- DMPC-Nanotubes - Untersuchungen einer neuartigen ... · Molekül-geometrie Packungs-parameter Molekülassoziat bzw. Phase Beispielsubstanzen P < 1/3

- DMPC-Nanotubes - Untersuchungen einer neuartigen Vesikelstruktur in

Dispersionen aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät

der Friedrich-Schiller-Universität Jena

von Apothekerin Ulrike Lauf

geboren am 09.02.1973 in Magdeburg

Gutachter:

1. Professor Dr. Anne S. Ulrich

2. Professor Dr. Alfred Fahr

3. Professor Dr. Alfred Blume

Tag der Doktorprüfung: 6. Oktober 2003

Tag der öffentlichen Verteidigung: 27. Oktober 2003

Die vorliegende Arbeit ist am Lehrstuhl für pharmazeutische Technologie der

Friedrich-Schiller-Universität Jena auf Anregung von Frau Prof. Dr. K. Westesen ent-

standen.

Mein Dank gilt allen, die zum guten Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben:

Frau Prof. Dr. K. Westesen danke ich für die Aufnahme an Ihrem Lehrstuhl und die

persönliche Betreuung der Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Dres. h. c. H. Oelschläger danke ich herzlich für seinen persönlichen

Einsatz nach dem Tod von Frau Prof. Dr. K. Westesen in der Weiterführung der

Arbeit.

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Anne S. Ulrich und Herrn Prof. Dr.

Alfred Fahr für die bereitwillige Übernahme der Betreuung, die hilfreichen Diskus-

sionen und die unkomplizierte, freundliche und motivierende Unterstützung in der

Endphase der Arbeit.

Steffi Richter danke ich besonders für ihren engagierten Einsatz bei der Gefrier-

bruch-Präparation, Markus Drechsler für seine geduldige Einweisung und Unterstüt-

zung in der Elektronenmikroskopie und Alexander Mohn für seine verläßliche Hilfe

bei den Röntgenmessungen.

Gerald Gellermann und Thomas Appel vom IMB Jena möchte ich für ihre Einweisung

und Unterstützung sowie die Bereitstellung der Gerätschaften für die Dünnschicht-

chromatographie danken.

Für die großzügige Überlassung größerer Mengen Phospholipid danke ich den Fir-

men Astra Arcus (S-Södertälje) und der Lipoid GmbH (D-Ludwigshafen).

Weiterhin möchte ich Heike Bunjes danken für ihre hilfreichen Diskussionen und An-

regungen, in besonderer Weise Tobias Unruh für die vielen wertvollen Gespräche

und Hilfestellungen und außerdem allen derzeitigen und ehemaligen Mitarbeitern des

Lehrstuhls für Pharmazeutische Technologie für das freundschaftliche Betriebsklima.

Abschließend danke ich allen, die mich durch die manchmal turbulenten Zeiten der

Promotion auf verschiedenste Weise helfend begleitet haben - meinen Freunden,

Oliver und meiner Familie.

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1.1. Chemische und physikalische Eigenschaften von Phospho- lipiden 1.1.1. Das Phasenverhalten von Phosphatidylcholinen in Wasser- überschuss: DPPC und DMPC 1.1.1.1. Der Einfluss von Zusätzen auf das Phasenverhalten von Phosphatidylcholin-Bilayern 1.1.1.2. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie zur Strukturaufklärung von Phospholipid-Wasser-Systemen 1.2. Liposomen - Phospholipide als Arzneistoffträger 1.3. Andere Phospholipid - Strukturen 1.4. Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit 2. Material und Methoden 2.1. Materialien 2.1.1. Phospholipide zur Herstellung der Liposomen 2.1.2. Wässrige Phase 2.1.3. Lösungsmittel, Sprühreagenzien und Referenzsubstanzen für die Dünnschichtchromatographie 2.1.4. Weitere Substanzen

2.2. Methoden 2.2.1. Herstellung der Dispersionen 2.2.1.1. Quellung der Phospholipide 2.2.1.2. Hochdruckhomogenisation 2.2.1.3. Extrusion 2.2.1.4. Ultraschall 2.2.1.5. Probenlagerung 2.2.2. Untersuchungsmethoden 2.2.2.1. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC) 2.2.2.2. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 2.2.2.3. Visuelle Prüfung / Makroskopisches Erscheinungsbild 2.2.2.4. Teilchengrößenanalyse 2.2.2.4.1. Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) 2.2.2.4.2. Laserdiffraktrometrie, gekoppelt mit Polarization Intensity Differential Scattering Technology (LD / PIDS) 2.2.2.5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

1 1 3 6 7 9 12 14 15 15 15 15 16 16

16 16 16 17 17 18 18 18 18 19 20 20 21 22 23

II 2.2.2.5.1. Gefrierbruch 2.2.2.5.2. Kryo-TEM 2.2.2.5.3. Negative Staining mit Uranylacetat (2%ig) 2.2.2.6. Röntgenstrukturanalyse 2.2.2.7. pH-Wert-Bestimmung 3. Ergebnisse 3.1 Lagerstabilität von DMPC-Dispersionen 3.1.1. Charakterisierung der Liposomen direkt nach der Her- stellung 3.1.2. Stabilität der Dispersionen in Abhänigkeit von der Lagerungstemperatur und der Phospholipidkonzentration 3.2. Das Gelierungsphänomen 3.2.1. Makroskopische Beschreibung der Geleingenschaften 3.2.2. Elektronenmikroskopische Beschreibung der halbfesten Systeme 3.2.2.1. Elektronenmikroskopische Charakterisierung der Nano- tubes 3.2.2.1.1. Gefrierbruch - TEM 3.2.2.1.2. Negative Staining Präparation (Negativkontrastierung) 3.2.2.1.3. Kryo-Präparation 3.2.2.2. Lagerstabilität der Nanotubes 3.2.2.3. Temperaturstabilität der Nanotubes 3.2.3. Einfluss der Herstellungsmethode auf die Gelbildung und Nanotube-Entstehung 3.2.3.1. Eigenschaften der Dispersionen nach Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation 3.2.3.2. Beeinflussung der Gelbildungsneigung durch Variation der Herstellungsparameter 3.2.3.2.1. Extrusion 3.2.3.2.2. Hochdruckhomogenisation 3.2.3.2.3. Ultraschall 3.2.3.2.4. Zusammenfassung 3.2.4. Einfluss verschiedener DMPC-Chargen auf die Gel- bildungstendenz 3.2.5. Einfluss von Konservierungsmitteln auf die Eigenschaften 10%iger DMPC-Dispersionen 3.2.5.1. DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel 3.2.5.2. Konservierung mit einem Gemisch aus Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat im Verhältnis 1:3

23 25 25 26 26 27 27 27 27 30 30 31 33 33 35 38 39 39 42 43 48 48 49 51 53 54 55 56

III (m/m) 3.2.5.3. Konservierung mit 0,05% (m/m) Natriumazid 3.2.5.4. Konservierung mit 0,1% Thiomersal 3.2.5.5. Zusammenfassung 3.2.6. Einfluss des Zusatzes von Lipiden auf Lagerstabilität und Ultrastruktur von 10%igen DMPC-Dispersionen 3.2.6.1. Die Referenz-Dispersion aus reinem DMPC 3.2.6.2. Einfluss der Verunreinigungen auf das Phasenverhalten von DMPC 3.2.6.3. Eigenschaften der Dispersion 3.3. Untersuchungen zur Reinheit von DMPC 3.3.1. Makroskopisches Quellungsverhalten 3.3.2. Thermoanalytische Untersuchungen 3.3.3. Ergebnisse der Röntgenkleinwinkeluntersuchungen 3.3.4. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie 3.3.5. Einfluss der Lipidvorbehandlung 3.3.6. Zweiwertige Kationen 3.4. Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC im Verhältnis 4:1 (m/m) 3.5. Dispersionen aus DPPC 4. Diskussion 4.1. Vorstellungen zur Morphologie der Nanotubes im Vergleich zu bekannten tubulären Strukturen 4.2. Überlegungen zum Entstehungsmechanismus der Nano- tubes 4.3. Der Einfluss von Zusätzen auf die Nanotubebildung 4.4. Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Hydratations- und Dispersionseigenschaften von DMPC 4.5. Fazit und Ausblick 5. Zusammenfassung

6. Literaturverzeichnis

Anhang A.1. Abkürzungsverzeichnis A.2. Anmerkungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestim- mungsmethoden

58 59 61 62 63 63 64 65 69 70 71 72 73 78 78 82 84 89 89 92 100 104 108 110

112

i ii

Einleitung

_________________________________________________________________________________

1

1. Einleitung

1.1. Chemische und physikalische Eigenschaften von Phospholipiden

Phospholipide sind ubiquitär in der Natur vorkommende Lipide, die Phosphorsäure

als Mono- bzw. Diester enthalten. Phospholipide sind amphiphile Verbindungen: Die

Moleküle sind vereinfacht aus einer hydrophilen Kopfgruppe und einem lipophilen

Kohlenwasserstoffrest aufgebaut, die über das Rückgrat miteinander verbunden sind.

Sie stellen eine sehr heterogene Verbindungsgruppe dar und können, je nach der

das Rückgrat darstellenden Alkoholkomponente, in Sphingophospholipide und Gly-

cerophospholipide (Alkoholkomponente Sphingosin bzw. Glycerol) unterteilt werden.

Die Glycerophospholipide lassen sich aufgrund der Struktur der hydrophilen Kopf-

gruppe in Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phospha-

tidylinositol, Phosphatidylglycerol und Phosphatidsäure unterteilen. Alle Glycerophos-

pholipide tragen eine oder zwei Acyl- oder Alkyl-Ketten. Eine Übersicht der verschie-

denen Phospholipidklassen ist in Abb. 1 gegeben.

Abb. 1 : Übersicht über die Strukturen verschiedener Phospholipid-Klassen.

lipophiler Kohlenwasserstoffrest

Rückgrat hydrophile Kopfgruppe

Phospholipidklasse

Phosphatidylcholin (PC)

Phosphatidylethanolamin (PE)

Phosphatidylserin (PS)

Phosphatidylglycerol (PG)

Phosphatidsäure (PA)

Phosphatidylinositol (PI)

Sphingomyelin (SM)

Einleitung

_________________________________________________________________________________

2

Phospholipide sind molekular praktisch unlöslich in Wasser (die Löslichkeit von Di-

palmitoylphosphatidylcholin beträgt z.B. 4,7 ·10-10 M; Tanford, 1980), aber ein kom-

pakter Lipidblock kann durch Penetration von Wassermolekülen zwischen die hydro-

philen Kopfgruppen quellen. Durch den hydrophoben Effekt, der die Zusammenlage-

rung der unpolaren Kohlenwasserstoffketten begünstigt, bilden die Amphiphile in

Wasser bei Überschreitung einer kritischen Konzentration, der so genannten critical

micelle concentration (CMC), größere Molekülaggregate. Dabei hängt die Gestalt der

Aggregate entscheidend davon ab, wie groß der Platzbedarf des hydrophilen und

des hydrophoben Molekülteils ist.

Israelachvili stellte erstmals solche geometrischen Überlegungen an und führte den

dimensionslosen Packungsparameter P = V / Ao · l zur Beschreibung von Mizellfor-

men ein. Dabei ist V das Volumen des hydrophoben Molekülteils, Ao die Quer-

schnittsfläche der hydrophoben Kopfgruppe und l die kritische Kettenlänge der Alkyl-

ketten. Israelachvili bestimmte kritische Werte für den Packungsparameter und ord-

nete diesen Werten bestimmte Assoziatformen zu. So ergibt zum Beispiel ein

Packungsparameter von P< 1/3 höchstwahrscheinlich Mizellen (Israelachvili et al.,

1977, 1980). Eine Übersicht über den Zusammenhang zwischen Packungsparameter

und entstehender Assoziatform ist in Abb. 2 dargestellt.

Phospholipide, die einen Packungsparameter zwischen ½ und 1 aufweisen, bilden

planare Doppelschichten, auch "Bilayer" genannt, aus. Kommt es zu einer Verkleine-

rung des Packungsparameters, beispielsweise durch Vergrößerung der Kopfgruppe

durch Ladung und verstärkte Hydratation oder zu einer Verkleinerung des Volumens

der lipophilen Ketten durch Hydrolyse einer der beiden Ketten, kann das zu einer

Umwandlung der lamellaren in eine mizellare Phase führen. Im Gegensatz dazu

kann eine Erniedrigung der Nettoladung der Kopfgruppe (zum Beispiel durch Wech-

selwirkungen mit mehrwertigen Kationen) oder eine Erhöhung des Platzbedarfs der

hydrophoben Ketten infolge Temperaturerhöhung zu einer Vergrößerung des

Packungsparameters und damit zu einer Umwandlung einer lamellaren in eine

hexagonale Phase führen (Lichtenberg & Barenholz, 1988).

Einleitung

_________________________________________________________________________________

3

Molekül-geometrie

Packungs-parameter

Molekülassoziat bzw. Phase

Beispielsubstanzen

P < 1/3

Mizelle

• Lysophospholipide • Tenside

Invers konisch P < 1

Hexagonale Phase HI

• Lysophospholipide

Zylindrisch

P ~ 1 Lamellare Phase • Phosphatidylcholin • Phosphatidylserin • Phosphatidylinositol • Sphingomyelin

P > 1 Hexagonale Phase HII

• Ungesättigtes

Phosphatidylethanolamin • Kalziumsalze der

Phosphatidsäure (pH< 6)

Konisch

P » 1

Inverse Mizelle • Natrium-bis(2-ethylhexyl)-

sulfosuccinat (AOT) in Heptan

Abb. 2 : Zusammenhang zwischen dem dimensionslosen Packungsparameter P und der daraus resul-tierenden Form von Molekülassoziaten. P = V / Ao · l (modifiziert nach Lichtenberg & Barenholz, 1988).

Von allen Phospholipiden stellen die Phosphatidylcholine die am häufigsten vor-

kommende Lipidklasse dar. Von großem Interesse ist das Phasenverhalten von

Phospholipid-Wasser-Systemen zum einen wegen der möglichen biologischen Rele-

vanz der verschiedenen Phasen und Phasenumwandlungen. Außerdem ermöglichen

erst umfassende Kenntnisse des Phasenverhaltens der Phospholipide ein rationales

Design phospholipidbasierter Arzneistoffträgersysteme.

1.1.1. Das Phasenverhalten von Phosphatidylcholinen in Wasserüberschuss: DPPC und DMPC

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DMPC) und 1,2-Dipalmitoyl-sn-

glycero-3-phosphatidylcholin (DPPC) gehören zu den meist untersuchten Phos-

Bilayer

Einleitung

_________________________________________________________________________________

4

phatidylcholinen (Koynova & Caffrey, 1998). Die chemische Struktur von DMPC ist in

Abb. 3 abgebildet, im DPPC sind beide Fettsäureketten um je 2 CH2-Gruppen verlän-

gert.

Abb. 3 : Strukturformel von 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phos-phatidylcholin (DMPC).

DMPC und DPPC bilden im Überschuss von Wasser eine Lamellarphase aus, die in

Abhängigkeit von der Temperatur einen ausgeprägten Polymorphismus zeigt.

In Abb. 4 sind die verschiedenen lamellaren Phasen von Phosphatidylcholinen stark

vereinfacht dargestellt, deren Phasenübergänge z.B. mittels Dynamischer Differenz-

kalorimetrie (DSC) detektiert werden können.

Abb. 4 : Schematische Übersicht über die lamellaren Phasen von Phosphatidylcholinen. Erklärungen siehe Text.

Nach Langzeitäquilibrierung bei niedrigen Temperaturen (bei DPPC sind mehrere

Stunden unterhalb 8°C notwendig; Nagle & Tristram-Nagle, 2000) bildet sich die

lamellar kristalline Phase (Subgelphase, Lc). Die Fettsäureketten liegen hier in einer

all-trans-Konformation vor und sind bezüglich der Bilayernormalen in einem Winkel

von 30 35° (DPPC: 34,5°; Katsaras et al., 1995) geneigt. Die Lipidmoleküle ord-

nen sich in einem orthorhombischen Gitter an, sie sind ausgestreckt und besitzen

keine Rotationsfreiheitsgrade. Der Bilayer ist planar.

Eine Temperaturerhöhung über die Subübergangstemperatur (TS) bewirkt die Auf-

weitung der Kettenpackung und eine Abnahme der kristallinen Ordnung durch eine

zunehmende Rotationsfreiheit der Ketten. Diese Phase wird als Lβ`-Phase (tilted gel)

bezeichnet. Der Neigungswinkel von vollständig hydratisiertem DMPC in der Lβ`-Pha-

se beträgt 32,3° (Tristam-Nagle et al., 2002). Die Temperatur dieser Phasenum-

1

2

3

+ -

Lα-Phase Lc-Phase Lβ`-Phase P β`-Phase

TS TP TM

Einleitung

_________________________________________________________________________________

5

wandlung hängt stark von den Äquilibrierungsbedingungen ab und liegt für DPPC

unter Gleichgewichtsbedingungen bei 14,5°C (Nagle & Wilkinson, 1982).

Bei weiterer Temperaturerhöhung findet ein nächster Übergang in eine zweite Gel-

phase, die so genannte Ripple Phase (Pβ`-Phase), statt (Vorübergang, TP; TP (DMPC):

13,7°C; TP (DPPC): 34,4°C; Koynova & Caffrey, 1998). In der Ripple Phase nimmt die

Kettenrotationsfreiheit weiter zu, die Kopfgruppen besitzen eine stärkere Mobilität

und der dadurch verstärkte Platzbedarf der Kopfgruppen wird durch die Bildung eines

periodisch modulierten Bilayers ausgeglichen. Es sind symmetrische und asymme-

trische (sägezahnförmige) Rippel beschrieben. Nach der Hydratation des Lipids bei

einer Temperatur innerhalb des Existenzbereiches der Ripple Phase bildet sich aus-

schließlich der asymmetrische Typ mit einer Periodizität von 13 - 15 nm. Dieser Typ

entsteht außerdem nach dem Erwärmen ausgehend von der Lβ`-Phase. Nach Abküh-

len aus der Lα-Phase wird dagegen hauptsächlich der symmetrische Typ mit einer

Periodizität von 25 - 30 nm beobachtet (Meyer & Richter, 2001).

Bei weiterer Temperaturerhöhung findet das eigentliche Kettenschmelzen statt

(Hauptübergangs- oder Kettenschmelztemperatur Tm; Tm(DMPC): 23,6°C; Tm(DPPC):

41,3°C; Koynova & Caffrey, 1998), es bildet sich die flüssig-kristalline Lα-Phase. Die

steife Kettenordnung geht in einem hochkooperativen Schmelzvorgang vollständig

verloren, und die gauche-Isomere der Fettsäureketten führen zu einer hohen Konfor-

mationsunordnung innerhalb des hydrophoben Teils des Bilayers. Der Bilayer ist wie-

der planar und die Lipide können lateral frei diffundieren.

Beim DPPC sind all diese Phasenübergänge reversibel. DMPC weist die Besonder-

heit auf, dass ausgehend von der Subgelphase Lc bei Temperaturerhöhung direkt die

Ripple Phase Pβ` gebildet wird. Dieser Übergang ist jedoch irreversibel, d.h., dass

sich ausgehend von der Ripple Phase bei Temperaturerniedrigung zunächst die

Gelphase Lβ` ausbildet. Diese ist metastabil und geht langsam in die Subgelphase Lc

über. Der Übergang Lβ` → Pβ` ist reversibel.

Die Kinetiken der Phasenumwandlungen sind sehr unterschiedlich: Während die

Hauptumwandlung weniger als 2 Sekunden benötigt, findet die Vorumwandlung

innerhalb von Minuten statt, der Subübergang benötigt hingegen Stunden bis Tage

(Cevc, 1993).

Einleitung

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6

Mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung werden Bragg-Reflexe der periodischen

Lipid-Wasser-Strukturen erfasst (Abb. 5). Anhand der Lage der Maxima ist über die

Braggsche Gleichung der so genannte d-Wert (räumliche Ausdehnung einer Wieder-

holungseinheit in Richtung der beobachteten Wiederholung, entspricht bei der La-

mellarphase der Dicke eines Bilayers zuzüglich dem Abstand zweier Bilayer), bere-

chenbar.

2d sinθ = n λ (Braggsche Gleichung)

d: d-Wert, lamellarer Wiederholungsabstand [nm] θ: halber Streuwinkel [°] n: ganze Zahl (Ordnung) λ: Wellenlänge der Röntgenstrahlung [nm]

Mit s = 2 sin θ / λ (s: reziproker Gittervektor [nm-1]) kann bei s = n/d der lamellare

Wiederholungsabstand bestimmt werden.

Abb. 5 : Schematische Darstellung der lamellaren Wiederholungseinheit und eines daraus resultierenden typischen Röntgenkleinwinkeldiffraktogramms. Der d-Wert errechnet sich aus d = n/s.

Die Werte für den Abstand der lamellaren Wiederholungseinheit sind bei voll-

ständiger Hydratation abhängig von der Struktur des Lipids und der Temperatur. So

wurde beispielsweise für DPPC in der Lα-Phase (50°C) ein d-Wert von 67 Å ermittelt

(Nagle et al., 1996), während in der Lβ`-Phase (20°C) ein d-Wert von 63,5 Å resultiert.

DMPC hat in der Lα-Phase (30°C) einen d-Wert von 62,7 Å (Nagle & Tristram-Nagle,

2000).

1.1.1.1. Der Einfluss von Zusätzen auf das Phasenverhalten von Phosphatidyl-cholin-Bilayern

Das Phasenverhalten der Phospholipide wird durch Fremdmoleküle beeinflusst.

Dabei hängt der Effekt der Zusätze von der Polarität der zugegebenen Moleküle ab

d

0,00 0,02 0,04

0

20

40

60

80

100

Inte

nsitä

t

s (nm-1)

Peak 1. Ordnung(n=1)

Peak 2. Ordnung(n=2)

Einleitung

_________________________________________________________________________________

7

(Seddon & Cevc, 1993). So werden amphiphile Moleküle (z.B. andere Lipide, Chole-

sterol) in die Membran eingebaut und wechselwirken sowohl mit den Kopfgruppen

als auch den Ketten der Phospholipide. Cholesterol führt beispielsweise in Konzen-

trationen über 5 mol% zu einer Unterdrückung der Vorumwandlung sowie zu einer

Verbreiterung und schließlich dem Verschwinden des Hauptübergangs (McMullen &

McElhaney, 1995). Es erniedrigt die Ordnung in der Gelphase und erhöht die Ord-

nung in der fluiden Phase.

Auch der Zusatz von Fettsäuren beeinflusst das Phasenverhalten von DMPC und

DPPC in Form einer deutlichen Erhöhung der Übergangstemperaturen (Mabrey &

Sturtevant, 1977; Inoue et al., 2001; Koynova et al., 1997).

