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EtablierungeinesMYCN‐vermittelten
murinenNeuroblastommodellsundAnalyse
tumorsuppressivermikroRNAs
Inaugural‐Dissertation
zurErlangungdesDoktorgrades
Dr.rer.nat.
derFakultätfürBiologie
ander
UniversitätDuisburg‐Essen
vorgelegtvon
KristinaAlthoff
ausHerne
August2013
Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden im
hämatologisch‐onkologischenLaborderKinderklinikIIIamUniversitätsklinikumEssen
durchgeführt.
1.Gutachter: Prof.Dr.JohannesSchulte
2.Gutachter: Prof.Dr.BertramOpalka
VorsitzenderdesPrüfungsausschusses: Prof.Dr.PeterBayer
TagdermündlichenPrüfung: 12.Dezember2013
Inha1 EI
1.1
1.2
1.3
1.3
1.3
1.4
1.4
1.4
2 ZI
3 M
3.1
3.
3.
3.
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.2
3.3
3.3
3.3
3.3
3.3
3.3
3.4
3.4
3.4
3.4
altsverzINLEITUNG
DasNeur
Molekula
DieMaus
3.1 Modelle
3.2 Konditi
MikroRN
4.1 DieBio
4.2 DieRol
Tumore
IELDERAR
MATERIAL
Tierexpe
1.1 Generie
1.2 Zuchtv
1.3 Xenogr
Molekula
2.1 Polyme
2.2 Agaros
2.3 Klonier
2.4 Bestimm
2.5 Isolieru
2.6 mRNA‐
2.7 Reverse
2.8 Quantit
2.9 Array‐b
2.10 mRN
2.11 miRN
Biochem
3.1 Herstel
3.2 Natrium
3.3 Wester
3.4 Proteom
3.5 Herstel
Histolog
4.1 Histolo
4.2 Elektro
4.3 Immun
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roblastom.
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zeichnis
I
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..............26
..............26
..............27
..............29
..............29
..........30
..............30
..............30
..............31
3.5
3.
3.
3.
3.
3.
3.
3.
3.
3.
3.6
3.6
3.6
3.6
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4.1
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.
4.2
4.2
4.2
4.2
4.2
4.2
4.2
4.2
Zellbiolo
5.1 Kultivie
5.2 Transie
5.3 Generie
5.4 Mikrosk
5.5 Zellviab
5.6 Apopto
5.7 Prolifer
5.8 Zellzyk
5.9 Luzifer
GensetE
6.1 Genset
6.2 Statisti
6.3 Bildbea
RGEBNISS
DasLSL‐
1.1 Generie
1.2 LSL‐MY
1.3 Genoty
1.4 Embryo
1.5 Tumori
1.6 Tumorh
1.7 Verglei
TH‐MYC
1.8 Genom
1.9 mRNA
1.10 miRN
1.11 miR‐
Dietumo
undZelll
2.1 Express
2.2 Funktio
2.3 Regulat
2.4 Direkte
2.5 Funktio
2.6 Partiell
Hochre
2.7 MiR‐54
undinv
ogischeMet
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SL‐MYCN;Dbh
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10.2
11 A
11.1
11.2
11
11
11.3
11.4
Dietumo
undZelll
3.1 KDM1A
3.2 Express
3.3 Funktio
3.4 Validier
3.5 Funktio
3.6 Partiell
ochregulation
3.7 Identifi
ISKUSSION
DasLSL‐
1.1 Tumore
beschre
1.2 Gegenü
TH‐MYC
1.3 Identifi
Mausm
1.4 Möglich
dieFor
1.5 DieRel
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2.1 Dietum
2.2 Dietum
USAMMEN
BSTRACT.
ITERATUR
BKÜRZUN
BBILDUNG
Abbildun
Tabellen
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Danksag
Publikat
1.2.1 Publ
1.2.2 Kong
Lebensla
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orsuppress
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nichtnureinederhäufigervorkommendenMutationen,sondernauchdieMutationmit
dergrößtenKorrelationzueinemaggressivenKrankheitsverlauf20‐22.
Die prognostische Aussagekraft eines teilweisen oder kompletten Zugewinns von
Chromosom 17q, der bei 63‐83% aller Neuroblastome auftritt, ist umstritten23.
Innerhalb dieser Region liegt das Gen BIRC5 (Baculoviral IAP repeat‐containing 5),
welches für das Protein Survivin kodiert23,24. Im Vergleich zu Normalgewebe,
MalignomenbeiErwachsenenundnicht‐malignenfetalenNeuroblastenderNebenniere
ist die Expression von Survivin im Neuroblastom erhöht. Die Überexpression von
Survivin im Tumor korreliert außerdem mit einer ungünstigen Prognose der
Patienten25,26.SurvivininteragiertmitAuroraBKinase(AURKB),INCENPundBorealin,
die zusammen den chromosomalenPassenger Komplex (CPC) bilden. Dieser Komplex
reguliertSchlüsselereignissewährendderMitosewiedieKorrekturvonFehlernbeider
AnheftungderChromosomenandieMikrotubuli,dieAktivierungvonKontrollpunkten
beim Aufbau des Spindelapparates und die Konstruktion und Regulation des
kontraktilenApparates,derdieZytokineseantreibt27.AußerdemstabilisiertSurvivindie
MikrotubulidurchdirekteBindungandiese28.
Die Lysin‐spezifischeDemethylase 1 (KDM1A), die die Entfernung der einfachen oder
doppeltenMethylierungsowohlvonLysin4alsauchvonLysin9anHiston3katalysiert,
spielteineSchlüsselrolleinderRegulationvonGenenwährendderEntwicklung29.Eine
Überexpression von KDM1A, die mit erhöhter Zellproliferation einhergeht, wird in
verschiedenen Tumorentitäten postuliert30‐34. In primären Neuroblastomen ist die
Expression von KDM1A invers mit Differenzierung und günstigem Krankheitsverlauf
korreliert. Die Herunterregulation von KDM1A in humanen Neuroblastomzelllinien
führtaußerdemzurReduktionderZellviabilität35.
D1.3
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5
1.3.1.2 DasTH‐ALKF1174LModell
Berry et al. generierten das TH‐ALKF1174L Mausmodell, indem sie humanes ALKF1174L
hinter den TH Promotor aus der Ratte klonierten und dieses Konstrukt in murine
Blastozysten injizierten.Keineder transgenenTiereentwickelteinenTumor,während
dieVerkreuzungmit derTH‐MYCNMaus jedoch zu einer signifikanten Steigerung der
Tumorpenetranz dieses Modells führt, vergleichbar mit der homozygoter TH‐MYCN
Tiere39.
1.3.2 KonditionaleModelle
Das Cre‐lox‐Rekombinationssystem ermöglicht eine genetische Modifikation
spezifischer Zell‐ und Gewebearten. Die Cre‐Rekombinase wird dabei hinter einen
spezifischenPromotorkloniertundnurindenZellenexprimiert,indenenderPromotor
aktiv ist. Ein Gen, das von loxP Sequenzen flankiert ist, wird in Cre‐exprimierenden
Zellen aufgrund der Rekombinase‐Aktivität ausgeschnitten. In konditionalen
Mausmodellen wird diese Technik zum einen zum Stilllegen von Genen und zum
anderen zur Entfernung von Sequenzen, die die Transkription von Transgenen
verhindern,verwendet.ImletzterenFallwirddasTransgennachdemAusschneidender
loxPSequenzenexprimiert.Eskommthäufigvor,dassnichtalleZellendesZielgewebes
dieCre‐Rekombinaseexprimieren,waszueinemmosaikartigenAusschneidender loxP
Stellenführt.DiesesPhänomenspiegeltdieSituationeinesspontanenTumorswider,bei
dem ebenfalls nicht alle Zellen des Gewebes, aus dem dieser entsteht, die Mutation
aufweisen. Die Aktivität des Promotors, der die Expression der Cre‐Rekombinase
antreibt, ist häufig nicht nur auf die Ziel‐Zelltypen beschränkt, was eine genaue
UntersuchungdesExpressionsmustersdeszuverwendendenCre‐Modellsunabdingbar
macht.
Etablierte konditionale Neuroblastommodelle nutzen das Dbh‐iCre Mausmodell zur
spezifischenExpressiondesjeweiligenOnkogens.DieCre‐Rekombinasestehthierunter
Kontrolle des murinen Dopamin beta‐Hydroxylase (Dbh) Promotors. Stanke et al.
zeigten anhand der Verkreuzung mit einer ROSA26 Reportermaus, dass die Cre‐
Rekombinase im Dbh‐iCre Modell ausschließlich in noradrenergen Neuronen des
peripherenunddeszentralenNervensystemsexprimiertwird40(Abb.1).
Abb.1:MausmMauslinGanglienvermittesympathgewebe.
1.3.2.1
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1.3.2.2
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Einleitung
9
1.4.2.1 DasonkogenemiR‐17‐92‐Cluster
Das bekannteste Beispiel für die Beteiligung von miRNAs an der Pathogenese des
Neuroblastoms ist das miR‐17‐92‐Cluster, das sechs miRNAs umfasst
(miR‐17,‐18a,‐19a,‐19b‐20aund‐92),dieinNeuroblastomzelllinienmithoherMYCN
Expression stärker exprimiert werden als in Zelllinien mit niedrigem MYCN Level.
Mittels Luziferase Reporter Analyse konnte gezeigt werden, dass MYCN in
verschiedenen Genregionen des miR‐17‐92‐Clusters direkt bindet und die miRNAs
hochreguliert. Eine ektopische Expression des miR‐17‐92‐Clusters in der
NeuroblastomzelllinieSK‐N‐AS,dienureineKopiedesMYCNGensträgt,führtzueiner
gesteigertenProliferationderZellen59.Auch inprimärenNeuroblastomenkonnteeine
HochregulationinHoch‐Risiko‐Patientengezeigtwerden60,61.
1.4.2.2 TumorsuppressivemiRNAs
Die erste miRNA, deren tumorsuppressive Funktion im Neuroblastom beschrieben
wurde, ist miR‐34a, die auf der chromosomalen Region 1p36.23 lokalisiert ist.
Besonders inhumanenNeuroblastomen,die eineMYCNAmplifikationaufweisen, liegt
diese Region häufig homozygot deletiert vor. Tumore mit 1p Deletion weisen eine
niedrige Expression von miR‐34a auf und die exogene Expression der miRNA in
Neuroblastomzelllinien führt zu einer Reduktion der Proliferation und induziert
Apoptose62,63. Interessanterweise weist die 3’UTR von MYCN zwei funktionelle
BindestellendermiR‐34aaufunddieBindungdermiRNAandieseBindestellenführtzu
einerHerunterregulationvonMYCNaufProteinebene64.Eswirdvermutet,dassgenau
diese Regulation den Phänotyp der miR‐34a Überexpression erklärt65. Chen et al.
beschreibeneinenweiterenSignalwegindieserAchse.Siekonntenzeigen,dassMYCNin
Neuroblastomzelllinien direkt die Expression von Survivin durch Bindung an den
SurvivinPromoterreguliert66.
Schulte et al. analysierten die Expression von 430 miRNAs in 69 Tumoren von
NeuroblastompatientenmittelsmultiplexHochdurchsatz‐qPCR67.AnhandeinerKaplan‐
Meier Analyse können diese Neuroblastompatienten anhand der miRNA
Expressionsprofile inLangzeit und‐Kurzzeit‐Überlebende separiertwerden.AufBasis
der 20 miRNAs mit der höchsten positiven und der 20 miRNAs mit der höchsten
negativen Beteiligung, die zu einer effizienten Separation der Patienten führt, wurde
eine nicht‐überwachte Clusteranalyse durchgeführt (Abb.3). Beide Isoformen der
miR‐542sindinTumorenmithohemStadiumniedrigerexprimiertalsinTumorenmit
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11
Bray etal. beschreiben ebenfalls eine Korrelation zwischen fehlender Expression von
miR‐542‐5p und sowohl schlechterem Ereignis‐freiem als auch schlechteremGesamt‐
überleben in 144 Neuroblastompatienten68. Nach exogener Expression dieser miRNA
kannzwarkeinUnterschiedinderProliferationsratederNeuroblastomzelllinienKelly,
SK‐N‐AS und NB1691 detektiert werden, aber sowohl Kelly als auch SK‐N‐AS Zellen
reagieren mit signifikant verringerter Invasivität durch eine Matrigel‐Matrix. Die
Expression von miR‐542‐3p induziert eine Reduktion der Proliferationsrate der
humanen Lungenkarzinomzelllinie A549, der humanen Zervixkarzinomzelllinie HeLa
undderhumanenBrustkrebszelllinieMCF769.DesWeiteren reduziertmiR‐542‐3pdie
FähigkeitvonA549ZellenzurKoloniebildung.Sowohl inA549alsauchinHeLaZellen
konntegezeigtwerden,dassSurvivineindirektesTargetvonmiR‐542‐3pist.
EinweiteresBeispielfüreinemiRNAmittumorsuppressiverFunktionistmiR‐137,die
aufdemhumanenChromosom1p22lokalisiertist.MiR‐137istinverschiedenenhuma‐
nen Tumorentitäten, wie dem Glioblastom70, dem Kolorektalkarzinom71, dem Mund‐
höhlenkarzinomunddemPlattenepithelkarzinomdesKopfesundNackensherunterre‐
guliert72. Die exogene Expression vonmiR‐137 in denMundhöhlenkarzinomzelllinien
HSC‐6undHSC‐7reduziertderenWachstumundKonfluenzinvitro72.
ZielderArbeit
12
2 ZielderArbeit
ZieldieserDissertationwares,einneueskonditionalesMYCNvermitteltesMausmodell
zugenerierenundzuetablieren.FolgendeFragestellungensolltenbearbeitetwerden:
1. Entwickeln LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäuse Tumore, die als murine
Neuroblastomebeschriebenwerdenkönnen?
AnhandderLokalisation sowiederhistologischenundmolekularenEigenschaftender
Tumore,diesichintransgenenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenentwickeln,solluntersucht
werden, ob sich dasModell alsmurinesNeuroblastommodell eignet.Weiterhin sollen
verschiedene Bildgebungsmethoden angewendet werden, um das Modell genauer zu
charakterisieren.
2. Wie unterscheiden sich die Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells von
denendesetabliertenTH‐MYCNModells?
IndiesemTeilderArbeitsollendieEigenschaftendesneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus‐
modellsmitdenendesetabliertenNeuroblastommodellsTH‐MYCNverglichenwerden,
umGemeinsamkeitenundUnterschiedeherauszuarbeiten.
3. KanndasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodell genutztwerden,umneueZiele
einerNeuroblastomtherapiezuidentifizierenundsinddiesevalidierbar?
Anhand des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells sollen potentiell tumorsuppressive
miRNAs detektiert werden, die sowohl bei der Genese als auch für die Therapie des
Neuroblastoms eine Rolle spielen könnten. Nach erfolgreicher Identifikation soll die
funktionelle Bedeutung ausgewähltermiRNAs in vitro in etablierten humanenNeuro‐
blastomzelllinienanalysiertwerden.DazusollendiemiRNAsektopischexprimiertund
die phänotypischen Auswirkungen auf die Zellen untersucht werden. Des Weiteren
sollenausanderenTumorentitätenbekannteZielgenediesermiRNAsimNeuroblastom
validiertwerden.
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ethoden
14
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MaterialundMethoden
15
Restriktionsenzymen sind in einerTabelle zusammengefasst (Tab.2).ValidierteKlone
wurdenvermehrtundinflüssigenStickstoffgelagert.
Tab.2:Sonden fürdieSouthernBlotAnalyseModifiziertnachMilestoneReportTaconicAr‐temisGmbH.
Fragmentgröße[kb]
Sonde Enzyme Wildtyp‐Allel F1RMCEAllel LSL‐MYCNAllel
5‘HindIIIEcoRIPciI
4,415,69,5
3,94,316,4
7,07,813,1
3‘AvrIIPciIStuI
5,39,54,9
12,116,48,3
6,66,715,3
neoHindIIIEcoRIAseI
‐‐‐
‐‐‐
7,07,84,5
3.1.1.3 GenerierungvonchimärenMäusen
Tetraploide Maus‐Blastozysten wurden aus superovulierten Balb/c Weibchen (Tag 3
post coitum) isoliert. In 60 Blastozysten wurden je 7‐10 rekombinante ES‐Zellen
(C57Bl/6N)injiziert.Je20BlastozystenwurdendanndreischeinträchtigenWeibchenin
den Uterus implantiert, woraufhin 10 chimäre Nachkommen geboren wurden. Die
chimärenNachkommen,diesichsowohlausdentransgenenES‐Zellenalsauchausden
Zellen der Blastozyste entwickelten, wurden weitergezüchtet und keimbahnmutierte
männlicheTiere(schwarze/weißeFellfarbe)durchVerpaarungmitC57Bl/6NWeibchen
vermehrt. Der Nachweis der Keimbahntransmission erfolgte anhand der schwarzen
Fellfarbe. Das Transgen wurde mittels LSL‐MYCN Primern in einer PCR amplifiziert
(s.3.2.1–Tab.3),umdenEinbauzuvalidieren.HeterozygoteLSL‐MYCNMäusewurden
anunsereArbeitsgruppe transferiert (Abb4(III))unddurchVerpaarungmitWildtyp‐
Tierenweitergezüchtet.
MaterialundMethoden
16
3.1.1.4 Genotypisierungen
ZurGenotypisierungallerverwendetenMausstämmewurdedenNachkommenanTag5
bis 8 nach der Geburt eine Schwanzbiopsie entnommen. Die Vervielfältigung des
LSL‐MYCN‐Amplikons aus genomischer Schwanz‐DNA erfolgte anhand einer PCR mit
LSL‐MYCN‐Primern(Abb.4:A1/A2undTab.3)unddieDetektionmitHilfederAgarose‐
Gelelektrophorese (s. 3.2.1 und 3.2.2). Homozygote LSL‐MYCN Mäuse wurden mit
ROSA26‐Wildtyp‐Primernidentifiziert(Tab.3).DieGenotypisierungvonDbh‐iCreMäu‐
senerfolgteunterVerwendungvonDbh‐iCre‐Primern(Tab.3).
3.1.2 ZuchtvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenundDetektionvonTumoren
Dbh‐iCreMäusewurdenfreundlicherweisevonProf.Dr.HermannRohrer(Max‐Planck‐
Institut für Hirnforschung, Frankfurt) zur Verfügung gestellt. Heterozygote Dbh‐iCre
Tiere wurden mit heterozygoten LSL‐MYCN Tiere verpaart. Doppelt‐transgene Nach‐
kommen wurden mittels LSL‐MYCN‐ und Dbh‐iCre‐Genotypisierungs‐PCRs (s.3.1.1.4)
identifiziertundalsLSL‐MYCN;Dbh‐iCrebezeichnet.
DurchwöchentlichesAbtasten des Abdomens und desHalsbereicheswurdenTumore
detektiert. Sowohl mittels Lumineszenz‐Bildgebung (s.3.1.2.1) als auch Ultraschall‐
Bildgebung (s.3.1.2.2) wurden ertastete Tumore validiert. Alle tumor‐tragenden
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäuse wurden bei Erreichen eines Tumorvolumens von ca.
500mm3oderbei schlechtemHabitusdurchzervikaleDislokationgetötetundseziert.
Abmagerung,BewegungseinschränkungundAtembeschwerdenaufgrundeinesTumors
inderNähederLuftröhrewurdealsschlechterHabitusdefiniert.Mittelseinerhandels‐
üblichen Kamera (Panasonic Lumix DMC‐FZ248) wurden makroskopische Fotos der
Tumoreerzeugt.Herz,Hirn,Milz,MuskulaturausdemFemur,Nebennieren(wennnicht
mitTumorverwachsen),Nieren,SchwanzundTeilederLebersowiederTumorewur‐
den sofort in flüssigem Stickstoff kryokonserviert und bei ‐80°C gelagert. Außerdem
wurdenFemursowieTeilederLeberundderTumore in4%Paraformaldehyd inPBS
pH7,2(Morphisto,FrankfurtamMain)eingelagert.
IndenTumorenwurdedaskonstitutiveAllelanhandderausgeschnittenenPolyadenyl‐
Stoppsequenz imVergleich zuKontrollgewebenmittels floxoutPrimern (Tab.3) vali‐
diert.
MaterialundMethoden
17
3.1.2.1 Biolumineszenz‐BildgebungvonTumor‐tragendenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen
ZellenderLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus,indenendieCre‐Rekombinaseaktivistunddamit
dieTranskriptionsabbruchstelle(hGHpA)herausgeschnittenwurde,solltennebendem
OnkogenMYCNauchLuziferase exprimieren. ZurDetektiondieserZellenwurdeMäu‐
sen, die einen tastbaren Tumor trugen, in die Schwanzvene D‐Luciferin in PBS
(PerkinElmer, Rodgau) injiziert (50mg/kg Körpergewicht). In Gegenwart von Luzi‐
ferase wird Luciferin oxidiert und bei der daraus resultierenden Abspaltung von
TeilgruppenwirdEnergieinFormvonLichtabgegeben.Tierewurdenmit3%Isofluran
(Forene®; Abbott,Wiesbaden) in Sauerstoff narkotisiert und in die Kammer des IVIS
Lumina II (PerkinElmer), in der eine kontinuierliche Behandlungmit 2% Isofluran in
Sauerstoff aufrechterhalten wurde, gelegt. Mittels dieses Luminszenz‐
Bildgebungsgeräteswurdedie IntensitätderLumineszenz‐Emissiongemessenunddie
BilderimTIF‐Formatexportiert.
3.1.2.2 Ultraschall‐BildgebungverschiedenerGewebevonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen
HochfrequenterSchallaußerhalbdeshörbarenBereichsdesMenschen(>16kHz)wird
als Ultraschall bezeichnet. In der Humanmedizin dient die Ultraschall‐Untersuchung
(Sonografie)zurBildgebungbeiverschiedenenErkrankungen.ManmachtsichzuNutze,
dass dieUltraschallwellen, die von einemSchallkopf ausgesendetwerden, je nachGe‐
webeart entweder absorbiert oder reflektiert werden. Der Schallkopf empfängt die
reflektiertenWellenwiederunddieReflektionwirdaufdemBildschirmalsGraustufen
dargestellt. Wässrige Strukturen werden schwarz dargestellt, während Luft, die kein
Ultraschallleitet,weißerscheint.
ImRahmendieserArbeitwurdedasUltraschall‐BildgebungssystemVevo®2100(Visual
Sonics, Amsterdam, Niederlande) verwendet, um Gewebe und Tumore der
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Maus zu untersuchen. Enthaarte Tiere wurden mit 3% Isofluran
(Forene®) in Sauerstoff narkotisiert und auf dem beheizbaren Untersuchungstisch so
fixiert, dass eineAbleitung derHerz‐ undAtemfrequenz ermöglichtwurde. DieUltra‐
schall‐UntersuchungwurdeunterkontinuierlicherNarkosemit2%Isofluran inSauer‐
stoff mittels eines MicroScan‐Schallkopfs (MS550D‐Visual Sonics) durchgeführt. An‐
hand der 3D‐Funktion wurden in 100µm Abstand Schnitte durch Gewebe gemacht,
dessenOberflächeanhanddesGerätsberechnetwurde.DurchAneinanderreihendieser
Schnittewurdedie3D‐StrukturdesjeweiligenGewebesrekonstruiertunddasVolumen
berechnet.
3.1.3 X
Sechs‐W
1·107W
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mZyklus
MaterialundMethoden
19
IndieserArbeitwurdedieMethodederPCRzurGenotypisierungtransgenerMäuseund
zur Validierung der ausgeschnittenen Polyadenyl‐Stoppsequenz benutzt, wobei die
GoTaq®HotStartPolymerase(Promega,Mannheim)Verwendungfand.DieStocklösung
derPrimerhatteeineKonzentrationvon20mM.FolgendesPipettierschemawurdefür
jedenPCR‐Ansatzverwendet:
5xGoTaq®FlexiPuffer 4µl
MgCl2(25mM) 1,2µl dNTP‐Mix(Bio‐Budget,Krefeld) 0,6µl Primerforward 1µl Primerreverse 1µl GoTaq®Polymerase(5U/µl) 0,1µl templateDNA 1µl DNase‐freiesH2O 11,1µl
DieAmplifikationdertemplateserfolgteimC1000™ThermalCycler(Bio‐Rad,München),
wobei die Annealingtemperatur vom GC‐Gehalt der verwendeten Primer und die
Elongationszeit von der Länge des zu synthetisierenden DNA‐templates (60Sek. pro
1kb)abhängigwar.DieverwendetenPrimer,sowiediespezifischenAnnealingtempera‐
turen und Elongationszeiten wurden in einer Tabelle zusammengefasst (Tab.3). Fol‐
gendesallgemeinesProgrammwurdebenutzt:
180Sek. 94°C
30Sek. 94°C 30Sek. 55‐65°C 39x 30‐180Sek. 72°C 300Sek. 72°C
MaterialundMethoden
20
Tab.3:OligonukleotidprimerfürPCRfwd=forward;rev=reverse
Bezeichnung Sequenz(5‘‐3‘) Produkt‐länge
Annealing‐temperatur
Elongations‐zeit
Dbh‐iCrefwd:ctgccagggacatggccaggrev:gcacagtcgaggctgatcagc 300bp 59°C 45Sek.
flox‐out fwd:gcccgcggtgatgcctttgaggrev:cggggactgggcggtggaac
2241bp703bp
67,7°C 240Sek.
LSL‐MYCN fwd:accacaaggccctcagtaccrev:tgggacgcacagtgatgg
168bp 60°C 30Sek.
ROSA26‐Wildtyp
fwd:ctcttccctcgtgatctgcaactccrev:catgtctttaatctacctcgatgg 299bp 62°C 45Sek.
Die Auswertung der PCRs erfolgte mittels der Agarose‐Gelelektrophorese (s.3.2.2),
wobeijeweils14µldesPCR‐Ansatzesaufgetragenwurden.
3.2.2 Agarose‐Gelelektrophorese
Aufgrund ihrernegativenLadungbewegensichsowohlDNA‐alsauchRNA‐Stränge in
einemelektrischenFeld inRichtungderAnode.DieLaufgeschwindigkeit vonNuklein‐
säure‐SträngeninAgarosegelenkorreliertmitderFragmentgröße,daAgarosegeleeine
siebartigeStrukturaufweisenundkleinerenFragmenteneinengeringerenWiderstand
bieten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 1‐2%‐ige Agarosegele benutzt, die in Tris‐Acetat‐
EDTA‐Puffer (40mM Tris, 20mM Essigsäure, 1mM EDTA, pH8,0) angesetzt wurden.
Die Zugabe von Ethidiumbromid (Endkonzentration 1,25µM), ein Farbstoff, dessen
Absorptionsspektrum sich bei Interkalation mit Nukleinsäuren verändert, diente zur
VisualisierungderDNA‐FragmenteunterUV‐Licht.ZurBestimmungderFragmentgrö‐
ßen wurde parallel zu den zu analysierenden Proben ein DNA‐Standard
(LifeTechnologies, Darmstadt) aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in Tris‐Acetat‐
EDTA‐Puffer bei 120V für 45 bis 60Min. und die Visualisierung am
DokumentationsgerätBiodocAnalyzer(Biometra,Göttingen).
MaterialundMethoden
21
3.2.3 KlonierungderKonstruktepDEST30‐KDM1AundpDEST30‐Survivin
Humane KDM1A cDNA ohne 3’UTR wurde im Vektor pDONR™ erworben (E1871‐
BC048134.1; THP Medical Products, Wien, Österreich). Humane Survivin cDNA ohne
3’UTR im Gateway® pENTR™ Vektor (LifeTechnologies) wurde freundlicherweise von
Fieke Lamers aus der Arbeitsgruppe Humangenetik der Universität Amsterdam zur
Verfügunggestellt74.Beidegenesofinterest(GOIs)konntenausdiesenDonorplasmiden
anhandderGateway‐Klonierungsehreffizient inZielvektorenkloniertwerden.Mittels
Gateway®LR‐Clonase®IIEnzym‐Mix (LifeTechnologies)wurdendieGOIsnachHerstel‐
leranweisungen in den Zielvektor Gateway® pT‐Rex™‐DEST30 (LifeTechnologies) klo‐
niert.EinKonstruktmitGFPalsGOIwarschoninunsererArbeitsgruppevorhanden.Die
Hitzeschocktransformation in chemisch kompetente E.coli TOP10 (LifeTechnologies)
erfolgtenachHerstellerangaben.Je50und200µldertransformiertenE.coliwurdenauf
LBAMP‐Platten(10%Trypton,0,5%Hefeextrakt,10%NaCl,1%Agar‐Agar,pH7,0,0,01%
Ampicillin)überNacht inkubiertundEinzelzellklonegepickt.UmgrößereMengendes
PlasmidszugewinnenwurdenEinzelzellklonein100mlLBAMP‐Medium(10%Trypton,
0,5%Hefeextrakt,10%NaCl,pH7,0,0,01%Ampicillin)vermehrt.Plasmid‐DNAwurde
mit Hilfe des PlasmidMaxi Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben isoliert. Um
sicherzustellen, dass das GOI fehlerfrei im Zielvektor vorlag, wurden bei der Firma
Seqlab (Göttingen)SequenzierungeninAuftraggegeben,wobeidieSequenzierungspri‐
mer benutzt wurden, die vom Hersteller für Gateway® pT‐Rex™‐DEST30 empfohlen
wurden. Auf der Homepage des National Center for Biotechnology (NCBI,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wurden die aus der Sequenzierung erhaltenen Ergeb‐
nissemitBLASTNanalysiert.
3.2.4 BestimmungderKonzentrationvonDNAundRNA
DieMessungderNukleinsäurekonzentrationerfolgtephotometrischmittelsdesNano‐
Drop2000c (ThermoScientific).DabeiwurdedieoptischeDichte (OD)bei einerWel‐
lenlänge von 260nm, dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren, gemessen. Eine
OD260von1entspricht50µg/mldoppelsträngigerDNAund40µg/mlRNA.Eventuelle
VerunreinigungendurchProteinewurdenbei280nmdetektiert.DerQuotientausder
OD260 und derOD280 liegt bei reinenDNA‐Präparationen bei 1,8 und bei reinenRNA‐
Präparationenbei2,0.ImRahmendieserArbeitwurdennurreineNukleinsäure‐Präpa‐
rationenweiterverwendet.
MaterialundMethoden
22
3.2.5 IsolierunggenomischerDNA
Genomische DNA aus Geweben von LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäusen wurde mittels des
peqGOLD Tissue DNAMini Kits (peqlab, Erlangen) nach Anweisungen des Herstellers
isoliertundin70µlDNase‐freiemWasseraufgenommen.
3.2.6 mRNA‐undmiRNA‐Isolierung
Die Extraktion vonmRNA aus pelletierten humanen Zelllinien undmurinenGeweben
erfolgteanhanddesRNeasy®MicrooderMidiKits(Qiagen).MiRNAswurdenausGewe‐
ben mittels desmiRNeasyMini Kits (Qiagen) extrahiert. Sämtliche Kits wurden nach
HerstelleranweisungeninklusivedesoptionalenDNase‐VerdausmittelsdesRNase‐free
DNase Sets (Qiagen) durchgeführt.Die Lagerung isoliertermRNAundmiRNAerfolgte
bei‐80°C.
3.2.7 ReverseTranskriptionvonkomplementärerDNAausisoliertermRNAund
miRNA
DiereverseTranskriptionzurHerstellungvonkomplementärerDNA(cDNA)ausmRNA
erfolgtemittelsderSuperScript® IIReverseTranscriptase (LifeTechnologies).DiecDNA
ausmiRNAwurdemittelsdesmiScriptReverseTranscriptionKits(Qiagen)transkribiert.
