Versuch von Beadle und Tatum Verändertes Gen...

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Versuch vonBeadle und Tatum

Verändertes Gen-> veränderter Phänotyp Neurospora crassa

Purves et al. 12.1

Ein-Gen-ein-Polypeptid-Hypothese

Ein-Gen-ein-Enzym Hypothese

Ein-Gen-ein-Genprodukt-Hypothese

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Das zentral Dogma: Von der DNA zum Protein

Transkription

Replikation

Translation

Purves et al. 12.2

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Genexpression:

• Fluss von der genetischen Information (DNA) zum Genprodukt• beteiligte Vorgänge sind:

Transkription (DNA in RNA)Translation (RNA in Protein)

• findet in allen lebenden Zellen statt

Expression

Gen

Abschnitt auf der DNA, der für ein Genprodukt kodiert, inkl. Kontrollregionen

RNA

Protein

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Bei Prokaryoten in einem Kompartiment

Purves et al. 12.3 Purves et al. 14.1

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DNA

RNA

Protein

Transkription des Matrizenstranges

Translation

Nicht-Matrizenstrang (+)

Matrizenstrang, codogen (-)

Pro- und eukaryotische Genexpression

6Purves et al. 12.4

Transkription

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Die chemische Struktur der RNA

RNA DNA

•RNA enthält den Zucker Ribose•RNA enthält Uracil anstelle von Thymin

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RNA-Polymerase aus E. coli

α

α

β

β‘

Minimal (Core) Enzym, 4 UE: α2,β,β‘

α: Struktur des Enzymsβ: RNA-Syntheseβ‘: Bindung an DNA

DNA-abhängige RNA-Polymerase

Die RNA-Polymerase transkribiert DNA

•Katalyse von Phosphatdiesterbindungen•Verlängerung der wachsenden RNA Kette in 5‘->3‘Richtung•Substrat: Ribonukleosidtriphosphate, kein Primer

α

α

β

β‘

σ

Holoenzym, 5 UE: α2,β,β‘,σ

σ: Erkennung des Transkriptionsstarts

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Konsensussequenzen prokaryotischer Promotoren-10-Region = Pribnow-Box-35-Region

Promotor: Erkennungs- und Startpunkt für die RNA-Polymerase

nicht-transkribierte DNA transkribierte DNA

ATG

+1 Start der Transkription

Start der Translation

-35 -10

- 35-Region

-10-Region

„upstream“-Bereich

-35 -10 +1 lac ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAtrp AAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCApL TCTGGCGGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGAGCACATKons.-S ----------TTGACA---17+/-1 bp-----TATAAT--------

-1 keine „0“

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Transkriptionszyklus einer bakteriellen RNA-Polymerase

Promotor

DNA

σ-Faktor

RNARNA

RNA

RNA-Polymerase

1. Bindung des RNA-Pol-Holoenzymsan den Promotor (geschlossener Komplex)

2. Aufwinden der DNA(offener Komplex)

3. Anfängliche Transkription (10 nt)

4. Ablösung des σ-Faktors

5. Elongationsphase mit hoher Prozessivität (50 nt/s)

6. Termination

7. Freisetzung des Transkripts

Haar-nadel

Ribonukleosid-triphosphate

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Alternative Sigmafaktoren: Regulation der Genexpression bei E. coli

Sigmafaktor Größe (kDA) Funktion

σ70 70 Standard-SigmafaktorσS 38 Hunger, Stressσ32 32 Hitzeschock

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Transkriptionstermination bei E. coli

Rho-unabhängige Termination

Haarnadelförmige Sekundärstruktur im 3‘ Nichtkodierungsbereich einer mRNA

Rho-abhängige Termination

Rho-Protein (Hexamer) lagert sich an mRNAspaltet ATP

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Kodierende RegionDNA

+1 Ende

RNA-Transkript5‘ 3‘

Leadersequenz5‘ untranslatierterBereich

Trailer-Abschnitt3‘ untranslatierterBereich

Transkripte sind länger als die kodierende Region

Promotor Terminator

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Prokaryot Eukaryot

RNA-Polymerase

polycistronischemRNA

Translation noch während der Transkription

RNA-PolymerasemonocistronischemRNACap-Struktur

Poly(A)-Schwanz

mRNA muss aus dem Kern ausgeschleustwerden

Kernpore

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Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen

Brown 6.1

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RNA-Polymerase Produkt Lokalisierung

RNA-Pol I: rRNA (28S, 18S, 5,8S) Nukleolus

RNA-Pol II: mRNA (Protein-kodierende Gene) NukleoplasmasnoRNAs, einige snRNAs

RNA-Pol III: 5S rRNA, tRNAs, viele snRNAs Nukleoplasmainterne Promotoren !

