Beobachtungen über den Nachweis von HS-Gruppen

Aus dem Forsehungsluboratorium der OndM GmbIt, Htinfeld/Hessen (Leiter: Dipl.-Ing., I)r. techn. HAns F~YTaO).

Beobaehtungen iiber den Naehweis yon HS-Gruppen.

Von HANS I~REYTAG.

(Eingegangen am 4. August 1956.)

In dieser Arbeit soll fiber Erfahrungen mit einigen weitereu l%eak- tionen yon tIS-Verbindungen in Fortsetzung und Erg~nzung friiherer Untersuchungen 11 beriehtet werden. Die Versuehe erstreeken sieh im wesentliehen auf Cystein, Cystin und Thioglykols~ure und, im Hinbliek auf die histoehemisehe Verwertbarkeit, ~uf das mensehliehe tIaar. Je naeh dem Verfahren wurden einmal Tiipfelnaehweise auf Papier, in anderen F/illen Reagensglasnaehweise bevorzugt. Die Verwendung yon Filtrierpapier Ms Tr/iger aufgebraehter HS-haltiger Verbindungen kann natiirlieh nur in grSbster Anni~herung als Modell fiir den histochemi- sehen Naehweis z. B. in Haaren dienen, denn das, was histochemische Nachweise weir empfindlicher als die iiblichen macht, ni~mlich die Lokali- sierung der I~eaktion auf Meinsten l%aum, der gerade noch visuell (mit Hilfsmitteln) beobachtbar ist 19, l~13t sieh auf dem Papier nur angenahert verwirklichen, yore Untersehied zwischen den Grundsubstanzen Cellulose und Protein (Keratin) ggnzlieh abgesehen.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit kamen folgende Verfahren bzw. Reagenzien zur Anwendung :

1. Die histochemische Methode yon M. CHi:Va~O~T und J. F ~ - D~IC ~, die auf der Bildung yon Berliner oder PreuBisch Blau und seiner Deponierung am l%eaktionsort beruht. Reagens ist Eisen (III)-hexaey- anoferrat(III), das auf diese Weise die HS-haltigen Bezirke blau f/irbt. Die Reaktion bedient sieh des t%eduktionsvermSgens der ItS-Verbin- dungen und wird daher yon Wasserstoffperoxyd is und yon Sulfit such gegeben. EinhMtung gewisser Bedingungen (pH und Konzentration) so- wie die Art des Untersuehungsgegenstandes sehlieBen manche redu- zierende Verbindungen aus. Die Autoren untersuchten mit dieser Me- rhode u. a. die Keratinisierung der t Iau t und des ttaares, wodurch die Methode besonders interessant erscheint.

2. Das yon M. CoI~N 4 zum Wasserstoffperoxydnaehweis benntzte Kupfer(II)-hexaeyanoferrat(III) , das dureh I%eduktion braunviolettes Kupfer (II)-hexacyanoferrat (II) liefert.

Z. anal. Chem., Bd. 143. 26

402 H.F~EYT~:

3. Das 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid*, das unter Redukt ion das entsprechende, rote, wasserunlSsliche F o r ~ t z a n bildet. Es ist zur Prii- lung der Keimf~higkeit yon Samen im Gebrauch und wurde vor kurzem zur Feststellung des Redukt ionsverm5gens yon Salbengrundlagen ver- wendet, wobei die Strahlungsempfindlichkeit der Verbindung verwertet wurde27, s. Die Reduktionsgeschwindigkeit (in lebenden Zellen) n immt mit steigendem p m W e r t zu, dutch starke Beleuchtung t r i t t Redukt ion yon Tetrazoliumsalz zu Formazan auf ~2. Cystein und Glutathion redu- zieren nach 1~. KuH~ und D. J ~ c H ~ L 17 erst in a]ka]ischen LSsungen oberhalb pH 9. 1%. A. FAIR]3~DC~, K. J. WILLIS und 1~. G. BOOTH 5 er- mit te l ten durch Photometr ie des gelSsten Formazans reduzierende Zucker, Cystein und Ascorbinsi~ure. Eine Berficksichtigung ihrer Befunde ist ffir die Benutzung dieser Reakt~on sehr wichtig.

4. Die yon 1%. FLn~az~r 1~ angegebene spezifische und empfindliche Reakt ion uuf Cystein mi t Dimethyl-p-phenylendiamin und Eisen(III) - chlorid. Es sollen 50 #g (1 : 20000) durch Blaufi~rbung nachweisbar sein. Weder Cystin, noch Thioglykolsiiure, Thiomilchs~ure und Glutathion sollen ansprechen. Die bekannte Methy]enblaureaktion 6, 7, 9, s0 unter- scheidet sich yon der Fn~MI~Gschen 1%eaktion dadurch, dab in s tark saurer LSsung gearbeitet wird. Die yon I t . TOYODA 26 mitgeteilte Mikro- methode zur Bes t immung yon HS- und Disulfidverbindungen beruht auf der Methylenblaureaktion. Es w~re yon hohem Interesse, festzu- stellen, inwieweit vorerw~ihnte Verbindungen die g]eiche Reakt ion geben wie Schwefelwasserstoff, und ob als letzte Ursache eine Schwefel- wasserstoffabspaltung im kons tanten Verhi~ltnis zur zu best immenden Verbindung in Bet racht zu ziehen ist.

5 . Die yon K. N~KAMU~A und F. BI~KLEy 21 zur colorimetrischen Best immung yon Cystein benutz te neue Farbreakt ion mit Brucin und Kaliumpersulfat .

Versuchsteil. 1. Reagenzien: Cysteinhydrochlorid (Chem. Produktion Bayreuth); 1-Cystin

(E. Merck); Thioglykolsi~ure, synthetisiert und frisch vor den Versuchen im Va- kuum destilliert; 2,4,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (E. Merck); Dimethyl-p- phenylendiaminhydrochlorid (E. Merck) ; Brucinsulfat (C. I-I. Boehringer Sohn AG., Nieder-Ingelheim a. Rh.) ; W~sserstoffperoxyd, 30%ig, p. a. (E. Merck) ; Natrium- hydrogensulfit und Natriumsulfit (Riedel-de Hahn); Eisen(III)-chlorid (p. a.) und Kaliumhexacyunoferrat(III) (E. Merck); Kaliumpersulfat (E. Merck) ; Kupfer- sulfat p. a. (E. Merck); Natrium~cctat (E. Merck); Glykokoll (E. Merck).

2. Ti~p/elpapier. Sehleicher & Sehfill Nr. 601. 3. Analysenquarzlampe (Original I-Ianau) als Bestrahlungsque]le.

* Naeh Beendigung dieser Arbeit erhielt ich Kenntnis yon einer Abhandlung yon G. E. ROGERS 23. Der Autor untersuchte die Einwirkung yon verschiedenen Tetrazoliumsalzen u. a. auf Haarfollikel, Cystein, Glutathion und reduzierte Wolle. Seine Ergebnisse sollen spi~ter in anderem Zusammenhang beriicksichtigt werden.