Neben organischen Molekülen beeinflussen aber auch Ionen, vor allem mehrwertige

Kationen, über Wechselwirkungen mit den Kopfgruppen das Phasenverhalten von

Phospholipiden. Über eine Dehydratation der Kopfgruppe und die Bildung von Ionen-

Brücken zwischen benachbarten Molekülen können sie zu einer Erhöhung der Ord-

nung und damit zu einer Erhöhung der Kettenschmelztemperatur führen (Arnold et

al., 1975; Arnold, 1976; Hauser & Shipley, 1984). Lis et al. haben gezeigt, dass der

Zusatz von Calciumionen eine starke Quellung von DPPC-Bilayern bewirkt. Dabei

vergrößert sich bei Raumtemperatur die interlamellare Wasserschicht von 19 Å in

reinem Wasser auf über 90 Å in 1mM CaCl2 (Lis et al., 1981).

1.1.1.2. Der Einsatz der Transmissionselektronenmikroskopie zur Strukturauf-klärung von Phospholipid-Wasser-Systemen

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) hat sich seit vielen Jahren zur

Charakterisierung von Lipid-Wasser-Systemen etabliert. Eine Darstellung einzelner

Lipidmoleküle ist zwar wegen der begrenzten Auflösung im Transmissionselektronen-

mikroskop nicht möglich, dennoch leistet sie große Dienste zur Visualisierung der

verschiedensten Phospholipid-Überstrukturen (z.B. Liposomen, planare Bilayer, tubu-

läre Vesikel) und macht diese einer strukturellen Analyse zugänglich (Meyer & Rich-

ter, 2001).

Die Vorbereitung der Probe kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Die einfachste

und daher auch gebräuchlichste Methode ist die Negativkontrastierung (Negative

Staining; Robenek, 1995; Harris, 1997), die bereits Ende der 50er Jahre entwickelt

wurde. Sie ist besonders hilfreich bei der Aufklärung der Lamellarität von Phos-

pholipid-Vesikeln. Hierbei werden die zu untersuchenden Strukturen in wässriger

Suspension zunächst auf einen Trägerfilm aufgebracht. Anschließend erfolgt die

Einleitung

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8

Kontrastierung mittels einer Lösung von Schwermetallionen, die sich an die Kopf-

gruppen der Phospholipide anlagern. Nach Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit

kann das Präparat im Elektronenmikroskop untersucht werden. Die Membranen und

Partikelstrukturen erscheinen hell auf dunklem Hintergrund. Aufgrund der not-

wendigen Trocknung kann es zur Bildung von Trocknungsartefakten kommen: Der

Kollaps von Vesikeln lässt diese oft als faltige und unförmige Strukturen erscheinen.

Aus diesem Grund ist Vorsicht bei der Bestimmung von Liposomendurchmessern

geboten. Für eine korrekte Interpretation ist es daher notwendig, neben der Negativ-

kontrastierung andere Präparationsmethoden anzuwenden.

Eine grundsätzlich andere Methode, die diese Trocknungseffekte umgeht, ist die

Kryofixierung. Dabei wird die Probe durch schnelles Eintauchen in eine Kühlflüssig-

keit (geeignet sind Propan oder Ethan) eingefroren und so in ihrem hydratisierten Ur-

sprungszustand fixiert. Problematisch bei der Kryofixierung ist allerdings die Möglich-

keit der Entstehung von Strukturschäden durch das Wachstum von Eiskristallen und

die Aufkonzentrierung von Elektrolyten, die nicht in das Kristallgitter des Eises mit

eingebaut werden. Idealerweise soll deshalb das Wasser amorph erstarren (Vitrifizie-

rung), die Abkühlung muss also schneller erfolgen als die Kinetik der Eiskristall-

bildung (Angell & Choi, 1986; Uhlmann, 1972). Zur Gewährleistung eines vollständi-

gen und sehr schnellen Erstarrens des Wassers müssen die Proben sehr dünn (eini-

ge µm) sein.

Die klassische Methode zur Erzielung eines TEM-Bildes nach Kryofixierung ist die

Gefrierbruch-Replika-Technik (Gefrierbruch-TEM). Die Methode beruht auf der An-

fertigung eines Metall-Abdruckes der Bruchfläche der gefrorenen Probe (Moor, 1964;

Winkelmann & Meyer, 1968). Der Bruch durch die Probe verläuft bevorzugt an den

Orten schwächster Wechselwirkungen. Bei Phospholipid-Bilayern sind das die Kon-

taktstellen der einander gegenüberliegenden lipophilen Fettsäureketten, so dass

hauptsächlich die hydrophoben Innenflächen der Bilayer freigelegt werden. Die an-

schließende Schwermetall-Schrägbeschattung führt in Abhängigkeit vom Relief der

Bruchfläche zur Bildung einer unterschiedlich dicken Metallschicht, die anschließend

durch senkrechtes Aufdampfen von Kohlenstoff stabilisiert wird. So entsteht die Re-

plika, die nach Abschwämmen und Reinigen im TEM untersucht werden kann. Im

TEM erscheinen die dicken Metallschichten dunkel, während Stellen, die nicht oder

nur dünn mit Metall bedeckt sind, hell erscheinen. Auch bei dieser Methode sind Ar-

tefakte nicht ausgeschlossen (Sleytr & Robards, 1982): So kann die Anlagerung von

Einleitung

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9

Schwermetallclustern an Orten mit besonders hoher Bindungsaffinität zu so ge-

nannten Dekorationseffekten führen, die den Schatteneffekt überlagern und das Bild

verfälschen können. Weiterhin können Restgase, insbesondere Wasserdampf, im

Vakuum auf der kalten Bruchfläche kondensieren und kleine Partikel vortäuschen.

Während des Bruchprozesses sind plastische Deformationen möglich.

Bei der Kryo-Elektronenmikroskopie wird die Probe nach der Kryofixierung direkt in

das TEM eingebracht und untersucht (Taylor & Glaeser, 1976; Dubochet, 1982), wo-

durch Interaktionen mit Metallen (Gefrierbruch-TEM) oder Kontrastierungsreagenzien

(Negative Staining) umgangen werden. Als Probenträger dient ein engmaschiges

Netzchen, welches in die Probe getaucht wird. Nach Entfernen der überschüssigen

Flüssigkeit bildet sich in den Maschen des Netzchens ein maximal 1 µm dicker

Flüssigkeitsfilm aus, der die dispergierten Untersuchungsobjekte enthält. Innerhalb

dieser Flüssigkeitslamelle kommt es zu einer Größenseparierung: kleine Objekte

können in der etwa 100 nm dicken Mitte der Flüssigkeitslamelle beobachtet werden,

während größere Objekte an den dickeren Rand gedrängt werden. Die Entstehung

von Eiskristallen ist auch hier problematisch. Außerdem ist die Gefahr von

Strahlenschäden (strukturelle Veränderungen, Verkochen) sehr hoch, was ein Ar-

beiten mit möglichst geringer Strahlendosis notwendig macht.

1.2. Liposomen - Phospholipide als Arzneistoffträger

Bangham zeigte 1965 erstmals im Elektronenmikroskop, dass in Wasser dispergierte

Phospholipide Vesikel ausbilden, die aus konzentrisch angeordneten Lamellen auf-

gebaut sind (Bangham, 1965).

Liposomen werden definiert als kugelförmige Vesikel, die einen wässrigen Kern

mittels einer oder mehrerer konzentrischer Phospholipid-Doppelschichten umschlie-

ßen. Die Größe der Liposomen ist sehr variabel. 1977 definierte die New York

Academy of Science folgende Liposomen-Typen:

SUV`s (Small Unilamellar Vesicles) sind Liposomen mit einem Durchmesser von

etwa 25 - 50 nm. Sie werden von einer einzigen Bilayerschicht gebildet. Die starke

Membrankrümmung verursacht einen hohen Krümmungsdruck, weshalb die Fusions-

tendenz der SUV`s sehr hoch und damit ihre Stabilität niedrig ist. Die Beladungska-

pazität mit hydrophilen Arzneistoffen ist auf Grund des geringen Einschlussvolumens

verhältnismäßig gering, außerdem ist die Membranpermeabilität wegen der hohen

Einleitung

_________________________________________________________________________________

10

Membranspannung sehr hoch. LUV`s (Large Unilamellar Vesicles) haben einen

Durchmesser von etwa 50 - 1000 nm. Wie die SUV`s bestehen sie aus nur einer

Lipid-Doppelschicht. Wegen ihrer Größe und dem damit verbundenen geringen

Krümmungsdruck ist die Membran nahezu spannungsfrei. MLV`s (Multilamellar

Vesicles) sind aus einer Vielzahl konzentrisch angeordneter Bilayer aufgebaut. Ist die

Bilayeranzahl gering, werden die Vesikel auch als OLV`s (Oligolamellar Vesicles)

bezeichnet. Die Größe der MLV`s kann zwischen 100 nm und mehreren Mikrometern

variieren. MVV`s (Multivesicular Vesicles) sind Vesikel, die in ihrem Inneren kleinere

Vesikel eingeschlossen haben.

Welche Art von Liposomen entsteht, hängt stark von der Herstellungsmethode ab.

Eine detaillierte Darstellung der verschiedenen Herstellungsverfahren ist bei Lasic

bzw. New gegeben (Lasic, 1993; New, 1990). An dieser Stelle sollen nur die Metho-

den Erwähnung finden, die im Laufe der eigenen Arbeiten verwendet wurden.

Eine mehrfache Extrusion durch isopore Polycarbonatmembranen führt zur Bildung

von LUV`s mit relativ enger und gut reproduzierbarer Teilchengrößenverteilung

(Olson et al., 1979, Mayer et al., 1986). 1994 wurde auf Basis dieses Herstellungs-

prinzips die Herstellung großer Chargen (im Litermaßstab) mittels kontinuierlicher

Hochdruck-Extrusion beschrieben, die einen Fortschritt in Richtung des Einsatzes

der Methode im Industriemaßstab darstellt (Schneider et al., 1994). Die Herstellung

von Liposomen mittels Hochdruckhomogenisation und Möglichkeiten des Scaling Up

wurden von Brandl und Mitarbeitern untersucht (Brandl, 1990; Brandl et al.,

1990, 1993). Die resultierende Liposomen sind sehr klein (SUV`s), und es handelt

sich dabei meist um vergleichsweise heterogene Liposomenkollektive mit bi- oder

trimodalen Teilchengrößenverteilungen (Lasic, 1993). Auch die Dispergierung mittels

Ultraschall produziert hauptsächlich SUV`s (Huang, 1969), diese Methode wird

allerdings nur für die Liposomenherstellung im Labormaßstab genutzt. Besonders

kritisch zu bemerken ist hier der starke Energieeintrag, der zum Erhitzen der Probe

führt und damit die Oxidation ungesättigter Lipide und die Esterhydrolyse forciert.

Außerdem ist anschließend häufig Metallabrieb der Ultraschallsonde mittels Filtration

oder Zentrifugation zu entfernen.

Seit etwa 30 Jahren werden Liposomen intensiv auf ihre Eignung als Arzneistoff-

träger untersucht. Da Phospholipide physiologisch vorkommende Substanzen sind

werden Liposomen als in der Regel physiologisch gut verträglich eingestuft. Die beim

Abbau der Phospholipide entstehenden Produkte sind untoxisch, und Liposomen

Einleitung

_________________________________________________________________________________

11

gelten als nicht immunogen. Aufgrund ihres Aufbaus können Liposomen sowohl zum

Einbau hydrophiler (im wässrigen Kern) als auch lipophiler Substanzen (in den

lipophilen Teil der Phospholipid-Doppelschicht) genutzt werden. Dem gegenüber

stehen eine Reihe von Nachteilen bzw. noch ungeklärten Problemen, zu denen vor

allem Stabilitätsprobleme gehören. Schwierigkeiten bereitet auch die Herstellung

steriler Liposomendispersionen und häufig das Scaling Up von im Labormaßstab

erfolgreichen Herstellungsverfahren (Lasic, 1993; Zuidam et al., 1996). Diese Gründe

mögen dazu beitragen, dass bis heute trotz intensiver Forschung erst verhält-

nismäßig wenige liposomenbasierte Fertigarzneimittel auf dem Markt sind.

Tab. 1 gibt einen Überblick über einige parenteral zu verabreichende Fertigarznei-

mittel auf Liposomenbasis. Bei AmBisome® umgeht man Probleme der Lagerstabili-

tät, in dem die frisch hergestellte Zubereitung einer Gefriertrocknung unterzogen und

als Lyophilisat in den Handel gebracht wird. Der unbeabsichtigte Verlust von Arznei-

stoffen aus dem Trägervehikel (drug leakage) im Blutkreislauf, der durch HDL (high

density lipoprotein) verursacht wird (Scherphof, 1978), kann durch die Nutzung relativ

dicht gepackter Bilayer (z.B. äquimolare Mengen DSPC + Cholesterol; Senior & Gre-

goriadis, 1982) minimiert werden. Ein weiteres Problem stellte die kurze Verweilzeit

von Liposomen im Blutkreislauf durch die Erkennung und Entfernung von Liposomen

durch das RES (Retikuloendotheliales System) dar. Die Verwendung von SUV`s mit

dicht gepackten Bilayern kann diesen Prozess verlangsamen (Senior & Gregori-

adis, 1982). Daneben konnten auch durch die Kopplung von Polyethylenglycol-

Resten an die Liposomenoberfläche lang zirkulierende, so genannte Stealth®-Lipo-

somen, hergestellt werden (Gregoriadis & McCormack, 1998), was beispielsweise in

Doxil® oder Caelyx® verwirklicht wurde (Tab. 1).

Handelsname Hersteller Arzneistoff Verwendete Lipide

AmBisome ® NeXstar Amphothericin B Hydriertes Soja-PC, DSPG, Cholesterol

DaunoXome ® NeXstar Daunorubicin DSPC, Cholesterol

Doxil ® Sequus Doxorubicin MPEG-DSPC, Hydriertes Soja-PC, Cholesterol

Caelyx ® Essex Pharma Doxorubicin MPEG-DSPC, Hydriertes Soja-PC, Cholesterol

Visudyne ® Novartis Pharma Verteporfin Ei-PC; DMPC

Tab. 1 : Überblick über einige liposomenbasierte Handelspräparate für die parenterale Applikation (Müller & Hildebrand, 1997; Rote Liste 2003). PC: Phosphatidylcholin; DSPG: Distearoylphosphatidyl-glycerol; DSPC: Distearoylphosphatidylcholin; MPEG-DSPC: Methoxypolyethylenglycol-Distearoyl-phosphatidylcholin; DMPC: Dimyristoylphosphatidylcholin.

Einleitung

_________________________________________________________________________________

12

1.3. Andere Phospholipid-Strukturen

Da sich die vorliegende Arbeit ausgehend von Liposomen hauptsächlich mit einer

neuen morphologischen Spezies von Nanotubes beschäftigen wird, soll an dieser

Stelle kurz auf bislang bekannte phospholipidbasierte tubuläre Strukturen eingegan-

gen werden.

Abb. 6 : Schematische Übersicht über phospholipidbasierte tubuläre Strukturen. Erklärungen im Text.

SUV´s aus Phosphatidylserin bilden nach der Zugabe von Calciumionen und

einstündiger Inkubation bei 37°C so genannte Cochleate Lipidzylinder (Papahadjo-

poulos, 1975). Diese Cochleate haben einen Durchmesser von 200 bis 1000 nm und

sind multilamellar, die Enden sind offen (Abb. 6, Mitte). Die Vorstellungen über die

Bildung der Cochleate beinhalten zunächst ein Aufbrechen der SUV`s nach Calcium-

zugabe. Die so gebildeten flachen Bilayer-Scheiben fusionieren zu großen Bilayern,

die sich anschließend spiralig zu Cochleaten aufwickeln. Durch Entzug der

Calciumionen mittels Natrium-EDTA werden die Cochleate zerstört, es entstehen

LUV`s.

Polymerisierbare Phospholipide, wie 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phos-

phatidylcholin (DC23PC oder DC8,9PC, siehe Abb. 7), wurden intensiv wegen ihrer

Fähigkeiten zur Bildung von so genannten Microtubes untersucht (Yager et al., 1985,

1986; Schoen et al., 1987; Burke et al., 1988; Schnur et al., 1987 ). Die Microtubes

haben einen Durchmesser von 0,4 bis 1 µm und eine Länge von 1 bis 200 µm. Sie

besitzen im Gegensatz zu Cochleaten einen flüssigkeitsgefüllten Innenraum, die

Enden sind stets offen und die Wand wird aus 1 bis 10 Bilayerschichten gebildet

(Abb. 6, links). Die Microtubes bilden sich spontan, wenn wässrige Dispersionen von

MLV`s aus der flüssig-kristallinen Phase unter die Kettenschmelztemperatur abge-

Microtube (d ~ 600 nm)

Cochleate (d ~ 400 nm)

Nanotube (d ~ 60 nm)

1 µm

Einleitung

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13

kühlt werden. Auch hier wird eine den Cochleaten ähnliche Bildung über das Zu-

sammenrollen von Bilayern, ausgelöst durch das Durchlaufen des Phasenüber-

ganges infolge Temperaturerniedrigung, vorgeschlagen.

Wird eine Dispersion einer 1:1 Mischung des oben erwähnten DC8,9PC mit dem

kurzkettigen gesättigten 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC,

siehe Abb. 7) einige Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, bilden sich so genannte

Nanotubes (Markowitz et al., 1994; Svenson & Messersmith, 1999). Sie haben einen

Durchmesser zwischen 50 und 60 nm und eine Länge zwischen 10 und 100 µm. Wie

bei den Microtubes existiert ein wässriger Innenraum, die Enden der Nanotubes sind

offen. Die Wand wird von 2 bis 4 Bilayern gebildet und zeigt nicht die typischen

helikalen Windungen, wie sie teilweise für die Microtubes aus reinem DC8,9PC

charakteristisch sind (Abb. 6, rechts). Die weitere Inkubation bei Raumtemperatur

führt zu einer teilweisen Transformation der Nanotubes in helikal gewundene Bänder

mit einer Breite von etwa 25 bis 30 nm. Die Bänder sind netzartig verwoben, an

Kontaktstellen fusioniert und bilden so ein dreidimensionales Gelgerüst.

Abb. 7 : Chemische Struktur von 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DC23PC oder DC8,9PC) und 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC).

Tubuläre und helikale Strukturen sind auch von anderen Amphiphilen, abgeleitet von

Gluconamiden (Fuhrhop et al., 1988, 1991) oder Glutaminsäure (Yamada et al.,

1984), bekannt. In der Klasse der Phospholipide gelten die oben genannten

Substanzen jedoch bisher als einzigartig in ihrer Fähigkeit, tubuläre bzw. helikale

Strukturen zu bilden (Singh & Schnur, 1993).

1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DC8,9PC)

1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DNPC)

Einleitung

_________________________________________________________________________________

14

1.4. Problemstellung und Ziel der vorliegenden Arbeit

Ausgangspunkt der Arbeit war die Frage nach der Lagerstabilität von Liposomen aus

reinen gesättigten Phosphatidylcholinen in der Gelphase. Erstmals wird ein

spezielles Instabilitätsphänomen beschrieben, welches bei der Lagerung von Disper-

sionen des gesättigten Phospholipids 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

(DMPC) auftritt: 10%ige DMPC-Dispersionen gelieren nach etwa 4 Wochen, wenn

sie bei 13°C gelagert werden.

Das Ziel der Untersuchungen war die Aufklärung der Ultrastruktur der entstandenen

halbfesten Systeme mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Die dabei ent-

deckten für gesättigte Phosphatidylcholine neuartigen tubulären Vesikelstrukturen

stehen im Vordergrund der Arbeit. Ein wichtiger Aspekt war die Frage, welchen Ein-

fluss die Herstellungsmethode auf die Entstehung der Nanotubes und damit die

Gelierung der DMPC-Dispersionen hat. Es sollten die Auswirkungen von Langzeitla-

gerung und Temperaturveränderungen auf die Morphologie der Nanotubes unter-

sucht und die Frage geklärt werden, ob die Wahl des Konservierungsmittels sowie

das Vorhandensein lipidischer Verunreinigungen Einfluss auf die Entstehung bzw.

Morphologie der Nanotubes hat.

Im Hinblick auf eine reproduzierbare Herstellung der Nanotubes war von Interesse,

ob ein Austausch der DMPC-Charge möglich ist. In diesem Zusammenhang wurden

Untersuchungen zur Reinheit verschiedener verwendeter DMPC-Chargen durchge-

führt. Abschließend wurde untersucht, ob die Nanotubes auch in Dispersionen, die

neben DMPC zusätzlich DPPC enthalten, gebildet werden und ob auch in reinen

DPPC-Dispersionen unter vergleichbaren Bedingungen Nanotubes gebildet werden

können.

Material und Methoden 15

_________________________________________________________________________________

2. Material und Methoden 2.1. Materialien

2.1.1. Phospholipide zur Herstellung der Liposomen

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DMPC) wurde bereitgestellt von

ASTRA ARCUS AB (S-Södertälje) und von Lipoid GmbH (D-Ludwigshafen). Im Lauf

der Arbeit wurden verschiedene Chargen verwendet (siehe Tab. 2). 1,2-dipalmitoyl-

sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DPPC) wurde ebenfalls von ASTRA ARCUS AB (S-

Södertalje) bereitgestellt. Die Phospholipide wurden ohne weitere Aufreinigung ver-

wendet. Untersuchungen zur Reinheit sind in Kapitel 3.2. dargestellt.

Lipid Nr. Chargen-Bezeichnung Hersteller

DMPC 1 100 / 93 Astra Arcus AB

DMPC 2 562191-1 Lipoid GmbH



DMPC 5 MA 404 722 Astra Arcus AB

Tab. 2 : Übersicht über die verwendeten DMPC-Chargen.

Zur Liposomenherstellung wurden außerdem folgende Substanzen eingesetzt:

Myristinsäure (technische Qualität, 98-100%, Cognis GmbH, D-Düsseldorf); Lyso-

Phosphatidylcholin, ca. 99% (aus Soja-Phosphatidylcholin, Sigma, D-Deisenhofen)

und hydriertes Soja-Lecithin S75-3 (Lipoid, D-Ludwigshafen).

2.1.2. Wässrige Phase

Zur Herstellung der wässrigen Phase wurde Aqua purificata verwendet. Dazu wurde

Leitungswasser über Umkehrosmose (Alpha Q Purification Pack, Millipore, D-

Schwalbach) von Ionen, Partikeln und organischem Material befreit. Der spezifische

Widerstand des aufbereiteten Wasser betrug 18,2 MΩcm (das entspricht einer elek-

trischen Leitfähigkeit von 0,06 µS/cm). Vor der Dispersionsherstellung erfolgte eine

Filtration durch einen 0,2 µm Sterilfilter (Sterifix®, Braun, D-Melsungen). Zur Kon-

servierung wurde standardmäßig 0,01% (m/V) Thiomersal (Synopharm, D-Bars-

büttel) verwendet. Zur Untersuchung des Einflusses von Konservierungsmitteln

kamen außerdem Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat (Fluka

Chemie AG, CH-Buchs) sowie Natriumazid (Sigma, D-Deisenhofen) zum Einsatz.