Beide Kitswurden nach Herstellerangaben durchgeführt und die synthetisierte cDNA
bei‐20°Cgelagert.
3.2.8 QuantitativePCR
DieMethodederquantitativenPCR(qPCR),dieaufdemPrinzipderherkömmlichenPCR
beruht,dientzurAnalysederTranskriptionspezifischerGene.DieausisoliertermRNA
mittels reverser Transkription generierte cDNA wird während der Amplifikation mit
einemFluoreszenzfarbstoffversetzt,derindieDNAinterkaliert.DiemessbareFluores‐
zenz der Probe nimmt proportional zur vorhandenen DNA‐Menge zu. Der Schwellen‐
wert‐Zyklus(Ct‐Wert)beschreibtdenPCR‐Zyklus,andemdieFluoreszenzerstmaligdie
Hintergrund‐Fluoreszenzübersteigt.
ImRahmen dieser Arbeitwurde für die Analyse von cDNA, die aus isoliertenmRNAs
synthetisiertwurden,abhängigvomOligonukleotidprimerderFastSYBR®GreenMaster
Mix(LifeTechnologies)oderderTaqMan®FastAdvancedMasterMix(LifeTechnologies)
MaterialundMethoden
23
verwendet.DieDetektionvoncDNA,dieausmiRNAs transkribiertwurde,erfolgtean‐
hand desmiScript SYBRGreen PCR Kits (Qiagen).Mittels des StepOnePlus™Real‐Time
PCR Systems (Life Technologies) wurde die qPCR durchgeführt. Die dabei benutzten
ProgrammevariierteninAbhängigkeitdesbenutztenKits(Tab.4).
Tab.4:ProgrammederqPCR
40x
SowohldieverwendetenPrimeralsauchdasbenutzteKitwurdentabellarischzusam‐
mengefasst(Tab.5).
Tab.5:OligonukleotidprimerfürqPCRhs=human;mm=murin;fwd=forward;rev=reverse
BezeichnungSequenz(5‘‐3‘) oderBestellnummer qPCRKit
Mm_Dbhfwd:tcatgcacatacaacacagarev:tgcacatagttgacacacat
Fast SYBR® Green Master Mix
Hs_GAPDHfwd:catcaagaaggtggtgaagcrev:gagcttgacaaagtggtcgt
Fast SYBR® Green Master Mix
Mm_GAPDH QT01658692(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix
Hs_KDM1A QT00099442(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix
Mm_Phox2bfwd:ggcagaggaattgaggtaagrev:cgtctccacatccatcttt
Fast SYBR® Green Master Mix
Hs_miR‐542‐3p MS00010073(Qiagen) miScript SYBR Green PCR Kit
Hs_MYCN QT00201404(Qiagen) Fast SYBR® Green Master Mix
Hs_NEFL QT00096369(Quagen) Fast SYBR® Green Master Mix
Hs_RNU6B MS00007497(Qiagen) miScript SYBR Green PCR Kit
Hs_Survivin Hs03063352(LifeTechnologies) TaqMan® Fast Advanced Master Mix
Hs_TFPI2fwd:gtcgattctgctgcttttccrev:ggagacagatctccgcgtta
Fast SYBR® Green Master Mix
Mm_Th fwd:aggtggtgacacttatccaarev:agtgccagagaggacaag
Fast SYBR® Green Master Mix
Fast SYBR® Green Master Mix
TaqMan® Fast Advanced Master Mix
miScript SYBR Green PCR Kit
95°C 20Sek. 95°C 20Sek. 95°C 20Sek.
95°C 3Sek. 95°C 1Sek. 95°C 3Sek.
60°C 30Sek. 60°C 20Sek. 60°C 30Sek.
MaterialundMethoden
24
DerCt‐WertvonzuanalysierendenmRNAswurdegegendendesubiquitär‐exprimier‐
tenEnzymsGlycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐Dehydrogenase(GAPDH)dergleichenSpezies
normalisiert.DerCt‐Wertderubiquitär‐exprimiertenmiRNARNU6BdientezurNorma‐
lisierung des Ct‐Wertes der zu analysierendenmiRNAs. Anhand der ∆∆‐CtMethode75
wurdediemRNAbzw.miRNAExpressionrelativzurjeweiligenKontrollekalkuliert.
3.2.9 Array‐basiertekomparativegenomischeHybridisierung
Die Technik der Array‐basierten komparativen genomischen Hybridisierung (aCGH)
findet indermedizinischenForschungAnwendung,umVerlusteundZugewinnegeno‐
mischerDNAineinemGeweberelativzurKontrollezudetektieren.DabeiwirddieDNA
der Referenzprobe und der zu analysierenden Probemit verschiedenen Fluoreszenz‐
farbstoffen gelabelt und gegen einRaster vonDNA‐Fragmenten hybridisiert. Das Ver‐
hältnisderFluoreszenzsignalegibtAufschlussaufchromosomaleAberrationen.
FürdieDetektionchromosomalerAberrationen,dieinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Modells auftraten,wurden jeweils13ProbenunddieentsprechendenKontrollen (Ge‐
webeausdemSchwanzdergleichenMaus)analysiert.GenomischeDNAwurdemitHilfe
desQIAampDNAMiniKits(Qiagen)nachHerstellerangabenisoliert.DieProbenwurden
auf einem 180K Array (AMADID 027411‐Agilent Technologies, Böblingen), der das
kompletteMausgenom enthielt, analysiert. Je 400ng DNA aus Tumorgeweben wurde
mittelsRandompriming (LifeTechnologies)Cy3(PerkinElmer,Rodgau)gelabelt,wäh‐
rend die gleiche Menge DNA aus Schwanzgewebe mit Cy5 (Perkin Elmer) markiert
wurde.DieHybridisierungundWaschungderProbenerfolgtenachHerstellerangaben
desArrays.DieMessungderFluoreszenz‐IntensitätenwurdeanhanddesAgilentScan‐
ners G2505C (Agilent Technologies) durchgeführt. Das Software Programm Feature
Extractionv10.1.1.1(AgilentTechnologies)fandbeiderExtrahierungderDatenAnwen‐
dung. Diese wurden mit Hilfe von aCGHbase (http://medgen.ugent.be/arraycghbase)
weiter bearbeitet. Verluste und Zugewinne von Genen wurden anhand des circular
binarysegmentation(CBS)Algorithmusberechnet76,77.
3.2.10 mRNAqPCRprofiling
Anhand von Exon‐Mikroarrays kann die mRNA‐Menge bestimmter Gene einer Probe
bestimmtwerden.DazuwirddieisoliertemRNAzunächstincDNAodercRNAtranskri‐
biertunddannmitFluoreszenzfarbstoffengelabelt.DerspezifischeMikroarray‐Genchip,
MaterialundMethoden
25
dereineAuswahlvonDNA‐Spotsenthält,hybridisiertdiecDNAodercRNAderzuanaly‐
sierenden Probe. Nach Abwaschen der nicht‐gebundenen Nukleinsäuren, gibt die zu
normalisierendeFluoreszenzintensitätderSpotsdiemRNAExpressiondesspezifischen
GensinderProbewieder.
Die Bestimmung der Konzentration und Qualität isolierter Gesamt‐RNA aus Tumoren
des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells und aus nicht‐malignen Nebennieren von Wildtyp‐
Tieren erfolgte anhand des RNA6000 Nano Assays auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer
(Agilent Technologies). Die Transkription in cDNA und die Fragmentierung dieser er‐
folgtemitHilfedesGeneChip®3‘IVTExpressKit (Affymetrix,Freiburg).DieHybridisie‐
rungdercDNAaufMausgenom‐Genchips4302.0(Affymetrix),dieSondenzurDetektion
allerGenederMausenthielten,unddasAuslesenerfolgtenachAnweisungendesHer‐
stellers.CELDateienwurdennormalisiertunddieExpressionmittelsderRMAMethode
mitPowerToolsv1.15.0(Affymetrix)berechnet.
DieKalkulationderMYCNmRNASignaturbasierteaufdemvonFredlundetal.publizier‐
tenAlgorithmus78.
3.2.11 miRNAqPCRprofiling
Isolierte miRNAs aus Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells und nicht‐malignen
Nebennieren aus Wildtyp‐Mäusen wurden mittels des TaqMan miRNA Reverse
TranscriptionKits(LifeTechnologies)unterVerwendungdesrodentstem‐loopMegaplex
RTPrimerPoolsAundB(v2.0‐LifeTechnologies)nachHerstelleranweisungenincDNA
transkribiert.Ein12ZyklenlangerAmplifikationsschrittzurHerstellungeinergrößeren
Menge an cDNAwurde durchgeführt. Amplifizierte cDNAwurde 1zu4 verdünnt und
mittels desTaqMan®MicroRNAAssay 7900HT (LifeTechnologies) in folgender qPCR
Reaktionquantifiziert:
TaqMan®Assay 1,5µl TaqMan®geneexpressionmastermix 1,75µl cDNA 0,02µl DNase‐freiesH2O 0,23µlRohdaten der miRNA Expressionswerte wurden anhand des Cq‐cutoff gefiltert und
normalisiertanhanddesglobalmean79.
DieKalkulationderMYCNmiRNASignaturbasierteaufdemvonMestdaghetal.publi‐
ziertenAlgorithmus80.
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MaterialundMethoden
27
(Invitrogen)aufgetragen.DieelektrophoretischeAuftrennungderProteineerfolgtebei
einerkonstantenelektrischenSpannungvon120VjenachLaufweitederFarbfrontfür
90‐120Min.
3.3.3 WesternBlotundimmunologischerNachweisvonProteinen
DerWesternBlotisteineproteinbiochemischeMethode,mitderProteinevomSDS‐Gel
auf eineMembranausNitrozellulose transferiertwerdenkönnen83.DieProteinewan‐
dern dabei durch ein senkrecht zum SDS‐Gel angelegtes elektrisches Feld inRichtung
der Anode auf die Membran, auf der sie aufgrund hydrophober Wechselwirkungen
haftenbleiben.DasandenProteinenangelagerteSDSwirdausgewaschen,wodurchdie
Proteine ihre Sekundär‐ und Tertiärstruktur wieder einnehmen. Freie unspezifische
Bindungsstellen der Proteine werden mit einer Lösung aus entfettetem Milchpulver
blockiert.DieDetektionbestimmterProteinekannmitspezifischenPrimärantikörpern,
dieanihrAntigenbinden,erfolgen.MittelseinesSekundärantikörpers,derspezifischan
denprimärenbindetundeinReporterenzymenthält,dasdasSubstratLuminolumsetzt,
wirddieProteinbandevisualisiert.
ImRahmendieserArbeitwurdenaufgetrennteProteinemittelsdesTrans‐Blot®Turbo™
(Biorad) vom SDS‐Gel auf die Hybond‐™C Extra Nitrozellulose‐Membran (Amersham
Biosciences, Freiburg) transferiert. Dazuwurden zuerst zwei Filterpapiere (Whatman)
mitAnodenpuffer1(300MTris,20%Methanol)getränktundinderBlotkammerüber‐
einanderpositioniert.EinweiteresFilterpapier,mitAnodenpuffer2(25mMTris,20%
Methanol)getränkt,wurdeaufdiebeidenFilterpapieregelegt.Alsnächsteswurdedie
Membran (in Anodenpuffer 2) und das SDS‐Gel, welchesmit Kathodenpuffer (25mM
Tris,40mMGlycine,10%Methanol)getränktwar,aufgestapelt.DreiweitereFilterpa‐
piere (in Kathodenpuffer) bildeten den Abschluss. Bei einer konstanten elektrischen
Stromstärkevon90mAwurdendieProteinefür1Std.übertragen.DieMembranwurde
mitTBS‐T0,1(0,1%Tween20inTBS)gewaschenunddieProteinemitPonceauS‐Lösung
(0,1%PonceauS,5%Essigsäure)zurÜberprüfungdesTransfersundzurEinzeichnung
derMarkerbandenangefärbt.NacheinemweiterenWaschschrittwurdendieunspezifi‐
schen Proteinbindestellen für 1 Std. mit Bovine Lacto Transfer Techniques Optimizer
(BLOTTO‐5%Milchpulver,50mMTrisHClpH8,80mMNaCl,2mMCaCl2,0,2%NP‐40)
blockiert.DieInkubationdesPrimärantikörpersinBLOTTOerfolgteüberNachtbei4°C,
gefolgtvoneinemweiterenWaschschritt.DerSekundärantikörper,andenMeerettich‐
MaterialundMethoden
28
peroxidase gekoppelt war, inkubierte in TBS‐T0,1 für eine Std. bei Raumtemperatur,
ebenfalls gefolgt von einemWaschschritt. Verwendete Verdünnungen der Antikörper
wurdentabellarischaufgeführt(Tab.6).ProteinewurdenmittelsdesDetektionsreagenz
ECLPlus™(AmershamBiosciences)visualisiert,imFusionFX(peqlab)detektiertunddie
Bilderalsjpegexportiert.
Tab.6:AntikörperfürdenimmunologischenNachweisvonProteinen
Antigen Bestellnummer Verdünnung
AuroraBkinase 3094(CellSignaling) 1:1.000
AKAP2 Ab64904(Abcam) 1:1.000
Aktin A3853(Sigma‐Aldrich) 1:2.000
Caspase9 IM3434(Immunotech) 1:1.000
GAPDH MAB374(Millipore) 1:2.000
Kaninchen‐IgG NA9340V(GEHealthcare) 1:5.000
KDM1A 2139(CellSignaling) 1:1.000
Maus‐IgG NA9310V(GEHealthcare) 1:5.000
N‐Myc sc‐53993(SantaCruz) 1:1.000
Survivin 2808(CellSignaling) 1:1.000
TetR 631131(Clontech) 1:2.000
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SämtlicheverwendeteZelllinienwurdeninRPMI1640Mediumsupplementiertmit10%
FCS,AmphotericinB(3µg/ml),Penicillin(100U/ml)undStreptomycin(100µg/ml)bei
37°C, 80% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 kultiviert. Bei Erreichen etwa 80%‐iger Kon‐
fluenzwurdendieZellenmit0,2%Trypsin/EDTA für2‐3Min.abgelöst.DurchZugabe
vonKulturmediumwurdedieReaktionabgestoppt.DieZellenwurdenmittelsdesTC10™
Automated Cell Counter (BioRad) gezählt und in für die Versuche erforderlichen Ver‐
dünnungenausgesätoderweiterkultiviert.
DieKryokonservierungvonZellenerfolgteinFCSmit10%DMSOinflüssigemStickstoff.
ZumAuftauenwurdendieKryoröhrchenbei37°Cfürca.1Min.inkubiertunddieZellen
inKulturmediumaufgenommen.
3.5.2 TransienteTransfektionenvonmiRNAundsiRNA
FürtransienteTransfektionenvonmiRNAundsiRNAinhumaneZelllinieninvitrowur‐
denZelleninverschiedenenZahlenausgesät,abhängigvonihrerWachstumsgeschwin‐
digkeit undGröße.Die imRahmendieserArbeit ausgesäten Zellzahlenwurden tabel‐
larischzusammengefasst(Tab.8).
Tab.8:AusgesäteZellzahlenderverwendetenZelllinien
ZelllinieZellzahl
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IMR‐32 1,5·104 12·104 18·104
SHEP 0,5·104 4·104 6·104
SK‐N‐BE 1·104 8·104 12·104
WACII 0,5·104 4 · 104 6·104
Transiente Transfektionen der Pre‐miRs™ (AM17100‐Life Technologies) miR‐137
(PM10513),miR‐542‐3p(PM11340)undmiR‐542‐5p(PM13010)PrecursorMolekülen
undderPre‐miR™Negativkontrolle(AM17110‐LifeTechnologies)erfolgtenmittelsdes
TransfektionsreagenzessiPort™NeoFX™(LifeTechnologies) ineinerEndkonzentration
von30nMnachAnweisungendesHerstellers.
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MaterialundMethoden
35
DieAnalysederViabilitätvonZellenerfolgteim96‐wellFormatzuverschiedenenZeit‐
punkten (24, 48, 72, 96und120Std.) nach der transientenTransfektion vonmiRNAs
undsiRNAs(s.3.5.2).DerFarbstoffMTTwurdeinPBSgelöst(10mM)und20µlprowell
zu den Zellen gegeben (Endkonzentration 1,7mM). Nach einer Inkubationszeit von
2Std.bei37°CwurdederÜberstandabgesaugtunddasentstandeneFormazanin100µl
Solubilisierungslösung (10% SDS, 0,6% Essigsäure in DMSO) gelöst. Die Messung er‐
folgte bei einer Wellenlänge von 570nm (Referenzwellenlänge 630nm) im Epoch
Spektralphotometer‐System (BioTech, Bad Friedrichshall). Alle Experimente wurden
mindestensdreiMal,jeweilsindreifach‐Bestimmungdurchgeführt.
3.5.6 Apoptose‐Assay
Zellen, die aufgrund von Apoptose sterben, geben Mono‐ und Oligonukleosome ins
Zytoplasmaab.DasCellDeathDetectionELISAPLUSKit(11774425001‐Roche)verwen‐
detAntikörper, die spezifisch gegenDNAundHistone gerichtet sind, umdieseMono‐
und Oligonukleosome zu detektieren. Die Umsetzung eines spezifischen Substrates
korreliertmitderFraktionapoptotischerZelleninderProbe.
DieAnalyseder apoptotischenZellen erfolgtenachHerstellerangaben im96‐well For‐
mat96Std.nachTransfektionvonmiRNAsodersiRNAs(s.3.5.2).DieMessungerfolgte
anhand des Epoch Spektralphotometer‐Systems (BioTech). Alle Experimente wurden
dreiMal,jeweilsindreifach‐Bestimmungdurchgeführt.
3.5.7 Proliferations‐Assay
DieSynthesevonDNAisteinindirekterParameterderZellproliferation.DasPrinzipdes
CellProliferationELISAKits(1647229001‐Roche)beruhtaufdemEinbauvon5‐bromo‐
2‘‐Deoxyuridin(BrdU)anstellevonThymidinindiegenomischeDNAvonproliferieren‐
denZellen.MittelseinesAntikörperswirddaseingebauteBrdUgebunden.DerUmsatz
desSubstratsgibtAufschlussaufdieProliferationsrateeinerZellprobe.
Die Analyse der proliferierenden Zellen erfolgte im 96‐well Format 96Std. nach der
Transfektion von miRNAs oder siRNAs (s.3.5.2). Es wurde nach Herstellerangaben
vorgegangen. Die Messung erfolgte anhand des Epoch Spektralphotometer‐Systems
(BioTech). Alle Experimentewurdenmindestens dreiMal und jeweils in dreifach‐Be‐
stimmungdurchgeführt.
MaterialundMethoden
36
3.5.8 Zellzyklusanalyse
Der Farbstoff Propidiumiodid interkaliert mit Nukleinsäuren von perforierten Zellen.
Bei der Zellzyklusanalysewird anhand vonDurchflusszytometriederDNA‐Gehalt von
Zellen bestimmt. Dieser gibt Aufschluss auf den Zellzyklusstatus einzelner Zellen. Die
subG1‐PhaseistcharakterisiertdurchdegradierteDNAunddamiteinCharakteristikum
apoptotischerZellen.InderG1‐PhaseliegtinderZelleeinvollständigerChromosomen‐
satzvor.BefindetsicheineZelleinderS‐Phase,inderdieDNArepliziertwird,liegtein
1‐2‐facherChromosomensatzvor.DieG2/M‐PhaseistdurchdasVorhandenseinzweier
Chromosomensätzecharakterisiert.
Zu analysierendeZellenwurden in12‐well PlattenmitmiRNAsoder siRNAs transient
transfiziert(s.5.3.2)undnach96Std.analysiert.ZellpelletswurdenmitPBSgewaschen
(5Min.bei1.000g),in70%EthanolaufEisfür1Std.fixiertundzentrifugiert(5Min.bei
1.000g).DasPelletwurdein500µlPBSresuspendiertunddieRNAdurchZugabevon
RNase A (Endkonzentration 0,25mg/ml) für 1Std. bei 37°C verdaut. Propidiumiodid
wurde in einer Endkonzentration von 10µg/ml zugegeben. Der zelluläre DNA‐Gehalt
von jeweils5.000ZellenwurdemittelsdesFlowCytometers FC500 (BeckmanCoulter,
Krefeld)gemessenundanhandderSoftwareCXPanalysiert.AlleExperimentewurden
mindestensdreiMaldurchgeführt
3.5.9 LuziferaseReporterAssay
DiedirekteBindungeinermiRNAaneinevorhergesagteZiel‐mRNAkannmittelseiner
LuziferaseReporterAnalysevalidiertwerden.DasLuziferase‐Reporter‐Plasmidenthält
diepotentielleBindestelledermiRNA.DieBindungdermiRNAandieBindestelleführt
zurHemmungderLuziferaseExpressionundsomitzurgeringerenAktivität.
Die Bindung vonmiR‐137 an die 3’UTR vonKDM1A wurdewie folgt untersucht: Das
Glühwürmchen‐LuziferaseReporterPlasmidpMir‐Target(OriGene),welchesdie3’UTR
von KDM1A beinhaltete (SC0204616‐NM_015013), das Plasmid pRL‐TK (E224A–
Promega, Mannheim), das als Transfektionskontrolle Renilla‐Luziferase exprimierte,
und Negativkontroll‐miRNA oder miR‐137 wurden im 12‐well Format sowohl in
HEK‐293alsauchinSHEPZellenkotransfiziert.
DieValidierungdermiR‐542‐3pBindungandie3’UTRvonSurvivinerfolgtemitfreund‐
licherweisevonDr.KwangheeBaek(Graduiertenschule fürBiotechnologie,KyungHee
Universität, Yongin, Korea) zur Verfügung gestellten Psi‐Check2‐Vektoren (Promega),
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MaterialundMethoden
38
3.6.2 StatistischeAnalysen
SämtlicheGraphenwurdenmitGradhPadPrism®5.0erstellt.StatistischeAnalysenwie
derStudent‘st‐Test,derLog‐Rank‐TestundderWilcoxonTesterfolgtenebenfallsmit‐
telsdieserSoftware.StatistischeUntersuchungenzumVerlaufzweierGraphenwurden
von Johannes Köster (Genome Informatics, Institut für Humane Genetik, Universität
Duisburg‐Essen) anhand eines Permutationstests durchgeführt. Expressionsdaten aus
qPCR‐Analysen einzelnermRNAswurdenmitBiogazelleqbasePLUS2.0 berechnet.Die
Signifikanz der Unterschiede zwischen zwei experimentell verschieden behandelten
Gruppenwurdemit*(p<0,05),**(p<0,01)und***(p<0,001)gekennzeichnet.
3.6.3 Bildbearbeitung
EingescanntehistologischeSchnittewurdenmitPanoramicViewer1.15.2analysiertund
als TIF‐Dateien exportiert.DieQualität vonFotos und anderenDateienwurdemittels
derSoftwarePhotoshop®CS4(Adobe)sinnerhaltendaufgewertet.
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2). Repräse
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gebnisse
42
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r, da die
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Dbh‐iCreon dreinglion(I)
Ergebnisse
43
Die Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells wurden mittels Ultraschall‐Bildge‐
bungweiteruntersucht.WährenddieoberenZervikalganglienaufgrundihrergeringen
Größe in heterozygoten LSL‐MYCN Tieren nicht genau dargestellt werden konnten
(Abb.13a), waren repräsentative Tumore die aus diesen Geweben entstandenwaren,
deutlichalsechoärmere,raumforderndeStrukturinderHalsregionrechtsundlinksder
Luftröhrenachweisbar(Abb.13b).ZurAuffindungeinerNebennierewurdezunächstdie
Lokalisation der Niere anhand ihrer auffälligen Struktur aus Nierenrinde, ‐mark
und ‐becken, die imUltraschall deutlich erkennbarwaren, definiert (nicht gezeigt). In
RichtungkranialkonntebeiheterozygotenLSL‐MYCNTierendieNebenniereamvorde‐
renNierenpol dargestelltwerden (Abb.13c).DieNebennierenrindewar als echoarme
Strukturdeutlicherkennbar,währenddas innenliegendeNebennierenmarkeinstärke‐
res Echo aufwies. Tumore der Nebenniere, die im LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodell
auftraten, konnten als echoarme Strukturen am oberen Nierenpol dargestellt werden
(Abb.13d).Mittelsder3D‐FunktiondesVevo2100wurdendie3‐dimensionalenStruk‐
turen verschiedener Gewebe rekonstruiert (Abb.13e) und ihre Volumina bestimmt.
Nicht‐maligneNebennierenausgewachsenerMäusewieseneinmittleresVolumenvon
2,18mm3(±0,61mm3)auf(Datennichtgezeigt).DieVoluminaderNebennierenvonje
sechs LSL‐MYCN und LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tieren wurden über 100Tage wöchentlich
gemessenundgegendasAlterderTiereaufgetragen(Abb.13f).ZwischendenVolumina
nicht‐maligner Nebennieren von LSL‐MYCN;Dbh‐iCre und LSL‐MYCN Mäusen konnte
keinUnterschieddetektiertwerden.Zweiderdoppelt‐transgenenMäuseentwickelten
innerhalb der Beobachtungszeit Tumore an einer der beiden Nebennieren, anhand
derenVolumina sichein exponentiellesWachstumnachweisen ließ.EinweiteresLSL‐
MYCN;Dbh‐iCreTierdieserKohortebildeteeinenTumordesoberenZervikalganglions
mitschnellerVolumenvergrößerungausundmusstenach50Beobachtungstagengetö‐
tetwerden(Datennichtgezeigt).DieTumorinzidenzderhierbeobachtetenKohortelag
innerhalbderStreuungderGesamtkohorte.
Abb.13(a)DurckalgangbeidseitLSL‐MYC(NN)einmeliert.LSL‐MYCeiner LLSL‐MYCgen TieeinenTu
3: Ultraschchschnittdelien (aufgrutig aus deYCN;Dbh‐iCrenerheterozy(d) Durch
YCN;Dbh‐iCreLSL‐MYCN;DYCN;Dbh‐iCreres. Zwei dumoranein
hall‐BildgeerHalsregiound der gern obereneMaus.(c)DygotenLSL‐hschnitt dure Maus. (e)Dbh‐iCre MeMäusenmder doppelt‐nerderNebe
ebung vonneinerheteringen GrößZervikalganDurchschnitMYCNMausrch einen a) 3D‐RekonMaus. (f)ittels3D‐Re‐transgenenennieren.
n Tumoreerozygotenße nicht genglien entsttderamvos.Nebennieraus der Nebnstruktion eNebenniereekonstruktion Tiere entw
en aus LLSL‐MYCNMenau definiestandene TorderenNierrenrindeschbenniere heeines repräsenvoluminaonaufgetragwickelten in
LSL‐MYCN;DMausinHöherbar). (b)Tumore einrenpollokalhwarz;Nebeervorgegangsentativen Nvon je
gengegendnnerhalb de
Erg
Dbh‐iCrehederobereDurchschniner repräselisiertenNebennierenmagenen TumNebenniere6 LSL‐MYCdasAlterdeser Beobacht
gebnisse
44
MäusenenZervi‐itt durchentativenbennierearkweiß‐or einerntumorsCN undsjeweili‐tungszeit
Sobald
aufgrun
einena
getötet
derers
desobe
Abb.14Modellseines Tuausdem
DasVor
LSL‐MY
Rekomb
Mittels
LSL‐MY
(Abb.1
cher d
ausgesc
durche
ein Tumo
nd eines d
allgemeinen
. Während
owohlTum
erenZervik
4: Makrokos (a) Darstumors desmoberenZer
rhandense
YCN;Dbh‐iC
bination s
PCR(Prim
YCN;Dbh‐iC
5). In geno
ie Polyade
chnittenw
einRekomb
or ein Volu
ie Luftröhr
nschlechte
d der Sekti
morederN
kalganglion
opische Auellung beidGanglion corvikalgangli
inderspez
reMäusen
tattgefund
merflox‐out
re Tieren
omischerD
enyl‐Stopp
wurde,war
binationser
umen von
re zudrück
esHabitusa
ion wurden
Nebennieren
ns(Abb.14b
ufnahmenseitig entstoeliacum (Monnaheder
zifischenPo
n deutete d
en hatte,
t‐Tab.3)k
, ein 224
DNAausTu
sequenz a
das Ampli
reigniskon
500mm3
kenden Tum
aufwies,wu
n makrosk
nunddes
b)dokume
repräsentatandener NeMitte). (b)DrLuftröhre.
olyadenyl‐S
darauf hin,
also keine
konnteing
41bp lang
umoren de
aufgrund d
ikon 703b
nntesoind
überschrit
mors einge
urdedieses
kopische A
Ganglionc
entiertwur
ativer TumebennierentDarstellung e
Stoppseque
dass in de
e Cre‐Reko
genomische
ges Amplik
es LSL‐MYC
der Expres
p lang. Die
enTumore
tt, die Atm
eschränkt w
sdurchzer
Aufnahmen
oeliacum(A
den.
more des Ltumore (receines Tumo
enzingeno
em jeweilig
ombinase e
erDNAaus
kon nachg
CN;Dbh‐iCr
ssion der
e Aktivieru
ennachgew
Erg
mung eines
war oder e
rvikaleDisl
gemacht,
Abb.14a)a
LSL‐MYCN;Dchts und linors, hervorg
omischerD
genGeweb
exprimiert
sHerzgew
gewiesen
reModells,
Cre‐Rekom
ung des Tr
wiesenwerd
gebnisse
45
s Tieres
ein Tier
lokation
anhand
alsauch
Dbh‐iCrenks) undgegangen
DNAvon
be keine
wurde.
ebevon
werden
inwel‐
mbinase
ansgens
den.
DieExp
auch au
undTu
vier rep
wurde
Tumore
höhteE
ten Kon
erhöhte
gleiche
(Abb.1
Abb.16(a)BalkwebenTest:pverMäu
pressionde
uf Protein‐
umorenvon
präsentativ
relativ zur
e zeigten i
Expression
ntrollgewe
e Expressio
n Maus w
6b).
6: Überexpkendiagrammaus einer=0,0002.(buse.GAPDH
esTransge
‐Ebenemit
nLSL‐MYCN
verTumor
r Expressio
mVergleic
vonMYCN
eben war d
on des Pro
urde in vi
pression vomderMYCNWildtyp‐Mab)MYCNPralsLadungs
ensMYCNw
ttelsWeste
N;Dbh‐iCre
e sowiede
on der nic
ch zuNebe
NmRNA.Im
die Hochre
oteinsMYC
er repräse
on MYCNNmRNAExpaus relativoteinExpreskontrolle.