Beobaehtungen fiber den Naehweis yon HS-Gruppen. 403

4. Zum Ti~/eln dienten selbstgefertigte Tropfpipetten, deren Tropfengr6Ben ermittelt worden waren.

5..Reagens nach C~V~EMo~ und F~D~gm 3. 1 Vol.-T. einer frisehen 0,1%igen wgl~rigen LSsung yon Kaliumhexacyanoferrat(III) wurde vor Gebraueh mit 3 VoI.-T. einer frischen l%igen Eisen(III)-ammoniumsulfatlSsung vermiseht, darin ab- weichend yon der Angabe der zitierten Autoren, um die Menge Eisen(III)-Ionen geringer zu halten. Diese LSsung yon pE 2,7--2,8 (gegen 2,4 bei C~gvg~osT und Fg~D~RIC) ist etwa 1 Std im Dunkeln haltbar, weshalb man zur Durehffihrung einer Reaktion die Anteile stets neu mischt.

6. Reagens nach Co~N 4. 21 ml 0,1 m KupfersulfatlSsung wurden mit 6 ml 0,1 m K~liumhexgey~noferrat(III)-]Ssung vermischt und mit 6 ml 15%iger Natrium- a, eetatlSsung versetzt. Die AEfschwemmung des entstandenen dicken, gr~ugrfinen Niederschlags wurde mit 30 ml Wasser verdtinnt. Das Reagens ist im Dunkeln recht haltbar. Vor Gebrauch ist es nmzuschfitte]n.

7. 2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Reagens. Die LSsungen yon 0,4 oder 0,5 g in 100 ml ~atronlauge versehiedener ~ormalit~t wurden friseh bereitet. Konzen- trationsunterschiede blieben praktisch einflul~los.

8. Real~tion nach FLnMING ~~ sowie naeh ToroD.~ 2s. Im ersten Falle wurde 1 ml der zu priifenden L6sung mit verschiedenen Mengen einer LSsung yon 0,2 g p-DimethyIphenylendiaminhydrochlorid (Reggens A) in 100 ml Wasser versetzt und dann entsprechende Mengen einer LSsung yon 5 g Eisen(III)-chloridhexahydrat in 100 ml Wasser (Reagens B) zugeffigt. In Gegenwart von Cystein entsteht naeh dem Erhitzen zum Sieden Blaufgrbung.

Der (mit Zinkstaub reduzierten CystinlSsung oder) Cystein enthaltenden L6sung (ira allgemeinen zumeist 1 ml) wurden im zweiten Falle verschiedene Mengen fol- gender ~eagenslSsungen, hergemdlt nach den Angaben des AEtors, zugeffigt: eine LOsung yon 0,5 g Dimethyl-p-phenylendiaminhydrochlorid in 50 ml konzen- trierter 8chwefe]sgure auf 1 Liter mit Wasser aufgefiillt (Reagens C), und eine LOsung yon 25 g Ammoniumeisenalaun, abet mit 10 ml konzentrierter Schwefelsgure, da die angegebenen 5 ml nicht zur vOlligen Beseitigung der Triibung ausreichten, auf 200 ml mit Wasser verdfinnt (Reagens D). Das Auftreten der Blaufgrbung wurde bis zu 3 T~ge ]ang beobaehtet.

Die Dimethyl-p-phenylendiaminhydroehloridlSsung naeh FLEMING nimmt gleieh naeh Hersteliung eine rOtliehe Fgrbung an, die sioh im Licht vertieft. Ein Einflu~ auf die Reaktion konnte nicht beobaehtet werden. Es geniigt, dieses Reagens alle 2 Tage friseh zu bereiten. Das stark saure I~eagens nach TOYODA bleibt hingegen farblos.

9. Reaktion nach NAXA~U~A und BI~KLEu 21. 5 ml PrfiflOsung wurden mi~ 2,5 m150% iger Sehwefelsgure, 10 ml einer 1% igen BrueinlSsung in 5% iger Schwefel- sgure, 2,5 ml 10%iger G]ykokollOsung und 2,5 ml l%iger XaliumpersnlfattOsung versetzt. In Cysteingegenwart beobgchtet man Bl~ufgrbung. CystinlOsungen in 0,1 n 8alzsgure wurden zungchst mit 100 mg Zink reduziert.

10. Frauenhaare gleieher }terkunft wurden dutch je lstfindiges Einlegen in Xthanol, Petrolgther End Ather gereinigt, dann an der Luft bei Raumtemperatur Enter Absaugen vom Ather befreit und im Exsiceator bei etwa 55% Luftfeuchtigkeit aufbewahrt. Auf diese Weise wird die Vorgesehichte der Haare in gewissem Aus- mal]e genormt. Die VorbehandlEng erstreckte sich auf mehrstiindige oder mehr- tggige (bis zn 3 T~gen) Einwirkung 10%iger WasserstoffperoxydlOsung (Bleichen) ohne Zusatz yon Alkali, auf die Wirkung yon Natronlauge mit nachfolgendem Be- handeln mit Sgure gleicher ~Norma]itgt und anschliegender Wasserung, TrocknEng im FOhnluftstrom und Aufbewahrung im Exsiccator bei 55% Luftfeuehtigkeit. Da Wasserstoffperoxyd, wie ich vor lgngerer Zeit zeigen konnte ~, vom Haar sehr

26*

404 H. FREYTAG :

hartn~ckig festgehalten wird - - wobei fiber die Art dieser ,,Bindung" oder ,,Auf- nahme" nichts Naheres ausgesagt werden kann- - , wurden die betreffenden tta~r- proben nach dem Abdruekverfahren mit Bleisulfidpapier geprtift und nur bei nega- tivem Ausfall des Nachweises verwendet. Die ReagenslSsungen befanden sieh im Reagensglas, die Haarproben wurden eingelegt. Das Verhaltnis ReagenslSsungs- volumen zu Haarmenge wurde stets angen~hert gleich gehalten.

Querschnitte yon Haaren von 15 # Dieke wurden in iiblieher Weise dureh Ein- betten in Paraffin hergestellt und mikroskopiseh untersueht.

Diskussion der Ergebnisse. I. Die Berlinerblaubfldung naeh Cm~VaEMO~T und FR~D]~IC kann unter den yon

(Geweben und) Haaren gebotenen einschr~nkenden Bedingungen und beim pH-Wert des Reagenses bevorzugt HS-Gruppen anzeigen. Um einen Begriff yon der Emp- findliehkeit der Reaktion zu bekommen, wurde Cystein, Thioglykolat und Sulfit sowie Wasserstoffperoxyd zun~chst im Tfipfelversueh geprfift. Cystin gibt, wie erwartet, keine Reaktion. Wiehtig ftir die Beurteflung des Auftretens einer positiven Reaktion ist die Blindprobe, da Blauf~rbung auch dureh das Filterpapier selbst (Oxycellulose) besonders am Licht, oder durch in der Laboratoriumsluft etwa vor- handene reduzierende Gase (S02, SH2) hervorgerufen werden kann. Zur Blindprobe verwendet man einen gleieh groi]en Tropfen destilliertes Wasser oder, falls die zu untersuchende LSsung noch andere Bestandteile aufweist, deren LSsung ohne die tIS-Verbindung. Die Blaufarbung eines Thioglykolsi~uret/ipfels yon Grenzkonzen- tration wird yon der Blindprobe in der Regel erst in etwa 10 rain erreicht. Etwa vor- handenes freies Ammoniak muB vor Ausffihrung der Reaktion neutralisiert werden, indem man das Papier zuerst mit entspreehend verdfinnter Salzs/~ure betfipfelt.