_________________________________________________________________________________

2.1.3. Lösungsmittel, Sprühreagenzien und Referenzsubstanzen für die Dünn- schichtchromatographie

Die folgenden Lösungsmittel und Chemikalien wurden für die Dünnschicht-

chromatographie verwendet:

Chloroform, HPLC-Qualität ( ACROS, USA-New Jersey); Methanol, HPLC-Qualität

(Merck, D-Darmstadt); Methanol >99,8% pro Analysi (Roth, D-Karlsruhe); Methyl-

acetat 99% (Sigma-Aldrich, D-Steinheim); Essigsäure 100% pro Analysi (Merck, D-

Darmstadt); n-Hexan (Roth, D-Karlsruhe); 1-Propanol >99,5% pro Analysi (Roth, D-

Karlsruhe); Molybdäntrioxid (ChemPur (D-Karlsruhe), Molybdän (Quelle unbekannt);

Schwefelsäure 95-97% zur Analyse (Riedel-de Haen, D-Hannover); Kupfersulfat-

Pentahydrat (Merck, D-Darmstadt); Phosphorsäure 85% (Merck, D-Darmstadt).

Als Referenz diente eine Mischung folgender Lipide: Sphingomyelin, Phosphatidyl-

cholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Phosphatidyl-

ethanolamin, Sulfatide, Galactocerebroside und Cholesterol (alle Lipide von Sigma

Chemie GmbH, D-München). Die Konzentration jedes Lipids betrug 1 µg/µl in einer

Mischung aus Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 (V/V).

2.1.4. Weitere Substanzen

Zur Herstellung einer 2%igen Natrium-EDTA-Lösung zum Entfernen von zwei-

wertigen Kationen wurde Natrium-EDTA-Dihydrat (Merck, D-Darmstadt) verwendet.

Calciumchlorid-Dihydrat (Merck, D-Darmstadt) wurde zur Herstellung verschieden

konzentrierter Calciumchlorid-Lösungen verwendet.

2.2. Methoden

2.2.1. Herstellung der Dispersionen

2.2.1.1. Quellung der Phospholipide

Das pulverförmige Phospholipid (typischerweise 0,4 - 4 g) wurde bei Raumtempera-

tur mit der wässrigen Phase, gefiltert durch einen 0,2 µm Sterilfilter (Sterifix®, Braun,

D-Melsungen), versetzt. Wenn nicht anders beschrieben, wurde auf die Herstellung

eines Lipidfilms verzichtet, da durch die großen Mengen an Lipid (s.o.) dünne Filme

und damit Vorteile für die Hydratation der Lipide nicht zu erwarten waren. Es wurden

Phospholipidkonzentrationen zwischen 1 und 10% (m/m) eingesetzt. Zur vollständi-

gen Quellung wurde der Ansatz verschlossen und, wenn nicht anders beschrieben, 2

Tage bei einer Temperatur, die ca. 20 K oberhalb der Kettenschmelztemperatur


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(Hauptübergangstemperatur, Tm) des Phospholipids lag, in einem Wasserbad oder

im Trockenschrank stehen gelassen.

Während dieser Quellungszeit und vor der Dispergierung wurden die Ansätze per

Hand kurz kräftig geschüttelt.

2.2.1.2. Hochdruckhomogenisation

Eine Möglichkeit, Liposomen herzustellen, bietet die Hochdruckhomogenisation

mittels eines Kolben-Spalt-Homogenisators. In der vorliegenden Arbeit wurde in An-

lehnung an die Arbeiten von Brandl (Brandl, 1990; Brandl et al., 1990, 1993) der

diskontinuierlich arbeitende Micron Lab 40 (APV Gaulin GmbH, D-Berlin) verwendet.

Die Probe wird hierbei mittels hohen Druckes durch einen Ringspalt gepresst,

dessen Spaltbreite hydraulisch eingestellt wird. Durch elektronische Regelung wird

für ein konstantes Druckgefälle am Spalt während des gesamten Homogenisiervor-

gangs gesorgt.

Alle produktberührenden Edelstahlteile wurden zuvor im Trockenschrank mindestens

2 Stunden auf dieselbe Temperatur erwärmt, bei der auch die Quellung der Ansätze

erfolgte (ca. 20 K oberhalb Tm). Wenn nicht anders beschrieben, wurden die Proben

8 Homogenisierzyklen bei einem Druck von 500 bar unterworfen. In einem Arbeits-

gang wird eine Chargengröße von 30 - 40 ml erhalten.

2.2.1.3. Extrusion

Neben der Hochdruckhomogenisation wurde auch die Extrusion zur Herstellung von

Liposomen angewendet. Hierfür wurde das Gerät EmulsiFlex™ C5 (Avestin, CA-

Ottawa) eingesetzt. Die Dispergierung erfolgt durch Pressen der Probe durch isopore

Polycarbonatmembranen mit Porenweiten von 800 nm, 200 nm oder 50 nm (Avestin,

CA-Ottawa).

Der gesamte Extruder wurde zuvor im Trockenschrank für mindestens 2 Stunden auf

eine Temperatur von ca. 20 K > Tm des Phospholipids temperiert. Eine kontinuier-

liche Temperierung der Apparatur während des gesamten Herstellungsprozesses

war nicht möglich. Die Liposomenherstellung erfolgte nicht über eine stufenweise

Zerkleinerung, da der Wechsel der Membranen zeitaufwendig ist und eine Abkühlung

von Apparatur und Dispersion unter Tm sowie eine zusätzliche Verdunstung von

Wasser durch zwischenzeitliches Wiederaufwärmen zu befürchten war. Ein Reißen

oder Verstopfen der Membranen wurde nicht beobachtet. Die Proben wurden 8 - 10


_________________________________________________________________________________

Dispergierzyklen unterworfen. Die Chargengröße betrug in Anlehnung an die Hoch-

druckhomogenisation ebenfalls 40 ml.

2.2.1.4. Ultraschall

Die Liposomenherstellung mittels Ultraschall erfolgte unter Verwendung des SONO-

PULS-Ultraschall-Homogenisators HD 200 (Bandelin, D-Berlin). Das Gerät ist mit

einem Hochfrequenzgenerator GM 200 (Leistung 200 W, Frequenz 20 kHz) und

einem Ultraschallwandler UW 200 ausgestattet. Verwendet wurde eine Titan-Sono-

trode mit einem Durchmesser von 12,7 mm. Es wurde mit einer Amplitudenbegren-

zung von 20% gearbeitet. Zur Schonung der Proben wurde die Beschallung gepulst

durchgeführt (30% von 1s) und die Proben in einem temperierbaren Dispergiergefäß

behandelt, um ein zu starkes Erhitzen zu verhindern. Als Beschallungszeiten wurden

10 bzw. 30 Minuten gewählt.

2.2.1.5. Probenlagerung

Nach Aliquotierung wurden die Dispersionen bei unterschiedlichen Temperaturen

gelagert. Die Lagerung bei 13°C, 28°C oder 38°C wurde im Thermostat (Julabo, D-

Tuttlingen), bei 23°C im Klimaschrank (Binder, D-Seelbach) und für 2-8°C im Kühl-

schrank durchgeführt. Die jeweils ausgewählten Lagerungstemperaturen sind in den

entsprechenden Kapiteln vermerkt.

2.2.2. Untersuchungsmethoden

2.2.2.1. Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

Für die vergleichende Untersuchung der verschiedenen DMPC-Chargen hinsichtlich

möglicher lipidartiger Verunreinigungen wurde die hochauflösende Dünnschicht-

chromatographie angewendet: Dazu wurden die Lipide über Phosphorpentoxid

getrocknet, genau gewogen und in einer Mischung von 2 Teilen Chloroform und 1

Teil Methanol (V/V) gelöst. Als stationäre Phase wurden Nano Silgur-20 Platten mit

einer Kombinationsschicht aus Kieselgur (Auftrags- bzw. Vorkonzentrierungszone)

und Nanokieselgel 60 (Trennschicht), Größe 10x10 cm und 10x20 cm (Macherey-

Nagel GmbH, D-Düren), verwendet. Die Platten wurden zur Entfernung möglicher

Verunreinigungen und zur Erhöhung des Trennvermögens mit Methanol und weiter-

hin mit Laufmittel 1 vorentwickelt und anschließend bei 110°C für 10 min im Ofen

ausgeheizt. Die Auftragung der gelösten Lipide erfolgte mit Hamiltonspritzen (0,5; 1;


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2; 5 µl) unter Zuhilfenahme einer Auftragsschablone aus Acryl. Die Entwicklung er-

folgte bei Kammersättigung über drei Stufen: Mit Laufmittel 1 wurde auf die Höhe von

4,8 cm der Trennschicht entwickelt, gefolgt von einer Entwicklung mit Laufmittel 2

und Laufmittel 3 über die gesamte Länge. Laufmittel 1 besteht aus einem Gemisch

aus Essigsäuremethylester/ 1-Propanol/ Chloroform/ Methanol/ 0,25% KCl im Ver-

hältnis 25:25:25:25:9 (V/V), Laufmittel 2 aus einem Gemisch von n-Hexan/ Diethyl-

ether/ Eisessig im Verhältnis 75:23:2 (V/V) und Laufmittel 3 aus n-Hexan.

Für die Detektion wurden zwei verschieden Reagenzien verwendet:

Kupfersulfat/ Phosphorsäure-Tauchbad: Die Lösung besteht aus 10% (m/V) Kupfer-

sulfat-Pentahydrat in 8 % (m/V) Phosphorsäure. Die Platte wird kurz in die Lösung

getaucht und anschließend ca. 7 - 9 min bei 160°C ausgeheizt. Ungesättigte Lipide

und Cholesterol werden als schwarze Flecken auf gelblich-hellbraunem Hintergrund

sichtbar, Lipide mit ausschließlich gesättigten Fettsäureketten werden nicht detek-

tiert.

Dittmer-Lester-Reagenz (Dittmer & Lester, 1964): 4,011 g Molybdän-VI-oxid wird in

100 ml Schwefelsäure (c= 25 mol/l) unter Kochen gelöst (Lsg. A).

0,178 g Molybdän wird zu 50 ml Lsg. A geben und 15 min gekocht, ggf. muss

anschließend dekantiert werden (Lsg. B). Gleiche Volumina Lsg. A und Lsg. B

werden gemischt und mit dem zweifachen Volumen Wasser verdünnt. Nach dem

Aufsprühen erscheinen Phosphatidylcholin, -ethanolamin, -serin, -inositol und

-glycerol sowie Phospatidsäure und Sphingomyelin als blaue, schnell verblassende

Flecken auf hellem Hintergrund. Fettsäuren, Cholesterol, Cerebroside und Triglyceri-

de werden nicht detektiert.

2.2.2.2. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC)

Für vergleichende Reinheitsuntersuchung der verwendeten Phospholipid-Chargen

sowie die Untersuchung des Einflusses von Konservierungsmitteln bzw. Verunreini-

gungen auf das Phasenverhalten von DMPC wurde mit Hilfe der Differenzkalori-

metrie die Lage und Form der Phasenübergänge der vollständig hydratisierten Lipide

bestimmt.

Als Leistungskompensations-Differenz-Kalorimeter wurde das Gerät Pyris 1 DSC

(Perkin Elmer, D-Überlingen) verwendet. Das Gerät ist mit einer Thermostat-Kühl-

möglichkeit und einem PC-gestützten Auswertesystem ausgestattet. Die Temperatur

des Thermostaten lag zwischen -46 und -50°C. Die Proben wurden in kalt ver-


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schweißten Aluminiumtiegeln (Perkin Elmer, D-Überlingen) gegen einen Leertiegel

als Referenz vermessen, dazu wurden etwa 10 mg Probe genau eingewogen. Soweit

nicht anders angegeben, betrugen die Heiz- und Kühlraten 5°C/min. Wenn nicht

anders erwähnt, wurde folgendes Temperaturprogramm angewendet: Die Proben

wurden zunächst von 20°C auf 2°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mindestens

30 min gehalten. Anschließend erfolgte ein Aufheizen auf 40°C im Falle von DMPC

bzw. auf 60°C bei DPPC. Diese Temperatur wurde für 2 min gehalten und die Proben

danach wieder auf 2°C abgekühlt. Das Gerät wurde mit Wasser und Indium für die

verwendeten Heizraten kalibriert und die Kalibrierungen durch Messungen mit reinem

Indium überprüft.

2.2.2.3. Visuelle Prüfung/ makroskopisches Erscheinungsbild

Als einfachste Kontrolle der Stabilität der Dispersionen wurde eine regelmäßige

Sichtkontrolle durchgeführt, um Inhomogenitäten wie Agglomeratbildung, Sedimen-

tation und Bodensatzbildung sowie Viskositätsveränderungen zu beurteilen.

2.2.2.4. Teilchengrößenanalyse

Die Messung von Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen ist eine wichtige

Voraussetzung zur Beurteilung der physikalischen Stabilität von Liposomen. Aller-

dings ist es oft nicht möglich, mit Hilfe einer einzigen Methode die gesamte Partikel-

größenverteilung zu beschreiben. Die Anwendung unterschiedlicher mathematischer

und physikalischer Grundlagen bei der Auswertung macht es zudem schwierig, die

erhaltenen Ergebnisse verschiedener Methoden miteinander zu vergleichen (Groves,

1984). Prinzipiell eignen sich Licht- und Elektronenmikroskopie zur Bestimmung der

Teilchengrößenverteilung disperser Systeme, jedoch erlaubt erstere Methode ledig-

lich die Bestimmung von Teilchen > 1 µm und die Elektronenmikroskopie kann immer

nur einen sehr kleinen Ausschnitt der Probe repräsentieren, was besonders bei in-

homogenen Proben problematisch ist. Beide Methoden erfordern zudem ein aufwen-

diges Ausmessen einer sehr großen Anzahl von Partikeln, um eine signifikante Aus-

sage zu erhalten (Groves, 1984) und eignen sich daher nicht für Routinekontrollen.

Allerdings kann die Elektronenmikroskopie ein hilfreiches Mittel zur Überprüfung der

Messergebnisse anderer Messverfahren darstellen (Westesen & Wehler, 1993).

Aufgrund einfacher Probenaufbereitung und relativ guter Reproduzierbarkeit haben

sich Laserstreulichtverfahren als Routinemessverfahren etabliert (Schreiber, 1995).


_________________________________________________________________________________

2.2.2.4.1. Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS)

Die Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) ist ein dynamisches Streulicht-

verfahren, mit dem sich Partikel in einem Größenbereich zwischen etwa 5 nm und

3 µm bestimmen lassen (Müller & Schuhmann, 1996).

Das Verfahren beruht auf der Auswertung der Fluktuation der Streulichtintensität von

Laserlicht infolge Brownscher Molekularbewegung der Teilchen, die in einem be-

stimmten Winkel zum einfallenden Licht gemessen wird. Kleine Partikel diffundieren

schneller und ergeben daher eine schnellere Fluktuation der Streulichtintensität als

große Partikel. Das Streulicht wird von einem Photomultiplier erfasst, die Daten an

einen Korrelator weiterleitet und dieser berechnet eine Autokorrelationsfunktion. An

diese gemessene Autokorrelationsfunktion wird eine theoretische Korrelations-

funktion g(τ) angepasst. Zwischen der Partikelgröße und der Korrelationsfunktion

besteht für verdünnte, monodisperse Systeme mit Partikeln, die kleiner als die

Wellenlänge des eingestrahlten Lichtes sind, folgender Zusammenhang:

τ: Verzögerungszeit

K: Betrag des Streulichtvektors

D: Diffusionskonstante

Der Betrag des Streulichtvektors K und die Verzögerungszeit τ sind abhängig von

den Messbedingungen und aus bekannten Größen während einer Messung rech-

nerisch zugänglich. Als einzig variable Größe verbleibt der Diffusionskoeffizient D der

dispergierten Teilchen, mit dessen Hilfe unter der Annahme kugelförmiger Teilchen

nach der Stokes-Einstein-Gleichung der Teilchendurchmesser berechnet werden

kann:

d: Teilchendurchmesser

k: Boltzmann Konstante

T: absolute Temperatur

η: dynamische Viskosität

Die Auswertung der Autokorrelationsfunktion erfolgte mit Hilfe der Kumulanten-

analyse. Als Ausdruck der mittleren Teilchengröße erhält man den so genannten z-

DTkd ⋅⋅⋅⋅= ηπ3

( )g e DKτ τ= −2 2


_________________________________________________________________________________

Average Wert unter der Annahme, dass es sich um ein monodisperses System aus

kugelförmigen Partikeln handelt. Daneben wird der Polydispersitätsindex, ein

dimensionsloser Zahlenwert als Ausdruck der Breite der Partikelgrößenverteilung,

angegeben. Er liegt zwischen 0 (für ideal monodisperse Systeme) und 1 (Müller &

Schuhmann, 1996). Anhand des mittleren Teilchendurchmessers und des Poly-

dispersitätsindexes ist keine Unterscheidung zwischen einer sehr breiten und einer

bi- oder multimodalen Verteilung möglich. Aufgrund der Einflüsse der Polydispersität

und der Teilchenanisometrie müssen die PCS-Partikelgrößenangaben mit Vorsicht

interpretiert werden. Für komplexe Teilchengrößenverteilungen ist zusätzlich eine

Auswertung der PCS-Daten mit der MSD-Analyse (MSD: Multi-Size-Distribution)

möglich, über die Aussagen über die Teilchengrößenverteilung zu erhalten sind.

Für die Untersuchungen wurde ein Zetaplus (Brookhaven Instruments, USA-

Holtsville,) mit einem Laser der Wellenlänge 677 nm eingesetzt. Die Detektion der

Streulichtintensität erfolgt unter einem festen Winkel von 90°. Für die Ermittlung der

Teilchengröße wurden 5 - 8 Einzelmessungen à 5 Minuten bei 25°C durchgeführt.

Zur Vermeidung von Streulichteffekten wurden die Proben, wenn notwendig, mit

filtriertem Aqua purificata so lange verdünnt, bis eine mittlere Zählrate von ca.

100000 Impulsen pro Sekunde resultierte.

2.2.2.4.2. Laserdiffraktometrie, gekoppelt mit Polarization Intensity Differential Scattering Technology (LD / PIDS)

Mit Hilfe der Laserdiffraktometrie (LD) können Partikelgrößenverteilungen im Bereich

zwischen 0,1 bis 3500 µm detektiert werden. Grundlage des Verfahrens ist die

Beugung des Lichtes an Teilchen, wobei das entstehende Beugungsmuster von

Form und Größe der Teilchen abhängig ist.

Bei dem verwendeten Laserdiffraktometer handelt es sich um ein LS 230 Small

Volume Module - Gerät (Coulter, USA-Miami). Als Lichtquelle dient ein 750 nm

Laser. 126 Fotodiodendetektoren, aufgeteilt in drei Sektionen, stehen für die Detek-

tion bei verschiedenen Winkeln zur Verfügung.

Für die Detektion von Teilchen kleiner 100 nm ist die Laserdiffraktometrie mit der so

genannten PIDS-Technologie (PIDS: Polarzation Intensity Differential Scattering) ge-

koppelt. Im Unterschied zur Laserdiffraktometrie wird die Streuung von polarisiertem

Licht ausgenutzt. Die Probe wird sowohl mit horizontal als auch vertikal polarisiertem

Licht dreier verschiedener Wellenlängen (450, 600 und 900 nm) bestrahlt. Als Licht-


_________________________________________________________________________________

quelle dient eine Wolfram-Halogenlampe. Die Detektion der Streulichtintensität er-

folgt über PIDS-Detektoren unter 6 verschiedenen Winkeln (60°, 75°, 90°, 105°, 120°

und 146°). Das sich ergebende Streulichtmuster stellt ein Maß für die Partikelgröße

dar. Durch die Kopplung der Laserdiffraktometrie mit der PIDS-Technologie ist eine

Teilchgrößenbestimmung ab einer Größe von 40 nm möglich.

Für jeden Versuch wurden 5 - 8 Läufe durchgeführt, wobei die Messdauer pro Lauf

120 Sekunden betrug. Zur Vermeidung von Mehrfachstreuung durch zu hohe Pro-

benkonzentrationen wurden die Proben, wenn möglich, so verdünnt, dass eine Be-

ladung von ca. 50% im PIDS-Bereich erreicht wurde. Es wurde bei einer Rührge-

schwindigkeit von 30% gemessen. Mit Hilfe des Coulter-Softwareprogramms wurde

die Volumenverteilung der Partikelgrößen unter Anwendung der Mie-Theorie und der

Annahme sphärischer Teilchen berechnet. In Anlehnung an die Herstellerempfehlun-

gen für das Vermessen von Emulsionen wurden für den Brechungsindex des Ver-

dünnungsmediums Wasser 1,332 und für die disperse Phase 1,45 angenommen.

Im Anhang wird kurz auf die Eignung der Methoden und entsprechenden Auswertun-

gen für die speziell in dieser Arbeit untersuchten Systeme eingegangen (A.2. Anmer-

kungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestimmungsmethoden, S. ii).

2.2.2.5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde zur Klärung der Ultrastruktur der

Lipid-Systeme eingesetzt. Für die Aufnahmen wurde ein CEM 902a (Zeiss, D-

Oberkochen) verwendet. Die Beschleunigungsspannung betrug 80 kV.

Die Proben wurden mit Hilfe von drei verschiedenen Präparationstechniken vorberei-

tet.

2.2.2.5.1. Gefrierbruch

Für den Gefrierbruch wurde ein Trägernetzchen mit der Dispersion benetzt bzw. ein

Gelklümpchen aufgebracht, zwischen 2 Kupferträger gelegt und die überschüssige

Substanz mit einem Filterpapier abgesaugt. Diese Sandwichprobe wurde mit Hilfe

von flüssigem Propan bei ca. -150°C eingefroren (Jet Freezer JFD 030, BAL-TEC,

Fl-Liechtenstein) und unter Flüssigstickstoffkühlung in die Gefrierbruchanlage (BAF

060, BAL-TEC, Fl-Liechtenstein) überführt. Dort wurde die Probe bei ca. -150°C und

10-10 bis 10-11 bar aufgebrochen. Die entstandenen Bruchflächen wurden unter einem


_________________________________________________________________________________

Winkel von 45° mit einem Gemisch aus Platin und Kohlenstoff (95/5% m/m)

bedampft (Schichtdicke: ca. 2 nm). Zur Fixierung dieses Schwermetallabdruckes

erfolgte anschließend das senkrechte Aufdampfen einer ca. 20 nm dicken Kohle-

Schicht.