Abb1tenenpräseniCreMHerz2der jewflox oTu=T
wurde sow
ern Blot in
eMäusena
erKontroll
cht‐malinge
ennieren ei
mVergleich
egulation v
CN im Tum
entativen L
in Tumorpressionviezur Expres
essionimHe
5:PCRzurPolyadeny
ntativen TMäusen Kon2241bplanweils gleichout (Tab.3umor.
wohl aufm
n Kontrollg
analysiert.D
gewebeNi
en Nebenn
ine signifik
hderTumo
vonMYCN
mor im Ver
LSL‐MYCN;D
en des LSerrepräsentssion der Nerz(He)und
Validierunyl‐Stoppsequmoren aunditionalesg,konstituthen Maus 73). wt=W
RNA‐Ebene
geweben vo
DieMYCN
iere,Leber
iere aufget
kant, imM
rezudena
mRNA noc
gleich zum
Dbh‐iCre M
SL‐MYCN;DtativerTumNebennieredTumor(Tu
Erg
ngderausgquenz in vus LSL‐MYLSL‐MYCNtivesAllel im703 bp langWildtyp; He
emittelsq
onWildtyp
mRNAExp
r,Herzund
tragen (Ab
ittel 14,5‐f
anderenan
ch deutlich
mHerz der
Mäusen dar
Dbh‐iCre MmoreundKo(NN). Stud
u)vierrepr
gebnisse
46
geschnit‐vier re‐YCN;Dbh‐Allel immTumorg. Primere=Herz;
qPCRals
p‐Tieren
pression
dGehirn
bb.16a).
fach, er‐
nalysier‐
her. Die
r jeweils
rgestellt
Modellsntrollge‐dent‘s t‐äsentati‐
4.1.6 T
DieExp
mittels
Marker
Herzun
gen (Ab
Nebenn
ren im
sion vo
derana
Die Str
histolog
DieTum
das a
Elektro
neuron
Zelladh
exprim
Neurob
wurdea
Tumorhis
pressionde
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r‐Expressio
ndGehirnw
bb.17). Inn
niereamhö
Mitteleine
onTh und
alysiertenN
ruktur repr
gischer Sch
morebesta
auch im
onenmikros
nales Gewe
häsionsmol
iert wird8
blastommar
anhandim
tologieun
erNeurobl
erschieden
onvierrep
wurderela
nerhalb de
öchsten.D
e2,4‐fach
eine22‐fa
Neuroblasto
räsentative
hnitte, die
andenausk
humanen
skopische
ebe spezifis
ekül,dasin
88, immunh
rkers Th, d
munhistoc
ndExpress
lastommark
nenGewebe
räsentative
ativzurExp
er Kontroll
ieTumore
erhöhteEx
ch erhöhte
ommarker
er Tumore
mitHämat
kleinen,bla
n Organis
Aufnahme
sch sind1 (
nneuronal
histochemi
die schon a
hemischer
sionspezif
kerDbh,T
endesLSL‐
erTumore
pressionde
lgewebe w
wiesenve
xpressionv
eExpressio
indenTum
AbblaTuBalmRTumExp(NNTum(StPhoHy
aus LSL‐M
toxylin und
auen,runde
smus die
en zeigten
(Abb.18b).
lenundneu
sch darge
auf Transk
rFärbungen
fischerNeu
ThundPhox
‐MYCN;Dbh
undderK
ernicht‐ma
war die Exp
erglichenm
vonDbh, e
on vonPho
morenwar
b.17: mRNastommarkmoren auslkendiagramRNA Expremore undpression deN). Signifmoren imtudent‘st‐Teox2b: p=droxylase;T
MYCN;Dbh‐
d Eosin an
enZellen,ty
se Strukt
neurosek
. Weiterhin
uroendokr
stellt (Abb
kriptionseb
naufProte
uroblastom
x2bwurde
h‐iCreMod
Kontrollgew
alignenNeb
pression al
mitnicht‐m
ine4,2‐fac
ox2b auf.D
signifikant
NA Expreskern in vies LSL‐MYCNmm der Nession vieKontrollgeer nicht‐mafikante HVergleich
est:Dbh:p=0,0006). DTh=Tyrosin
iCre Mäus
ngefärbtwu
ypischfürd
tur aufw
kretorische
n wurde C
inenGewe
b.18c). Die
bene gezeig
inebeneva
Erg
mmarker
eaufmRNA
dellsanalys
webeNiere
bennierea
ller Marker
malignenNe
cherhöhte
DieHochreg
t.
ssion voner repräsenN;Dbh‐iCreeuroblastomer repräseeweben relalignen NebHochregulatih zur Neb=0,005;Th:Dbh=DopamnHydroxyla
en wurde
urden, unt
dasNeurob
weist1 (Ab
Vesikel,
CD56, ein n
ebenundT
e Express
gt werden
alidiert(Ab
gebnisse
47
A‐Ebene
iert.Die
e,Leber,
ufgetra‐
r in der
ebennie‐
Expres‐
gulation
Neuro‐ntativenMäusenmmarkerentativerativ zurbenniereion inbennierep=0,02;min‐betase.
anhand
ersucht.
blastom,
bb.18a).
die für
neurales
umoren
ion des
konnte,
bb.18d).
Abb.18LSL‐MYblaue ZAufnahmtochemi(rechts)Negativk
4.1.7 V
d
DasTu
lierten
fanden
129x1/
Mäuse
(50%)
schon i
zeigten
Überleb
des T
LSL‐MY
TH‐MYC
82,5Ta
8: HistoloYCN;Dbh‐iCrellen. Maßsmemitneurische Färbu). Maßstabskontrollenu
Vergleich
desetablie
mor‐freieÜ
TH‐MYCN
sich im
/SvJ (25%)
100%129x
und 129x
in vorherig
n im Vergl
ben,ermitt
TH‐MYCN‐M
YCN;Dbh‐iC
CN Mäusen
agenlag.Di
ogische ureModellsstabsbalkenrosekretorisung von CDsbalken=20urmitSekun
derTumo
ertenTH‐M
Überleben
Neuroblas
gemischte
), während
x1/SvJwar
1/SvJ (50%
gen Publik
eich zu TH
teltanhand
Modells be
re Modell
n betrug 1
ejenigenT
und mole(a)Hämato: links=10schenVesikeD56 (links)00 µm. (d)ndärantikör
orinzidenz
MYCNMau
vonLSL‐M
stommodel
en genetis
d der gene
r.TH‐MYCN
%) entwick
kationen be
H‐MYCN T
deinerKap
etrug 48%
ls (76,3%
54 Tage, w
iere,dieim
ekulare CoxylinundE0µm; rechteln(Pfeile).und NegaImmunhist
rper(rechts)
zdesLSL‐M
usmodells
MYCN;Dbh‐
lls verglich
schen Hint
etische Hi
NTiereim
kelten kein
eschrieben
Tieren ein
plan‐Meier
% und w
%). Das m
während d
mLaufeder
CharakterisEosinFärbuts=50µm.Maßstabsbtivkontrolletochemische).Maßstabs
MYCN;Dbh
iCreMäuse
hen. Die LS
tergrund
ntergrund
gemischten
ne Tumore
wurde37.
signifikant
‐Analyse(A
war dam
mediane T
das von LS
rBeobachtu
tika vonng.Überwie(b) Elektrobalken=500e nur mit Se Färbung v‐balken=20
‐iCreMaus
enwurdem
SL‐MYCN;D
aus C57Bl
der analy
nHintergru
e (Daten n
LSL‐MYCN
t schlechte
Abb.19).D
it geringe
umor‐freie
L‐MYCN;Db
ungmindes
Erg
n Tumoreegendkleinonenmikrosk0nm.(c)ImSekundäranvon Th (lin00µm.
smodellsm
mitdemd
Dbh‐iCre Ti
l6/N (75%
ysierten TH
undausC5
nicht gezei
N;Dbh‐iCre
eres Tumo
DieTumori
er als d
e Überleb
bh‐iCre Tie
stenseinen
gebnisse
48
en dese,runde,kopischemmunhis‐ntikörpernks) und
mitder
esetab‐
iere be‐
%) und
H‐MYCN
57Bl6/N
gt), wie
Mäusen
or‐freies
inzidenz
die des
en von
eren bei
nTumor
ausbild
Lebens
4.1.8 G
Genom
nieren
demSc
einerÜ
Zeit bis
Tumore
zur Ent
der Zei
konnte
den.
Einer d
Chromo
kalgang
Zunahm
sowohl
ren. Au
LSL‐MY
ren Ze
frequen
more g
17, die
Tumore
deten, entw
,imLSL‐M
Genomisch
ischeAber
undzweiT
chwanzder
Übersichtsg
s zur Entw
enwurden
twicklung
it bis zur T
aufgrund
der analysi
osoms1. In
glions wur
medeskom
lTumored
uf diesem
YCNMausm
rvikalgang
ntierte Zun
gefunden (A
e in 50% a
ewurdeein
wickeltend
YCN;Dbh‐iC
heAberra
rrationenv
Tumorede
r jeweils g
graphikden
wicklung ei
n keine chr
dieser beid
Tumorentw
der gering
ierten Tum
nachtTum
rde eine Z
mplettenC
derNebenn
Chromoso
modellsklo
glions amp
nahmeder
Abb.20c),
aller huma
nekomplet
iesen imT
CreModell
ationenvon
on13LSL‐
esoberenZ
leichenMa
njeweiligen
ines Tumo
romosomal
den Tumor
wicklung u
genAnzahl
more einer
morender
Zunahme d
hromosom
nierenals a
om liegt de
niertwurd
lifizierten
distalenH
entspreche
aner Neuro
tteZunahm
TH‐MYCNM
nach79,6
Abb.zwisundAnalyheter(n=8(n=3Mäus
nLSL‐MYC
‐MYCN;Dbh
Zervikalgan
ausmittels
nChromos
ors in dies
lenAberra
re betrug 4
und dem A
l an analys
Nebennie
Nebennier
des komple
ms6 zeigten
auchdeso
er ROSA26
de.EinTum
diesen Lo
HälftedesC
end einer R
oblastome
medesChro
Modell imM
Tagen.
19: Vergchen demdem TH‐
yse des Trozygot tr84) und38).Tumorisensignifika
CN;Dbh‐iCr
h‐iCreTumo
nglions)wu
s einer aCG
omenzuge
er Kohorte
tionen det
46Tage. E
Auftreten ch
iertenTum
ere zeigte e
reundeine
etten Chro
n fünfder
oberenZerv
6 Genlokus
morderNe
okus sogar
Chromosom
Region auf
eine Zuna
omosoms1
Mittelnach
gleich der LSL‐MYCNMYCN ModTumor‐freieansgenenLSL‐MYCN
inzidenzinanthöher(L
reTumore
oren(elfTu
urdenrelat
GHAnalyse
eteilt(Abb.
e betrug 8
tektiert. Die
in Zusamm
hromosom
morennich
eine teilwe
emTumor
omosoms 3
analysierte
vikalgangli
s, in den d
ebenniereu
r (Abb.20b
ms11wurd
f dem hum
hme aufwe
12festgeste
Erg
h85,3Tage
r TumoriN;Dbh‐iCredell Kaplaen ÜberlebTH‐MYCNN;Dbh‐iCreLSL‐MYCN;DLog‐RankTe
en
umoreder
tivzuGew
edetektiert
.20a).Die
80,4 Tage.
emittlere
menhang zw
maler Aberr
ht untersuc
eise Zunah
desobere
3 detektie
enTumore
ionsbetrof
das Transg
undeinerd
b). Eine n
de invier
manen Chro
eist42. In d
ellt.Beide
gebnisse
49
en ihres
inzidenzModelln‐Meier‐ens vonMäusenTieren
Dbh‐iCreest).
rNeben‐
webeaus
t und in
mittlere
In zwei
Zeit bis
wischen
rationen
chtwer‐
hme des
nZervi‐
rt. Eine
e,wobei
ffenwa‐
gen des
desobe‐
iedriger
derTu‐
omosom
drei der
Tumore
desobe
auf.
Interes
Aberrat
mor12
andere
(Tumor
Teilwei
LSL‐MY
Abb.20AnalysegleichenZunahmROSA26des ChrBeckers
erenZervik
santerweis
tionenauf
2und13)),
Aberratio
r8und9).
ise oder k
YCN;Dbh‐iC
0: Genomis von13LSLnMaus.(a)me;rot=Abn6Genlokusaromosoms 1s.
kalganglion
se wies ein
wiederTu
während
onen als d
komplette
reModells
sche AberrL‐MYCN;DbhÜberblickünahme.(b)RaufChromos11 in vier d
nssowieein
ner der Tu
umorausd
derzweite
er dazugeh
Verluste g
nichtdete
rationen vh‐iCreTumoübergenomRepräsentatsom6.(c)Reer Tumore.
nTumord
umore des
derNebenn
eanalysiert
hörige Tum
ganzer Chr
ektiert.
von TumororenrelativmischeAberrtiveDarstellepräsentativ. Graphik ge
erNebenn
oberen Ze
nierederg
teTumord
mor der N
romosomen
ren des LSvzuGeweberationenallelungdesinzveAnsichtdeneriert in
ierewiesen
ervikalgang
gleichenMa
desoberen
Nebenniere
n wurden
SL‐MYCN;DeausdemSeranalysierzweiderTuderZunahmeZusammena
Erg
ndieseAbe
glions die g
aus(Abb.2
Zervikalga
e zeigte (A
in Tumor
Dbh‐iCre MSchwanzdertenTumorumoreampliederdistalearbeitmit A
gebnisse
50
erration
gleichen
20a(Tu‐
anglions
Abb.20a
ren des
Modellsr jeweilse.blau=ifiziertenenHälfteAnneleen
Ergebnisse
51
4.1.9 mRNAProfiling
Mittels Affymetrix mRNA Arrays wurden mRNA Expressions Profile von drei nicht‐
malignenNebennierenundachtLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenerstellt.
4.1.9.1 Gene Set Enrichment Analyse (GSEA) von Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Mausmodells
Eines der am stärksten angereicherten Gensets innerhalb der in Tumoren von
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mäusen hochregulierten Gene, das anhand der GSEA detektiert
wurde, beinhalteteMarkerpädiatrischerKrebserkrankungen89 (Abb.21a (oben)).Die‐
sesGenset besteht aus in Xenografts, die acht verbreitete pädiatrischeTumore reprä‐
sentieren,verschiedenexprimiertenGenenimVergleichzuNormalgewebe.Einweiteres
Genset,das inTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells starkangereichertwar,bein‐
halteteGene,dieinBZellLymphomen,dieeineaktivierteFormvonMYCexprimieren,
hochreguliertsind90(Abb.21a(unten)).WeiterevonMYChochregulierteGensetswaren
inTumorenausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenangereichert91‐93,währendvonMYCherun‐
terregulierteGensets90,93,94 inNebennierenangereichertwurden(Abb.21b).Zusätzlich
waren verschiedene Gene, die die DNA Replikation und den Zellzyklus betreffen95‐98,
statistisch signifikant hochreguliert in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells. Ein
weiteresGenset,dasGenerepräsentierte,diewährendneuralerDifferenzierungherun‐
terreguliert sind99, wurde in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen hochreguliert,
wasdieHypotheseeinesundifferenziertenPhänotypunterstützt.
Abb.21NebennKrebseristderPMSigDBwaren.Größe=positivR
4.1.9.2
An den
Basisd
einezw
Regulat
amplifiz
gene.or
Die nic
einerei
1:GensetEnierenvonWrkrankungenPlotderRanC2KollektiRang=Ran=AnzahlderRate.Graphi
Expressio
Tumoren
n gleichen
dervonFre
wei‐dimens
tion dieser
zierten Ne
rganhand
cht überwa
indeutigen
nrichmentAWildtyp‐Mäunrepräsentingsummendion,die inLng des GensrGeneinjedikgeneriert
on einer Si
mRNA Arr
edlundeta
ionaleClus
r mRNAs
euroblastom
vonPfeilen
achte Clust
Separation
AnalyseAchusen.(a)Hoiert(oben)desMSigDBLSL‐MYCN;Dsets innerhdemGenset,inZusamm
ignatur MY
ray Daten,
al. publizier
steranalyse
in humane
men78 und
ndargestel
teranalyse
nvonNebe
htLSL‐MYCNochregulatioundeinesM(v3.1)GensDbh‐iCrebzwhalb aller G,NES=norm
menarbeitmi
YC(N) regu
die für die
rtenMYC(N
edurchgefü
en MYCN‐
d die der
lt.
anhand de
ennierenun
N;Dbh‐iCreoneinesGenMYCN‐abhänsets.(b)Taw. inNebenGensets, geomalisierterEitAnneleen
ulierter mR
e GSEA ver
N)Signatu
ührt(Abb.
amplifizier
Internet‐D
er Gene de
ndLSL‐MYC
Tumoreundnsets,dasMngigenGensbelleausgewnnierensignordnet nachEnrichmentBeckers.
RNAs in LS
rwendetw
rhumaner
22).DesW
rten im Ve
atenbank
er MYCN S
CN;Dbh‐iCr
Erg
ddreinichtMarkerpädiasets(unten)wählterGennifikantangeh abfallendeScore,FDR
SL‐MYCN;D
wurden, wu
rNeurobla
Weiterenwu
ergleich zu
www.myc‐
Signatur fü
reTumoren
gebnisse
52
‐maligneatrischer.Gezeigtnsetsderereichertem NES,=falsch‐
Dbh‐iCre
urde auf
astome78
urdedie
u nicht‐
‐cancer‐
ührte zu
n.
Abb,22sionaletur vonNebennDatenbaphikgen
Die Ho
konnte
Mitose
konnte
hohe N
LSL‐MY
hydrog
marker
murine
netes T
regulier
2:Regulierthierarchischn Fredlundieren.Regulank (www.mneriertinZu
chregulatio
imMausm
von Neu
eine Hoch
NME1 Expr
YCN;Dbh‐iC
enaseLeve
r13. Die Reg
eNeuroblas
Target von
rt.
temRNAsinheClusteranet al.78 inlationinMYmyc‐cyncer‐usammenarb
on vonNra
modellvalid
uroblastom
hregulation
ression mi
re Modells
el imBlut
gulation de
stomedies
n MYCN103,
nTumorennalysebasien acht LSLYCN‐amplifiz‐gene.org) abeitmitAnn
as, die auc
diertwerde
zelllinien
n detektier
it einem u
s überexpr
vonNeuro
es Gens in
esEnzymü
, war im
ndesLSL‐Merendaufde‐MYCN;Dbhziertenhumals Pfeile. ExneleenBeck
ch für das
en.DemGe
zugeschrie
rt werden.
ungünstige
rimierten d
oblastompa
n LSL‐MYCN
überexprim
LSL‐MYCN
MYCN;Dbh‐iCerExpressio‐iCre TumomanenNeuroxpression: bers.
humane N
nUBE2Cw
eben101. A
In human
en Stadium
diese mRN
atientendi
N;Dbh‐iCre
mierten.SR
N;Dbh‐iCre
CreMausmondermRNAoren und doblastomen7blau=hoch;
Neuroblasto
wirdeinepo
Auch in LS
en Neurob
m assoziier
NA ebenfall
ent inder
Tumoren
M,einbeka
Modell eb
Erg
modellsZweAsderMYCdrei nicht‐m78undRegu; rot = nied
om bekann
ositiveRoll
SL‐MYCN;D
blastomen
rt102. Tumo
ls. Der Lak
Klinik als
zeigte, da
anntesnac
enfalls sig
gebnisse
53
ei‐dimen‐CNSigna‐malignenulationindrig. Gra‐
nt ist100,
leinder
Dbh‐iCre
ist eine
ore des
ktat‐De‐
Tumor‐
ass auch
hgeord‐
gnifikant
4.1.9.3
Die Ex
(Abb.2
tionals
vonMY
Rolle in
konnte
nen Ne
Dickkop
miR‐19
zeigten
tionvon
Abb.23(log2)MLSL‐MYC
4.1.10
Mittels
LSL‐MY
4.1.10.1
Einezw
zierten
der mi
Regulatio
Mausmod
xpression b
3).DieCar
s vonMYC
YChochreg
nderRegu
auch inTu
ebennieren
pf‐3(Dkk3)
9bundmiR
n imVergle
nDkk3.
3:ReguliertMYCNhochrYCN;Dbh‐iCre
miRNAPr
qPCR wu
YCN;Dbh‐iC
1 Expressio
LSL‐MYCN
wei‐dimens
MYCSigna
iRNAs in h
onbekannte
dells
bekannter
rbamoyl‐Ph
undMYCN
uliertesZie
ulationdes
umorende
n festgeste
)wirdinh
R‐92aandie
eichzunich
teMYCTarregulierter(eTumorenu
rofiling
urden miRN
reTumore
on einer
N;Dbh‐iCre
sionaleClu
aturhuman
humanen
erMYCNm
MYCN re
hosphatSy
Nhochregu
elistdieCy
Zellzyklus
esLSL‐MYC
llt werden
humanenN
e3’UTRerk
ht‐maligne
rgets inTu(CadundCdundnicht‐m
NA Profile
enerstellt.
Signatur
Modells
steranalys
nerNeurob
MYCN‐amp
mRNATarge
egulierter
ynthetase2
uliertesEn
yclin‐abhän
s spielt106,1
CN;Dbh‐iCr
n. Die MYC
Neuroblasto
klärt108,109.
enNebenni
morendesdk4)undMYmalignenNeb
e von fünf
MYCN re
ewurdeau
blastomed
plifizierten
etsinTum
Targets w
2(Cad)wir
nzymbesch
ngigeKinas
07.Eine sig
eModells
CN‐induzie
omzellenm
.Tumored
iereneine
sLSL‐MYCNYCNheruntebennieren.S
f nicht‐mal
egulierter
ufBasisde
urchgeführ
im Vergl
orendesLS
wurde geso
rd inversc
hrieben92,10
se4(Cdk4)
gnifikant er
imVerglei
rte Herun
mitderdire
erLSL‐MY
signifikant
N;Dbh‐iCreMerregulierterStudent‘st‐te
lignen Neb
miRNAs i
ervonMes
rt80(Abb.2
eich zu ni
Erg
SL‐MYCN;D
ondert unt
chiedenenP
04,105. Ein e
),dieeinew
rhöhteExp
chzunich
nterregulati
ektenBindu
YCN;Dbh‐iC
teHerunte
Modells Exr(Dkk3)Zietest.
bennieren
in Tumor
stdagheta
24).DieReg
icht‐amplif
gebnisse
54
Dbh‐iCre
tersucht
Publika‐
benfalls
wichtige
pression
t‐malig‐
ion von
ungvon
reMaus
rregula‐
xpressionelgenein
und elf
ren des
al. publi‐
gulation
fizierten
Neurob
stellt.
Dienich
einer e
Mäusen
Abb.24nalehievonMesRegulatihoch;roVerschi
miR‐18
LSL‐MY
nieren.
sionin
tumors
miR‐21
Tumore
blastomen,
htüberwac
eindeutigen
n.
4:RegulierterarchischeCstdaghetal.ion in MYCot=niedrig.
iedene miR
8a‐5p, mi
YCN;Dbh‐iC
Dieonkog
LSL‐MYCN
uppressive
14‐3p114,m
en eine He
aufderdi
chteCluste
n Separatio
temiRNAsClusteranaly.80inelfLSLN‐amplifizieGraphikgen
RNAs des b
iR‐19a‐3p,
reTumore
gene,direk
N;Dbh‐iCreT
er Funktio
miR‐340‐3p1
erunterreg
eMYCNSi
eranalysea
on von Neb
inTumoreysebasierenL‐MYCN;Dbherten humaneriertinZu
bekannten
miR‐20a
ensignifika
tvonMYC
Tumoren.V
n im Neur
115undmiR
gulation. W
ignaturber
anhandder
bennieren
envonLSLndaufderEh‐iCreTumoanen Neurobusammenarb
n onkogene
a‐5p, miR
anthöhere
Nreguliert
Verschiede
roblastom
R‐542‐5p67
Weitere miR
ruht,wurd
rmiRNAsd
und Tumo
L‐MYCN;DbhExpressiondorenundfünblastomen abeitmitAnn
en miR‐17‐
R‐20b‐5p,
exprimiert
te80,miR‐1
enebeschri
wie miR‐1
7,116zeigten
RNAs, die
eanhandv
derMYCNS
oren aus LS
h‐iCreMäusdermiRNAsnfnicht‐malals Pfeile80.neleenBeck
‐92 Cluster
miR‐92a
alsinnicht
181azeigte
ebenemiR
103‐3p111,
nauchinLS
im human
Erg
vonPfeilen
Signaturfü
SL‐MYCN;D
sen Zwei‐dsderMYCNlignenNebeExpression
kers.
rs110 (miR‐
‐3p) war
t‐malignen
eeineÜber
RNAsmitpo
miR‐184‐3
SL‐MYCN;D
nen Neurob
gebnisse
55
ndarge‐
ührtezu
Dbh‐iCre
imensio‐Signaturennieren.n: blau =
‐18a‐3p,
ren in
Neben‐
rexpres‐
otentiell
3p112,113,
Dbh‐iCre
blastom
gleich r
15b, m
61580.V
humane
renkei
Neurob
signifik
eineein
4.1.10.2
Die Exp
ebenfal
miR‐19
zu nich
anderen
miR‐19
Abb.25ExpressLSL‐MYC
reguliert w
miR‐30c, m
Verschiede
enNeurobl
neeindeut
blastom re
kantherunt
ndeutigeHo
2 Regulatio
LSL‐MYCN
pression b
lls untersu
9a‐3pundm
ht‐malignen
nMitgliede
9b‐3p)sign
5: Reguliertion (log2)
YCN;Dbh‐iCre
werdenwie
iR‐103, mi
enemiRNAs
lastomvon
tigeRegula
guliert. Zu
terregulier
ochregulat
on von
N;Dbh‐iCre
bekannter
ucht (Abb
miR‐92a‐3p
n Nebenni
erdesClus
ifikanthoc
teMYCNmausgewählteTumorenu
e in Tumor
iR‐140, mi
s,wiezum
nMYCindu
ation.Ande
um Beispie
t(s.4.3),w
tionzeigten
miRNAs
Mausmod
MYCN reg
.25). Eine
pinTumor
eren konn
sters(miR‐
hreguliert
miRNA Targter MYCN hundnicht‐m
ren des LS
iR‐148a, m
Beispieldi
uziertwird1
remiRNAs
el ist die
währendTu
n.
des miR‐
ells
gulierter Ta
e signifika
renvonLS
nte validier
17‐3p,miR
(Datennic
gets in Tumhochregulie
malignenNeb
SL‐MYCN;Db
miR‐326, m
iebekannt
117,zeigtei
swarenen
miR‐137 i
umoredes
‐17‐92 Cl
argets des
ante Hoch
SL‐MYCN;Db
rt werden.
R‐18a‐5p,m
htgezeigt)
moren deserter miRNAbennieren.S
bh‐iCreMo
miR‐491, m
eonkogene
nLSL‐MYC
tgegengese
n humane
LSL‐MYCN
lusters in
miR‐17‐9
regulation
bh‐iCreMä
Weiterhin
miR‐18a‐3p
.
s LSL‐MYCNAs des miRStudent‘st‐te
Erg
odells ware
miR‐500 un
emiR‐9‐5p
CN;Dbh‐iCre
etztzumhu
en Primärt
N;Dbh‐iCre
n Tumore
92 Clusters
von miR
äusenimV
n waren a
p,miR‐20a
N;Dbh‐iCreR‐17‐92 Clutest.
gebnisse
56
enmiR‐
nd miR‐
p,dieim
eTumo‐
umanen
tumoren
Modells
en des
s wurde
R‐17‐5p,
ergleich
auch die
‐5pund
Modellsusters in
4.1.11 m
Eine tu
blastom
Funktio
miRNA
auchim
Es ste
LSL‐MY
herunte
miR‐54
Express
miR‐54
siert.A
in90%
Abb.26TH‐MYCLSL‐MYC(NN).St
Aufgrun
zelllinie
wurde
Zelllinie
miR‐542a
umorsuppr
mzellen gez
onimKolon
imLSL‐MY
mmurinen
ellte sich
YCN;Dbh‐iC
erreguliert
42‐5psonie
sionvonm
42‐5pinzeh
uchindies
(miR‐542‐
6:RegulatioCN DotplotsYCN;Dbh‐iCretudent‘st‐Te
ndderbek
en und ih
deren pote
enweitera
alspotenti
ressive Fun
zeigt word
nkarzinom
YCN;Dbh‐iC
Neuroblast
heraus, d
re Mäusen
t waren. In
edrig,dass
miR‐542‐3p
hnunddie
senTumore
‐5p)bzw.7
onvonmiRs der ExpreundTH‐Mest:***=p<
kanntenRo
rer starke
entiell tum
analysiert(
ielltumorm
nktion der
den68. Auch
mnachgewie
CreModell
tommodell
dass beide
n im Vergl
n 91% der
diesenich
p in55%d
emiR‐542‐
enwarenb
76%(miR‐5
R‐542 inTuession vonYCNTumor<0,001.
ollender Is
en Regulat
morsuppres
(s.4.2).
moduliere
5p‐Isofor
h für miR‐5
esenwerde
sollteAufs
lreguliertw
e Isoform
leich zu ni
r analysier
htdetektier
derTumore
3pExpress
beideIsofo
542‐3p)so
umorende (a) miR‐5renrelativz
soformenv
tion im ne
ssive Funkt
endemiRN
m von mi
542‐3p ko
en69.DieA
schlussdar
wurde.
men der m
icht‐malign
rten Tumo
rtwerdenk
e.Weiterhi
sionin21T
rmensigni
garnichtd
rMausmod542‐5p undurExpressi
vonmiR‐54
euen LSL‐M
tion in hum
NAimNeur
R‐542 ist
nnte eine
nalyseder
rübergeben
miR‐542 i
nen Neben
ore war di
konnte.Die
nwurded
TH‐MYCNT
ifikantheru
etektierbar
delleLSL‐Md der vononnicht‐ma
42 in versc
MYCN;Dbh‐
manenNeu
Erg
roblastom
bereits in
tumorsupp
Expression
n,obdiese
in Tumor
nnieren sig
ie Expressi
esgaltauch
dieExpress
Tumorenr
unterreguli
r(Abb.26)
MYCN;Dbh‐i(b) miR‐54alignerNebe
chiedenen
‐iCre Maus
uroblastom
gebnisse
57
m
Neuro‐
pressive
ndieser
emiRNA
ren aus
gnifikant
ion von
hfürdie
sionvon
e‐analy‐
iertund
).
Creund42‐3p inennieren
Tumor‐
smodell,
men und
D4.2
N
Beide I
vonTu
nieren
konnte.
inhuma
4.2.1 E
Ineiner
profile
Dateng
aufdie
überdi
(Tab.9)
Dietumo
Neurobla
Isoformen
umoren aus
herunterr
.Indiesem
anenprimä
Expressio
rvorherige
von 69 P
generiert67
Regulation
ePatienten
).
orsuppr
astomen
dermiR‐5
s LSL‐MYCN
eguliert ge
mTeilderA
ärenNeuro
nsanalyse
enStudiew
Primärtumo
.ImRahm
ndermiR‐
nalsauchd
ressiveF
nundZe
42wurden
N;Dbh‐iCre
efunden, w
Arbeitsollte
oblastomen
evonmiR‐5
wurdensow
oren huma
endieserA
542Isofor
dasStadium
Funktio
elllinien
n bei der A
eMäusen i
was im TH
edietumo
nundZellli
542undS
wohldiem
aner Neur
Arbeitwur
rmenre‐an
mundden
onvonm
n
Analyse de
mVergleic
H‐MYCN M
rmoduliere
nienunters
urvivinin
miRNAalsa
roblastomp
rdedervor
alysiert.Ge
Verlaufder
miR‐542
ermiRNA E
ch zu nicht
ausmodell
endeFunkt
suchtwerd
humanen
auchdiem
atienten a
rhandeneD
enaueInfor
rErkranku
Erg
2inhum
Expression
t‐malignen
validiert
tiondieser
den.
nPrimärtu
mRNAExpre
anhand vo
Datensatzin
rmationen
ungwarenb
gebnisse
58
manen
nsprofile
Neben‐
werden
rmiRNA
umoren
essions‐
n qPCR
nBezug
sowohl
bekannt
Ergebnisse
59
Tab.9:Zusammensetzungder69NeuroblastompatientendermiRNAundmRNAExpres‐sions‐KohorteModifiziertnachAlthoffetal.67.
