Neuer luminescenzanalytischer Nachweis von Ascorbinsäure und einigen Mercaptoverbindungen

H. FREYTAG: Neuer lumineseenzanalytiseher Naehweis yon Aseorbins~ure. 263

Untersuchunjsgang /i~r Glylcole und ihre Ablc6mmlinge. Man ermittelt zun~chst Siedepunkt, Brechungsindex und gegebenenfMls

Diehte des zur Untersuehung gelangenden Produktes bzw. der daraus durch Destillafion gewonnenen einheitlichen Fraktionen. tm Anschlul3 daran bestimmt man die Verseifungszahl durch Erhitzen mit 0,5 n alkoholiseher KOH-L6sung sowie die Acetylierungszahl, wozu sieh z. B. die Methode yon A. VERLE~ U. F. BSL- SlI~G a gut eignet. Aus diesen Befunden erhs man h/tufig bereits gute ftinweise auf die Natur des untersuehtcn Produktes.

Aus der Acetylierungszahl bereehnet man die zur Umsetzung erforderliehe Menge PSC und ffihrt die Umsetzung nach Methode A oder ]3 dutch. Deutet die Verseifungszahl auf das Vorliegen yon Estern hin, so ffihrt man mit 1--2 g Sub- stanz zun~ehst eine pr~ipar~tive Verseifung mit tiberschiissiger 1 n KOH-LSsung dutch, neutralisiert mit 1 n Salzs~ure, s~ttigt die LSsung mit KMiumcarbon~t und perforiert mit Xther. Die ~itherisehe LSsung wird mit Katiumcarbonat getroeknet, abgedampft und der I~tiekstand mit PSC umgesetzt.

Idteratur.

Literaturangaben sind in der Dissertation H. OPFER, M~r'~urg 1953, zusammen- gestellt. - - 2 ~EAD0~, J. 1~., und E. E. REID : J. Amer. chem. Soc. 65,457 (1943). - - a JESURV~, J. A.: Ber. dtseh, chem. Ges. 26, 2286 (I893). - - t VERLEY, A., u. F. B6LSI~G : Ber. dtsch, chem. Ges. 34, 3354 (1902) ; vgl. diese Z. 41, 441 (1902).

Prof. Dr. H. B 6 ~ , Marburg/Lahn, Marbacher Weg 6.

Aus dem Forschungslabora~orium der Ondal GmbIt., Hiinfeld/Hessen.

Neuer luminescenzanalytischer Nachweis yon Ascorbinsiiure und einigen Merca)toverbindungen*.

Von HANS FREYTAG,

(Eingegangen am 1. Juni 1953.)

Fiir das l~edox-Geschehen in der Ze]le und in KSrperfliissigkeiten be- si tzen bckannt] ich l - (+) -Ascorb ins~ure u n d HS-Verb indungen wie Cystein bzw. Cystin sowic Glu ta th ion sehr erhebliche Bedeutung. Daher ist der Nachweis dieser Verb indungen ebenso wichtig.

Der bekanntes te Nachweis yon Vi t amin C ist der mi t Dichlorphenol- indophenol, der in neuester Zeit i~ K o m b i n a t i o n mi t der P~pierchromato- graphie yon S. KofCrSTEK u n d Z. P~OC~TXZKA ~ a~gewendet wurde, neben dem Nachweis mi t Silberni~rat in ammoniakal ischer LSsung bzw. mi t Jodd~mpfen ~. Eine interess~nte Methode wurde vor einiger Zeit yon F. WEYGA~D u n d E. CSE~D~S a angegeben. Sie be ruh t auf der Bi ldung eines Ti tan(IV)-Kornp]exes un te r E inbez iehung yon Pyr id in mi~ dem Endiol Ascorbins~ure in Fo rm eines ro ten Niederschlages.

* Kerrn Prof. Dr. phi]. O. RICHTER, Hannover, zum 75. Geburtst~g.

264 H. FREYTAG:

Zwei empfindliehe Naehweise s tammen von F. FEraL und H. T. CAR- I)oso ~, denen die l~eduktion yon Mangandioxyd bzw. Ammoniumphos- phormolybdat zugrundeliegt.

