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6. Techniken der Protein-Reinigung

1. Protein-IsolationA) Wahl der ProteinquelleB) Methoden der SolubilisierungC) Stabilisierung von ProteinenD) Protein AssaysE) Generelle Strategien zur

Protein-Reinigung2. Löslichkeit von Proteinen

A) SalzeffekteB) Organische LösungsmittelC) pH-EffekteD) Kristallisierung

3. Chromatographische SeparierungA) Ionentauscher-ChromatographieB) PapierchromatographieC) GelfiltrationD) AffinitätschromatographieE) Andere chromatographische Techniken

4. ElektrophoreseA) Papier ElektrophoreseB) Gel ElektrophoreseC) SDS-PAGED) Isolelektrische FokusierungE) Kapillar Elektrophorese

5. UltrazentrifugationA) SedimentationB) Präparative Ultrazentrifugation

Protein-Reinigung: Das Problem

o Unser Protein beträgt ~0.1% des Zelltrockengewichtes(oftmals liegt es gar nur in wenigen Kopien pro Zellevor), muss aber zur Charakterisierung ~98% rein sein.

o Besseres Verständnis der biochemischen Abläufe gehtHand in Hand mit verbesserten Methoden der Analyse.-> Verständnis der Methodik ist sehr wichtig.

1.Schritte in der Protein-Reinigung

1. Selektion der Proteinquelle– Hämoglobin von Erythrozyten– Lac Repressor aus E. coli– Rekombinante Expression

2. Methoden der Solubilisierung– Zytosolisch <-> Membrangebunden / unlöslich– Osmotische Lyse der Zelle durch hypotone Lösung– Zellwand-Abbau bei Bakterien durch Lysozym– Mechanische Zerkleinerung des Gewebes– Klärung des Lysates (Filtration/Zentrifugation) -> Homogenat– Eventuelle Anreicherung für ein Organell (Mitochodrien,..)

mittels differenzieller Zentrifugation

Schritte in der Protein-Reinigung(2)

3. Stabilisierung des Proteins– Kontrolle des pH durch geeignete Pufferlösungen– Temperatur (4°C), Salzgehalt– Inaktivierung der Proteasen

4. Protein Assay– Unser Protein muss „gesehen“ werden– Bsp. Enzyme über ihre Aktivität– Bindungseigenschaften, Bsp. Rezeptor - Ligand– Biologische Aktivität, Bsp. Toxin– Immunologische Techniken, Bsp. ELISA

• Antikörper: Monoklonal / Polyklonal

ELISAenzyme-linked

immunosorbant assay

Bsp. Schwangerschaftstestbasierend auf ELISA detektierenChorion Gonadotropin im Urin

Generelle Strategie derProteinreinigung

o James Summer (1926) ersteProteinkristallisation,Urease aus Sojabohnen

o ~1940, ca. 20 Enzymegereinigt

o Heute, tausende

o Prinzip: Alle physiko-chemischen undbiologischen EigenschaftenIhres Proteins werdenausgenützt

2.Löslichkeit von Proteinen– Was bedeutet Löslichkeit ?– Da Proteine viele Säure-Base Gruppen

besitzen, ist ihre Löslichkeit abhängigvon:• pH• Salzkonzentration• Art von Salz• Temperatur• Polarität des Lsm

Ammonium Sulfate

Einfluss der Salzkonzentration

o Ionenstärke: I = 1/2∑ci Zi2

ci molare conc.Zi ionische Ladung

o Bei tiefer Ionenstärkenimmt die Löslichkeit mitder Salzkonzentration zu(Einsalzen)

o Bei hoher Ionenstärkenimmt die Löslichkeit ab(Aussalzen) [AmmoniumsulfatFraktioinierung]

Salzabhängige Löslichkeit von Carboxy-Hemoglobin bei pI

Einfluss organischer Lösungsmittel

o Wasserlösliche organische Lösungsmittelkönnen zugesetzt werden, um dadurch diePolarität und Dielektrizitätskonstante derwässrigen Lösung zu erniedrigen ->Prezipitation des Proteins, bei 4°C

o Organische Lösungsmittel mit hoher Dielk.Hingegen sind gute Lsm für Proteine (DMF,DMSO)

o Vorsicht: Denaturierung von Proteinen

pH-Abhängigkeit der Löslichkeit

• Minimal beimisoelektrischen Punkt, pI,des Proteins, isoelektrischePrezipitation

• pI eines Proteins: Summeder neg. = Summe der pos.Ladungen– Keine Nettoladung– Keine Mobilität im

elektrischen Feld.