AnzahlPatienten 69
Geschlechtmännlich 37weiblich 32
AlterbeiDiagnose<1Jahr 25≥1Jahr 44
Stadium1+2 133+4 384s 18
MYCNAmplifikation
nein 53ja 16
11qWildtyp 36Deletion 16Ungleichgewicht 2
1p36Wildtyp 44Deletion 15Ungleichgewicht 6
17q Zugewinn 13
Verlauf
Rückfall 28Ereignis‐freiesÜberleben 41Tod 20Überleben 49
Ereignis‐freiesÜberleben[Tage]
Median 2283Bereich 456‐4844
Gesamt‐Überleben[Tage]
Median 2260Bereich 456‐4844
Die Expression beidermiR‐542 Isoformenwurde gegen verschiedene bekannte prog‐
nostischeMarkerderKohorteaufgetragen(Abb.27a).SowohlmiR‐542‐5palsauch‐3p
waren inTumorenvonPatienten,die spätereinenRückfall erlitten,herunterreguliert.
WeiterhinkonnteeineKorrelationzwischenniedrigermiR‐542‐5pund‐3pExpression
und hohem Stadium sowie MYCN Amplifikation gezeigt werden. Neuroblastome mit
hoherNTRK1 ExpressionwiesenerhöhteLevelbeidermiR‐542 Isoformenauf.Mittels
Kaplan‐Meier Analyse konnte gezeigtwerden, dass Patientenmit Tumorenmit hoher
miR‐542‐5p bzw. ‐3p Expression eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit eines
Ereignis‐freien Überlebens aufwiesen, als diejenigen mit niedriger Expression der
miRNAs(Abb.27b).
Abb.27Überlebren vonderExpoderohWhitneynis‐freiebzw.‐3p
ZurBes
sionspr
Datensa
fünfNe
über de
(Tab.10
Tab.10Modifizi
7Korrelatiobeninhumn 69 NeurobpressionderhneMYCNAyU‐Test:*=enÜberlebepExpression
stimmungd
rofile,diem
atzerstellt
euroblastom
en Krankh
0).
0: ZusammeiertnachSch
AnzahlPatiStadiumAlterbeiDi[Tage]
MYCNAmpTodaufgrunEreignis‐freÜberleben[
Gesamtübe[Tage]
onvonmiRmanenNeurblastompatir Tumore vomplifikation=p<0,05;*ens (EFS)von.Log‐Rank
derabsolut
mittelsNext
twurden110
menmitgü
heitsverlauf
ensetzunghulteetal.11
ienten
agnose
lifikationndvonErkreies[Tage]
rleben
‐542‐5punoblastomenenten anhanonPatienten(MNA)un**=p<0,01onPatientenTest.
tenmiR‐54
t‐Generatio
0,re‐analys
ünstigemun
f, sowie St
der Patien10.
MedianBereich
rankungMedianBereichMedianBereich
nd‐3pExprnExpressiond vorhandnmit oderdmithoher;***=p<0nmitTumo
42‐5pund
on‐Sequenz
siert.Diese
ndungüns
tadium und
nten der Ne
günstiger51456103‐961neinnein31092856‐37431092856‐374
ressionmitonvonmiR‐5dener qPCRohneRückfroderniedr0,001.(b)Kaorenmithoh
‐3pExpres
zierungine
rDatensat
tigemVerl
dMYCN A
ext‐Generat
rVerlauf
45
45
prognostis542‐5pundDaten67 (Tafall, verschirigerNTRK1aplan‐Meierherodernie
ssionwurd
einemweit
zbestanda
auf.Genau
mplifikatio
tion‐Sequen
ungünstig541045496‐4827jaja261184‐946539207‐1375
Erg
schenMark‐3pinPrimab.9). (a)Viedener Stad1Expressionr‐AnalysedeedrigermiR
enmiRNA
terenvorha
ausProfile
uereInform
on waren b
nzierungs‐K
gerVerlauf
7
5
gebnisse
60
kernundmärtumo‐Vergleichdien,mitn.Mann‐esEreig‐R‐542‐5p
Expres‐
andenen
nvonje
mationen
bekannt
Kohorte
Sowohl
Verlauf
Express
Cluster
absolut
Ergebn
Abb.28NeurobblastomExpressmiR‐542
Da in i
wurde6
qPCRD
niedrig
Scatterp
Tumore
niedrig
lationz
analysi
lmiR‐542‐
fimVerglei
sionfielnie
s,sogarin
tenExpress
is,dassdie
8:Korrelatiblastome Rmenmitgünion des mi2‐5pund‐3p
in silico A
69,sollteein
Daten der 6
gerSurvivin
plots geze
enmithoh
gerExpress
zwischenh
ertanhand
‐5p als auc
ichzuTum
edrigeraus
Neuroblas
sionsleveld
eseetwagle
onvonmiRRe‐Analyse vstigemundR‐17‐92‐Clupäquivalen
Analysen Su
neKorrelat
69Neurob
nExpressio
igt werden
hermiR‐54
siondermi
hoherSurvi
deinerKap
chmiR‐542
morenmitg
salsdieEx
stomenmit
derbeiden
eichhoche
R‐542‐5punvon Next‐Geungünstigeusters undt.
urvivin als
tionzwisch
blastompati
onundhoh
n (Abb.29
42‐3pExpre
iRNA(Abb.
ivinExpres
lan‐Meier‐A
2‐3pwaren
günstigemV
xpressiond
tgünstigem
miR‐542‐I
exprimiertw
nd‐3pExpeneration‐SemVerlauf11beider miR
s potentiel
henmiR‐54
ienten67 un
hermiR‐54
a). Außerd
essionsign
.29b).Wei
ssionunds
Analyse(A
n inNeuro
Verlaufher
dermiRNA
mVerlauf(
Isoformenu
wurden(A
ressionmitequenzierun10 (Tab.10)R‐542‐Isofor
les Ziel fü
42‐3pundS
ntersuchtw
42‐3pExpr
dem war d
nifikantnie
iterhinbest
schlechtere
Abb.29c).
oblastomen
runterregul
sdesonko
(Abb.28a).
untereinan
bb.28b).
tgünstigemngs‐Daten v.(a)Darstermen. (b)Ex
ür miR‐542
Survivinin
werden. Di
ressionkon
die Survivi
edrigerals
tandeines
emÜberleb
Erg
nmit ungü
liert.Ihrea
ogenenmiR
.EinVergle
nderführte
mVerlaufhvon je fünfellungderaxpressionsle
2‐3p vorhe
ndenvorha
ie Korrelat
nnteanhan
in Express
vonTumo
signifikante
benderPa
gebnisse
61
nstigem
absolute
R‐17‐92‐
eichder
ezudem
humanerf Neuro‐bsolutenevel von
ergesagt
andenen
tion von
ndeines
ion von
orenmit
eKorre‐
atienten,
Abb.29derExphandeneniedrigeMeier‐ArigerSu
4.2.2 F
Dieim
LSL‐MY
miRNA
Überpr
humane
Eine fü
mende
BEund
tenmit
normal
mitder
tät übe
Reaktio
zeigten
bilitätü
allerun
9:Korrelatipressionvoner qPCR Daer SurvivinAnalysedesrvivinExpre
Funktionv
Vergleichz
YCN;Dbh‐iC
einetumo
rüfung dies
enNeurobl
ürkeinemi
ermiR‐542
dWACIIex
ttelsdesM
lisiert und
rNegativko
er die Zeit
onen. Währ
n, führtedie
überdieZe
ntersuchten
ionvonmiRnmiR‐542‐3aten67 (TabExpressionEreignis‐freession.Log‐
vonmiR‐5
zumKontr
reModell
orsuppress
ser Hypoth
lastomzelll
iRNAkodie
wurdenin
primiert.D
TTAssayg
gegendie
ontroll‐miR
auf.Die Ex
rend IMR‐
eExpressio
eit.DieExp
nZelllinien
R‐542‐3pu3pundSurvb.9). (a/b)anhand voeiesÜberlebRankTest.
542‐3pExp
rollgewebe
und inhum
iveFunktio
hese wurde
liniendurch
erendeNeg
ndenhuma
Dierelative
gemessen,
Zeit aufge
RNAtransfi
xpression v
32, SK‐N‐B
oninSHEP
pressionde
nimVerglei
undSurvivivivinmRNAKorrelationn Scatter‐ ubensvonNe
pressionin
niedrigeE
manenPrim
onimNeu
en verschie
hgeführt.
gativkontro
anenNeuro
eZellviabili
aufden24
etragen (Ab
ziertwurd
vonmiR‐5
BE undWA
Pzueiner
ermiR‐542
ichzurNeg
in inhumainhumanenn von hoheund Boxploeuroblastom
nZelllinien
Expression
märtumore
roblastom
edene in v
oll‐miRNA
oblastomze
itätwurde
4Std.Wert
bb.30). All
en,wiesen
42‐5p führ
ACII keine
signifikant
2‐3phingeg
gativkontro
nenNeuronNeuroblaser miR‐542‐t. Student‘smpatientenm
n
vonmiR‐5
en ließver
habenkön
vitro Versu
odereined
elllinienIM
zuverschi
tderNegat
e analysier
Steigerung
rte zu Zelll
Reduktion
enVerring
genverring
oll‐miRNAs
Erg
oblastomenstomenanh‐3p Express t‐Test. (c)mithoheru
542‐5pund
rmuten,da
nnte.Zurw
uche in eta
derbeiden
MR‐32,SHEP
iedenenZe
tivkontroll
rtenZelllin
genderZel
linien‐spez
n der Zellv
gerungder
gertedieV
signifikant
gebnisse
62
Analyseandvor‐sion mitKaplan‐
undnied‐
d‐3pim
ssdiese
weiteren
blierten
n Isofor‐
P,SK‐N‐
eitpunk‐
‐miRNA
nien, die
llviabili‐
zifischen
viabilität
Zellvia‐
Viabilität
.
Abb.30miR‐54SHEP,SMessungmiR‐542
Zur gen
durchm
Transfe
Zellena
menmi
exprim
Express
nachTr
lichwie
0: Redukti42‐3pExpreK‐N‐BEundgderZellvi2‐5poder‐3
naueren U
miR‐542‐3p
ektion dur
amstärkst
iR‐542‐3p
ierendenZ
sion vonm
ransfektion
emitmiR‐5
ion der VessionTrandWACIImitabilitätanh3pgegenNK
Untersuchun
pExpressi
rchgeführt,
tenverring
exprimiere
Zelleneine
miR‐542‐5p
nmitNegat
542‐3p(Ab
ViabilitätsienteTranstNegativkonanddesMTKberechnet
ng der Me
onzugrun
da zu die
gertwerden
enderZelle
deutlichve
p zeigten N
tivkontroll
bb.31).
von humsfektionderntroll‐miRNTTAssay.Ananhandeine
echanismen
de liegen,
esem Zeitp
nkonnte.A
nkonnteim
erringerteK
Neuroblasto
‐miRNA,je
manen NeurhumanenNNA(NK),miRngegebenepesPermutat
n, die der
wurdenw
punkt die
Anhandvo
mVergleich
Konfluenz
omzellen e
edochward
uroblastomNeuroblastoR‐542‐5podp‐Wertefürtionstests.
Reduktion
eitereAnal
Viabilität
onmakrosk
hzurNegat
festgestellt
eine gering
derEffekth
Erg
mzelllinienomzellliniendermiR‐542rdieSignifik
n der Zellv
lysen96St
aller analy
kopischen
tivkontroll
twerden.A
gere Konflu
hiernichts
gebnisse
63
mittelsnIMR‐32,2‐3pundkanzvon
viabilität
td.nach
ysierten
Aufnah‐
‐miRNA
Auchbei
uenz als
sodeut‐
Abb.31Mikrosktroll‐miR
Weiterh
untersu
Negativ
subG1‐
Express
Zellen
(G2/M)
inkein
Zellzyk
nienein
IMR‐32
ging. E
werden
1: ReduzierkopischeAuRNA(NK),m
hinwurde
ucht.Währ
vkontroll‐m
Phase,dem
sion von m
in den Zel
)wurdena
erder ana
klus‐Fraktio
nesignifika
2,SHEPund
ine tenden
n.
rte KonfluefnahmenvomiR‐542‐5p
mittelsDu
renddieEx
miRNA zu
mnachmutm
miR‐542‐5p
lzyklus‐Ph
alsBalkend
alysiertenZ
onen.Dahin
anteSteiger
dWACIIZe
nziell verri
enz von NonNeuroblaodermiR‐5
urchflusszyt
xpressionv
einer sign
maßlichap
p aus (Dat
asen Postm
dargestellt
Zelllinien z
ngegenwu
rungderFr
ellenmitei
ngerte G1‐
Neuroblastoastomzellen542‐3p.Maß
tometried
vonmiR‐54
nifikant ges
poptotische
ten nicht g
mitose (G1
(Abb.32).
zueiner sig
urde inalle
raktionvon
nersignifik
‐Phase kon
omzellen n96Std.nach
ßstabsbalken
derZellzykl
42‐3p imV
steigerten
enZellen,f
gezeigt). D
1), Synthes
DieExpres
gnifikanten
enmitmiR
nZellenin
kantenRed
nnte auch
nach miR‐5hTransfektn=200µm.
us96Std.
Vergleichz
Fraktion v
führte,blieb
ie prozent
e (S) und
ssionvonm
nVeränderu
‐542‐3ptr
derS‐Phas
duktionder
in SK‐N‐BE
Erg
542‐3p ExptionmitNeg
nachTran
zurExpress
von Zellen
bdieserEf
tualen Ant
Prämitose
miR‐542‐5p
ungder ei
ransfizierte
sedetektier
rG1‐Phase
E Zellen v
gebnisse
64
pressiongativkon‐
sfektion
sionder
n in der
ffektbei
eile der
/Mitose
pführte
nzelnen
enZellli‐
rt,diein
einher‐
ermutet
Abb.32nachmkontroll(Postmit‐Test:*
Dierela
Isoform
untersu
scher Z
Zellpro
nahm9
währen
erreich
Abb.33nachm(NK),mgemessezuNK,g**=p<
2:VerschiebmiR‐542‐3pl‐miRNA (Ntose), S (Sy*=p<0,05;
ativeAnzah
menimVer
ucht.DieB
Zellen, wäh
liferation,
96Std.nach
nd ein dera
twurde(A
3:InduktionmiR‐542‐3pmiR‐542‐5penmittelsCgemessenan0,01;***=p
bung des ZExpression
NK), miR‐54ynthese) un**=p<0,0
hlapoptoti
rgleichzur
ehandlung
hrend mit
dieanhand
hmiR‐542‐
artiger Effe
Abb.33b).
nvonApopExpressionoder ‐3p. (aCelldeathELnhandvonEp<0,001.
Zellzyklus dn Analyse d42‐5p odernd G2/M (P1.
scherZelle
Negativkon
mitmiR‐5
miR‐542‐5
dderELISA
‐3pExpres
ekt bei Exp
ptoseundRn Analyse 9a)BalkendiLISA.(c)BalELISA‐basier
durch gestdes Zellzyklu‐3p. AnteilPrämitose u
enwurde9
ntroll‐miRN
542‐3pind
5p kein Ef
A‐basierten
sioninalle
pression v
Reduktionv96Std. nachagrammdelkendiagramrterBrdUIn
teigerte S‐Pus 96Std. n der Zellenund Mitose)
96Std.nach
NAanhand
uziertesig
ffekt detek
nBrdUInk
enanalysie
onmiR‐54
vonProliferhTransfektier Zahl apopmmderZahnkorporation
Phase inNenach Transfen in den Ze als Prozen
hExpressio
ddesELISA
nifikantde
ktiert wurd
orporation
rtenZelllin
42‐5p nur i
rationinNeon vonNegptotischer Zlproliferiern.Student‘s
Erg
euroblastofektion vonellzyklus‐Phnt‐Balken. S
onbeiderm
ACelldeath
enAnteilap
de (Abb.33
ngemessen
niensignifi
in SK‐N‐BE
euroblastogativkontrolZellen relativrenderZellet‐Test:*=
gebnisse
65
mzellenNegativ‐hasen G1Student‘s
miR‐542
hAssays
poptoti‐
3a). Die
nwurde,
kantab,
E Zellen
omzellenll‐miRNAv zuNK,enrelativp<0,05;
Ergebnisse
66
4.2.3 RegulationderExpressionvonSurvivindurchmiR‐542‐3p
Die 3’UTR von Survivin weist eine Bindestelle für miR‐542‐3p auf, die schon in der
Adenokarzinomzelllinie A549 und der Brustkrebszelllinie MCF7 validiert wurde69. In
diesemTeilderArbeitsolltedieRegulationvonSurvivindurchmiR‐542‐3pinhumanen
Neuroblastomzellen validiert werden. Dazu wurden Negativkontroll‐miRNA,
miR‐542‐5p oder miR‐542‐3p transient in IMR‐32, SHEP, SK‐N‐BE undWACII Zellen
exprimiertunddieExpressionvonSurvivin96Std.nachTransfektionuntersucht.
DieSurvivinmRNAExpressionvonmiR‐542‐5pbzw.‐3pexprimierendenZellenwurde
relativ zu Negativkontroll‐miRNA exprimierenden aufgetragen. Die Expression von
miR‐542‐3p führte zu einer signifikanten Reduktion von Survivin mRNA in IMR‐32,
SHEPundWACIIZellenundinSK‐N‐BEZellenkonnteeineTendenzzurHerunterregula‐
tionvonSurvivinmRNAgezeigtwerden. ImGegensatzdazuzeigtedieExpressionvon
miR‐542‐5pkeinenEffektaufdieSurvivinExpression(Abb.34a).InWesternBlotAnaly‐
sen wurden zum einen das Protein Survivin und zum anderen der Komplexpartner
AURKB detektiert. Anhand der Ladungskontrolle Aktin konnte eine ungleichmäßige
BeladungderGeleausgeschlossenwerden.SowohldieProteinexpressionvonSurvivin
als auch die von AURKB wurden nach Expression von miR‐542‐3p im Vergleich zur
Negativkontroll‐miRNA deutlich herunterreguliert, während dieser Effekt mit
miR‐542‐5p nicht erreicht wurde (Abb.34b). In Immunfluoreszenzfärbungen wurde
DAPIeingesetzt,umdieZellkernenachBehandlungmitderNegativkontrolleodermiR‐
542‐3p anzufärben. Die Konfluenz der Zellen nach Transfektionmit miR‐542‐3p war
geringeralsnachBehandlungmitderNegativkontroll‐miRNA,einEffekt,der schon in
vorherigen Versuchen (Abb.31) gezeigt werden konnte. Sowohl Survivin als auch
AURKBwurde inallenmitNegativkontroll‐miRNAbehandeltenZellendetektiert.Nach
ExpressionvonmiR‐542‐3pdagegenwardieExpressionbeiderProteinedeutlichver‐
ringert(Abb.34c).
Abb.34pressiomiRNAt‐Test: *nachExzenz‐FäNKoderstabsbal
4.2.4 D
Anhand
gulation
miR‐54
Vektore
Vektore
HEK‐29
mit der
sowohl
DieAkt
als Tra
4:Herunteron (a)Survi(NK), detek*=p<0,05;xpressionvorbung vonrmiR‐542‐3lken=50µm
DirekteBi
dvonLuzif
nvonSurv
42‐3pandi
en enthielt
ensomutie
93undSHE
r Negativk
ldieAktivit
tivitätder
ansfektions
rregulationvinmRNAnktiert mitte **=p<0,0onNK,miR‐Survivin (A3pExpressiom.
indungvon
feraseRepo
ivinnachd
e3’UTRvo
ten die 3’U
ert,dassdi
EPZellenw
kontroll‐mi
tätderSee
Glühwürm
kontrolle e
n von SurvinachmiR‐54els qPCR un01. (b)Wes‐542‐5podelexa‐Fluor‐4on.Zellkern
nmiR‐542
orterAnaly
derExpress
onSurvivin
UTR von Su
evorherge
wurdenmit
RNA oder
feder‐alsa
mchen‐Luzif
exprimiert
ivin in Neu42‐5pundnd normalistern Blot Aer ‐3p.Aktin488 ‐ grün)neimselben
2‐3panSu
ysensollte
sionvonmi
zurückgef
urvivin, je
esagteBind
jeweilsein
miR‐542‐
auchdiede
ferasewur
t wurde, no
uroblastom‐3pExpresssiert gegenAnalyse dernalsLadunundAURKnFeldmitte
rvivin3‘UT
untersucht
iR‐542‐3p
führtwerde
doch war
destelleder
nemderbe
3p kotrans
erGlühwür
rdeaufdie
ormalisiert
mzellen nacsion relativGAPDH ExProteine Sugskontrolle
KB (Alexa‐FluelsDAPI(bla
TR
twerden,o
aufeinedir
enkonnte.
diese auf
rmiR‐542‐
idenVekto
sfiziert. Na
rmchen‐Luz
derSeefed
t. Die norm
Erg
chmiR‐542zuNegativkxpression. Survivin und.(c) Immunuor‐568 ‐ rau)angefär
obdieHeru
rekteBind
BeidePsi‐
einem der
3pzerstört
orenunden
ach 48Std
ziferasege
der‐Luzifer
mierte Glüh
gebnisse
67
2‐3p Ex‐kontroll‐Student‘sd AURKBnfluores‐rot) nachrbt.Maß‐
unterre‐
ungvon
Check2‐
r beiden
tvorlag.
ntweder
. wurde
messen.
rase,die
hwürm‐
chen‐Lu
relativ
Reporte
Reporte
kantre
mutiert
3pand
Abb.35undSHEtyp‐ odechen‐LuStudent
4.2.5 F
Einedir
deneH
sollte u
Neurob
gen mi
Zellenw
gegenS
siSurviv
Wester
express
siRNAh
uziferase‐A
zur Aktivi
ergen‐Aktiv
ergen‐Aktiv
eduziert.Im
tenBindest
die3’UTRv
5:DirekteBEPZellenener mutierteuziferase‐Akt‘st‐Test:**
Funktionv
rekteBind
Herunterreg
untersucht
blastomzell
t sich brin
wurdenen
Survivin(s
vin wurde
rnBlotanal
sionvonSu
herunterre
Aktivität,di
ität nach
vität).Sow
vitätbeiK
mGegensat
tellenichtg
onSurvivin
Bindungvontwedermiten Survivinktivitätnach=p<0,01;*
vonSurviv
ungvonm
gulationvo
werden, o
llinienIMR
ngen würd
twedermit
iSurvivin)
die Expre
lysiert,wob
urvivin, als
guliertwer
iebeiExpr
Negativkon
wohl inHEK
Kotransfekt
tzdazu,kon
gezeigtwer
nkonnteda
onmiR‐542tNegativkon3’UTR trageh48Std.und***=p<0,0
vinHerunt
iR‐542‐3p
onSurvivin
ob eine He
R‐32,SHEP,
e, die dene
teinerNeg
transient t
ession des
beiGAPDH
sauchdie
rden(Abb.
ressionvon
ntroll‐miRN
K‐293alsa
tionmit de
nntediese
rden(Abb.
amitvalidie
2‐3panSurntroll‐miRNenden LuzifdNormalisi001.
terregulat
andas3’U
nmRNAun
erunterreg
,SK‐N‐BEu
en der miR
gativkontro
transfiziert
Proteins
HalsLadun
desKomp
36).
nmiR‐542‐
NA Transfe
auch inSHE
emWildtyp
rEffektbe
35).Diedi
ertwerden
rvivin3‘UTNA(NK)odeferase Repoerunggegen
tioninZell
UTRvonSu
ndProtein
ulation vo
undWACII
R‐542‐3p E
oll‐siRNAo
t.ZurÜber
48Std. na
ngskontroll
lexpartner
‐3pberech
ektion aufg
EPZellenw
p3’UTRvo
iderKotra
irekteBind
.
RKotransfeermiR‐542‐3orter. MessunSeefeder‐L
llinien
rvivinund
konntegez
n Survivin
phänotypi
Expression
dereiners
rprüfungde
ch der Tra
ediente.So
sAURKBk
Erg
hnetwurde
fgetragen (
wurdedie
on Survivin
ansfektion
dungvonm
ektionvonH3pundeineung der GlüLuziferase‐A
diedamit
zeigtwerd
n in den hu
ischeVerän
n entspräch
spezifische
erEffektiv
ansfektion
owohldieP
konntemit
gebnisse
68
e,wurde
(relative
relative
n signifi‐
mitder
miR‐542‐
HEK‐293emWild‐ühwürm‐Aktivität.
verbun‐
en.Nun
umanen
nderun‐
hen. Die
nsiRNA
vitätvon
mittels
Protein‐
ttelsder
Abb.36von SusiRNA WExpressAURKBTransfekzellliniesiRNAsiRNAgGAPDH
Die Via
wurde
Negativ
aufwies
beider
nienals
Abb.37regulat(NK)odvivingeDieTra
troll‐siR
Apopto
Phasen
6: Spezifiscurvivin PrWestern Bloion von48Std. naktion vonn mit Ne(NK) ode
gegenSurvivalsLadungs
abilität der
mittels MT
vkontroll‐si
sen,zeigten
Datensätze
ssignifikan
7: ReduktioionvonSudersiRNAgegenNKbere
ansfektion
RNAzuein
osehinwies
n G1, S und
che Reduktrotein mittot AnalyseSurvivin uach transienNeuroblastoegativ‐kontrr spezifiscvin(siSurvivskontrolle.
r Zellen na
TT Assay
iRNA trans
ndiemits
ebeschrieb
ntverschied
on der ViaurvivinMTTegenSurviviechnetanha
von siSurv
nemsignifik
s(Datenni
d G2/M (A
tiontelsderundnterom‐roll‐chervin).
ch Transfe
untersucht
sfizierte Ze
siSurvivinb
bdenVerla
den(Abb.3
abilität huTAssaynachin(siSurviviandeinesPe
vivin führte
kantenAns
chtgezeigt
Abb.38) so
ektionmit
t und gege
ellen einen
behandelte
aufderGra
37).
umaner Nehtransientein).Angegebermutations
e imVergl
stiegdersu
t).Weiterh
owohl in IM
Negativko
en die Zeit
n Anstieg i
enZellenei
apheninne
euroblastomerTransfekbenep‐WertestsPermu
eich zurTr
ubG1Phas
hinkonnte
MR‐32 und
ntroll‐siRN
t aufgetrag
hrer Viabil
ineRedukt
rhalbdera
mzelllinientionmitNetefürdieSiutationstest.
ransfektion
e,dieaufe
beiVerglei
d SHEP als
Erg
NA bzw. siS
gen. Währe
lität über
tion.DerV
analysierte
durch Heegativkontroignifikanzvo.
n vonNega
eineIndukt
ichderZel
s auch in S
gebnisse
69
Survivin
end mit
die Zeit
ergleich
enZellli‐
erunter‐oll‐siRNAonsiSur‐
ativkon‐
tionvon
llzyklus‐
SK‐N‐BE
Zellene
Phase d
SHEPu
Phase.
Abb.38Neurobverschietransien(siSurvi
Der Eff
siRNA
analysi
signifik
einesignifi
detektiert
undWACIIZ
8: Verschieblastomzelledenen Phanter Transfvin).Studen
fekt auf di
wure anh
erten Zell
kanterRedu
ikanteStei
werden. W
Zellenreag
ebung desen nachHasen des Zfektion vonnt’st‐Test:*
ie Zellproli
hand der
llinien rea
uktionder
gerungder
WACII Zelle
giertenauß
s ZellzykluerunterregZellzyklus. An Negativk=p<0,05;
iferation n
ELISA‐bas
agierten a
Zellprolifer
rS‐Phasem
en zeigten
ßerdemmit
us durchgulation voAnalyse mkontroll‐siR***=p<0,0
nach siSurv
sierten Brd
auf die H
ration(Abb
AbhuHeInTr(NSt**
miteinherg
n eine Ten
teinemsign
gesteigerton Survivinittels DurcNA (NK)001.
vivin im V
dU‐Inkorpo
Herunterreg
b.39).
bb.39: Reumaner NeerunterregnkorporationransfektionNK)odersiRtudent‘s t‐T**=p<0,00
gehenderR
denz zur e
nifikantenA
te S‐ bzw Fraktionenhflusszytomoder siRN
ergleich zu
oration er
gulation v
eduktioneuroblastomgulation von von Ze
mit NeRNAgegenSTest: *=p<1.
Erg
Reduktion
erhöhten S
Anstiegde
w. G2/M‐Phn von Zellenmetrie 96StNA gegen
u Negativk
rmittelt. A
von Surviv
der Prolimzelllinienon Survivinellen 96Stdegativkontrourvivin(siS<0,05; **=
gebnisse
70
derG1‐
S‐Phase.
rG2/M‐
hase inn in dentd. nachSurvivin
kontroll‐
lle vier
vin mit
ferationn durchn BrdU‐d. nacholl‐siRNAurvivin).p<0,01;
4.2.6 P
m
DieHer
Neurob
Prolifer
Herunt
Zusamm
Herunt
miR‐54
Einzelz
Konstru
(SHEP‐
induzie
24Std.
ten un
(Abb.4
Gesamt
wurde.
ternBlo
Abb.40SurvivinBlot AnTetrazykhandluneinemmitGFP(SHEP‐S
Diegen
mitTet
tivkont
wurde
einer s
Tetrazy
Dieglei
Partielle
mittelsHo
runterregu
blastomzell
ration.Dies
erregulatio
menhangz
erregulatio
42‐3penthi
zellklone se
ukt,jedoch
GFP). Die
ert werden
nachTetra
d zum SH
0).Aufgrun
tproteinme
Innicht‐in
ots(Abb.3
0: Survivinn nach Indnalyse derklin‐ (TET)ng von stabTetrazyklinP (SHEP‐GFPSurvivin).
neriertenZ
trazyklino
troll‐miRNA
dieZellviab
signifikant
yklin behan
ichzeitigeE
Wiederhe
ochregulat
ulationvon
llinien zu
serPhänoty
on von Sur
zwischend
on bestand
ielt,stabilm
elektiert (
hmiteiner
Expression
n. MittelsW
azyklin‐Beh
HEP‐GFP‐Kl
ndderhoh
enge gearb
nduzierten
4undAbb.
n ÜberexduktionmitSurvivin Ex bzw. Lösubil‐transfizien‐ induzierbP)oderSurv
ZellkloneSH
oderdemL
Aodermit
bilitätaller
reduzierte
ndelt oder
Expression
erstellung
tionvonSu
Survivinm
erhöhter
ypähnelte
rvivin einh
emPhänot
d. Dazu w
mittelseine
SHEP‐Surv
cDNAfürG
n beider cD
Western Blo
handlungin
lon ermitt
henIndukti
beitet wer
SHEP‐Zell
36)nurei
xpressiont Tetrazyklxpression 2ungsmittel‐erten SHEPbaren Vektvivin cDNA
HEP‐GFPu
Lösungsmit
tmiR‐542‐
rAnsätzeb
en Zellviab
nicht, und
derSurviv
des Phän
urvivinoh
mittelssiRN
Apoptose
demderE
herging. Es
typdermi
wurde Surv
esVektorsy
vivin). Ein
GFPstattS
DNAs konn
ot wurde d
nSHEP‐Su
telt, wobei
onvonSur
rden, die
enwardes
inegeringe
in SHEPlinWestern24Std. nach(EtOH) BeP‐Zellen mitorkonstrukohne3’UTR
undSHEP‐S
ttelEthano
3p transien
estimmt.D
bilität des
d des unbe
vincDNAoh
notyps de
hnemiRNA
NAführtei
und ver
Expression
sollte nun
R‐542‐3pE
vivin cDNA
ystemsinS
Negativkon
Survivintru
nte durch
die Indukt
rvivinimV
GAPDH a
rvivinkonn
in vorher
shalb imV
SurvivinE
‐nh‐ttR
Survivinwu
olbehandel
nt transfizi
DieExpress
SHEP‐GFP
handelten
hneBindes
er miR‐54
A‐Bindeste
ndenanal
ringerter
vonmiR‐5
n untersuch
Expression
A, die kein
SHEPZelle
ntroll‐Klon
ug,wurdee
Behandlun
ion der Su
Vergleichzu
als Ladung
ntenurmit
igen Versu
Vergleichzu
Expression
urdenüber
ltundgleic
iert.Mittel
ionvonmi
P‐Klons, un
SHEP‐Surv
tellefürdie
Erg
42‐3p Exp
elle
lysiertenhu
Zellviabilit
42‐3p,der
ht werden
nundderS
ne Bindest
eneingebra
n, der das
ebenfallsge
ng mit Tetr
urvivin Exp
umnicht‐in
gskontrolle
teinemFün
uchen ver
uvorherige
detektierb
r96Std.en
chzeitigm
lsdesMTT
iR‐542‐3pg
nabhängig
vivin‐Klons
emiRNAu
gebnisse
71
ression
umanen
tät und
mitder
, ob ein
Survivin
telle für
achtund
gleiche
eneriert
razyklin
pression
nduzier‐
e diente
nftelder
rwendet
enWes‐
ar.
ntweder
itNega‐
TAssays
gingmit
ob mit
einher.
ndmiR‐
542‐3p
ringerte
4.2.7 M
N
Zusätzl
blastom
diealsX
einems
kel als
sphäris
Potenti
keine s
geladen
p führte zw
enZellviab
MiR‐542‐3
Neuroblas
ich zumN
mzelllinien
Xenografts
sofortigen
Transpor
schundha
ial betrug
strukturelle
nenNanopa
war imVerg
bilität,jedoc
3p belad
stomzellen
achweis de
in vitro, so
inMäusen
Abbauder
ter verwe
atten einen
+37mV.
en Untersc
artikelnfes
gleich zur
chwardies
dene Na
ninvitrou
er tumorsu
ollte diese
ninvivowu
selbenführ
ndet84,85. D
mittleren
Anhand e
chiede zwis
stgestelltw
Negativkon
serEffektn
anopartike
undinvivo
uppressive
auch inN
uchsen.Da
renwürde
Die versch
Durchmes
elektronenm
schen Neg
werden(Ab
ANA(t
ntroll‐miRN
nichtsignifi
Abb.4lungmittelvin ohMTT Avonoder mTetraztel‐ (EZellentor‐kooderSBindesdent‘s***=p
el zur
nFunktion
euroblasto
dieInjektio
,wurdenC
hieden bela
sser vonw
mikroskopi
gativkontro
b.42).