Gegenstand vorliegender Arbeit ist ein luminescenzanalytischer Naeh- weis der Aseorbins/~ure mit dem Na-Salz der 1,2-Naphthoehinon-4-sul- fons/iure, das bekanntlich yon O. FOLr~ in Gemeinsehaft mit H. W v 5 als niehtspezifisehes Reagens flit Aminos~uren empfohlen und yon M. S. SULLIVAN 6 zur colorimetrisehen Cystin- und Cysteinbestimmung heran- gezogen wurde. Ich beobaehtete, dab eine nicht zu verdiinnte Ascorbin- s~urel6sung nach dem Versetzen mit einer s0daalkalisehen LSsung yon FoLx~schem Reagens eine gegen dunlden Hintergrund dentlich sicht- bare blguliche Fluorescenz in s tarkem Tageslieht zeigt. I m filtrierten UV bietet sieh eine starke, weiB]ichblaue Fluoreseenz. In u dieser Reaktion wurden aueh andere reduzierende Substanzen geprfift (Glutathion stand leider nieht zur Verfiigung). Positiv reagieren aul~er Aseorbins~ure noeh Thioglykols~ure, Thiomilchsgure und Cystein.

Es scheint m6glieh, diese Nachweisreaktion mit der Papierehromato- gr~phie zu verbinden und eine fluorometrische Bestimmung auf ihr auf- zubauen.

Da sowohl FOLIN als auch SULLIVAN ihr Hauptaugenmerk auf die Farbreaktion richteten, ist es durchaus verst~ndlieh, dab diese Autoren die Fluoreseenzreaktion bei Cystein iibersahen.

Eine reeht naheliegende, mSgliche Deutung des neuen Nachweises ist in der Reduktion yon 1,2-Naphthoehinon dureh Aseorbins~ure (bzw. HS-Verbindungen) zu 1,2-Dioxynaphthalin-4-sulfonat zu sehen. Eine formal ~hnliehe Reaktion, die a]s Argument fiir diese Deutung dienen kann, ist die Reduktion des 1,2-Naphthoehinons mit sehwefliger Sgure naeh B6NIGE~ 7. Bei der Reaktion mit Ascorbins~ure muB sieh zugleieh Dehydroaseorbinsgure bilden. Was die HS-Verbindungen betrifft, so ist dutch J. BONGAI~TZ s festgestellt worden, dab Chinon mit Thioglykol- sgure reduziert wird. Naphthole und ihre Derivate besitzen bekanntlich Fluoreseenz (L. J. DESHA, R. E. SHEl~ILL und L. M. HARRISONg).

V e r s u c h s t e i l .

1. D i e S u b s t a n z e n . - - Die verwendete Ascorbins~ure war ein DAB 6-Pr~parat. Die Thioglyko]s~iure wurde dreimal im Vakuum destilliert, ebenso die nach J.M. Lov~N 1~ aus Brenztraubensaure und Schwefelwasserstoff sowie durch Reduktion der gebildeten Trithiodilac~ylsaure hergestellte (optisch inaktive) ~-Mercapto- propions~ure. Das Cystein stand als tIydrochlorid zur Verfiigung (Chemische Pro- duktion Bayreuth). Das Na-Salz der Mercaptobutansulfons~ure (Henkel & Cie.) wurde dreimal aus 80 vol~/oigem ~hano] umkristallisier~. Diese Substanzen wurden in ausgekochtem Wasser gelSst, tier Gehal~ wurde jodome~risch bestimmt, und nach diesem wurden jeweils die Verdfinnungen eingestellr 1~. Zweifellos ent- hielten diese LSsungen auch gewisse Mengen yon entsprechenden Disulfiden.

Lumineseenz-Naehweis v. Aseorbins&ure u. Mereaptoverbdg. 265

Untersucht warden ferner Aminoessigs~ure, Essigs/~ure, Natriumthiosulfat, Natriumsulfit, Natriumsulfid, Schwefelwasserstoff und Thioharnstoff.

2. Die L6sungen. - - Ihr Ansetzen erfo]gte mit geeichten Glasger~ten. Die Capillaren waren selbstgezogen und geprtif~. Die TropfengrSBe betrug im Durch- sehnitt n 0,02 g (= 0,02 ml).

3. UV-Strahlenquelle war die Analysenquarzlampe ,,Original-Hauau". 4. Das Fi l tr ierpapier stamlnte yon Schleicher & Schfill. Es zeigte sich, dab

die guten Sorten gebraucht werden kSnnen. Um aber die Eigenfluorescenz des Papiers, die stSrend wirkt, weitgehendst auszusehlieBen, wurde Nr. 2190 beuutzt, das praktisch kaum blEuliehe Fluoreseenz aufweist. In diesem Zusammenhang mag interessieren, dab die Fluorescenz yon Nr. 597, 598 und auch 2190 mater l~ngerem Einflu$ (1 Std) der unfiltrierten Gesamtstrahlung des Quarzbrenners zunimmt, im Gegensatz zu bisherigen allgemeinen Erfahrungen 12.