Nach Entnahme aus der Anlage wurde der Abdruck mit demineralisiertem Wasser

abgeschwemmt, zur Entfernung von Lipidresten dreimal mit einer Mischung aus

Chloroform und Methanol (Volumenverhältnis 1:1) gewaschen und anschließend auf

ein Trägernetzchen aus Gold (200 mesh, Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar)

überführt. Es wurden elastische Hellfeldaufnahmen mit Fotonegativen (SO-163,

Kodak Eastman) gemacht.

Neben der Durchführung der oben beschriebenen Präparationsschritte (Herstellung

der Sandwichprobe mit nachfolgendem Einfrieren) bei Raumtemperatur wurde eine

selbstgebaute Einfriereinrichtung (Drechsler, 1990) verwendet, welche die Temperie-

rung der Umgebungsluft sowie aller probenberührenden Teile ermöglicht, so dass

eine Aufwärmung der Proben während der Präparationsphase verhindert und die

Probe von einer definierten Temperatur aus eingefroren werden kann. Die Apparatur

ist in Abb. 8 abgebildet.

Abb. 8 : Apparatur zur Immersion temperierter Proben in flüssige Kryogene („plunge device“). Links: Übersichtsaufnahme; Der obere Teil (A) trägt den Injektor, an dessen Ende das Präparat befestigt wird. Rechts: Detailaufnahme des Temperiermantels (B) mit Probenhalter (Pfeil a) und Thermofühler (Pfeil b). Das Dewargefäß wird mit flüssigem Stickstoff gefüllt und kühlt den inneren Kupferzylinder (Pfeil c), der das Kryogen (flüssiges Propan) enthält.

b a

c


_________________________________________________________________________________

Alle probenberührenden Teile wurden vor der Präparation ca. 1 Stunde im ge-

schlossenen Temperiermantel (Abb. 8 B) vortemperiert, danach erfolgte die Herstel-

lung der Sandwichprobe und das Einschießen in flüssiges Propan unter ständiger

Überwachung der Temperatur.

2.2.2.5.2. Kryo-TEM

Vor der Präparation wurden die Dispersionen mit filtriertem Aqua purificata so weit

verdünnt, bis eine Lipid-Konzentration von etwa 1% (m/V) resultierte. Gelklümpchen

wurden durch Schütteln dispergiert. Ein Tropfen der so vorbereiteten Probe wurde

auf ein unbefilmtes Trägernetzchen aus Kupfer (600 mesh, BAL-TEC, Fl-

Liechtenstein) aufgebracht, die überschüssige Flüssigkeit mit einem Filterpapier

abgesaugt und das Trägernetzchen sofort in flüssiges Ethan bei ca. -173°C

eingeschossen. Nachdem überschüssiges Ethan mit einem Filterpapier abgesaugt

wurde, konnte die kryofixierte Probe mit Hilfe einer Kryotransfereinrichtung in den auf

75 – 85 K gekühlten Tisch des Transmissionseletronenmikroskops eingeführt wer-

den. Die Proben wurden unter „Low-Dose“ Bedingungen angeschaut und elastische

Hellfeldaufnahmen digital mittels einer Videokamera (DAGE SIT Kamerasystem),

gekoppelt mit einem Bildverarbeitungssystem (IBAS, LEO, D-Oberkochen), gemacht.

2.2.2.5.3. Negative Staining mit Uranylacetat (2%ig)

Für die Negativkontrastierung wurden die Proben mit filtriertem Aqua purificata auf

eine Lipid-Konzentration von maximal 1% (m/V) verdünnt, Gelklümpchen wurden

durch Schütteln dispergiert. Als Probenträger wurden Trägernetzchen (200 mesh,

Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar) mit Formvar® befilmt oder kommerzielle,

kohlebefilmte Trägernetzchen (200 mesh, Plano, W. Plannet GmbH, D-Wetzlar)

verwendet. Ein Tropfen Probe wurde auf das befilmte Trägernetzchen aufgetropft

und nach 30 - 60 Sekunden Einwirkzeit mit einem Filterpapier abgesaugt. Danach

wurde ein Tropfen Uranylacetat-Lösung 2% (m/m) aufgetragen und ebenfalls nach

30 - 60 Sekunden mit einem Filterpapier abgesaugt. Nach dem Trocknen (frühestens

15 Minuten, spätestens 5 Tage nach der Präparation) wurden die Proben im

Transmissionselektronenmikroskop betrachtet und elastische Hellfeldaufnahmen mit

Hilfe von Fotonegativen (SO-163, Kodak Eastman) gemacht.


_________________________________________________________________________________

2.2.2.6. Röntgenstrukturanalyse

Zur Detektion der Lamellarphase vollständig hydratisierten DMPC`s im Rahmen von

Reinheitsuntersuchungen der DMPC-Chargen (siehe Kapitel 3.2) wurden Klein-

winkelmessungen an einem Generator ID 3003 (Seifert & Co., D-Ahrensburg)

durchgeführt. Die Generatorspannung betrug ca. 50 kV, der Röhrenstrom ca. 40 mA.

Die Detektion der Cu-Kα1α2-Strahlen erfolgte auf ortsempfindlichen Detektoren

(PSD 50 M, M. Braun, D-Garching) eines Kratky-Kollimator-Systems. Der Abstand

zwischen Probe und Detektor betrug ca. 270 mm. Die Proben wurden in einem

Probenträger zwischen zwei Folien (Polyethylenterephthalat) bei einer Temperatur

von 40°C vermessen, die Messdauer betrug, wenn nicht anders beschrieben,

1 Stunde. Für die Bestimmung der d-Werte aus den Peaklagen erfolgte eine

Kalibrierung mittels Silberbehenat (Gitterkonstante/ d-Wert: 58,373 Å; Huang et al.,

1993). Ein für die Lamellarphase typisches Röntgenkleinwinkeldiffraktogramm ist in

der Einleitung (Abb. 5) dargestellt.

2.2.2.7. pH-Wert-Bestimmung

Der pH-Wert der wässrigen Phasen wurde mit dem pH Meter 691 (Ω Metrohm

Ionenanalytik, CH-Herisau) bestimmt. Als Messsonde diente eine Glaselektrode. Die

Messtemperatur betrug 20°C. Die Kalibrierung erfolgte mit Pufferlösungen der Firma

Beckmann bei pH 4,00 (Ch.-Bez. M609077) und pH 7,02 (Ch.-Bez. M609174). Für

jede Probe wurden 3 Messungen durchgeführt.

Alle nicht näher beschriebenen Arbeiten wie beispielsweise das Herstellen von

Lösungen etc. wurden auf Grundlage annerkannter pharmazeutischer Regeln

durchgeführt.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

27

3. Ergebnisse

3.1 . Lagerstabilität von DMPC-Dispersionen Ausgangspunkt der Untersuchungen war die Frage, ob und in welcher Form sich die

physikalische Lagerstabilität reiner DMPC-Liposomen in Abhängigkeit von der

Phasenlage des Lipids unterscheidet. Liposomen werden zum einen gezielt als

Arzneistoffträger hergestellt, entstehen andererseits auch als Nebenprodukt bei der

Herstellung von phospholipidstabilisierten Emulsionen. Daher ist die Kenntnis vom

Verhalten der Vesikel unter verschiedenen Lagerbedingungen sowohl für liposomale

Zubereitungen als auch für kolloidale Emulsionen von Bedeutung. Betrachtet wird in

der vorliegenden Arbeit nur der Aspekt der physikalischen Lagerstabilität.

Zur Herstellung der Liposomen wurde DMPC 5 (MA 404722 Astra Arcus, siehe

Kapitel 2.1.1.) verwendet. Die Lipidkonzentrationen in der wässrigen Phase betrugen

1%, 2%, und 10% (m/m). In Anlehnung an die Emulsionsherstellung wurde die Di-

spergierung mit Hilfe der Hochdruckhomogenisation durchgeführt. Vorversuche erga-

ben, dass über 8 Homogenisierzyklen bei 500 bar makroskopisch homogene Disper-

sionen mit Teilchengrößen unter 200 nm hergestellt werden können.

3.1.1 . Charakterisierung der Liposomen direkt nach der Herstellung

Nach der Dispergierung erschienen die Dispersionen makroskopisch homogen,

weißlich-trüb und durchscheinend. Die mit Hilfe der PCS ermittelten mittleren

Teilchengrößen sind in Tab. 3 aufgeführt.

DMPC Konzentration 1% (m/m) 2% (m/m) 10% (m/m)

Mittlere Teilchengröße (PCS, z-Average)

157 nm 147 nm 157 nm

Polydispersitätsindex 0,24 0,23 0,21

Tab. 3 : Mittlere Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswertung) ver-schieden konzentrierter DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomo-genisation bei 8 x 500 bar/ 40°C. Die Auswertung über MSD-Analyse ergab trimodale Teilchen-größenverteilungen, wobei stets mehr als 95% der Teilchen zwischen 16 und 100 nm groß sind. Hinweis: Die gezeigten Werte sind Messdaten einer Versuchsreihe. Im Verlauf der Arbeit wurden bei Verwendung desselben Lipids und gleicher Herstellungsmethode schwankende mittlere Teilchengrößen (z-Average) zwischen 110 und 190 nm erhalten, es handelte sich immer um sehr breite trimodale Verteilungen.

Die großen Polydispersitätsindices (> 0,2) weisen bereits auf eine sehr breite

Teilchengrößenverteilung oder auf mehrere Teilchenpopulationen hin. Tatsächlich

zeigen elektronenmikroskopische Untersuchungen (Gefrierbruch-TEM, Abb. 9) von

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

28

frisch hergestellten Dispersionen eine sehr heterogene Größenverteilung: Der

zahlenmäßig überwiegende Teil der Liposomen ist deutlich kleiner als 100 nm.

Daneben sind größere Liposomen (100 300 nm) und wenige ausgedehnte Bilayer

bzw. große Lipidpartikel im µm-Bereich enthalten.

Abb. 9 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen einer 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung durch Hochdruckhomogenisation (8x 500 nm/ 40°C). Neben Liposomen der Größenordnung 30 100 nm und kleinsten Lipidpartikeln (< 20 nm) enthält die Dispersion wenige Liposomen zwischen 100 und 300 nm (links) und ausgedehnte Bilayerbereiche, die eine Strukturierung der Ripple Phase aufweisen (rechts).

Da die durch Hochdruckhomogenisation hergestellten Dispersionen sehr heterogen

sind, repräsentieren die mittels PCS mit z-Average-Auswertung bestimmten mittleren

Partikelgrößen nur mangelhaft die tatsächlichen Teilchengrößenverhältnisse der

Dispersionen. Die zusätzliche MSD-Auswertung (MSD: Multi Size Distribution) der

PCS-Daten ergibt, dass nach der Hochdruckhomogenisation breite trimodale Ver-

teilungen entstehen. Aus den Verteilungen geht hervor, dass über 95% der Teilchen

zwischen 16 und 100 nm groß sind und die verbleibenden Teilchen Größen bis in

den µm-Bereich besitzen, was gut mit den Beobachtungen der Elektronen-

mikroskopie übereinstimmt. Für vergleichende Untersuchungen bzw. die routine-

mäßige Charakterisierung der Dispersionen wurden trotz der Heterogenität der

Proben und wegen des großen Zeitaufwandes, der zur verlässlichen Bestimmung der

Teilchengrößenverteilung aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen notwendig

wäre, auch weiterhin PCS-Messungen mit z-Average-Auswertung mit Angabe der

Verteilungsbreite aus der MSD-Auswertung herangezogen.

Aus den gezeigten Daten lässt sich festhalten, dass unter Verwendung von reinem

DMPC mittels Hochdruckhomogenisation unter den genannten Herstellungsbe-

dingungen keine homogenen Dispersionen hergestellt werden konnten.

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

29

3.1.2 . Stabilität der Dispersionen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur und der Phospholipidkonzentration

Die mittels Hochdruckhomogenisation hergestellten Dispersionen wurden bei 2 - 8°C,

13°C und 38°C gelagert. Bei 38°C liegt vollständig hydratisiertes DMPC in der Lα-

Phase vor, bei 13°C in der Lβ`-Phase. Bei 2 - 8°C wird vermutlich zunächst die Lβ`-

Phase ausgebildet, die mit der Zeit in die Lc-Phase übergeht. Auf Veränderungen des

Phasenverhaltens infolge Dispergierung wird in der Diskussion eingegangen.

Generell ist festzustellen, dass die Dispersionen nicht lagerstabil sind und es zum

Teilchengrößenwachstum und zur Niederschlagsbildung kommt. Diese Instabilität ist

in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur jedoch unterschiedlich stark ausge-

prägt, was anhand der 2%igen Dispersion dargestellt werden soll.

Bereits nach 2 Wochen bildete sich ein Niederschlag, der bei 38°C nur sehr fein, bei

2 - 8°C etwas stärker und bei 13°C deutlich ausgeprägt war. Der feine Niederschlag

bei 38°C konnte durch Schütteln leicht redispergiert werden und veränderte bzw.

vermehrte sich über eine Lagerdauer von 6 Monaten nicht. Bei 2 - 8°C bildete sich

dagegen nach 5 Wochen ein grober, stückig-inhomogener Bodensatz, der sich auch

nach Aufschütteln nicht redispergieren ließ. Bei 13°C war diese Inhomogenität noch

stärker ausgeprägt, und nach 8 Wochen zeigte sich die gesamte Probe stückig-

inhomogen. Teilchengrößenmessungen mittels PCS (Abb. 10) bestätigen die makro-

skopischen Beobachtungen, obwohl die gemessenen mittleren Teilchengrößen (z-

Average) mit Sicherheit fragwürdig sind, da multimodale Verteilungen vorliegen und

die gemessenen Größen weit außerhalb des Messbereichs der Methode (etwa 5 nm

bis 3 µm) liegen. Dennoch werden sie hier aufgeführt, da sie zumindest den

deutlichen Unterschied zwischen den bei 38°C und den bei 13°C bzw. 2 - 8°C

gelagerten Proben dokumentieren. Wegen der starken Inhomogenität der 13°C-

Probe wurden Teilchengrößenmessungen nach 5 Wochen abgebrochen.

Vergleichbare Teilchengrößen ergaben auch die Messungen der 1%igen Dispersion.

Obwohl es auch bei den bei 38°C gelagerten Proben zur Ausbildung eines sehr

feinen Niederschlages kam, detektieren die PCS-Messungen nur einen schwachen

Anstieg der mittleren Teilchengrößen. Möglicherweise liegt das an der vergleichswei-

se geringen Anzahl größerer Partikel, die im Laufe der Messung als Ausreißer eli-

miniert wurden.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

30

Abb. 10 : Vergleich der mittleren Teilchen-größen (z-Average) einer 2%igen (m/m) DMPC-Dispersion bei unterschiedlichen Lagertemperaturen. Die Messungen der bei 13°C gelagerten Probe wurden nach 5 Wochen abgebrochen.

Eine gravierende Steigerung der beschriebenen Instabilität zeigte sich bei 10%igen

Dispersionen: Bei 13°C gelagert, zeigten sie nach 3 Wochen eine Gelierung der ge-

samten Dispersion zu einer festen, weißlich-transparenten Masse ohne bzw. mit

minimalem flüssigen Überstand. Bei 2 - 8°C bildete sich innerhalb von 3 Wochen

zwar ein stückiger Bodensatz, allerdings kam es auch nach 6 Monaten zu keiner voll-

ständigen Verfestigung der Proben. Das Verhalten der 10%igen Dispersionen bei

38°C entspricht dem der 1%igen und 2%igen Dispersionen.

Als Ergebnis dieser Untersuchungen lässt sich festhalten, dass unter den gewählten

Herstellungsbedingungen keine lagerstabilen Dispersionen aus reinem DMPC herge-

stellt werden konnten. Die Stabilität der DMPC-Liposomen ist in der Gelphase im

Vergleich zur Lα-Phase deutlich schlechter. Überraschend war die Beobachtung der

Gelierung der 10%igen Dispersionen bei 13°C, die ansatzweise auch bei den

niedriger konzentrierten Dispersionen und in kühlschrankgelagerten Proben in Form

von stückig-inhomogenen Niederschlägen beobachtet wurde. Da eine Gelbildung bei

DMPC-Liposomen bisher nicht beschrieben wurde, rückte die Untersuchung dieses

speziellen Instabilitätsphänomens ins Zentrum der vorliegenden Doktorarbeit.

3.2 . Das Gelierungsphänomen

3.2.1 . Makroskopische Beschreibung der Geleigenschaften

Liposomengele sind bisher nur aus den Arbeiten von Brandl et al. bekannt (Brandl

et al.,1997a; 1997b; 1998). Diese werden allerdings direkt nach der Hochdruckhomo-

genisation von hochkonzentrierten (30% - 60% [m/m]) Phospholipidsystemen ge-

bildet. Sie bestehen aus dicht gepackten Liposomen und lassen sich mit Wasser

0 1 2 3 4 5 6120160200240280

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000M

ittle

re T

eilc

heng

röße

/P

CS

/ z-

Ave

rage

(nm

)

Lagerdauer (Monate)

2-8 °C

38°C

13°C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

31

bzw. Pufferlösungen zu homogenen Dispersionen verdünnen.

Im Gegensatz dazu entstehen die hier beobachteten DMPC-Gele aus vergleichswei-

se niedrig konzentrierten und zunächst dünnflüssigen Dispersionen erst nach etwa 3-

bis 4-wöchiger Lagerung bei 13°C. Mit Wasser lassen sie sich nicht verdünnen, der

Versuch der Dispergierung führt lediglich zur Zerkleinerung des Gels in kleinere

Stücke. Mechanische Beanspruchung durch kräftiges Schütteln eines Gels führt zur

Bildung einer breiartig fließfähigen Masse, die sich auch nach mehrmonatigem

Ruhen bei 13°C nicht wieder verfestigt. Bei Temperaturerhöhung über die Ketten-

schmelztemperatur kommt es ebenfalls zur Zerstörung der festen Konsistenz, wobei

inhomogene, fließfähige Systeme entstehen. Auch hier führt eine anschließende

Lagerung bei 13°C zu keiner Wiederherstellung des Gels. Die makroskopische

Festigkeit des entstehenden Gels wird auch durch die mechanische Manipulation

während der Lagerung beeinflusst. So bilden Dispersionen, die über Wochen in Ruhe

gelassen wurden, feste und gleichmäßige Gele, während Proben, die häufig bewegt

oder zwischenzeitlich geschüttelt wurden, stückig-inhomogene und häufig fließfähige

Systeme bilden.

Diese Beobachtungen geben bereits erste Hinweise auf die Art des Gelgerüstes.

Demnach sind Wechselwirkungen an Partikelgrenzflächen als Ursache für die Aus-

bildung eines Gelgerüstes, wie sie zum Beispiel für Bentonitgele beschrieben (Voigt,

2000) oder für Gele aus festen Lipidnanopartikeln angenommen wurden (Siek-

mann, 1994), unwahrscheinlich. Wahrscheinlicher erschien das Vorliegen mecha-

nischer Verhakungen zwischen sowohl mechanisch als auch temperatur-empfind-

lichen vesikulären Strukturen. Dass die Bildung der Gele temperaturabhängig ist und

eine gewisse Zeit benötigt, deutet darauf hin, dass sich derartige Strukturen erst mit

der Zeit und nur in der Gelphase des Lipids bilden. Im folgenden Abschnitt wird

mittels elektronenmikroskopischer Untersuchungen die Ultrastruktur dargestellt und

eine mögliche Ursache für das beobachtete Phänomen vorgeschlagen.

3.2.2 . Elektronenmikroskopische Beschreibung der halbfesten Systeme

Abb. 11 zeigt typische elektronenmikroskopische Aufnahmen (Gefrierbruch-TEM)

von bei 13°C verfestigten Proben. Die Aufnahmen dokumentieren eine sehr hetero-

gene Zusammensetzung, wobei insbesondere lang gestreckte Strukturen mit heli-

kaler Musterung ins Auge fallen. Aufgrund ihres Aufbaus und ihrer Dimensionen

(siehe Kapitel 3.2.2.1.) werden sie als Nanotubes“ bezeichnet. Der aus den Gefrier-

bruch-TEM Aufnahmen ermittelte Durchmesser der Nanotubes beträgt 40 bis 50 nm.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

32

Die Schraubenstruktur der Nanotubes ist linkshändig (entgegen den Uhrzeigersinn

bezüglich der Ausbreitungsrichtung entlang der Tubulusachse) und die Ganghöhe

oder Pitch beträgt etwa 23 nm. Der Pitchwinkel kann zwischen 15° und 50° variieren.

Daneben findet man Liposomen mit einer polyedrischen Oberflächenstrukturierung

und einer Größe um 100 nm, weiterhin Liposomen der Größenordnung um 50 nm

ohne erkennbare Strukturierung sowie große Vesikel bzw. Lipidpartikel mit Ripple

Strukturierung.

Abb. 11 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen zwei verschiedener 10%iger DMPC-Dispersionen nach Ge-lierung bei 13°C. A) Überblick mit Nanotubes (Pfeil a) und polyedrisch strukturierten Liposomen (Pfeil b); B) Detailansicht eines Bündels von Nanotubes aus A); C) heterogener Probenbereich mit Nano-tube (Pfeil a), Liposomen (Pfeil b) und großen Bilayerbereichen mit Rippelmuster (Pfeil c).

Durch Untersuchung aller bis dahin hergestellten Gele konnte nachgewiesen werden,

dass es sich nicht um einen einmaligen Zufallsbefund handelte, sondern dass die

makroskopische Gelierung immer mit dem Auftreten der Nanotubes korreliert. Die

Untersuchungen der stückig-inhomogenen Niederschläge von bei 2 - 8°C gelagerten

Dispersionen zeigten ebenfalls Nanotubes. Dagegen traten diese Strukturen nie in

frisch hergestellten Dispersionen auf, was belegt, dass sie sich erst im Laufe der

Lagerung bilden.

Dispersionen, die oberhalb bzw. im Bereich der Kettenschmelztemperatur gelagert

wurden und trotz Niederschlagsbildung keinerlei Tendenz zur Gelierung zeigten, wa-

ren frei von Nanotubes. Abb. 12 zeigt stellvertretend eine 10%ige DMPC-Dispersion,

die über 3 Monate bei 23°C gelagert wurde. Untersuchungen des Niederschlags zei-

gen, dass keine kleinen Liposomen der Größenordnung 100 nm und kleiner vor-

lagen, wie sie in den frisch dispergierten Proben und auch noch in den Gelen zu

finden sind. Vielmehr sind bei 23°C alle Vesikel zu großen Liposomen und

Bilayerbereichen bzw. Lipidpartikeln fusioniert, deren Größe über 200 nm liegt. Die

Liposomen und Bilayer weisen Ripple Strukturen auf. Nanotubes sind nicht enthalten.

