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Dipl. Ing. Anne Bärenwaldt
AG Nimmerjahn
Die Rolle von FcgRIIB in der B-Zell-Entwicklung
Fc Rezeptoren (FcR)
Rezeptoren für Immunglobuline Expression auf Immunzellen Binden konstante Domäne der schweren Kette von Antikörpern
Verbindung zwischen adaptiven Immunsystem und Effektorfunktionen des angeborenen Immunsystems
FcR Arten
Für jeden AK Typ gibt es Fc Rezeptoren
Fc Rezeptor für • IgA Fc R• IgG Fc R• IgE Fc R• IgM Fc R• IgD Fc R
Maus 4 Gene für
• FcgRI• FcgRII• FcgRIII• FcgRIV
Mensch 8 Gene für• FcgRI (A, B, C)• FcgRII (A, B, C)• FcgRIII (A, B)
Fc g Rezeptoren
Größte und am häufigsten vorkommende Gruppe von FcR verschiedene Spezifität, Affinität, Struktur, Expression und biochem. Funktion
ITIM
FcRIIBFcRI
2 2
FcRIII
Mouse
Human
2
hFcRIIIAFcRI
2ITIM
FcRIIB
FcRIIA
high affinity low/medium affinity
FcRIV
2 ITAM
ITAM
FcgR
Aktivierende FcgR• FcgRI, FcgRIIA, FcgRIII
Inhibierende FcgR• FcgRIIB
werden gemeinsam auf Effektorzellen exprimiert• Makrophagen, Neutrophile, NK, dendritische Zellen (DC), Mastzellen
Bindung von Immunkomplexen (IC) aktiviert aktivierenden und inhibitorischen Signalweg
Schwellenwert für Aktivierung der Zelle wird gesetzt die Stärke der Immunantwort bestimmt
Vielzahl an downstream Antworten wird dadurch reguliert• Degranulation, Phagozytose, Antigen-Präsentation, antibody-
dependend cellular cytotoxity (ADCC)
Signalleitung
Aktivierende FcgR benötigen für Signalleitung assozierte Adaptermoleküle
Adaptormolekül ist vom Zelltyp abhängig Am häufigsten ‚common chain‘ Adaptor hat immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)
Inhibitorischer Rezeptor besitzt immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)
Braucht kein Adaptormolekül
FcRI
2ITAM
ITIM
FcRIIB
Signalleitung aktivierender FcgR
Src-family Kinase phosphoryliert ITAM
SH2 Bindedomäne entsteht Syk bindet Signalkaskade wird eingeleitet Ras/Raf/MAP Kinase pathway
wird aktiviert Kalzium abhängige Signalwege
aktiviert
downstream signaling pathways (ERK, p38, JNK)
cell activation-ADCC-Phagocytosis-Cytokine release-Oxidative burst
Signalleitung inhibitorischer + aktivierender FcgR
Co-Ligation beider FcgR führt zu Phosphorylierung des ITIM vom FcgRIIB
SHIP bindet an entstandene SH-2 Dömäne
Blockiert Ras Weg und Kalziumsignalkette (Btk und PLC-γ)
Inhibitorischer FcgRIIB (CD32)
Größe: 40 kDa Aufbau:
• 2 extrazelluläre Domänen
• 1 Transmembranregion
• 1 cytoplasmatischer Schwanz
geringe Affinität für monomeres IgG hohe Avidität für Immunkomplexe Signalleitung mittels ITIM (immunoreceptor tyrosine-based
inhibitory motif) 2 Isoformen
• IIB-1 Signalwirkung
• IIB-2 Signalwirkung + Internalisiert/phagozytotisch
Einziger FcR auf B-Zellen
ITIM
FcRIIB
FcgRIIB Signalleitung in B-Zellen
Co-Ligation mit:
• Sich selbst führt zu Apoptose
• BCR Verminderung des BCR Aktivierungssignal
anti-apoptotisches Signal
Co-Ligation mit BCR führt zur Aktivierung der Kinase Lyn
Lyn phosphoryliert ITIM des FcgRIIB
Initiation des Signalwegs (SHIP) Blockiert Ras Weg und Kalzium-
signalkette (Btk und PLC-)
FcgRIIB als Toleranzkontrollpunkt
FcgRIIB setzt Schwellenwert für Aktivierung von B-Zellen Induzierte Apoptose durch Selbst-Ligation
mögliche Beteiligung an Erhalt der Toleranz
mögliche Deletion selbst-reaktiven B-Zellen
FcgRIIB wichtig für B-Zell Toleranz
Untersuchung von Toleranz: Autoimmunanfällige Mausstämme (NZB, BXSB, NOD, MRL/lpr)entwickeln spontan Autoimmunität (z.B. SLE)
FcgRIIB und Toleranz
Bolland und Ravetch 2000 Fcgr2b -/- Mäuse
(Balb/C und C57.B6)
Balb/C• Wie WT
B6• Erhöhte Sterberate
• Entzündungen in Vielzahl von Organen
• Erhöhter Proteingehalt im Urin
• Glomerulonephritis
• Nierenversagen
genetischer Hintergrund ist sehr wichtig
Test auf anti-nucleäre AK
Immunfluoreszenzfärbung von Hep-2 Zellen
Inkubation mit Serum der Mäuse Detektion von gebundenem IgG
mit FITC-anti-mouse IgG
ELISA IgG AK gegen:• dsDNA
• dsDNA mit Histon 1
• dsDNA mit Histon 2A und 2B
Toleranzverlust in FcgRIIB-/-
Bolland und Ravetch 2000
Wiederherstellung der Toleranz durch FcgRIIB
McGaha et al. 2007 Retroviraler Vektor für Expression von FcgRIIB
Fcgr2bKontrollvektor
Gewinnung von KM-Zellen aus autoimmunanfälligen und FcgRIIb-/- Mäusen
Transduktion mit retroviralem Vektor
Rekonstitution bestrahlter Mäusemit autologem tranduziertem KM
FcgRIIB Mock
Untersuchung der Mäuse
McGaha et al.