Das Anttipfeln der Papiere mit st~rkeren L6sungen yon Natriumcarbonat, Natriumborat und Natron]auge hat das Auftreten einer relativ sehr kr~ftigen blauliehen Fluoreseenz zur Folge, ein Umstand, der bei der Auwendung des FoLI~- sehen l%eagenses stSren muB.

5. W i r k u n g der Alkal ien. - - Es tra~en aber nieht nur StSrungen dieser Art auf Papier ein, sondern aueh in w/~Briger LSsung. Mit alkMischen LSsungen, wie starkem Ammoniak, Natronlauge usw. allein zeigte sieh Fluorescenz der L/isung naeh Zugabe der Reagensl6sung. Eine Ausnahme unter den schwaeh alkaliseh reagieren- den Verbh~dungen wurde im Mono~thanolamin geflmden, dessen w~tBrige LSsungen keine blaue Papier- oder Reagensl6sungsfluorescenz hervorruft. Das handelsfibliche Mono~Lthanolamin ist vor der Anwendung im Vakuum zweimM zu destfllieren.

6. FoLI~rS Reagens. - - Das Na-SMz der 1,2-Naphthochinon-4-sulfonsgnre war yon E. Merck. Die LSsung yon 0,1 g in 100 ml destilliertem Wasser wurde stets /risch bereitet.

7. Aus/i~hrung. - - Die Versuche ftihrteu zu folgeader Methodik: Die zu priifende Fliissigkeit wird mit einem oder mehreren Tropfen einer L5sung yon 5,7 g Mono- /~thano]amhl in 100 ml Wasser auf pH 7,5 eingestellt. Den pE-Wert prtift man mit Lyphanpapier, Was in diesem Fall geniigt. Mit der so vorbereiteten L0sung tfipfelt man Schleicher & Schfill-Papier Nr. 2190 an und troeknet den Tfipfel 3--4 rain ]aug, gegebenenfa]ls unter Mithilfe eines FShns, wobei grSBerer Abstand yon seiner AustrittsSffnung zu wahren ist. Auf den so eingetroekneten Tiipfel bringt man 1 Tr. der ffisch bereiteten ReagenslSsung und trocknet aueh diesen ein. ttierauf betrachtet man den Tiipfel unter der Analysenquarzlampe. Eine weiBblaue Fluo- rescenz zeigt Ascorbins~ure oder die erw~hnten IIS-Verbindungen an, w~hrend die fibrigen Verbindungen keine Fluoreseenz aufweisen. Das gleiehe gilt yon destfllier- tern Wasser, das mit einer Spur Mono~thanolamin auf p~I 7,5 gebraeht und ebenso geprfift wurde. Diese Blindprobe ist grundsg~tzlich parallel auszuffihren, wie es sich auch empfiehlt, die Fluorescenz des nicht mit Reagens betfipfelten Flecks der zu pr/ifenden LSsung zu beob~chten. Die Erfassungsgrenze und Grenzkonzentration beim Ttipfelnachweis auf Filtri~rpapier sind relativ gering, obwohl aus Grtinden der Adsorption mit hgherer Empfindliehkeit gereehnet werden mfiBte. ~u hgngt diese relative Unempfindliehkeit mit der Troeknung des Tiipfels und dem VerNiltnis der Priif- und geagenslSsungsmengen (yon beiden je 1 Tr.) zusammen. Eine hohe Empfindliehkeitssteigerung bietet die Ausfiihrung des Naehweises in LSsung. Man versetzt 1 ml der Prfifl6sung (PH 7,5 wie oben) im Reagensglas naeh Beobaehtung ehler etwaigen Eigenfluoreseenz (die.iibrigens bei den reinen Sub- stanzen nie festgestellt werden konnte) mit I Tr. des Reagenses, zweekmiiBig unter der Analysenquarzlampe, und zugleich Ms Blindprobe Wasser, das mit einer Spur Mono~thanolaminlSsung auf pE 7,5 gebraeht worden war. Diese Blindprobe ist