A B C

100 nm 100 nm 100 nm

b

a

a

b

c

c

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

33

Abb. 12 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des Niederschlags einer 10%igen DMPC-Dispersion nach dreimonatiger Lagerung bei 23°C. Die Probe wird dominiert von großen Vesikeln, die Ripple Struktu-ren aufweisen. Sie ist frei von Liposomen der Größenordnung 100 nm und kleiner, Nanotubes sind ebenfalls nicht vorhanden.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Nanotubes die Ursache für die beob-

achtete Gelbildung darstellen. Im Folgenden sollen die Nanotubes näher charakteri-

siert und geklärt werden, wie sie zur Bildung eines Gelgerüstes befähigt sind.

3.2.2.1 . Elektronenmikroskopische Charakterisierung der Nanotubes

3.2.2.1.1 . Gefrierbruch-TEM

Standardmäßig erfolgte die Probenpräparation für den Gefrierbruch bei Raum-

temperatur. Durch zügiges Arbeiten konnte die Verweilzeit der Probe bei Raum-

temperatur auf etwa eine halbe Minute reduziert werden. Dennoch ist bei einem

Probenvolumen von 5 µl eine Erwärmung der gesamten Probe sehr wahrscheinlich.

Um auszuschließen, dass es sich bei den beobachteten Nanotubes um Artefakte

durch Temperaturerhöhung handelt, wurde die Präparation mit Hilfe einer thermo-

statisierbaren Kryofixationsapparatur (Drechsler, 1990) unter Vorkühlung der direkten

Umgebungsluft sowie aller probenberührender Gerätschaften bei 13°C ± 1°C

durchgeführt (siehe 2.2.2.5.1). Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen belegen,

dass die Morphologie der Nanotubes im Vergleich zur Präparation bei

Raumtemperatur unverändert ist (Abb. 13). Damit konnte gezeigt werden, dass die

Nanotubes sich nicht infolge kurzzeitiger Erwärmung während der Präparation bilden.

Einen deutlichen Unterschied sieht man allerdings bei den ausgedehnten Lipid-

partikeln: Bei 13°C Präparationstemperatur findet man konvex-konkave Bilayerdefor-

mationen mit Krümmungsradien von etwa 20 nm, wie sie von kalt hydratisiertem

DMPC bekannt sind (Meyer et al., 2000). Im Gegensatz dazu wurden bei der

500 nm 500 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

34

üblichen Präparationsmethode bei Raumtemperatur ausschließlich Lipidpartikel mit

Ripple Muster gefunden (vgl. Abb. 11).

Abb. 13 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen eines Gels (10% DMPC) nach Einfrieren bei genau 13°C. Links erkennt man neben Nanotubes Liposomen der Größenordnung 100 nm. Rechts sind außerdem Bilayer mit konvex-konkaven Deformationen (Pfeile) sichtbar. Der Krümmungsradius dieser Aus-buchtungen beträgt etwa 20 nm.

Meyer et al. beschrieben, dass die konvex-konkaven Bilayerdeformationen schon bei

geringen Temperaturerhöhungen zugunsten der Rippelmuster verschwinden. Das

korreliert mit den vorliegenden Beobachtungen und unterstützt die Vermutung, dass

es während der Präparation bei Raumtemperatur zu einer Erwärmung der Probe

kommt. Die Nanotubes hingegen zeigen keine vergleichbare Temperaturabhängig-

keit, ihre Morphologie und Abmessungen blieben in den kurzen Zeiträumen unverän-

dert.

Die Gefrierbruchpräparation erlaubt zwar das Beurteilen der Vesikeloberflächen,

ermöglicht aber nur einen sehr begrenzten Einblick in die innere Struktur der

Nanotubes. Einige Nanotubes sind im Querschnitt gebrochen (Abb. 14, Kreise). Zu

erkennen ist hier, dass es sich um schlauchartige Gebilde handelt, deren Innenraum

hohl bzw. wassergefüllt erscheint.

Abb. 14 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme ei-nes Gels (10% DMPC, gelagert bei 13°C). Einige Nanotubes sind im Querschnitt gebrochen (Kreise) und lassen den schlauchähnlichen Aufbau erkennen.

Allerdings können mit der Gefrierbruchpräparation Fragen nach der Länge, der

Lamellarität sowie nach dem Aussehen der Enden nicht eindeutig beantwortet

100 nm

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

35

werden. Weiterhin musste geklärt werden, ob diese Strukturen tatsächlich zur

Bildung eines Gerüstes befähigt und damit für die Gelierung der Probe verantwortlich

sind. Dazu wurden die Negative Staining Präparation mit Uranylacetat (Negativkon-

trastierung) und die Kryo-Präparation eingesetzt.

3.2.2.1.2 . Negative Staining Präparation (Negativkontrastierung)

Diese Präparationsmethode ermöglicht, ebenso wie die Kryo-Präparation, eine elek-

tronenmikroskopische Darstellung der Lipidstrukturen in Transmission. Für die Prä-

paration ist es notwendig, die Proben auf eine Lipidkonzentration von ~ 1% zu ver-

dünnen. Dies geschieht durch mechanisches Zerkleinern eines Gelstückes in der

entsprechenden Menge Wasser.

Abb. 15 : Verschiedene Negative Staining Präparation von DMPC-Nanotubes (Erklärungen im Text).

100 nm 100 nm

100 nm

100 nm

1 µm

100 nm

F

A

E

B

C D

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

36

Als Konsequenz dieser Behandlung werden kaum intakte Nanotubes gefunden.

Somit sind keine eindeutigen Aussagen über deren Länge möglich. Das längste

gefundene Bruchstück maß ca. 14 µm (Abb. 15 C), es kann aber davon ausgegan-

gen werden, dass die Nanotubes deutlich länger sind.

Die Nanotubes sind ausnahmslos unilamellar, d.h. sie stellen lange, schlauchartige

Zylinder dar, deren Wand von einer einzigen Bilayerschicht gebildet wird. Die helikale

Strukturierung ist auch hier deutlich erkennbar (Abb. 15 A). Die Ganghöhe beträgt

ca. 23 nm, was etwa den symmetrischen Periodizitäten der Bilayer der Pβ`-Phase

(25 - 30 nm) entspricht. Die Negativkontrastierung mit Uranylacetat unterstützt die

ersten Beobachtungen im Gefrierbruch (Abb. 14), dass es sich um schlauchartige

Gebilde handelt, die einen wässrigen Hohlraum umschließen: In die offenen Enden

konnte das Uranylacetat während der Kontrastierungsphase eindringen, wurde aber

zum Teil bei der Entfernung des Kontrastmittels durch Absaugen mittels Filterpapier

wieder entfernt, was an der Aufhellung der offenen Enden erkennbar ist (Abb. 15 E,

Pfeile). Die TEM-Aufnahmen zeigen aber auch Nanotubes mit intakten Enden

(Abb. 15 B und D, Kreise): Die Röhren sind mit halbrunden Kappen verschlossen. Es

wurden keinerlei Verzweigungen gefunden. In Abb. 15 F ist erkennbar, dass die

Nanotubes eine gewisse Flexibilität aufweisen und dadurch in der Lage sind, sich

untereinander zu verflechten, was die Grundlage für ein dreidimensionales Gelgerüst

darstellen kann.

Damit lassen sich die Nanotubes als unverzweigte, unilamellare, zylinderförmige und

an den Enden durch halbrunde Kappen geschlossene Lipidvesikel beschreiben, die

einen wässrigen Hohlraum einschließen. Aus den TEM-Aufnahmen werden Durch-

messer von etwa 40 nm bis 50 nm und eine Länge von > 14 µm ermittelt. Der Bilayer

zeigt eine linkshändige helikale Struktur.

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Nanotubes tatsächlich Bausteine eines

Gelgerüstes sind. Abb. 16 (A und B) zeigt die TEM-Aufnahmen eines völlig intakten

Netzwerks aus Nanotubes. Die Nanotubes sind ähnlich Fäden in einem Gewebe

miteinander verwoben. In den Maschen dieser Netze können Liposomen (Abb. 16 B)

oder auch andere Lipidpartikel eingelagert sein. Die einzelnen Nanotubes verlieren

durch die Vernetzung ihre Identität nicht und es wurden keinerlei Fusionen der Nano-

tubes an den Kontaktstellen beobachtet. Der Zusammenhalt erfolgt demnach auf-

grund rein mechanischer Wechselwirkungen. Im Falle der Verdünnung in Kombina-

tion mit mechanischer Belastung in Vorbereitung auf die Negative Staining Präpara-

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

37

A B C

100 nm 100 nm 100 nm

tion werden derartige Netzwerke in der Regel durch Zerreißen der Nanotubes zer-

stört. Dadurch gelingt die Präparation intakter Netzwerke relativ selten, häufig findet

man aber Nanotubes, die trotz großer Verdünnung an den Kontaktstellen miteinander

verbunden bleiben (Abb. 16 C).

Abb. 16 : TEM-Aufnahmen von vernetzten Nanotubes nach Negative Staining Präparation. A) Intaktes Nanotube-Netzwerk (Überblick); B) Detailansicht des Netzwerks aus Aufnahme A; C) Nanotube-Bruchstücke bleiben auch in der Verdünnung teilweise an ihren Kontaktstellen ver-bunden.

Diese elektronenmikroskopischen Befunde korrelieren sehr gut mit der makrosko-

pischen Sensitivität der Gele gegenüber mechanischer Belastung, die zur Bildung in-

homogener fließfähiger Systeme führt.

Bezüglich der Präparationsmethode lässt sich festhalten, dass sich die Negative

Staining Präparation sehr gut zur Darstellung und Charakterisierung der Nanotubes

und ihrer Netzwerke eignet. Im Vergleich zur Gefrierbruchpräparation und der

nachfolgend genutzten Kryo-Präparation ist sie relativ unkompliziert und schnell

durchführbar, was einen großen Vorteil für Routineuntersuchungen darstellt. Ein

Problem stellt allerdings die notwendige Verdünnung dar, infolge derer die Nanotube-

netzwerke zerstört werden. Kritisch zu bemerken ist außerdem das Auftreten von

Trocknungseffekten. Häufig kommt es zur Abbildung faltiger Liposomen aufgrund der

Kollabierung der Vesikel durch den Flüssigkeitsverlust. In einigen Präparationen tre-

ten außerdem viele kleine stäbchenförmige Gebilde mit Längen von etwa 30 nm und

Dicken von etwa 6 nm auf (siehe auch Abb. 15 A). Dabei kann es sich möglicher-

weise um Stäbchenmizellen handeln, die durch chemische Veränderungen infolge

Hydrolyse (Bildung von Lysophosphatidylcholin und freien Fettsäuren) entstanden

sein könnten. Eine andere Erklärung wäre, dass es sich um durch den Trocknungs-

prozess kollabierte kleine Liposomen handeln, wobei diese Möglichkeit wahrschein-

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

38

licher erscheint, da derartige Stäbchen im Gefrierbruch nicht auftraten.

3.2.2.1.3 . Kryo-Präparation

Auch mittels Kryo-TEM ist die Abbildung der Nanotubes prinzipiell möglich (Abb. 17).

Bemerkenswert ist, dass die mit dieser Methode detektierten Nanotubes einen deut-

lich kleineren Durchmesser von nur etwa 35 - 45 nm aufweisen, während im Gefrier-

bruch und vor allem beim Negative Staining ca. 40 - 50 nm gemessen werden. Die

stäbchenförmigen Strukturen, die in den Negative Staining Präparationen auftraten,

wurden mit Kryo-TEM nicht gefunden. Daher kann davon ausgegangen werden, dass

es sich dabei um Trocknungsartefakte aus kleinen kollabierten Liposomen handelt.

Abb. 17 : Kryo-TEM Aufnahme eines 5 Monate gelagerten DMPC-Gels. Neben Nanotubes mit einem Durchmesser von etwa 40 nm (A, B) lassen sich vor allem Liposomen < 100 nm detektieren (C, D), die zum Teil Falten auf ihrer Oberfläche tragen (Pfeile).

Die meisten Liposomen sind nicht rund, was darauf hinweist, dass sie sich in der

Gelphase befinden. Einige Liposomen enthalten stark kontrastierte Bereiche, die wie

Falten aussehen (Abb. 17 A, C und D, gekennzeichnet durch Pfeile). Die Auflösung

der mit der Restlichtverstärker Videokamera aufgenommenen Bilder vor allem im

Bereich der Nanotubes ist jedoch vergleichsweise schlecht, so dass keine neuen

Strukturinformationen gewonnen werden können und zur Charakterisierung der

50 nm

50 nm

50 nm

50 nm

A B

C D

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

39

Nanotubes der Negative Staining Präparation eindeutig der Vorzug zu geben ist.

Wie bei der Negative Staining Präparation ist auch hier die notwendige Verdünnung

mit ihren Folgen für die Nanotubes kritisch anzumerken. Weiterhin kommt es zu

einer, in der speziell verwendeten Methode begründeten, Auftrennung der Lipo-

somen in Abhängigkeit von der Teilchengröße, was dazu führt, dass hauptsächlich

die kleinen Liposomen abgebildet werden. Große Strukturen werden entweder vor

dem Einfrieren abgesaugt (ebenso beim Negative Staining), oder entziehen sich an

den dickeren Rändern liegend der Betrachtung.

3.2.2.2 . Lagerstabilität der Nanotubes

Die DMPC-Nanotubes erwiesen sich als sehr lagerstabile Strukturen. Die ältesten

untersuchten Gele zeigten im Gefrierbruch nach 12- bzw. 20-monatiger Lagerung bei

13°C keinerlei morphologische Veränderungen der Nanotubes (Abb. 18). Ebenso wie

in jüngeren Proben begleiten sowohl Liposomen als auch größere Lipidpartikel die

Nanotubes.

Abb. 18 : Gefrierbruch-TEM eines über 12 Monate bei 13°C gelagerten DMPC-Gels. A) Übersichtsauf-nahme; B) Detailansicht von A).

3.2.2.3 . Temperatur-Stabilität der Nanotubes

DMPC-Gele, die auf 38°C erwärmt wurden, verflüssigen sich innerhalb von 48

Stunden ohne mechanische Beanspruchung vollständig. Mittels Gefrierbruch-TEM

konnte gezeigt werden, dass es dabei zum vollständigen Verschwinden der Nano-

tubes kommt (Abb. 19). Stattdessen sind neben kleinen Liposomen (SUV`s = Small

Unilamellar Vesicles) sehr große multilamellare (MLV`s = Multilamellar Vesicles) und

multivesikuläre Liposomen (MVV`s = Multivesicular Vesicles) zu finden. Dieser Pro-

zess ist irreversibel, d.h. auch eine anschließende mehrmonatige Lagerung bei 13°C

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

40

führt nicht wieder zu einer Gelierung. Es konnten keine Nanotubes mehr detektiert

werden. Das Einhergehen der Verflüssigung mit dem Verschwinden der Nanotubes

bestätigt, dass die Nanotubes die strukturelle Grundlage für die Gelierung der

Dispersionen darstellen.

Abb. 19 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme einer 10%igen DMPC-Dispersion, die nach vollständiger Gelierung auf 38°C erwärmt wurde. Die Probe ist vollständig verflüssigt, Nanotubes sind nicht mehr zu detektieren.

Aus dieser Beobachtung ergab sich die Frage, wie sich die Morphologie der Nano-

tubes in Abhängigkeit von der Temperatur, besonders bei Temperaturerhöhung,

verändert. Einerseits wäre ein Abbau der Nanotubes zu Liposomen denkbar, die

ihrerseits anschließend durch Fusion große Vesikel bilden. Eine andere Möglichkeit

umfasst die direkte Fusion der Nanotubes zu Vesikeln bzw. Lipidpartikeln. Zur Klä-

rung des Zerstörungsmechanismus der Nanotubes wurden Gefrierbrüche eines

10%igen DMPC-Gels unter stufenweiser Erhöhung der Temperatur in 2°C-Schritten

zwischen 13°C und 19°C angefertigt. Die Probe wurde bei jeder Temperatur

24 h äquilibriert und direkt kryofixiert.

Abb. 20 : Gefrierbruch-TEM Aufnahme eines 10%igen DMPC-Gels (Lagerung bei 13°C). Links: Aus-gangssituation nach 2,5-monatiger Lagerung bei 13°C; Rechts: gleiche Probe nach Erwärmung auf 15°C über 24h. Eine Temperaturerhöhung auf 15°C über 24h bewirkt noch keine morphologische Ver-änderung der Nanotubes.

100 nm

13°C 15°C

100 nm100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

41

!

! 100 nm 100 nm 100 nm

17°C 17°C 17°C

Eine Temperaturerhöhung auf 15°C führt nach einer Äquilibrierungsphase von

24 Stunden zu keiner sichtbaren Veränderung der Nanotubes (Abb. 20). Bei der

weiteren Erwärmung auf 17°C werden allerdings zwei Veränderungen beobachtet:

Neben den bekannten Nanotubes findet man in der erwärmten Probe auch solche,

deren Enden keulenartig aufgeweitet sind bzw. in große Lipidpartikel münden

(Abb. 21, gekennzeichnet durch Kreise). Daneben treten außerdem vereinzelt Nano-

tubes auf, die ihre strenge Strukturierung mit einer Ganghöhe von etwa 23 nm

zugunsten einer etwa doppelten Ganghöhe verloren haben (Abb. 21, Pfeil).

Abb. 21 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des unter Abb. 20 vorgestellten Gels nach 24-stündiger Lage-rung bei 15°C und weiteren 24 Stunden Lagerung bei 17°C: Neben unveränderten Nanotubes (linke Abbildung, Sternchen) sind vereinzelt keulenartige Ausstülpungen an den Nanotube-Enden zu finden (Kreise). Daneben findet man Nanotubes, deren gleichmäßig enge Schraubung von ca. 23 nm auf 42 - 50 nm aufgeweitet ist (rechte Abbildung: Pfeil).

Abb. 22 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen des unter Abb. 20 gezeigten Gels nach 24 h Lagerung bei 15°C, 24 h Lagerung bei 17°C und 24 h Lagerung bei 19°C. Bei 19°C werden vermehrt Nanotubes mit vergrößerter Ganghöhe gefunden.

Das Auftreten dieser aufgeweiteten Nanotubes nimmt bei der weiteren Temperatur-

100 nm

19°C

100 nm 100 nm

19°C 19°C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

42

steigerung auf 19°C zu (Abb. 22), während immer weniger der ursprünglichen

Nanotubes mit kleinerer Ganghöhe zu finden sind. Gleichzeitig findet man verstärkt

ausgedehnte Lipidpartikel bzw. große Vesikel mit einer Ripple Phase Struktur. In

einigen Nanotubes ist in den Bereichen vergrößerter Ganghöhe außerdem eine

Längsstreifung zu sehen (Abb. 22, Detailansicht in der Mitte).

Gefrierbruch-Präparationen, bei denen die Gele bis zu 20 Minuten der Raum-

temperatur (21°C ± 2°C) ausgesetzt waren (Abb. 23 A) und auch Negative Staining

Präparationen unter gezielter Erwärmung der Probe auf Raumtemperatur (Abb. 23 B

und C) zeigen Nanotubes mit den gleichen morphologischen Veränderungen.

Abb. 23 : Verschiedene Präparationen von DMPC-Gelen bei Raumtemperatur (21°C). A) Gefrier-bruch-TEM Aufnahme; B) und C) Negative Staining mit Uranylacetat. Die Nanotubes zeigen keulen-artige Aufweitungen.

Die vorgestellten Ergebnisse belegen, dass eine Temperaturerhöhung zu Entspan-

nung und Aufweitung der strengen Schraubenstruktur führt. Dies äußert sich ent-

weder in keulenartigen Ausstülpungen, wobei die Nanotubes in große Vesikel über-

gehen. Zum anderen können Veränderungen auch über das gesamte Nanotube in

der Form einer Aufweitung der Schraubenstruktur stattfinden. Dabei scheint zunächst

jede zweite Windung betroffen zu sein. Die so neu entstandenen Zwischenräume

lassen teilweise eine Längsstreifung erkennen. Endpunkt dieses Veränderungspro-

zesses bildet das vollständige Verschwinden der Nanotubes zugunsten großer Vesi-

kel bzw. ausgedehnter Lipidpartikel.

3.2.3 . Einfluss der Herstellungsmethode auf die Gelbildung und Nanotube- Entstehung

Eine weitere Fragestellung beinhaltete, inwieweit die Art der Dispergierung die

Entstehung der Nanotubes beeinflusst. In diesem Zusammenhang wurde untersucht,

100 nm 100 nm 300 nm

A B C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

43

ob durch eine Variation der Herstellungsparameter bzw. die Wahl einer anderen

Herstellungsmethode die Gelierung und Entstehung der Nanotubes gezielt gefördert

oder aber verhindert werden kann.

Zunächst wurde geprüft, ob für die Bildung von Nanotubes eine Dispergierung

überhaupt notwendig ist. Dazu wurde vollständig hydratisiertes DMPC bei 13°C für

3,5 Monate ohne mechanische Beanspruchung gelagert. Die TEM-Aufnahmen

(Abb. 24) zeigen, dass ausschließlich ausgedehnte lamellare Lipidstrukturen vorlie-

gen, zwischen denen große Mengen Wasser eingelagert sind. Nanotubes haben sich

unter diesen Umständen nicht gebildet.

Abb. 24 : Gefrierbruch-TEM von vollständig hydratisiertem DMPC-Bulkmaterial nach 3,5 Monaten La-gerung bei 13°C. Es sind ausschließlich ausgedehnte Bilayer mit Rippel-Muster zu sehen, Nanotubes haben sich nicht gebildet.

Daraus lässt sich schließen, dass eine Dispergierung des Phospholipids eine ent-

scheidende Voraussetzung für die Bildung der Nanotubes darstellt.

3.2.3.1 . Eigenschaften der Dispersionen nach Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation Neben der bisher standardmäßig verwendeten Hochdruckhomogenisation wurden

Liposomen mittels Extrusion durch isopore Polycarbonatmembranen hergestellt. Die

Dispergierung erfolgte über 8 Zyklen durch zwei geschichtete Membranen mit einem

Porendurchmesser von 200 nm bei 40°C. Es wurde DMPC der Charge 5 (MA

040722 Astra Arcus) verwendet und Dispersionen mit 2%, 5% und 10% (m/m) DMPC

hergestellt.

Die Dispersionen sind weiß, homogen und kaum durchscheinend. Die mittels PCS

mit z-Average-Auswertung ermittelten mittleren Teilchengrößen nach der Herstellung

sind in Tab. 4 aufgelistet. Die MSD-Auswertung der PCS-Daten ergab für die 2%ige

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

44

Dispersion eine sehr enge monomodale Verteilung (160 175 nm), für die 5%ige

Dispersion ebenfalls eine monomodale Verteilung (zwischen 71 und 271 nm) und für

die 10%ige Dispersion eine bimodale Verteilung (95 112 nm und 180 212 nm).