Tfipfelt man das Papier zuerst mit dem Reagens und dann mit der PrfiflSsung, so erzielt man gegenfiber der umgekehrten Reihenfolge eine beaehtliche Empfindlieh- keitssteigerung, wie naehstehende ~bersieht veranseh~ulieht (Tab. 1). Liegen zu prfifende ttaare vor, so spielen diese die Rolle der zuerst auf Papier aufgebraehten PriiflSsung. Dann gilt aber der empfindliehkeitssteigernde EinfluB des Wirkraums der Reaktion (vgL L~so~lS).

Tabelle 1.

Substanz

Thioglykolsaure . . . Cysteinhydrochlorid. . Natriumhydrogensulfit. Wasserstoffperoxyd . .

Zuerst PrfiflSsung

Erf.-Gr. in ~g (1 Tr.= 0,015 ml)

0,3 1 0,8

15

Gr.-Konz.

1:52083 1:15000 1:19531 1:1032

Zuerst Reagens

Erf.-Gr. in gg (1 Tr.= 0,015 ml)

0,14 0,5 0,53

13

Gr.-Konz.

1:108577 1:30000 1:29137 1:1176

I I . Ungeble ich tes H a a r f~ rb t sich naeh insgesamt 3 s t f indiger Einwh'- kung un te r dre imal iger E rneue rung der ReagenslSsung fiber die ganze L~nge grf inst iehigblau. I m Querschni t t is t keine Fi~rbung, aul~er an der der (Haar- )Cut :cu la zuzusprechenden Peripherie, zu erkennen. Aul3erdem is t das H a a r keineswegs einheit l ich, sondern unregelmgflig angef~rbt . Zun~chst kSnnte erwogen werden, die Anf~rbung w~re durch die vom Reagens bewirk te H y d r o l y s e der Cyst inbrf icken bedingt . J edoch reag ie r t Cyst in selbst n ich t mi~ dem sauren Reagens (nach A. SC~SBE~L

Beobachtungen fiber den Naohweis yon HS-Gruppen. 405

und H. ECK 17 erfolg~ die hydrolytische Aufspaltung der Disulfidbindung nur im a]kalischen und neutralen Bereich). So kSnnte es sieh um de~ Nachweis freier (bestiindiger) HS-Gruppen in der Cuticula hande]n, denn normales Haar gibt die FEIGLsehe Jodazidprobe 7 augenblicklich und dentlich, woraus nach vergleiehenden analytischen Befunden yon W. Aw~ 19 zu schliel3en w~re, dal~ entweder HS:, ~ C z S oder - - S - - S - Gruppen vorliegen. Die letzten scheiden wegen der positiven Reaktion nach C~VREMONT und F ~ D ~ I c aus. Gebleichtes Haar verh~lt sich ebenso, was gegen diese DeuSung und eher fiir andere reduzierende Sub- stanzen zu sprechen scheint, wenn nicht angenommen wird, dab im Kerat in entweder die t tS-Gruppen der Cutieula gegen die Einwirkung yon Wasserstoffperoxyd (steriseh) geschiitzt oder durch Oxydation neue und andere reduzierende Gruppen aufgetreten sind.

Es is~ unzweckm~l]ig, mi t dieser Reaktion ein mit Thioglykolat ~5 oder Sulfit 25 behandeltes Kerat in zu priifen. Die Gefahr des mehrdeutigen Befundes ist zu groin, tt ingegen zeigt der positive Ausfall der Re~ktion eines mit Natronlauge vor-, dann mit Salzs~ure gleicher Normaliti~t nachbehandelten, vor ahem gebleichten Huares in den Querschnitt hinein, dal~ die reduzierenden Gruppen vermehrt auftreten, eine Folge der laugebewirkten Hydrolyse der Cystinbriieken~: Das leichter quell- bare gebleichte Haar ~3 zeigt nach etw~ 20 rain langer Einwirkung yon n Natronl~uge, ebensol~nger Neutralisierung mit n Salzs~ure, Wgsse- rung und 10 rain langer Behandlung mit dem Reagens im Querschnitt teflweise, v o n d e r Peripherie her verschieden tier, aueh punkt- oder insel- f6rmige Blauf~rbung. Das Haar ist t rotz S~urenachbehandlung noch in gequollenem Zustand. n AmmoniumhydroxydlSsung aber ftihr~ bei 30 rain langer Einwirkung und l stiindiger Einwirkung des Reagenses selbst bei gebleichtem Haar lediglich zu oberfl~chlieher, peripherer An, fi~rbung, etwa wie dies bei ungebleichtem, mit n Natronlauge behan- deltem H a a r zu beobachten ist.

Der Versueh, gebleichtes yon ungebleichtem Haar mit dem Reagens yon CH~V- ~ O ~ T und FR~D]~RIC nach vorangehender Behandlung mit n Natronlauge, 1Neu- tralisation mit n Salzsaure und Wasserung zu unterseheiden, ffihrt zu keinem brauehbaren Resultat. Die Reaktion tritt in beiden Fallen rasch und praktisch in g]eicher St&rke ein.

III . Die lkTachpriifung des yon COliN angegebenen Wasserstoffperoxydnachwei- ses zum ~Taehweis yon Thioglykolsaure und Cystein (bzw. Sulfit) wurde ~uf Tfipfel- papier ausgeffihrt. ~esent]ich f~ir die Empfindlichkeit war, zuerst 0,04 ml Reagens- 15sung zu tiipfeln, ~uf die gleiehe Ste]le 0,04 ml PrfiflSsung zu setzen und 4 Tropfen Wasser zuzuffigen. Auf diese Weise wird n~tmlich das sonst durch den Niederschlag des l~eagenses verdeck~ bleibende I~eakfionsprodukt nach ~ul~en verdrang~ und es bilde~ sich ein rotbraunvioletfer Ring, der bei der entsprechenden Blindprobe nicht auftritt. Erfassungsgrenze ffir Thioglyko]saure 25/~g, Grenzkonzentration 1 : 10000. Ffir Cysteinhydrochlorid wurde etwa die gleiehe GrSl]enordnung gefunden. Sulfi~, dessen Naehweis etwas unempfindlicher ist, stSrt. I)er Wasserstoffperoxyd-

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naehweis ist am empfindiiehsten. Versuehe an Haaren analog jenen mit dem Rea- gens yon CH~VRE~O~T und FR~.D~nIC blieben ergebnislos.

