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Aus derNeurologischen Klinik des St. Josef-Hospital
- Universitätsklinik -der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. Przuntek____________________________________________
Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus,Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson
Inaugural-Dissertationzur
Erlangung des Doktorgrades der Medizineiner
Hohen Medizinischen Fakultätder Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt vonThomas Hummel
aus Berlin2001
Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent: Prof. Dr. Dr. W. Kuhn
Koreferent: Prof. Dr. med. Malin
Tag der mündlichen Prüfung: Dienstag, 17.07.2001
Für meine Eltern
Abstract
Hummel
Thomas
Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Polymorphismus, Homocystein und MorbusParkinson
Homocystein ist eine schwefelhaltige, aliphatische Aminosäure, welche Ausgangsstoff
der Remethylierung des Methionin ist und auf verschiedene andere Stoffwechselwege
Einfluß nimmt. Homocystein kann auf verschiedene Arten pathogen auf den
menschlichen Organismus wirken. Es induziert oxidativen Streß durch seine zweifache
Wirkung am NMDA-Rezeptor (exzessiver Kalzium-Ionen-Einstrom und reaktive
Oxygenierung) und durch eine Erhöhung des Homocystein Thiolacton-Spiegels,
wodurch es zu einer vermehrten Bildung freier Radikale kommt. Des weiteren wirkt
Homocystein prothrombogen und induziert Arteriosklerose mit daraus resultierendem
erhöhten Schlaganfall- und Herzinfarktrisiko als anerkannter, unabhängiger
Arterioskleroserisikofaktor.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde bei 79 Parkinsonpatienten im Vergleich zu
Kontrollen eine signifikante Erhöhung der Homocysteinkonzentration gefunden. Hierbei
zeigte sich eine signifikante Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration vom
heterozygoten und homozygoten MTHFR C677T Genotyp.
Homocystein könnte somit ein wichtiger ätiologischer oder prognostischer Faktor des
Morbus Parkinson sein. Eine Hyperhomocysteinämie kann neben anderen Auslösern
auch durch eine L-Dopa-Therapie bedingt sein. Die MTHFR C677T Punktmutation mit
ihrem heterozygoten und homozygoten Genotyp ist mit einer Prävalenz von ca. 50% in
der Bevölkerung weit verbreitet als ein möglicher Auslöser einer
Hyperhomocysteinämie und der damit verbundenen Risiken.
Falls die Ergebnisse dieser Arbeit in weiteren Studien bestätigt werden können, müßte
vor der Einleitung einer L-Dopa-Therapie eine Bestimmung der Homocysteinkonzen-
tration im Serum erfolgen und im Falle einer Erhöhung eine Genotypisierung der
MTHFR durchgeführt werden. Bei einem heterozygoten oder homozygoten Genotyp
müßte eine kontinuierliche Kontrolle der Homocysteinkonzentration im Serum der
Parkinsonpatienten erfolgen, und im Falle einer Erhöhung eine Homocystein-senkende
Therapie durchgeführt werden, um schwerwiegende Komplikationen zu vermeiden.
Inhalt
1. Einleitung 1
1.1. Morbus Parkinson 1
1.1.1. Allgemeines 1
1.1.2. Pathologisch-anatomische Grundlagen 1
1.1.3. Klinik und Diagnosestellung 2
1.1.4. Ätiologie 3
1.1.5. Therapie 4
1.2. Homocystein 6
1.3. Hyperhomocysteinämie 11
1.4. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase 12
1.5. Fragestellung 13
1.5.1. Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson 13
2. Material und Methoden 16
2.1. Materialien 16
2.1.1. Geräte 16
2.1.2. Verbrauchsmaterialien 16
2.2. Patienten 16
2.2.1. Ausschlußkriterien 16
2.2.2. Einschlußkriterien 17
2.2.3. Patientendaten 17
2.3. Verlaufsprotokoll 17
2.3.1. Motorikerfassung 17
2.4. Verarbeitung der Proben 18
2.4.1. Vitamin B12 und Folsäure 18
2.4.2. Vitamin B6 19
2.4.3. Homocystein 20
2.4.4. Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase 20
2.4.5. Cholesterin und Triglyceride 23
2.5. Statistische Auswertungskriterien 23
2.6. Ethische Kriterien 23
3. Ergebnisse 24
3.1. Charakterisierung der untersuchten Probanden 24
3.1.1. Patienten 24
3.1.2. Kontrollgruppe 26
3.1.3. Zusatzuntersuchungen der Patienten 27
3.2. Statistik und Auswertung 29
3.2.1. Vergleich der Homocysteinkonzentration der 29
Parkinsonpatienten und Kontrollen
3.2.2. Kontrollgruppe im Vergleich zu Patienten mit 31
Unterschiedlicher Genetik
3.2.3. Vergleich der Patienten mit unterschiedlicher 33
Genetik
4. Diskussion 35
4.1. Schlußfolgerung 38
5. Literaturverzeichnis 43
6. Danksagung 63
7. Lebenslauf 64
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: L-Dopa-Metabolismus 7
Abb. 2: Homocystein-Metabolismus 9
Abb. 3: Folat-Stoffwechsel 10
Abb. 4: Normaler, heterozygoter, homozygoter Genotyp 22
Abb. 5: Homocysteinkonzentration der Patienten mit heterozygoter (I), 32
homozygoter (II), normaler (III) Genetik und Kontrollgruppe
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Die Klassifizierung nach Hoehn und Yahr 18
Tab. 2: Patientenkollektiv 25
Tab. 3: Kontrollgruppe 26
Tab. 4: Zusatzparameter des Patientenkollektivs 28
Tab. 5: Varianzanalyse bezüglich der Homocysteinkonz. der 30
Parkinsonpatienten und der Kontrollen
Tab. 6: Post hoc Test: 1 = Parkinsonpatienten; 2 = Kontrollen 30
Tab. 7: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, 30
Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure) der Patienten
und Kontrollen
Tab. 8: Mittelwerte des Homocysteins und der Covarianten 31
(0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homozygot; 3=normal)
Tab. 9: Standardabweichung des Homocysteins und der Covarianten 31
(0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homozygot; 3=normal)
Tab. 10: Post hoc Test: {1}=Kontrollen; {2}=heterozygot; 32
{3}=homozygot; {4}=normal
Tab. 11: Varianzanalyse: Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, 32
Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure) der Kontrollen und Patienten
mit heterozygotem, homozygotem, normalem Genotyp
Tab. 12: ANOVA: Mittelwerte mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 33
3=normalem Genotyp der Parkinsonpatienten
Tab. 13: Standardabweichungen mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 33
3=normalem Genotyp der Parkinsonpatienten
Tab. 14: Post hoc Test der Mittelwerte der Homocysteinkonzentrationen 34
(1=heterozygoter, 2=homozygoter, 3=normaler Genotyp der
Parkinsonpatienten)
Tab. 15: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, 34
Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride,
L-Dopa-Dosis, Dauer der Erkrankung, Krankheitsausprägung
(Hoehn-Yahr-Skala)) innerhalb der verschiedenen
Mutationsformen
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AMP Adenosin-5´-Monophosphat
ANOVA Analysis of Variance
ATP Adenosin-Triphosphat
CH3 Methylgruppe
CMP Cytidin-Monophosphat
CO2 Kohlendioxid
COMT Catechol-O-Methyl-Transferase
Cu++ Kupfer
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Et al. et alii (und andere)
FADH2 Reduzierte Form des Flavin-Adenin-Dinucleotid
g Gramm
GMP Guanosin-Monophophat
GTP Guanosin-Triphosphat
H2O Wasser
H2O2 Wasserstoffperoxid
HCHO Formaldehyd
Het. Heterozygot
Hinfl Restriktionsendonuklease
Hom. Homozygot
HPLC High Performance Liquid Chromatographie
ITP Inosin-Triphosphat
K+ Kalium
Kontr. Kontrolle
l Liter
LDL Low Density Lipoprotein
L-Dopa L-Dihydroxy-Phenylalanin
m männlich oder milli (10-3)
M Molar
MAO-B Monoaminooxidase B
Mg++ Magnesium
MPP+ 1-Methyl-4-Phenylpyridinium
MPTP 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin
MTHFR Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase
MTHFR C677T Punktmutation am Nukleotid 677 der MTHFR,
an der Cytosin gegen Thymin substituiert wird
µ Mikro (10-6)
NAD+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid
NADH+H+ Reduzierte Form des NAD+
NADP+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NADPH+H+ Reduzierte Form des NADP+
Neg. negativ
NH3 Ammoniak
Norm. Normal
O2 Sauerstoff
Pat. Patient
PCR Polymerase Chain Reaction
Pi Phosphat
Pos. Positiv
PPi zwei Phosphate
SAH S-Adenosyl-Homocystein
SAM S-Adenosyl-Methionin
SBD-F Thio-spezifisches Reagenz
Tab. Tabelle
UMP Uridin-Monophosphat
w weiblich
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Morbus Parkinson
1.1.1. Allgemeines
James Parkinson beschrieb erstmalig ein hypokinetisch-hypertones Krankheitsbild in
seiner Abhandlung „An essay on the shaking palsy“ (Parkinson 1817), welches später
als Morbus Parkinson in der Neurologie ihren Eingang fand. M. Hall beschrieb dieses
Phänomen 1841 als „Paralysis Agitans“. Im Volksmund nennt sich die Krankheit
„Schüttellähmung“.
Der Morbus Parkinson gehört zu den häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen
(Kessler 1978) deren Prävalenzrate von 0,1-0,2% im Alter stark zu nimmt (über 55-
jährig: 1,4%) (De Rijk et al. 1995). 80% der Fälle sind Patienten, die älter als 65 Jahre
sind (Kurtzke et Kurland 1977). Bisher wurden keine signifikanten
geschlechtsspezifischen Unterschiede der Prävalenzrate gefunden (Sutcliff et al. 1985).
Die Inzidenzrate liegt bei der schwarzen Weltbevölkerung signifikant niedriger als bei
der weißen Bevölkerung (Zhang et Román 1993). Insgesamt wird die Zahl der
Parkinson-Kranken in Deutschland auf etwa 150.000 - 200.000 geschätzt (Schneider
1991).
1.1.2. Pathologisch-anatomische Grundlage
Der Morbus Parkinson ist eine Erkrankung, die neuropathologisch durch eine
Degeneration dopaminerger Neurone in den vorwiegend ventro-lateralen Anteilen der
Substantia nigra pars compacta und des Locus coeruleus gekennzeichnet ist (Gibb et
Lees, Tertiakoff 1919). Diese nigrale Degeneration geht in 80% der Fälle mit der
Bildung sogenannter Lewy-Körper einher. Sie stellen intraneuronale eosinophile
Einschlußkörper dar, welche aus Neurofilamenthaufen und dem Streßprotein Ubiquitin
bestehen (Riede et Schäfer 1993). Man nimmt an, daß diese Einschlußkörper den
neurogenen „Streß“ widerspiegeln (Langston 1996). Diese lassen sich aber auch bei
anderen degenerativen Erkrankungen nachweisen (Rossor 1996). Lewy-Körper fanden
Einleitung
2
sich bei Parkinson-Patienten auch in extranigralen Strukturen des limbischen Systems
(tiefe Schichten der entorhinalen Region, Hippocampusformation, Amygdala), in diffus
zur Hirnrinde projizierenden Kerngebieten und in Zentren zur Regulation autonomer
Funktionen (Braak et al. 1996). Erst bei einem nigralen Zellverlust von 60-70% wird die
Erkrankung klinisch manifest (Schneider 1997). Biochemisch ist der Morbus Parkinson
durch einen verminderten Dopamin-Gehalt des Corpus Striatum gekennzeichnet, der
durch eine herabgesetzte Bildung in der Substantia nigra und durch eine erhöhte
Aktivität der Monoaminooxidase-B im nigrostriatalen System resultiert (Poewe et
Oertel 1992; Riederer 1995). Die klinischen Kardinalsymptome Rigor, Tremor,
Bradykinese resultieren aus diesem Dopamin-Mangel im nigrostriatalen System und aus
anderen abhängigen Transmittersystemen in nicht nigralen Strukturen (Poewe et al.
1996; Deutschl 1996).
1.1.3. Klinik und Diagnosestellung
Die Klinik des idiopathischen Morbus Parkinson ist in drei Subtypen unterteilt. Es
werden der Tremor-Dominanztyp, der Rigor-Akinese-Dominanztyp und der
Äquivalenztyp unterschieden (Poewe et al. 1983). Wenn systemübergreifende
Beschwerden wie Hirnatrophie, zerebelläre Ataxie oder Blickparesen hinzukommen
wird dies als „Parkinson-Plus“ bezeichnet (Schneider 1997). Motorische Symptome des
Morbus Parkinson sind Akinese/Bradykinese (Amimie, Mikrographie, Einschränkung
der Feinmotorik), Rigor mit Zahnradphänomen und Tremor (niederfrequenter
Ruhetremor von 3-5/s unterschiedlicher Amplitude bei 90% der Patienten im Laufe der
Erkrankung) (Dengler 1995; Przuntek 1992; Fischer 1995; Schneider 1997; Deutschl
1996). Vegetative Symptome sind vermehrter Speichelfluß und Talgproduktion
(Salbengesicht), Obstipation (Jurow 1998; Jost et Schimrigk 1992), Harnverhalt,
Impotenz und Blutdruckregulationsstörungen mit Hypotonie (Jörg 1993; Jost 1995).