Isoelektrischer Punkt von einigenhäufigen Proteinen

Proteinkristalle

• Kristallisation ausgehendvon hochgereinigtenProteinlösungen

• Induzierte, langsamePrezipitation

• Röntgenkristallstruktur-Analyse

3.ChromatographischeTrennungen

o Chromatographie: Gr. chroma, Farbe + graphie,schreiben

o Auftrennen von Farbe in ihre Bestandteileo Prinzip: Mobile Phase - stationäre Phase

Dabei treten Wechselwirkungen zwischen dem in dermobilen Phase gelösten Analyten und der stationärenPhase auf

o Klassifikation nach Art der Wechselwirkung mit derstationären Phase, Bsp. Ionentauscher Chr., AdsorptionsChr.

o Zur Proteinreinigung werden typischerweise mehrere Chr.Separationen hintereinander durchgeführt.

Papierchromatographie

• Set 1941, einfache Technik zurSeparierung von kleinen Molekülen, AS,Oligopeptide

• Stationäre Phase ist polar (Cellulose),mobile Phase ist apolar -> Separationaufgrund der Polarität der Substanz

• Migrationsrate hängt vomPartitionskoeffizienten ab:Kp = conc. Stat. Phase / conc. Mobil Phase

• Migrationsrate charakteristisch für jedeSubstanz,Rf = Distanz der Substanz /Distanz des Lsm

• Dedektion: Radioaktiv, Fluoreszenz,Derivatisierung, Bsp. Ninhydrin für AS

• Zwei-dimensional

Reaktion von Ninhydrinmit Aminosäuren

Zwei-dimensionalePapierchromatographie

Gradientenmischer (linear)

C = C2-(C2 -C1)ƒ

C1, conc. Mixing chamberC2, conc. Reservoirƒ, remaining fraction of combinedvolumes initially present

Ionentauscher Chromatographie

o Reversibler Austausch von Ionen an der inerten Matrix (stationärePhase, R+) mit Ionen in der Lösung (mobile Phase, B-)

R+A- + B- <-> R+B- + A- (Anionen Tausch)o Proteine sind Polyelektrolyte, können daher über Anionen- oder

Kationen-Tauscher gereinigt werdeno Affinität der Interaktion hängt von der Präsenz anderer

Bindungspartner ab, Salz, pHo Vorgehen: 1. Bindung der Proteine an den Ionentauscher

unter gegebenen Bedingungen2. Selektive Elution entweder schrittweise oder mittels eines Gradienten

Typen von Ionentauscher

o Resign: support Matrix der stationären Matrix, Bsp.Cellulose, cross-linked polyacrylamide, polydextran (allesind komprimierbar, daher nicht für HPLC geeignet).

o Beeinflusst Durchfluss, Ionen-Zugang, Stabilität derMatrix

o Trägt die ionisierbare Gruppe

Bsp. von IonentauscherMatrix

Gel-Filtrations Chromatographieo Gel-Filtration = Size Exclusion Chromatography =

Molekularsieb, Separierung aufgrund der Grösse undForm von Proteinen

o Stationäre Phase, Kügelchen (beads) mit kleinen Poreno Exclusion Limit, Ausschluss Grenze, Grösse des

kleinsten Moleküls, das nicht in die Poren eindringenkann.