IV. W~hrend die Berlinerblaureaktion nahezu augenblieklieh eintritt - - beim t taar ist die beobaehtete etwas l~ngere Reaktionsdauer eine Folge des langsameren Eindringens der ReagenslSsung in die Keratinsubstanz - - , beansprucht die Tetra- zoliumreaktion auch in LSsung vergleichsweise lange. In w~Briger L5sung erseheint eine sieh immer mehr zum roten Niedersehlag verdichtende Trtibung, wenn Cystein, Cystin (Hydrolyse), Sulfit oder sogar Wasserstoffperoxyd vorhanden sind. Entgegen aller Erwartung ist diese Reaktion, die den Vorzug elnes unlSslichen Reduktions- produktes bietet, sehr unempfindlieh. Hinzu kommt noeh ihre Langsamkeit bei Raumtemperatur. Mit ausreichender Sieherheit konnte Formazan erst nach 4stfin- diger EinwirkUngsdauer beobaehtet werden. Die Ergebnisse sind Tab. 2 zu entneh- men. Es wurde stets 1 ml PriiflSsnng yon Grenzkonzentration mit 1 ml Reagens- 15sung (0,4 g/]00 ml n Natronlauge) vermiseht und im Dunkeln 4 Std, d. h. bis zum Auftreten des roten Niederschlages, stehen gelassen. Natfirlich kann auch mit geringeren Flfissigkeitsmengen gearbeitet werden.

Subs~anz

Tabelle 2.

Erfassungsgrenze pg/ml Grenzkonzentration

Thioglykolsaure . . . . . . . . . 920 1 : 1080 Cysteinhydrochlorid . . . . . . . 3154 ~ 1 : 317 Cystin . . . . . . . . . . . . . 24030 i 1 : 41,6 Na-hydrogensulfid . . . . . . . . 20800 I 1 : 48,1 Wasserstoffperoxyd (nach 12 Std) . ] 54400 ] 1 : 18,4

Tiipfeln las t sich mit dem Tetrazoliumreagens nieht, weft Cellulose ebenfalls Formazanbildung verursachen kann, abgesehen yon der starken Herabsetzung der Empfindlichkeit.

Da die Laugenkonzentration ebenfalls die Empfindliehkeit beeinflul]t - - n Na- tronlauge erwies sich besonders gfinstig - - (yon hSheren Konzentrationen wurde, wie weiter unten erlautert wird, abgesehen), wurde eine LSsung yon 0,1 g Tetrazo- liumsalz in 100 ml 0,2 n Natronlauge gewahlt und dieser LSsungsmenge 0,1 g Cy- stein hinzugeffigt. Bei Raumtemperatur (22 ~ C) war noch naeh 105 rain kein Form- azanniederschlag aufgetreten, w~hrend die gleiche LSsung bei 85--86 ~ C nach 25 min Niedersehlag aufwies. Die anfangs feine Formazansuspension bleibt lange genug bestehen, um roh photometriert zu werden (Colorimeter yon Dr. B. LARGE). Diese unter solehen Bedingungen sehr primitive Verfolgung tier Formazanbildung gibt den ttinweis, dab sieh durch Erw~rmung die Reaktionsdauer um etwa die H~lfte herabsetzen laBt. Unter den eigentliehen Naehweisbedingungen - - halbe Normalit~t der Natronlauge im Endgemisch Reagens-PrfiflSsung bzw. Reagens-- Wasser - - ist festzustellen, dab die letztere, die Blindprobe selbst, schon naeh 3,5 rain bei der Temperatur des kochenden Wasserbades Formazan abscheidet. Sind Reduktionsmittel anwesend, so erfolgt die Formazanabscheidung raseher, doch ist nur sehr schwer zu erkennen, ob die zeitliehe Differenz des ersten Auftretens zwischen Versuch und Blindprobe grog genug ist, um die Gegenwart einer redu- zierenden Substanz mit Sicherheit bejahen zu kSnnen.

Beim Tropfen einer w~Brigen TetrazoliumlSsung auf Natriumhydroxydplatz- chen tr i t t sofort Formazan auf. Diese Beobachtung steht durchaus mit der Tat-. saehe im Einklang, dab Kochen an sich geniigt, in alkalischer TetrazoliumlSsung Formazanbildung herbeizufiihren.

Beobaehtungen fiber den Naehweis yon HS-Gruppen. 407

Der Wert der Tetrazoliumreaktion auf HS-Verbindungen in Alkaligegenwart er- seheint noch dureh die Str~hlungsempfindliehkeit des Salzes weiter vermindert. Es fiel auf, dab ein ~lteres Tetrazoliumpriparat gelblich gef~rbte Bestandteile auf- wies, w~hrend ein frisehes vo]lkommen einheitlich well3 war. Die neutrale LSsung des gelbliehen (gealterten) Pri~parates gab bei UV-Bestrahlung rascher die Formazan- abseheidung als die des neuen. Gen~u so verh]elt sieh das frisehe, ~ber in Substanz 30 min lang UV-bestr~hlte und dadureh bis zu einem gelbliehen Ton verfirbte Priparat in w~iBriger LOsung. Dureh Natronlauge oder UV-Bestrahlung (aueh lange zur Einwirkung gelangtes Tageslieht geniigt) entstehg aus Triphenyltetrazolium- ehlorid eine Verbindung yon ausgesproehen reduzierenden Eigensehaften in zur t~ormazanabseheidung ausreiehender Menge. Reduzierende Substanzen besehleuni- gen in beiden F~llen die Formazanentstehung dutch UV-Bestrahlung, doeh bleibt es trotz Blindversuchen ungewig, in welehem Ausmal3 Probe und ,,Verunreinigung" in ihrer Kombination zusammen wirken. Wegen dieser Unsieherheit kann der Me- rhode yon N. ZI~GSHEIM ein vorl/iufig nut verhiltnismggig geringer Weft zuge- billigt werden, denn Salbengrundlagen ohne tteduktionsvermSgen k6nnen infolge der erwihnten Verunreinigung des l~eagenses ein solehes vortgusehen.

V. Mit alkalisehem Tetrazoliumreagens behandelte Haare f i rben sieh naeh einiger Zeit, je nach den niheren Bedingungen, rot. Diese Rot- fgrbung ist zweifellos auf die aus den Cystinbr/ieken des Keratins dureh Hydrolyse entstehenden HS-Gruppen zurtiekzuffihren. Das Eintreten der F i rbung ist in hohem Grade abhgngig yon der Laugenkonzentration. Am besten eignet sieh 0,5--1,0 n Natronlauge. Man kann dies nieht etwa dureh die Dauer der Cystinbriiekenhydrolyse allein erkl~ren. Vielmehr beanspruehen aueh Quellungs- (und Diffusions)-vorggnge, die erst die Cystinbriieken zuggnglieh maehen, ebenfalls Zeit 13. Ferner wire daran zu denken, dab unter den Bedingungen des Haares diese Laugenkonzen- ~ration die Cystinbrticken optimal aufspaltet. Bei ungebleiehtem Haar wiihrt die geak t ion etwa 2--3 min mit 0,2 g Tetrazolimnsalz/100 ml 1,0 n Natronlauge, bei Anwendung yon 0,1 n Natronlauge als L6sungs. mittel etwa 45 rain. Quellungsvorggnge mfissen eine wesentliehe t~olle spielen, da z. B. eine LSsung yon 0,2 g Tetrazoliumsalz in 0,5 n Natron- lauge Haar naeh etwa 20 min stark rot, die gleiehe LSsung abet naeh Zusatz yon 5 g Natriumehlorid je 100 ml in gleicher Zeit I I aa r gleieher Herkunft wesentlich sehwi~eher fgrbt. Es ist aus meinen friiheren Unter- suehungen i3 bekannt geworden, dag NeutrMsalze quellungsvermindernd auf Haare wirken und die sehwiehere I{eaktion bedeuteg, dab infolge Quellungshemmung weniger Cystinbriieken hydrolysiert werden.