Psychische Symptome bestehen nicht selten aus einer depressiven Stimmungslage (10%
schwerwiegend, 45% leichtgradig), die häufig (ca. 20%) mit einem kognitiven Defizit
assoziiert ist (Bader et Hell 1998; Ebert et Lammers 1997; Lang 1994). Desweiteren
können psychotische Episoden nach jahrelangem Therapieverlauf auftreten (Fassauer
1998). Angststörungen zeigen etwa 40% aller Parkinson-Patienten (Poewe et al. 1996).
Einleitung
3
Gerade die beschriebene Symptomatik der Parkinson-Erkrankung ist von entscheidender
Bedeutung bei der Diagnosestellung, da diese bis heute klinisch zu stellen ist. Es
existieren keine spezifischen genetischen, biochemischen oder breit anwendbare
neuroradiologische Parameter (Brooks 1997). Krankheitsverlauf, das Ansprechen auf L-
Dopa und das Fehlen von unvereinbaren Befunden sind ebenfalls von Bedeutung zur
Diagnosestellung (Oertel et al. 1996; Poewe et al. 1996). Die nicht seltenen
Fehldiagnosen zeigen bei der Vielzahl der Differentialdiagnosen wie schwierig die
Diagnosestellung mitunter für den Kliniker sein kann (Quinn 1995).
1.1.4. Ätiologie
Die Ursache der Parkinson-Erkrankung ist heute immer noch nicht abschließend geklärt.
Genetische Faktoren scheinen, wie epidemiologische Studien zu Erkrankungsfällen
unter Familienangehörigen zeigen, eine pathogenetische Rolle zu spielen (Payami et al.
1994; Vieregge et Heberlein 1995). Das Erkrankungsrisiko für Angehörige gegenüber
der Normalbevölkerung ist erhöht (Bonifati et al. 1995; Vieregge et Heberlein 1995). In
einigen Familienuntersuchungen zeigte sich ein autosomal dominanter Erbgang (Waters
et Miller 1994; Wszolek et al. 1994), wohingegen einige Zwillingsuntersuchungen
gegen eine genetische Ätiologie sprechen (Duvoisin et al. 1981; Marsden 1987). Es
zeigte sich jedoch in einer weiteren Studie, daß bei einigen der zur Zeit
asymptomatischen Zwillingsgeschwister mit Hilfe der Positronen-Emissions-
Tomographie (PET)-Technik nigrostriäre Veränderungen nachzuweisen waren (Burn et
al. 1992; Holthoff et Vieregge 1994). Ob eine multifaktorielle Genese der Erkrankung
anzunehmen ist, wird zur Zeit diskutiert (Langston 1996), wobei Mutationen
verschiedener Gene als Risikofaktoren angesehen werden. Diese sind: Cytochrom P450
2D6 (Armstrong et Daly 1992; Smith et al. 1992; Langston 1996), Glutathion S-
transferase M1 (Langston 1996), Polymorphismus in den Genkodierungen der
Monoaminooxidase B (Kurth et al. 1993) und der Monoaminooxidase A (Hotamisligil
et al. 1994). Bei dem Abbau von Dopamin entstehen aus dem Zwischenprodukt
Wasserstoffperoxid chemisch reaktive Hydroxylradikale. Bei dieser Reaktion wird,
unter Beteiligung von Melanin, zweiwertiges in dreiwertiges Eisen umgewandelt. Die
Dopamin-Zelle ist also einem hohen „oxidativen Streß“ ausgesetzt, welcher zur
Einleitung
4
Degeneration der Zelle führen könnte (Lange et al. 1992). In Post-Mortem-
Untersuchungen wurden bei Parkinson-Patienten freie Sauerstoffradikale und eine
reduzierte Aktivität der Glutathion-Peroxidase, die protektiv wirkt, in den Basalganglien
gefunden (Poewe 1994). Ursache könnte ein Komplex-I-Defekt der mitochondrialen
Atmungskette sein (Reichmann et al. 1993). Die Theorie des „oxidativen Stresses“
unterstrich die Entdeckung der Substanz 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin
(MPTP), welche ein akutes und anhaltendes Parkinson-Syndrom auslösen kann
(Hellenbrand 1993; Ballard et al. 1985). MPTP wird in 1-Methyl-4-Phenylpyridinium
(MPP+) umgewandelt, welches über spezielle Dopamintransporter in die Zelle gelangt
und somit hochselektiv für das dopaminerge System ist (Hellenbrand 1993; Jenner et
Olanow 1996). Durch den elektrochemischen Gradienten konzentriert sich MPP+ in den
Mitochondrien und hemmt dort den Komplex-I der Atmungskette (Hellenbrand 1993;
Jenner 1996; Reichmann et al. 1993; Lange et al. 1992). Die klinischen Auswirkungen
unterscheiden sich nicht von denen des Morbus Parkinson, es fehlt jedoch die
Progredienz, und es lassen sich keine Lewy-Körperchen finden. Die Ähnlichkeit vieler
Pestizide zu MPTP werfen die Frage nach ätiologisch relevanten Umweltfaktoren auf
(Lange et al. 1992; Kuhn et Müller 1996). Es gibt Fallbeschreibungen eines Parkinson-
Syndroms nach 15-jährigem Kontakt mit Paraquat (Sanchez-Ramos et al. 1987). Unter
dem Begriff der multifaktoriellen Genese werden des weiteren auch noch Ernährungs-
einflüsse und sekundäre Ursachen (Traumen, Infekte, Medikamente etc.) diskutiert.
Auch wird die Apoptose als ein möglicher ätiologischer Faktor der Neurodegeneration
angesehen (Przuntek et al. 1996; Mochizuki et al. 1997).
1.1.5. Therapie
Das therapeutische Spektrum des Morbus Parkinson ist aufgrund der erforschten
neurochemischen, neurophysiologischen, neuroanatomischen, histochemischen und
pathophysiologischen Grundlagen des bestehenden Dopamindefizites vorangetrieben
worden. Birkmayer und Hornykiewicz setzten 1961 erstmalig aufgrund der
Entdeckungen von Carlsson et al. 1958 im Tierversuch 3,4-Dihydroxyphenyl-L-Alanin,
genannt L-Dopa, zur Behandlung von Patienten mit Morbus Parkinson ein. L-Dopa ist
die direkte metabolische Vorstufe des Dopamins und kann die Blut-Hirn-Schranke
passieren. Mit der Einführung der Kombination des L-Dopa mit peripheren
Einleitung
5
Decarboxylasehemmern (Benserazid und Carbidopa) ließen sich mehrfach höhere
Konzentrationen im zentralen Nervensystem mit einer Verminderung der peripheren
Nebenwirkungen erreichen (Birkmayer et Birkmayer 1989; Calne et al. 1971;
Lieberman et al. 1975). Zentrale Nebenwirkungen wie Hyperkinesien, Angstzustände,
Halluzinationen, Wahnvorstellungen, Alpträume, Verwirrtheitszustände („Dopa-
Psychose“) traten damit mehr in den Vordergrund (Birkmayer et Birkmayer 1989). Die
Langzeittherapie mit L-Dopa wird dafür verantwortlich gemacht, daß es zu einer
Akzeleration der Neuronendegeneration und zur Progredienz zentraler Nebenwirkungen
kommt (Cohen 1984; Nakamura 1997). Nach Therapiedauer von 3-5 Jahren ist mit
einem Wirkverlust des L-Dopa zu rechnen (Lees 1994), so daß heute versucht wird die
L-Dopatherapie soweit wie möglich hinauszuzögern und zunächst eine Kombination mit
anderen Antiparkinson-Mitteln anzustreben ist. Eine kausale Therapie ist bis zum
heutigen Tage nicht möglich, aufgrund der noch nicht endgültig geklärten Ätiologie. Die
medikamentöse Therapie kann somit nur symptomatisch und substituierend sein (Kuhn
et Müller 1997).
Aufgrund der ausgeprägten Nebenwirkungen der L-Dopa Therapie wurden alternative
Therapiemöglichkeiten zur Verbesserung der dopaminergen Transmission entwickelt.
Großen Stellenwert nehmen hierbei die Dopaminagonisten ein (z. B. Bromocriptin,
Lisurid, Pergolid, Alpha-Dihydro-Ergocryptin, Cabergolin und Apomorphin), welche
zur direkten, selektiven Stimulation postsynaptischer, dopaminerger D1- und D2-
Rezeptoren führen (Kuhn et Müller 1997; Jörg 1997). Dopaminagonisten zeigten im
Tierversuch einen MPTP-antagonistischen Effekt und könnten somit neuroprotektiv
wirken (Cohen 1984; Lange et al. 1994; Przuntek 1994). Die Dopaminkonzentration im
synaptischen Spalt wird durch die Hemmung der Monoaminooxidase B (MAO-B)
(Selegilin) oder der Catechol-0-Methyl-Transferase (COMT) (Tolcapone und
Entacapone) erhöht und somit eine Verbesserung der Symptomatik erzielt. Das zentral
und peripher wirksame Tolcapone wurde im November 1998 wegen seltenen, akut
verlaufenden, hepatotoxischen Nebenwirkungen vom deutschen Markt genommen. In
vorherigen Studien wurde bereits auf eine mögliche neurotoxische Wirkung und
potentielle Risiken zentral wirksamer COMT-Hemmer hingewiesen (Kuhn 1998). Des
weiteren können Anticholinergika und Glutamatrezeptorantagonisten (Amantadin,
Dimethylamantadin) als adjuvante Therapiemöglichkeit verwendet werden.
Einleitung
6
Anticholinergika sind vor allem bei vegetativen Nebenwirkungen und Tremor-
symptomatik indiziert. Glutamatrezeptorantagonisten haben sich besonders bei akine-
tischen Krisen, Rigor und Tremor auch als Monotherapie bewährt und erfahren zur Zeit
aufgrund ihrer außerdopaminergen Wirkung eine Renaissance (Kuhn et Müller 1997).
Die neurochirurgische Therapie hat durch die Probleme der medikamentösen
Langzeittherapie, durch neuere Erkenntnisse über Pathomechanismen und Topographie
des Morbus Parkinson sowie weiterentwickelte Operationstechniken wieder an
Bedeutung gewonnen (Müller 1996). Zur Anwendung kommen als stereotaktische
Therapieansätze die Thalamo- und Subthalamotomie, besonders bei Rigor und Tremor
(Müller 1994, Moringlaine 1996, Kupsch et Oertel 1996, Oertel 1991, Ostertag et al.
1997). Durch eine gezielte Läsion des posteroventralen Globus pallidus internus
(Pallidotomie) kann es zu einer dramatischen Verbesserung sowohl von Rigor, Tremor
und Akinese kommen (Müller 1994, Laitinen et al. 1992, Iacano et al. 1994, Kupsch et
Oertel 1996). Neuerdings werden Transplantationsverfahren sowohl mit homologem
ventralen Mittelhirngewebe von menschlichen Feten als auch autologem
Nebennierenmark des Parkinson-Patienten verwendet (Kuhn et Müller 1997, Kupsch et
Oertel 1996, Glaß et Vogel 1991, Vogel 1991). Desweiteren findet die chronische
Stimulation des Nucleus ventralis intermedius thalami und des Nucleus subthalamicus
besonders bei der Tremor-Problematik ihre therapeutische Bedeutung (Kuhn et Müller
1997, Diederich et Alesch 1997, Obeso et al. 1997, Bülau 1998, Kupsch et Oertel 1996).
Ob sich diese Verfahren der konventionellen Thermokoagulation als überlegen
erweisen, kann heute noch nicht mit Sicherheit gesagt werden (Kuhn et Müller 1997,
Kupsch et Oertel 1996).
Eine unterstützende Rolle in der Parkinson-Therapie ist die regelmäßige
Krankengymnastik sowie die logopädische und ergotherapeutische Betreuung (Ulm
1998). Zur psychischen Stabilisierung ist die längerfristige familiäre Betreuung wichtig.
1.2. Homocystein
Homocystein ist eine schwefelhaltige, aliphatische α-Aminosäure, welche
Ausgangsstoff der Remethylierung des Methionin ist und zusammen mit Serin Einklang
Einleitung
7
in der Synthese von 2-Ketobutyrat und Cystein findet (Stryer 1991; Lehninger et al.