Mock
Fcgr2b
Indirekter ImmunofluoreszenzassayANA Reaktivität gegen fixierte HepG2 Zellen
Überlebensrate NZM2410
ELISA
Verbessertes Überleben Weniger Auto-AK
Schlussfolgerung
FcgRIIB ist wichtig für den Erhalt der Toleranz
Bei Fehlen des Rezeptors entsteht • IgG anti-DNA AK
Verlust von Toleranz
Herstellung der Toleranz durch Wiederherstellung des FcgRIIB Levels
Ist wichtiger Kontrollpunkt in peripherer Toleranz
Einfluss von FcgRIIB in B-Zell-Entwicklung
Wo genau reguliert er?
Keimzentrum (germinal center)
Induzierbare lymphoide Mikroumgebung Entstehen durch Antwort auf T-abhängige Antigene Entstehen durch Einwanderung aktivierter B-Zellen in die
Lymphorgane AG wird im GC als Immunkomplex (IC) von folliculären
dendritischen Zellen (FDC) präsentiert Hohe Mutationsfrequenz in variabler Region
des BCR in GC-B-Zellen
Selektion von hoch affinen B Zell Varianten Formation von Memory B Zellen
Keimzentrum
Durch Mutation auch BCR mit verminderte Affinität
muss Mechanismen geben, die zwischen hoch und niedrig affinen B-Zellen unterscheiden
Annahme: B Zellen mit hoch-affinem BCR werden bevorzugt stimuliert Aufnahme von AG und Präsentation für Th Lymphozyten
Dieses Modell bezieht sich nur auf den BCR Ignoriert den Schwellenwert von FcgRIIB bei der B-Zell Selektion
durch IC Interaktion
FcgRIIB kann durch Apoptosesignal niedrig affine B-Zellen eliminieren
Rao et al. 2002/Jiang et al. 1999
Untersuchung der Expression von FcgRIIB in Keimzentrumszellen
Reduzierte FcgRIIB Expression in GC-B-Zellen
FcgRIIB in GC, auch in FDC reichen Regionen
reduzierter Schwellenwert für B-Zell Aktivierung
2.4G2 FcgRIIBGL7 GC
Rao et al. 2002
Histologie Milz
Facs
• Bestrahlte IIB -/- Mäuse• Rekonstitution mit KM von IIB+/+ Mäusen Färbung des IIB Rezeptors im GC nur bei B-Zellen
2.4G2 FcgRIIB K9.361 FcgRIIB
B220+IgD+GL7- Nicht GC Zellen B220+IgD-GL7+ GC B-Zellen
Immunisiert mit NP-CGGHistologie 9 Tage nach Immun.
Milzzellen
Chimäre Mäuse
Verminderte FcgRIIB Expression in GCB-Zellen von autoimmunanfälligen Mäusen
Jiang et al. 1999
Milzzellen von 8-Mo. alten immunisierten Tieren
Autoimmunanfällig (SLE)• NZB• (NZB x NZW)F1
Nicht-anfällig• NZW
geringere Expression von FcgRIIB auf GC-B-Zellen in allen Mäusen
In autoimmunanfälligen Mäusen ist FcgRIIB Expression auf GC B-Zellen geringer als bei nicht anfälligen Mäusen
Zusammenfassung Rao et al./Jiang
Expression von FcgRIIB ist in GC B Zellen herunterreguliert
FcgRIIB Expression in Autoimmunanfällige Mausstämme noch geringer
Wirkmechanismus von FcgRIIB?
