Ein Verfahren zur Bestimmung der Hyaluronsäure

458 Berioht: Spezielle analytische Methoden.

yon HS-Glutathion zum Krautsaft wurde eine Eiehkurve mit anderem Verlauf erhalten, als bei Zusatz zu der Pufferl6sung ohne S~ft. Wegen des unterschiedliehen Einflusses versehiedener pflanzlieher S~fte auf die Eichkurve (Viscosit/~t, ober- fl/~ehenaktive Stoffe, Proteine) wird sie mit Hilfe der PufferlSsung ohne 'Salt ermittelt. Stets sind S/~fte und Pufferl6sung in gleichen Teilen vermiseht zu polaro- graphieren.

In einer weiteren Arbeit behandeln L. JmOVSE~:, M. P~.Tg~6KOVA und S. Vom~ov~ 1 die polarographisehe Bestimmung yon Mereaptoverbindungen in tierischem Material, Sein Zustand daft nieht ge~ndert werden. In der JLeber existiert ein die HS-Gruppen vor der Oxydation schiitzendes System; im Fleisch besteht ein solches in geringerem AusmaBe. Gegentiber pflanzliehem Material li~Bt sieh bei tierisehem der EirdtuB des Luftsauerstoffs daher schwer aussehalten. Die Proben sind binnen 24 Std naeh Entnahme und Aufbewahrung im Eissehrank zu ver~rbeiten. Milch wird direkt in das ]:~ALOUSEK-Gef/~B pipettiert. Koagulieren und Zentri- fugieren sind nicht erforderlieh. 1%oh gr/indlicher Durehmisehung der Probe mittels Stiekstoff und Zusatz yon Aeetatpuffer (PH 4,7) wird polarographiert. Fleisch und Leber werden mit einem Messer aus rostfreiem Stahl gesehabt, man wagt rasch etwa 10 g ab und fiigt Puffer zu. ])as Fleisch wird in der Porzellansehale noeh ver- rieben und in einem Gazebeutel ausgedrtickt. Von diesem Salt werden 5 ml in im K~LousEK-Gef~B befindliehe 5 ml Pufferl6sung pipettier~. ~hnlieh wird mit Eiklar und Dotter verfahren. Bei diesem ist eine quantitative Trermung veto Eiklar un- 4urchf/ihrbar. Die Auswertung der Messungen erfolgt mit Hilfe einer Eichkurve, die durch Polarographieren yon Glutathion in Pufferl6sung erhalten ist. Die Ab- weichungen yon der Eichkurve sind im Fa]te tierisehen Materials gr6Ber als bei pflanzlichem. Die HS-Kurven bei Leber sind besonders deutlieh ausgepr~gt und h/iufig zeigen sie 2 Stufen, die beim Aufbewahren der Probe nieht versehwinden. Dutch Adsorptionsstrom verursachte Vorstufen sind nieht beobachtb~r. ]3as biolo- gische Material enth~lt grebe Mengen oberfl/~chenaktiver Stoffe, die sich an der ovalen 1%rm des oberen Tefls der anodischen Kurve erkennen lassen. Mit Eiklar verunreinigter ]:)otter ffihrt h/~ufig zu StSrungen der Tropfenform der Capillare. Es ist dann bei gut ausgebfldeten Kurven eine niedrige Stufe festzustellen, die um etwa 50 mV positiver ist als die gewShnliehe Stufe der HS-Verbindung. H. FREYTAG.

Ein Verfahren zur Bestimmung der Hyaluronsiiure (I) in Organen wird yon H. LA~GECX~ 2 angegeben. Es beruht auf der Beobacbtung, dab I mit verdiinntem Serum (Albumin) bei p~ 4,2, dem isoelektrisehen Punkt des Proteins, einen Nieder- seblag gibt, der konzentrationsabh~ngig ist 3. Fiir die Bestimmung in Geweben und K6rperfliissigkeiten muf~ I aus ihrem Verband mit den Proteinen gel5st und die k6rpereigene Hyaluronidase mSglichst rasch inaktiviert werden. Dazu wird alas zerkleinerte Material bei p~ 6 ausgekoeht. Die dabei gewonnenen noeh eiweif~reiehen Extrakte werden dureh eine Pepsinverdauung gekl~rt, wonaeh die Triibungsreak- tion angestellt wird. In einem Parallelversueh wird I mit Hyaluronidase abgebaut und die Differenz beider Triibungswerte als Hyalurons~ure bewertet. --- Arbeitsweise. ]:)as unmittelbar nach dem Ted des Tieres entnommene Organ wird m6gliebst raseh dutch den Fleisehwolf getrieben, mit eisgekfihltem 0,1 n Natriumacetatpuffer yon Pit 6 versetzt (15--50 ml auf 10 g Organ), 10 min in ein koehendes Wasserbad ge- braeht, wieder eisgekiihlt und durch Mull abgeprel]t. Der Preftsaft wird raseh aufgekoeht und veto ausgesehiedenen EiweiB abzentrifugiert oder filtriert. ]:)ann

1 Chem. Listy 47, 1463--1466 (1953) [Tseheehiseh]. Klin, Wschr. 1952, 222--223. Sehering A.G., West-Berlin.

a MEYER, K., and J. W. PALME~: J. biol. Chemistry 114, 689 (1936); SEASTO~E, C. V. : J. exper. Medicine 70, 347 (1939).