1994). Die Synthese des Homocysteins ist abhängig von verschiedenen
Stoffwechselwegen (siehe Abb. 2). Homocystein entsteht aus S-Adenosyl-L-
Homocystein, welches durch die Adenosyl-Homocysteinase unter H2O-Verbrauch zu
Adenosin und Homocystein gespalten wird. S-Adenosyl-L-Homocystein entsteht durch
eine Demethylierung von S-Adenosyl-L-Methionin. S-Adenosyl-L-Methionin ist einer
der wichtigsten Methylgruppendonatoren und wirkt an zahlreichen biosynthetischen
Methylierungen mit. S-Adenosyl-L-Methionin entsteht durch den Transfer einer
Adenosylgruppe von ATP auf das Schwefelatom des L-Methionin. Ein wichtiges
Enzym, welches S-Adenosin-L-Methionin als Methylgruppendonator benötigt, ist die
Catechol-O-Methyltransferase (COMT). Sie läßt sich beim Menschen in fast allen
Geweben nachweisen, insbesondere jedoch im Gehirn, Leber und Intestinum (Kuhn
1998). Die COMT ist wichtig zur Eliminierung biologisch aktiver (z.B. L-Dopa) und
toxischer Katecholamine. Eine typische Reaktion mit Beteiligung der COMT ist die
Metabolisierung von L-Dopa (siehe Abb. 1).
COMT
pos. neg. Ecdysone AMP,GMP,UMP,CMP, Dopa Decarboxylase α-Methyldopa Coenzym: Pyridoxalphosphat CO2
COMT
Disulfiram Ascorbate, O2
Dopamine Hydroxylase Coenzym: Cu++
Dehydroascorbate, H2O
S-Adenosyl-L-Methionine
Phenyl-Ethanol-Amine- N-Methyltransferase S-Adenosyl-L-Homocysteine
Abb. 1: L-Dopa-Metabolismus
L-Dopa
Dopamin
L-Norepinephrine
L-Epinephrine
3-O-Methyldopa
3-O-Methoxytyramin
Einleitung
8
In Gegenwart von S-Adenosyl-L-Methionin entsteht dabei S-Adenosyl-L-Homocystein
und 3-O-Methyldopa. Daraus folgt, daß bei einem Überschuß von L-Dopa vermehrt S-
Adenosyl-L-Homocystein gebildet wird, was dann vermehrt zu Homocystein
umgewandelt wird (Kuhn 1998). S-Adenosyl-L-Methionin kann ebenfalls bei der
Umwandlung von L-Norepinephrin zu L-Epinephrin über die Phenyl-Ethanol-Amin-N-
Methyltransferase als Methylgruppendonor dienen und somit ebenfalls zu einer
Erhöhung des Homocysteins führen. Ursprung dieser Reaktion wäre ein Abbau des L-
Dopa durch die Dopa Decarboxylase (Stryer 1991; Lehninger et al. 1994; Michal 1982).
Diese Reaktion spielt aber seit Einführung der peripheren Decarboxylase-Hemmer eher
eine untergeordnete Rolle.
Homocystein reagiert mit Serin, katalysiert durch die Cystathionin-β-Synthetase, zu
Cystathionin (Abb. 2). Des weiteren wird das Cystathionin durch die Cystathionin-γ-
Lyase in Cystein und α-Ketobutyrat unter Freisetzung von NH3 gespalten. Die Enzyme,
die diese Reaktionen katalysieren, haben Pyridoxalphosphat als Coenzym, welches aus
Vitamin B6 gebildet wird.
Methionin wird durch die Übertragung einer Methylgruppe auf Homocystein
regeneriert. Methylgruppendonor dieser Reaktion ist 5-Methyl-Tetrahydrofolate. Diese
Reaktion katalysiert die 5-Methyl-Tetrahydrofolate-Homocysteine-Methyltransferase.
Coenzyme, die diese Methylierung vermitteln, sind das vom Vitamin B12 abgeleitete
Methylcobamid sowie S-Adenosyl-Methionin, FADH2 und Mg++. Methionin hemmt
diese Reaktion. Alternative Methylgruppendonoren sind Betain und Dimethylthetin.
Einleitung
9
Abb. 2: Homocystein-Metabolismus
Einleitung
10
5-Methyl-Tetrahydrofolat entsteht aus 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat katalysiert durch
die 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase. Cofaktor dieser Reaktion ist NADH+H+,
welches zu NAD+ reduziert wird. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat wird aus 5,6,7,8-
Tetrahydrofolat über verschiedene Methylierungsreaktionen gebildet, die teilweise
Pyridoxalphosphat als Coenzym benötigen. Grundsubstanz dieser Reaktionen ist die
Folsäure (Stryer 1991; Lehninger et al. 1994; Michal 1982).
NADPH+H+
Dihydrofolatdehydrogenase
NADP+
neg. Folatantagon. (Methotrexat), Purines NADPH+H+
Tetrahydrofolate-Dehydrogenase NADP+
HCHO NAD+, Glycine L-Serine
Coenzym: Serine-Hydroxy- Coenzym: Pyridoxalphosphat Methyltransferase Pyridoxalphos.
H2O CO2, NH3, Glycine, NADH+H+ H2O
pos. wenig Methionin
NADH+H+
5,10 Methylene Tetrahydrofolatereduktase
neg. NAD+
ATP, GTP, ITP, Guanosin, Inosin, viel Methionin
Abb. 3: Folat-Stoffwechsel
Folate
7,8-Dihydrofolate
5,6,7,8-Tetrahydrofolate
5,10 Methylene Tetrahydrofolate
5-Methyl Tetrahydrofolate
Einleitung
11
1.3. Hyperhomocysteinämie
Schon seit längerer Zeit ist bekannt, daß Homocystein ein unabhängiger Risikofaktor für
die Atherosklerose und die Atherothrombose ist und somit das Risiko eines
Schlaganfalls, einer koronaren Herzerkrankung und einer arteriellen
Verschlußerkrankung des peripheren Gefäßsystems signifikant erhöht ist (Clarke et al.
1991; Nygard et al. 1997; Alfthan et al. 1997). In letzter Zeit wird die
Hyperhomocysteinämie ebenfalls als ein Risikofaktor für eine tiefe
Beinvenenthrombose diskutiert (Den Heijer et al. 1995; Den Haeijer et al. 1996).
Homocystein wirkt sowohl endothel- als auch gewebetoxisch (Kuhn 1998). Es wird
angenommen, daß die atherogene Potenz des Homocystein durch eine Anhäufung von
Homocystein Thiolacton bedingt wird. Homocystein Thiolacton führt nun zu einer von
Eisen-Ionen katalysierten Thiolation freier Aminogruppen von Low Density
Lipoproteinen (LDL), was eine vermehrte zelluläre Aufnahme von LDL bedingt. Das
durch diese vermehrte LDL Aufnahme in die Zelle gelangte Homocysteine Thiolacton
kann nun seinerseits ebenfalls zu einer Intima-Schädigung führen (McCully 1993,
Hirano et al. 1994). Homocystein liegt zu 20-30% in freier Form und zu 70-80% in
proteingebundener Form vor (Malinow 1994). Bei einem gesunden Menschen liegt der
Homocystein-Spiegel zwischen 5,0 und 15,9 µmol/l Plasma (Ueland et al. 1993). Bei
der Hyperhomocysteinämie wird die mäßig ausgeprägte (16-30 µmol/l), die mittelgradig
ausgeprägte (31-100 µmol/l) und die ausgeprägte (>100 µmol/l) Form unterschieden
(Kang et al. 1992). Als Ursachen einer Hyperhomocysteinämie kommen hereditäre und
erworbene Ursachen in Betracht. Eine hereditäre Ursache ist Cystathionin-β-
Synthetase-Mangel (Boers et al. 1985; Lehninger et al. 1994). Die Genlokalisation
dieses Defektes befindet sich beim Menschen auf dem Chromosom 21. Die homozygote
Form hat eine Inzidenz von 1 zu 332000 (Malinow 1994) und führt zu einer
ausgeprägten Hyperhomocysteinämie mit dem klassischen Bild einer Homocysteinurie.
Die heterozygote Form (Prävalenz 0,5%-1,5% (Boers et al. 1985)) kann eine
mäßiggradig ausgeprägte Hyperhomocysteinämie aufweisen, bei etwa 40% liegen die
Werte aber im Normbereich (Kang et al. 1992; Murphy-Chutorian et al. 1985). Des
weiteren führt ebenfalls ein 5, 10 Methyl-Tetrahydrofolat-Reduktase-Mangel in seiner
homozygoten Form zu einer ausgeprägten Hyperhomocysteinämie (Kang et al. 1992).
Neun seltene Mutationen können zu einem ausgeprägtem Mangel an Methylen-
Einleitung
12
Tetrahydrofolat-Reduktase führen, wobei alle diese Mutationen Einzelbasen-
Substitutionen sind (Rozen 1996).
Des weiteren kann eine Hyperhomozysteinämie durch erworbene Ursachen bedingt sein.
Hierzu zählen ein Betain-Mangel durch cholinarme Kost, Cobalamin- (Vitamin B12)
Mangel, Folsäure-Mangelzustände und ein Mangel an Pyridoxalphosphat (Vitamin B6)
(Kang et al. 1992; Kang et al. 1987). Außerdem kann eine Hyperhomocysteinämie
medikamentös induziert sein. Diese Form der Hyperhomocysteinämie ist unter
Chemotherapeutika- (Methotrexat) und Antikonvulsiva-Therapie (in erster Linie
Phenytoin) nachgewiesen (Refsum et al. 1991; Dastur et Dave 1987).
1.4. 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase
Verschiedene epidemiologische Studien zeigten, daß die milde Form der
Hyperhomocysteinämie ebenfalls ein unabhängiger Risikofaktor für eine Atherosklerose
der Koronararterien, des cerebralen und peripheren Gefäßsystems ist (Van den Berg et
al. 1995; Kluijtman et Van den Heuvel 1996). Die milde Form der
Hyperhomocysteinämie wird mit einem thermolabilen Polymorphismus des Gens,
welches die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase kodiert, in Verbindung gebracht
(Frosst et al. 1995; Kang et al. 1991; Kluijtmans et al. 1996). Es handelt sich hierbei um
eine Punktmutation am Nukleotid 677, bei der Cytosin gegen Thymin substituiert wird.
Diese Punktmutation führt dazu, daß ein Alanin-Codon (GCC) in ein Valin-Codon
(GTC) umgewandelt wird. Diese Substitution resultiert in eine thermolabile Form der
Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase. Die Prävalenz dieser Mutation zeigte sich in einer
Untersuchung von 57 Kanadiern in der heterozygoten Form bei 50% und der
homozygoten Form bei 12% als weit verbreitet (Frosst et al. 1995). Des weiteren fand
sich in 15-17% Nord-Amerikanischer und Niederländischer Patienten, die an einer
koronaren Herzkrankheit erkrankt waren, und in jeweils 5% der Kontrollgruppen diese
thermolabile Variante der Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (Kang et al. 1991;
Kluijtmans et al. 1996). Es wird davon ausgegangen, daß etwa 5% der Normal-
Bevölkerung homozygot für diese Mutation sind (Welch et Loscalzo 1998).
Homozygote Individuen zeigen eine 50%ige Reduktion der Aktivität des Enzyms und
tendieren zu mäßig ausgeprägter Hyperhomozysteinämie (Kang et al. 1992; Rees et
Einleitung
13
Rodgers 1993). Es zeigte sich eine um 24% höhere Homocysteinkonzentration als bei
normalem Genotyp bei einer Folatkonzentration < 15,4 nmol/l. Es zeigten sich
allerdings keine signifikanten Unterschiede in der Homozysteinkonzentration bei einer
Folatkonzentration > 15,4 nmol/l (Jacques et al. 1996). Somit scheint diese Mutation
prädispositionierend für eine Hyperhomozysteinämie zu sein, wenn sie mit einer
niedrigen bis normalen Folatkonzentration einhergeht. In Lymphozytenextrakten zeigte
sich eine signifikant geringere Enzymaktivität. Die homozygote Mutation zeigte eine
verbliebene Aktivität von 30%, heterozygote von 65% im Vergleich zur
Kontrollgruppen-Enzymaktivität. Werden diese Extrakte bei 46°C für 5 Minuten erhitzt
war die verbliebene Enzymaktivität bei homozygotem Normaltyp auf 67%, bei
heterozygoter Mutation auf 56% und bei homozygoter Mutation auf 22% abgesunken
(Frosst et al. 1995). Obwohl der thermolabile Effekt dieser Mutation als gesichert gilt ist
der exakte Mechanismus noch nicht bekannt. Diese Form der Mutation wird in letzter
Zeit auch mit der multifaktoriellen Genese der Neuralrohr-Defekte, wie der Spina
Bifida, in Zusammenhang gebracht (Van der Punt et al. 1995).
