Zur Bestimmung von Oestradiol, Oestron und Oestriol im Harn

4.Analyse yon biologisehem Material 235

den Leerwert. In der besehriebenen Art behandelt man fortlaufend mehrere Serien zu je 3 oder mehr t{6hrchen im Abstand yon jeweils 5 rain. Zur Au/stellung der Eichkurve verwendet man 1,5, 3,0, 4,5, 6,0 nnd 7,5 ml einer StandardlTsung (25 mg Cholesterin ~- 27,7 mg Cholesterylaeetat werden in 200 ml EDG 15 rain im sieden- den Wasserbad gel6st und naeh Abkiihlen mit EDG auf 250 ml aufgefiillt. 1 ml entsprieht 0,20 nag Gesamteholesterin), die man jeweils mit EDG auf 7,5 ml auf- fiillt. Ein Leerwert mit 7,5 ml EDG wird mitgefiihrt.. Man versetzt jedes Glas mig 0,27 ml Wasser (entsprieht der mi~ dem Serum eingebraehten Wassermenge), erhitzt 30 m i n i m siedenden Wasserbad, kiihlt ab, filtriert und verwendet 5 ml des t~iltrats znr Durehffihrung der Bestimmung. - - Da Wasser einen grol?en Einflug auf die Farbdiehte der LTsung ausiibt, ist auf dessen Fernhaltung unbedingt, zu aehten. Aueh is~ es erforderlieh, die Farbentwieklung vor hellem Lieht zu sehiitzen.

1 t~6ntgen- u. Labor-PraMs 11, L. 53--60 (1958). - - 2 j . biol. Chemistry 164, 657 (1946). ~ . PELZ~R

Fiir ehm klinisch schnell und einfach anwendbare Cholesterh~bestimmung im Serum schl~gt J. F. TonnEs 1 folgende Arbeitsweise vor: Man gibt in ein Zentri- fugenglas yon 12--15 ml 0,1 ml Blutserum, 0,3 ml Eisessig und 0,1 ml Wasser, fiigt 1 ml DigitoninlSsung (1 g in 100ml absol.~thanol) hinzu, schiittelt und 1/igt 30 rain ruhen. Naeh 5 mill langem Zentrifugieren (2500 U/rain) wird die iiber- stehende Fliissigkeit durch ein Papierfilter filtriert. Der Niederschlag wird noch 2real mit 1 ml und 3 ml ~rasser geschiittelt und wie oben zentrifugiert. Danaeh gibt man 4 ml Aceton zu, zentrifugiert 10 rain, l~13t 5 rain umgekehrt ablaufen, gibt 6 ml Eisessig zu, um den Niedersehlag aufzulSsen und stellt einige Minuten ins siedende Wasserbad. Man l~Bt abkiihlen und fiigt 4 ml Co-Reagens zu (85,5mg CoCI 2 �9 5HeO in 2 ml bidest. Wasser ~- 5 ml Eisessig auf 100 ml mit Sehwefels/~ure [D t,84] aufgefiillt). Die Extinktion wird im Photocolorimeter unter Anwendung des ~ilters 50 gemessen und der Cholesterinwert einer Eichkurve entnommen. -- Die vorgeschlagene Methode tibertrifft die iibliehen oder ist ihnen zumindest gleichwertig. Es werden 87--100~ Choles~erin wiedergefunden bei Anwesenheit aon 3 0 - 4 0 rag.

1 t~ev. Asoc. bioqulm. Argent. 22, 330--341 (1957). Univ. Nacional del Sud. IR~IGAI~D ~F[TZER

Zur Bestimmung yon 0estradiol, 0estron und 0estrio! im H a m einer nieht schwangeren Frau empfehlen JE. A. KAKVgKINA und V. G. OXLOVA 1 folgende Arbeitsweiae. 250 ml 1~Iarn werden mit 37,5 ml konz. Salzs~ure 10 rain am I{iick- flul3kiihler gekoeht; man kiihlt, filtriert (Biichner-Triehter) und extrahiert 4mal mit je 20--25 ml frisch dest. Ather die Glueuron- oder Schwefels~ureester der oes~rogenen Stoffe. Die vereinigtenAtherextrakte w~scht man 1--2ram mit 5 bis 7 ml ges/~tt. Sodal6sung (um Emulgieren zu verhtiteil). Dann extrahiert man aus der AtherlTsung das Oes~riol 4mal mi* je 7--10 ml 0,1 n Natronlauge, w~scht die Atherl6sung mit Wasser naeh und dampft sie zur Trockne ein. I)er trockene Riick- stand enth~lt Oestron und Oestradiol; man 15st ihn in 15--20 ml thiophenfreiem Toluol und extrahiert 4mal mit je 7--10 ml 1 n Natronlauge, s/~uer~ die alkalisehen Extrakte mit konz. Salzs~ure auf pE 3,0 an (Kongorot) und extrahier~ daraus die I)henolsteroide 4 mal mit je 20 ml J~her, w~seht die A~herextrakte mit SodalSsung, danaeh mit Wasser nach und dami0ft ein. Dann wird eine chromatographische Si~ule (10• mit 3 g AleO~ gefiillt, mit 3 ml Benzol (thiophenfrei) gewasehen. Man 16s~ nun den oes~rogeuen Trockenriiekstand in 2--3 ml 2~ CHaOI-I-LSsung in Benzol und l~13t die LSsung dutch die S/~ule mit 0,5 ml/min tropfen. Man eluiert die 30estrogene mit CHaOH-LTsungen in Benzol unterschiedlieher Konzentration: zuerst das Oestron mit 15 ml 2~ LTsung (2 g Methanol und 98 g Benzol),