266 g . FamrTiG: Luminescenz-Naehweis v. Ascorbinsiure u. Mereaptoverbdg.

wichtig, besonders f ib den Nachweis der Substanzen in stark verdiinnten LSsungen. Die Blindprobe zeigt nuch Zugabe des l~eugenstropfens zun/~ehst eine schwache, grfinlichbNiuliehe Fluorescenz, die aber, vornehmlich beim Schfitteln des Reagens- gluses, in ganz kurzer Zeit verschwindet. Ist z. B. Ascorbinsgure vorhanden, so bil- det sieh sofort eine weiBHchbl~uliche Fluoresccnz aus, die sich durch diese Nuance yon der der Blindprobe unterscheidet, ferner noeh dadurch, dug sic wesentlich li~n- ger beim Schtitteln bestehen bleibt und beim Verdiinnen mit Wasser nicht ver- schwindet. Ein Fehlurteil erscheint unmSglich.

Tabelle 1.

Ascorbins~ure . . . . . Cys te inhydroch lor id . . Thioglykolsiure . . . c~-)/iercaptoloropion-

s~ure . . . . . . . Na-Mercuptobutun-

sulfon~t . . . . . .

I~achweis auf/)aDler

Erfassungs- Grenz- grenze i./~7 konzentration

2,5 1 : 8000 10 1 : 2000 2 1 : 10000

l 0 1 : 2000

20 1 : 1000

Erfassuags- grenze i. gg

Nachwels in L6sung

Grenz- konzentration

0,5 33

0,33

11

1 : 2000 000 1 : 30000 1 : 3000000

1 : 90000

1 : 500000

Aminoessigs~iure , E s s i g s i u r e , N a t r i u m t h i o s u l f a t , N a t r i u m s u l f i t , Na -

t r iumsu l f id , Schwefe lwasse r s to f f u n d T h i o h a r n s t o f f sowie Disulf ide, wie

Cyst in , l i e fe rn ke ine l%eaktion. Ve rg l e i eh t m a n obige B e f u n d e m i t den A n g a b e n y o n F. FEraL u n d

C~I )OSO e inerse i t s u n d y o n WEYGAND u n d Cs~NoES andere r se i t s , so

sehe in t es sieh be i d e m hier m i t g e t e i l t e n u m den b i she r e m p f i n d l i e h s t e n

N a e h w e i s fiir Aseorb ins~ure zu hande ln . I m V e : g l e i e h mi~ a u d e r e n

R e i k t i o n e n n i s t a u e h der N a e h w e i s de r Thioglykols i~ure als hoeh-

empf ind l i ch zu b e t r a c h t e n .

Es wurde versueht, die Asc0rbinsiure aueh in Citronensa/t nach der neuen Me- thods zu erfassen. Hierzu wurde der ~cait nnverdfinnt mit Monoithanolamin auf ps 7,5 eingestellt. Der Nachweis war im Tiipfel und im l~eagensglas positiv. Die Prti- lung ~uf HS-Verbindungen mit dem sehr empfindliehen Na-Nitroprussiatreagens in der Modifikation naeh FLEm~G (vgl. n ) war negativ. Ferner wurde unverdiinnter Citronensaft (6 ml) mit 10~ Triehloressigsiurel6sung (3 ml) versetzt, einmal filtriert und 1 Std lung zentrifugiert. Die nut noeh ganz wenig getriibte LSsung wurde wie vorher auf pg 7,5 eingestellt. Im filtrierten UV zeigte diese L6sung an sieh eine schw~che opake Fluorescenz, die beim Verdfinnen mit Wasser versehwand, bei 1;~eagenszugube uber stgrker wurde. Beim Verdiinnen naeh l~eagenszusatz blieb die Fluorescenz der PrfiflSsung erhalten. CitronensgurelSsung yon hSherer Konzen- tr~tion zeigt schwuch blguliehe, beim Verdtinnen versehwindende geringe Fluores- eenz, Tdchloressigs/ture iiberhuupt keine; mit dem Reugens tr i t t keine Finorescenz UU~.

Z u s a m m e n f a s s u n g .

E s wi rd ein neue r empf ind l i che r h m i n e s c e n z a n a l y t i s c h e r N a c h w e i s y o n

Ascorb ins i iure , Cys te in , Thioglykols~iure , ~ - M e r e a p t o p r o p i o n s a u r e u n d N a - m e r c a p t o b u t a n s u l f o n a t b e s c h r i e b e n u n d a u f C i t r o n e n s a f t a n g e w a n d t .