Die Art der Base ist ebenfalls yon Einflul3. 0,2 g Tetrazoliumehlorid in 100 ml n Monogthanolaminl6sung fgrbt unbehandeltes Haar erst naeh etwa 3 Std, zum Untersehied yon einer Reagensl6sung mit n Natronlauge, die den gleiehen Effekt spi~testens naeh 15 min erzielen l~13t. Mit in n Ammoniumhydroxydl6sung gel6stem Reagens isg naeh 3 Std nur eine sehwaehe Rotfgrbung der gleiehen Haare feststellbar. Diese Beobaehtungen sind wohl aueh auf einen Quellungseffekt zuriick- zuftihren, erinnern aber zugleieh an den untersehiedliehen Einflug

408 H. FREYTAG:

versehiedener Basen auf die sogenannte ,,Bindung" yon Thioglykolat durch Keratin, den ich vor kurzem beschrieben habe 14.

Je naeh Base und Einwirkungsdauer zeigt sich bei mikroskopiseher Betrachtung der mit Tetrazoliumreagens behandelten Haare - - ge- bleiehte Haare sind unter sonst gleiehen Bedingungen ira allgemeinen st/~rker als die entspreehenden ungebleichCen gefi~rbt - - im Quersehnitt (15# Dieke) periphere Anfgrbungen oder Gesamtanfi~rbungen. Infolge der LSslichkeit des Formazans sowohl in Paraffin als aueh in den Pa- raffinentfernungsmitteln ist die i~ui3ere Zone (Cutieula) aufgehellt odor farblos. Bei peripherer Anfi~rbung des Querschnitts ist h~ufig eine deut- liche Asymmetrie zu erkennen. Gleich scharf eingestellte, gegenfiber- liegende Zonen sind verschieden intensiv gef/~rbt. Diese Variabilit/it, die durehaus der der Haare iiberhaupt entspri~che 14, kSnnte vielleieht als Beweis einer konfigurativ-konstitutionellen Verschiedenheit der Haar- laser im Simle einer Bilateralit~t gelten, die durch andere Anfgrbungen yon Wollfasern yon M. HORIO und T. KoNDo 16 gezeigt wurde. Wahr- scheinlieher aber ist doch zuni~ehst die Annahme einer unterschiedlichen Quellung durch die Reagensl6sung und damit Diffusion des Reagenses. Die Untersehiedlichkeit der Quellung lgngs eines Haares ist bekannt.

2, 3, 5-Triphenyltetrazoliumeblorid 1/il~t sieh zur Demonstration der hydroly- sierenden Wirkung yon Alkalien auf Cystin bzw. Cystinbrficken in Keratin verwen- den bzw. zum Nachweis gebleichten oder geschgdigten Haares fiberhaupt bei Ab- wesenheit yon Sulfit, Thioglykolat und grSl]eren Mengen yon Wasserstoffperoxyd.

Das zu priifende Haar iibergiel3t man mit einer LSsung yon 0,5 g Tetrazolium- ehlorid in 100 ml n Natronlauge. Gebleiehtes Haar f~rbt sieh, je nach Bleichungs- grad, binnen 2--3 rain schw~cher oder starker rot. In der gleichen Zeit aber ist un- gebleichtes Haar nur schwach rot gef/~rb~. Der Unterschied ist deutlich.

VI. Naeh FL~MING 1~ sind mit 0,2%iger Dimethyl-p-phenylendiamin- hydrochloridlSsung 50 #g (1 : 20000) Cysteinhydrochlorid in 1 ml LSsung naehzuweisen. Wegen der offenbaren Wesensgleiehheit der Reaktionen naeh FLV.MING und TO~-ODA wurde jene sowohl naeh Vorschrift des ersten Autors, ngmlich durch Erhitzen, als auch nach der des zweiten, durch Stehenlassen des Reaktionsgemisches, herbeigefiihrt. In beiden F/illen ergab sich eine deutliche Abh/ingigkeit der Reaktionen yon der N[engo der zugesetzten ReagenslSsungen (Tab. 3 und ~, S. 409, bzw. 410).

Die yon FLE~IXG mitgeteilte. Empfindlichkeit seiner Reaktion kann somit besti~tigt werden. Allerdings erfordert ein solcher Nachweis das Ansetzen von Reihenproben mit gesta]]elten Reagenszusiilzen, da man sonst negative Ergebnisse erhi~lt. Positiver Ausfall der Reaktion ist nur die klare Blaufi~rbung.

Wie aus der Blindprobe und den Reaktionen bei bestimmten Mengenverh~lL- nissen der ReagenslSsungen hervorzugehen seheint, handelt es sich bei den Rot-, Gelb-, Braun- und Violettfarbungen um Nebem'eaktionen, mSglieherweise um die Entstehung gef~rbter (und auch farbloser) Oxydationsprodukte yon Dimethyl-p- phenylendiamin. Man erhitzte stets bis zum Sieden oder bis zum Erscheinen einer

Beobaehtungen fiber den Naehweis yon HS-Gruppen. 409

sieh nicht mehr ver/~ndernden Fi~rbung, gegebenenfalls unter Ersatz des verdampf- ten Wassers, in der Flamme. Nach Zugabe yon Reagens A und B (in dieser Reihen- folge) zur TestlSsung wird das Gemisch zuerst s tark rot, dann beim Erhi tzen violett- rot. Negative Reakt ionen (Blindprobe odor bei n icht dem jewefls vorhandenen

Tabelle 3. Reaktion nach FLEMING mit verschieden groflen Zusiitzen an Reagenzien A und B (vgL S. 403, Zi]]. 8). Au@i~hrung im .Reagenzglas.