1.5. Fragestellung
1.5.1. Hyperhomocysteinämie und Morbus Parkinson
Es ist nachgewiesen, daß die Homocystein-Plasmakonzentration bei Parkinson Patienten
im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant erhöht ist (Kuhn et al. 1998; Allain et al.
1995; Kuhn et al. 1997). Homocystein induziert oxidativen Streß und könnte somit
neben der Gefäßendothelschädigung ebenfalls eine Rolle bei neurodegenerativen
Prozessen spielen (Schlüssel et al. 1995; McCully 1994). Dies unterstreicht die
zweifache Wirkung von Homocystein am N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor. Homocystein
wirkt an der glutamatbindenden Seite des Rezeptors als Agonist, aber ebenso als
partieller Antagonist an der Seite des Rezeptors, welche Glycin als Coagonist hat. Unter
pathologischen Bedingungen, wie Schlaganfall oder Kopftrauma, ist die
Glycinkonzentration erhöht und Homocystein wirkt nun vermehrt als Agonist am N-
Methyl-D-Aspartat Rezeptor. Es kommt somit zu einem exzessiven Kalzium-Ionen
Einstrom und einer reaktiven Oxygenierung. Über diesen Mechanismus wäre eine
neurotoxische Wirkung des Homocystein zu erklären (Lipton et al. 1997, Olney et al.
Einleitung
14
1987; Do et al. 1986). Ein weiterer Anhalt hierfür ist die Erhöhung freier oxidativer
Radikale durch Homocystein Thiolacton (McCully 1994). Ebenfalls wird schon seit
längerer Zeit eine mögliche vaskuläre Genese des Morbus Parkinson diskutiert. Horner
et al. konnten bei 27% der untersuchten Parkinson Patienten ein erhöhtes vaskuläres
Risiko nachweisen (Horner et al. 1997). Bei der Todesursachenerforschung von 220
Parkinson Patienten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von 421 Personen zeigte sich
eine signifikante Erhöhung von ischämischen Herzerkrankungen und cerebrovaskulären
Erkrankungen in der Gruppe der Parkinson Patienten (Ben-Schlomo et Marmot 1995).
Andere Studien zeigten hingegen eine geringe Inzidenzrate von Schlaganfällen bei
Parkinson Patienten auf (Struck et al. 1990). Ein Fallbericht schildert ein 2 jährig
verstorbenes Mädchen, welches einen 5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase
Mangel hatte und dabei das klinische Bild eines Morbus Parkinson, einer
Leukoencephalopathie und einer kombinierten Degeneration des Herzens aufwies. Es
zeigten sich jedoch keine Veränderungen der Basalganglien (Clayton et al. 1986).
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob es einen möglichen
Zusammenhang zwischen den verschiedenen Genotypen der thermolabilen Variante der
5,10-Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase und einem signifikant erhöhten Homocystein
Plasmaspiegel bei Morbus Parkinson Patienten gibt.
Im einzelnen wurde untersucht:
1. die Häufigkeit des homozygoten, heterozygoten und normalen Genotyps der
Punktmutation am Nukleotid 677 des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Gens
bei Parkinson Patienten.
2. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu dieser thermolabilen Mutation.
3. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu der täglichen L-Dopa-Dosis,
Krankheitsausprägung (Hoehn- u. Yahr Klassifikation), Dauer der Erkrankung in
Jahren sowie Cholesterin- und Triglyceridkonzentrationen der Parkinson
Patienten
4. die Homocysteinkonzentration in Korrelation zu Geschlecht, Vitamin B6,
Vitamin B12 sowie Folsäure Konzentrationen und Alter der Patienten und
Kontrollen.
Einleitung
15
Ursachen für eine Anhäufung von Homocystein kann ein vermehrter Aufbau oder ein
verminderter Abbau des Homocysteins sein. So kann ein vermehrtes Angebot von S-
Adenosyl-L-Homocystein zu einer Hyperhomocysteinämie führen. Ursache hierfür
könnte ein erhöhter Methionin-Spiegel oder eine L-Dopa-Therapie sein. Des weiteren
könnte eine Genmutation der Cystathionin-β-Synthetase oder der 5-Methyl-
Tetrahydrofolat-Homocystein-Methyltranferase zu einer Hyperhomocysteinämie führen.
Material und Methoden
16
2. Material und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Geräte
! Kühlzentrifuge (J2-21, Fa. Beckmann)
! Eppendorfpipetten verschiedener Größe
2.1.2. Verbrauchsmaterialien
! Eppendorf-Caps
! Polypropylenröhrchen
! EDTA-Monovetten
! Serum-Monovetten
! Venenpunktionsbesteck (Venofix® S Luer Lock, Fa. Braun)
2.2. Patienten
2.2.1. Ausschlußkriterien
! Patienten mit Diabetes mellitus, arteriellem Hypertonus oder anderen
metabolischen Erkrankungen, welche mit einem erniedrigtem Level an Vitamin
B6, B12 und/oder Folsäure einhergehen
! Erniedrigte Werte des Vitamin B6, B12 und/oder Folsäure
! Andere neurologische Erkrankungen außer Morbus Parkinson
! Demenz oder andere neurologisch/psychiatrische Erkrankungen, welche die
Evaluation des Patienten behindern könnten
! Medikamentöses Parkinsonoid
! Jede akute Erkrankung oder schwerwiegende instabile oder nicht kompensierte
Erkrankung von Lunge, Herz, Niere, Leber oder Gastrointestinaltrakt
! Krebsleiden oder bekannte HIV-Infektion
! Positive Suchtanamnese
Material und Methoden
17
! Schwangerschaft oder Stillzeit
! Vaskuläre oder kardiale Vorerkrankungen
! Teilnahme an anderen klinischen Studien innerhalb der letzten 30 Tage vor
Studienbeginn
! Fehlende Zustimmung des Patienten
2.2.2. Einschlußkriterien
! Alter mindestens 40 Jahre
! Gesichertes idiopathisches Parkinson-Syndrom
! Zustimmung zur Teilnahme an der Studie
2.2.3. Patientendaten
Siehe Ergebnisteil 3.1.
2.3. Verlaufsprotokoll
Nachdem unter Berücksichtigung der Ein- und Ausschlußkriterien sowie durch die
Zustimmung des Patienten die Teilnahme an der Studie gesichert war, erfolgte vor der
morgendlichen Medikamenteneinnahme und nach einer Fastenzeit von mindestens 10
Stunden zwischen 6.00 und 7.30 Uhr morgens die Blutentnahme. Es wurden eine 10 ml
EDTA-Monovette, eine 1 ml EDTA-Monovette sowie eine 10 ml Serum-Monovette mit
Blut aus einer peripheren Unterarmvene gefüllt. Die Blutprobe aus der 10 ml EDTA-
Monovette wurde jeweils direkt nach der Entnahme 10 Minuten in der Kühlzentrifuge
(4°C) bei 3000 G zentrifugiert, danach das Plasma abpipettiert und bei – 80 °C bis zur
weiteren Verarbeitung eingefroren.
2.3.1. Motorikerfassung
Die klinische Begutachtung hinsichtlich der Motorikerfassung des Patienten wurde vor
Studienbeginn mittels der Hoehn- und Yahr-Klassifikation vorgenommen (Hoehn et
Material und Methoden
18
Yahr 1967, siehe Tab. 1). Des weiteren wurde die Dauer der Erkrankung, Medikation,
Alter, Geschlecht und ggf. Zusatzerkrankungen des Patienten schriftlich fixiert.
Tab. 1: Die Klassifizierung nach Hoehn und Yahr
Stadium Klinische Symptomatik
0 Keine
I Unilaterale Manifestation
II Bilaterale Manifestation ohne Störung der Balance
III Leichte bis mäßige bilaterale Erkrankung,
Erste klinische Zeichen gestörter Haltereflexe,
Anamnestisch Gleichgewichtsstörung, Hinstürzen,
Patient ist physisch noch unabhängig
IV Schwere Beeinträchtigung, vollständig ausgebildete Symptomatik,
Patient kann noch ohne Hilfe laufen und stehen
V Bettlägeriger oder rollstuhlpflichtiger Patient
2.4. Verarbeitung der Proben
Die Blutprobe aus der 10 ml Serum-Monovette wurde in das hauseigene Labor zur
Bestimmung der Cholesterin- und Triglycerid-Werte gebracht.
Das gewonnene Plasma wurde umgehend zusammen mit der 3 ml EDTA-Blutprobe zur
weiteren Verarbeitung in das Labor Dr. Eberhard & Partner eingeschickt. Die
Plasmaprobe diente dabei jeweils zur Bestimmung der Homocystein-, Vitamin B12- und
Folsäurekonzentration. Aus der Blutprobe wurde hingegen die Vitamin B6-Konzen-
tration bestimmt und die molekulargenetische Mutationsuntersuchung durchgeführt.
2.4.1. Vitamin B12 und Folsäure
Die Vitamin B12- und Folsäure-Bestimmung basiert auf dem Prinzip der kompetitiven
Liganden-Assays. Liganden-Bindungsassays wenden spezifische Rezeptoren oder
Liganden an, um den Analyten zu binden. Der Analyt konkurriert hierbei mit einem
markierten Liganden um einen in niedriger Konzentration vorliegenden spezifischen
Rezeptor. Die Verdrängung des markierten Liganden vom Rezeptor ist umgekehrt-
Material und Methoden
19
proportional der Konzentration des Analyten in der Probe. Die quantitative Bestimmung
des markierten Liganden nach Ablauf der Bindungsreaktion erfolgt nach Trennung des
gebundenen markierten Liganden vom ungebundenen. Die ungebundene Form wird
anschließend quantitativ gemessen (heterogener Assay). Je nach Markierung werden
Radio-, Enzym-, Fluoreszenz- und Lumineszenz-Ligandenassays unterschieden
(Thomas 1998).
Das Vitamin B12 in der Patientenprobe konkurriert mit einem acridiniumester-
markierten Vitamin B12 um eine begrenzte Menge an gereinigtem Intrinsic-Faktor,
nachdem es von den Bindungsproteinen des Serums mittels eines Releasing Agens
(Natriumhydroxid) und DTT extrahiert wurde. Zugesetztes Cobinamid verhindert eine
Rückbindung. Hierbei handelt es sich um ein Lumineszenz-Ligandenassay (Chiron
Diagnostics Corporation 1996).
Dieses Prinzip gilt auch bei der Bestimmung der Folsäure. Nach Extrahierung der
Folsäure von ihren endogenen Bindungsproteinen konkurriert die freie Folsäure dann
mit einer markierten Folsäure (5-Methyltetrahydrofolat) um eine begrenzte Menge
hinzugegebenes β-Lactoglobulin. Dieses wird aus dem Reaktionsansatz entfernt und die
ungebundene Menge markierter Folsäure bestimmt, welche sich invers zur
Folsäurekonzentration der Probe verhält (Thomas 1998).
2.4.2. Vitamin B6
Die Bestimmung des Vitamin B6 sowie des Homocysteins erfolgte mittels HPLC. Die
HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) ist eine Methode zur Analyse
fester, flüssiger und löslicher Substanzgemische. Die zu analysierende Probe wird dabei
in einer mobilen Phase (Eluens) gelöst und mit dieser durch eine Säule transportiert, die
die stationäre Phase enthält. Die Affinitätsunterschiede der Probenbestandteile zur
stationären Phase führen dann zu einer Auftrennung des Substanzgemisches entlang der
Säule. Mittels verschiedener Meßverfahren ist anschließend eine quantitative
Bestimmung der in der Probe enthaltenden Substanzen möglich. Dabei wird im
Detektor der austretende Konzentrationspeak in ein elektrisches Signal übertragen. Bei
entsprechenden Potentialdifferenzen zwischen Eluens und Probe wird dabei die
Redoxreaktion der Probe ausgenutzt, und man erhält ein Meßpotential (Bussemas et
Harhoff 1990).
Material und Methoden
20
2.4.3. Homocystein
Vor der Bestimmung wird das gesamte Homocystein (freies und an Proteine
gebundenes) mit einem Thio-spezifischen Reagenz (Kurzname: SBD-F) derivatisiert.
Das Derivat kann dann aufgrund seiner Fluoreszenz mittels HPLC detektiert und
quantifiziert werden. Von dem gewonnenem Plasma werden 0,3 ml in einem schmalen
Reagenzglas mit 30 µl einer 10 %igen Tri-n-butylphosphin-Lösung in reinstem
Dimethylformamid versetzt und geschüttelt. Man läßt die Mischung 30 Minuten bei 4°C
stehen, um die Reduktion des Homocysteins und der Disulfidbrücken bzw. die
Freisetzung des proteingebundenen Homocysteins zu bewirken. Dann werden 0,3 ml
einer 10 %igen Trichloressigsäure (enthält 1 mmol/l EDTA) zugesetzt. Hierdurch
werden die Proteine gefällt, das freigesetzte Homocystein bleibt in Lösung. Nach
Zentrifugation werden 100 µl der überstehenden Lösung zu einer vorbereiteten
Mischung von 20 µl einer 1,55 M Natriumhydroxid-Lösung, 250 µl eines 0,125 M
Boratpuffers (pH 9,5; mit 4 mmol EDTA) sowie 100 µl der SBD-F-Lösung (1 mg/ml
Boratpuffer) pipettiert. Der Ansatz reagiert daraufhin 1 h bei 60 °C im Wasserbad. Die
Proben verfärben sich je nach Homocysteingehalt gelblich bis tiefgelb. 20 µl werden im
HPLC analysiert (Te Poele-Pothoff et al 1995; Ubbink et al.1991; M. Mansoor et al.;
Araki et Sako 1987).
