen einer

Gewichtsabnahme und dem Abbau von Fettgewebe gezeigt werden [55]. Metformin

verbessert die Insulin-Sensitivität des Muskelgewebes, nimmt aber keinen Einfluss

auf die antilipolytische Wirkung, die das Insulin auf Muskelgewebe ausübt.

Zusätzlich kann Metformin das Körpergewicht eher über eine reduzierte Zufuhr von

Kalorien beeinflussen als über einen höheren Energieverbrauch [38].

In der vorliegenden Arbeit haben die mit Metformin bzw. EMD behandelten Tiere

durchschnittlich ein höheres Körpergewicht als die Placebo-behandelte

Vergleichsgruppe. Dieser Unterschied ist statistisch nicht signifikant. Zwischen der

Metformin-Gruppe und der EMD-Gruppe gab es kaum einen Unterschied. Die

Körperlänge der mit EMD behandelten Tiere liegt im Mittel aber signifikant

(p<0,05) unter der Körperlänge der Tiere, die mit Metformin behandelt wurden.

6.2.7 Metformin und EMD – Auswirkungen auf die arterielle Wandstruktur und Kapillarisierung des Myokards

Um den Einfluss von Metformin im Prozess der Atherosklerose zu analysieren,

wurden die Auswirkungen einer Metformin-Therapie auf die Dicke der Intima- und

Media-Schicht der Karotiden bei Typ 2 – Diabetikern untersucht [33]. Die Dicke der

jeweiligen Schichten wurde nach einem bzw. nach zwei Jahren einer Behandlung mit

Metformin gemessen. Zwei Jahre nach Metformin-Gabe war die Zunahme der

Intima- und Mediadicke signifikant (p<0,01) niedriger als bei den unbehandelten

Kontroll-Patienten. Da andere kardiovaskuläre Risikofaktoren (Körpergewicht,

Blutdruck, HbA1c und Serum-Lipide) in dieser Studie keine Änderungen durch

76

Metformin aufwiesen, wurde der Schluss gezogen, dass Metformin die Zunahme der

Media- und Intimadicke an den Karotiden verzögern kann. Verschiedene

Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, werden diskutiert, z.B. die

Verbesserung der Insulinresistenz und Verminderung von PAI-1.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Wanddicke von intramyokardialen Arteriolen

bezogen auf den Lumendiameter, die Wanddicke bezogen auf die Lumenfläche und

die Wandfläche bezogen auf die Lumenfläche bestimmt. Dabei zeigt sich, dass die

mit Metformin behandelten Tiere, verglichen mit der Kontrollgruppe, eine in der

Relation geringere Wanddickenzunahme aufweisen. Dieser Unterschied ist aber nicht

signifikant. Die mit EMD-behandelten Tiere zeigen eine signifikant (p<0,05) dickere

Gefäßwand, bezogen auf das Lumen der Gefässe. Die ZDF-fatty-Tiere zeigen eine in

der Relation größere Dickenzunahme der Gefäßwand, verglichen mit den ZDF-lean-

Tieren. Dieser Unterschied ist allerdings nicht signifikant.

Das kann ein Hinweis darauf sein, dass EMD nicht in gleichem Maße wie Metformin

bzw. das Placebo-Präparat zu einer reduzierten Gefäßwand –Dicke führt.

Die Längendichte der Kapillaren als Maß für die Blut- und Sauerstoffversorgung des

Myokards ist in der mit EMD behandelten Tiergruppe signifikant (p<0,001)

erniedrigt, verglichen mit der ZDF-fatty-Placebo-Gruppe. Auch im Vergleich mit der

Metformin-Gruppe ist die Kapillarisierung der mit EMD behandelten Tiere

tendentiell niedriger. Dieser Unterschied ist nicht signifikant. Zudem zeigen die mit

EMD behandelten Tiere eine signifikant (p<0,05) geringere Volumendichte der

intramyokardialen Kapillaren, was bedeutet, dass der prozentuale Anteil des

Kapillarvolumens in der EMD-Gruppe signifikant erniedrigt ist. Hier ist der

Unterschied zur Metformin-behandelten Tiergruppe ebenfalls signifikant (p<0,05).

Auch die Werte der interkapillären Distanz ergeben eine ähnliche Tendenz. Die

höchsten Abstände zwischen den einzelnen Kapillaren konnten bei der EMD-

behandelten Gruppe gemessen werden. Im Vergleich dazu war die interkapilläre

Distanz bei den Placebo-behandelten fatty-Tieren signifikant niedriger (p<0,001).

Dieser Zusammenhang bekräftigt die geringere myokardiale Kapillarversorgung bei

den EMD-behandelten Tieren, verglichen mit der Placebo-behandelten Kontrolle und

den Tieren, die mit Metformin behandelt wurden.

77

6.3 Schlussfolgerung

Die allgemein bekannten Zusammenhänge, in welcher Form der Diabetes mellitus

Typ 2 sich auf Strukturen des kardiovaskulären Systems auswirkt, sind mittels

verschiedener Studien umfassend erforscht worden und finden sich in den aktuell

gültigen Therapieleitlinien wieder.

Zusammenfassend spiegeln die laborchemischen Ergebnisse der vorliegenden

tierexperimentellen Arbeit nur teilweise die aktuelle Studienlage wider. Dies mag

unter anderem daran liegen, dass viele der zitierten Studien randomisierte klinische

Studien sind und sich nur teilweise mit tierexperimentellen Studien korrelieren

lassen.