Zusätzlich RNA-Polymerasen in Mitochondrien und Chloroplasten

mt-RNA-Pol mitochondriale Transkripte Mitochondrien(nur eine UE) (kernkodiert)

pt-RNA-Pol (PEP) plastidäre Transkripte Plastiden(E.coli-ähnlich) (plastidenkodiert)

pt-RNA-Pol (NEP) plastidäre Transkripte Plastiden(nur eine UE) (kernkodiert)

Eukaryoten: drei DNA-abhängige RNA-Polymerasen im Kern

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Eukaryotische Promotoren sind weniger konserviert

prokaryotischerPromotor

eukaryotischerRNA-Pol IIPromotor

Jannig & Knust 14.3

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Struktur und Transkription eines eukaryotischen Gens

Purves et al. 14.4

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Transkription eukaryotischer DNA durch die RNA-Polymerase II benötigt viele allgemeine Transkriptionsfaktoren (TF)

TFIIH

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Eukaryotische Gene enthalten kodierende Exon- und nicht-kodierende Intron-Bereiche,eukaryotische RNA-Pol II-Transkripte werden prozessiert

1. Anfügen des Cap am 5‘ Ende2. Polyadenylierung am 3‘ Ende3. Spleißen

Alle drei Prozesse finden im Zellkern statt !

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„Capping“ des Transkriptes am 5‘ Ende: Anfügen eines modifizierten Guaninnukleotids

• 5‘ Cap signalisiert 5‘ Ende eukaroytischer mRNAs•Wird während der Transkription angehängt• 5‘ Cap wichtig für Export der mRNA ins Cytosol und die Translation

Methylgruppe

5‘-5--Bindung

7-Methyl-Guanosintriphosphat

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Polyadenylierung am 3‘-Ende

10- 20 Nukleotide < 30 Nukleotide

Spaltung durch Endonukleasekomplex

Poly(A)-Anheftung durch Poly(A)-Polymerase

wird abgebaut

• 3‘-Poly(A)-Schwanz signalisiert 3‘-Ende eukaroytischer mRNAs• Poly(A)-Polymerase (Polymerisation ohne Matrize !)• 200-250 A-Nukleotide werden angehängt• 3‘-Poly(A)-Schwanz wichtig für Export der mRNA ins Cytosol, für die Stabilität und die Translation

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Spleißen des Transkripts

Intron wird entfernt

Teil der mRNA

• Nukleotidsequenzen markieren die Spleißstellen

• Spleißen wird durch Spleißosomenausgeführt

• Spleißosomen sind aus Proteinen und snRNAs zusammengesetzt

Spleißen = Entfernen der Intronsequenzen aus dem Primärtranskript, Verknüpfung der Exons

Janning & Knust 14.9

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Das Spleißosom,eine Spleißmaschine

Purves et al. 14.10

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Eukaryoten: Kontrolle der Transkription durch die Chromatinstruktur

Modifikation (z. B. Acetylierung) der Chromatinproteine (Histone) reguliert die Transkription

offenes Chromatin -> transkriptionsaktiv

kondensiertes Chromatin -> transkriptionsinaktiv

Histon-AcetylierungHiston-Acetyltransferase(HAT)

Histon-DeacetylierungHiston-Deacetylase(HDAC)

DNA

Nukleosom

30 nm

Histon-oktamer

10 nm

Janning & Knust 17.16

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Histon-Acetyltransferase (HAT)

Reguliert Zugänglichkeit der DNA für Proteine der TranskriptionsmaschinerieHiston-Acetyltransferase (HAT) acetyliert Histone in der Nähe der TATA-Box

Histone

Nukleosom

DNA

Transkriptionsfaktor

Ac

RNA-Polymerase II

Transkription

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Histon-Deacetylierung

Histon-Acetylierung

Histon-MethylierungDNA-Methylierung

Histon-DemethylierungDNA-Demethylierung

Modifikation des Chromatins

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Prokaryoten Eukaryoten

RNA-Polymerase eine RNA-Polymerase, drei RNA-Polymerasen,einige Sigma-Faktoren viele allgemeine

TranskriptionsfaktorenregulatorischeTranskriptions- ja ja; zahlreichfaktoren

Transkript meist polycistronisch, monocistronisch,keine Modifikation Modifikation am 5‘- u. 3‘-Ende

Introns i.d.R. nicht vorhanden, meist vorhanden,kein Spleißen Spleißen

Trennung von Transkription u. nein ja (Kern/Cytoplasma)Translation

Einfluss derChromatinstruktur kein Chromatin! ja

Initiation der Genexpression:Unterschiede zwischen Pro- und Eukaryoten

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Die drei durch die Transkription erzeugten Haupttypen von RNA-Molekülen