2.4.4. Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase
Die Analyse von Nukleinsäuren erfordert zunächst ihre Isolierung aus
unterschiedlichem Probenmaterial. Die Lyse des gewonnenem EDTA-Blutes erfolgte
durch Inkubation in einem speziellen Puffer in der Gegenwart von Proteinasen.
Anschließend werden die Nukleinsäuren spezifisch in Gegenwart eines chaotropen
Salzes an Glasfaser- oder Silica-Oberflächen gebunden (Vogelstein et Gillespie 1979).
Die Bindungsreaktion findet innerhalb von wenigen Sekunden statt und wird durch die
Zerstörung der geordneten Struktur der Wassermoleküle und ihrer Wechselwirkung mit
den gelösten Nukleinsäuren verursacht. Somit wird die Absorption an das Glasfaservlies
gefördert. Da nur Nukleinsäuren spezifisch gebunden werden, kann die DNA nach der
Durchführung eines einfachen Waschvorgangs frei von Begleitsubstanzen isoliert
werden (Miller et al. 1988). Zur genetischen Untersuchung ist die Menge der DNA-
Material und Methoden
21
Zielsequenz oft nicht ausreichend und muß daher zur Steigerung der
Nachweisempfindlichkeit spezifisch vervielfältigt werden.
Hierfür wird die Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction (PCR)),
welche im folgenden beschrieben wird, als effektivste Methode benutzt. Durch
Erhöhung der Temperatur über 90°C wird die Nukleinsäure reversibel in die
Einzelstränge geteilt. Bei anschließendem Abkühlung auf etwa 50°C können die im
Überschuß vorhandenen Primer schneller an ihre komplementären Sequenzen binden als
sich der DNA-Doppelstrang renaturieren kann (Annealing). Die in der Reaktionslösung
vorhandene Polymerase verlängert daraufhin bei etwa 70°C die Primer mit freien
Nukleotiden komplementär zur Basensequenz der DNA-Stränge (Extension). Die neu
synthetisierten Stücke dienen bei folgenden Zyklen als weiteres Ausgangsmaterial.
Durch die so erzielte enorme Vermehrung des gewünschten Fragments sind
anschließende Arbeitsschritte wesentlich vereinfacht.
Nach der PCR erfolgt die Restriktionsanalyse mittels einer spezifischen
Restriktionsendonuklease, welche die doppelsträngige DNA-Nukleotidsequenz
spezifisch in Bruchstücke (Restriktionsfragmente) schneidet. Für die Untersuchung der
spezifischen Mutation des Gens, welches die Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase
kodiert, wird das HinfI-Restriktionsenzym (Firma: Fermentas Ltd.) verwendet, welches
die Nukleotid-Basensequenz zwischen Guanin und Adenosin erkennt und die kovalente
Bindung einer DNA dort spaltet, wo diese Sequenz auftritt, also genau komplementär
zur eigentlichen Punktmutation.
Der Nachweis des Mutationsstatus wurde nun mittels Elektrophorese auf einem
2,5%igem Agarosegel durchgeführt. Je nach Anreicherung kann hier auch zwischen
einer heterozygoten oder homozygoten Mutation unterschieden werden (Thomas 1998,
Kluijtmans et al. 1996).
Material und Methoden
22
Abbildung 4: Normaler, heterozygoter und homozygoter Genotyp
Material und Methoden
23
2.4.5. Cholesterin und Triglyceride
Die Bestimmung des Cholesterins und der Triglyceride erfolgte durch das hauseigene
Labor mittels standardisierter automatisierter Methoden.
Das Prinzip der Cholesterinbestimmung basiert auf einer vollenzymatischen Reaktion,
wobei Cholesterin-Ester durch eine Esterase in freies Cholesterin und Fettsäuren
gespalten werden. Mittels einer Cholesterin-Oxidase wird danach unter
Sauerstoffverbrauch das freie Cholesterin oxidiert, wobei H2O2 entsteht, dessen Menge
proportional zur Menge des Cholesterins ist (Thomas 1998).
Die Bestimmung der Triglyceride erfolgt nach hydrolytischer Spaltung derselben. Die
Menge des nun freien Glycerins ist proportional zur Menge der Triglyceride (Thomas
1998).
2.5. Statistische Auswertungskriterien
Da die Werte normal verteilt waren, wurden parametrische Tests angewandt, wobei das
übliche 0,05 Signifikanzniveau angenommen wurde.
Die statistische Auswertung erfolgte mittels ANOVA (Analysis of Variance), dem
Tukey honest difference Test als post hoc Test sowie Regressionsanalysen.
2.6. Ethische Kriterien
Die Studie ist von der unabhängigen Ethik-Kommission der Ruhr-Universität Bochum
geprüft und genehmigt. Die Studienteilnehmer wurden vor Studienbeginn über Art,
Umfang, Ablauf, Ziel und Freiwilligkeit der Untersuchung aufgeklärt und stimmten
einer Blutentnahme zu.
Ergebnisse
24
3. Ergebnisse
3.1. Charakterisierung der untersuchten Probanden
Es wurden 123 Probanden untersucht, die sich in 79 Parkinsonpatienten und 44
Kontrollen aufteilten. 47 Patienten und 24 Kontrollen waren männlichen, 32 Patienten
und 20 Kontrollen weiblichen Geschlechts. Das mittlere Alter der Patienten betrug
63,494 Jahre (+ 11,236), das der Kontrollen 58,136 Jahre (+ 12,422), der Unterschied
zwischen beiden Gruppen 5,358 Jahre. Die mittlere Homocysteinkonzentration der
Patienten betrug 16,343 µmol/l (+ 7,259), die der Kontrollen 13,009 µmol/l (+ 5,492).
Die statistische Signifikanz dieses Unterschiedes wurde unter Berücksichtigung der
einflußnehmenden Größen der verschiedenen Gruppen weiter untersucht.
3.1.1. Patienten
Das Patientenkollektiv bestand aus 35 Patienten (44,3 %) mit normalem Methylen-
Tetrahydrofolat-Reduktase-Genotyp, 36 Patienten (45,57 %) mit heterozygoter
Mutationsform und 8 Patienten (10,13 %) mit homozygoter Mutationsform. Die mittlere
Homocysteinkonzentration der Patienten mit normaler Genetik betrug 13,520 µmol/l (+
5,237), mit heterozygoter Genetik 17,719 µmol/l (+ 7,134) und mit homozygoter
Genetik 22,500 µmol/l (+ 10,323). Im weiteren Verlauf wurde die statistische
Signifikanz dieser Unterschiede unter Berücksichtigung von Dauer der Erkrankung,
Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride sowie
L-Dopa-Medikation und Krankheitsstadium (Hoehn-Yahr-Skala) als Covarianten in die
Auswertung mit einbezogen. Die Mittelwerte sowie Standardabweichungen werden
später noch ausführlich dargestellt.
Die Referenzbereich des Vitamin B6 liegt zwischen 7,0 und 30 ng/ml, des Vitamin B12
zwischen 200 und 1000 pg/ml sowie der Folsäure zwischen 3,0 und 20,0 ng/ml. Der
Normwertbereich für das Homocystein liegt bis 15 µmol/l. Ein Ausschlußkriterium für
diese Studie waren erniedrigte Werte für Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure.
Ergebnisse
25
Tabelle 2: Patientenkollektiv
Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein Mutation(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)
Pat. 1 m 82 15 200 13 20 hetPat. 2 m 71 18,5 276 8,6 14,5 hetPat. 3 m 54 19 203 13,5 15 hetPat. 4 m 63 24 509 5,9 9,4 hetPat. 5 m 70 22 308 3,4 21,5 hetPat. 6 w 81 32,5 296 3,3 42,5 hetPat. 7 m 51 16 265 3,8 22,5 hetPat. 8 w 69 32,5 264 5,8 17,5 hetPat. 9 w 77 14,5 310 4,1 15,5 hetPat. 10 w 80 14,5 224 4,6 33 hetPat. 11 m 54 21 565 8,3 19 hetPat. 12 w 48 13 306 4,7 12,5 hetPat. 13 m 56 23 263 5,6 34 hetPat. 14 w 60 3700 303 5,5 15,5 hetPat. 15 w 77 14 388 8,1 9,3 hetPat. 16 w 77 16 234 7,4 21 hetPat. 17 m 73 12,5 202 8 26 hetPat. 18 m 78 15 341 4,8 17 hetPat. 19 m 66 20,5 336 5,4 13,5 hetPat. 20 m 53 7,3 456 4,5 13 hetPat. 21 w 71 15,5 280 4,1 23,5 hetPat. 22 m 57 17,5 277 5,8 14 hetPat. 23 m 63 23,5 293 4 16 hetPat. 24 m 82 15,5 1011 3,5 17 hetPat. 25 w 58 27,5 793 5 18,5 hetPat. 26 w 69 16 669 5,8 8,4 hetPat. 27 m 53 8 357 8 8,8 hetPat. 28 w 63 18,5 380 10,3 16,5 hetPat. 29 m 76 17 687 5 13,5 hetPat. 30 w 64 17 1611 4,2 15,5 hetPat. 31 m 38 30 316 10,3 13 hetPat. 32 w 68 140 394 16,6 11,5 hetPat. 33 m 53 13,5 275 4,8 17,5 hetPat. 34 m 49 10,5 701 6,5 15,5 hetPat. 35 w 76 13 417 7,8 19 hetPat. 36 m 59 12,5 303 7,1 17,5 hetPat. 37 m 41 13,5 266 3,4 38,5 homPat. 38 m 57 22,5 347 6 18,5 homPat. 39 m 77 16 693 3,9 19,5 homPat. 40 m 64 18,5 494 12,6 16,5 homPat. 41 w 80 18 355 7,5 23 homPat. 42 m 70 15,5 401 4,6 15 homPat. 43 m 68 33,5 675 7,2 11 homPat. 44 m 60 19,5 300 4 38 homPat. 45 w 58 27,5 264 3,6 22 normPat. 46 w 57 29 239 4,3 13 normPat. 47 w 50 12 349 7,6 11 normPat. 48 w 75 23,5 224 3,5 23 normPat. 49 m 64 22 254 5,1 12,5 normPat. 50 w 72 17,5 570 6,5 11,5 normPat. 51 w 79 17,5 426 11,7 16 norm
Ergebnisse
26
Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein Mutation(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)
Pat. 52 w 56 18 241 9,4 9,5 normPat. 53 m 56 16,5 241 10,2 8 normPat. 54 m 55 19,5 515 12,9 4,9 normPat. 55 m 57 37 699 >21 10 normPat. 56 m 60 20,5 306 7,7 11,5 normPat. 57 m 60 21 384 6,8 15 normPat. 58 w 59 18 301 6,4 12 normPat. 59 m 49 50 1387 14,2 11,5 normPat. 60 w 66 16,5 308 4,4 25 normPat. 61 m 59 24 511 13,1 7,5 normPat. 62 w 88 39,5 300 6,5 16,5 normPat. 63 w 56 24,5 353 17,1 10 normPat. 64 m 55 31,5 291 8,6 9,7 normPat. 65 m 57 15,5 428 4,1 9,8 normPat. 66 m 59 17,5 307 3,6 10 normPat. 67 m 77 21 269 3,3 18,5 normPat. 68 w 62 13,5 279 5,1 10,5 normPat. 69 w 29 24 428 12,4 6,3 normPat. 70 m 54 14,5 333 5,3 14 normPat. 71 m 65 13 226 6,3 24,5 normPat. 72 w 52 26 383 6,6 6 normPat. 73 w 73 13,5 266 12,9 12 normPat. 74 m 61 34 269 7,4 15 normPat. 75 m 76 1900 >2100 3,9 19,5 normPat. 76 m 64 17 228 6,7 18,5 normPat. 77 m 48 22 308 5,5 17,5 normPat. 78 w 68 19,5 234 5,9 19 normPat. 79 m 55 22 280 7,5 12 norm
3.1.2. Kontrollgruppe
Das Kontrollgruppenkollektiv bestand aus 44 Kontrollen, wobei die mittlere
Homocysteinkonzentration bei 13,009 µmol/l (+ 5,492), das mittlere Alter bei 58,136
Jahre (+ 12,422), die mittlere Folsäurekonzentration bei 6,482 ng/ml (+ 2,862) lag. Es
zeigte sich ein Mittelwert von 21,693 ng/ml (+ 17,453) des Vitamin B6 und 417,864
pg/ml (+ 232,952) des Vitamin B12.