Abb.42:StrNanopartikAufnahmen(NK)undmtikeln.Graph
NA zu eine
ikant(Abb.
41: Partielldes miR‐5lsÜberexprhne miR‐5Assay 96 StNegativkonmiR‐542‐3pzyklin‐ (TETEtOH) Behamit einemnstrukt miSurvivincDNstelle (SH
t‐Tesp<0,001.
miRNA‐Be
nvonmiR‐
omzellen un
onvonmiR
Calcium‐Pho
adenen Na
weniger als
ischer Auf
ll‐miRNA‐
rukturvonkelnElektrovon Nega
iR‐542‐3p‐bhikerstelltv
Erg
er tendenz
.41).
le Wiederh542‐3p Phressionvo542‐3p Bintd. nach Exntroll‐miRNAp und gleichT)bzw. Lösuandlung voninduzierbait GFP (SHNAohnemiRHEP‐Survivinst: *=
ehandlung
‐542‐3p in
ntersuchtw
RNAindieM
osphat‐Nan
anopartikel
200nm. Ih
fnahmen k
und miR‐
miRNA‐beonenmikroskativkontrollbeladenenNvonDianaK
gebnisse
72
iell ver‐
her‐stel‐änotypsnSurvi‐ndestellexpressionA (NK)hzeitigerungsmit‐n SHEP‐renVek‐HEP‐GFP)R‐542‐3pn). Stu‐p<0,05;
g von
nNeuro‐
werden,
Mauszu
noparti‐
l waren
hr Zeta‐
konnten
542‐3p‐
ladenenkopische‐miRNA‐Nanopar‐Kozlova.
Ergebnisse
73
Zur Untersuchung der Funktionalität der Nanopartikel in vitro wurden WACII Zellen
ausgewählt,dadieseindenvorherigentransientenTransfektionenamstärkstenaufdie
Expression der miR‐542‐3p reagiert hatten. Die Zellen wurden mit Negativkontroll‐
miRNA‐ oder miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln behandelt und der Effekt auf die
Zellen inverschiedenenAssaysuntersucht.DierelativeZellviabilität,gemessenmittels
MTTAssay,wurdeanverschiedenenZeitpunktendetektiert,aufden24Std.Wertunbe‐
handelterZellennormalisiertundgegendieZeitaufgetragen.DieBehandlungmitNega‐
tivkontroll‐miRNA beladenen Nanopartikeln führte im Vergleich zu unbehandelten
Zellen tendenziell zu einer Reduktion der Zellviabilität über die Zeit, die jedoch nicht
signifikantwar.WährenddessenverringertedieBehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenen
NanopartikelndieViabilitätderZellensignifikant,sowohlimVergleichzuunbehandel‐
tenalsauchzumitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopartikelnbehandeltenZellen
(Abb.43a). Der Anteil apoptotischer Zellen wurde 96Std. nach Behandlung mit den
verschieden beladenen Nanopartikeln anhand des ELISA Cell deathAssay untersucht.
WieschonbeiderAnalysederZellviabilitätwurdeauchindiesemAssayeintendenziel‐
ler Effekt der mit Negativkontroll‐miRNA beladenen Nanopartikel beobachtet, der
jedoch nicht das Signifikanzniveau erreichte. Dagegen reagierten die Zellen bei Be‐
handlungmitmiR‐542‐3p beladenen Nanopartikelnmit einer signifikanten Induktion
vonApoptose,sowohlimVergleichzuunbehandeltenZellenalsauchzumitNegativkon‐
troll‐miRNA behandelten Zellen (Abb.43b). Die Abnahme der BrdU Inkorporation bei
mitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikelnwarimVergleichzuallenKontrollensignifi‐
kantvermindert.AllerdingszeigtendiemitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopar‐
tikelbereitseinesignifikantverminderteBrdUInkorporationimVergleichzuunbehan‐
delten Zellen (Abb.43c). Die Funktionalität der miR‐542‐3p Expression nach
BehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikeln inWACII Zellenwurde anhand
derExpressiondesZielproteins Survivin analysiert. EineWesternBlotAnalyse zeigte,
dass dieBehandlungmitmiR‐542‐3p‐beladenenNanopartikeln imVergleich zu unbe‐
handelten und mit Negativkontroll‐miRNA behandelten Zellen zu einer deutlichen
HerunterregulationderSurvivinProteinexpressionführte(Abb.43d).DieSpezifitätder
miR‐542‐3p Expression durch Behandlung mit miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln
invitrokonntesomitbewiesenwerden.
Abb.43HerunteZellenNanopaanhandgrammgemessedelten KELISA‐bSurvivin
ZurUnt
Xenogr
Negativ
und die
mittels
miR‐54
behand
t‐Test:
relativ
gen. Im
more i
signifik
542‐3p
InWes
3:Reduktioerregulatioin vitro Bertikeln.(a)desMTT Ades zur unenanhanddKontrolle rebasierter Brnnach48St
tersuchung
afts in nu/
vkontroll‐m
e Leber so
qPCR gem
42‐3p‐beha
deltereine
p=0,006;
zu der Exp
mMittelwa
im Verglei
kanterhöht
pwurdeanh
tern Blot A
onderZellvon von Surehandlung mZellviabilitäAssay. SignifnbehandeltendesELISACelativen AntdU Inkorpotd.*=p<0,0
gdesEffekt
/nuMäuse
miRNA‐ als
owie die T
messen un
andelter Le
200‐fache
Datennich
pression e
ardiemiR‐
ch zu mit
t(Abb.44a
handdesE
Analysen k
viabilitätunrvivinmittemit Negativätrelativzufikanz berecn KontrolleCelldeath.Stteil proliferoration. Stud05;**=p<0
tsdersynt
nwuchsen
auchmit
Tumore ana
nd gegen d
eber konnt
erhöhteExp
ht gezeigt)
ines derm
‐542‐3pEx
t Negativko
).DieFunk
Einflussesa
konnte eine
ndderProelsmiR‐54vkontroll‐miu24Std.Wechnet anhane relativen Atudent‘st‐Terierender Zedent‘s t‐Tes0,01;***=p
thetisierten
n,wurden
miR‐542‐3
alysiert. D
die Expres
te im Verg
pressionde
.DiemiR‐
mit Negativ
xpressiond
ontroll‐miR
ktionalität
aufdieExp
e reduziert
oliferation,2‐3p‐beladiRNA‐ (NK)ertderunbend eines PeAnteils apopest.(c)Balkellen nach 9st. (c) Westp<0,001.
nNanopart
Xenograft‐
3p‐beladen
ie Express
sion von R
gleich zu
ermiRNAd
542‐3pEx
vkontroll‐m
dermitdie
RNA behan
derinden
ressiondes
te Express
InduktiondenenNano oder miR‐ehandeltenKermutationsptotischer Zkendiagramm96 Std., gemtern Blot An
tikelaufWA
‐tragendeM
nen Nanopa
sion von m
RNU6B no
mit Negati
detektiertw
pressiond
miRNA beha
esermiRNA
ndelten Tu
Tumorene
sTargetsS
ion des Su
Erg
vonApoptopartikel in‐542‐3p‐ beKontrolle,gtest. (b)BaZellen nachmdeszurumessen anhnalyse des
ACIIZellen
Mäuse sow
artikeln be
miR‐542‐3p
ormalisiert.
ivkontroll‐
werden(St
derTumore
andelten a
Abehandel
umoren 25
exprimiert
Survivinge
urvivin Pro
gebnisse
74
toseundnWACIIeladenenemessenalkendia‐96 Std.,
unbehan‐hand vonProteins
n,dieals
wohlmit
ehandelt
p wurde
. In mit
miRNA‐
tudent‘s
ewurde
ufgetra‐
ltenTu‐
5,8‐fach,
tenmiR‐
messen.
oteins in
mit mi
Ladung
Abb.44miRNA‐miR‐542behandeWesterntrolle.
Die tum
scher S
Tumore
spezifis
(Abb.4
Schnitt
wiesen
miRNA
derapo
rer Ant
miRNA
Zellen w
Tumors
relativ
tragen.
Negativ
Anteila
(Abb.4
R‐542‐3p‐b
gskontrolle
4: Expressi‐beladenen2‐3p in miteltenNeuronBlotAnaly
morsuppre
Schnitte de
en analysi
schen klei
5a).Weite
enangefär
wesentlich
behandelt
optotischen
teil apopto
behandelt
wurde rela
sausgezäh
zudenenv
Die Zellpr
vkontroll‐m
apoptotisch
5c).
beladenen
dienteGAP
ion von mn Nanopart Negativkooblastom‐XeysevonSur
ssive Wirk
er mit Neg
ert. Eine H
n‐, blau‐
rhinwurde
bt.Diemit
hweniger
ten.Mittels
nZellengef
otischer Ze
twurden.
ativ zur Ge
hlt.DieMitt
vonTumore
roliferation
miRNA‐beh
herZellenw
Nanoparti
PDH(Abb.
miR‐542‐3prtikeln inntroll‐miRNnograftsanrvivinProtei
kung der m
gativkontro
Hämatoxyl
und rund
eMib‐1,ein
miR‐542‐3
aktiv‐proli
sderFärbu
färbt.Inmi
ellen detek
Der Anteil
esamtzellza
telwertede
en,diemit
n der miR‐
andelten s
warindies
ikeln beha
44b).
p und HerWACII‐Xe
NA‐ (NK) odnhandvonqin indengl
miR‐542‐3p
oll‐miRNA
lin‐Eosin‐F
dzelligen T
nMarkerf
3p‐beladen
iferierende
ungvonge
iR‐542‐3p
ktiert, als
derMib‐1
ahl von dr
ermitmiR‐
tNegativko
‐542‐3p‐be
signifikant
senTumore
ndelten Tu
runterregulenograftsder miR‐54PCR‐Daten.leichenTum
p Expressi
und der m
ärbung off
Tumore1, d
füraktiv‐pr
nenNanopa
eZellenauf
espaltener
behandelte
in Tumore
1 bzw. gesp
rei repräse
‐542‐3p‐be
ontroll‐miR
ehandelten
um 85%
ensignifika
umoren ge
lation voninvivo (a)2‐3p‐beladeStudent‘st‐
moren.GAPD
on wurde
mit miR‐54
fenbarte d
die den X
roliferieren
artikel‐beha
falsdiemi
Caspase3
enTumore
en, die mit
paltene Ca
entativen A
ehandelten
RNAbehand
Tumore w
% reduziert
antumden
Erg
ezeigt werd
n Survivina) Expressienen Nanop‐Test:p=0,DHalsLadu
anhand hi
42‐3p‐beha
die Neurob
Xenograft b
ndeZellen,
andeltenT
itNegativk
wurdede
nwurdeei
t Negativk
aspase 3 ge
Ausschnitte
nTumoren
deltwurden
war relativ
t (Abb.45
nFaktor2,9
gebnisse
75
den. Als
mittelsion vonpartikeln,008.(b)ungskon‐
istologi‐
andelten
blastom‐
bildeten
aufden
umoren
kontroll‐
erAnteil
inhöhe‐
kontroll‐
efärbten
en jedes
wurden
n,aufge‐
zu den
b). Der
9erhöht
Abb.45mierenEosingescheZelnenNanvonMibrenreladreirep*=p<0
5:HemmundenNeuroefärbtenundllen)gefärbtnopartikeln‐b‐1undApoativzumitNpräsentative0,05.
ngderProlblastom‐XedMib‐1(aktenSchnitte‐behandelteoptoseanhanNegativkontrenAusschnit
iferationuenografts(aktiv‐proliferiendermitNenNeuroblandvongesproll‐miRNAttenrelativ
und Induktia) JezweirierendeZellNegativkontastom‐XenogpaltenerCas(NK)behanzurGesamt
ionvonAprepräsentatilen)sowiegroll‐miRNA‐grafts. (b/c)spase3inmndelten.Kaltzellzahljed
poptose inmiveBildervogespalteneC‐(NK)undm)MittlerePmiR‐542‐3p‐kulationdudesXenograf
Erg
miR‐542‐3vonHämatoxCaspase3(amiR‐542‐3pProliferation‐behandelteurchAuszähfts.Student
gebnisse
76
p‐expri‐xilinundapoptoti‐p‐belade‐nanhandnTumo‐lungvon‘st‐Test:
D4.3
N
4.3.1 K
KDM1A
chunge
Retinob
DieReg
Tumore
Tumore
Express
sieben
Express
Aufgrun
nach m
aufweis
KDM1A
KDM1A
Dietumo
Neurobla
KDM1Aal
A ist in un
nkonnte a
blastomen
gulationdie
endesLSL‐
e zeigten i
sionvonK
TH‐MYCN
sionaufwie
ndderpot
miRNAs ges
sen. Für m
A vorherges
AlagdieseB
orsuppr
astomen
spotentie
ndifferenzie
außerdem
gezeigt we
esespotent
‐MYCN;Dbh
mVergleic
Kdm1a.Zur
Tumoren
esen(Abb.
tentiell onk
sucht, für
miR‐137 w
sagt (www
Bindestelle
ressiveF
nundZe
ellesZielei
erten Neur
eineHoch
erden (Pro
tielltherap
h‐iCreMaus
ch zu nicht
Validierun
untersuch
46).
kogenenAk
die 3’UTR
wurde ein p
w.Targetsca
ezwischen
Funktio
elllinien
inerNeuro
roblastome
regulation
of. Dr. Joha
peutischrel
smodellsu
t‐malignen
ngdiesesR
ht, die ebe
ktivitätvon
von huma
passende
an.org). Inn
denPositio
onvonm
n
oblastomt
en hochreg
inaggress
annes Schu
levantenTa
untersucht.
n Nebennie
Resultatsw
nfalls eine
Abb.46:Rin LSL‐MYTumorenExpressionTH‐MYCNTnicht‐maligdent’st‐Tes
nKDM1Aw
anem KDM
Bindestelle
nerhalb de
onen65un
miR‐137
herapie
uliert. In w
sivenMedu
ulte, persön
argetswurd
ren eine s
wurdedieE
e signifikan
Regulation vYCN;Dbh‐iCrBoxplot din LSL‐M
Tumorenrelgner Nebenst:***=p<
wurden in
M1A eine d
e (7mer‐m
er 327bp l
nd71(Abb.
Erg
7inhum
weiteren U
ulloblastom
nliche Mitt
dedeshalb
ignifikant
Expression
nt erhöhte
vonKdm1are und Tder Kdm1aMYCN;Dbh‐iClativzurExnnieren (N0,001.
in silico A
direkte Bin
m8) an 3’U
langen 3’U
47).
gebnisse
77
manen
Untersu‐
menund
teilung).
bauchin
erhöhte
auchin
Kdm1a
amRNATH‐MYCNa mRNACre undpressionN). Stu‐
Analysen
ndestelle
UTR von
UTR von
Abb.47vorhergPos.=PIn ver
Lungen
Funktio
DieExp
analysi
renvon
dieHyp
werden
vorherg
vorherg
Abb.48LSL‐MYder ELSL‐MYCgleich zNebenn***=p<
Imfolg
vonmi
suchtw
7: 3’UTR vogesagten Biosition.Mod
rschiedenen
ntumoren12
ondieserm
pressionvo
ert,wobei
nWildtyp‐M
potheseein
n. Dies kön
gesagtenT
gesagtwird
8: RegulatioYCN;Dbh‐iCrxpression
YCN;Dbh‐iCrezur Expressieren (NN<0,001.
endenTeil
R‐137alsa
werden.
on KDM1Andestelle vdifiziertnac
n humane
21, Melano
miRNAbere
onmiR‐13
sichherau
Mäusenhoc
nertumors
nnte darin
TargetKDM
d(www.tar
on von mre Tumorevon miR
e Tumorenion in nichtN). Student
ldieserArb
auchdaso
mit Bindevon miR‐13hAlthoffet
en Tumor
mzellen122
eitsbekann
7wurdea
usstellte,da
chreguliert
uppressive
n begründe
M1A immu
rgetscan.or
iR‐137 inn BoxplotR‐137 inn im Ver‐t‐malignent’s t‐Test:
beitsolltes
onkogeneT
estelle von37 innerhalal.118.
rentitäten
und Bru
nt.
uch inTum
asssieinde
twar(Abb.
enFunktion
et liegen, d
urinenOrga
rg).
sowohldie
TargetKDM
n miR‐137lb der 3’UT
wie dem
stkrebs123
morenaus
enTumore
.48).Immu
nvonmiR‐
dass dem
anismuske
epotentiell
M1A imhu
SchematiscTR von KD
m Kolorek
ist eine
LSL‐MYCN
enimVergl
urinenNeu
‐137demna
im human
eineBindes
ltumorsup
manenNeu
Erg
ches DiagraDM1A (Targ
ktalkarzino
tumorsupp
N;Dbh‐iCre
leichzuNe
uroblastom
achnichtb
nen Neuro
stelle fürm
ppressiveF
uroblastom
gebnisse
78
amm dergetscan).
m119,120,
pressive
Mäusen
ebennie‐
mkonnte
bestätigt
blastom
miR‐137
Funktion
munter‐
4.3.2 E
Wie sch
Neurob
In Bezu
miR‐13
miRNA
denzfü
Die Exp
(Abb.4
Express
freien‐
Abb.49ÜberlebNeuroblsionvonhoher o***=p<des GesExpress
Expressio
hon für m
blastompat
ug auf ver
37Expressi
signifikan
ürdieHeru
pression v
9a). Mitte
sionfürdie
alsauchde
9: Korrelatben inhumlastompatienPatientenoder niedrig<0,001;n.s.samtüberlebion.Wilcoxo
nsanalyse
miR‐542 du
ienten67(T
rschiedene
ion aufgetr
tmitgüns
unterregula
von NTRK1
ls Kaplan‐
ePatienten
esGesamtü
tion der ExmanenPrimntenanhanverschiedeger NTRK1=nichtsign
bens (OS) von‐Test.Mo
evonmiR‐1
urchgeführt
Tab.9)auch
prognosti
ragenwurd
tigemStad
ationvonm
1 korrelier
‐Meier‐Ana
nsowohlm
überlebens
xpressionmärtumorenndvorhandenerStadiumExpressionnifikant.(b)on Patientedifiziertnac
137inhum
t, wurde in
hdieExpre
ische Mark
de, zeigte s
diumeinhe
miR‐137in
rte signifik
alysen wur
miteinerhö
einherging
von miR‐1n ExpressioenerqPCRDm,mitoderals Balken)Kaplan‐Meen mit TumchAlthoffet
manenPri
n den vorh
essionvonm
ker des Ne
sich, dass
erging.Auß
MYCN‐am
kant mit de
rde gezeig
herenWah
g(Abb.49b
137 mit pon vonmiR‐Daten67 (TabohneMYCNdiagramm.eier‐Analysemoren mit htal.118.
märtumor
handen qP
miR‐137un
euroblastom
einehohe
ßerdemste
plifizierten
er Express
t, dass ein
hrscheinlich
b).
rognostisch‐137 in Primb.9).(a)VeNAmplifikatStudent‘s t‐edesEreignoher gegen
Erg
ren
PCR Daten
ntersucht.
ms, gegen
Expression
elltesichei
nTumoren
sion von m
ne hohe m
hkeitdesE
hen Markemärtumorenergleichdertion(MNA)t‐Test.: **=nis‐freien‐(En niedriger
gebnisse
79
von 69
die die
n dieser
ineTen‐
heraus.
miR‐137
miR‐137
Ereignis‐
ern undn von69rExpres‐undmitp<0,01;EFS)undmiR‐137
Die Re
(Tab.10
günstig
geführt
Die Exp
undfiel
miR‐92
4.3.3 F
Diehoh
ologie u
Theses
den.
Wiesch
einerfü
transfiz
MTTAs
bilitätw
die Exp
Zellenm
e‐Analyse
0), indem
gemundun
twurde,so
pression vo
lsignifikan
2a(p<0,00
Funktionv
heExpressi
unterstützt
solltemitte
honfürmiR
ürkeinemi
ziertundd
ssayunters
wurdegege
pression vo
miteinersi
des vor
dieabsolu
ngünstigem
llteauchfü
onmiR‐13
ntniedriger
01;Abb.50)
vonmiR‐1
ionvonmi
te die Thes
els invitro
R‐542wur
iRNAkodie
dieZellviab
sucht.Dier
endieZeit
on miR‐13
ignifikante
handenen
utenExpres
mVerlaufu
ürmiR‐137
7 korrelier
rausalsdi
).
137inZelll
R‐137inh
se einer tu
Studien in
rdendiehu
erendenNe
ilitätanhan
relativzum
aufgetrage
7 im Verg
nVerringe
Next‐Gen
ssionenvo
untersucht
7ausgeführ
rte signifik
iederonko
linien
humanenN
umorsuppr
nhumanen
umanenZel
egativkontr
nddermet
mjeweiligen
en.Alledre
gleich zu N
rungderV
eration‐Seq
onmiRNAs
wurden,d
rtwerden.
kantmit gü
ogenenmiR
AbbmiRgembladenzierblaungDarsiongen92anac
euroblasto
ressiven Fu
nNeurobla
lllinienIMR
roll‐miRNA
tabolischen
nWertnac
eianalysier
Negativkont
Viabilitätüb
quenzierun
infünfNe
ieschonfü
ünstigem V
RNAsmiR‐1
b.50: KR‐137Exprm Verlaufastome Rener Next‐rungs‐Datenstomen mgünstigem Vrstellungden von miR‐nen miRNAsa. Student‘schAlthoffet
omenmitgü
unktion die
stomzelllin
R‐32,SHEP
Aodermitm
nAktivität
ch24Std.g
rtenZelllin
troll‐miRNA
berdieZeit
Erg
ngs‐Datens
euroblastom
ürmiR‐542
Verlauf (p=
17(p<0,0
Korrelationressionmithumaner
e‐Analyse‐Generation‐nvonjefünit günstigeVerlauf110 (erabsoluten‐137 und des miR‐17 us t‐Test. Motal.118.
ünstigerTu
esermiRNA
nienvalidie
PundSK‐N
miR‐137tr
derZellen
gemessene
nienreagie
A exprimie
t(Abb.51).
gebnisse
80
satzes110
menmit
2durch‐
=0,046)
01)und
vontgünsti‐Neuro‐vorhan‐‐Sequen‐nfNeuro‐em undTab.10).nExpres‐er onko‐und miR‐odifiziert
umorbi‐
A. Diese
ertwer‐
N‐BEmit
ransient
nmittels
Zellvia‐
rtenauf
erenden
Abb.51miR‐13SHEP unüberdietionstes
Makros
einede
miRNA
Mittels
(subG1
Dieser
signifik
miR‐13
bestimm
(Abb.5
ein Eff
Caspase
1: Reduktio7 Expressind SK‐N‐BEeZeitsignifst.Modifizier
skopischeA
eutlichverr
(Abb.52).
Analyse d
) in allen
Effektdom
kant (Abb.5
37 gegen N
mt und zei
3b).Inein
fekt der in
e9 Aktivitä
on der Viaion TransieE mit NegatfikantverschrtnachAlth
Aufnahmen
ringerteKo
des Zellzyk
analysierte
miniertein
53a). Die r
Negativkon
igte eine s
nerWestern
n pro‐apop
ät konnte
abilität huente Transfetivkontroll‐mhieden.Statoffetal.118.
nderZelle
onfluenzim
klus konnt
en Zelllinie
SHEPZelle
relativeAn
ntroll‐miRN
ignifikante
nBlotAnal
ptotischen
deutlich ge
umaner Neektion dermiRNA (NKtistischeSig
nzeigten9
mVergleich
te ein Ans
en nach m
en,warabe
nzahl apopt
NA wurde
e Induktion
lysewurde
Zellen au
ezeigtwer
uroblastomhumanen NK) oder miRnifikanzber
96Std.nac
hzurTrans
AbflublgeMiZetio(Nbana
stieg des A
miR‐137 Ex
erauchfür
totischer Z
anhand d
n von Apop
ederAntei
uftritt, unt
rden (Abb.
mzelllinienNeuroblastomR‐137. Verlarechnetanh
chTransfek
sfektionvon
bb.52: Reduenz huastomzellliener miRikroskopischellen96Std.on mit NegaNK) oder malken = 20achAlthoffe
Anteils apo
xpression d
rIMR‐32un
ellen nach
es ELISA
ptose in al
ildergespa
tersucht. D
53c). Anha
Erg
mittels exmzelllinienauf der ZellvhandeinesP
ktionmitm
nNegativk
duktion deumanerinien nacR‐137 Exphe Aufnahm.nachderTativ‐kontrolmiR‐137. M00 µm. Moetal.118.
optotischer
detektiert w
ndSK‐N‐BE
hTransfekt
Cell death
llen drei Z
altenenCa
Die Indukt
and der EL
gebnisse
81
xogenerIMR‐32,viabilitätPermuta‐
miR‐137
kontroll‐
er Kon‐Neuro‐
ch exo‐pressionmen vonTransfek‐ll‐miRNAaßstabs‐odifiziert
r Zellen
werden.
EZellen
tion von
Assays
elllinien
spase9,
ion der
LISA‐ba‐
sierten
primier
allendr
Abb.53rendenNegativkZellen inexprimiZahlapoWesternBalkendter BrdUnachAltUmzu
kann,w
Marker
zu Neg
inmiR‐
BrdU Ink
renden Zel
reiZelllinie
3: InduktionZellenAnakontroll‐miRnverschiederenden ZeoptotischernBlotAnalydiagrammdeU Inkorporathoffetal.118
testen,ob
wurde anha
rfürneuron
gativkontro
‐137‐exprim
orporation
llen relativ
enreduzier
nvonApopalysendesPRNA‐exprimdenenPhaseellen signifikZellenrelatysevonKDMerZahlprolation. Stude8.
miR‐137n
and einer
naleDiffere
ll‐miRNA‐e
mierenden
n gemessen
v zu Negat
rtemiR‐137
ptoseundRhänotypsvomierenden (endesZellzykant erhöhttivzuNK,geM1Aundgeliferierenderent‘s t‐Test.
neuronaleD
qPCR die E
enzierung,
exprimiere
Zellensign
n, wurde d
tivkontroll‐
7dieProlif
ReduktiononmiR‐137(NK) 96StdyklusalsPrt. Student‘semessenmiespaltenerCrZellenrela*=p<0,05
Differenzie
Expression
gemessen
enden Zelle
nifikanthoc
Abb.54:inNeurofilamExpressioExpressionormalise*=p<0,0
die Prolifer
‐miRNA ex
ferationsig
derProlife‐exprimiered. nach Trarozent‐Balket‐Test: p<ittelsELISACaspase9.AativzuNK,g5; **=p<0,
rungvonN
n vonNeur
undgegen
enwurde d
chreguliert
EinleitungmiR‐137‐ement (NEon relativon (NK), dert gegen001.Modifiz
rationsrate
xprimieren
gnifikant(A
eration inmendenZelllinansfektion. (en.SubG1‐F0,05. (b)BCelldeath.AktinalsLagemessenm,01; ***=p
Neuroblasto
rofilament,
nGAPDHno
deutlich, da
twurde(Ab
neuronaleexprimierenEFL) mRNA
zu Negdetektiert mGAPDH.
iertnachAl
Erg
e von miR‐
nden analys
Abb.53d).
miR‐137exnienimVerg(a) FraktioFraktion inalkendiagraStudent‘st‐adungskontrmittelsELISA<0,001.Mo
omzellene
einem bek
ormalisiert
ass Neurof
bb.54).
er DifferenndenA nachgativkontrolmittels qPStudent‘s
lthoffetal.11
gebnisse
82
‐137‐ex‐
siert. In
xprimie‐gleichzunen vonmiR‐137amm der‐Test.(c)rolle.(d)A‐basier‐odifiziert
einleiten
kannten
.Relativ
filament
nzierungZellen
miR‐137ll‐miRNACR undt‐Test:
18.
4.3.4 V
Die vor
diesem
Zellen
vonKD
undauf
troll‐mi
Zellen
Herunt
Abb.55mRNA nblastomTest: *=Expressdungsko
Zur Val
KDM1A
feraseR
TK,das
miRNA
fiziert.