i ml TestlSsung mi~ c g Cysteinhydrochloridgehalt Nach ~rhitzen Ohne Erhitzen

versetzt mit beobachtet nach beobachtet nach

Blindprobe; c = 0 g sofort: violett A: 0,5 ml, B: 0,05 ml 15 Std: s tark violett

c = 0,0005 g A: 0,5 ml, B: 0,05 ml

c = 0,0005 g A: 1 nil, B: 0,1 nfl

e = 0,0001 g A: 1 nil, B: 0,I ml

e = 0,00005 g A: 1 ml, B: 0,1 ml

e = 0,00005 g A: 0,5 ml, B: 0,05 ml

c = 0,00005 g A: 0,1 ml B: 0,01 ml

c = 0,00005 g A: 0,05 ml, B: 0,01 ml

c = 0,000005 g A: 3 ml, B: 0,3 ml

c = 0,000005 g A: 1 ml, B: 0,1 ml

c = 0,000005 g A: 0,5 ml, B: 0,05 ml

e ~ 0,000005 g A: 0,05 ml, B: 0,01 ml

sofort: violet t 40 Std: violett, b laust iehig

sofort: klare Blaufi~rbung 15 Std: etwas s tarker

sofort: rotviolet t 1 Std: braunviole t t 20 Std: s tark violett

sofort: violet t 20 Std: s tark violett

sofort: violett 20 Std: violett

sofort: klare Blauf~trbung 20 Std: etwas verst/~rkt

sofort: sehwaehe, aber klare Blauf~rbung 15 Std: etwas abge- schwgehte Blaufgrbung

sofort: violett 15 Std: s tark violett

sofort: Violett 15 Std: s tark violett

sofort: violett 15 Std: s tark violett

sofort: gelbbraun 15 Std: s tark gelbbraun

anfangs hellrot 20 Std: violett (schw~cher als nach Erhitzen)

1 rain: braungelb 20 SM: Mare Blaufarbung

1 Std : violet tbraun, vorher rotviolet t 20 Std: s tark violett , blaustichig

20 Std: s tark violett ent- sprechend Blindprobe

20 Std: s tark vioIett wio Blindprobe

20 Std: s ta rk violett wie Blindprobe

1 Std: gelb 40 Std: farblos

1 Std: ro tb raun 15 Std: schw/~eher rot- b raun als vor

anfangs rot, dann hellrot 20 Std: violett

anfangs rot, 1 min hellrot- rotbraun-gelb 20Std : schwaoh braun-gelb

1 Std. sehwaeh ro tb raun 15 Std: ebenso

Cysteingehalt entsprechenden Reagensmengen) zeigen an sieh eine eharakteristische Farb~nderung: Das Violet trot schl~gt nach Violett urn. Liegt unter gfinstigen Reagensmengenverh~ltnissen Cystein vor, so entf~rbt sich das Violet trot zunaehst, naeh wenigen Sekunden erscheint eine Gelbfiirbung, die fiber Gelbgrfin in das klare

410 H. FRErTAa:

Blau iibergeht. Gelegen~lich beobachtet man, dal3 eine Entf/~rbung eintritt , die sich nicht mehr bei weiterem Kochen/~ndert. Die Reaktion kann auch bis zur Gelbf~r-

Tabelle 4. Reaktion nach TOu mit verschieden groflen Zus~itzen an Reagenzien C ~nd D (vgL S. 403, Ziff. 8). Aus]i~hrung im l~eagensglas.

1 ml TestliSsung (mit c g 0hne Erhitzen Nach ]~rhitzen Cyst einhydrochloridgehalt )

versetzt mit beobachtet nach beobachtet nach

c = 0,0005 g C = 0,5 ml, D = 0,05 ml

c = 0,0001 g C = l m l , D = 0,1 ml

c = 0,0001 g C = 0,1 ml, D -- 0,01 ml

c = 0,0005 g C = 2,5 ml, D = 0,25 ml

c = 0,000005 C = 0,05 ml, D = 0,005 ml

c = 0,0005 g C = 0,5 ml, D = 0,05 ml

c = 0,00005 g C = 2 ml, D = 0,2 ml

e = 0,00005 g C = 3 ml, D = 0,3 ml

c = 0,00005 g C = 5 ml, :D ~ 0,5 ml

Blindprobe C = l m l , D = 0 , 1 m l

c = 0,000005 C = 5 ml, D = 0,1 ml

1 Std: erstes Anzeichen einer Blauf~rbung 24 Std: eben noch zu se- hende Blauf/~rbung

6 Std: Blauf~rbung 24 Std: starke Blaufi~r- bung

24 Std: farblos geblieben

5 Std: deutliche Blau- f/~rbung 24 Std: starke Blauf/~r- bung

7 Std: schwaeh bramlrot 24 Std: sehr schwach rot- braun, violettstichig

7 Std: Blauf~rbung 24 Std: klare Blauf~rbung

9 Std: schwaches, gerade noch sichtbares Blau 24 Std: sehr schwache Blaufarbung, violettstichig

24 Std: schwache, schmut- zigviolettb]aue F/irbung

24 Std: sehr schwach schmutzigblau, violett- stichig

24 Std: schwach braunrot, violettstichig

7 Std: Gelbfi~rbung 24 SM: etwas verst~rkte Gelbf/irbung

sofort: sehr schwache Blauf/irbung 15 Std: ebenso

sofort: Btaufgrbung 15 Std: Violettblau

sofort: farblos 15 Std: ebenso

sofort: klare Blaufarbung 15 Std: starke Blaufarbung mit Violettstich

sofort: farblos 15 Std: ebenso

sofort: schwache Blau- fi~rbung 15 Std: violettblau, schmutzig

sofort: schwach schmutzig- blau 15 Std: schmutzigviolett- blau

sofort: griinblaue F/~rbung, 15 Std: schmutzigviolett- blau

sofort: Gelbbraunviolett- f&rbung 15 Std: wie vor, etwas verst/~rkt

sofort: gelb, griinstichig 15 Std: Gelbf~rbung

sofort: gelbbraun, violett- stichig 15 Std: etwas verst/irkt

bung fortschreiten und dann unver~ndert bleiben. Stets handelt es sich in dlesen F~llen um IJberg/~nge zu opgimalen Reaktionsbedingungen, die zur Erzielung der

Beobachtungen fiber den Nachweis yon H S-Gruppen. 411

Blaufirbung erforderlich sind. Man dsrf dsher sagen, dal~ mit Anniherung an die optimalen Resgensmengen der Wechsel der Fsrbstufen umso raseher stattfindet, je h6her der Cysteingeha]t der Testl6sung ist. Dsrauf ist bei Durehffihrung der n6ti- gen Reihenversuche (vgl. oben) zu aehten; es bietet }Iilfe bei Auffindung der passenden Reaktionsbedingungen.

Thiog lykolsaure is t naeh FL~MI~G nieht nachweisbar . Die naeh Zu- gabe von Reagens A und B ~uftre~ende t~otf~rbung geht, je nach lV[enge der Reagenzien, en~weder in ein Ge lbb raun oder Viole t t fiber. Eine nach Zusa tz yon Reagens B e twa raseh vorf ibergehende Blaufi~rbung is t often- s ieht l ieh ident iseh mi t der F a r b r e a k t i o n yon 1%. ANDREASCg 11.