Die morphologischen Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich anhand der aktuellen

Literatur in vielen Teilen nachvollziehen. Hier ergeben sich deutliche Unterschiede

zwischen der EMD- und der Metformin-Behandlung, vor allem bezüglich der

kapillären Versorgung des Myokards sowie der Veränderung der arteriellen

Wandstruktur. Auch im Bereich der unerwünschten Begleiterscheinungen, z.B. der

Zunahme des Körpergewichtes oder der Laktatazidose, kann EMD keine Vorteile

gegenüber Metformin aufweisen.

Daher ist es aufgrund der vorliegenden tierexperimentellen Daten zunächst nicht

naheliegend, EMD als adäquate Alternative zu Metformin in der antidiabetischen

Therapie zu sehen.

78

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85

8. Abkürzungsverzeichnis

AMP Adenosinmonophosphat AT-II Angiotensin II BMI Body Mass Index DDG Deutsche Diabetes Gesellschaft D.m. Diabetes mellitus EKG Elektrokardiogramm FAU Friedrich-Alexander-Universität Erlangen/Nürnberg GLUT Glukose Transporter HDL High-Density-Lipoprotein HOPE Heart Outcomes Prevention Study IGF Insulin-like Growth Factor i.v. intravenös KG Körpergewicht KHK Koronare Herzkrankheit LDL Low-Densitiy-Lipoprotein LV Linker Ventrikel Met Metformin MONICA MONitoring CArdiovascular disease NIDDM Non-Insulin-Dependent Diabetes mellitus PAI-I plasminogen activator inhibitor I TGF Transforming Growth Factor UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study VLDL Very-Low-Density-Lipoprotein WHO World Health Organization ZDF Zucker Diabetic Fatty

86

9. Danksagung

Ich möchte mich bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann für die Überlassung

des Themas und die gute Betreuung während der gesamten Dauer dieser

Arbeit bedanken.

Herrn Prof. Dr. med. A. Hartmann, Direktor des Pathologisch-Anatomischen

Instituts der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, danke ich

für die Bereitstellung der Räumlichkeiten und der personellen Kapazitäten,

sowie die Möglichkeit, am Pathologischen Institut zu promovieren.

Besonders bedanken möchte ich mich bei den Mitarbeitern der AG Amann,

allen voran Monika Klewer, Miriam Reutelshöfer und Stefan Söllner, die mir

in vielen Fragestellungen und bei der Einarbeitung in die notwendigen

Arbeitsschritte eine große Hilfe waren. Auch die Mitdoktoranden trugen durch

die gute Einweisung in die Methodik und ihre große Hilfsbereitschaft

maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.

Schließlich gilt mein Dank meiner Familie, die den Fortgang der Arbeit mit

großem Interesse verfolgt und mich während jeder Arbeitsphase in vielerlei

Hinsicht unterstützt hat.

87

10. Lebenslauf

Name: Ulrike Götze Geburtsdatum/-ort: 02. Oktober 1983 Eltern: Mutter: Kerstin Götze, geb. Deml, Gymnasiallehrerin Biologie, Chemie Vater: Hans-Ulrich Götze, Gymnasiallehrer Geographie, Sport Adresse: Hallstädter Weg 3 90425 Nürnberg Email: [email protected] Familienstand: ledig Schulbildung: 09/1990 - 08/1994 Grundschule: Dunant-Schule, Nürnberg 09/1994 - 06/2003 Melanchthon-Gymnasium, Nürnberg 06/2003 Abitur Hochschulstudium: Seit 09/2003 Studentin der Humanmedizin an der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

am 28/09/2005 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 12/2009 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Famulaturen: 08/2006 Famulatur am Universitätsspital Basel (Schweiz),

Medizinische Klinik 1, Bettenstation mit Schwerpunkt Gastroenterologie und Hämatologie

02/2006-04/2006 Famulatur im Labor der klinisch-chemischen

Demenzdiagnostik in der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg

08/2007 Famulatur in der Dermatologischen Universitätsklinik

Erlangen-Nürnberg

88

03/2007 Praxisfamulatur in der Anästhesiologischen Gemeinschaftspraxis Dr. Schacher/Dr. Weber Erlangen

02/2008-03/2008 Famulatur in der Ambulanz der Kinder- und

Jugendabteilung für psychische Gesundheit der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg

Praktisches Jahr: 15/08/2008 – 05/12/2008 Erstes Tertial in den Medizinischen Kliniken 1 und 2 des Universitätsspitals Basel (Schweiz) 08/12/2008 – 27/03/2009 Wahltertial in der Kinder- und Jugendabteilung für

psychische Gesundheit der Psychiatrischen Universitätsklinik Erlangen-Nürnberg

04/2009 - 07/2009 Drittes Tertial in der Chirurgischen Klinik des

Klinkums Nürnberg (Allgemeinchirurgie und Unfallchirurgie)

Sprachkenntnisse: Englisch, Grundkenntnisse Französisch und Italienisch, großes Latinum, großes Graecum Nürnberg, 03.11.2009

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Untersuchung des Einflusses von Metformin und EMD 387008 ... · Aus dem Pathologischen Institut der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Leiter: Prof. Dr. med. Hartmann