Brown 6.1

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Ribosomale RNA

Ribosomen bestehen aus RNA (rRNA) und Proteinen und sind aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt

Purves et al. 12.9

31

Ribosomen

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Svedbergeinheit S

•Maß für Sedimentationsgeschwindigkeit bei Zentrifugation in einem Dichtegradienten•S-Wert abhängig von Größe, Form, Volumen und Dichte des Partikels/Moleküls•je größer und kompakter, desto größer ist Wanderungsgeschwindigkeit

Zellfraktionierung durch differentielle Zentrifigation, Sedimentationsanalyse oder Dichtegradientenzentrifugation(Saccharose)

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Dichten und S-Werte von Zellmaterial

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Zusammensetzung der Ribosomen bei Pro- und Eukaryoten

Prokaryoten Eukaryoten

S1, S2, S3, etc.Ges.: ca. 35

18S rRNA(1874)

40SS1, S2, S3, etc.Ges.: >20

16S rRNA(1542)

30Skleine UE

L1, L2, L3, etc.Ges.: ca. 50

28S rRNA(4818)5,8S rRNA(160)5S rRNA(120)

60SL1, L2, L3, etc.Ges.: >30

23S rRNA(2904)5S rRNA(120)

50Sgroße UE

ProteinerRNA (Nukleotide)

GrößeProteinerRNA (Nukleotide)

Größe

35

Molekulare Feinstruktur eines 70S Ribosoms

Purves et al. 12.9 b

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Sekundärstruktur der 16 S rRNA von E. coli

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Prozessierung der eukaryotischen rRNA

Janning & Knust 15.1e

38

DNA, die rRNA kodiert ist repetitiv

Purves et al. 14.2

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•Kernkompartiment•Ort der rRNA Synthese•Nukleolus besteht aus DNA, RNA und Proteinen•Prozessierung der prä-rRNA, Zusammensetzung präribosomaler Partikel

Nukleolus-Organisator (NO) besteht aus rDNA, die von mehreren Chromosomenstammen kann und tandemartig abgeordnete rDNA enthält

Nukleolus

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tRNAs fungieren als Adapter(400 000 tRNA Moleküle pro Bakterien-Zelle)

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•tRNAs bestehen aus 74 – 95 Nukleotiden•Kleeblattstruktur•Akzeptorarm bindet Aminosäure; 3‘ Ende endet immer auf -CCA•DHU-Arm enthält ungewöhnliches Pyrimidin Dihydrouracil•Anticodonarm erkennt mRNA•Variabler Arm enthält variable Anzahl an Nukleotiden•TψC enthält die Abfolge T, Pseudouracil und C

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Tertiärstruktur der tRNA

jede tRNA hat individuelle 3D-Struktur

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Uridin

Zucker

44

Der genetische Code

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Die 20 in Proteinen vorkommenden Aminosäuren

Janning & Knust 15.3

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Problem: 4 Buchstaben A,T,G,C -> aber 20 Aminosäuren

Singulet-Code: 4 CodonsDuplett-Code: 42 = 16 Codons

Triplett-Code: 43 = 64 Codons

Purves et al. 12.5

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Frage: Welches Triplett codiert für welche Aminosäure?

Versuch von Nirenberg und Matthaei

Purves et al. 12.6

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Der Code ist degeneriert, d.h. mehrere Triplettscodieren eine Aminosäure(Ausnahme: Tryptophan und Methionin)

Synonyme Codons sind sich meist ähnlich, so dass die ersten beiden Basen eines Tripletts oft schon die Aminosäure spezifizieren (Ausnahmen: Leucin und Arginin)

Leucin

Leucin

Arginin

Arginin

Purves et al. 12.5

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Die "Wobble"-Hypothese (F. Crick 1965)

"wobble" = "Schwanken, Wackeln"Eine einzelne z. B. mit Glycin beladene tRNA kann drei verschiedene Codons auf der mRNA erkennen

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"Wobble" Abweichungen bei der Bindung des Anticodons an das Codon

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Der genetische Code ist fast universellund gilt für alle Organismen

Es gibt wenige Ausnahmen(insbesondere in Mitochondrien-Genomen) z.B. UGA (normalerweise Stop) in Mitochondrien Tryptophan und AUA (normalerweise Isoleucin) in Mitochondrien Methionin

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Verwendung von Code-Wörtern (Codon usage)

Ein Beispiel: 6 Arginin Codons

CGT 43%

CGC 32%

CGA 7%

CGG 8%

AGA 9%

AGG 1%

korrespondiert mit Vorkommen synonymer tRNAs d.h. es gibt seltene Codons (Spezies-spezifisch)

Regulation von Genaktivität, da seltene Codons zu schwächerer Expression führen