Deut l ieher Beweis ffir die Wesensgle iehhei t der ReM~tionen naeh Fr~MI~G und TOYODA ist, dub aueh m i t dem F L ~ I ~ G s e h e r t Reagens d ie bei langem Stehen (20 Std) bei geeigneten Reagensmengen Mare Blauf~rbung zu beobaeh ten i s t (vgl. Tab. 3). Die Aufe inanderfo lge der F/~rbungen bei R a u m t e m p e r a t u r is t jener be im Erh i t zen (FL]~MI~G) i h n - lich. Das urspr i ingl iehe R o t und He l l ro t geht dann deut l ieh ins Fa rb lose fiber, wenn die R e a k t i o n pos i t iv wird. Die einzelnen S tad ien sind oft wenig un te r sehe idbar , such b r aueh t Gelbf~rbung n ieh t aufzut re ten , sondern es b l i u t sieh die farblose LSsung unmi t t e lba r . S t a r t G e l b f i r b u n g wi rd such Braunge lb fg rbung beobaeh te t , die l angsam in Blau fibergeht.

Mit der Nachweisbarkeit yon 50/~g Cysteinhydroehlorid in 1 ml L6sung besitzt die l~e~ktion yon TO'ZODA die gleiehe Empfindlichkeit wie die yon FSE~INO. Der Einflug der t~eagenzienmengen ist ebenso deutlieh. Die Notwendiglceit, beziiglich Reagens C Reihenversuehe zur Ermittlung der gi~nstigsten Bedingungen anzustellen, ist gleichfalls gegeben. Obwohl das Auftreten der kennzeiehnenden Blaufirbung bei der Grenzkonzentration nach wenigstens 7 Std zu beobaehten ist, so ist trotzdem der Ausffihrung naeh TOYODA der Vorzug zu geben, weft wahrscheinlich die Zwi- schenfirbungen (schwaches Violettrot, Rotgelb, Brsugelb, Gelb, Blau) nieht so deut- lieh Ms Folge yon Nebenresktionen besonders des t~eagenses C verzSgert oder unter- drtiekt werden. Dementsprechend ist die nach TOYODA erzielte Blauf~rbung stets klsrer sis die nseh F L ~ I ~ .

l\regstiv verlsufende ToYoDA-Nsehweise bleiben in den meisten Fallen bei der Brsunf~rbung stehen, weniger h~iufig bei Rotgelb oder Gelb und selten wird die Reaktionsl6sung farblos.

Die Thioglykols~ure liefert keine positive t~esktion. Die beobsehtete Firbung war naeh 6 Std Wsrtezeit braunrot, naeh 24 Std klsr braunrot mit Violettstieh, naeh dem Erhitzen sofort gelbbrsunviolettstiehig, nseh 15 Std etwss st&rker.

Zum weiteren Nsehweis der Wesensgleiehheit der l~eaktionen nseh FLEMISrG und nseh ToYoD~ wurden unter Beibehaltung der Resgenzien A und C Resgens B naeh F L E ~ ersetzt dureh die eisen(III)-iquivalente Nenge Eisensmmonium- M~un (I~esgens D). Demn~eh wurden verwendet: geagens A und BT (8,879 g EisenammoniumMaun und 5 ml konzentrierte Sehwefelsiure, mit Wssser auf 100 ml verdiinnt) ffir die F L E ~ s e h e Ausffihrungsform des Naehweises und Res- gens C und DF (3,519 g Eisen(III)-ehloridhexahydrst und 5 ml konzentrierte Sehwefelsiure, mit Wasser auf 100 ml verdfinnt) ffir die To~roDA-Resktion.

Der To~roDx-Naehweis ist deutlieh empfindlieher als der nsch FL~NO. W~hrend 50/~g Cysteinhydroehlorid in 1 ml mit 0,5 ml Reagens A und 0,05 ml t~eagens BT bei Raumtemperatur nseh 5 min Violettrot-, naeh 40 Std starke Violettf~rbung

412 H.F~E~T~r

liefern, bzw. sofor~ nach dem Erhitzen die LSsung violettrot, 40 Std sparer violet~ wird, ergib~ die gleiche Cysteinhydrochloridmenge mit 0,5 ml Reagens C und 0,05 ml Reagens DF nach 10 rain bei Raumtemperatur ]eiehte Braunrot-, nach 40 Std klare- Blauf~rbung, sofort nach dem Erhitzen eine schmutzige Blauf~rbung, nach 40 Std klares Violettblau. Noch 5/~g Cysteinhydrochlorid in 1 ml sind mi~ 1 ml Reagens C und 0,1 ml Reagens DF nach 40 Std Stehen des Reaktionsgemisches (ira Dunkelu) an einer schwachen, allerdings schmutzigblauen Farbung erkennbar. Die Ausfiih- rung nach FLEMING zeigt eine ebenso deutliche Empfindlichkeitsabnahme. Nur- 500/~g Cysteinhych'ochlorid in 1 ml LSsung sind mit 1 mI Reugens A und 0,1 m]r Reagens BT feststellbar an der sofort nach dem Erhitzen auftretenden klaren B]aufarbung (die nach 40 Std unver~nder~ erscheint) und bei Raumtemperatur bereits nach 3 Std beobachtbar ist (Beginn der Blaufarbung nach 5 rain). Die Blind- proben mit Reagenzien C und DF ffihren sofor~ nach dem Erhitzen zu Gelbf~rbung und bleiben bei Raumtemperatur ~'arblos, mit den Reagentien A und BT treten sofort nach dem Erhitzen Viole~trot- und bei Raumtemperatur nach 5 rain Violett- farbung ein, die sich nach 40 Std etwas abschw~cht (Rotstich).

Es ist mSglich, Cysteinhydrochlorid unter gewissen Bedingungen neben Thio- glykols~ure nachzuweisen. Ubersteigt die Thioglykols~uremenge nicht 2500 #g je ml,. so sind in dieser Flfissigkeitsmenge noch 50 #g Cysteinhydrochlorid nachweisbar, wenn 2,5 ml l~eagens A und 0,25 ml Reagens BT zugeffigt werden. Die Bl~uf~rbung tritt nach etwa 20 Std Stehen bei Raumtemperatur auf, wobei in den ersten 5 min Grfingelbf~rbung festzustellen ist. Erhitzen ffihrt lediglich zu starker Rotviolett- f~rbung. Weniger empfindlich ist die Reaktion bei Anwesenheit yon 2500 #g Thio- glykolsaure neben 250/~g Cysteinhydrochlorid in 1 ml, wenn 0,5 ml Reagenz C uncU 0,05 ml Reagens DF zugesetzt werden. Beim Erhitzen bleibt dus Reaktionsgemisch farblos, beim 3stiindigen Stehen bei Raumtemperatur tritt eine schwache, aber deutliche Blaufarbung auf. Befinden sich neben 83 ,ug Cysteinhydrochlorid 417/tg Thioglykols~ure in 1 ml LSsung, so ist jenes nach Zugabe yon 2,5 ml Reagenz C und 0,25 ml Reagens DF bei Raumtemperatur binnen 5 rain an schwacher Blauf~rbung, sofort nach Erhitzen an gelbgr~ner, 20 Std sparer an sehr schwach blauer Farbung erkennbar.