Aufgabe von FcgRIIB im GC/ bei der Affinitätsreifung?
Welchen Effekt hat die verringerte FcgRIIB Expression im GC?
Rolle von FcgRIIB in Toleranzerhaltung?
Modellsystem 3H9 Maus
Transgenes knock-in Modell für Anti-DNA exprimierende B-Zellen Rearrangiertes schweres Kettengen (anti-DNA) wird benutzt
• Aus DNA bindendem Hybridoma aus MRL.lpr Maus
• Insertion im Igh Locus (IgMa Allel)
Editierung der leichten Kette ist wichtig für den Erhalt von Toleranz Durch Kombination mit verschiedenen Leichten Ketten entstehen
autoreaktive AK
Weiterentwicklung des 3H9 Modells durch Einfügung weiterer Argininreste DNA Bindung von AK meist über Arg-Reste• 3H9/56R ein Arg Rest
• 3H9/56R/76R zwei Arg Reste
Modellsystem 3H9 Maus
Mit steigender Arg Anzahl steigt Autoreaktivität der produzierten AK(je basischer höhere Autoreaktivität)
Fukuyama et al. 2004
Verwendung von 3H9 und 3H9 56R Mäusen mit und ohne Fcgr2b Expression• Balb/C und C57.B6
Untersuchung der Toleranzerhaltung
Spezifität des genetischen Hintergrundes
Balb/C Hintergrund:• Sowohl bei niedrig-affinem 3H9 Allel als auch beim hoch-affinen 56R
Allel wurde Toleranz in Balb/C Mäusen erhalten C57.B6 Hintergrund:
• Höhere IgM und IgG Produktion bei 56R
Fukuyama et al.
C57.B6: 12 Wochen alt
IgM IgGAnti-DNAELISA
Serum
Mechanismus zum Erhalt der Toleranz
Fukuyama et al.
Untersuchung zur Auswahl der leichten Kette in den Mausstämmen• Vκ21D Leichte Kette, die am effektivsten die Autoimmunität der
schweren Kette unterdrückt
• Vκ38c weniger effizient
Veränderte Benutzung von leichten Ketten in den MausstämmenUnabhängig von FcgRIIB
FcgRIIB Defizienz steigert IgG anti-DNA Produktion
Fcgr2b Defizienz erhöht Anzahl von IgG anti-DNA
durch erhöhtes Auftreten von IgG produzierenden Plasmazellen/Plasmablasten
Fukuyama et al.
IgG IgM
Serum
Splenocyten
Anti-DNA
ELISA
IgG anti-DNA ist pathologisch
C57.B6 Fcgr2b-/- entwickeln nach 6 Mo. starke Glomerulonephritis
Nur 56R Fcgr2b-/- zeigte gleiche Pathologie wie pos. Kontrolle (Fcgr2b -/-)
• Glomerulonephritis• Immun-Komplex Ablagerung• Komplement C3 Ablagerung
Histologie der Niere
Fukuyama et al.
Nach 9 Mo.
Zusammenfassung Fukuyama et al.
„Editing“ ist der primäre zentrale Mechanismus um autoreaktive B-Zellen in unschädliche B-Zellen umzuwandeln• Nutzung verschiedener leichter Ketten in unterschiedlichen
Mausstämmen
FcgRIIB Defizienz führt zu Produktion von IgG produzierenden Plasmablasten negatives Feedback-Signal ist gestört
Proliferation autoreaktiver Plasmazellen
Paul et al. 2007
Rolle von FcgRIIB in der peripheren B-Zell Toleranz Prinzip:
follicular exclusion• Ansammlung von autoreaktiven B-Zellen an der T-B Grenze von
Milzfollikeln
Hypothese:
folliculare exclusion ist abhängig von normalem FcgRIIB signalling
Versuchsprinzip:
3H9 Mäuse defizient in FcgRIIB
wenn FcgRIIB an peripherer Toleranz und follicular exclusion beteiligt ist, sollte in 3H9FcgRIIB-/- Tieren ein Verlust der folliculärer Exclusion auftreten
Erhöhte Anzahl autoreaktiver B-Zellen in FcgRIIb -/-
Bei Paarung von 3H9 mit λ1 leichter Kette entsteht autoreaktiver AK
λ1 B-Zellen exprimieren transgenen IgMa Allotypen
FcgRIIb-/- Mäuse haben erhöhte Frequenz von λ1 B-Zellen
autoreaktive AK für weitere Nachweise
Paul et al.