Die Extrusion ermöglicht somit im Gegensatz zur Hochdruckhomogenisation die

Herstellung deutlich homogenerer Dispersionen: Vesikel mit Größen über 300 nm

sind nicht enthalten, ebenso fehlen Liposomen bzw. Lipidpartikel, die kleiner als

50 nm bzw. 30 nm sind. Es handelt sich demnach um verhältnismäßig eng verteilte

Teilchenkollektive, deren mittlere Größe gut durch den z-Average repräsentiert wird.

Eine Gefrierbruch-TEM-Aufnahme einer frisch extrudierten 10%igen Dispersion ist in

Abb. 27 C in direkter Gegenüberstellung mit einer hochdruckhomogenisierten Disper-

sion abgebildet.

DMPC Konzentration 2% (m/m) 5% (m/m) 10% (m/m)

Mittlere Teilchengröße 168 nm 142 nm 149 nm

Polydispersitätsindex 0,01 0,09 0,09

Verteilungsbreite nach MSD-Auswertung

Monomodal (160 175 nm)

Monomodal (71 271 nm)

Bimodal (95 112 nm und 180 212 nm)

Tab. 4 : Mittlere Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswertung) sowie Breite der Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) unterschiedlich konzentrierter DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung mittels Extrusion durch zwei 200 nm Polycar-bonatmembranen (8 Zyklen, 40°C). Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.

Da die Dispersionen weiß sind, ist die Homogenität im Laufe der Lagerung nur

schwer zu beurteilen. Bei Betrachtung der durchschnittlichen Teilchengrößen (z-

Average) weisen alle Dispersionen unabhängig von der Lagerungstemperatur eine

gute Lagerstabilität auf (Abb. 25). Auch die Polydispersitätsindices (hier nicht mit

aufgeführt) verändern sich kaum. Die bei 38°C gelagerten Proben zeigen auch

makroskopisch eine gute Stabilität. Bei den bei 13°C bzw. bei 2 - 8°C gelagerten

Proben scheinen dagegen nach etwa 5 bis 8 Wochen leichte Inhomogenitäten aufzu-

treten, die allerdings wegen der Undurchsichtigkeit der Proben nicht weiter zu

präzisieren sind und sich auch nicht in den Teilchengrößenmessungen nieder-

schlagen.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

45

0 2 4 6 8 10 12100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

Dur

chsc

hnitt

liche

Tei

lche

ngrö

ße /

PCS

(nm

)

Lagerdauer (Wochen)

38°C 13°C 2-8°C

0 2 4 6 8 10 12110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

Dur

chsc

hnitt

liche

Tei

lche

ngrö

ße /

PC

S (n

m)

Lagerdauer (Wochen)

13°C 38°C2-8°C

2% DMPC 5% DMPC

0 2 4 6 8 10 12110

120

130

140

150

160

170

180

190

Dur

chsc

hnitt

liche

Tei

lche

ngrö

ße /

PCS

(nm

)

Lagerdauer (Wochen)

2-8°C 13°C 38°C

10% DMPC

Abb. 25 : Veränderung der durchschnittlichen Teilchengrößen (PCS mit z-Average Auswertung) ver-schiedener DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur über einen Lage-rungszeitraum von 3 Monaten. Alle Dispersionen wurden mit DMPC 5 (MA 040722 Astra Arcus) über Extrusion durch Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 200 nm (8 Zyklen, 40°C) her-gestellt. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.

Abb. 26 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen einer mittels Extrusion hergestellten 10%igen (m/m) DMPC-Dispersion nach 12 Monaten Lagerung bei 13°C. A) Übersichtsaufnahme: Die Probe enthält haupt-sächlich Liposomen, vereinzelt sind auch größere Lipidpartikel und extrem selten Nanotubes (rechteckiger Kasten bzw. dessen Detailansicht in B) enthalten. Die Liposomen sind häufig länglich verformt (C) und sind polyedrisch bzw. zeigen Ripple Phase Muster.

Im Gegensatz zu den hochdruckhomogenisierten Proben kam es auch nach Lang-

A

200 nm 100 nm 100 nm

B C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

46

zeitlagerung in keinem Fall zu einer Gelbildung. Gefrierbruch-TEM Aufnahmen der

10%igen Dispersion nach 12 Monaten Lagerung bei 13°C zeigen nur extrem verein-

zelt Nanotubes (Abb. 26). Die Proben werden dominiert von Liposomen, deren

Größe zwischen 50 nm und 200 nm variiert. Die Liposomen sind zum Teil länglich

verformt und besitzen eine polyedrische Oberfläche oder Ripple Muster. Seltener

sind auch größere Vesikel enthalten.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die mittels Extrusion hergestellten Di-

spersionen gegenüber den hochdruckhomogenisierten Dispersionen eine deutlich

bessere Lagerstabilität aufweisen. Zwar kommt es auch hier bei Lagerung in der

Gelphase des Lipids zu leichten Inhomogenitäten, jedoch sind diese nur sehr

schwach ausgeprägt und führen nicht zu einer Gelierung des Systems. Mittels

Elektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass auch nach Langzeitlagerung bei 13°C

nur extrem vereinzelt Nanotubes in den Proben zu finden sind, was die ausbleibende

Gelbildung erklärt.

Daraus ergab sich die Frage nach der Ursache für die ausbleibende Nanotube- und

Gelbildung der extrudierten Dispersionen im Gegensatz zu den hochdruckhomogeni-

sierten Dispersionen.

Bei der direkten Gegenüberstellung von frisch hergestellten hochdruckhomogeni-

sierten und extrudierten Dispersionen gleicher Konzentration (Tab. 5) fallen trotz

ähnlicher mittlerer Teilchengrößen (PCS mit z-Average-Auswertung) die sehr unter-

schiedlichen Breiten der Teilchengrößenverteilung auf. In Analogie zu den durch

MSD-Auswertung gewonnenen Informationen über die Breite der Teilchengrößen-

verteilungen veranschaulichen Gefrierbruch-TEM Untersuchungen an frisch herge-

stellten Dispersionen die unterschiedliche Ultrastruktur der Systeme (Abb. 27). Die

hochdruckhomogenisierten Dispersionen zeigen, wie auch bereits in Kapitel 3.1.1

ausgeführt, eine sehr heterogene Zusammensetzung (Abb. 27 A, B): Die über-

wiegende Anzahl der Liposomen ist deutlich kleiner als 100 nm, außerdem sind

kleinste Lipidpartikel mit Größen unter 20 nm enthalten. Daneben liegen wenige

Liposomen der Größenordnung 100 200 nm und große Lipidpartikel vor. Ein voll-

kommen anderes Bild ergeben Gefrierbruch-TEM Aufnahmen von frisch extrudierten

Proben (Abb. 27 C): Die Proben sind sehr homogen, wobei Liposomen mit Größen

zwischen 50 nm und 200 nm dominieren. Große und auch extrem kleine Lipidpartikel

sind praktisch nicht enthalten. Die gleichen Ergebnisse beim Vergleich der resul-

tierenden Teilchengrößen in Abhängigkeit von der Herstellungsmethode erhält man

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

47

auch beim Einsatz anderer DMPC-Chargen und bei der Verwendung von DPPC.

Dispergierungs-methode

Hochdruckhomogenisation Micron Lab 40, 8x500 bar/ 40°C

Extrusion EmulsiFlex C5, 8x 200 nm/ 40°C

Makroskopischen Aussehen

Weißlich-trüb und etwas durchscheinend

Weiß und kaum durchscheinend

Mittlere PCS Teilchen-größe (z-Average)

186 nm 156 nm

Polydispersitätsindex 0,19 0,07

Partikelgrößenverteilung (PCS, MSD-Auswertung)

Trimodal (zwischen 16 nm und 3500 nm)

Bimodal (zwischen 97 nm und 231 nm)

Tab. 5 : Gegenüberstellung von Aussehen, mittlerer Teilchengröße und Polydispersitätsindex (PCS mit z-Average Auswertung) sowie Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) von frisch hergestellten DMPC-Dispersionen (10% [m/m] DMPC 5 [MA040722 Astra Arcus]) in Abhängigkeit von der Herstellungsmethode. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar. Die dazugehörigen Gefrierbruch-TEM-Aufnahmen finden sich in Abb. 27.

Abb. 27 : Gegenüberstellung von Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger DMPC-Dispersionen direkt nach der Herstellung: A) und B) Hochdruckhomogenisation mit 8x 500 bar / 40°C; C) Extrusion 8x 200 nm / 40°C.

Da hochdruckhomogenisierte DMPC-Dispersionen bei 13°C gelieren, extrudierte

Dispersionen dagegen nicht, kann aufgrund der sehr unterschiedlichen Teilchen-

größen davon ausgegangen werden, dass neben der Art der Energieeintragung die

Liposomengröße, im speziellen der Feinanteil an Liposomen und Lipidpartikeln,

einen entscheidenden Faktor für die Nanotube-Entstehung darstellt. In Kapitel 3.2.3

(Abb. 24) wurde bereits nachgewiesen, dass große Lipidpartikel bzw. ausgedehnte

lamellare Lipidstrukturen keine Vorstufe der Nanotubes darstellen. Deshalb wurde im

Folgenden untersucht, wie sich die Verringerung der Liposomengröße auf die

Lagerstabilität auswirkt.

100 nm 100 nm 100 nm

A B C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

48

3.2.3.2 . Beeinflussung der Gelbildungsneigung durch Variation der Her- stellungsparameter

3.2.3.2.1 . Extrusion

Mittels Extrusion durch 50 nm Membranen (statt durch 200 nm wie bisher) ist es

möglich, die Ausgangsteilchengröße und nachfolgend die Lagerstabilität der Disper-

sionen bei 13°C deutlich herabzusetzen. Für diese Untersuchungen wurde das

Phospholipid DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) in 10%iger (m/m) Konzentration verwen-

det. Die ermittelten Teilchengrößen sind daher nicht direkt mit denen der bisher be-

schriebenen Proben vorheriger Kapitel vergleichbar, da diese mit einer anderen

DMPC-Charge (MA 040722 Astra Arcus) hergestellt wurden. Zum direkten Vergleich

der Dispersionseigenschaften wurde parallel eine Dispersion mittels Hochdruck-

homogenisation (8 x 500 bar / 40°C) hergestellt. In Kapitel 3.2.4 wird auf die abwei-

chenden Dispersionseigenschaften in Abhängigkeit von der verwendeten Lipid-Char-

ge eingegangen.

Herstellungsmethode E1: Extrusion 8 x 200 nm / 40°C

E2: Extrusion 8 x 200 nm + 8 x 50 nm /

40°C

Hochdruck-homogenisation

(8 x 500 bar) / 40°C Mittlere PCS Teilchen-größe (z-Average) / Polydsipersitätsindex

111 nm / 0,14 70 nm / 0,25 77 nm / 0,24

Breite der Teilchen-größenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung)

Bimodal (22 26 nm;

101 148 nm)

Trimodal (12 21 nm; 49 87 nm;

124 224 nm)

Tetramodal (9 35 nm;

35 174 nm; 343 678 nm;

1340 4175 nm) Makroskopisches

Aussehen nach der Herstellung

Weißlich-trüb, durchscheinend und

homogen


homogen


homogen

Nach 2 Wochen bei 13°C

Unverändert Bodensatz wie ein Teppich verdichtet, nach

Aufschütteln stückig inhomogen

Inhomogen: Transparente Gelklumpen

Nach 6 Wochen Unverändert Inhomogen: Transparente Gelklumpen

Vollständig inhomogen

Nach 12 Wochen Sehr wenig feinflockiger Niederschlag

Unverändert Unverändert

Nach 29 Wochen Unverändert Unverändert Unverändert

Tab. 6 : Durchschnittliche Teilchengrößen und Polydispersitätsindices (PCS mit z-Average Auswer-tung) sowieTeilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) nach der Herstellung und makro-skopische Stabilität bei 13°C von unter verschiedenen Bedingungen extrudierten Dispersionen im Vergleich zu einer hochdruckhomogenisierten Dispersion. Alle Dispersionen wurden mit DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) hergestellt. Dispersion E1 (8 x 200 nm) ist im Vergleich zu den anderen beiden Dispersionen etwas weniger durchscheinend. Die Messwerte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass durch Verwendung der 50 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

49

Membran der Feinanteil an Liposomen deutlich zugenommen hat und ein Teil der

Vesikel kleiner als 50 nm ist (Abb. 28 B, C), was auch durch die über PCS ermittelten

Werte für die Breite der Verteilung (MSD-Auswertung) bestätigt wird (Tab. 6).

Abb. 28 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen von extrudierten DMPC-Dispersionen direkt nach der Her-stellung. A) Extrusion 8 x 200 nm/ 40°C, Übersichtsaufnahme; B) Extrusion 8 x 200 nm und an-schließend 8 x 50 nm, Übersichtsaufnahme; C) Detailansicht von B. Durch die zusätzliche Extrusion durch Membranen mit 50 nm Porendurchmesser hat sich der Feinanteil deutlich erhöht. Nahezu alle Liposomen sind kleiner als 100 nm, daneben existieren auch kleinste Lipidpartikel mit Größen unter 20 nm.

Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Wahl kleinerer Porendurchmesser bei der

Extrusion Dispersionen mit einem höheren Feinanteil an Liposomen bzw. Lipidparti-

keln hergestellt werden können, wobei die erzielten Teilchengrößen im Durchschnitt

etwas größer sind als die, die während der Hochdruckhomogenisation entstehen. Die

durch 50 nm Membranen extrudierten Proben zeichnen sich im Vergleich zu den

durch 200 nm Membranen extrudierten Proben durch eine deutlich verschlechterte,

im Vergleich zu den hochdruckhomogenisierten Proben durch eine etwas bessere

Lagerstabilität aus, was sich nach etwa 2 Wochen bei 13°C in einer teilweisen

Gelierung der Dispersionen äußert. Im stückigen Niederschlag konnten mittels Trans-

missionselektronenmikroskopie Nanotubes nachgewiesen werden (hier nicht ge-

zeigt).

3.2.3.2.2 . Hochdruckhomogenisation

Wie bei der Extrusion ist es auch bei der Hochdruckhomogenisation möglich, die

Gelbildung hier durch Erhöhung des Homogenisierdruckes - zu forcieren. Während

bei der Verwendung des DMPC der Charge 1 unter Standardbedingungen (8x

500 bar/ 40°C) nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C lediglich inhomogen-stückige

Systeme entstehen, wird durch Drucksteigerung auf 1000 bar im selben Zeitraum

und bei 1400 bar bereits nach 3 Wochen eine komplette Gelierung der Probe er-

100 nm 100 nm

A B C

50 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

50

reicht. Abb. 29 stellt dar, wie sich die mittlere Teilchengröße (z-Average) der

Dispersionen in Abhängigkeit vom Homogenisierdruck verändert. Die Verkleinerung

der mittleren Teilchengröße durch Druckerhöhung korreliert mit der gesteigerten

Gelierungsneigung der Dispersionen.

Abb. 29 : Veränderung der mittleren Teilchen-größen (PCS mit z-Average Auswertung) 10%iger DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit vom Homo-genisierdruck bei der Hochdruckhomogenisation. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.

Anhand der Grafiken der MSD-Auswertung wird die Zunahme an Liposomen und

Lipidpartikeln mit Größen unter 50 nm mit zunehmendem Homogenisierdruck

verdeutlicht (Abb. 30). In allen Proben verbleiben neben diesen sehr kleinen Partikeln

auch große Teilchen mit bis zu mehreren µm Größe.

Abb. 30 : Auswertung von PCS-Daten mittels MSD-Methode von frisch hergestellten 10%igen DMPC-Dispersionen nach Hochdruckhomogeni-sation unter verschiedenen Drücken. Die Teil-chengrößen sind logarithmisch aufgetragen. Die Balken stellen die Anzahl an Partikel in der entsprechenden Größenklasse dar, während die Kurven die Summenverteilung darstellen.

Die Transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen der entstandenen

Gele zeigen, dass der erhöhte Homogenisierdruck keinen Einfluss auf die Morpholo-

8 x 500 bar 8 x 1000 bar

8 x 1400 bar

400 600 800 1000 1200 1400

30

40

50

60

70

80

Mitt

lere

Tei

lche

ngrö

ße (z

-Ave

rage

) / n

m

Homogenisierdruck (bar)

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

51

gie der Nanotubes hat (Abb. 31). Weit ausgedehnte Nanotubenetzwerke sind trotz

Verdünnung häufig gut erhalten anzutreffen.

Abb. 31 : TEM Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) eines Gels nach 5-wöchiger Lagerung bei 13°C (Herstellung der Dispersion mittels Hochdruckhomogenisation, 8 x 1400 bar / 40°C). Die Morphologie der Nanotubes ist auch bei diesem hohen Herstellungsdruck unverändert. Dominierend sind weit ausgedehnte Nanotube-Netztwerke. Die in der Dispersion verbleibenden Liposomen sind zwischen 40 und 150 nm groß.

Während neben den Nanotubes weiterhin größere Liposomen (zwischen 50 nm

und 150 nm) im Gel vorhanden sind, werden nahezu keine kleinen Lipidpartikel

(< 20 nm) gefunden, wie sie direkt nach der Herstellung vorliegen (vergleiche

Abb. 27 A bzw. Abb. 30).

3.2.3.2.3 . Ultraschall

Zum Abschluss dieser Versuchsreihe sollte geprüft werden, ob bei der Dispergierung

mittels Ultraschall ein vergleichbarer Zusammenhang zwischen dem Energieeintrag

während der Herstellung (und damit der Liposomengröße) und der Gelierungs-

neigung besteht. Als Beschallungszeiten wurden 10 Minuten bzw. 30 Minuten ge-

wählt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Abb. 32 und Tab. 7 dargestellt.

Die MSD-Auswertung der PCS-Daten ergab, dass nach 10 Minuten Ultraschall Teil-

chengrößen zwischen 20 und 161 nm entstehen, während nach 30 Minuten Ultra-

schall zusätzlich eine Population kleinster Partikel mit Größen zwischen 8 und 15 nm

gebildet wird.

A B

1 µm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

52

Abb. 32 : Vergleich der Entwicklung der durchschnittlichen Teilchengrößen (LD/PIDS: Laserdiffrakto-metrie mit PIDS gekoppelt; PCS mit z-Average-Auswertung) und des Polydispersitätsindex von zwei verschiedenen, durch Ultraschall hergestellten DMPC-Dispersionen in Abhängigkeit von der Lager-dauer bei 13°C. Die Veränderung des makroskopischen Erscheinungsbildes ist in Tab. 7 zusammen-gefasst. Im Fall von inhomogenen Proben (siehe Tab. 7) wurde nur noch der flüssige Überstand zur Vermessung herangezogen, nach 3 Wochen wurden die Teilchengrößenmessungen wegen zu starker Inhomogenität abgebrochen.

Bei der Betrachtung des Überstandes (Abb. 32) fällt auf, dass es bereits innerhalb

der ersten Woche bei beiden Dispersionen unabhängig von der Ausgangsteilchen-

größe zu einem Anstieg der mittleren Teilchengröße auf etwa 80 nm bis 90 nm (ab-

hängig von der genutzten Meßmethode) kommt. Dieser Wert vergrößert sich nach-

folgend nur noch wenig auf etwa 95 nm bis 105 nm.

10 Minuten Ultraschall / 40°C 30 Minuten Ultraschall / 40°C

Direkt nach der Herstellung

Stark durchscheinend, wenig trüb Sehr stark durchscheinend, fast klar

1 Woche Unverändert Minimale Inhomogenität am Boden (kleine Flocken)

3 Wochen Inhomogen: Probe enthält einige Stückchen

Stückig-inhomogener Bodensatz

9 Wochen Probe komplett stückig-inhomogen Vollständig geliert

13 Wochen Probe komplett stückig-inhomogen, am Boden verfestigt

Vollständig geliert

Tab. 7 : Veränderung des makroskopischen Erscheinungsbildes zweier durch Ultraschall hergestellter DMPC-Dispersionen im Verlauf der Lagerung bei 13°C. Eine Ultraschallbehandlung über 30 Minuten führt zu einer erhöhten Instabilität, die nach 9 Wochen in eine vollständige Verfestigung mündet.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Größe der neben den

entstandenen Nanotubes verbliebenen Liposomen zwischen 50 nm und 200 nm liegt

(Abb. 33). Dagegen sind auch hier, wie schon bei den hochdruckhomogenisierten

und extrudierten Proben, die sehr kleinen Liposomen bzw. Lipidpartikel nicht mehr

vorhanden.

0 1 2 30,00,10,20,3

30405060708090

100P

olyd

ispe

rsitä

t / P

artik

elgr

ößen

(nm

)

Lagerdauer bei 13°C (Wochen)

LD/PIDS-Partikelgrößen PCS-Partikelgrößen

Polydispersitätsindex

0 1 2 30,00,10,20,3

30405060708090

100110

Pol

ydis

pers

itäts

inde

x /

Par

tikel

größ

en (n

m)

Lagerdauer bei 13°C (Wochen)

LD/PIDS Partikelgrößen PCS-Partikelgrößen

Polydispersitätsindex

10 min Ultraschall 30 min Ultraschall

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

53

Abb. 33 : TEM-Aufnahmen von mittels Ultraschall hergestellten DMPC-Dispersionen nach 7 Wochen Lagerung bei 13°C. Abgebildet sind die neben den Nanotubes verbliebenen Liposomen. A) Dispergie-rung mittels 10 Minuten Ultraschall; B) Dispergierung mittels 30 Minuten Ultraschall.

3.2.3.2.4 . Zusammenfassung

Als Ergebnis der in diesem Kapitel beschriebenen Untersuchungen lässt sich

zusammenfassen, dass ein eindeutiger Zusammenhang zwischen der Teilchengröße

der Dispersionen und ihrer Neigung zur Gelierung bzw. Nanotube-Entstehung be-

steht. Aus den gezeigten Daten geht hervor, dass mit großer Wahrscheinlichkeit der

Anteil an kleinen Liposomen (deutlich kleiner als 100 nm) und Lipidpartikeln

(< 20 nm) entscheidend für die Nanotube-Entstehung sind, da extrudierte Disper-

sionen, denen dieser Feinanteil fehlt, nahezu keine Nanotubes ausbilden und keine

Gelierung zeigen. Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Nanotubebildung gezielt

durch Variation der Herstellungsparameter zu fördern bzw. zu unterdrücken. In

einem abschließenden Vergleich der Herstellungsverfahren lässt sich folgende

Reihenfolge bezüglich der Gelbildungstendenz aufstellen:

Extrusion Hochdruck-homogenisation

Ultra-schall

Ultra-schall



8 x 200 nm

8 x 200 nm + 8 x 50 nm

8 x 500 bar 10 min 30 min 8 x 1000 bar 8 x 1400 bar

Abb. 34 : Übersicht über den Zusammenhang zwischen Herstellungsmethode und Herstellungs-bedingungen und der Neigung der Dispersionen zur Gelbildung.