Die nach ~LEIWLNG-TOYODA ~es~ges~e]lte Empfindlichkei~ des Cysteinhydro- ehloridnachweises yon 50 rig/m] ist neben 5000/~g Thioglykols~ure/ml zu erreichen, wenn die Konzentrationen der Reagenzien C und D verdoppelt werden (C' uncl D'). Je ml TestlSsung ffigt man dann 2,5 ml Reagens C' und 0,25 ml Reagens D' zu und erhal~ nur bei Raumtemperatur nach 8 Std Wartezeit eine klare, gerade noch feststellbare Blauf~trbung des nach 5 rain farblosen Reaktionsgemisches.

VII. Bei Ausfiihrung des Nachweises nach N ~ u ~ A und BI~L~u el sind noch 62,8/~g Cysteinhydrochlorid/ml LSsung (1 : 15900), yon Cystin 1200/~g/ml (1:833) festzustellen. In Best~tigung der Beobachtung der Autoren liefert Thioglykols~ure keine Reaktion. Die charakteristische Blauf~rbung der Reaktionsl5sung ver~ndert sich nach einiger Zeit. Es erscheint ein braungelber, ziemlich heller Ton oder eine gelbrote F~rbung. Manche Proben behal~en die Blauf~rbung l~nger bei. Bei der Grenzkonzentration schlagt die F~rbung naeh 12--24 Std nach R5tlich urn. Die Blindprobe weist dunkelrote F~rbung auf, wie sie ffir den Chlorldnachweis yon F. BINKLEu ~ kennzeichnend ist.

VI I I . Gebleiohte Haare, die in einer Menge yon etwa 500 mg dem EinfluB yon jeweils 100 ml n Na~ronlauge 20 bzw. 60 min lang bei R a u m - t empera tu r ausgesetzt worden waren, wurden nach dem Ansspii len mi t Wasser 15 min lang in je 100 ml n Essigs~ure neutral is ier t , gut m i t Wasser abgespfilt und un te r dem FShn getrockne~. Diese so behande l t en

Beobachtungen fiber den Naehweis yon HS-Gruppen. 413

sogenannten Ansatz- und Spitzenhaare 14 sind gegen Lauge besonders empfindlich (vgl. II und V). Der durch Hydrolyse gebildete Cysteinrest miil~te die F~]~MI~G-Tou liefern. Etwa 50 mg der nach obigem 20 min mit Lauge behandelten Ansatzhaare wurden mit 2 ml Reagens C und 0,2 ml l~eagens D versetzt und zur v5lligen Benetzung geschiittelt. Schon nach 3 rain trat leichte B]~uung der LSsung auf, die sich binnen 30 rain zu klarer Blaufiirbung entwickelte. Die 60 rain lang in Natron]auge befindlich gewesenen Haare zeigten unter gleichen Be- dingungen in der gleichen Zeit keine Blaufiirbung. Dies ]~l~t eventuell darauf schliel~en, dab l~ngere Laugeneinwirkung weitere Umsetzung des Cysteinrestes im ttaar bewirkt. Ebenso verhielten sich Spitzenhaare.

Es erscheint also mSglich, mit dieser I~eaktion Spaltprodukte des Haares mit HS-Gruppen in LSsung nachzuweisen. Histochemisch ist die Reaktion unbrauchbar. Die Reaktion yon NAKA~V~A und BI~KL]~u war in ihrer Anwendung auf Haare erfo]glos.

Zusammenfassang.

Der Nachweis yon Cystein bzw. Cystin und yon Thioglykols~iure wurde mit einigen bekannten l~eaktionen (C~vaEMO~T und F~D~RIC, ~L]~MII~G, TOYODA, NAKAMUI~A und BI~]~LEY), aber auch mit dem Reagens von COHN auf Wasserstoffperoxyd und mit 2,3,5-Triphenyl- tetrazoliumchlorid untersucht und auf menschliches Haar angewandt. Beim Ttipfelnachweis nach C t I ~ V ~ o ~ und F~D~I~IC wird die Emp- findlichkeit nahezu verdoppelt, wenn die PrfiflSsung auf den Reagens- tiipfel aufgebracht wird. ~3mliches grit vom Nachweis mit dem CoH~- schen Reagens, bei dem eine Verdr~ngung des anzeigenden Reaktions- produktes durch Auftiipfe]n yon Wasser die Sichtbarkeit des Reaktions- ausfalls verbessert. Der Nachweis mit Tetrazoliumchlorid ist unempfind- lich und mehrdeutig. Aus diesem Reagens selbst entstehen beim Altern und durch UV-Bestrahlung reduzierende Substanzen, die Formazan- bildung bewirken. Auch starkes A]kali wirkt so. Die Nachweise yon FLEMING und Tou sind praktisch identiseh und abh~ngig vom Ver- haltnis der Menge des Cysteinhydrochlorids zur Menge des l~eagenses. Daher erfordert jede Ausfiihrung Reihenversuche mit abgestuften Reagensmengen. Die Ausfiihrungsform der l~eaktion yon To~oD~ ist vorzuziehen, obwohl sie zeitraubend ist. Durch geeignete Kombination der Reagenzien beider Ausfiihrungsweisen lal~t sich die Empfindlichkeit des Cysteinnachweises steigern. Thioglykolsaure ]iefert keine l~eaktion. Neben ihr ist daher unter bestimmten Bedingungen Cysteinhydrochlorid nachweisbar. Der Nachweis yon I~AKAMURA LIPid BINKLEY scheint unempfind]icher zu sein.

Der C~]~VaE~ONT-F~D~ICsehe Nachweis bei Haaren deutet auf die Anwesenheit yon ttS-Gruppen in der Cuticula hill, bei mit Wasserstoff-

414 H. FREYTAO: Beobaehtungen fiber den Nachweis yon HS-Gruppen.

p e r o x y d b e h a n d e l t e m H a a r k S n n t e n o c h die E x i s t e n z a n d e r e r r e d u z i e -

r e n d e r G r u p p e n i n B e t r a e h t k o m m e n . A n w e s e n h e i t h y d r o l y s i e r b a r e r

D i s u l f i d b r i i e k e n is~ m i t T e t r ~ z o l i u m c h l o r i d l e i e h t f e s t z u s t e l l e n . Ge-

b l e i c h t e s u n d u n g e b l e i c h t e s he l l es H a a r l~{~t s i ch b i s zu e i n e m gewi s sen

G r a d e m i t d e r F o r m a z a n r e a k t i o n u n t e r s c h e i d e n . G e b l e i c h t e s H a a r g i b t

n a e h k f i r z e r e r L a u g e n b e h a n d l u n g ( C y s t e i n a b s p a l t u n g ) p o s i t i v e F ~ i ~ c -

T o Y o D ~ - R e a k t i o n . N a e h ] ~ n g e r e r L a u g e n e i n w i r k u n g t r i t t k e i n e B l a u -

f ~ r b u n g d e r R e a g e n s l S s u n g auf . H i s t o c h e m i s c h i s t d ie FLEMING-TOYODA-

g e a k t i o n e b e n s o w e n i g a n w e n d b a r wie d ie y o n I~AKAM~lCA u n d B ~ K ~ Y .

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Dr. H. F~EYTAC, Fulda, LSherstr. 13.