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Nachweis von Lebensmittelallergenen – Eine analytische Herausforderung?
Verena Peterseil
Institut für Lebensmittelsicherheit Wien
2
o Gesetzliche Grundlagen (Auszüge)
o Analytik
Allergene in der amtlichen LM-Kontrolle
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• „Allgemeine“ Rechtsvorschriften− VO (EG) 178/2002 „Basis Verordnung“
− VO (EG) 882/2004 „Amtliche Kontrolle“
• „Spezielle“ Rechtsvorschriften− VO (EG) 1169/2011 „Lebensmittelinformationsverordnung“
− VO (EG) 828/2014 „Durchführungsverordnung Gluten“
− BGBl. II 175/2014 „Allergeninformationsverordnung“
Gesetzliche Grundlagen
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Kennzeichnung AllergeneEU (VO) 1169/2011 - BGBl. II 175/2014
Warum wird freiwillig deklariert?
• Abwehr zivilrechtlicher Ansprüche (oft verschuldensunabhängig)
• Vermeidung von Produktrückrufen
• Verbraucherinfo - Gesundheitsschutz
Kennzeichnung „Allergenspuren“ProdHaftG
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Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen• Durchführungsbestimmungen von EU noch nicht veröffentlicht
Freiwillige InformationenEU (VO) 1169/2011
√
tw.
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?
Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen Fehlende „Kennzeichnungs-Grenzwerte“
Kennzeichnung AllergeneDurchführungsverordnung / Spezialrecht
8
Lösungsansatz: „Beurteilungswerte“
Kennzeichnung AllergenePAL (precautionary allergen labelling)
9Auszug aus Newsletter 6/2015 von Krell Weyland Grube RA, Gummersbach; Schwellenwertdosis = Referenzdosis (Taylor)
Beurteilung - RisikobewertungDiskussion Schwellenwerte
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Dilemma – Rechtliche Grundlagen fehlen• Keine „PAL-Regeln“ vorhanden� „lockere vs. strikte“ Verwendung
Zu locker: Viele Produkte werden vorbeugend gekennzeichnet (= limitierte Auswahl für betroffenene AllergikerIn)
Zu streng: Inverkehrbringer geht Risiko einer Beanstandung/ Rückholung/ Haftung ein…..
� Einheitliche PAL-Regelung wäre wünschenswert (Durchführungsrechtsakte)
� EU task force erarbeitet zurzeit neue Dokumente (inkl. FAQ-Katalog)
Kennzeichnung AllergeneEU (VO) 1169/2011
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Amtliche Kontrolle zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts:
• Artikel 3: Allgemeine Verpflichtungen hinsichtlich der Organisation amtlicher Kontrollen
− Die Mitgliedstaaten stellen sicher, dass regelmäßig, auf Risikobasis und mit angemessener Häufigkeit amtlicheKontrollen durchgeführt werden….
� Multi Annual National Control Plan (MANCP)� Planproben (Schwerpunktaktionen, Monitoring,…)
− Beispiele für Planproben - Allergene
� 4S in Wurstwaren (Senf, Sesam, Sellerie, Soja)
� Laktose in Milchprodukten
Amtliche Kontrolle in Ö - Warum?
VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004
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Amtliche Kontrolle in Ö - Warum?
VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004
Bp für einen Probenahmeplan (Auszug; Risikolandkarte)
WarengruppeProbenanzahl
(Handel + PEP) aus Probenplan 2014
GlutenKrebstie
reEier Fische
Erdnüsse
Sojabohnen
MilchSchalenfrü
chteSellerie Senf
Proben für Allergenuntersuchung/ Jahr
0101 Rohes Fleisch frisch oder tiefgekühlt 327
0102 Rohes Fleisch zerkleinert, ungewürzt 291
0103 Fleischzubereitungen 347 10 10 10 10 35
0104 Pökel- und Räucherfleisch 272
0105 Würste 638 10 10 10 10 10 10 64
0106 Fleischkonserven 100 10 10 10 10 10 10 10
0107Suppen mit/aus Fleisch, Fleischextrakte und Suppen daraus 30 a a a a
0108 Naturdärme
0109 Wildbret frisch oder tiefgekühlt 100
0110 Wildbreterzeugnisse 100 10 10 10 10 10 10 10
0201 Meeresfische frisch oder tiefgekühlt 223
0202 Meeresfischerzeugnisse 183 a a a a a a a
Allergenanalytik ist eine Speziesdifferenzierung• Kein Nachweis ob ein LM eine allergische Reaktion
auslösen kann• Ergebnisangabe: mg Allergen / kg LM• 2 methodische Ansätze
a) Protein-Methoden b) DNA-Methoden
Allergen-Analytik
Repräsentative Probe
Kritisch: Homogenität & Extraktion
Herstellungsprozess meist unbekannt
Methodenwahl (DNA<->Protein)
• LM-Prozessierung -> Einfluss auf Analyt (zB. Gluten-ELISA)
• Matrixeffekte -> Analyt vorhanden/extrahierbar?
• Referenzmaterial / Kalibriermaterial
• Analyt -> Ergebnisangabe
Analytik
Indirekte Methode (Messung des
Farbumschlags nach enzymatischer Reaktion)
Quantifizierung möglich
Allergene Proteine / Markerproteine
(speziesspezifisch)
Monoklonale Polyklonale
Antikörper (erkennen multiple Epitope,
tolerant ggüber Proteinmodifizierung)
Lineare Epitope
Konformationsepitope (3D-Struktur wird
erkannt)
ELISA
Proteinextraktion in einer
Vielzahl an Matrizes möglich?