o Vt = Vx + V0 Vt, Bett Volumen der Säule; Vx, Volumen der Gelbeads;V0, Volumen des Lösungsmittel um die Beads (voidvolume), Typischerweise ist V0 ~35% von Vt

o Ve, Elutionsvolumen eines bestimmten Proteinso Relatives Elutionsvolumen, charakteristisch für jedes

Protein, normalisiert für Säulengrösse, Ve/V0

Gelfiltration zur Mw BestimmungDas relative Elutionsvolumen eines Proteins, Ve/V0, ist

invers proportional zu seiner Masse

Gebräuchliche Materialien zurGelfiltration

o Resign: Dextran (polymervon Glucose), Agarose (redalgae), Polyacrylamid

o Porengrösse wird über denGrad an crosslinkingkontrolliert

o Entsalzen vonProteinlösungen

Dialyseo Dialyse ist ebenfalls eine Art

der Molekulargewichts-Filtration

o Semipermeable Membran ausCellophan (Cellulose Acetat)

o Wechsel des Lsm.o Dialyse gegen Polyethylenglykol

zur Aufkonzentration derProtein Lösung

Affinitätschromatographieo Nutzt die Eigenschaft vieler Proteine an

Liganden zu binden aus, Bsp. Enzymekönnen an Substratanaloga binden

o Ligand ist über Spacer kovalent an dieMatrix gekoppelt.

o Lösung der Ligand - Proteininteraktion zB.mit einem Liganden höherer Affinität oderpH, Salz-Sprung

o Cyanogen Bromid oder Epoxy aktivierteResigns zur Kopplung des Liganden an dieMatrix

o Immunaffinitätschromatographie,spezifische Antikörper werden an dieMatrix gebunden

Cyanogen Bromid oder Epoxy-aktivierte Trägerzur kovalenten Kopplung des Liganden an das

Resign

Epoxy-aktivierte Agarose

Bsp. Affinitätsreinigung der Nucleaseaus Staphylococcus

Bsp. Reinigung der Rattenleber Glucokinase

Weitere chromatographischeTechniken

o Adsorptions Chromatographie zur Separierung vonapolaren Substanzen, Bsp. Lipide. Matrix(hydrophil):Silica Gel, Kieselguhr, Aluminium Oxid

o Hydroxyapatit, unlösliche Form des Calzium Phosphateso Dünnschicht Chromatographie (TLC), Separierung

organischer Moleküle, Bsp. Lipideo Reverse Phase Chromatography (RPC), (reversed relativ

zu Papierchromatographie) Stationäre Phase ist eineapolare Flüssigkeit, die mobile Phase ist polar,normalerweise denaturierend, Bsp. Lipide, Oligopeptide

o Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) wieRPC, aber die hydrophile Matrix ist nur leicht hydrophobderivatisiert (Octyl, Phenyl-Gruppen)

o HPLC

HPLCo High pressure liquid chromatograpy

unkomprimierbare Matrix basierend aufGlaskügelchen oder Silica, welche derivatisiertwerden -> Ionentauscher, RPC, HIC, Affinitäts Chr.

o Lange, dünne Säulen in Metallröhrchen welche mitsehr hohem Druck (bis 5000 psi) gefahren werden– Gute Auflösung– Schnell <1h– Sensitiv– Automatisierbar

4.Elektrophorese

o Migration von Ionen in einem elektrischen Feld,o Elektrische Kraft, Felectric, auf Ion mit Ladung q in

einem elektrischen Feld E ist: Felectric = qEo Diese Migration wird durch einen Widerstand, Ffriction,

gebremst, der sich aus dem Produkt derBeschleunigung, v (velocity), mit einemWiderstandskoeffizienten, f, ergibt: Ffriction = vf

o Bei Konstanz, d.h. Ionen bewegen sich nicht: qE = vfo Elektrophoretische Mobilität eines Ions: µ = v/E = q/f

Wandernde Grenze

• 1937, erste elektrophoretische Trennungvon Proteinen durch Arne Tiselius

Papierelektrophorese

o Eine Art zonaler Elektrophorese,die Probe muss auf einem Trägerund nicht in Lösung wandern

o ~20 V/cmo Hochspannungs Elektrophr. ~200

V/cmo Kombination von Papierelektroph.