W. DI~5~AII~ u. K. Bo~Kl~Ol~: Ktinstliche t~arbstoffe und Fermentreaktionen. 267

Literatnr. KOfilSTEX, S., ~nd 2;. PlCOtZ~ZI~A: Chem. Listy 45, 272 (1951); vgL diese Z. 138,

383 (1953). - - 2 Vgl. ~ueh Z. Pxocm6zK~ and S. Ko f~ISTEK : Chem. Listy45, 274 (1951) ; vgl. diese Z. lg8, 383 (1953). - - 8 W~:fGA~I), F., u. E. Csn~I)ES: Chem. Ber. 35, 45 (1951); vgL diese Z. 136, 380 (1952). - - 4 Siehe FEraL, F. : ,,Qualitative Analysis by Spot Tests", S. 420/21, Elsevier Publishing Comp., Inc. 1947. - - ~ FOLIN, 0., and H. Wu : J. biol. Chemistry 51,377 (1922) ; vgl. diese Z. 66, 203 (1925). - - 6 SULLIVAI% I~. S.: PubL Health P~ep. 44, 1421 (1929). - - 7 Zit. nach V. 5~EYElZ 11. P. JAOOBSON: ,,Lehrbuch der organischen Chemie", 2. Bd., II., S. 372, Leipzig 1903. - - s BON- ~AI~TZ, J.: Ber. dtsch, chem. Ges. 21,478 (1888). - - 9 DESHA, L. J., 1%. E. SI~nlr and L. M. H~nI~XSON: J. Amer. chem. See. 48, 1493 (1926); vgL diese Z. 76, 448 (1929). - - Zit. nach P. W. ])s ,,Luminiscenz-Analyse im filtrierten ultravioletten Licht", 5. Aufl., S. 58, Leipzig 1949. - - ~ Lov~N, J. M.: J. prakt. Chem. (2) 29, 366 (1884); 47, 174 (1893); 78, 65 (1908). - - ~ FI~EYTAG, H.: diese Z. 138, 259 (1953). - - ~ VgL P. W. ~)ANC:KW'OI~TT ~, S. 27, 28.

Dr. H. FREYTAG, Fulda, L6herstraBe 13.

Aus dem Universit~tsinstitut fiir Lebensmittelehemie, Frankfurt a. M.

Kiinstliehe Farbs[offe und Fermentreaktionen, 5. Mitteilung*.

Der Einflul~ auf die Katalase.

Von W. DIEMAIR und K. BOEKHOFF.

5~it 7 Textabbildungen.

(Eingegangen am 22. April 1953.)

I m Zellgeschehen kommt den Oxyda t ionsenzymen eine grebe Bedeu- t ung zu, insbesondere der Kata lase u n d der Peroxydase, zwei F e r m e n t e n vo~ spezifischer Wirkung . Sie sind weit verbre i te t im Tier- u n d Pflanzen- reich. Die Kata lase ist haupts~chlich in der Leber, dann in den Nieren der Si~ugetiere u n d im Fe t tgewtbe zu finden, in der Muskula tm dagegen weniger. Das Op t imum ihrer W i r k u n g liegt bei etwa p~ = 7. Si t ist ein F e r m e n t h ~ m i n vom Molekulargewicht 225000 mi t einem Eis tngeha l t yon 0,09% u n d greift nu r ein einziges Subs t ra t an, das Wasserstoffper- oxyd, nicht dagegen a n d e r t Peroxyde. Ihre Spezifit~tt ist somit scharf ausgtpri igt . Si t bewirk~ die Zerlegung yon Wasstrs~offperoxyd in Wasser und Sauerstoff. t t i e r au f be ruh t auch ih r t F u n k t i o n im Organismus. W e n n m a n ~nn immt , dab die biologisehe Oxyda t ion eine Dehydr ie rung nach WIXLA~D ist, bei der der molekulare Sauerstoff als Wasserstoffaeceptor dient, so ergibt sich als erstes Reak t ionsproduk t n icht W~sser, sond t rn

* 1. und 2. Mitteilung: D I ~ I X , W., u. It. ttiivss~n: Z. Unters. Lebensmittel 92, 165, 403 (1951). - - 3. und 4. Mitteflung: DIE~AIX, W., u. K. BOEK~OF~: diese Z. 139, 25, 35, (1953).