Seefede
(Abb.5
konnte
Validierun
rhergesagt
TeilderU
im Verglei
DM1A unter
fdieExpre
iRNA‐expri
signifikant
erregulatio
5:Herunternach miR‐1mzellen dete=p<0,05; *ion Negativontrolle.Mo
lidierung d
A (Abb.46)
ReporterP
salsTrans
oder miR
Relativ zu
er norma
6). Die vor
damitvali
ngvonKDM
e, direkte
ntersuchun
ich zu mit
rsucht. Mit
essionvon
imierenden
t herunterr
onvonKDM
rregulation37 Expressktiertmitte**=p<0,01vkontroll‐modifiziertnac
der direkte
) wurde ei
Plasmid,we
fektionsko
R‐137 wurd
u Negativk
alisierte G
rhergesagt
diertwerd
M1Aalsdi
Bindung v
ngvalidiert
Negativko
ttels qPCR
GAPDHno
n Zellen, w
reguliert (A
M1Aaucha
nvonKDM1ion relativels qPCRun1; ***=p<0iRNA‐ (NK)chAlthoffet
en Bindung
in Reporte
elchesdie
ntrolleRen
den sowoh
kontroll‐m
Glühwürmc
te direkte B
en.
irektesZie
von miR‐13
twerden.D
ontroll‐miR
wurde die
ormalisiert.
wurde KDM
Abb.55a).
aufProteine
1A inmiR‐zu Negativk
nd normalisi0,001. (b) W) und miR‐tal.118.
g vonmiR‐
er Assay d
3’UTRvon
nilla‐Luzife
hl in HEK‐2
iRNA‐expr
chen‐Luzife
Bindung v
elvonmiR
37 an die
Dazuwurd
RNA‐transfi
eKDM1A m
.Relativzu
M1A mRNA
In Wester
ebenevalid
137‐exprimkontroll‐miiert gegenGWestern Blo137‐exprim
‐137 an die
durchgeführ
nKDM1Abe
eraseexpri
293 als au
imierenden
erase‐Aktiv
onmiR‐13
R‐137inZe
3’UTR von
enmitmiR
izierten au
mRNA Exp
urExpressi
A in miR‐1
rn Blot Ana
diertwerde
mierendenRNA (NK) iGAPDH Exprot Analyse dmierender Ze
e Bindeste
rt. Ein Glü
einhaltete,
mierte,und
ch in SHEP
n Zellen, w
vität sign
7 an die 3
Erg
elllinien
n KDM1A s
R‐137‐trans
uf ihre Exp
pression ge
ioninNega
37‐exprim
alysen kon
en(Abb.55
Zellen (a)in humanenression. Studer KDM1Aellen. Aktin
elle der 3’U
ühwürmche
dasPlasm
dNegativk
P Zellen k
wurde die
nifikant re
3’UTR von
gebnisse
83
sollte in
sfizierte
pression
emessen
ativkon‐
miernden
nnte die
5b).
)KDM1An Neuro‐udent‘s t‐A Proteinn als La‐
UTR von
en‐Luzi‐
midpRL‐
kontroll‐
o‐trans‐
e gegen
eduziert
KDM1A
Abb.563’UTRHEK‐29tivkontrnem KDLuziferaGlühwüund NoAktivitäStudentAlthoffe
Im We
miR‐13
Target
tion vo
TFPI2 i
einerq
Express
liert,wa
6:DirekteBvon KDM3 und SHEProll‐miRNADM1A 3’UTRase Reportrmchen‐Luzrmalisierunät der Trat‘s t‐Test: *etal.118.
iteren soll
37 Express
vonKDM1
on KDM1A
in Negativk
qPCRgeme
sionvonTF
asdieFunk
BindungvonM1A Ko‐TP Zellen en(NK) oderR tragendenter Plasmiziferase‐Aktng gegen Seansfektionsk*=p<0,01.
te untersu
sion für Sig
AistTFPI2
in Neurob
kontroll‐m
ssenundg
FPI2inalle
ktionalität
nmiR‐137Transfektionntweder mitmiR‐137 un Glühwürmd. Messuntivitätnacheefeder‐Luzikontrolle p. Modifizier
ucht werde
gnalwege
2(tissuefac
blastomzell
iRNA‐ und
gegenGAPD
enanalysie
derKDM1A
andien vont Nega‐und ei‐mchen‐ng der48Std.iferase‐pRL‐TK.rt nach
en, ob die
des Protei
ctorpathw
llinien hoc
d miR‐137‐
DH normal
ertenZelllin
AHerunter
AmvoinmtrunSt**et
Herunterr
ins von Be
wayinhibito
chreguliert
‐exprimiere
lisiert.Rela
nienmitm
regulation
Abb.57:ReamiR‐137‐indon KDM1Anhibitor 2)miR‐137 Exproll‐miRNAnd normalistudent‘s t‐T**=p<0,00tal.118.
regulation
edeutung i
r2),dasbe
wird35. Di
enden Zell
ativ zurKo
iR‐137sign
validierte
aktionvonduzierte HA TFPI2 (tis
mRNA ipression rel(NK), deteksiert gegenTest: *=p<01. Modifiz
Erg
von KDM1
ist. Ein be
eiHerunter
ie Express
len wurde
ontrollewu
nifikantho
(Abb.57).
KDM1AZiHerunterregssue factorin Zelllinieativ zuNegktiert mitteGAPDH Exp<0,05; **=ziert nach
gebnisse
84
1A nach
kanntes
rregula‐
ion von
anhand
urdedie
ochregu‐
elenaufgulationpathwayen nachgativkon‐els qPCRpression.p<0,01;Althoff
4.3.5 F
KDM1A
Bindun
ebene.
wargez
wirkun
tionvon
KDM1A
SHEPu
wurden
gegen
48Std.
Redukt
Abb.58KDM1ABlot An48Std.nNeuroblkontrollsiRNA gkontrolletal.118.
Die im
Alle an
gleichz
Abb.59relativ z(NK) odsiKDM1
Funktionv
Awurdeals
ng führte so
TPFI2,ein
zeigt,dass
ngenaufdie
nKDM1Ae
AHerunterr
undSK‐N‐B
n transient
KDM1A (s
nach Tran
tiondesKD
8: SpezifiscAProteinmnalyse dernachtransielastomzelllinl‐siRNA (NgegenKDM1le. Modifi
MTTAssay
alysierten
zurNegativ
9:Reduktiozum jeweilider siRNAAgegenNK
vonKDM1
sdirektesT
owohl zu e
bekanntes
dieBindun
eNeuroblas
eintreten.N
regulation
BEdenPhä
t mit einer
siKDM1A)
nsfektion a
DM1AProte
che RedukmittelssiRN KDM1AenterTransfnien mitK) oder s1A. Aktin alziert nach
yermittelt
Zelllinien
vkontrollem
on der Zellgen 24Std.gegen KDM
Kberechneta
1AHerunte
Targetvon
einer Heru
sZielvonK
ngvonmiR
stomzellen
Nunsollteu
mittelssiR
notypder
r Negativko
transfizier
anhand ein
einsvalidie
ktion vonNAWesternExpressionfektionvon
Negativ‐spezifischers Ladungs‐h Althoff
teZellviabi
reagierten
miteinersi
viabilität dWert nach
M1A (siKDManhandeine
erregulati
miR‐137,d
unterregula
KDM1A,ko
R‐137and
nhervorruf
untersucht
RNAinden
miR‐137E
ontroll‐siR
rt. Zunächs
nerWestern
ertwerden
ilitätwurde
auf dieHe
ignifikantr
durchHeruh transienteM1A). AngeesPermutat
oninZelll
dieandie3
ation aufm
onnteeben
die3’UTRv
ft,dieauch
twerden,o
humanen
Expression
NA oder m
st wurde
n Blot Ana
konnte(Ab
egegendie
erunterreg
reduzierten
unterregular Transfektegebene p‐WtionstestsM
inien
3’UTRbind
mRNA‐, als
fallsvalidie
vonKDM1A
beidirekte
obderPhän
Neuroblast
ähnelnwü
mit einer s
die Spezif
alyse unter
bb.58).
eZeitaufg
gulation vo
nViabilität
ation vonKtion von NeWerte für dodifiziertna
Erg
det,validier
auch auf P
ertwerden
A funktione
erHerunter
notypderd
tomzellen
ürde.DieZ
pezifischen
fität dieser
rsucht, wob
getragen(A
nKDM1A
überdieZ
KDM1A MTegativkontrodie SignifikachAlthoffe
gebnisse
85
rt.Diese
Protein‐
n.Damit
elleAus‐
rregula‐
direkten
IMR‐32,
elllinien
n siRNA
r siRNA
bei eine
Abb.59).
imVer‐
eit.
TT Assayoll‐siRNAkanz vonetal.118.
Die det
Herunt
einesC
fektion
imVerg
dieInd
tionde
tiert(A
Abb.60ZellendtivkontrverschieZellen,**=p<anhandModifizi
taillierte U
erregulatio
CelldeathE
untersuch
gleichzur
uktionvon
rProliferat
Abb.60c).
0: InduktiodurchHeruroll‐miRNAedenenPhasrelativ zu0,01. (c) Bder ELISA‐iertnachAlt
ntersuchun
on von KD
LISAundd
ht.DerAnte
Negativkon
nApoptose
tion,diere
n von Apounterregula(NK) odersendesZellNK, geme
BalkendiagrabasiertenBthoffetal.11
ng derMe
M1Amitte
derELISA‐b
eilapoptot
ntroll‐siRN
validiertw
elativzurN
optose undationvonKsiRNA gegezyklusalsPssen mittelamm der ZBrdU Inkorp8.
chanismen
els siRNAw
basiertenB
tischerZell
NAan (Abb
werden(Ab
Negativkon
d ReduktioKDM1AAnaen KDM1AProzentbalkels ELISA Cahl proliferporation. Stu
n der Redu
wurde anh
BrdUInkor
enstiegbe
b.60a).Mit
bb.60b).Au
troll‐miRN
n der Viabalysen96Std(siKDM1A)en.(b)BalkCell death.rierender Zudent‘s t‐Te
uktion der
and einer
rporation9
eiTransfek
telsCellde
ußerdemw
Aaufgetra
bilität undd.nachTran. (a) FraktiendiagrammStudent‘sellen relativest: *=p<0
Erg
Zellviabilit
Zellzyklus
96Std.nach
ktionvonsi
eath ELISA
wurdeeine
agenwurde
Proliferatnsfektionvoionen von Zmderapoptt‐Test: *=v zu NK, g0,05; ***=p
gebnisse
86
tät nach
analyse,
hTrans‐
iKDM1A
Akonnte
eReduk‐
e,detek‐
tion vononNega‐Zellen intotischenp<0,05;emessenp<0,001.
Ergebnisse
87
4.3.6 Partielle Wiederherstellung des Phänotyps der miR‐542‐3p Expression
mittelsHochregulationvonKDM1AohnemiRNA‐Bindestelle
Der Phänotyp von Neuroblastomzelllinien nach der Herunterregulation von KDM1A
mittelssiRNAähneltedemderExpressionvonmiR‐137.Nunwurdeuntersucht,obder
miR‐137‐Phänotyp aufgrund der durch miR‐137 Expression herunterregulierten
KDM1A Expression auftrat. KDM1A ohne miR‐137‐Bindestelle (3‘UTR) wurde mittels
eines Tetrazyklin‐induzierbaren Vektors stabil in SHEP Zellen eingebracht
(SHEP‐KDM1A).AlsKontrollewurdenSHEPZellenmitdemgleichemVektorabereiner
induzierbarenExpressionvonGFPgeneriert(SHEP‐GFP).UnabhängigvonderBehand‐
lungmitTetrazyklinwurdedieExpressionvonKDM1AinSHEP‐GFPZellenbeiExpres‐
sionvonmiR‐137reduziert.AuchinSHEP‐KDM1AZellenreduziertedieExpressionvon
miR‐137dieExpression vonKDM1A inAbwesenheit vonTetrazyklin.BeiBehandlung
mitTetrazyklinwurdedieExpressionvonKDM1A ohne3‘UTR inSHEP‐KDM1AZellen
induziert,dieresistentgegendieExpressionvonmiR‐137war(Abb.61a).MittelsMTT
Assay wurde die Zellviabilität unter den gleichen Bedingungen wie im Western Blot
analysiert.DieViabilitätderZellenbeiExpressionvonmiR‐137wurdedazurelativzur
jeweiligen Negativkontroll‐miRNA exprimierenden Viabilität aufgetragen. Die Expres‐
sion vonmiR‐137 reduzierte die Viabilität sowohl von SHEP‐GFP als auch von SHEP‐
KDM1AZelleninAn‐undAbwesenheitvonTetrazyklinsignifikant.InnerhalbderSHEP‐
GFP Zellen konnte kein Unterschied zwischen der Zellviabilität von nicht‐induzierten
undinduziertenZellen,diemitmiR‐137behandeltwurden,detektiertwerden.Zwischen
miR‐137exprimierendenSHEP‐KDM1AwardieReduktionderZellviabilitätininduzier‐
tenZellensignifikantwenigerstarkalsinnicht‐induziertenZellen(Abb.61b).
Abb.61miR‐13TetrazykeinemT3’UTR.Gder ZellNegativkmittelsetal.118.
4.3.7 I
Das du
zwar e
KDM1A
von KD
werden
ZurDet
manaly
troll‐mi
gefunde
zeigt).
sowohl
kam.
1: Induzierb7 Expressklin‐ (TET)Tetrazyklin‐iGleichzeitigelviabilität vokontroll‐miRMTT Assay
Identifizie
urchgeführt
ein Teil de
Azurückzuf
DM1A, sond
nmusste.
tektionwe
yse vonmi
iRNA expr
en, die dur
Mittels in
leineBinde
bare Expresion (a) W oder LösuinduzierbareExpressioonmiR‐137RNA exprimy. Student‘s
erungund
te Rettung
es Effekts
führenwar
dern allein
eitererpote
R‐137 exp
rimierende
rchmiR‐13
silico Anal
estellefür
ession vonWestern Blngsmittel‐BrenVektorkonvonmiR‐17 exprimiermierenden is t‐Test: **
Validierun
gsexperime
der miR‐1
r,aberdass
n oder zusä
entiellerZie
rimierende
Zellen als
37 Express
lyse wurde
miR‐137au
n KDM1A iot AnalyseBehandlungonstruktmi137.Aktinaenden SHEPin Ab‐ und*=p<0,01;
ngvonAK
ent des mi
137 Expres
sdergröße
ätzlich auf
elewurde
en SHEP Z
s Vergleich
sion signifi
e untersuc
ufwies,als
n SHEP‐KDe der KDMvon stabil‐itGFP(SHEPalsLadungsP‐GFP undAnwesenh***=p<0
KAP2alsw
R‐137 Phä
ssion auf
ereAnteiln
f weitere m
96Std.nac
ellen durch
h dienten.
ikant regul
ht, welche
auchalsp
DM1A ZelleM1A ExprestransfizierteP‐GFP)oderkontrolle.(bSHEP‐KDM1eit von Tet,001. Modif
eiteresZie
änotyps de
die Herun
nichtallein
miR‐137 Zi
chTransfe
hgeführt,w
Dabei wu
liert waren
dieser reg
otentielles
Erg
en resistenssion 96Sten SHEP‐ZerKDM1AcDb)Balkendi1A Zellen rtrazyklin, gfiziert nach
elvonmiR
emonstrier
nterregulati
aufdieReg
iele zurück
ktioneine
wobeiNega
urden 38 P
n (Daten n
gulierten P
sOnkogeni
gebnisse
88
nt gegentd. nachellen mitNAohneiagrammelativ zuemessenh Althoff
R‐137
te, dass
ion von
gulation
kgeführt
Proteo‐
ativkon‐
Proteine
nicht ge‐
Proteine
inFrage
DasPro
Zellenb
(Abb.6
Abb.62mittelsgleichdkontrollmiR‐137Proteomgleichenkontroll
Dem P
bekann
gesagt
Bindest
(8mer)
Abb.63vorherg(www.ta
Anhand
Neurob
Funktio
gezeigt
oteinAKAP
beiderAna
2a),wasim
2: HerunteExpressio
derExpressil‐miRNA (N7exprimiermanalyse.(bn Proben wle.
rotein AKA
ntist,wurd
(www.tar
tellenand
und3851‐
3: 3’UTR vogesagten Bargetscan.or
d einer
blastomen
on imNeur
werden,
P2 (Akinas
alysedesP
mWestern
erregulationon von miRion vonAKANK) exprimrendenZelleb)WesternBwie (a). Akti
AP2, über
envierdir
rgetscan.or
enPosition
‐3857(7me
on AKAP2Bindestellenrg).Pos.=P
Analyse
sollte festg
roblastom
dass Pati
seanchorp
Proteomsa
Blotvalidie
n von AKR‐137 (a)AP2 inNegamierendenenanhandeBlotAnalysein als Ladu
dessen tu
ekteBinde
rg). Innerh
nen912‐91
er‐m8)(Abb
mit Bindesn von mosition.
der Expr
gestelltwer
spielenkö
enten mit
protein2)
alssignifika
erbarwar(
KAP2Ver‐ativ‐undeinerederungs‐
umormodu
estellenvon
halb der
18(7mer‐1
b.63).
stellen vonmiR‐137
ression vo
rden, obd
önnte.Mitte
t Tumoren
war inmiR
antherunte
(Abb.62b)
lierende F
nmiR‐137
4014bp
1A),1634‐1
nmiR‐137innerhalb
on AKAP2
iesesProte
els einerK
n mit hoh
R‐137expr
erreguliert
.
Funktion b
am3’UTRd
langen 3’U
1640(7me
Schematiscder 3’U
2 in hum
eineine tu
Kaplan‐Meie
her AKAP2
Erg
rimierende
gefunden
isher noch
dermRNA
UTR lagen
er‐m8),177
ches DiagraUTR von
manen pr
umormodul
erAnalyse
2 Expressio
gebnisse
89
enSHEP
wurden
h nichts
vorher‐
n diese
75‐1782
amm derAKAP2
rimären
lierende
ekonnte
on eine
signifik
Patient
desGes
AKAP2
ImFolg
renzin
behand
ziert(A
eine Re
ELISA‐b
Abb.65siRNAgNegativkbilitätüsiAKAP2tischendiagramTest:*=
kantniedrig
tenmitTum
samtüberle
imTumor
genden sol
SHEPZelle
deltwurden
Abb.65a).W
eduktion d
basiertenB
5:ReduktiogegenAKAPkontroll‐siRüberdieZeit2gegenNKZellen96StmmderZahl=p<0,05.
geWahrsch
morenmit
ebens(Abb
signifikant
ltedieFun
ennäheru
n,war imV
Weiterhini
der Zellpro
BrdUInkorp
nderZellvP2transfiziRNA(NK)odtrelativzumberechnetatd.nachTralproliferiere
heinlichkei
niedrigerA
b.64).DesW
tmitMYCN
nktioneine
ntersuchtw
Vergleichz
nduziertes
liferation,
poration(A
iabilitätuniertenSHEPdereinersiRmWertnachanhandeinensfektionreenderZellen
itfüreinE
AKAP2Exp
Weiterenk
NAmplifikat
erAKAP2H
werden.Di
zumitNeg
siAKAP2in
gemessen
Abb.65b/c
ndProliferaPZellenTrRNAgegenh24Std.AnesPermutatielativzuNKnrelativzu
Ereignis‐fre
pression.D
korrelierte
tion(Daten
Herunterre
ieViabilität
gativkontro
nSHEPZell
anhand de
).
ationundInansienteTrAKAP2(siAngegebenepionstests.(bK.Student‘stNK96Std.
iesÜberleb
iesgaltau
eineerhöh
nnichtgeze
Abb.64:ExpressionÜberlebenroblastompMeier‐Analyfreien (EFSüberlebensroblastomprenmit hohAKAP2 ExpTest.
gulationm
tderZellen
ll‐siRNAtr
ensowohl
es Cell dea
nduktionvoansfektionvAKAP2).(a)p‐Wertefürb)Balkendiat‐Test:*=pnachTrans
Erg
benaufwie
uchfürdie
hteExpress
eigt).
Korrelation von AKAn vonpatientenyse des ES) und des (OS) vopatientenmiher gegen npression. W
mittelsRNA
n,diemits
ransfizierte
Apoptosea
ath ELISA u
onApoptosvonSHEPZeVerlaufderrdieSignifikagrammder<0,001.(c)sfektion.Stu
gebnisse
90
esen,als
Analyse
sionvon
on derAP2 mit
Neu‐Kaplan‐Ereignis‐Gesamt‐
on Neu‐itTumo‐niedrigerWilcoxon‐
A Intefe‐
siAKAP2
enredu‐
alsauch
und der
seinmitellenmitrZellvia‐kanzvonrapopto‐)Balken‐udent‘st‐
5 Di
Die vor
MYCN‐v
weitere
derFun
weitera
D5.1
5.1.1 T
b
Eine Ü
Stadium
dieHei
dernse
MYCN‐A
in dies
Erkrank
tersuch
analysi
ristika
piendie
Dievom
lich im
Express
anhand
Die ana
oberen
Neurob
undden
iskussi
rliegende A
vermittelte
envorhand
nktioniden
analysiertw
DasLSL‐
Tumored
blastomeb
berexpress
m und eine
ilungschan
ehrgutsind
Amplifikati
en bösarti
kungenwi
hungen von
ertenLSL‐M
deshuman
eserbeimK
mDbh‐Pro
m sympathi
sion der C
dderUnter
atomischen
Zervikalg
blastome, d
nNebennie
ion
Arbeit umf
en Neurob
denenDate
ntifiziert,de
wurden.
MYCN;D
esLSL‐MY
beschreib
sion oder
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MYCN;Dbh
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Neuroblast
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n, von gro
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CreMausm
tion von W
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Ganglion co
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kombinase
Dbh‐iCre M
Expressio
Proteinebe
en Tumore
ähnelten de
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Cre‐kondit
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91
ionalem
wie aus
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elllinien
Neuro‐
m hohen
Während
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menmit
nalwege
s dieser
che Un‐
Im hier
harakte‐
eThera‐
uptsäch‐
hrte die
CN, was
twurde.
nnieren,
humaner
nzstrang
Diskussion
92
ImhistologischenBildbestandenTumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenauskleinen,
blauen,rundenZellen.InderpathologischenUntersuchungvonhumanenpädiatrischen
TumorenwirdebenfallszuersteineHämatoxylinundEosinFärbungdurchgeführt.Die
Unterscheidung zwischen den Entitäten der klein‐, blau‐ und rundzelligen Tumore
erfolgthauptsächlichanhanddesNachweisesspezifischerMarkerinimmunozytochemi‐
schen und genetischen Analysen. Sind diese Untersuchungen nicht eindeutig, werden
elektronenmikroskopischeAufnahmenzuRategezogen.Alsspezifischeultrastrukturelle
Kennzeichen des Neuroblastoms innerhalb der klein‐, blau‐ und rundzelligen Tumore
gelten Neuriten, neurosekretorische Vesikel, Synapsen‐ähnliche Strukturen und zwi‐
schenzelluläre Anschlüsse1. Neurosekretorische Vesikel, die neurale Differenzierung
anzeigen,warenauchinTumorenausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusendetektierbar.
Tumoredes LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells exprimierten sowohl dasOberflächenantigen
CD56,alsauchdieNeuroblastommarkerDbh,ThundPhox2b.DieExpressionvonCD56
gilt als Marker für neuroendokrine Tumore. Th katalysiert die Biosynthese der Kate‐
cholamine und wird vor allem in noradrenergen Zellen exprimiert125. Bei der
UnterscheidungvonNeuroblastomenzuanderenklein‐,blau‐undrundzelligenTumo‐
rengiltdieExpressionvonTh,diespezifischfürdasNeuroblastomist,alsMerkmal126.
Phox2bwirdbei derEntwicklung von sympathischen, parasymphatischenund enteri‐
schen Ganglien exprimiert, die sich von der Neuralleiste ableiten127. Hartomo etal.
beschreiben elfMarker, anhand derer sich eineminimale Resterkrankung desNeuro‐
blastomsdetektierenlässt,unterdenensichsowohlDbhundThalsauchPhox2bbefin‐
den128.
Anhand der Lokalisation, der histologischen Eigenschaften und der Expression von
spezifischenNeuroblastommarkernwurdedieHypothesebestätigt, dass es sichbei in
dieser Arbeit analysierten Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells ummurine
Neuroblastomehandelte.
Diskussion
93
5.1.2 Gegenüberstellung der beiden Neuroblastom‐Mausmodelle
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN
Das TH‐MYCN Mausmodell37 stellt ein exzellentes, weltweit anerkanntes Neuro‐
blastommodelldar,dasinverschiedenenArbeitsgruppen,diesichmitderErforschung
desNeuroblastomsbeschäftigen,zuüber200Publikationengeführthat.Esgibtjedoch
EinschränkungendesModells,diedieForschungandiesemerschweren.IndiesemTeil
derArbeitsollenverschiedeneEigenschaftendesTH‐MYCNunddesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Mausmodells einander gegenübergestellt werden, um abzuschätzen, ob das neue
MausmodellVorteilegegenüberdemetabliertenaufweist.
DasTH‐MYCNModellwurde1997durchPronukleusinjektiondercDNAvonhumanem
MYCNinmurineBlastozystengeneriert37.DieDefinitiondergenauenIntegrationsstelle
inderdistalenRegiondesChromosoms18imGenomderMauserfolgteerst2003129.Es
istnichtbekannt, obder entsprechendeLokusubiquitär exprimiertoder epigenetisch
inaktiviert wird, was zu einer instabilen Expression von MYCN führen könnte. Das
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modell wurde mittels eines Rekombinase‐vermittelten Kassetten‐
austauschineinengenaudefiniertenGenlokusgeneriert,waszurFolgehatte,dassder
Genlokus,indendasMYCNTransgenintegriertwurde,genaubekanntwar.DerROSA26
Genlokus stellt bei der Generierung transgener Mausmodelle den am häufigsten ver‐
wendetengenetischenLokusdar,daeineUnterbrechungdiesesubiquitärexprimierten
GensbekanntermaßenkeinenPhänotyphervorruft130‐133.
VorteiledesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsgegenüberdemTH‐MYCNModell,dieIntegra‐
tionsstelledesTransgensbetreffend,sinddemnachzumeinendieGewissheit,dassjede
phänotypischeVeränderungdoppelt‐transgenerTiereaufdasVorhandenseindes inte‐
griertenTransgens, nicht aber auf dieUnterbrechung eines endogenen Lokus zurück‐
zuführen ist und zum anderen dieKenntnis, dass der Lokus ubiquitär exprimiert und
nichtinirgendeinerWeisereprimiertwird.
Die Vermehrung undErhaltungder transgenenMausstämmeLSL‐MYCN undDbh‐iCre
erfolgtdurchdieVerkreuzungmitWildtyp‐TierenodermitTierendes gleichenStam‐
mes.DadiegetrennteZuchtbeiderStämmezukeinemPhänotypführtistdieseunkom‐
plizierter als die desTH‐MYCN‐Modells, das im 129x1/SvJ Hintergrund potentiell Tu‐
more entwickelt. Die Ausbildung eines tödlichen Tumors in einem transgenen
Muttertier führt dabei häufig zumVerlust des ganzenWurfes oder zurNotwendigkeit
Diskussion
94
einerAmme.InfolgedessenwerdenhäufigheterozygoteTH‐MYCN‐MännchenundWild‐
typ‐Weibchen für die Erhaltungszucht benutzt, die stets verfügbar sein sollten. Es ist
unabdingbar jedes transgene TH‐MYCN Tier nach Tumoren abzutasten, was einen
enormenZeitaufwandmitsichbringt.WeiterhinbestehtinnerhalbeinerPopulationaus
TH‐MYCN Tieren ein Selektionsvorteil für die Tiere, die keinen Tumor entwickeln, da
sichdiesemit größererWahrscheinlichkeit fortpflanzen.Dassdies aufDauer zu einer
AbnahmederTumorinzidenzführenkann,wurdeauchinunsererArbeitsgruppefestge‐
stellt.
TumoredesTH‐MYCNModellsentstammenunifokalausdemGanglioncoeliacum37.Die
LokalisationvonTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,dievorallemandenNeben‐
nieren, aber auch an den oberen Zervikalganglien auftraten, spiegelte die humaner
Neuroblastome4demnachbesserwideralsdiedesTH‐MYCNModells.
MöglicherweiseistdergenetischeHintergrund129x1/SvJsensiblerfürdieEntwicklung
bösartigerNeuroblastomealsandereMausstämme,wiez.B.C57Bl/6N,weilsiesichin
der Expression nicht‐identifizierter Stamm‐spezifischerModifizierer unterscheiden134.
Trotz des unsensibleren Hintergrundes zeigte die Kaplan‐Meier‐Analyse der beiden
Mausmodelle eine signifikant gesteigerte Tumor‐Inzidenz des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Modells.
AufgrundderExpressionvonLuziferaseinCre‐RekombinaseexprimierendenZellendes
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellssindTumoredieserMäusemittelsinvivoBiolumineszenz‐
Bildgebungsverfahren detektierbar. Diese Eigenschaft der Tumore kann eingesetzt
werden, um Tumorvolumenveränderungen im Vergleich mit anderen Individuen des
gleichen Stammes, z. B. während einer Behandlungssimulation, zu untersuchen (hier
nichtdurchgeführt).TumoreausTH‐MYCNMäusenexprimierendahingegenkeinRepor‐
tergen, weshalb diese Methode der schnellen und unkomplizierten Bildgebung nicht
anwendbarist.
Die Kombination von Tumormodellenmit anderen transgenenMausmodellen, die ein
fürdieEntwicklungderTumorentitätpotentiellfunktionellesGenherunter‐oderüber‐
exprimierenisteineinteressanteStrategie,fürdieErkrankungrelevanteSignalwegezu
findenundzuuntersuchen.DasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellentwickelteimnicht‐sensi‐
Diskussion
95
tivengenetischenHintergrund(75%C57Bl/6Nund25%129x1/SvJ)Tumore,während
TH‐MYCN Mäuse nur im sensitiven 129x1/SvJ Hintergrund Tumore ausbilden. Eine
KombinationvonTH‐MYCNmitanderenMausmodellenistdemnachnurmöglich,wenn
dieseweitestgehendaufden129x1/SvJHintergrundzurückgekreuztwurden.Erfahrun‐
gen unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass mindestens fünf Rückkreuzungen (96,9%
129x1/SvJ) erforderlich waren, damit Mäuse im gemischten genetischen Hintergrund
eineähnlicheTumorinzidenzerreichten,wie reine129x1/SvJTiere.Der zeitlicheAuf‐
wandderRückkreuzungenvonmehrerenMonaten,derbeieinerKombinationmitdem
TH‐MYCN Modell aufgewendetwerdenmuss, ist bei Verwendung des LSL‐MYCN;Dbh‐
iCreModellnichterforderlich.DarüberhinaussindtumorspezifischeRegulationenvon
GenenbeiKombinationdesLSL‐MYCN;Dbh‐iCremitanderenCre‐konditionalenModel‐
lenohnegroßenAufwandmöglich.
Aus der Gegenüberstellung der beiden murinen Neuroblastommodelle TH‐MYCN und
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreergabensichdiverseVorteilefürdieLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMaus,wie
dieKenntnisseüberdenGenlokusderTransgenintegration,dieKosten‐undZeiterspar‐
nisbeiderErhaltungszucht,dieanatomischenLokalisationenderentstehendenTumore
sowiederenInzidenz,dieOpportunitätderLumineszenz‐Bildgebungsowiedieunkom‐
plizierteundschnelleMöglichkeitderKombinationmitanderentransgenenTiermodel‐
len.DasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodellüberkommtsomitdie indieserArbeitdisku‐
tiertenLimitationendesetabliertenTH‐MYCNModells.
Diskussion
96
5.1.3 Identifikation neuer Ziele einer Neuroblastomtherapie anhand des
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells
IndiesemTeilderArbeitsollengenomischeAberrationenundreguliertemRNAssowie
miRNAsausTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsmitdenenhumanerErkrankun‐
genundmitdenenanderermurinerNeuroblastomeverglichenwerden,umfestzustel‐
len,obdasLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellgenutztwerdenkönnte,umneuepotentiellfunk‐
tionelleZieleeinerNeuroblastomtherapiezudetektieren.
5.1.3.1 Vergleich genomischer Aberrationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre
MäusenmitdenenhumanerundanderermurinerNeuroblastome
Genomische Aberrationen von 13 LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tumoren wurden relativ zu
GewebeausdemSchwanzderjeweilsgleichenMausdetektiert.