(Trennung aufgrund der Ladung)und Papierchromatography(Trennung aufgrund der Polarität)wird zum Fingerprinting eingesezt

Gelelektrophorese

o Eine der häufig gebrauchten und bestenMethoden, um Makromoleküle zu trennen.

o Agarose und Polyacrylamide als Trägero Kombination von Elektrophorese mit Gel

Filtration

PAGEo Polyacrylamid Gelelektrophoreseo Die Polymerisation von Acrylamid

wird durch freie Radikale(Ammonium Persulfat, TEMED alsStabilisator) induziert

o Porengrösse wird durch denAnteil an Acrylamid undBisacrylamid bestimmt

o Lauf bei pH ~9 -> Proteine sindnegativ geladen

Elektrodenreaktion in derElektrophorese

Sammel- und Trenngele erhöhendie Auflösung

o Diskontinuierlicher pH, Disc Elektrophoreseo Konzentration der aufgetragenen Probe in einem

dünnen Bereich durch Sammelgel + Trenngelo Trick: pH im Sammelgel 2 Einheiten Tiefer +

grössere Poren -> Fokusierung der Proteine an derGrenzschicht

Färbung von Proteineno Coomassie-Färbung, detektiert µg

Fraktioneno Silber-Färbung, ca. 50x sensitivero Fluorescamin modifiziert Lys

– Radioaktive Proben -> Autoradiographie

– Scintillations Zählung

Western blottingo Zur Detektion spezifischer Proteine mittels Antikörper

SDS-PAGEo SDS, starkes anionisches Detergents, Bindung

von ca. einem SDS Molekül pro 2 AS ->negative Ladung

o Alle Proteine haben die selben Ladung-zu-Masse Verhältnisse und eine ähnliche Form, dadenaturiert

o Trennung aufgrund der Massedurch die Gel Filtration vonPAGE

Isoelektrische Fokusierung

o Elektrophorese durch einen pH-Gradienten, Wanderung stoppt, wenndas Protein seinen isolektrischen Punkt erreicht

o Der stabile pH-Gradient wird durch ein Gemisch von Polyampholytenmit unterschiedlichen pI realisiert. Diese wandern im elek. Feld undbauen den pH-Gradienten auf.

o Mit Zusatz von Harnstoff zur Denaturierung der Proteine

Zwei-dimensionaleGelelektrophorese

• Isoelektrische Fokusierung gepaart mit SDS-PAGE

5.Ultrazentrifugation

o Separation aufgrund unterschiedlicher Dichteo Die Kraft, Fsed, welche auf ein Partikel mit Masse m, welches in einer

Distanz von r vom Drehzentrum, um welches es sich mit derGeschwindigkeit ω dreht (in rad s-1), entspricht der Zentrifugalkraftdes Partikels (mω2r) abzüglich der Auftreibkraft durch die Lösung (Vpρω2r): Fsed = mω2r - Vpρω2r ; wobei Vp das Partikelvolumen und ρ dieDichte der Lösung

o Ein Partikel hat eine charakteristische Sedimentationskonstante(analog zur elektrophoretischem Mobilität), in Svedbergs (S) (10-13 s)

o Die Partikelmasse kann durch analytische Ultzrazentrifugationbestimmt werden

Physikalische Parametereiniger Proteine

Sedimentations-Koeffizienten in

Svedbergs

PreparativeUltrazentrifugation

• Preparative Trennung von Partikeln durch:– Differenzielle Zentrifugation– Zonale Zf.– Equilibriums Zf.

Zonale Ultrazentrifugationo In Dichtegradienten (linear, step), Bsp. Sucrose, CsClo Trennung aufgrund der Masse (Beschleunigung)

Gleichgewichts / isopyknischeUltrazentrifugation

o In linearen Dichtegradienteno Trennung aufgrund der Dichte