Zunahme der Gelbildungstendenz

100 nm 100 nm

A B

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

54

3.2.4 . Einfluss verschiedener DMPC-Chargen auf die Gelbildungstendenz

Im Folgenden wird vorgestellt, wie sich die Verwendung unterschiedlicher DMPC-

Chargen auf die Liposomengröße sowie Gelierungsneigung und Nanotube-Ent-

stehung der Dispersionen auswirkt. Von der Firma Astra standen verschiedene

DMPC-Chargen zur Verfügung, zusätzlich wurde DMPC der Firma Lipoid für die

Untersuchungen herangezogen (siehe Kap. 2.1.1.). Zum Vergleich wurden alle Di-

spersionen mit 10% (m/m) DMPC mittels Hochdruckhomogenisation bei 8 x 500 bar /

40°C hergestellt. Die Ergebnisse für die Lipide 1 (100/93 Astra Arcus) und 5 (MA

040722 Astra Arcus) wurden ausführlicher bereits in den vorangegangenen Kapiteln

(3.1.1 und 3.2.3) dargelegt. Weiterhin wurden DMPC 2 (562191-1, Lipoid), DMPC 3

(201/92, Astra Arcus) und DMPC 3 (200/92, Astra Arcus) verwendet.

Trotz gleicher Prozessführung resultieren Dispersionen mit unterschiedlichen Eigen-

schaften (Abb. 35): Die DMPC-Chargen 3 und 4 ergaben stark durchscheinende Di-

spersionen mit mittleren Teilchengrößen von deutlich weniger als 100 nm, während

die DMPC-Chargen 1, 2 und 5 weiße und wenig durchscheinende Dispersionen mit

mittleren Teilchengrößen von 100 nm und mehr ergaben. Verfolgt man die Lager-

stabilität der Dispersionen bei 13°C, so ergibt sich der überraschende Befund, dass

die Chargen, die kleinere mittlere Partikelgrößen aufweisen, eine geringere Neigung

zur Gelbildung zeigen: Während bei Dispersionen der Chargen 2 und 5 nach 3

Wochen ein Gel gebildet wird, bildet Charge 1 im selben Zeitrahmen nur stückig-

inhomogene Systeme. Bei den Chargen 3 und 4 ist der Effekt noch schwächer

ausgeprägt, nach erst 5 bzw. 6 Wochen treten stückig-inhomogene Niederschläge

auf. Das beschriebene Ausmaß der Gelbildung ändert sich im Verlauf einer 12-

monatigen Lagerung bei 13°C nicht.

Als Ursache für die beobachteten Unterschiede in den Eigenschaften der Disper-

sionen sind Reinheitsunterschiede zwischen den Chargen wahrscheinlich. So schei-

nen vor allem die Chargen 3 und 4 Substanzen zu enthalten, die eine stärkere

Krümmung der DMPC-Bilayer ermöglichen und damit kleinere Partikelgrößen stabili-

sieren. Desweiteren tragen die Verunreinigungen zu einer erhöhten Lagerstabilität

der Liposomen bei, was sich in einer verminderten Nanotube-Bildung und damit einer

verzögerten und abgeschwächten Gelierung äußert. Die Ergebnisse der Reinheits-

untersuchungen, die zur Klärung dieses unterschiedlichen Verhaltens der Disper-

sionen in Abhängigkeit von der verwendeten DMPC-Charge beitragen, sind in Kapitel

3.3. ausgeführt.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

55

Charge Makroskopischen Aussehen direkt nach der Herstellung (8x 500 bar, 40°C)

DMPC 1 Weißlich-trüb, durchscheinend

DMPC 2 Weiß, wenig durchscheinend

DMPC 3 Weißlich- trüb, stark durch-scheinend

DMPC 4 Weißlich-trüb, sehr stark durch-scheinend

DMPC 5 Weiß, wenig durchscheinend

Abb. 35 : Zusammenhang zwischen der verwendeten DMPC-Charge und dem makroskopischen Aussehen (siehe Tabelle), der durchschnittlichen Teilchengröße (ermittelt über PCS [z-Average]) und der Gelbildungsneigung (siehe Diagramm) bei 13°C Lagertemperatur. Die Herstellung erfolgte über Hochdruckhomogenisation, 8 x 500 bar / 40°C. Im Diagramm ist neben der Teilchengröße aufge-tragen, nach wie viel Wochen deutliche makroskopische Anzeichen der Gelierung der Dispersionen festzustellen waren. Es wird darauf hingewiesen, dass die Zeitangaben ungefähre Werte darstellen (± 3 Tage) und die Ausprägung der Gelierung stark differiert: DMPC 2 und 5 bilden Gele, DMPC 1 stückig-inhomogene Dispersionen und DMPC 3 und 4 lediglich stückige Niederschläge.

In allen Fällen konnten in den Gelen bzw. entsprechenden Niederschlägen Nano-

tubes nachgewiesen werden (hier nicht gezeigt). Für die nachfolgenden Untersu-

chungen zum Einfluss von Konservierungsmitteln und Lipid-Zusätzen auf die Nano-

tube- und Gelbildung wurde die Charge 1 verwendet, da die Chargen 2 und 5 nicht

mehr in ausreichender Menge vorhanden waren und die Chargen 3 und 4 nur eine

schwache Gelbildung zeigten.

3.2.5 . Einfluss von Konservierungsmitteln auf die Eigenschaften 10%iger DMPC-Dispersionen

Um auszuschließen, dass das Phänomen der Nanotube-Entstehung auf die An-

wesenheit von Thiomersal (bisher standardmäßig als Konservierungsmittel der Was-

serphase in einer Konzentration von 0,01% (m/V) eingesetzt) zurückzuführen ist,

wurden DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel hergestellt und die Lagersta-

bilität sowie die Ultrastruktur der Systeme untersucht. Von Interesse war weiterhin

die Frage, inwieweit sich eine höhere Thiomersalkonzentration und die Verwendung

anderer Konservierungsmittel auf die Gelierung der Dispersionen und die Ultrastruk-

tur der Nanotubes bei 13°C auswirken. Als alternative Konservierungsmittel wurden

Natriumazid und eine Mischung von Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxy-

benzoat eingesetzt (Abb. 36). Alle Dispersionen enthielten 10% (m/m) DMPC 1

(100/93, Astra Arcus). Die Hydratation des Lipid-Pulvers erfolgte über 2 Tage bei

DMPC 1 DMPC 2 DMPC 3 DMPC 4 DMPC 52

4

6

DMPC-Charge

Gel

ieru

ng (W

oche

n)(S

ymbo

l: D

reie

ck)

40

60

80

100

120

140

Durchschn. Teilchengröße (nm

) (Sym

bol: Kreis)

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

56

40°C, die Dispergierung wurde mittels Hochdruckhomogenisation mit dem Micron

Lab 40 über 8 Zyklen mit 500 bar bei 40°C durchgeführt.

Abb. 36 : Chemische Struktur der verwendeten Konservierungsmittel.

3.2.5.1 . DMPC-Dispersionen ohne Konservierungsmittel

Mit Hilfe der DSC am hydratisierten Bulkmaterial wurde nachgewiesen, dass sowohl

bei An- als auch bei Abwesenheit von Thiomersal zur Konservierung der wässrigen

Phase identische DSC Heizkurven resultieren (Daten nicht gezeigt). Daher ist davon

auszugehen, dass der Verzicht auf Thiomersal in der Rezeptur keine entscheidenden

Veränderungen im Verhalten der Dispersionen bedingt. Der pH-Wert des demine-

ralisierten Wassers betrug 6,5.

Die Eigenschaften der Dispersion sind in Tab. 8 zusammengefasst.

Makroskopisches Aussehen Weißlich-durchscheinend und homogen

Mittlere Teilchengröße (PCS: z-Average) 53 nm

Polydispersitätsindex 0,31

Teilchengrößenverteilung (PCS: MSD-Auswertung)

Trimodal (9 16 nm; 23 - 48 nm; 99 179 nm)

Mittlere Teilchengröße und Teilchengrößenverteilung (LD/PIDS)

82 nm (Monomodal zwischen 40 und 200 nm)

Tab. 8 : Überblick über die Eigenschaften einer frisch hergestellten 10%igen DMPC-Dispersion ohne Konservierungsmittelzusatz. Die Werte stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar. Eine Gefrierbruch-TEM Aufnahme der Dispersion ist in Abb. 37 A abgebildet.

Die elektronenmikroskopischen Gefrierbruchaufnahmen (Abb. 37 A) zeigen neben

einer Population mittelgroßer Liposomen (65 bis 90 nm), etwa ebenso viele sehr

kleine Partikel (Durchmesser ≤ 20 nm) und nur vereinzelt findet man sehr große

Vesikel (Durchmesser > 200 nm).

NaN3

Thiomersal Natriumazid Propyl-4-hydroxybenzoat Methyl-4-hydroxybenzoat

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

57

Bei den mittelgroßen Liposomen ist eine deutliche polyedrische Oberflächenstruktu-

rierung zu erkennen. Die sehr großen Vesikel zeigen Ripple Strukturierung.

Abb. 37 : Elektronenmikroskopische Aufnahmen einer 10%igen DMPC-Dispersion in konservierungs-mittelfreiem Wasser. A) Gefrierbruch-Aufnahme der Dispersion direkt nach der Herstellung (Hoch-druckhomogenisation mit Micron Lab 40, 8 x 500 bar / 40°C); B) und C) Negative Staining Präpara-tion (Uranylacetat) des stückig-inhomogenen Systems nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C.

Nach der Herstellung wurden die Proben bei 13°C, und zum Vergleich auch bei 2 -

8°C (Kühlschrank) und 23°C gelagert.

Bereits zwei Wochen nach der Herstellung zeigen die bei 13°C gelagerten Proben

eine zunehmende Trübung und mittels LD/PIDS wird eine sehr breite bimodale Teil-

chengrößenverteilung zwischen 40 nm und 8 µm detektiert. Nach 4-wöchiger Lage-

rung bei 13°C sind die Proben durchweg gelig-stückig inhomogen, weitere Teilchen-

größenmessungen sind unmöglich. Die Negative Staining Präparation dieser Gel-

stückchen zeigt die Anwesenheit der typisch strukturierten Nanotubes (Abb. 37 B),

die auch in Knäulen verschlungen anzutreffen sind (Abb. 37 C). Es ergibt sich also

das gleiche Bild wie bei den Proben, die 0,01% Thiomersal zur Konservierung

enthielten. Bei den im Kühlschrank (2 - 8°C) gelagerten Proben zeigt sich ein

ähnliches, jedoch im Vergleich zu den bei 13°C gelagerten Proben stark abge-

schwächtes Verhalten: Erst nach 10 Wochen tritt ein stückig-inhomogener Nieder-

schlag auf und nach Negative Staining Präparation des Bodensatzes finden sich

auch hier Nanotubes, wie sie bei den 13°C-Proben (vgl. Abb. 37 B, C) aufgetreten

sind.

Kritisch zu bemerken ist in diesem Versuch sicher das Fehlen einer Konservierung,

da keine anderen keimmindernden Verfahren eingesetzt wurden. Die bei 23°C

gelagerten Proben zeigen bereits nach 2 Wochen erste Anzeichen eines mikrobiellen

Befalls, der nach 4 Wochen in dick-weiße inhomogene Systeme mündet, an denen

keine weiteren Untersuchungen vorgenommen wurden.

Abschließend lässt sich jedoch feststellen, dass eine Beteiligung von Thiomersal an

100 nm 100 nm 100 nm

A B C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

58

0 5 10 15 20 25 30 35 40

2,50

2,55

2,60

2,65

2,70

2,75

2,80

2,85

Hea

t Flo

w E

ndo

Up

(mW

)

Temperatur (°C)

0,01% Thiomersal

0,1% Parahydroxy-benzoesäureester

der Ausbildung der tubulären Strukturen ausgeschlossen werden kann. Auch ohne

Thiomersal entstehen während der Lagerung bei 13°C gelige Stückchen, die bei

elektronenmikroskopischer Untersuchung die typischen Nanotubes als Bausteine

eines Gelgerüstes aufweisen.

3.2.5.2 . Konservierung mit einem Gemisch aus Propyl-4-hydroxybenzoat und Methyl-4-hydroxybenzoat im Verhältnis 1:3 (m/m) Als alternatives Konservierungsmittel wurde ein Gemisch aus einem Teil Propyl-4-

hydroxybenzoat und drei Teilen Methyl-4-hydroxybenzoat in 0,1%iger (m/m) Konzen-

tration eingesetzt. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 5,7. Mittels DSC wurde

nach der Quellungsdauer von 2 Tagen geprüft, ob die Parahydroxybenzoesäureester

das Phasenverhalten des vollständig hydratisierten Lipids beeinflussen (Abb. 38).

Abb. 38 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tagen Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase kon-serviert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,1% Para-hydroxybenzoesäureestern.

Anhand der DSC-Heizkurven ist ersichtlich, dass die Parahydroxybenzoesäureester

einen deutlichen Einfluss auf das Phasenverhalten des DMPC haben. Der Vorüber-

gang (Tp(Onset) = 7,2°C) und auch der Hauptübergang (Tm(Onset) = 22,7°C) sind gegen-

über den mit Thiomersal konservierten Proben zu niedrigeren Temperaturen ver-

schoben. Weiterhin kommt es zu einer Peakverbreiterung. Daher ist davon

auszugehen, dass es zu Wechselwirkungen zwischen den Parahydroxybenzoesäure-

estern und den DMPC-Molekülen kommt, was ein verändertes Verhalten der

Dispersionen erwarten lässt.

In Tab. 9 sind die Eigenschaften der Dispersion nach der Herstellung zusammen-

gefasst.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

59

Makroskopisches Aussehen Weiß-gräulich durchscheinend und homogen




Trimodal (17 48 nm; 89 248 nm; 846 1564 nm)


92 nm (Monomodal zwischen 40 und 200 nm)

Tab. 9 : Eigenschaften einer mit 0,1% Parahydroxybenzoesäureestern konservierten DMPC-Disper-sion direkt nach der Herstellung über Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar / 40°C).

Nach 2-wöchiger Lagerung bei 13°C bildet sich zunächst ein sehr dünner Nieder-

schlag aus. Dieser verdichtet sich nach 4 Wochen zu einem flockigen Bodensatz. Die

Teilchengrößenmessungen mittels LD/PIDS detektieren allerdings trotz Aufschüttelns

des Bodensatzes lediglich die kleinen Liposomen und zeigen eine monomodale

Verteilung zwischen 40 nm und 200 nm mit einer mittleren Teilchengröße von

116 nm an. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen des Bodensatzes zei-

gen Nanotubes (Abb. 39).

Abb. 39 : Transmissionselektronenmikrosko-pische Aufnahme (Negativkontrastierung mit Uranylacetat) des Bodensatzes einer bei 13°C gelagerten 10%igen DMPC-Disper-sion, die mit Parahydroxybenzoesäureestern konserviert wurde.

Die Lagerung bei 2 - 8°C verursacht nach etwa 4 Wochen ebenfalls die Bildung eines

flockigen inhomogenen Niederschlages, auch hier konnten Nanotubes detektiert wer-

den.

Somit lässt sich festhalten, dass auch bei der Verwendung von Parahydroxybenzoe-

säureestern in 0,1%iger Konzentration zur Konservierung bei 13°C und auch 2 - 8°C

innerhalb von 4 Wochen Nanotubes gebildet werden, was makroskopisch zur Bildung

flockig inhomogener Niederschläge führt. Wegen beschränkter Lagerkapazitäten

wurden die Proben jedoch nicht über einen längeren Zeitraum beobachtet.

3.2.5.3 . Konservierung mit 0,05% (m/m) Natriumazid

Weiterhin wurde Natriumazid in einer Konzentration von 0,05% (m/m) zur Konser-

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

60

0 5 10 15 20 25 30 35 40

1,90

1,95

2,00

2,05

2,10

2,15

2,20

2,25

Hea

t Flo

w E

ndo

Up

(mW

)

Temperatur (°C)

0,01% Thiomersal

0,05% Natriumazid

vierung eingesetzt. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 7,5. Die thermo-

analytischen Untersuchungen (Abb. 40) des über 2 Tage hydratisierten Bulkmaterials

ergaben keine Beeinflussung des Phasenverhaltens im Vergleich zu Bulkmaterial,

welches mit 0,01% Thiomersal konserviert wurde. Das Peakmaximum des Vorüber-

gangs ist leicht zu höheren Temperaturen verschoben. Die Onset-Werte der Phasen-

übergänge (14,0°C für den Vorübergang und 24,1°C für den Hauptübergang) sind

mit denen der thiomersalhaltigen Proben (13,9°C für den Vorübergang und 24,1°C

für den Hauptübergang) vergleichbar. Die Peakbreite bleibt unverändert.

Abb. 40 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tagen Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase konser-viert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,05% Natriumazid.

Die Eigenschaften der frisch hergestellten Dispersion sind in Tab. 10 zusammen-

gefasst.

Makroskopisches Aussehen Weißlich-durchscheinend




Trimodal (18 29 nm; 58 103 nm; 184 326 nm)


Nicht bestimmt

Tab. 10 : Eigenschaften einer mit 0,05% Natriumazid konservierten 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar / 40°C).

Nach zweiwöchiger Lagerung bei 13°C bildete sich ein Niederschlag aus, der sich

nach 4 Wochen zu einem dick-flockigen Bodensatz ausweitete. Die elektronen-

mikroskopische Untersuchung des flockigen Bodensatzes mittels Negative Staining

zeigt deutlich die Anwesenheit von Nanotubes, die in Netzwerken verflochten vor-

liegen (Abb. 41 A).

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

61

Abb. 41 : Transmissionselektro-nenmikroskopische Aufnahme (Negative Staining mit Uranyl-acetat) von 10%igen DMPC-Dispersionen nach 9 Wochen Lagerung, Konservierung mit 0,05% Natriumazid. A) Lagerung bei 13°C; B) Lagerung bei 2 - 8°C.

Das gleiche Verhalten zeigen Dispersionen, die bei 2 - 8°C gelagert wurden. Sie sind

hinsichtlich des makroskopischen Erscheinungsbildes und der Teilchengrößenver-

teilung kaum von den bei 13°C gelagerten Dispersionen zu unterscheiden. Die elek-

tronenmikroskopische Untersuchung bestätigt die Vermutung, dass auch hier Nano-

tubes zur Bildung der flockigen Niederschläge geführt haben (Abb. 41 B).

Damit konnte gezeigt werden, dass auch bei Anwesenheit von 0,05% (m/m) Natrium-

azid zur Konservierung Nanotubes entstehen, die die Grundlage für flockige Boden-

sätze bilden. Nach 2 Monaten wurde die Lagerung wegen mangelnder Lagerkapa-

zität abgebrochen. Daher sind keine Aussagen dazu möglich, ob es mit der Zeit zu

einer vollständigen Gelierung des Systems kommt.

3.2.5.4 . Konservierung mit 0,1% Thiomersal Da Thiomersal als organisches Molekül (siehe Abb. 36) mit den Bilayern interagieren

könnte sollte geklärt werden, ob die Erhöhung der Thiomersalkonzentration um das

zehnfache die Nanotube-Bildung beeinflusst. Dazu wurden Dispersionen mit 0,1%

(m/m) Thiomersal konserviert (d.h. auf 60 DMPC-Moleküle kommt ein Thiomersal-

Molekül).

Anhand der DSC-Daten ist kein Einfluss der höheren Thiomersalkonzentration auf

das Phasenverhalten des DMPC erkennbar (Abb.42).

Abb. 42 : DSC-Heizkurven von vollständig hy-dratisiertem DMPC nach 2 Tage Quellung bei 40°C. Obere Kurve: Wässrige Phase konser-viert mit 0,01% Thiomersal; untere Kurve: Wässrige Phase konserviert mit 0,1% Thio-mersal.

0 5 10 15 20 25 30 35 402,05

2,10

2,15

2,20

2,25

2,30

2,35

0,01% Thiomersal

0,1% Thiomersal

Hea

t Flo

w E

ndo

Up

Temperatur (°C)

A B

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

62

Um die Gelierung und Nanotubebildung zu beschleunigen, wurde die Dispergierung

mit dem Hochdruckhomogenisator über 8 Zyklen bei 8 x 500 bar und anschließend

weiteren 6 Zyklen bei 1400 bar durchgeführt. Die Eigenschaften der frisch herge-

stellten Dispersion sind in Tab. 11 zusammengefasst.

Makroskopisches Aussehen Stark durchscheinend, homogen




Trimodal (11 31 nm; 50 121 nm; 470 929 nm)

Tab. 11 : Eigenschaften einer mit 0,1% Thiomersal konservierten 10%igen DMPC-Dispersion direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 500 bar und 6 x 1400 bar / 40°C).

Nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C hat sich ein gelig fester Pfropf mit flüssigem

Überstand gebildet. Die Teilchengröße des stark durchscheinenden Überstandes

wurde mittels PCS auf 82 nm (z-Average) mit einem Polydispersitätsindex von 0,13

bestimmt. Die elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigt das Vorhandensein

der Nanotubes in dem gelig verfestigten Teil der Probe (Abb. 43). Daneben finden

sich auch Liposomen, die ≤ 100 nm sind.

Abb. 43 : Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (Negative Staining mit Uranylacetat) einer gelierten DMPC-Dispersion nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C; Konservierung mit 0,1% Thiomersal.

Die Ergebnisse zeigen, dass auch höhere Thiomersalkonzentrationen die Gelbildung

und Nanotubeentstehung bei 13°C weder fördern noch behindern.

3.2.5.5 . Zusammenfassung Aus den dargestellten Ergebnissen geht hervor, dass die Bildung der Nanotubes

nicht durch Konservierungsmittel beeinflusst wird. Bei allen untersuchten Konservie-

rungsmittelzusätzen und auch bei konservierungsmittelfreien Dispersionen konnten

nach 2 bis 4 Wochen Lagerung bei 13°C sichtbare Anzeichen einer Gelbildung in

Form von flockig-stückigen Bodensätzen beobachtet werden. Die elektronenmikro-

100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

63

skopische Untersuchung dieser Bodensätze wies in allen Fällen die Anwesenheit der

Nanotubes nach. Veränderungen in der Morphologie der Nanotubes wurden nicht

festgestellt. Aufgrund der Inhomogenität der Proben und der notwendigen Ver-

dünnung im Zuge der Negative Staining Präparation war es nicht möglich, Unter-

schiede in der Quantität der Nanotubes oder deren Länge in Abhängigkeit vom Kon-

servierungsmittel zu detektieren.