Tabelle 3: Kontrollgruppe
Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)
Kontr. 1 m 62 16,5 309 4,6 14,5Kontr. 2 w 74 19 326 7,7 10,5Kontr. 3 w 69 15,5 303 10,1 12,5Kontr. 4 m 65 21,5 242 8,4 9Kontr. 5 m 67 16,5 251 5,2 7,5Kontr. 6 w 55 18,5 235 5 10,5
Ergebnisse
27
Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Homocystein(Jahre) (ng/ml) (pg/ml) (ng/ml) (µµµµmol/l)
Kontr. 7 w 66 18 687 8,3 10,5Kontr. 8 m 53 16,5 526 6,4 6Kontr. 9 m 51 23 521 7,6 17,5Kontr. 10 w 24 23,5 305 4 15Kontr. 11 m 51 14,5 366 3,6 19Kontr. 12 w 50 15,5 544 3,6 14Kontr. 13 m 27 23,5 427 6,2 9Kontr. 14 m 77 12,5 261 5,1 7,5Kontr. 15 w 59 120 767 8,3 6,4Kontr. 16 w 43 23 290 10,3 15,5Kontr. 17 m 61 10 376 3,3 23,5Kontr. 18 w 42 15 585 7,2 5,8Kontr. 19 m 57 15,5 488 3,5 9Kontr. 20 w 68 10,5 460 3 30Kontr. 21 m 58 13 452 5,4 11Kontr. 22 m 67 20,5 378 6,8 10Kontr. 23 w 59 15 215 5,9 7,5Kontr. 24 m 46 30,5 296 7,9 12Kontr. 25 m 80 18,5 276 15,7 12,5Kontr. 26 w 56 20,5 1161 5 9,3Kontr. 27 m 58 36,5 433 9,2 10,5Kontr. 28 w 65 18,5 360 3,3 24,5Kontr. 29 m 75 21 261 6,8 5,6Kontr. 30 w 63 11 438 5,2 8,1Kontr. 31 m 60 14,5 239 4,5 14Kontr. 32 m 71 20 664 5,3 8,2Kontr. 33 w 53 17 220 3,2 20,5Kontr. 34 m 67 19,5 1389 9,1 17,5Kontr. 35 m 53 15,5 442 3,7 9,5Kontr. 36 w 57 27 405 5,2 17Kontr. 37 m 66 10 314 4,7 13,5Kontr. 38 m 46 22,5 263 7,9 23,5Kontr. 39 m 43 15,5 348 6,9 14,5Kontr. 40 m 40 11 233 4,6 16,5Kontr. 41 w 73 24,5 479 15,4 11Kontr. 42 w 63 20,5 385 5 17,5Kontr. 43 w 45 20 238 6,8 13,5Kontr. 44 w 73 63,5 228 10,3 11,5
3.1.3. Zusatzuntersuchungen der Patienten
Weiter wurde bei den Parkinsonpatienten zusätzlich noch die Cholesterin, Triglyceride,
L-Dopa-Tagesdosis sowie die Dauer der Erkrankung und die Krankheitsausprägung
Ergebnisse
28
mittels der Hoehn-Yahr-Klassifikation bestimmt. Die hierbei errechneten Mittelwerte
sowie Standardabweichungen werden später noch ausführlich dargestellt.
Tabelle 4: Zusatzparameter des Patientenkollektiv
Geschl. Cholesterin Triglyceride L-Dopa - Dauer der Hoehn - Yahr(mg/dl) (mg/dl) Dosis (mg) Erkr. ( J ) Klassifikation
Pat. 1 m 197 180 400 2 3Pat. 2 m 213 162 300 2 2Pat. 3 m 182 104 650 11 4Pat. 4 m 186 120 400 4 4Pat. 5 m 198 56 500 5 3Pat. 6 w 273 204 700 6 4Pat. 7 m 230 148 275 15 4Pat. 8 w 251 153 700 15 4Pat. 9 w 260 287 600 0 3Pat. 10 w 249 99 500 4 3Pat. 11 m 244 64 500 3 2Pat. 12 w 326 324 0 0 2Pat. 13 m 223 129 0 0 2Pat. 14 w 179 155 500 4 2Pat. 15 w 172 144 200 0 2Pat. 16 w 272 114 400 2 3Pat. 17 m 276 134 900 15 3Pat. 18 m 170 188 400 5 4Pat. 19 m 273 122 600 12 3Pat. 20 m 316 404 600 4 2Pat. 21 w 226 142 775 20 3Pat. 22 m 205 305 500 2 3Pat. 23 m 174 44 800 9 3Pat. 24 m 139 94 200 0 4Pat. 25 w 256 114 475 11 3Pat. 26 w 185 75 0 5 1Pat. 27 m 245 85 800 13 2Pat. 28 w 286 133 150 13 3Pat. 29 m 165 174 200 3 4Pat. 30 w 240 213 300 1 3Pat. 31 m 255 206 500 1 1Pat. 32 w 314 151 300 1 2Pat. 33 m 251 189 600 7 4Pat. 34 m 248 167 225 8 2Pat. 35 w 152 69 600 1 3Pat. 36 m 237 290 175 3 1Pat. 37 m 277 109 400 6 1Pat. 38 m 278 132 500 5 2Pat. 39 m 164 119 500 15 4Pat. 40 m 222 101 700 9 2Pat. 41 w 164 157 600 1 2Pat. 42 m 233 127 400 10 3Pat. 43 m 214 104 900 10 4Pat. 44 m 160 108 400 1 2Pat. 45 w 294 217 950 12 2Pat. 46 w 271 203 450 20 3
Ergebnisse
29
Geschl. Cholesterin Triglyceride L-Dopa - Dauer der Hoehn - Yahr(mg/dl) (mg/dl) Dosis (mg) Erkr. ( J ) Klassifikation
Pat. 47 w 134 52 1075 5 4Pat. 48 w 149 88 450 0 5Pat. 49 m 219 142 600 14 4Pat. 50 w 261 56 400 8 3Pat. 51 w 205 124 800 17 3Pat. 52 w 166 97 600 12 3Pat. 53 m 209 77 300 4 2Pat. 54 m 245 119 200 0 3Pat. 55 m 259 99 37,5 0 1Pat. 56 m 210 106 400 1 2Pat. 57 m 242 187 0 0 2Pat. 58 w 251 175 500 3 3Pat. 59 m 237 121 0 4 4Pat. 60 w 256 500 700 4 2Pat. 61 m 221 194 0 0 2Pat. 62 w 231 72 600 22 3Pat. 63 w 161 160 250 3 3Pat. 64 m 192 31 600 8 2Pat. 65 m 259 71 600 4 2Pat. 66 m 237 207 300 7 4Pat. 67 m 235 148 400 1 3Pat. 68 w 160 97 350 17 3Pat. 69 w 299 141 0 2 1Pat. 70 m 302 81 0 4 2Pat. 71 m 287 171 0 0 1Pat. 72 w 269 167 400 10 1Pat. 73 w 267 131 600 6 3Pat. 74 m 243 106 600 12 4Pat. 75 m 223 73 500 12 4Pat. 76 m 196 92 200 7 2Pat. 77 m 209 128 450 6 2Pat. 78 w 294 189 300 3 4Pat. 79 m 235 257 200 2 3
3.2. Statistik und Auswertung
3.2.1. Vergleich der Homocysteinkonzentration der Parkinsonpatienten und
Kontrollen
Zunächst wurde eine Varianzanalyse zum Vergleich zwischen Parkinson Patienten und
Kontrollen durchgeführt, wobei als Covarianten Folsäure, Vitamin B6, Vitamin B12
sowie Alter und Geschlecht eingesetzt wurden. Diese Varianzanalyse testete die
Nullhypothese, daß die Homocysteinkonzentrationen der Parkinson Patienten und der
Kontrollgruppe gleich groß sind.
Ergebnisse
30
Es zeigt sich jedoch, daß sich die Homocysteinkonzentrationen der Patienten signifikant
(F(dF 1, 116) = 5.916, p = 0,017) von denen der Kontrollgruppe unterscheiden.
Tab. 5:Varianzanalyse bezüglich der Homocysteinkonz. der Parkinsonpatienten und der Kontrollen
df MS df MSEffect Effect Error Error F p-level
1 252.368 116 42.661 5.916 0.017
Der post hoc Test (Tukey honest difference Test für ungleiche Gruppen) zeigt ebenfalls
signifikante Unterschiede (p = 0,018) zwischen Parkinsonpatienten und Kontrollen
hinsichtlich des Mittelwertes der Homocysteinkonzentration der gesamten Gruppen.
Tab. 6:Post hoc Test: 1 = Parkinsonpatienten; 2 = Kontrollen
{1} {2}{1} 0.018{2} 0.018
Die Varianzanlyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin
B12, Folsäure) ergab im Vergleich hinsichtlich der Parkinsonpatienten und Kontrollen
keinen signifikanten Einfluß (F(dF 5, 116) = 2.148, p = 0,065).
Tab. 7: Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12,Folsäure) der Patienten und Kontrollen
Sum of MeanSquares df Square F p-level
Effect 458.151 5 91.63 2.148 0.065Error 4948.679 116 42.661
Ergebnisse
31
3.2.2. Kontrollgruppe im Vergleich zu Patienten mit unterschiedlicher Genetik
Da bei Parkinsonpatienten, wie oben beschrieben, eine signifikante
Homocysteinerhöhung nachgewiesen werden konnte, soll jetzt die Abhängigkeit zum
Polymorphismus diesbezüglich untersucht werden. Deswegen wurden die
Parkinsonpatienten in (1) heterozygote, (2) homozygote Mutation sowie (3) normale
Form des Methylen-Tetra-hydrofolat-Reduktase-Gens unterteilt und mittels ANOVA
gegen die Kontrollgruppe (0) verglichen.
Da bei den Kontrollen die Subtypisierung nicht vorgenommen wurde, wurden sie als
gesamte Gruppe (0) angesehen. Als Covarianten wurden Geschlecht, Alter, Vitamin B6,
Vitamin B12 und Folsäure berücksichtigt.
Es zeigten sich hier signifikante Unterschiede (F(dF: 3,114) = 7.49, p < 0.0001) hinsichtlich
der Homocysteinkonzentration zwischen den einzelnen Gruppen.
Tab. 8: Mittelwerte des Homocysteins und der Covarianten (0=Kontrollen; 1=heterozygot; 2=homo-zygot; 3=normal)
Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homocystein Geschlecht Alter Vitamin B6 Vitamin B12 Folsäure
0 13.009 1.455 58.136 21.693 417.864 6.4821 17.719 1.417 64.972 123.508 417.028 6.5862 22.500 1.125 64.625 19.625 441.375 6.1503 13.520 1.457 60.886 75.957 357.171 10.174
Tab. 9: Standardabweichung des Homocysteins und der Covarianten (0=Kontrollen; 1=heterozygot;2=homozygot; 3=normal)
Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homocystein Geschlecht Alter Vitamin B6 Vitamin B12 Folsäure
0 5.492 0.504 12.422 17.453 232.952 2.8621 7.134 0.500 11.360 613.480 275.049 3.0452 10.323 0.354 12.351 6.238 164.493 3.0283 5.237 0.505 10.772 317.493 212.686 16.019
Im post hoc Test (Tukey honest difference Test für ungleiche Gruppen) zeigten sich
signifikante Unterschiede der Homocysteinkonzentration zwischen der Kontrollgruppe
und der heterozygoten Mutationsform (p = 0.009) sowie zwischen der Kontrollgruppe
Ergebnisse
32
und der homozygoten Mutationsform (p = 0.014). Es zeigte sich jedoch kein
signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentration zwischen den Patienten ohne
Mutation, also mit einer normalen Genetik, und der Kontrollgruppe (p = 0.986).
Tab. 10: Post hoc Test: {1}=Kontrollen; {2}=heterozygot; {3}=homozygot; {4}=normal
{2} {3} {4}{1} 0.009 0.014 0.986
Abbildung 5: Homocysteinkonzentration der Patienten mit heterozygoter (I), homozygoter (II),normaler Genetik und Kontrollgruppe
Die Summe aller Covarianten (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure)
ergab hinsichtlich der Parkinson Patienten mit normaler, heterozygoter, homozygoter
Genetik und Kontrollen keinen signifikanten Einfluß (F(dF: 5,114) = 2.161, p = 0,063).