Milz
Verlust der follicular exclusion bei FcgRIIb Defizienz
Histologische Untersuchung der Milz
• 3H9FcgRIIB+/+B6 Mäuse: λ1 B Zellen an T-B Grenze von Milzfollikeln• 3H9FcgRIIB-/-B6 Mäuse: λ1 B Zellen in gesamten Follikel verteilt
λ1 B ZellenB-Zell ZoneT-Zell Zone
• Stärkere Keimzentrumsaktivität in FcgRIIB-/- Mäusen• λ1 B-Zellen im Keimzentrum
Paul et al.
100-fach 600-fach
Erhöhte Anzahl von Plasmazellen in 3H9RIIB-/- Tieren
Kein Unterschied bei IgM anti-DNA produzierenden B-Zellen
8x höhere Anzahl an IgG anti-DNA produzierenden B-Zellen in 3H9RIIB-/- Tieren
Klassenwechsel der autoreaktiven B-Zellen hat stattgefunden
B220: B-Zell MarkerCD138: Marker für Plasmazellen
Paul et al.
ELISPOT
FACS Milz
Anti-DNA
Erhöhte Anzahl von anti-DNA-AK im Serum
3H9FcgRIIB-/- Mäuse:• Höhere Anzahl an IgG und IgM
anti-DNA AK
Paul et al.
Alle Beobachtungen waren Altersabhängig:• Junge 3H9FcgRIIB-/- Mäusen
(2 Monate alt) zeigten WT verhalten
• Alte 3H9FcgRIIB-/- Mäusen (9 Monate) zeigte IgG Anti-DNA
Serum Anti-DNA
Zusammenfassung Ergebnisse (Paul et al.)
FcgRIIB ist notwendig um Zellen aus Keimzentrum auszuschließen
Klassenwechsel zu IgG wird dadurch verhindert
Keine Plasmazellentwicklung von autoreaktiven B-Zellen
Zusammenfassung: Bedeutung von FcgRIIB
FcgRIIB hat wichtige Funktion in der peripheren Toleranz
Ist innerhalb und außerhalb des Keimzentrums unterschiedlich exprimiert (Rao et al.)
In autoimmunanfälligen Mäusen im Keimzentrum noch schwächer exprimiert (Jiang et al.)
Reguliert Anzahl IgG produzierender Plasmazellen/-blasten
Verhindert das Einwandern autoreaktiver B-Zellen in die Milzfollikel (Paul et al.)
Unser Projekt
Untersuchung der Funktion von humanem FcgRIIB bei der Toleranzerhaltung
FcgRIIB und Toleranz beim Menschen
systemischer Lupus Erythematodes (SLE)• hohe Anzahl von autoreaktiven IgG Antikörpern
Allele Varianten von FcgRIIB • Ile232Thr
Assoziation in verschiedenen Asiatischen Bevölkerungen keine Assoziation in Europäern
Promoter Polymorphismus• in Europäern
Verminderte Expression in memory B-Zellen • in SLE Patienten in der Afrikanisch-Amerikanischen Bevölkerung
Hohe Heterogenität im Menschen
Genetischer Hintergrund ist sehr wichtig
Mensch vs. Maus• FcgR von Maus und Mensch unterschiedlich
• Bisher nur epidemiologische Assoziationen beim Menschen
Testsystem notwendig, dass menschliches Immunsystem darstellt
humanisierte Maus
Sind Ergebnisse aus Mausstudien auch für das menschliche Immunsystem gültig?
Versuchsaufbau
Bestrahlung
Neugeborenen Rag2-/- NOD/SCID
Rekonstitution mit hHSC
Mäuse entwickeln menschliches Immunsystem
Vorbereitung der hHSC:
Isolation
hHSCTransduktion mit lentivirus kodierter miRNA
Vorbereitung der Mäuse:
Promoter miRNA
GFP Reporter
Gen
n
Untersuchung des Immunstatus
Gesundheitszustand• Überleben
• Vitalität
Veränderte B-Zell Antwort• Schwellenwert
• Antikörper-Affinität
• Veränderter Klassenwechsel
• anti-DNA AK
• antinucleäre AK
• anti-Chromatin AK
Untersuchung des Auftretens von SLE
• Entwicklung von Glomerulonephritis
• Nierenfunktion
• Proteingehalt im Urin
• histologische Untersuchung der Leber
Derzeitige Arbeit
Klonierung von Fc g Rezeptoren (inhibitorisch and aktivierend), CD22 und CD72
Stabile Transfektion von CHO Zellen mir diesen Plasmiden Zelllinien exprimieren diese Rezeptoren
Klonierung von miRNA/shRNA Stabile Transfektion von CHO Zelllinien und primären B-Zellen
FcgRIIB, CD22, CD72 Aktivierende FcgR
Effektivitätstest der miRNA/shRNA(positive Kontrolle)
miRNA/shRNA sollten keinen Einfluss auf diese haben (negative Kontrolle)
Vielen Dank für die Aufmerksamkeit
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