4. Auf Physiologie und Pathologic beztigliehe Mehoden. 459

wird das Filtrat mit der gleiehen Menge einer 5% igen Pepsinl5sung in O, 1 n Natrium- acetatpuifer yon pE 4 versetzt und 3 Std bei 37 ~ C inkubiert, danaeh wieder zentri- fugiert oder filtriert. I n dem nunmehr ldaren Filtrat wird der Trfibungstest ausge- ftihrt, indem man 1 : 1 ml enteiweiBten Extrakt mit 1 ml 0,02 n Natriumacetatpuffer (pE 6) nach Ktihlung im Eisbad mit 8 ml Serumpuffergemisch (Pferdeserum, frei yon Desinfieientien, wird 1 : 10 mit 0,5 n Natriumaeetatpuffer yon pH 4,2 verdiinnt) 30 mill im Eisbad stehen lgBt; 2: ebenso verfghrt, nur start I ml 0,02 n Natrinm- acetatpuffer 1 ml Hyaluronidase (15 E Kinetin Sehering) 30 rain bei 37 ~ C inkubiert, darm ins Eisbad stellt; 3: einen Leerwert mit I ml 0,1 n Natrinmaeetatpuffer (pg6), 1 ml 0,02 n Natrinmacetatpuffer (pE 6) (eisgektihlt) und 8 ml Serumpuffergemiseh (30 min im Eisbad) ermittelt. Die Trtibungsmessung erfolgte im HAVE~AN~sehen lichtelektrisehen Colorimeter mit Filter BG 12 ohne Mattscheiben in einer 10 mm- Kfivette. Die Trfibungen werden auf einer Eiehkurve abgelesen, die t~glieh aus der Tr/ibungsreaktion yon 6 versehiedenen Verdiinnungen (0,50/00, 0,30/00, 0,20/00, 0,10/00 0,05~ gereinigter Hyalurons~ure ermittelt wird. Ansatz: I ml Hyalurons~ure; 1 ml 0,02 n Natrinmacetatpuffer yon p~ 6; 8 ml Serumpuffergemisch. - - Naeh diesem Verfahren wurde zu Muskulatur zugesetzte Hyaluronsgure zu 80~o wieder- gefunden.

E. HEI]~ und R. VIERLI~G ~ beobaehteten bei Anwendung. des vorstehenden Verfahrens naeh Zusatz yon Kinetin (Hyaluronidase) nicht die erwartete Trtibungs- minderung, sondern im Gegenteil eine erhShte Triibung, die auf unvollstgndigen EiweiBabbau mit Pepsin zurtickgeffihrt wird. Die Sehwierigkeiten verschwinden bei Anwendung yon Combizym (Luitpoldwerk, Mfinehen), start Pepsin, wenn gleieh- zeitig die pH-Werte der PufferlSsungen wie folgt ge~ndert werden: 0,5 n Natrium- aeetatpuffer pg 3,8 (start 4,2), 0,1 n Natrinmaeetatpuffer pE 8,5 (start 4). Combizym wird 5~oig in 0,1 n Natriumacetatpuffer pE 8,5 gelSst. Naeh der Combizymbehand- lung zentrifugiert man und filtriert ansehlieBend zur vollst~ndigen K!arung dureh einen sehr feinporigen Filtertiegel (A 1). Im fibrigen bleibt das Verfahren yon LA~GECKER unver~ndert. H. SPERLICH.

Die quantitative Bestlmmung yon Hexaehlorcyclohexan in tierischem Material nehmen K, v ~ A s r ~ und F. J. OPPE~OO~TH ~ nach der Methode yon M. S. •CHECttTER und I. HORNSTEIN 3 (in der Apparatur yon J. F. REIT~ a) vor, die auf der Reduktion des Hexachloreyclohexan zu Benzol, dessen Nitrierung und colori- metriseher Bestimmung des gebildeten m-Dinitrobenzols mit der Farbreaktion naeh JANOVSKY beruht. Von Gehirn, Leber und Nieren yon Mausen sowie yon Haus- ftiegen werden etwa 1 g in zerkleinertem Zustand in den Reduktionskolben E (s. Abb. im Orig.) gebracht. Dann fiigt man 5 ml Eisessig, 0,5 g Zinkstaub und 1 g Malonsaure zu. Das Nitriergefal3 wird mit Glasperlen und mit 5 ml Nitriersaure (gleiche Teile rauchende Salpetersaure und konz. Sehwefelsaure) geffillt. Die Schliffstopfen werden mit 85%iger Phosphorsaure abgedichtet. Der Kiihler wird mit Wasser yon etwa 85 bis 95 ~ C gefiillt. Der Inhal t des Kolbens E wird vorsichtig zum Sieden gebracht. Die Essigsauredampfe werden im Kfihler niedergesehlagen, wahrend die KoMensaure mit den geringen Mengen a n Benzoldampfen dutch das Ni~riergefaB gefiihrt wird. Naeh 45 m i n wird der Inhalt des NitriergefaBes in einen Scheidetriehter iiber- gefiihrt. Dann wird, wie bei SCHEC~TER und HO~NSTEIN besehrieben, weiter- behandelt. - - Bei der Bestimmung in grSDeren Mengen Material wird die zu unter-

1 Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 294, 56--61 (1953). Univ. Miinchen. Chem. Weekbl. 59, 353--356 (1954) [Hollandisch]. Lab. Biocidenonderzoek

T:N.O., Utrecht (Holland). a Analyt. Chemistry ~4, 544 (1952); vgl. diese Z. 139, 307 (1953). a Chem. Weekbl. 49, 689 (1953); vgl. diese Z. 1~3, 70 (1954).