236 Bericht: Spezielle anMytische Methoden

dann das Oestradiol mi t 10 ml 5~ LSsung (5 und 95 g), zuletzt das Oestriol mi t 10 ml 30~ LTsung (30 und 70 g), portionsweise zu je 3,3 ml. Die Eluate sam- melt man gesondert und dampft sic im Vakuum zur Trockne ein. Zur quant i ta t iven Best immung auf Grund der Farbreakt ion n~ch H. C o ~ und 1~. BA~ES ~ 15st man die Riickst~nde in ]e 0,4 ml absol. Ath~nol, setzt 1 ml konz. Schwefelsi~ure hinzu, erhitzt gcnau 3 rain auf siedendem Wasserbad, setzt 4 ml 25 vol-~ Schwcfels~ure hinzu und erhi tzt wieder 3 rain. Danach filtriert man die triiben, ros~ gef~rbten, griin fluorescierenden L6sungen durch Glasfilter Nr. 4 ab und m i ~ die Ext inkt ion der klaren farbigen HormonlSsungen bei 500 m~ gegen Blind- l(~sungen ohne Hormon (Athanol ~- ~I2S0a). Znr Berechnung der Ergebnisse dient eine im Original enthal tene Tabelle. - - Durch spezifische Reakt ionen (yon K o ~ ftir Oestradiol, yon Z ~ E n ~ ftir 0estron) ist die erfolgte Trennung besti~tigt worden. Bei Kontrollzus~tzen yon Oestron und Oestradiol zum Harn sind im Mittel 90% der Zus/~tze nachgewiesen worden. In Parallelversuchen sind ein mitt lerer Fehler yon ~ 0,45 #g fiir Oestriol (zugleich gleich dem mit t leren Fehter der Summe), sowie ~ 0,65/~g fiir die beiden ~nderen oestrogenen Stoffe ermittelt .

Laborat. Delo 4, I t . 2, 11--16 (1958) [Russisch]. Inst . fiir Geburtshilfe u, Gyn~kologie des Gesundheitsminist . der RSFSR. -- ~ Clin. Endocrinol. 7, 701 (1947). A.v . W I L r ~

Die chemische Bestimmung yon Digitoxin in Geweben und Ausseheidungen beschreibt K. I~EPKE 1. Das gekiihlte Material wird mit eiskalter physiologischer SalzlTsung im Verh~ltnis 1 : 10 bis 1 : 50 versetzt, grob zerkleinert und untcr Eis- kiihlung grfindlich homogenisiert. 5 - -30 ml der Suspension werden 2 • 5 rain je nach Emulgierung im Verh~ltnis I : 3 his 1 : 5 mit reinem Chloroform ausgeschiittelt. Die Suspensionen werden auf 5- -10 g A120 ~ nach B~OCKMA~ gegeben und nach Waschen mit 10--20 ml Chloroform mit 2 • 15--25 ml 20/o Athanol in Chloroform und 2 • 15--25 ml 10~ _&thanol in Chloroform ehier t . Zu den zur Trockne ver- dampften Elua ten gibt man je 2 ml Reagens (1,5 mg Xanthydrol , 15 ml Eisessig und 0,15 ml konz. Salzsi~ure) und erhi tzt nach Verschlul~ mit Schliffstopfen genau 3 min im siedenden Wasserbad. Vor dem ~essen der Ext ink t ion stellt man 5 min in Eiswasser und 10 min in Wasser yon 20 ~ C. - - Fiir die m-Dinitrobenzolreaktion (0,5~ LSsung in Pyridin) wird der trockene t~fickstand mit je 2,00 ml l~eagens aufgenommen und nach Zumisehen yon je 0,05 ml 0,1 n ~aOH-L6sung 5 rain im I)unkeln bei 25 ~ C gehalten. Vor dem ~essen wird je ein kleiner Kristal l Bors~ure zugegeben, wora.uf bei positiver Reakt ion eine violette Farbe hervortr i t t . - - Die ~iessung der Absorption erfolgt bei 546 m# (Xanthydrolreaktion) bzw. bei 579 m# (m-Dinitrobenzolreaktion). - - Die Leistungsf~higkeit der Methode wird tabellurisch un 17 verschiedenen Geweben und Ausscheidungen demonstriert .

1 ~Naunyn-Schmiedcbergs Arch. exper. Patho]. Pharmakol . 233, 261--270 (1958). Inst . f. Med. u. Biol., Akad. Wiss. Berlin. A. M~RI)~L

Zur Besthnmung der Ascorbinsi~ure im Gewebe ha t E. Go~I 1 die ~ e t h o d e yon J. H. Ro~ and C. A. KVETHn~ 2 in verschiedenen Punk ten abge~ndert. Er emp- fiehlt nach eingehender Begriindung der Anderungen iblgende Arbeitsweise/i~r die Bestimmunff der gesamten AscorbinsSure. 4 ml Gewebsextr~kt]Ssung in 4~ Trichloressigsaure werden mit 1 Tr. einer DichlorphenolindophenollSsung (20 rag/ 20 ml Wasser), 1 ml 2~ L6sung yon 2,4-Dinitrophenylhydrazin in 9 n Schwcfe]- saure und mit 1 ml 4~ L6sung yon Thioharnstoff in 9 n Schwefelsaure ver- setzt. Man belaBt 45 min in einem Wasserbad yon 57 ~ C und gieBt dann in 5 ml eisgekiihlte 85~ Schwefelsaure. Die Ext inkt ionsmessung erfolgt bei 515 m#, I m Bereich yon 0- -10 ,ug Ascorbinsaure/ml L6sung besteht lineare Abhangigkeit