Gefahr falsch negative Ergebnisse
Auf bestimmte Proteinfraktionen
kalibriert / validiert
Unter-/Überschätzung
Ei-ELISA:
• Zielanalyt: Ovomucoid (eines von vielen Eiweißproteinen)
• Endergebnis: Gesamt-Eiweiß (bei Kitkalibrierungberücksichtigt)
• Wenn Probe andere Ei-Protein-Zusammensetzung hat -> Messfehler
• Gutachter: Umrechnung Gesamt-Eiweiß -> Gesamt-Ei
Gluten-ELISA:
• Zielanalyt: Gliadin (Gluten: Gliadin + Glutenin, ~1:1)
• Kalibierung mit PWG-Standard (>20 Weizensorten)
• Endergebnis: mg Gliadin/kg LM• Wenn Probe andere Getreideanteile (Roggen, Gerste,…)
aufweist -> Messfehler
• Gutachter: Gluten -> Gliadin x 2
ELISA-Beispiele
Gesundheitsstadt Berlin
Picquery.com
(real time) PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Target: DNA-Sequenz (Spezies-spezifisch)-> Floureszenzmessung!
• Screening (qualitativ -> quantitative Abschätzung möglich?)
• Quantifizierung möglich (Matrix-abhängige Kalibrierung)
� DNA-Kopien ->mg?
• Sensitiv (multi-copy-gene)
• Multiplexen möglich
PCR (DNA-Nachweis)
Fotolia.comOptimum.me
Ergebnisinterpretation
• Umrechnung DNA in Protein – kein direkter Zusammenhang!
Matrixangepasste Kalibierung mit realen Modellproben -> Vergleichbarkeit Probe mit Kalibiermaterial gegeben
• Jeder Probe eigenes Kalibiermaterial…
• ODER: Zertifiziertes Referenzmaterial (ZRM)
Ausnahme: Erdnuss (IRMM-481) Eipulver: NIST RM-8445 (nicht zertifiziert)
Milch: NIST RM-1549 (nicht zertifiziert)
Lösungsansätze:
• Standardisierung (Definieren von Mindestanforderungen für Methoden)
• Referenzmaterial herstellen
• Methodenentwicklung (MS, dPCR, NGS, …)
PCR (DNA-Nachweis)
Ergebnisangabe Allergene
EN 15633-1:
EN 15634-1:
KEIN zertifiziertes RM verfügbar! (Ausnahme Erdnuss)19
„…results are expressed as total amount of
allergenic ingredient per kilogram of food (mg/kg),
or as total amount of protein per kilogram of food,
using an appropriate factor that allows conversion to
the amount of allergenic ingredient per kilogram of
food.“
„…LODs/LOQs must be expressed as the number of
copies of DNA equivalent to a total quantity of the
allergenic ingredient per kilogram of food (mg/kg).
The equivalence should be based on certified
reference material.“
*1=ELISA, 2= rt-PCR
Analytik Allergene ELISA vs. PCR
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Methode Warum ja Warum nein
ELISA
-Einfache Durchführung-Allergen kann direkt nachgewiesen werden-Direkte Quantifizierungder Proteine
-Proteine instabiler als DNA-Eine Methode je Allergen erforderlich-Antikörper nicht für alle Allergene entwickelt-Antikörper richten sich nicht unbedingt gegen allergeneProteine-Eignung matrixbezogen-Unterschiedliche Eignung bei verschiedenen Matrices-Limitierungen oft nicht bekannt-Etablierung/Validierung teuer (Kit-Kosten)
PCR-DNA ist stabiles Molekül-Multiverfahren möglich-Etablierung günstiger
-Kein Nachweis des Allergens-Keine direkte Quantifizierung der Proteine (sondern der DNA-Kopien, Umrechnung bzw. Kalibrierung notwendig)-Nicht alle LM enthalten ausreichend amplifizierbare DNA
Fazit: Die quantitative Allergen-Analytik ist zurzeit nicht zufriedenstellend.-> Kombination ELISA und PCR
Jede Beurteilung ist eine Fall-zu-Fall Entscheidung
BeurteilungAmtliche Begutachtung
Rechtliche Aspekte
ExpositionAnalytik
Irreführende Angaben
Nicht sicher
Verzehrsmengen
Action levels
Referenzdosis
PAL
Lose Ware
vorverpackt
Nachweisgrenze
Protein/DNA-Methoden
Analyt
Referenzmaterial
Unbestimmte Angaben
Gesetzliche Grenzwerte
Vor-Ort Ermittlungen
Unterscheidung zwischen Kontamination zu wissentlichem Zusatz analytisch nicht möglich
− Unvermeidbare Kontamination (= nicht kennzeichnungspflichtig); rezepturbedingter Zusatz (= kennzeichnungspflichtig)
Methodik
- was wird gemessen - DNA/Protein/Allergen?
- welche Matrix wurde validiert / auf welche Substanz wird kalibriert?
- Kein Referenzmaterial verfügbar
− Keine zufriedenstellende Validierung von quantitativen Methoden möglich
� Lösung:
− Standardisierung (CEN/ISO-Normen)
u.a. zur Festlegung von Minimum Performance Kriterien
Beurteilung – Dilemma Analytik
AGES – Österreichische Agentur für Gesundheitund Ernährungssicherheit GmbH
www.ages.at
Abt. Molekular- u. Mikrobiologie
Spargelfeldstr. 191A-1220 Wien
+43 50555 32203
Verena Peterseil
Quellen: Teile der Präsentation stammen aus Beiträgen der Fresenius-Praxistage
"Allergenmanagement„ vom März 2017 in Dortmund