2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2.2. Ausglühen und Abflammen mit Bunsenbrenner 2.2. Abtötung...

2. Sterilisation und Keimreduktion

2.2.2. Ausglühen und Abflammen• mit Bunsenbrenner

2.2. Abtötung durch trockene Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Bunsenbrenner so einstellen (Luft), dass eine nichtleuchtende, hellblaue Flamme im Innenkegel und eine helle, orange-gelbe Flamme im Außenkegel entsteht

• Innenkegel mit ca. 300 °C: stark reduzierende Bedingungen am Übergang zum Außenkegel

• Außenkegel mit bis zu 1500 °C: stark oxidierende Bedingungen an der Spitze

2.2. Abtötung durch trockene Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Ausglühen– für Impfnadeln, Impfösen, Klingen, Scheren,

Präpariernadeln, Pinzetten, …– diese werden durch den äußeren Teil des

Flammenkegels gezogen bis sie glühen– Temp. von ca. 1000 °C– Mikroorganismen werden innerhalb von

Sekundenbruchteilen getötet – steril– Material leidet, Klingen verlieren Schärfe

2.2. Abtötung durch trockene Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Abflammen– für Metall-, Porzellan-, Glasgeräte (z.B. Drigalski-

Spatel)– oberflächliche Sterilisation– Gegenstand wird durch die Flamme gezogen, ohne

ihn zum Glühen zu bringen– tw. unter Zuhilfenahme von 96%igem EtOH:

Eintauchen + Abflammen (Spatel)– früher weit verbreitet, heute eher Notbehelf

2.2. Abtötung durch trockene Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Sterilisation durch Gase: Ethylenoxid– für hitzeempfindliche Produkte– sehr giftig, explosionsgefährlich– nicht immer rückstandsfrei (Filter)– im Labor nicht/selten verwendet

• Desinfektion durch chemische Mittel– Desinfektionsmittel genannt– für Oberflächen: Medizin gegen Krankheitserreger,

Labor/Industrie möglichst breit gegen alle Keime– Keimreduktion um 5 Zehnerpotenzen angestrebt

(99,999%)

2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion

2. Sterilisation und Keimreduktion

– Fertigprodukte (optimiert für ein bestimmtes Einsatzgebiet): z.B. Sterilium, …

– 70%iger EtOH (Verdünnung 96% EtOH)– Kontrolle z.B. Filterplättchentest– Wirksamkeit abhängig von:

• Schmutz-, Fett-, anderen Begleitstoffen• pH-Wert• Temperatur• Ausgangskeimzahl

2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Händedesinfektion– Waschen mit Seife reduziert Keimzahl um 60 bis 80

Prozent– Desinfektion zumeist auf Alkoholbasis

• 70% Ethanol (nicht 96%)• 70% 2-Propanol• 60% 1-Propanol (n-Propanol)• Fertigdesinfektionsmittelgemisch: „Sterilium“ • am schnellsten keimtötende Verbindungen: vegetative Zellen

bereits nach 30 bis 60 sek abgetötet• Wirkung 1 bis 2 Stunden

2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion

2. Sterilisation und Keimreduktion

– Anleitung

2.3. Chemische Sterilisation und Desinfektion

2. Sterilisation und Keimreduktion

• nur mit energiereicher, ionisierender Strahlung möglich (dringt tief genug ein)

• Gammastrahlung z.B. für medizinische Artikel (Spritzen, Kanülen, Katheter, Verbandmaterial), aber auch in der pharmazeutischen Industrie für z.B. Verpackungsmaterialien

• in der mikrobiologischen Praxis nur UV-Bestrahlung relevant:– meist zur Verminderung der Keimzahl in Raumluft

und an Oberflächen eingesetzt

2.4. Bestrahlung

2. Sterilisation und Keimreduktion

– für Werkbänke, Arbeitsflächen, Laminar-Flows– v.a. UV-C Strahlung eingesetzt (200-280 nm)– Optimum bei ca. 260 nm, da Nukleinsäuren in diesem

Bereich absorbieren – strukturelle Veränderungen der DNA (kovalenter Ringschluss zw. Pyrimidin-Basen) und Replikationsfehler (Zelltod)

– Beim Einsatz von UV-Strahlung zur Desinfektion muss auf Staubfreiheit geachtet werden

2.4. Bestrahlung

2. Sterilisation und Keimreduktion

• zur Entkeimung thermolabiler Substanzen (z.B. Antibiotikalsgen, Vitaminlsgen, …) und Gasen

• für Entfernung von Partikeln in Lsgen• Entgasen von Lsgen• mittels Oberflächenfiltern:

– aus Cellulose, Celluloseestern, Kunststoff (PTFE (Polytetrafluorethylen), Teflon, …)

– dünne Membranen– regelmäßige Poren mit gleichmäßigem Durchmesser (v.a.