Eine teilweise Zunahme des Chromosoms 1 wurde in einem der Tumore aus
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusengefunden.DieZunahmedeshumanenChromosoms2q,das
ortholog zummurinen Chromosom 1 ist, wird für 12% der humanen Neuroblastome
beschrieben135.TeilederhumanenChromosomen1q,2q,5q,6p,8q,13qund18qsind
ebenfalls ortholog zu Teilen des murinen Chromosom 1, jedoch ist deren Funktion
bishernichtbekannt. ImTH‐MYCNModell isteineZunahmedesChromosoms1 in5%
bis30%derTumorengefundenworden37,129,136.
DieTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsweisenin69%derFälleeineZunahmedes
komplettenChromosoms3auf,welchesorthologzuTeilenderhumanenChromosomen
1,3q,4,8qund13qist137.DashumaneChromosom1q,eineRegion,diehäufiginhuma‐
nenNeuroblastomenmehrfachauftritt,istebenfallsortholog138.Daspubliziertemurine
Neuroblastommodell, das von der Überexpression vonmutiertemALKF1174L getrieben
wird,weistin100%derFälleeineZunahmedesChromosoms3auf42.
Dasmurine Chromosom6, dessen Zunahme in fünf Tumoren auftrat, ist teilweise or‐
tholog zudenhumanenChromosomen2p, 3, 4q, 7, 10qund12p. In humanenNeuro‐
blastomen kommt eine Zunahme des kompletten Chromosoms 7 in 40% der Tumore
verschiedenerStadienvor,wobeieineZunahmevon7q in12%auftrittundmithoch‐
Risiko Tumoren assoziiert ist139. Interessanterweise weisen zwei Tumore eine lokale
AmplifikationdesChromosoms6auf,diedenROSA26‐Genlokuseinschließt,indendas
Diskussion
97
humane MYCN Transgen kloniert wurde. Infolgedessen wurde untersucht, ob beide
Tumore, die über diese Aberration verfügen, im Vergleich zu denen ohne Aberration
aucheinehöhereExpressiondesTransgensaufweisenundeskonntegezeigtwerden,
dass dies der Fall war (Daten nicht gezeigt). Schon im TH‐MYCN Mausmodell wurde
gezeigt,dasshomozygoteMäusedieserLinie schnellerTumoreentwickeltenunddass
dieseschnellerzumTodführtenalsbeiheterozygoteTiere.MitderhöherenExpression
vonMYCNwurdediesbegründet137.Sowirdvermutet,dassdieZunahmedesROSA26‐
LokusimneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModelldasTumorwachstumbeschleunigenkönnte.
Die Zunahmeder distalenHälfte des Chromosoms11 in 30%der LSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Tumore ist ortholog zumhumanenChromosomenarm17q, der in50%allerhumaner
Neuroblastome mehrfach vorkommt und mit ungünstigem Verlauf der Erkrankung
sowiemitMYCNAmplifikationkorreliert42.Einbekanntes,potentiellfunktionellesOnko‐
genaufdiesemLokusistSurvivin,dasinderRegion17q25liegt140,141.TH‐MYCNTumore
weisen ebenfalls häufig (20‐30%) eine Zunahme der Region auf Chromosom 11
auf129,136,137.
DieZunahmedesChromosoms12istorthologzuTeilendeshumanenChromosoms2p,
dasdenendogenenMycnLokusenthält, sowie14qundTeilenvon7pund7q.DieZu‐
nahme von 7q tritt, wie schon erwähnt, in 12% humaner Neuroblastome auf ist mit
hohemRisikokorreliert139.
Der Verlust der Heterogenität von Chromosom 1p36 korreliert in humanen Neuro‐
blastomenmitderAmplifikationvonMYCNundeinerungünstigenPrognose142‐144.Auf
diesemLokus liegtmiR‐34a,der inverschiedenenTumorentitäteneinetumorsuppres‐
siveFunktionzugeschriebenwird145,146.DieExpressionvonmiR‐34ainduziertinNeuro‐
blastomzellen Apoptose63 und reguliert direkt die Expression von MYCN64. Weitere
potentiell funktionelle Kandidaten auf diesem Lokus sindCHD5147 undKIF1Bβ148. Ein
VerlustdesmurinenChromosoms4,dasdasOrthologzumhumanen Lokus1p36ent‐
hält,istwederimTH‐MYCNModell136,nochinTumorenvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen
vorhanden. Jedochweisen50%derTumoredesALKF1174LModellseinenVerlustdieses
Lokus auf42. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass das Transgen in
beidenMYCN‐vermitteltenMausmodellen inFormvoncDNAvorliegtunddamitkeine
Bindestelle fürmiR‐34aaufweist.DementsprechendwäreeinVerlustdiesesLokus für
Diskussion
98
dieMYCN‐getriebenenModellekeinVorteilfürdieEntstehungvonTumoren.Weiterhin
wird damit die Hypothese unterstützt, dass in humanen Neuroblastomen durch die
RepressionvonmiR‐34adieTumorentwicklungangetriebenwird,wodurchdieFunkti‐
onalitätdesVerlustesdesChromosoms1p36erklärtwerdenkönnte.
ImVergleichzudemALKF1174L;Dbh‐iCreNeuroblastommodellsindchromosomaleAber‐
rationen in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre und TH‐MYCN Mäusen seltener 37,42,129.
EineÜberexpressionvonWildtypMYCNbenötigtdemnach,umeinenTumorzutreiben,
weniger bis keine weiteren spontanen Aberrationen als die Überexpression der
ALKF1174LMutation.Heukampetal. beschreiben in einemvondreiTumorenvondrei‐
fach‐transgenen TH‐MYCN;ALKF1174L;Dbh‐iCre eine Zunahme des Chromosoms 3. Des
Weiteren werden nur wenige Verluste einzelner Regionen von Chromosomen detek‐
tiert42.DemnachsindbeigleichzeitigerÜberexpressionvonWildtypMYCNundmutier‐
tem ALKF1174L weniger chromosomale Aberrationen nötig, als bei den beidenMYCN‐
getriebenenModellen.
Aus demVergleich der chromosomalenAberrationen des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells
mitpubliziertenhumanenundanderenmurinenNeuroblastomenergibtsich,dasssich
dieSpektrenderchromosomalenAberrationensehrähnlichsind.
5.1.3.2 Vergleich der Genregulationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen
mithumanenundanderenmurinenNeuroblastomenaufmRNAEbene
Mittels mRNA Profiling drei nicht‐maligner Nebennieren und acht Tumoren aus
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwurdenimModellreguliertemRNAsidentifiziert.
AnhandderGSEAwurdendiverseGensets,dievonMYC(N) regulierteZiele enthalten,
als signifikant angereichert in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells detektiert,
wodurchdieHypothesebestätigtwird,dassMYCNimmurinenSystemähnlicheSignal‐
wege reguliert wie im humanen. Weitere Gensets, die in Tumoren von
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenalssignifikantangereichertdetektiertwurden,beinhalteten
Gene, die sowohl die DNA Replikation als auch den Zellzyklus betrafen. Dementspre‐
chendreguliertendieseTumoreGene,diefürdieKennzeichenvonTumorzellen,wiedie
Stimulation ihres eigenen Wachstums, Resistenzen gegen Wachstumsstopp sowie
Diskussion
99
ApoptoseundunendlicheVervielfältigung149,vonBedeutungsind.DieAnreicherungvon
Gensets,dieneuronaleDifferenzierungherunterregulieren,bestätigte,dasssichTumore
ausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen ineinemundifferenziertenStatusbefinden,einweite‐
resbekanntesMerkmalvonTumorzellen150.
Mittels einer Clusteranalyse derGene, die in einer publiziertenMYCN Signatur aufge‐
decktwurden78,konntenTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellseindeutigvonnicht‐
malignenNebennierensepariertwerden,eindeutlicherHinweisaufdieÄhnlichkeitder
MYCNreguliertenmRNAsinmurinenundhumanenTumoren.
DieRegulationeinzelnermRNAsderMYCNSignatur78undweitererbekannterZielevon
MYCNinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswurdenimFolgendenmithumanen
Neuroblastomenverglichen:
Cyclin‐abhängigeKinase4 (Cdk4)wirdwährendderG1‐PhasedesZellzyklusvonCyc‐
linendesTypesDaktiviert.Molenaaretal.zeigen,dassdiehoheExpressionvonCDK4
mitschlechteremÜberlebenvonNeuroblastompatientenkorreliert.AußerdemistCDK4
sowohl in Tumoren als auch Zelllinien im Vergleich zu verschiedenen nicht‐malignen
Geweben hoch exprimiert. Die Herunterregulation von CDK4 in humanen Zelllinien
führt sowohl zu einem Arrest in der G1‐Phase des Zellzyklus als auch zur Induktion
neuralerDifferenzierung151,152.DieerhöhteExpressionvonCdk4inLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
TumorenkönntemalignenZellendenDurchgangdurchdieG1‐Phaseerleichtern.
DasUbiquitin‐konjugierendeEnzymE2C(Ube2c)spieltbeiderDegradationvonmitoti‐
schenCyclinen und demAblauf des Zellzyklus eineRolle153. InGliomzellen führt eine
Herunterregulation von UBE2C zu einem Zellzyklusarrest in der G2/M Phase und zu
Apoptose154.IndenhumanenNeuroblastomzellenSHEPundSK‐N‐BE(2)‐CwirdUBE2C
einewichtigeRolle inderMitosezugeschrieben,wieeinsiRNAScreeningaufdeckte101.
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorezeigteneineHochregulationvonUbe2c.
MYCN‐amplifiziertehumaneNeuroblastomeexprimierensignifikanthöhereMengenan
Laktat‐Dehydrogenase(LDH) imVergleichzuTumorenmitnureinerMYCNKopie.Die
HerunterregulationvonLDHindenbeidenMYCN‐amplifiziertenNeuroblastomzelllinien
LAN5 und Kelly reduziert deren Proliferation. Außerdem verlieren Kelly Zellen bei
komplettemVerlustvonLDHihreTumorigenitätinvivo155.LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumore
exprimiertenLDHimVergleichzunicht‐malignenNebennierenüber.
Diskussion
100
EineÜberexpressionvonNme1korreliertmitungünstigemStadiumvonNeuroblastom‐
patienten. Eine Zunahme desNme1 Gens, das auf Chromosom17q lokalisiert ist, tritt
häufig inNeuroblastomenmithohemRisikoauf156.AußerdemistdasExpressionslevel
vonNme1starkmitderAggressivitätMYCN‐amplifizierterNeuroblastomeassoziiert102.
DieHochregulationvonNme1mRNAinLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenwurdeparallelzur
ZunahmedesChromosoms11,dasorthologzuhumanem17qist,festgestellt.
DerFamiliederRAS‐GenewerdeninverschiedenenTumorentitätenonkogeneFunktio‐
nen zugeschrieben157. Einer der drei Hauptvertreter dieser Familie ist NRAS, das ur‐
sprünglichauseinemhumanenNeuroblastomisoliertwurde158.InNeuroblastomzellen
mithoherMalignitätwirdNRAShöherexprimiertalsindenenmitniedrigererMaligni‐
tät100.InTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswarNrasebenfallserhöht.
Schulteetal.beschreiben,dassKDM1AinundifferenziertenNeuroblastomenhochregu‐
liert ist.Außerdem regulierendifferenzierendeNeuroblastomzelllinienKDM1Aherun‐
terunddieHerunterregulationvonKDM1Amittels siRNA führtzurWachstumsinhibi‐
tion in vitro35. Sowohl LSL‐MYCN;Dbh‐iCre als auch TH‐MYCN Tumore weisen im
Vergleichzunicht‐malignenNebenniereneinesignifikanteÜberexpressionvonKdm1a
mRNAauf.
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumorenexprimierienSpermidinSynthase(SRM)über.DieExpres‐
siondiesesEnzymskorreliertstarkmitderExpressionvonMYCNinhumanenNeuro‐
blastomen103.
Weitere Gene, die im LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModell reguliert wurden, wurdenmit einer
Internet‐Datenbank Myc‐regulierter Gene verglichen (www.myc‐cyncer‐gene.org),
wobeivalidiertwerdenkonnte,dassdiverseZielevonMYC,die imhumanenOrganis‐
musreguliertwerden,auchimmurineneinerRegulationunterliegen.
Einzelne mRNAs, die im murinen System anders reguliert waren, als im humanen
Neuroblastom, wurden ebenfalls detektiert, wodurch der Unterschied zwischen den
beidenSpeziesdeutlichwird.VerschiedeneepigenetischeRegulationsmechanismenund
verschiedeneSignalwegekönntenhiereineBegründungsein.
Diskussion
101
5.1.3.3 Vergleich der Genregulationen von Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen
mithumanenundanderenmurinenNeuroblastomenaufmiRNAEbene
Mittels miRNA Profiling von fünf nicht‐malignen Nebennieren und elf Tumoren aus
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwurdenimModellreguliertemiRNAsidentifiziert.
AnhandeinerClusteranalysederGene,dieineinerpubliziertenMYCNmiRNASignatur
aufgedecktwurden80, konnten Tumore des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells eindeutig von
nicht‐malignenNebennierensepariertwerden,eindeutlicherHinweisaufdieÄhnlich‐
keitderMYCNreguliertenmiRNAsinmurinenundhumanenTumoren.
DieRegulationeinzelnermRNAsderMYCNmiRNASignatur80undweitererbekannter
miRNAZielevonMYCNinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellswurdenimFolgen‐
denmithumanenNeuroblastomenverglichen:
TumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenwieseneineerhöhteExpressiondesmiR‐17‐92
Clusters auf. Für das humane Neuroblastom ist bekannt, dass dieses von c‐MYC und
MYCN induzierte, onkogene Cluster, Targets mit Schlüsselrollen in der Kontrolle des
Zellzyklus und der Apoptose reguliert159, wie zum Beispiel Bim59, E2F1159, p2159 und
TGFβ61. Für TH‐MYCN Tumore ist die Hochregulation verschiedener miRNAs des
miR‐17‐92Clustersebenfallsbeschrieben160.
Im Vergleich zu Neuroblastomenmit günstigemVerlauf, überexprimieren sowohl Tu‐
moremitungünstigemVerlaufalsauchTumoremitMYCNAmplifikationdasonkogene
miR‐181 Cluster80,110,112. Mestdagh et al. zeigen, dass miR‐181a zwar in MYCN‐
amplifizierten,abernicht inTumorenmiteinzelnerMYCNKopiehochreguliert istund
dassMYCNdirektandenPromotorvonmiR‐181abindet80.AuchinLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
TumorenwarmiR‐181aüberexprimiert.
Die miR‐184 ist herunterreguliert in MYCN‐amplifizierten Tumoren im Vergleich zu
Tumoren mit nur einer Kopie von MYCN112. In den humanen Neuroblastomzelllinien
KellyundSK‐N‐ASkorrelierteineektopischeExpressionvonmiR‐184mitderInhibie‐
rung des Überlebens und der Herunterregulation von AKT2, einem Mitglied des
Phophatidylinositol‐3‐Kinase Signalweges, das eine wichtige Rolle für das Überleben
vonverschiedenenTumorzellenspielt.EineÜberexpressionvonMYCNführtzurHerun‐
terregulation der tumorsuppressiven miR‐184112,113,161. Auch Tumore des
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells wiesen eine Herunterregulation von miR‐184 auf, die
vermutlichaufdieÜberexpressionvonMYCNzurückzuführenist.
Diskussion
102
EineniedrigeExpressionvonmiR‐340istsignifikantmitMYCNAmplifikation,schlech‐
temEreignis‐freiemundGesamtüberlebenkorreliert. Außerdem führt dieExpression
vonmiR‐340 in denhumanenNeuroblastomzelllinien SK‐N‐BE, SH‐SY5YundKelly zu
einer signifikanten Reduktion der Zellviabilität80,115. Tumore aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCre
MäusenzeigtenebenfallseinegesteigerteExpressionvonmiR‐340.
Schulte et al. beschreiben eine signifikante Korrelation von niedrigermiR‐542‐5p Ex‐
pression und hohem Stadium in primären Neuroblastomen. Des Weiteren zeigen sie
eineAssoziationvonPatienten,dieeinenRückfallerleidenodereineMYCNAmplifika‐
tion haben und niedrigerer Expression dieser miRNA67. Sowohl miR‐542‐5p als auch
miR‐542‐3pwareninLSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCNTumorensignifikantherunter‐
reguliert.
SowohlmiR‐26a undmiR‐26b als auchmiR‐30a,miR‐30d undmiR‐30e undmiR‐328
waren in Tumoren aus LSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen niedriger exprimiert als in nicht‐
malignenNebennieren.EineFunktiondiesermiRNAsinhumanenoderTH‐MYCNTumo‐
ren ist zwar noch nicht beschriebenworden, aber sowohl inMYCN‐amplifizierten hu‐
manenNeuroblastomenalsauchinmurinenTumorensindsieherunterreguliert80,160.
WeiteremiRNAs,diesowohl inhumanenNeuroblastomenmitMYCNAmplifikationals
auch in Tumoren des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modells gleich reguliert werden, sind
miR‐15b, miR‐30c, miR‐103, miR‐140, miR‐148a, miR‐326, miR‐491, miR‐500 und
miR‐61580. Funktionen dieser miRNAs im Neuroblastom sind bisher jedoch nicht be‐
kannt.
Sowohl miR‐149, miR‐214 und miR‐324‐5p als auch miR‐331 und miR‐488 sind in
Tumorendes LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells undhumanenNeuroblastomen verschieden
reguliert.Während humaneNeuroblastomemit ungünstiger Prognose eine niedrigere
miR‐149 undmiR‐324‐5p Expression aufweisen als die mit günstiger Prognose110,112,
exprimierenTumoredesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsdiesemiRNAsüber.Tumoremit
MYCN Amplifikation bzw. ungünstiger Prognose exprimieren miR‐214 über, was ver‐
mutlichaufdiedirekteBindungvonMYCNandenPromotordermiRNAberuht80,wäh‐
rend Tumore der LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Maus eine Herunterregulation dieser miRNA
aufweisen.HumaneNeuroblastomemitungünstigemVerlaufexprimierenimVergleich
zu denen mit günstigem Verlauf niedrige Level der miRNAs miR‐331‐3p und
miR‐488‐p110,währendTumoreausLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusenbeidemiRNAsüberex‐
primieren.
Diskussion
103
AusderAnalysederinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsreguliertenmRNAund
miRNA lässt sich zusammenfassen, dass ein großer Teil der im Modell regulierten
mRNAsundmiRNAsTargetsvonMYC(N)sindunddassdiversemRNAsundmiRNAsim
LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Modell ähnlich reguliert sind wie im humanen Neuroblastom. Je‐
dochwurdenauchmRNAsundmiRNAsgefunden,dieimmurinenSystemandersregu‐
liertwaren,als imhumanenNeuroblastom,woranderUnterschiedzwischendenSpe‐
zieserkennbarwird.EineweitermöglicheBegründungdafürkönntesein,dasssichdie
miRNA‐Bindestellen mancher mRNAs zwischen den Spezies unterscheiden
(www.targetscan.org),waszuverschiedenenRegulationenführt.
EinevollständigeÜbertragungvonErkenntnissensowohlaufderEbenechromosomaler
Aberrationenals auchaufmRNAundmiRNALevel,die imLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModell
gewonnenwerden, aufdashumaneNeuroblastom istdemnach,wie in jedemanderen
Mausmodell auch, nicht möglich. Jedoch kann das LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodell
genutztwerden,umneuepotentielltumormodulierendemRNAsundmiRNAszuidenti‐
fizieren. Ob diese auch bei der humanen Erkrankung eine Rolle spielen, muss dann
weiteranalysiertwerden.
5.1.4 MöglicheWeiterentwicklungen des LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells, die neue
ErkenntnissefürdieForschungamhumanenNeuroblastomgebenkönnten
Eine interessante Fragestellung betreffend der Neuroblastomentwicklung des
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,istdienachderZeitspanne,inderdasTransgenexprimiert
werdenmuss,damit esdieEntstehungeinesTumorsvermittelt.Dazu soll in späteren
VersuchendieVerpaarungderLSL‐MYCNMausmiteinerinduzierbarenDbh‐iCreMaus
durchgeführtwerden.Stubbuschetal. generierten2011dasMausmodellDbh‐CT,des‐
senCre‐Rekombinase‐AktivitätabhängigvoneinerBehandlungmitTamoxifen ist.Wie
beidemindieserArbeitverwendetenModellvonStankeetal.40stehtdieCre‐Rekombi‐
nase‐Expression unter Kontrolle des Dbh‐Promotors, jedoch handelt es sich um eine
inaktive Form der Rekombinase, die nur in Anwesenheit von Tamoxifen aktiviert
wird162. Mittels einer Tamoxifen‐Behandlung doppelt‐transgener LSL‐MYCN;Dbh‐CT
MäusewährendihrerEntwicklungundzuverschiedenenZeitpunktenihresLebenssoll
die Zeitspanne detektiert werden, während der eineMYCN Überexpression die Ent‐
wicklung eines Neuroblastoms vermittelt. Eine Übertragung auf den menschlichen
Diskussion
104
Organismus könnteweitere Einblicke in die Entstehung des humanenNeuroblastoms
gewähren.
Anhand des LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Mausmodells, dessen Tumore sich sowohl in ihren
chromosomalenAberrationenalsauchihrenmiRNAundmRNARegulationenhumanen
Neuroblastomenähneln, könnenneuepotentielleTargets einermedikamentösenThe‐
rapiegefundenundgetestetwerden.DieReaktionderTumoreaufdieBehandlungmit
nochnichtetabliertenMedikamentenkannwichtigeAufschlüsseaufdiehumaneThera‐
pierelevanzderMittelgeben.
EinweitererinteressanterVersuchsansatzistdieVerkreuzungmitanderentransgenen
Mausmodellen,diepotentiellfürdieNeuroblastomgeneserelevanteGeneregulieren.
UnsereArbeitsgruppepublizierte2012dasshLsd1‐Mausmodell,dasDoxycyclin‐abhän‐
gig eine shRNA gegen Lsd1 (Kdm1a) exprimiert, die Kdm1a spezifisch herunterregu‐
liert163.DieVerpaarungdiesesModellsmitderLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausunddieInduk‐
tion des Kdm1a Knockdowns könnte ein interessanter Ansatz zur Untersuchung der
RollevonKdm1abeiderTumorgenesedesNeuroblastomssein.Eswirdvermutet,dass
derKnockdownvonKdm1a,aufgrundseineronkogenenFunktion35,118,dasWachstum
der MYCN‐vermittelten murinen Neuroblastome verlangsamt. Weiterhin könnte der
VergleichdermolekularenEigenschaftenvonDoxycyclin‐behandeltenundnicht‐behan‐
deltenTumorenneueEinblickeindenSignalwegvonKdm1ageben.
AuchdieVerkreuzungmitMausmodellen,diemiRNAsregulieren, istein interessanter
Versuchsansatz. Eine miR‐17‐92‐Maus, die die miRNAs dieses Clusters Cre‐abhängig
deletiert164,stehtunsererArbeitsgruppezurVerfügung.EineHerunterregulationdieses
ClustersindenZellendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells,diehumanesMYCNexprimieren,
könntedieTumorgeneseverlangsamenodersogarunterbinden,schließlichwirddiesen
onkogenenmiRNAseinewichtigeFunktionimNeuroblastomzugeschrieben59,61.Weiter‐
hinkönntenunbekannteTargetsdermiRNAsdiesesClustersanhandvonExon‐Arrays
entdeckt werden, die nicht nur im Mausmodell sondern auch im humanen Neu‐
roblastomeineRollebeiderFunktiondiesermiRNAsspielenkönnten.
Diskussion
105
DieEtablierungeinerZelllinieausTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellskannvon
großerBedeutung fürdieArbeitmitdiesemModell sein.PotentiellwirksameMedika‐
mente könnten vor dem in vivo Experiment an den Zellen in vitro getestet werden,
wodurchTierexperimenteeingeschränktwürden. ImVerlaufdieserArbeit ist esnicht
gelungeneineZellliniedesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellszuetablieren.
5.1.5 Die Relevanz des LSL‐MYCN Mausmodells für die Genese anderer
Tumorentitäten
Neben der Verpaarung mit derDbh‐iCre Maus, wurden LSL‐MYCN Tiere mit Alb‐iCre
Mäusengekreuzt.Doppelt‐transgeneNachkommenentwickeltenimAltervon246‐286
Tagen mit einer Inzidenz von 86% Tumore, die pathologisch als Leberzellkarzinome
beschriebenwurden (Datennicht gezeigt). Somit konnte gezeigtwerden, dass die Ex‐
pression vonhumanemMYCN in spezifischenGewebendieEntwicklung vonweiteren
Tumormodellen treiben kann. Besonders für Tumorentitäten, für die noch keine pas‐
sendenMausmodelleexistieren,wäredieseininteressanterAspektfürdieForschung.
T5.2
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Diskussion
107
5.2.1 DietumorsuppressiveFunktionvonmiR‐542imNeuroblastom
Aufgrund der niedrigen Expression vonmiR‐542‐3p in murinen Neuroblastomen des
neuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodellswurdevermutet,dassmiR‐542‐3peinetumor‐
suppressiveFunktionimNeuroblastomhabenkönnte.EinesignifikanteHerunterregula‐
tionvonmiR‐542‐3pinhumanenNeuroblastomenmitschlechterPrognoseimVergleich
zuTumorenmitguterPrognosebestätigtedieseThese.
AnhandvoninvitroAnalyseninetabliertenNeuroblastomzelllinienwurdederNachweis
erbracht,dasseineexogeneExpressionvonmiR‐542‐3psowohlApoptoseinduziertals
auch die Viabilität und Proliferation der Zellen reduziert. Weiterhin konnte gezeigt
werden,dassdieExpressiondiesermiRNAeinenArrestderZellen inderS‐Phasedes
Zellzyklusmit sich bringt.Dahingegen resultierte die exogeneExpressionder5p‐Isof‐
ormdermiR‐542nurbeieinerderanalysiertenZelllinienineinerReduktionderZellvi‐
abilitätund‐proliferation.WederApoptosenocheinArrestimZellzykluswurdeinden
Zelllinien ausgelöst. Dieses Resultat unterstützt die Publikation von Bray etal., dass
miR‐542‐5p keinen Effekt auf die Proliferation der Neuroblastomzelllinien Kelly,
NB1691 und SK‐N‐AS hat, aber sowohl in Kelly als auch in SK‐N‐AS Zellen zu einer
verringerten Invasivität durch eineMatrigel‐Matrix führt68. Entgegen der allgemeinen
Annahme, dass die 5p‐Isoform vonmiRNAs diejenige ist, die den biologischen Effekt
ausmacht, wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass im Fall der miR‐542 die 3p‐Form als
tumorsuppressivfungiert,währenddie5p‐FormkeineneindeutigenEffektzeigt51,52.
Yoon et al. publizierten, dassmiR‐542‐3p das vorhergesagte Target Survivin in A549
undMCF7 Zellen direkt herunterreguliert69. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt
werden, dass in primären humanen Neuroblastomen eine niedrige Expression von
SurvivinzumeinenmiteinergesteigertenExpressionvonmiR‐542‐3pundzumanderen
einer besseren Prognose für den Patienten einhergeht,wobei die Korrelationmit der
Prognosebekanntist173,174.WeiterhinwareineexogeneExpressionvonmiR‐542‐3pin
NeuroblastomzelllinienmiteinerHerunterregulationvonSurvivinkorreliert.Außerdem
führtediesermiR‐542‐3p‐vermittelteKnockdownvonSurvivinzueinerVerminderung
derExpressionvonAURKB,demKomplexpartnervonSurvivin.Esistbekannt,dassdie
EntfernungvonSurvivinmitFehllokalisationundverminderterAktivitätvonAURKBin
Zusammenhangsteht.AußerdemführtderKnockdownvonSurvivinzuFehlernbeider
Zytokinese, die auf die verminderteAktivität vonAURKBzurückgeführtwerden175‐177.
InteressanterweisewirdbeiderdurchdiePolo‐like‐Kinase1‐vermitteltenPhosphoylie‐
rung von Survivin zuerst Survivin und dann AURKB aktiviert178.Wie schon für A549
Diskussion
108
Zellenpubliziert69,wurdeanhandvonLuziferaseReporterAssayseinedirekteBindung
dermiR‐542‐3pandieWildtyp3’UTRvonSurvivin,sowohlinfürdiesenAssayetablier‐
tenHEK‐293 als auch in SHEP Zellen, nachgewiesen,während dieser Effektmit einer
mutiertenBindestellenichterreichtwurde.
In Neuroblastomzelllinien führte ein Knockdown von Survivin zu einer verminderten
Zellviabilitätund‐proliferation,einEffekt,derauchdurchExpressionvonmiR‐542‐3p
erreichtwurde.BeiderUntersuchungdesZellzyklusreagiertendreivonvierZelllinien
beiKnockdownvonSurvivinmiteinemArrestinderPhaseS,währendeineZellliniemit
einemArrestinderG2/M‐Phaseantwortete.
Die herausragende Bedeutung von Survivin für die tumorsuppressive Funktion der
miR‐542‐3p im Neuroblastomzelllinien, konnte anhand eines Rettungsexperimentes
bewiesenwerden.DieÜberexpressionvonSurvivincDNAohnemiR‐542‐3p‐Bindestelle
rettetedieNeuroblastomzelllinieSHEPgrößtenteilsvordemPhänotypdermiR‐542‐3p
Expression. Daraus lässt sich schließen, dass es einen Zusammenhang zwischen dem
Phänotyp dermiR‐542‐3p Expression und der Survivin Regulation gibt. Jedoch ist es
möglich, dassdieRegulation vonanderenZielendiesermiRNAebenfalls eine funktio‐
nelle Auswirkung auf den Phänotyp humaner Neuroblastomzellen haben könnte. In
zusätzlichenExperimenten,diebeimVerfassendieserArbeitnochnichtabgeschlossen
waren, sollten weitere von miR‐542‐3p regulierte Targets gefunden werden. Dazu
werden mRNA‐Expressionsprofile von mit Negativkontroll‐miRNA oder miR‐542‐3p
transfiziertenNeuroblastomzelllinienmiteinanderverglichen.Weiterepotentiellfunkti‐
onelle Targets der miRNA, die dabei evtl. gefunden werden, sollen dann anhand von
weitereninvitroStudienvalidiertwerden.
Transfektionsreagenzienwerden benutzt, ummiRNAs in vitro in Zellen einzubringen.