Tab. 11:Varianzanalyse: Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12, Folsäure)der Kontrollen und Patienten mit heterozygotem, homozygotem, normalem Genotyp
Sum of MeanSquares df Square F p-level
Effect 411.838 5 82.368 2.161 0.063Error 4344.591 114 38.110
������������������������������������������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
ho
mo
cyst
ein
eµ µµµ M
ol(m
ean
+/-
SD
)
I II III controls0
10
20
30
40I
������������
II������������������������
III
������������������������
controls
Ergebnisse
33
3.2.3. Vergleich der Patienten mit unterschiedlicher Genetik
Bei den Parkinsonpatienten wurden die Dauer der Erkrankung, das Geschlecht, das
Alter, die Vitamin B6-, Vitamin B12-, Folsäure-, Cholesterin-, Triglyceridkonzentration
sowie die L-Dopa-Medikation und das Krankheitsstadium (Hoehn-Yahr-Skala) als
Covarianten in die Auswertung mit einbezogen.
Die durchgeführte ANOVA testet die Nullhypothese, daß die Homocystein-
konzentrationen der verschiedenen Formen des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-
Gens (1 = heterozygote; 2 = homozygote Mutation; 3 = normal) gleichgroß sind.
Das Ergebnis (F(dF: 2,66) = 6,05, p<0,004) zeigt, daß sich die Homocysteinkonzen-
trationen signifikant voneinander unterscheiden.
Tab. 12:ANOVA: Mittelwerte mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 3=normalem Genotyp derParkinsonpatienten
Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homoc. Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Cholest
erinTriglyc
erideL-Dopa Erkrank
ungsdauer
HY-Skala
1 17.719 1.4167 64.972 123.508 417.028 6.586 229.667 159.500 436.806 5.750 2.8062 22.500 1.125 64.625 19.625 441.375 6.150 214.000 119.625 550.000 7.125 2.5003 13.520 1.457 60.886 75.957 357.171 10.174 232.229 139.400 394.643 6.571 2.714
Tab. 13:Standardabweichungen mit 1=heterozygotem, 2=homozygotem, 3=normalem Genotyp derParkinsonpatienten
Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar. Covar.Homoc. Geschl. Alter Vit. B6 Vit. B12 Folsäure Cholest
erinTriglyc
erideL-Dopa Erkrank
ungsdauer
HY-Skala
1 7.134 0.500 11.360 613.480 275.049 3.045 47.619 80.350 236.604 5.411 0.9202 10.323 0.354 12.351 6.238 164.493 3.028 48.412 18.685 177.281 4.824 1.0693 5.237 0.505 10.772 317.493 212.686 16.019 43.563 82.348 275.522 6.094 1.017
Die daraufhin durchgeführte post hoc Analyse mittels Tukey Test zeigte einen
signifikanten Unterschied der Homocysteinkonzentrationen zwischen dem normalen
Genotyp und der heterozygoten Mutationsform (p = 0,025) sowie zwischen dem
normalen Genotyp und der homozygoten Mutation (p = 0,022).
Ergebnisse
34
Tab. 14: Post hoc Test der Mittelwerte der Homocysteinkonzentrationen(1=heterozygoter, 2=homozygoter, 3=normaler Genotyp der Parkinsonpatienten)
{1} {2} {3}{1} 0.319 0.025{2} 0.319 0.022{3} 0.025 0.022
Die Varianzanalyse der Summe der Covarianten (Geschlecht, Alter, Vitamin B6,
Vitamin B12, Folsäure, Cholesterin, Triglyceride, L-Dopa-Medikation, Dauer der
Erkrankung, Krankheitsausprägung (Hoehn-Yahr-Skala)) der Parkinsonpatienten ergab
im Vergleich der einzelnen Mutationsformen (heterozygot, homozygot, normal) keinen
signifikanten Einfluß (F(dF: 10,69) = 1.470, p = 0.170).
Tab. 15:Varianzanalyse der Covarianten insgesamt (Geschlecht, Alter, Vitamin B6, Vitamin B12,Folsäure, Cholesterin, Triglyceride, L-Dopa-Dosis, Dauer der Erkrankung, Krankheitsausprägung(Hoehn-Yahr-Skala)) innerhalb der verschiedenen Mutationsformen
Sum of MeanSquares df Square F p-level
Effect 607.560 10 60.756 1.470 0.170Error 2851.972 69 41.333
Diskussion
35
4. Diskussion
Wie in der Einleitung schon ausgeführt kann Homocystein auf verschiedene Weisen
pathogen auf den menschlichen Organismus einwirken. Homocystein induziert
oxidativen Streß durch seine zweifache Wirkung am N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor
(dadurch bedingter exzessiver Kalzium-Ionen Einstrom und reaktive Oxygenierung) und
durch eine Erhöhung des Homocystein Thiolacton-Spiegels, wodurch es zu einer
vermehrten Bildung freier Radikale kommt. Des weiteren wirkt Homocystein
prothrombogen und induziert Arteriosklerose mit daraus resultierendem erhöhtem
Schlaganfall- und Herzinfarktrisiko als anerkannter, unabhängiger Arteriosklerose-
risikofaktor.
Die Ätiologie des Morbus Parkinson ist bis zum jetzigen Zeitpunkt ungeklärt. Diskutiert
werden neben multifaktoriellen Ursachen sowohl eine neurodegenerative als auch eine
vaskuläre Genese. Eine wichtige Rolle könnte hierbei das Homocystein einnehmen, da
es bei Parkinson Patienten im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht ist (Kuhn et al.
1998; Allain et al. 1995; Kuhn et al. 1997). Die Ergebnisse unserer Studie bestätigen
dies.
Erklärbar wäre hierdurch auch eine mögliche Ursache der noch unklaren Progredienz
des Morbus Parkinson, welcher trotz zur Zeit gut wirksamer Medikamente keinen
ätiologischen Ansatz in der Therapie aufweist und einen progredienten, protrahierten
Verlauf, auch durch medikamentöse Nebenwirkungen mitbedingt, nimmt. Eine zentrale
Rolle spielt hierbei der derzeit bestehende Goldstandard der medikamentösen Therapie
mit L-Dopa, welcher ebenfalls zu einem erhöhten Homocystein-Spiegel führen kann
durch Abbau über die COMT. Dieser Mechanismus konnte bislang nur im Tiermodell
an L-Dopa-behandelten Ratten nachgewiesen werden (Miller et al. 1997).
Eine Erhöhung der Homocysteinvorstufe S-Adenosyl-Homocystein (SAH) fand sich bei
L-Dopa-behandelten Mäusen (Liu et al. 2000). Durch L-Dopa wird eine Vermehrung
der Methylierungsreaktionen mittels SAM induziert, was zu einer konsekutiven
Erhöhung des SAH führt (Surtees et Hyland 1990). Vitamin B12- oder
Folsäurestoffwechsel-störungen können ebenfalls zu einer Erhöhung von SAH im
Tiermodell führen (Scott et al. 1994). Methylierungsreaktionen sind wie der Morbus
Diskussion
36
Parkinson altersabhängig vermehrt. Nach Injektion von SAM in den lateralen Ventrikel
von Ratten fanden sich Rigor, Tremor und Hypokinese bei den so behandelten
Versuchstieren, was sich in Form einer neuronalen Degeneration als morphologisches
Korrelat belegen ließ (Charlton et Mack 1994). Diese ebenfalls beim Morbus Parkinson
als Kardinalsymptome bekannten Erscheinungsformen lassen auf eine Vermehrung der
SAM abhängigen Erhöhung von Methylierungsreaktionen schließen und somit im
Zusammenhang die L-Dopa-Therapie in einem neuem Licht erscheinen (Fahn 1996).
Andere Ursachen einer Hyperhomocysteinämie wurden bereits in der Einleitung
aufgeführt (Vitamin, Folsäure oder medikamentös induziert).
In mehreren Studien konnte bereits jeweils im Vergleich zu Kontrollgruppen eine
Hyperhomocysteinämie bei Parkinson Patienten nachgewiesen werden (Müller et al.
1999; Yasui et al. 1999; Kuhn et al. 1997; Kuhn et al. 1998; Allain et al. 1995). Im
Rahmen unserer Studie fand sich ebenfalls ein signifikanter Unterschied der
Homocysteinkonzentrationen bei Parkinson Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Unseres Wissens nach wurde bisher nur in einer Studie ein Vergleich L-Dopa-
behandelter Patienten mit unbehandelten Patienten durchgeführt. Es zeigte sich hierbei
ein signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentrationen zwischen den
unterschiedlich therapierten Patientengruppen, jedoch nicht zwischen unbehandelter
Patientengruppe und der Kontrollgruppe (Müller et al. 1999). Dies könnte für eine L-
Dopa induzierte Hyperhomocysteinämie im menschlichen Organismus sprechen.
Entsprechende Studien stehen noch aus.
Eine mögliche Ursache für eine Erhöhung der Homocysteinkonzentration ist eine
Punktmutation am Nukleotid 677 des Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR)
kodierenden Gens (siehe Einleitung). Im Zusammenhang mit dem Morbus Parkinson
fanden Harmon et al. 1997 zunächst beim Vergleich von 188 Parkinson Patienten mit
184 Kontrollen keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der heterozygoten,
homozygoten und normalen Form des MTHFR-Gens, ohne dabei die Homocystein-
konzentration zu berücksichtigen. Es zeigte sich hierbei eine Prävalenz der
homozygoten Form von 7,1% (Kontrollen) und 9,6% (Patienten) sowie der
heterozygoten Form von 47,3% (Kontrollen) und 42,5% (Patienten).
Diskussion
37
Im Gegensatz dazu konnten Kowa et al. 1999 eine signifikante Erhöhung der
homozygoten Form des MTHFR-Gens bei 169 Parkinson Patienten (15,4 %) im
Vergleich zu 187 Kontrollen (8,6 %) nachweisen. Generell wird von einer Prävalenz der
homozygoten Form in der Normalbevölkerung von 5-10% ausgegangen und der
heterozygoten Form von über 40% (Rozen 1996; Kang et al. 1988; Kang et al. 1991
siehe Einleitung;Welch et Loscalzo 1998 siehe Einleitung; Gussekloo et al. 1999).
Eine im August 2000 veröffentlichte japanische Studie von Yasui et al. zeigte einen
signifikanten Unterschied der Homocysteinkonzentrationen von 90 Parkinson Patienten
im Vergleich zu 50 Kontrollen auf. Jedoch fand sich kein signifikanter Unterschied
innerhalb der Patientengruppe mit unterschiedlichem Genotyp (homozygot, heterozygot
und normal). Im Kontrast dazu stehen die Ergebnisse unserer Studie, wobei ein
signifikanter Unterschied der Homocysteinkonzentration zwischen dem normalen
Genotyp und der heterozygoten Mutationsform (p = 0,025) sowie zwischen dem
normalen und dem homozygoten Genotyp (p = 0,022) innerhalb des Patientenkollektivs
beweisbar war. Des weiteren fällt bei der Studie von Yasui et al. eine auffallend hohe
Prävalenz der homozygoten Mutationsform von 23,33% beim Patientenkollektiv und
von 20,75% in der Kontrollgruppe auf. Dies könnte in einer Fehlschichtung des in die
Studie eingeschlossenen Kollektivs begründet sein, zumal andere Studien eine
Prävalenz des homozygoten Genotyps in der japanischen Bevölkerung zwischen 10,6 %
und 11 % aufzeigen (Nishio et al. 1996; Nakai et al. 2000).
Die Ergebnisse hinsichtlich der Homocysteinkonzentration der unterschiedlichen
Genotypen innerhalb der Parkinson Patientengruppe sowie im Vergleich der
heterozygoten und homozygoten Mutationsform zur Kontrollgruppe scheinen für eine
Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration vom Genotyp zu sprechen. Des weiteren
fand sich insbesondere kein signifikanter Einfluß durch die tägliche L-Dopa Dosis,
Folsäure-, Vitamin B6-, oder Vitamin B12-Konzentration, welche auf den Homocystein-
Stoffwechsel Einfluß nehmen können.
Bereits 1997 konnten Markus et al. eine Abhängigkeit der Homocysteinkonzentration
zum homozygoten MTHFR-Genotyp in Interaktion mit der Folsäurekonzentration
Diskussion
38
finden. Es zeigte sich jedoch keine Assoziation zwischen cerebrovaskulären
Erkrankungen und dem Genotyp.
Jedoch konnte die homozygote Mutationsform mit einem erhöhten Risiko für eine
vaskulär bedingte Demenz in Einklang gebracht werden (Yoo, Choi et Kang 2000). Im
Gegensatz zu einer Studie von Spence et al. 1999, in der Homocystein und nicht der
MTHFR-Genotyp signifikant mit einer Carotisarteriosklerose assoziiert war, konnte
Bova et al. 1999 die hochgradige Arteria Carotisstenose mit dem MTHFR C677T Allel
in Verbindung bringen.