0,2 µm und 0,45 µm eingesetzt)– wirken wie ein Sieb und halten die Partikel an der Oberfläche– kaum Wirkung gegen Viren, dünne Bakterienzellen, DNA– hohe Durchflussleistung– leicht verstopft

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

• mittels Tiefenfiltern:– entweder aus feinen Fasern (Cellulose-, Keramik-, Kunststofffasern), die

regellos miteinander verbunden sind– oder aus körnigem, meist gesintertem Material (Kieselgur, Keramik,

Glassinter)– dick geschichtet (bis in Meterbereich)– labyrinthartiges Hohlraumsystem– kein einheitlicher Porendurchmesser– Partikel v.a. in der Tiefe des Filters zurückgehalten:

• mechanisch, • Adsorption, • elektrostatische Kräfte

– auch Partikel, die kleiner sind als der Porendurchmesser, können zurückgehalten werden

– geringe Durchflussraten (ca. 40 mal geringer als bei Oberflächenfiltern)– Hallenbäder

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Sterilfiltration von Flüssigkeiten (Oberflächenfilter):– im Labor meist mit sterilen 0,2 µm Membranfiltern aus

hydrophilem Material (v.a. Cellulosenitrat, Celluloseacetat)

– Verwendung von größer-porigen Vor-Filtern– „Auswaschen“ von verschiedenen Stoffen aus dem

Filtermaterial möglich: z.B. bei Nitratbestimmung keine Cellulosenitrat-Filter verwenden

– Filtrationsgeräte (Filterhalter, Schläuche, Gefäße) werden separat (dampf)sterilisiert

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

– Durchführung:• meist wird im Auffanggefäß ein Unterdruck erzeugt

(Vakuumpumpe), die aufgesetzte, sterile Filtereinheit mit der Flüssigkeit beschickt und letztere durch den Unterdruck über einen Membranfilter in das Auffanggefäß gesaugt

• Aufsetzen der Filtriereinheit muss unter aseptischen Bedingungen erfolgen

• Verschluss ebenfalls unter aseptischen Bedingungen

• ODER: sterile Fertigfilter mit 0,2 µm Porendurchmesser für kleine Volumina

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

– Filtriereinheit

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

– Filtriereinheit

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

• Sterilfiltration von Gasen:– Tiefenfilter

• im Labor für Belüftung oder Begasung von Kulturen notwendig

• für Kleinfermenter• meist Watte- oder Glaswollefilter• ein Glasgefäß, -röhrchen o.Ä. wird mit Watte/Glaswolle (bis

6 µm Faserdurchmesser) gleichmäßig und fest gestopft• Material sollte hydrophob sein (wenig Flüssigkeitsaufnahme

(z.B. Aquarienwatte))• Durchmesser 1 bis 3 cm, Länge 5 bis 20 cm, je nach

Verwendung• Länge abhängig vom beabsichtigten Durchfluss• gestopfte Filter autoklavieren

2.5. Sterilfiltration

2. Sterilisation und Keimreduktion

Gase:

2.5. Sterilfiltration

3. Steriles Arbeiten• Ziele:

– Sterile Nährböden, Lösungen und Geräte vor Kontamination schützen– Reinkulturen „rein“ halten– die Umwelt (Raum, Personen,...) vor Infektionen durch

Versuchsorganismen schützen• Hauptkontaminationsfaktoren:

– Luft• viele Organismen sind luftgetragen (Sporen)• „normale“ Raumluft mit bis zu 2000 (2 x 103) Keimen (zumeist an/auf

Staubpartikeln)– Mensch (Hände, Haare,…)– Staub– „Tröpfcheninfektion“– unsteriles Arbeitsgerät– Öffnen von sterilem Material (sterile Spitzen) etc. in unsteriler

Umgebung

3. Steriles Arbeiten

• 4 Risikogruppen für den Umgang mit pathogenen Mikroorganismen:– Risikogruppe 1: kein Risiko (oder sehr geringes)

Risiko für (gesunde) Menschen und Wirbeltiere– Risikogruppe 2: geringes (bis mäßiges) Risiko für

Menschen und Wirbeltiere. Potentielle Krankheitserreger, die aber wirksam behandelt werden können

– Risikogruppe 3: mäßiges bis hohes Risiko, Erreger schwerer Krankheiten beim Menschen, Behandlung normalerweise möglich

– Risikogruppe 4: hohes Risiko für den Menschen, Behandlung oft schwierig

3. Steriles Arbeiten

• 4 Risikogruppen - Beispiele:– Gruppe 1: Bacillus subtilis, E. coli K12 (Laborstamm),

Lactobacillus casei, Micrococcus luteus; Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Penicillium chrysogenum

– Gruppe 2: Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, E. coli; Aspergillus flavus, Candida albicans, Aspergillus fumigatus

– Gruppe 3: Bacillus anthracis, E. coli (EHEC-Stämme), Yersinia pestis; Histoplasma capsulatum var. capsulatum

– Gruppe 4: bestimmte Viren

• Mit Organismen der Risikogruppen 2 bis 4 darf nur in genehmigten und dafür eingerichteten Labors gearbeitet werden