Für eine Behandlung in vivo müssen miRNAs vor ihrem Abbau durch Nukleasen ge‐
schütztwerden.DieArbeitsgruppeEppleanderUniversitätDuisburg‐Essenentwickelte
Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel,mitderenHilfesiesiRNAsinvitroinZelleneinbringen
konnten,waszueinerHerunterregulationdessiRNATargetsführte84.Dabeiwerdenmit
siRNA‐beladene Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel durch Endozytose in die Zelle aufge‐
nommen.ImZytoplasmaschütztderNanopartikeldieNukleinsäurevorihremAbbau.Es
istbekannt,dassdasEindringenderNukleinsäureindenZellkernüberKernporenkom‐
plexevermitteltwird,aberesistnochunklar,obderNanopartikeldiesenWegebenfalls
nimmt oder im Zytoplasma verbleibt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten mit miRNA‐
beladeneCalcium‐Phosphat‐NanopartikelfürdieUntersuchungdertumorsuppressiven
Diskussion
109
FunktionvonmiR‐542‐3pinvivoverwendetwerden.ZuerstwurdederenFunktionalität
invitroanWACIIZellenvalidiert.ImVergleichzurunbehandeltenKontrollereagierten
mitNegativkontroll‐miRNAbeladenenNanopartikeln behandelte Zellenmit einer ten‐
denziellen,abernichtsignifikantenReduktionvonZellviabilitätsowie‐proliferationund
mit einer signifikanten Induktion von Apoptose. Demnach schienen die verwendeten
Calcium‐Phosphat‐Nanopartikel allgemein einen toxischen Effekt aufWACII Zellen zu
induzieren.EineToxizitätaufdieZellviabilität ist inHeLaZellennichtbekannt179.Auf‐
grund der apoptotischen Wirkung von PEI auf verschiedene humane Zelllinien180,181,
wurdevermutet,dassauch inWACIIZellendas indenNanopartikelnvorhandenePEI
derenToxizitätausmacht.TrotzdeminduzierteeineBehandlungvonWACIIZellenmit
miR‐542‐3pbeladenenNanopartikelnimVergleichzuunbehandeltenundmitNegativ‐
kontroll‐miRNAbehandeltenZellensignifikantsowohleineReduktionderZellviabilität
und‐proliferationalsaucheineSteigerungderApoptose.AufBasisdieserTatsacheund
desNachweises, dassmiR‐542‐3p‐beladeneNanopartikel die SurvivinProteinExpres‐
sion inWACII Zellen reduzieren, wurde die Spezifität der mit miR‐542‐3p‐beladenen
Nanopartikel bestätigt. Weiterhin wurden Neuroblastom‐Xenografts‐tragende Mäuse
mitmiR‐542‐3p beladenen Nanopartikeln über zwei Tage behandelt. Sowohl eine er‐
höhteExpressionvonmiR‐542‐3palsaucheineReduktionvonSurvivinProteinkonnte
in den Tumoren aus mit miR‐542‐3p behandelten Mäusen im Vergleich zu den mit
Negativkontroll‐miRNAbehandeltenvalidiertwerden,wasdieSpezifitätderNanoparti‐
kel auch invivo bestätigte.Die signifikanteReduktionvonProliferationund Induktion
von Apoptose in diesen Tumoren wies darauf hin, dass der miR‐542‐3p‐vermittelte
KnockdownvonSurvivinauchinvivofunktionellwar.DieProduktionvonmiRNA‐bela‐
denenNanopartikelnistbiszumheutigenZeitpunktnochineffektiv,weshalbeineLang‐
zeitstudie zum Effekt der Behandlung auf die Volumenveränderung der Tumore im
RahmendieserArbeitnichtdurchgeführtwerdenkonnte.
AufgrundderhohenÜberexpressionvonSurvivininverschiedenenTumorentitätenund
derniedrigenExpressioninnormalenGewebenwirdSurvivinsowohlalsTumormarker
alsauchalsTargetfürdieNeuroblastomtherapiediskutiert182,183.VerschiedeneGruppen
beschreiben Medikamente, die die Expression von Survivin in Neuroblastomzellen
reduzieren. Demnach ist die proapoptotische Antwort der Neuroblastomzelllinien
SK‐SY5Y und LA1‐5S auf Noscapine vermittelt durch die Unterdrückung der Survivin
Protein Expression184. Interessanterweise potenziert ein Survivin Knockdown in SK‐
N‐BE2 und SH‐SY5Y Zellen den Effekt von Epigallocatechingallat185, einem
Diskussion
110
CarbonsäureesterderGallussäure,deringrünemTeevorkommtunddemapoptotische
Wirkung in verschiedenen neuroektrodermalen Tumoren nachgewiesen wurde186. Da
ein direkter Knockdown von Survivin in vivo nicht ausführbar ist, könnte hier eine
Kombination aus miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln und Epigallocatechingallat
getestetwerden.YM155,einnieder‐molekularesPräparatzurRepressionvonSurvivin,
wurde2007vonNakaharaetal.beschrieben.DieSubstanzsupprimiertdieExpression
von Survivin, induziert Apoptose von Prostatakarzinomzelllinien PC‐3 und PPC‐1 in
vitround induziertTumor‐RegressionvonXenograftsausPC‐3Zellen187.Lamersetal.
untersuchten die Effizienz von YM155 in 23 Neuroblastomzelllinien, die auf einen
shRNA‐vermitteltenKnockdownvonSurvivinmitmassiverApoptose reagierten.Neun
Zelllinienwiesen eineResistenz gegenYM155 auf, diemit hoher Expression desMul‐
tidrug‐ResistanceProtein1(MDR1)korrelierte74.UnterdenresistentenZelllinienbefin‐
det sich unter anderen SK‐N‐BE, die wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, auf die
miR‐542‐3p‐vermittelte Repression von Survivin sehr effizient reagiert. In weiteren
StudiensolltedieEffektivitätdermiR‐542‐3pExpressionaufweitereNeuroblastomzell‐
liniengetestetwerden,davermutetwird,dassdertumorsuppressiveEffektdermiRNA
nichtdurchResistenzentwicklungaufgehobenwerdenkann.
Sobald die Effizienz der Nanopartikelherstellung erweitert und damit effektiver ist,
könnte eine Nanopartikel‐basierte Therapie mit ausgewählten miRNAs, wie der
miR‐542‐3p, inZukunfteinneuerAnsatz fürdieBehandlunghumanerNeuroblastome
undandererTumorentitätensein.
Diskussion
111
5.2.2 DietumorsuppressiveFunktionvonmiR‐137imhumanenNeuroblastom118
SowohlimneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCrealsauchimetabliertenTH‐MYCNMausmodellfür
dasNeuroblastomwarKdm1a imVergleichzunicht‐malignenNebennierensignifikant
hochreguliert. Auf Basis dieser Erkenntnis wurde KDM1A als potentielles Ziel einer
Neuroblastomtherapie gehandelt. In verschiedenen Tumorentitäten wie Brustkrebs33,
kleinzelligem Lungenkarzinom, Kolorektal‐, Blasen‐ und Prostatakrebs188 ist KDM1A
überexprimiert. Auch im humanenNeuroblastom ist eine erhöhte Expression imVer‐
gleich von undifferenzierten zu differenzierten Tumoren bekannt35. Weiterhin ist
KDM1AinnerhalbderneuroblastischenTumoreimNeuroblastomhöherexprimiertals
imgutartigenGlanglioneuroblastom189.DieEffektivitätverschiedenernieder‐molekula‐
rer Inhibitoren gegenMonoaminoxidasenwurden auf ihreWirkung gegen KDM1A in
NeuroblastomzelllinienSHEP,SH‐SY5YundLAN‐1getestet,jedochwareinEffektaufdie
ViabilitätderZellennur invitro,nichtaberim invivoXenograft‐Modellnachweisbar35.
DieEntwicklungvonneuenspezifischenKDM1AInhibitorenwirdalsKDM1A‐gerichtete
TherapiegegendasNeuroblastomdiskutiert35,190.
EinemöglicheVerminderungderKDM1AExpressionkönnteauchdurchdieExpression
einermiRNAerreichtwerden,diedirektandie3’UTRvonKDM1Abindet.Einepotentiell
tumorsuppressive Funktion, die eine Bindestelle in der 3’UTR von humanem KDM1A
aufweist, war miR‐137. In murinen LSL‐MYCN;Dbh‐iCre Tumoren war diese miRNA
hochreguliert, was die These einer tumorsuppressivenmiRNA nicht unterstützte. Am
murinen Kdm1a befindet sich jedoch keine Bindestelle für diese miRNA
(www.targetscan.org),weshalbdieseRegulationsachse immurinenSystemkeineRolle
spielt.ImhumanenNeuroblastomwurdedieFunktionvonmiR‐137imweiterenVerlauf
derAnalysenuntersucht.
Eine niedrige Expression vonmiR‐137 ging sowohlmit ungünstigemVerlauf als auch
mit niedrigeremÜberleben vonNeuroblastompatienten einher. Invitro reduzierte die
exogeneExpression dermiRNA sowohl Zellviabilität und ‐proliferation als auch indu‐
zierte sie Apoptose, Caspase 9 Aktivität sowie neuronale Differenzierung der Neuro‐
blastomzelllinienIMR‐32,SHEPundSK‐N‐BE.WeiterhinwurdeKDM1Adirektdurchdie
ExpressionmiR‐137herunterreguliert,wodurchdasKDM1AZielTFPI2ebenfallsregu‐
liertwurde.FürmiR‐137sindverschiedenemRNAZielevorhergesagt,weshalbsichdie
Frage stellte, welcher Teil des Effektes von miR‐137 auf die Regulation von KDM1A
zurückgingundwelcheraufdenKnockdownanderermiR‐137Ziele.EinRettungsexpe‐
rimentzeigte,dassderEffektdermiR‐137ExpressionteilweiseaufdieRegulationvon
Diskussion
112
KDM1Azurückzuführenwar,jedochandereZieledermiRNAebenfallseinefunktionelle
Rollespielenmussten.WeiterhinerklärtedasModelldiephänotypischenUnterschiede
zwischenderExpressionvonmiR‐137unddesKnockdownvonKDM1AmittelssiRNA,
wiezumBeispieldieEinleitungvonApoptoseoderderBlockderProliferationinIMR‐32
Zellen.
AnhandderdurchgeführtenProteomanalysewurdeAKAP2alsweiterespotentiellfunk‐
tionelles Target der miR‐137 gefunden. Dieses Protein, welches vier Bindestellen für
miR‐137 aufweist, separiert die Prognose von Neuroblastompatienten anhand seiner
Expression in den Tumoren,was eine onkogene Funktion vermutet lässt. Der Knock‐
down von AKAP2 mittels siRNA kopierte den Phänotyp der miR‐137 Expression. Im
RahmendieserArbeitwurdedieBedeutungdermiR‐137‐vermitteltenRegulationvon
AKAP2nichtweiteruntersuchtunddiedirekteBindungdermiRNAandievorhergesag‐
tenBindestellenbishernichtvalidiert. InweiterenExperimentensollteAKAP2alspo‐
tentiellfunktionellesTargetdermiR‐137näheruntersuchtwerden.BiszudiesemZeit‐
punktistnochkeineFunktionvonAKAP2inKrebserkrankungenbeschrieben.
InteressanterweiseistKDM1AauchinneuralenVorläuferzellenexprimiertundintera‐
giert hier mit dem Transkriptionsfaktor NR2E1. Dieser nukleare Rezeptor wird aus‐
schließlich imembryonalenNeuroepitheliumexprimiertundregulierthierdieExpres‐
sionvonmiR‐137.KDM1AgiltalstranskriptionalerKo‐RepressorvonNR2E1undeine
erhöhteExpressionvonmiR‐137inneuralenStammzellenführtzureduzierterProlife‐
rationund induziert neuronaleDifferenzierung191.DieExpression vonmiR‐137 ist im
GlioblastomsignifikantniedrigeralsimGehirnundinneuralenStammzellen.Weiterhin
unterstützteineÜberexpressiondermiRNAneuronaleDifferenzierung inGlioblastom‐
zellen. In diesen Zellen wird ein weiteres Zielgen der miR‐137, nämlich RTVP‐1, be‐
schrieben, das direkt von miR‐137 gebunden wird und dessen Herunterregulation
tumorsuppressiveWirkunghat192.Lietal.demonstrierten,dassdieExpressionvonmiR‐
137dasZellwachstumsowiedieInvasionderGlioblastomzellenU87undU373inhibiert
und die Expression von CSE1L, einemweiteren vorhergesagten Target diesermiRNA,
reguliert193.WeiterhinsupprimiertmiR‐137dieInvasionvonKolorektalkarzinomzellen
durchdiedirekteBindunganFMNL2120.AndersrumführtdieSuppressionvonmiR‐137
inKolorektalkarzinomzellenzueinerÜberexpressionvonPaxillin(PXN)undzurInhibi‐
tionderProliferation,MigrationundInvasionderZellen119. InBrustkrebszellen istdie
Diskussion
113
Expression von miR‐137 invers mit der von YB‐1 korreliert, einem weiteren Target
diesermiRNA194.SowohlCDC42alsauchCDK6sindbeschriebeneTargetsvonmiR‐137
inLungenkrebszellen,derenProliferationdurchdieExpressionvonmiR‐137 inhibiert
wird121.DieseundweiterePublikationenunterstützendieTheseeinertumorsuppressi‐
ven Funktion vonmiR‐137 in verschiedenen Tumorentitäten, die in dieser Arbeit an‐
handdesNeuroblastomsgezeigtwurde.DiebeschriebenenTargetsdermiRNAkönnten
auch im humanen Neuroblastom die tumorsuppressive Funktion vonmiR‐137weiter
erklären.
ZusammenfassungundAusblick
114
6 ZusammenfassungundAusblick
DasNeuroblastom istderhäufigstesolideTumordesKindesaltersundverantwortlich
fürca.15%allerpädiatrisch‐onkologischenTodesfälle.EineAmplifikationdesOnkogens
MYCN,durchwelchedieprognostischungünstigstePatientengruppedefiniertist,liegtin
20%allerNeuroblastomevor.ImRahmendieserArbeitwurdeeinneuesCre‐konditio‐
nalesMYCN‐vermitteltesMausmodell (LSL‐MYCN) entwickelt.DurchdieKreuzungmit
Dbh‐iCre Mäusen wurde die Expression desMYCN Transgens auf Dopamin‐‐Hydro‐
xylaseexprimierendeZellenbeschränkt,waszurEntwicklungvonTumorenderNeben‐
nieren, der oberen Zervikalganglien und des Ganglion coeliacum führte. Die Tumore
wiesensowohldiefürdasNeuroblastomspezifischenkleinen,blauenundrundenZellen
alsauchneurosekretorischeVesikelauf.WeiterhinkonnteeinesignifikanteÜberexpres‐
sion von humanem MYCN und spezifischer Neuroblastommarker detektiert werden.
Genomische Aberrationen sowie mRNA und mikroRNA (miRNA) Expressions‐Profile
entsprachendenenhumanerNeuroblastome.
MiRNAs sind kurze, nicht‐kodierende RNA Moleküle, die durch Bindung an mRNAs
derenStabilitätundTranslationregulieren.DieBedeutungvonmiRNAsinderTumorbi‐
ologie ergibt sich aus der Regulation von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen. In
humanenprimärenNeuroblastomenwardieniedrigeExpressiondermiRNAsmiR‐542‐
3pundmiR‐137mitungünstigerPrognoseassoziiertundeineHerunterregulationvon
miR‐542‐3pkonnteauchinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModellsbeobachtetwer‐
den.DieFunktionbeidermiRNAswurde invitro inpräklinischenModellsystemendes
humanen Neuroblastoms detailliert untersucht. Die ektope Expression der miRNAs
reduziertedieZellviabilitätundProliferation,erhöhtedieApoptoserateundinduzierte
einenZellzyklusarrest.WeiterhinwurdediedirekteBindungder vorhergesagtenZiel‐
mRNAsKDM1A(miR‐137)undSurvivin(miR‐542‐3p)mittelsLuziferaseReporterAna‐
lysenvalidiertunddieRegulationsowohlaufmRNA‐alsauchaufProteinebeneverifi‐
ziert.DieHerunterregulationderZielgeneinNeuroblastomzellenstellteeinePhänoko‐
piederEffekteeinerexogenenExpressionderjeweiligenmiRNAdar.DieSpezifitätder
miRNA‐vermittelten Regulationwurde durch ektope Expression des Zielgensmitmu‐
tierter miRNA‐Bindestelle nachgewiesen. Eine Therapiesimulation in Neuroblastom‐
Xenografts mit miR‐542‐3p‐beladenen Nanopartikeln zeigte sowohl eine Herunterre‐
ZusammenfassungundAusblick
115
gulationdesZielproteinsSurvivinalsaucheineReduktionderProliferationundErhö‐
hungderApoptoserateindenTumorzellen.
DieEtablierungdesneuenLSL‐MYCN;Dbh‐iCreNeuroblastom‐Mausmodellskanndabei
helfensowohldiePathogenesedesNeuroblastomsbesserzuverstehenalsauchpotenti‐
ellNeuroblastom‐relevanteGeneundmiRNAszuidentifizieren.EineWeiterentwicklung
dieses Modells durch Kombination mit anderen Mausmodellen, die potentiell Neuro‐
blastom‐relevante Gene regulieren, könnte im Zusammenspiel mit neuen Behand‐
lungsstrategien Einblicke in die Wirksamkeit von künftigen Neuroblastomtherapien
geben. Die Behandlung humaner Neuroblastompatienten mit tumorsuppressiven
miRNAs,wiemiR‐542‐3pundmiR‐137,könnteeinmöglicherAnsatzseindenaggressi‐
venVerlaufdieserErkrankungzureduzieren.
Abstract
116
7 Abstract
Neuroblastomaisacommonsolidtumorofinfancyandaccountsformorethan15%of
pediatric cancer deaths. Amplification ofMYCN oncogene defines themost aggressive
subtypeofneuroblastomawithpoorprognosis. Inthepresentstudy,anewCre‐condi‐
tionalMYCN‐driventransgenicmousemodelwasgeneratedtoanalysetumorigenesisin
vivo.WhentargetingMYCNexpressiontotheneuralcrestintransgenicLSL‐MYCN;Dbh‐
iCremice,palpabletumorsdeveloped,whicharosepredominantly frombothadrenals,
but also from superior cervical ganglia and ganglion coeliacum. LSL‐MYCN;Dbh‐iCre‐
induced tumors consisted of small round blue cells and possessed neurosecretory
vesicles.ExpressionofhumanMYCNandspecificneuroblastomamarkergeneswashigh
intumors.Furthermore,murineneuroblastomasrecapitulatedgenomicaberrationsand
MYCNmRNAaswellasmicroRNA(miRNA)signaturesdescribedforhumanneuroblas‐
toma.MiRNAsaresmallnoncodingRNAmoleculesthatbindtargetmRNAsresultingin
translational repressionordegradationof themRNA. Incancer, theycanactas tumor
suppressorsoroncogenes. Inhumanprimaryneuroblastomas, lowexpressionofmiR‐
542‐pandmiR‐137washighlycorrelatedwithunfavourableprognosisandmiR‐542‐3p
wasupregulatedinmurineLSL‐MYCN;Dbh‐iCretumors.Exogenousexpressionofthese
miRNAs in established neuroblastoma cell lines reduced viability and proliferation,
increased apoptosis and induced cell cycle arrest. Furthermore, direct interaction be‐
tweenthepredictedtargetssurvivin(miR‐542‐3p)andKDM1A(miR‐137)wasvalidated
by luciferase reporter assays and regulation was demonstrated on mRNA as well as
protein level. Ectopic expression of miR‐542‐3p or miR‐137 phenocopied the knock‐
down of respective targets. In addition, wewere able to validate a direct interaction
between miRNAs and their targets by performing rescue experiments. Treatment of
micebearingneuroblastomaxenograftswithmiR‐542‐3p‐loadednanoparticlesresulted
indownregulationof survivinand inducedreduced tumorcellproliferationaswell as
increasedapoptosis.
Inconclusion,thenovelLSL‐MYCN;Dbh‐iCreneuroblastomamousemodelcontributeto
abetterunderstandingofMYCN‐drivenneuroblastomaandtoidentificationofrelevant
genes and miRNAs. Combination with other transgenic models, regulating potential
relevantgenes,couldprovidenewinsightsintoneuroblastomatumorigenesis.Restoring
functionoftumorsuppressivemiRNAs,suchasmiR‐542‐3pormiR‐137,couldrepresent
afeasibleapproachtoreduceneuroblastomaaggressiveness.
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Abkürzungen
131
9 Abkürzungen
°C GradCelsiusaCGH Array‐comparativegenomichybridizationAURKB AuroraBKinaseBIRC5 BaculoviralIAPrepeat‐containing5bp BasenpaarBrdU 5‐bromo‐2‘‐DeoxyuridinCAG Hühner‐Aktin‐PromotorcDNA komplementäreDNACDK4 Cyclin‐abhängigeKinase4CPC ChromosomalPassengerKomplexCt‐Wert Schwellenwert‐ZyklusDbh Dopaminbeta‐HydroxylaseDGCR8 DiGeorgesyndromecriticalregiongene8DKFZ DeutschesKrebsforschungszentrumDMSO DimethylsulfoxidDMSZ DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbHDNA DesoxyribonukleinsäuredNTP DesoxyribonukleosidtriphosphatEDTA EthylendiamintetraessigsäureES EnrichmentScoreES‐Zellen embryonaleStammzellenetal. undandereFCS fetalcalfserum(fetalesKälberserum)FDR falsch‐positivRateFluc LuziferaseGeng ErdbeschleunigungG1‐Phase PostmitoseG2/M‐Phase PrämitoseundMitoseGAPDH Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐DehydrogenaseGFP GrünfluoreszierendesProteinGOI geneofinterestGSEA GeneSetEnrichmentAnalyseH&E Hematoxylin&EosinHCl ChlorwasserstoffINSS InternationalNeuroblastomaStagingSystemIRES interneribosomaleEintrittsstellei.v. intravenöskb kiloBasenKDM1A Lysin‐spezifischeDemethylase1LB‐Medium lysogenybrothLDH Laktat‐Dehydrogenase
Abkürzungen
132
LIN28B LIN28HomologBLSL loxP‐flankiertePolyadenyl‐StoppsequenzmiRNA microRNAMPL MolecularProteomicsLaboratoryMSigDB MolecularSignaturesDatenbankMTT 3‐(4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐Diphenyl‐tetrazoliumbromidMYCN v‐myc myelocytomatosis viral related oncogen ,neuroblastoma
derivedNEFL NeurofilamentNES normalisierterEnrichmentScoreNTRK1 neurotropheRezeptor‐Tyrosinkinase1OD optischeDichtePBS PhosphatgepufferteSalzlösungPCR PolymerasekettenreaktionPEI Poly‐Ethyleniminpri‐miRNA primäremicroRNApre‐miRNA Vorläufer‐microRNAqPCR quantitativePolymerasekettenreaktionRCME Rekombinase‐vermittelteKassettenaustauschstelleRIPA RadioimmunoprecipitationassaybufferRISC RNA‐induziertersilencingKomplexRNA RibonukleinsäureS‐Phase SynthesePhasedesZellzyklusSDS‐PAGE Natriumdodecylsulfat‐PolyacrylamidgelelektrophoresesiRNA silencerRNASRM SpermidinSynthaseTBS TrisgepufferteSalzlösungTFPI2 tissuefactorpathwayinhibitor2TH TyronsinHydroxylaseTris Tris(hydroxymethyl)‐aminomethanU unitUBE2C Ubiquitin‐konjugierendeEnzymE2CUTR untranslatierteRegionUV ultraviolettwt Wildtyp
10 A
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…...49
Abbildungs‐undTabellenverzeichnis
134
Abb.20: GenomischeAberrationenvonTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Modells………………………………………………………………………………..……………………………...50
Abb.21: GensetEnrichmentAnalyse……………………………………………………………………….52
Abb.22: ReguliertemRNAsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMausmodells……….53
Abb.23: RegulierteMYCTargetsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCreModells………...54
Abb.24: ReguliertemiRNAsinTumorenvonLSL‐MYCN;Dbh‐iCreMäusen……………….55
Abb.25: RegulierteMYCNmiRNATargetsinTumorendesLSL‐MYCN;Dbh‐iCre
Modells……………………………………………………………………………………………………………….56
Abb.26: RegulationvonmiR‐542inTumorenderMausmodelle
LSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN………………………………………………….……………………57
Abb.27: KorrelationvonmiR‐542‐5pund‐3pExpressionmitprognostischen
MarkernundÜberlebeninhumanenNeuroblastomen…………………………………………60
Abb.28: KorrelationvonmiR‐542‐5pund‐3pExpressionmitgünstigemVerlauf
humanerNeuroblastome……………………………………………………………………………………..61
Abb.29: KorrelationvonmiR‐542‐3pundSurvivininhumanenNeuroblastomen……62
Abb.30: ReduktionderViabilitätvonhumanenNeuroblastomzelllinienmittels
miR‐542‐3pExpression……………………………………………………………………………………….63
Abb.31: ReduzierteKonfluenzvonNeuroblastomzellennachmiR‐542‐3p
Expression…………………………………………………………………………………………………………..64
Abb.32: VerschiebungdesZellzyklusdurchgesteigerteS‐Phasein
NeuroblastomzellennachmiR‐542‐3pExpression………………………………………………..65
Abb.33: InduktionvonApoptoseundReduktionvonProliferationin
NeuroblastomzellennachmiR‐542‐3pExpression………………………………………………..65
Abb.34: HerunterregulationvonSurvivininNeuroblastomzellennachmiR‐542‐3p
Expression…………………………………………………………………………………………………………..67
Abb.35: DirekteBindungvonmiR‐542‐3panSurvivin3’UTR………………………………….68
Abb.36: SpezifischeReduktionvonSurvivinProteinmittelssiRNA…………………………69
Abb.37: ReduktionderViabilitäthumanerNeuroblastomzellliniendurch
HerunterregulationvonSurvivin………………………………………………………………………….37
Abb.38: VerschiebungdesZellzyklusdurchgesteigerteS‐bzw.G2/M‐Phasein
NeuroblastomzellennachHerunterregulationvonSurvivin………………………………….70
Abb.39: ReduktionderProliferationhumanerNeuroblastomzellliniendurch
HerunterregulationvonSurvivin………………………………………………………………………….70
Abb.40: SurvivinÜberexpressioninSHEP‐SurvivinnachInduktionmit
Tetrazyklin………………………………………………………………………………………………………….71
Abbildungs‐undTabellenverzeichnis
135
Abb.41: PartielleWiederherstellungdesmiR‐542‐3pPhänotypsmittels
ÜberexpressionvonSurvivinohnemiR‐542‐3pBindestelle….…………………………..… 72
Abb.42: StrukturvonmiRNA‐beladenenNanopartikeln………………………………………….72
Abb.43: ReduktionderZellviabilitätundderProliferation,Induktionvon
ApoptoseundHerunterregulationvonSurvivinmittelsmiR‐542‐3p‐beladenen
NanopartikelinWACIIZelleninvitro…………………………………………………………………....74
Abb.44: ExpressionvonmiR‐542‐3pundHerunterregulationvonSurvivinmittels
miRNA‐beladenenNanopartikelninWACII‐Xenograftsinvivo………………………………75
Abb.45: HemmungderProliferationundInduktionvonApoptoseinmiR‐542‐3p‐
exprimierendenNeuroblastom‐Xenografts…………………………………………………………...76
Abb.46: RegulationvonKDM1AmRNAinLSL‐MYCN;Dbh‐iCreundTH‐MYCN
Tumoren………………………………………………………………………………………………..……………77
Abb.47: 3’UTRvonKDM1AmitBindestellevonmiR‐137………………………………………..78
Abb.48: RegulationvonmiR‐137inLSL‐MYCN;Dbh‐iCreTumoren………………………….78
Abb.49: KorrelationderExpressionvonmiR‐137mitprognostischenMarkern
undÜberlebeninhumanenPrimärtumoren………………………………………………………….79
Abb.50: KorrelationvonmiR‐137ExpressionmitgünstigemVerlaufhumaner
Neuroblastome……………………………………………………………………………………………………80
Abb.51: ReduktionderViabilitäthumanerNeuroblastomzelllinienmittels
exogenermiR‐137Expression……………………………………………………………………………...81
Abb.52: ReduktionderKonfluenzhumanerNeuroblastomzellliniennachexogener
miR‐137Expression…………………………………………………………………………………………….81
Abb.53: InduktionvonApoptoseundReduktionderProliferationinmiR‐137
exprimierendenZellen…………………………………………………………………………………………82
Abb.54: EinleitungneuronalerDifferenzierunginmiR‐137‐exprimierendenZellen…82
Abb.55: HerunterregulationvonKDM1AinmiR‐137‐exprimierendenZellen…………..83
Abb.56: DirekteBindungvonmiR‐137andie3’UTRvonKDM1A……………………………84
Abb.57: ReaktionvonKDM1AZielenaufmiR‐137‐induzierteHerunter‐regulation
vonKDM1A…………………………………………………………………………………………………………84
Abb.58: SpezifischeReduktionvonKDM1AProteinmittelssiRNA…………………………..85
Abb.59: ReduktionderZellviabilitätdurchHerunterregulationvonKDM1A……………85
Abb.60: InduktionvonApoptoseundReduktionderViabilitätundProliferation
vonZellendurchHerunterregulationvonKDM1A…………………………………………………86
Abb.61: InduzierbareExpressionvonKDM1AinSHEP‐KDM1AZellenresistent
gegenmiR‐137Expression…………………………………………………………………………………..88
Abb.62: 3’UTRvonAKAP2mitBindestellenvonmiR‐137……………………………………….89
Abb.63: HerunterregulationvonAKAP2mittelsExpressionvonmiR‐137……………….89
Abb
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Anhang
139
11.2.2 Kongressbeiträge
Auszüge der Arbeit wurden auf folgenden Konferenzen für einen Vortrag oder eine
Posterpräsentationausgewählt:
11.2.2.1 Vorträge
AlthoffK,LindnerS,OderskyA,MestdaghP,MolenaarJJ,KnauerS,SpelemanF,BaekK,
VandesompeleJ,EggertA,SchrammA,SchulteJH.MiR‐542‐3pexertstumorsuppressive
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‐AdvancedNeuroblastomResearchConference,08.‐21.Juni2012,
Toronto,Kanada
‐4thInternationalTuebingenSymposiuminPediatricSolidTumors–FromBench
toBedsideinNeuroblastoma,16.‐18.Februar2012,Tübingen
11.2.2.2 Posterpräsentationen
AlthoffK,BeckersA,SprüsselA,ThorT,HeukampL,dePreterK,KumpsC,SpelemanF,
SchrammA,EggertA,SchulteJH.AnewMYCN‐drivenneuroblastomamousemodelusing
Cre‐drivenconditionalexpressionofMYCN.
‐PediatricCancerResearchattheINTERFACE,06.‐08.Juni2013,Wien,Österreich
‐5thAnnualMeetingofNGFN‐PlusandNGFN‐TransferintheProgramofMedical
GenomeResearch,11.‐13.Dezember2012,Heidelberg,Deutschland
‐11.ForschungstagderMedizinischenFakultätderUniversitätDuisburg‐Essen,
23.November2012
AlthoffK,LindnerS,OderskyA,MestdaghP,MolenaarJJ,KnauerS,SpelemanF,BaekK,
VandesompeleJ,EggertA,SchrammA,SchulteJH.MiR‐542‐3pexertstumorsuppressive
functionsinneuroblastomabydown‐regulatingsurvivin.
‐PediatricCancerResearchattheINTERFACE,06.‐08.Juni2013,Wien,Österreich
‐5thAnnualMeetingofNGFN‐PlusandNGFN‐TransferintheProgramofMedical
GenomeResearch,11.‐13.Dezember2012,Heidelberg,Deutschland
Anhang
140
AlthoffK,BeckersA,OderskyA,MestdaghP,SpelemanF,VandesompeleJ,EggertA,
SchrammA,SprüsselA,SchulteJH.MiR‐137functionsasatumorsuppressorin
neuroblastomabydownregulatingKDM1A.
‐PediatricCancerResearchattheINTERFACE,06.‐08.Juni2013,Wien,Österreich
‐5thAnnualMeetingofNGFN‐PlusandNGFN‐TransferintheProgramofMedical
GenomeResearch,11.‐13.Dezember2012,Heidelberg,Deutschland
‐AdvancedNeuroblastomResearchConference,08.‐21.Juni2012,Toronto,
Kanada
‐4thInternationalTuebingenSymposiuminPediatricSolidTumors–FromBench
toBedsideinNeuroblastoma,16.‐18.Februar2012,Tübingen,Deutschland
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141
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