Eine rein vaskuläre Genese des Morbus Parkinson scheint eine Rarität zu sein. In groß
angelegten Studien konnte ein reines vaskuläres Parkinson Syndrom zwischen 0,9 und
1,6 % der Fälle festgestellt werden. Jedoch zeigten sich bei 20 bis 27 % der Fälle
zusätzliche zerebrovaskuläre Erkrankungen (Jellinger 1998; Horner 1997; Scigliano et
al. 1996). Des weiteren fand sich bei Parkinson Patienten in der
Todesursachenforschung im Vergleich zur Normalbevölkerung eine signifikante
Erhöhung von ischämischen Herzerkrankungen und cerebrovaskulären Erkrankungen
(Ben-Schlomo et Marmot 1995). Im Gegensatz dazu steht eine Studie von Struck et al.
1990, die weniger Schlaganfälle bei Parkinson Patienten aufzeigen konnte.
4.1. Schlußfolgerung
Aufgrund der hier aufgeführten Studien scheint sich ein erhöhtes cerebrovaskuläres
Risiko bei Patienten mit Morbus Parkinson aufgrund verschiedenster Mechanismen
abzuzeichnen, welches durchaus auch Niederschlag in der Krankheitsprognose findet.
Ursächlich hierfür scheint eine Hyperhomocysteinämie zu sein, welche ebenfalls durch
die Ergebnisse unserer Untersuchung gestützt mit dem Morbus Parkinson assoziiert zu
sein scheint. Diese erhöhte Homocysteinkonzentration kann neben nicht hereditären
Ursachen (z. B. Vitaminmangelerscheinungen, medikamenteninduziert), wobei hier
gerade beim Morbus Parkinson der L-Dopa-Therapie ein besonderer Stellenwert zuteil
wird, durch hereditäre Ursachen (z. B. Cystathionin-β-Synthetase-Mangel; 5, 10
Methyl-Tetrahydrofolat-Reduktase-Mangel) bedingt sein. Eine in der Bevölkerung mit
Diskussion
39
bis zu 50% weit verbreitete Punktmutation am Nukleotid 677 des MTHF codierenden
Gens scheint bei Morbus Parkinson Patienten gehäuft aufzutreten.
Unsere Ergebnisse zeigen eine signifikante Assoziation der erhöhten Homo-
cysteinkonzentration sowohl am homozygoten, als auch am heterozygoten Genotyp bei
Parkinson Patienten im Vergleich zu Patienten mit normalem Genotyp und zur
Kontrollgruppe. Dies läßt auf einen direkten Zusammenhang der
Hyperhomocysteinämie bei Parkinson Patienten mit dem Auftreten des heterozygoten
und homozygoten MTHFR-Genotyps schließen. Weitere Studien diesbezüglich stehen
noch aus.
Aufgrund der im Tierversuch nachgewiesenen Erhöhung der Homocysteinkonzentration
durch eine L-Dopa-Medikation und der in unserer Arbeit signifikant nachgewiesenen
Hyperhomocysteinämie bei hetero- und homozygotem Genotyp des MTHFR
kodierenden Gens bei Parkinson Patienten ist ein additiver Effekt bei L-Dopa
behandelten Parkinson Patienten nachvollziehenbar und könnte das erhöhte
cardiovaskuläre Risiko bei Parkinson Patienten erklären. Interessant wären hierbei
Untersuchungen hinsichtlich der Homocysteinkonzentration vor und nach Beginn einer
L-Dopa-Therapie.
Auf der anderen Seite können sowohl L-Dopa, als auch Homocystein neurodegenerativ
wirken und so zu einer Progredienz der Erkrankung beitragen.
Welche Rolle Homocystein bei der Ätiologie des Morbus Parkinson einnimmt bleibt
unklar und müßte in weiteren Studien noch näher untersucht werden.
Falls die Ergebnisse dieser Studie durch weitere, nachfolgende Untersuchungen
bestätigt werden können, müßte vor Einleitung einer L-Dopa Medikation eine
Bestimmung der Homocysteinkonzentration im Serum erfolgen, um mögliche
cardiovaskuläre und neurodegenerative Komplikationen einer durch L-Dopa induzierten
Hyperhomocysteinämie vorzubeugen und eine eventuell vorbestehende Erhöhung der
Homocysteinkonzentration auszuschließen.
Falls eine Erhöhung der Homocysteinkonzentration besteht sollte dann eine
Genotypisierung der MTHFR durchgeführt werden, aufgrund der weiten Verbreitung
Diskussion
40
der heterozygoten und homozygoten Frequenz der MTHFR C677T-Mutation von über
50 % in der Bevölkerung. Dies sollte in Kombination mit einer Bestimmung der
Vitamine B6, B12 und Folsäure erfolgen, um ein mögliches Vitaminmangelsyndrom als
Ursache für eine Hyperhomocysteinämie auszuschließen.
Falls sich hier erniedrigte Werte ergeben, sollte zunächst eine Vitaminsubstitution mit
anschließender erneuter Homocysteinbestimmung durchgeführt werden, bevor eine L-
Dopa-Therapie anschließt.
In dem Falle einer homozygoten oder heterozygoten Mutation sollte die
Homocysteinkonzentration kontinuierlich, nach klinischer Applikation von L-Dopa,
kontrolliert werden, um einer chronischen Toxizität durch erhöhte Homocysteinwerte
durch synergistische Effekte der L-Dopa-Medikation und der homozygoten und
heterozygoten Mutation vorzubeugen.
Falls im Krankheitsverlauf eine L-Dopa-Therapie unumgänglich ist und weiterhin
erhöhte Plasmakonzentrationen des Homocysteins zu erwarten sind muß dies auch
therapeutische Konsequenzen nach sich ziehen.
Eine Erniedrigung der Homocysteinkonzentration könnte aufgrund der
Stoffwechselwege durch eine Erhöhung der Substratkonzentration oder vermehrte
Rekrutierung alternativer Stoffwechselwege und Verminderung der
Homocysteinsynthese erreicht werden (Kang 1996).
Die Effizienz einer Homocystein-senkenden Therapie konnte bereits am Beispiel des
angeborenen Neuralrohrdefektes bewiesen werden (Copp 1998; Wald et al. 1998;
Schorah 1998). Hierbei konnte eine tägliche Medikation mit 4 mg Folat eine Reduktion
der Neuralrohrdefekte um 70 % erreichen. 30 % zeigten sich nicht sensibel auf die
Folsäuretherapie. Eine tägliche Einnahme von 437 µg Folat resultierte in eine 21%igen
Reduktion der Homocysteinkonzentration (Riddell et al. 2000). Eine sichere Prävention
der Neuralrohrdefekte wird bei einer täglichen Einnahme von 400 µg angenommen
(Wald et al. 1998; Schorah 1998). Wie eine amerikanische Studie mit einer
folsäureangereicherten Müslipräparation gezeigt hat, bringt die tägliche Zufuhr von 600
Diskussion
41
µg nicht mehr als die Einnahme von 400 µg. Jedoch scheint die Einnahme von 200 µg
nicht ausreichend zur adäquaten Homocysteinsenkung zu sein (Malinow et al. 1998).
Durch eine konsequente Einnahme von 400 µg Folsäure und 1 mg Vitamin B12 kann ein
erhöhter Homocysteinspiegel normalisiert werden (Berlit 2000). Bei Einnahme von 500
µg Folsäure und 50 µg Vitamin B12 ließ sich der Homocysteinspiegel um 3-6 µmol/l
senken, was mit einer Risikoreduktion für eine koronare Herzerkrankung um 25 %
einhergeht (Sander 2000).
In einer Doppelblindstudie, die 285 älteren Personen einschloß, zeigte sich nach
8maliger Applikation von 1 mg Vitamin B12, 5 mg Vitamin B6 und 1,1 mg Folsäure
intramuskulär innerhalb von 3 Wochen bei 92% der behandelten Gruppe eine völlige
Normalisierung des Homocysteinwertes (in der Placebogruppe 20% normwertig)
(Naurath et al. 1995).
Bei einem genetischen Mangel von MTHFR zeigte sich jedoch die Therapie mittels
Folsäure, Vitamin B12 und Vitamin B6 nicht signifikant erfolgreich. Aufgrund dessen
wurde bereits seit 1972 erfolgreich in solchen Fällen Betain eingesetzt (Kishi et al.
1994). Betain ist ein alternativer Methylgruppendonor für die Umwandlung von
Homocystein zu Methionin über die Betain-Homocystein-Methyltransferase, welche
weder Folat noch Methylcobalamin als Coenzym benötigt.
In mehreren Einzelfallstudien konnte gezeigt werden, daß Betain eine Kompensation der
durch die MTHFR-Genmutation bedingten Hyperhomocysteinämie erbringen konnte.
Die SAM-Konzentration konnte dabei gesteigert, und die SAH-Konzentration gesenkt
werden und somit bessere Konditionen für Methylierungsreaktionen geschaffen werden.
Eine durch L-Dopa bedingte Verminderung von SAM und Erhöhung von SAH könnte
so eventuell kompensiert werden. Benötigt wurden hierbei Betaindosen zwischen 5 bis
20 g täglich. Bei keiner der Fallstudien zeigten sich irgendwelche Nebenwirkungen der
Betainmedikation (Hyland et al. 1988; Kishi et al. 1994; Bottiglieri et Hyland 1994).
Studien mit groß angelegten Patientenkollektiven fehlen zum jetzigen Zeitpunkt noch.
Diskussion
42
Der Abbau von L-Dopa über die Catechol-O-Methyltransferase (COMT), bei dem SAM
zu SAH umgewandelt wird und so ebenfalls eine Erhöhung des Homocysteins bewirken
kann, könnte über COMT-Hemmer abgefangen werden (Kuhn et Müller 1997). In vitro
konnte eine Verminderung der Toxizität von L-Dopa durch COMT-Hemmer
nachgewiesen werden (Storch et al. 2000).
Jedoch werden COMT-Hemmer zur Zeit noch relativ kontrovers diskutiert aufgrund
möglicher toxischer Nebenwirkungen (Kuhn 1998; Müller et al. 1993) und finden
deshalb erst bei Patienten in späten Krankheitsstadien hauptsächlich Anwendung.
Grundlage dieser möglichen therapeutischen Schritte einer Hyperhomocysteinämie
mittels Folsäure, Vitamin B6, Vitamin B12, Betain oder COMT-Hemmern ist, daß vor
Beginn einer L-Dopa-Therapie alle weiteren therapeutischen Optionen ausgeschöpft
werden, um die L-Dopa-Therapie so lange wie möglich vermeiden zu können.
Neuere Therapieoptionen könnten die Wirkung von L-Dopa verstärken, so daß eine
Dosis-Reduktion möglich oder zumindest eine weitere Erhöhung der L-Dopa-Dosis
vermeidbar wäre. In erster Linie wäre hier eine zusätzliche Medikation mit potentiellen
NMDA-Antagonisten wie z. B. Budipin und Amantadin zu überdenken (Kuhn et Müller
1997; Luginger et al. 2000).
Falls sich jedoch trotz Ausschöpfung aller therapeutischen Möglichkeiten einer
homocysteinsenkenden Therapie im Verlauf eine persistierende Hyperhomocysteinämie
zeigt, ist unter Abwägung des Benefits der L-Dopa-Therapie auf das Parkinsonsyndrom
gegen mögliche schwerwiegende Nebenwirkungen einer Hyperhomocysteinämie
gegebenenfalls auf eine L-Dopa-Therapie zu verzichten.
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166. Yasui K, Kowa H, Nakaso K, Takeshima T, Nakashima K: Elevated Plasma
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Literaturverzeichnis
62
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update review. Neuroepidemiology, 1993, 12: 195-208
Danksagung
63
6. Danksagung
Mein Dank gilt Herrn Prof. Kuhn für die Überlassung des Themas und die exzellente
Betreuung.
Herrn Priv.-Doz. Dr. Thomas Müller für die Unterstützung in organisatorischen Fragen
und statistischen Problemen.
Den vielen Parkinsonpatienten, die durch ihre Bereitschaft zur Teilnahme an der Studie
diese Arbeit erst ermöglicht haben.
Den Mitarbeitern des Labor Eberhard. Maria, Helga, Ferdinand und Dragica Hummel.
Angelika Basu
Lebenslauf
64
7. Lebenslauf
28.01.1974 Geburt als drittes Kind des Ehepaars
Dragica und Ferdinand Hummel in Berlin
1980-1984 Grundschule an der Josefinenstr. in Bochum
1984-1993 Gymnasium am Ostring in Bochum
Mai 1993 allgemeine Hochschulreife
Oktober 1993 Beginn des Medizinstudiums an der Ruhr-Universität-
Bochum
September 1995 Physikum
September 1996 1. Staatsexamen
September 1998 2. Staatsexamen
Oktober 1998 Beginn des Praktischen Jahres im St. Josef-Hospital
(Universitätsklinik der Ruhr-Universität-Bochum)
November 1999 3. Staatsexamen
Seit 15. November 1999 Tätigkeit als Arzt im Praktikum in der chirurgischen
Klinik des St. Josef-Hospitals (Universitätsklinik der
Ruhr-Universität-Bochum) unter der Leitung von Prof. Dr.
med. V. Zumtobel
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