3.2.6 . Einfluss des Zusatzes von Lipiden auf Lagerstabilität und Ultrastruktur von 10%igen DMPC-Dispersionen

Ziel der folgenden Untersuchungen war es zu klären, welchen Einfluss der Zusatz

von lipidartigen Verunreinigungen auf die Gelierung und Nanotubebildung in 10%igen

DMPC-Dispersionen bei 13°C hat. Alle Dispersionen für diese Versuchsreihe wurden

mit DMPC 1 (100/93 Astra Arcus) hergestellt. Um die Gelierung zu forcieren, erfolgte

die Dispergierung des hydratisierten Lipids mit dem Hochdruckhomogenisator über 8

Zyklen bei 1000 bar / 40°C.

3.2.6.1 . Die Referenz-Dispersion aus reinem DMPC Zum direkten Vergleich wurde eine reine DMPC-Dispersion unter denselben Be-

dingungen hergestellt. Die Eigenschaften der frisch hergestellten Dispersion sind in

Tab. 12 zusammengefasst.

Makroskopisches Aussehen Weißlich, stark durchscheinend




Trimodal (7 61 nm [> 95%]; 147 282 nm; 1041 2483 nm)


78 nm Monomodal 40 200 nm

Tab. 12 : Eigenschaften einer 10%igen DMPC-Disperision direkt nach der Herstellung mittels Hoch-druckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C).

Die elektronenmikroskopische Untersuchung (Abb. 44 A) zeigt hauptsächlich sehr

kleine Liposomen mit Durchmessern von weniger als 70 nm und Lipidpartikel mit

Größen unter 20 nm. Nach 4 Wochen Lagerung bei 13°C ist die Dispersion bereits

vollständig geliert. Im Elektronenmikroskop sind nach Negative Staining Präparation

Nanotubes in großräumigen Netzwerken zu sehen, zwischen ihnen findet man

vereinzelt Liposomen (Abb. 44 B). Der Teil der Probe, der bei 2 - 8°C gelagert wurde,

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

64

bildet nach 4 Wochen einen flockigen, teppichartig zusammengeballten Bodensatz.

Der Überstand ist trüb und enthält Stückchen. Die elektronenmikroskopische

Untersuchung des verfestigten Teils detektiert auch hier Nanotubes (Abb. 44 C).

Dagegen bleibt der bei 28°C gelagerte Teil der Probe durchscheinend-homogen und

niederschlagsfrei, lediglich ein dünner Schleier ist sichtbar. Die Probe wird dominiert

von Liposomen der Größenordnung 20 nm bis 100 nm (Abb. 44 D), daneben werden

vereinzelt größere Vesikel (> 150 nm) gefunden. Nanotubes sind nicht enthalten.

Abb. 44 : Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat): A) Frisch hergestellte DMPC-Dispersion; B) Gel nach 4-wöchiger Lagerung bei 13°C; C) Bodensatz nach 5-wöchigerLagerung bei 2 - 8°C; D) Dispersion nach 5-wöchiger Lagerung bei 28°C.

3.2.6.2 . Einfluss der Verunreinigungen auf das Phasenverhalten von DMPC

Neben 10% (m/m) DMPC wurden als Verunreinigungen etweder Myristinsäure, Lyso-

phosphatidylcholin oder hydriertes Soja-Lecithin (S75-3) in Konzentrationen von

0,1% (m/m) zugesetzt. Bezogen auf den Gesamtlipidgehalt entspricht das einer Kon-

zentration von 1% (m/m). Mit der niedrigen Konzentration sollte das Vorliegen dieser

Substanzen als Verunreinigung bzw. Abbauprodukte simuliert werden.

Die Substanzen wurden genau gewogen und in einer 2:1 (V/V) Mischung aus

Chloroform und Methanol vollständig gelöst. Nach Abrotieren des Lösungsmittelge-

misches unter Vakuum bei 40°C wurden die Lipidgemische mit demineralisiertem

Wasser (konserviert mit 0,01% Thiomersal) versetzt und über 2 Tage bei 40°C hy-

dratisiert.

Vor der Dispergierung wurde mittels DSC geprüft, ob die Verunreinigungen einen

Einfluss auf das Phasenverhalten des DMPC ausüben. In Abb. 45 und Tab. 13 sind

die Ergebnisse dieser Messungen zusammengefasst.

100 nm 2 µm

A B C D

100 nm 100 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

65

0 5 10 15 20 25 30 35 401,70

1,75

1,80

1,85

1,90

1,95

2,00

2,05

2,10

2,15

2,20

2,25

2,30H

eat F

low

End

o U

p (m

W)

Temperatur (°C)

DMPC1

DMPC1 + LysoPC

DMPC1 + MA

DMPC1 + S75-3

Abb. 45 : DSC-Heizkurven von hydrati-siertem DMPC unter Zusatz ver-schiedener lipidartiger Verunreini-gungen. LysoPC: Lysophosphatidyl-cholin; MA: Myristinsäure; S75-3: hy-driertes Soja-Lecithin.

Proben-bezeich-nung

Zusammen-setzung

Vorübergang TOnset (°C) ∆H(J/g)

Hauptübergang TOnset (°C) ∆H(J/g)

DMPC 1 10% DMPC 13,9 ± 0,1 0,43 ± 0,13 24,1 ± 0,05 4,05 ± 0,5

DMPC1 + LysoPC

10% DMPC 0,1% Lyso-PC

11,6 ± 0,1 0,30 ± 0,01 23,8 ± 0,05 3,45 ± 0,1

DMPC1 + MA

10% DMPC 0,1% Myristinsäure

16,3 ± 0,2 0,44 ± 0,02 24,9 ± 0,01 3,91 ± 0,03

DMPC1 + S75-3

10% DMPC 0,1% hydriertes Soja-PC

13,8 0,48 24,4 3,80

Tab. 13 : Onset-Temperaturen und Umwandlungsenthalpien von vollständig hydratisiertem DMPC unter Zusatz verschiedener lipidartiger Verunreinigungen. LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myristinsäure; S75-3: hydriertes Soja-Phosphatidylcholin; Alle Daten stellen (mit Ausnahme von S75-3) Mittelwerte aus mindestens 2 unabhängigen Einzelmessungen dar.

Der Zusatz von 0,1% hydriertem Soja-Lecithin beeinflusst das Phasenverhalten von

DMPC nicht. Dagegen führt die Zugabe von 0,1% Lysophosphatidylcholin zu einer

deutlichen Erniedrigung der Phasenübergangstemperaturen sowohl des Vor-, als

auch des Hauptübergangs. Auch die Enthalpien der Phasenübergänge werden leicht

erniedrigt. Im Gegensatz dazu bewirkt der Zusatz von Myristinsäure eine deutliche

Erhöhung der Phasenübergangstemperaturen, wobei die Enthalpien beider Phasen-

übergänge im Vergleich zum reinen DMPC keine Veränderungen erfahren.

3.2.6.3 . Eigenschaften der Dispersionen In Abb. 46 sind die Teilchengrößenverteilungen (PCS mit MSD-Auswertung) und das

makroskopische Aussehen der vier Dispersionen direkt nach der Herstellung zu-

sammengefasst.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

66

Auf die Angabe des z-Average-Wertes für die mittlere Teilchengröße wurde verzich-

tet, da dieser durch die wenigen zum Teil sehr großen Partikel verfälscht wird und

damit die wahren Teilchengrößen nur unzureichend repräsentiert.

Zusammensetzung Aussehen der Dispersionen 10% DMPC dünn-weißlich durchscheinend

10% DMPC + 0,1% Lyso-PC stark durchscheinend, fast klar

10% DMPC + 0,1% MA dünn-weißlich durchscheinend

10% DMPC + 0,1% S75-3 dünn-weißlich durchscheinend

Abb. 46 : Makroskopisches Aussehen und Teilchengrößenverteilung (PCS mit MSD-Auswertung) von DMPC-Dispersionen unter Zumischung verschiedener Verunreinigungen direkt nach der Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C). LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myri-stinsäure; S75-3: hydriertes Soja-Lecithin. In allen Dispersionen sind etwa 98% der Teilchen zwischen 5 und 50 nm groß.

Gemäß der MSD-Auswertung der PCS-Messungen sind in allen Dispersionen etwa

98% der Teilchen zwischen 5 und 50 nm groß, nur etwa 2% der Teilchen sind grö-

ßer, wobei im Falle des Lysophosphatidylcholins maximale Teilchengrößen von bis

zu 10 µm auftreten. Die elektronenmikroskopischen TEM-Aufnahmen (Negativ-

kontrastierung, Abb. 47) zeigen bei allen Dispersionen Liposomen mit Größen zwi-

10% DMPC 10% DMPC + 0,1% LysoPC

10% DMPC + 0,1% Myristinsäure 10% DMPC + 0,1% hydriertes Soja-Lecithin

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

67

DMPC + LysoPC DMPC + MA DMPC + S75-3

100 nm 100 nm100 nm

schen 20 nm und 100 nm. In den mit Lysophosphatidylcholin versetzten Proben fin-

den sich neben den Liposomen auch kleinste fadenförmige Mizellen (Abb. 48). Die

Mizellen haben eine Dicke von etwa 5 nm und eine Länge von etwa 50 nm.

Abb. 47 : TEM Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) von frisch hergestellten Dispersionen, die 10% DMPC und 0,1% Verunreinigung (LysoPC: Lysophosphatidylcholin; MA: Myristinsäure; S75-3: Hydriertes Soja-Lecithin) enthalten. Die Herstellung erfolgte über Hochdruckhomogenisation bei 8 x 1000 bar / 40°C.

Abb. 48 : Stark vergrößerter Bereich einer TEM Aufnahme (Negativkontrastierung mit Uranylacetat) einer frisch hergestellten Dispersion aus 10% DMPC und 0,1% Lysophosphatidylcholin nach Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (8 x 1000 bar / 40°C). Die Abbildung zeigt fadenförmige Mizellen, deren Dicke etwa 5 nm entspricht.

Im Verlauf der Lagerung bei 13°C kommt es innerhalb von 4 bis 5 Wochen bei den

Myristinsäure bzw. Soja-Lecithin enthaltenden Dispersionen zu einer Gelbildung, wie

sie auch in der Dispersion ohne Verunreinigung beobachtet wurde. Die Dispersion

mit Lysophosphatidylcholin wurde im selben Zeitraum viskos, blieb aber noch flüssig.

Zu einer Verfestigung kommt es hier nach insgesamt etwa 8 Wochen.

Die elektronenmikroskopischen TEM-Aufnahmen der verfestigten Systeme nach 4

Monaten sind in Abb. 49 zusammengefasst. Während der Zusatz von 0,1% Myristin-

säure (Abb. 49 B) bzw. 0,1% hydriertem Soja-PC (Abb. 49 C) keinen Einfluss auf die

Ultrastruktur der Gele hat, treten unter Zusatz von 0,1% Lysophosphatidylcholin

neben Nanotubes (Abb. 49 A1 [Pfeil a]) zwei neue Bänderstrukturen in den Vorder-

grund: Die Bänder sind verdrillt und weisen eine Breite von 20 bis 25 nm (Abb. 49 A1

25 nm

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

68

[Pfeil b] und A4) bzw. 50 bis 60 nm (Abb. 49 A1 [Pfeil c] und A3) auf. Sie sind

mehrere Mikrometer lang und ebenso wie die Nanotubes in der Lage, Netzwerke zu

bilden (Abb. 49 A2), was mit der makroskopisch beobachteten Verfestigung der

Dispersionen korreliert.

Abb. 49 : TEM-Aufnahmen (Negative Staining mit Uranylacetat) der unter Abb. 47 beschriebenen Di-spersionen nach 4 Monaten Lagerung bei 13°C. A1-A4) 10% DMPC + 0,1% Lysophosphatidylcholin; B) 10% DMPC + 0,1% Myristinsäure; C1-C2) 10% DMPC + 0,1% Hydriertes Soja-Lecithin. Die Pro-ben aus einer Mischung aus 10% DMPC und 0,1% Lysophosphatidylcholin (A1-A4) werden neben den selten auftretenden Nanotubes (A1, Pfeil a) von zwei Sorten helikal verdrillter Bänder dominiert: Die großen Bänder sind zwischen 50 und 60 nm breit (siehe A1, Pfeil c sowie A3), die schmalen Bänder haben eine Breite von etwa 20 bis 25 nm (siehe A1, Pfeil b sowie Detailansicht A4). Die Bänder sind in der Lage, ein Netzwerk auszubilden (siehe A2). Der Zusatz von Myristinsäure (B) bzw. hydriertem Soja-Lecithin (C1 und C2) hat keinen Einfluss auf die Bildung und Morphologie der Nanotubes; in diesen Proben bilden wie schon für reines DMPC beschrieben Nanotubenetzwerke die vorherrschende Struktur.

Bei einer Lagerung bei 2 - 8°C kommt es bei allen Dispersionen zu vergleichbaren In-

stabilitäten. Allerdings setzen Gelbildung bzw. Verfestigung später ein und sind

schwächer ausgeprägt (maximal 1/3 der Probe sind betroffen). Bei der Untersuchung

der verfestigten Bereiche der Probe im Transmissionselektronenmikroskop treten die

gleichen Strukturen wie bei 13°C (vgl. Abb. 49) auf.

Während der Lagerung bei 28°C kommt es im Gegensatz dazu in keinem Fall zu

100 nm 500 nm

100 nm

100 nm

A(1) A(2) A(3)

A(4)

B C(1) C(2)

100 nm 100 nm 100 nm

a

b

c

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

69

einer Gelbildung. Die Dispersionen bleiben flüssig und durchscheinend, sich ab-

setzender Niederschlag konnte mittels Elektronenmikroskopie als große Vesikel iden-

tifiziert werden (nicht gezeigt).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Myristinsäure und hydriertes Soja-Lecithin

in der verwendeten Konzentration keinen Einfluss auf die Lagerstabilität der Disper-

sionen und die Morphologie der Nanotubes haben. Dagegen bilden sich unter Zusatz

von 0,1% Lysophosphatidylcholin neue Strukturen in Form langer verdrillter Bänder

aus, die in ähnlicher Weise wie die Nanotubes zur Bildung von dreidimensionalen

Netzwerken und damit zur Gelierung der Dispersionen befähigt sind.

Aus Zeitgründen konnten der Einfluss von lipidischen Verunreinigungen sowie die

Bänderstrukturen jedoch nicht genauer untersucht werden, so dass die gezeigten

Ergebnisse erst den Beginn ausführlicher Untersuchungen darstellen. So wäre es

beispielsweise interessant, über Konzentrationsreihen die für die Bänderentstehung

notwendige Lysophosphatidylcholin-Konzentration zu bestimmen und die Morpholo-

gie der Strukturen bei weiterer Erhöhung des LysoPC Gehaltes zu verfolgen. Weiter-

hin wären systematische Untersuchungen von DMPC-Dispersionen mit höheren

Myristinsäure- bzw. Soja-Lecithingehalten denkbar. Eigene Untersuchungen mit der

10fachen Menge hydriertem Soja-Lecithin (hier nicht dargestellt) haben ergeben,

dass damit Nanotubebildung und Gelierung vollständig unterbunden werden.

3.3 . Untersuchungen zur Reinheit von DMPC Im folgenden Kapitel sind Untersuchungen zu physikochemischen Eigenschaften und

zur Reinheit der Lipide zusammengefasst. Diese wurden notwendig, da die im Laufe

der Arbeit eingesetzten verschiedenen DMPC-Chargen bei gleicher Prozessführung

Dispersionen mit zum Teil sehr unterschiedlichen Eigenschaften ergaben (Tab. 14).

Dispersionen der Chargen 2 und 5 bestehen aus durchschnittlich größeren Lipo-

somen und zeigen ein ausgeprägteres Gelierungsverhalten im Vergleich zu den

Dispersionen der anderen drei Lipide. Tab. 14 fasst die Unterschiede zwischen den

physikochemischen Eigenschaften der Dispersionen verschiedener DMPC-Chargen

zusammen.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

70

DMPC-Charge Eigenschaften der Dispersionen nach Hochdruckhomogenisation (8x500bar / 40°C)

(1) 100/93 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 100 nm, • deutlich stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 4 Wochen, auch später

kein komplettes Gelieren (2) 562191-1 (Lipoid) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 110 - 160 nm,

• komplette Gelierung bei 13°C nach 3 Wochen (3) 201/92 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 75 nm,

• leicht stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 5 Wochen, auch später kein komplettes Gelieren

(4) 200/92 (Astra Arcus) • Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 50 nm, • leicht stückig-inhomogen bei 13°C nach ca. 6 Wochen, auch später

kein komplettes Gelieren (5) MA 040722 (Astra Arcus)

• Teilchengröße (PCS, z-Average) nach Herstellung ca. 110 - 160 nm, • komplette Gelierung bei 13°C nach 3 Wochen

Tab. 14 : Zusammenhang zwischen der verwendeten DMPC-Charge und den wichtigsten Unterschie-den in den Eigenschaften der resultierenden Dispersionen (hergestellt mittels Hochdruckhomogeni-sation, 8 x 500 bar / 40°C)

In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse des makroskopischen Quel-

lungsverhaltens, der thermoanalytischen Untersuchungen, der Röntgenkleinwinkel-

messungen sowie der dünnschichtchromatographischen Untersuchungen vorgestellt.

Mit DMPC der Charge MA040722 konnten keine dünnschichtchromatographischen

Reinheitsuntersuchungen durchgeführt werden, da die Charge zu diesem Zeitpunkt

bereits vollständig verbraucht war.

3.3.1 . Makroskopisches Quellungsverhalten

Die trockenen, pulverförmigen Lipide zeigten makroskopisch keine Unterschiede. Zur

Untersuchung des Quellungsverhaltens wurden die pulverisierten Lipide genau

gewogen und bei Raumtemperatur mit filtriertem Aqua purificata, das 0,01% Thio-

mersal zur Konservierung enthielt, versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von

10 % (m/m) resultierte. Nach kurzem Umschütteln (15x, per Hand) wurden die Ge-

fäße verschlossen und 2 Tage bei 40°C stehen gelassen. In einer zweiten Versuch-

sreihe wurden die Lipide in gleicher Weise mit konservierungsmittelfreiem Wasser

versetzt, um einen möglichen Einfluss des Konservierungsmittels auf das Quellungs-

verhalten zu untersuchen.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tab. 15 aufgeführt. Die An- bzw.

Abwesenheit von Thiomersal hatte keinen Einfluss auf das Aussehen der Lipide nach

der Hydratation.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

71

Charge (1) 100/93 Astra Arcus

(2) 562191-1 Lipoid

(3) 201/92 Astra Arcus


(5) MA040722 Astra Arcus

makroskop. Aussehen

schleimig- durchschein. Masse; zäh, aber fließend; viele kleine Luftbläschen inkorporiert

Lipid weiß am Boden abgesetzt, überstehendes Wasser nahezu klar, dünnflüssig



Lipid als weißer Niederschlag am Boden; wässriger, leicht trüber Überstand, flüssig

Tab. 15 : Makroskopisches Aussehen verschiedener DMPC-Chargen nach Quellung in thiomersal-freiem bzw. thiomersalhaltigem Wasser. Hydratationsdauer: 2 Tage; Hydratationstemperatur: 40°C.

Es ist deutlicher Unterschied im makroskopischen Erscheinungsbild der hydrati-

sierten Phospholipide zu beobachten: die Lipide 1, 3 und 4 ergeben nach Quellung

eine zähe, durchscheinende Masse schleimiger Konsistenz, in der das gesamte

Wasser inkorporiert ist. Dagegen bilden die Lipide 2 und 5 einen weißen, dichten

Niederschlag mit überschüssigem Wasser als Überstand.

3.3.2 . Thermoanalytische Untersuchungen

Um festzustellen, ob sich das makroskopisch stark unterschiedliche Verhalten der

hydratisierten Lipide auch in ihrem thermoanalytischen Verhalten widerspiegelt,

wurde anschließend das Phasenverhalten der unter 3.3.1 hergestellten Proben

untersucht. Nach Abkühlen auf 2°C und Halten dieser Temperatur für 45 Minuten

wurden die Proben mit 5°C/min auf 40°C aufgeheizt. Für alle Lipide wurden die für

vollständig hydratisiertes DMPC bekannten DSC-Heizkurven mit einem kleinen endo-

thermen Ereignis für den Vorübergang und einem großen endothermen Ereignis für

den Hauptübergang erhalten. Zur Charakterisierung wurden die Onset-Temperaturen

der Phasenübergänge ermittelt und das Verhältnis der Enthalpien der Phasen-

übergänge errechnet (Tab. 16). Die An- oder Abwesenheit von Thiomersal hatte

keinen Einfluss auf die Lage und die Enthalpien der Übergänge.

Die Temperatur des Hauptübergangs (Kettenschmelzen, Pβ` → Lα) ist bei allen fünf

Chargen nahezu gleich und liegt bei ca. 24,2°C. Betrachtet man jedoch die Lage der

Vorübergänge (L β` → Pβ`), lassen sich die Lipide in Analogie zu den makro-

skopischen Beobachtungen in zwei Gruppen einteilen: DMPC 2 und 5 weisen eine

deutlich höhere Vorübergangstemperatur (etwa 2°C höher) auf als die Lipide 1, 3

und 4. Dieselbe Gruppenbildung ergibt sich auch, wenn man das Verhältnis der

Enthalpien der Phasenübergänge ∆HTm/ ∆HTp betrachtet: Die Werte für DMPC 2 und

5 liegen deutlich tiefer als die Werte für die Lipide 1, 3 und 4 (Differenz etwa 2,4).

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

72

Charge (1) 100/93 Astra Arcus

(2) 562191-1 Lipoid



(5) MA040722Astra Arcus

Vorübergang Tp(Onset) Hauptübergang Tm(Onset) ∆HTm/ ∆HTp

13,9 ± 0,04°C 24,1 ± 0,02 °C 7,9 ± 0,1

15,9 ± 0,02 °C 24,3 ± 0,03 °C 5,4 ± 0,1

13,7 ± 0,08°C 24,2 ± 0,03°C 7,8 ± 0,2

13,4 ± 0,05 °C 24,1 ± 0,02°C 7,9 ± 0,1

15,5 ± 0,03 °C 24,1 ± 0,05°C 5,4 ± 0,1

Tab. 16 : Gegenüberstellung der T(Onset) -Werte der Phasenübergangstemperaturen und der Verhält-nisse der Umwandlungsenthalpien verschiedener DMPC-Chargen im vollständig hydratisierten Zu-stand, bestimmt mittels DSC. (Tp(Onset): Onset der Temperatur des Vorübergangs; Tm(Onset): Onset der Temperatur des Hauptübergangs; ∆HTm Umwandlungsenthalpie des Hauptübergangs; ∆HTp Umwand-lungsenthalpie des Vorübergangs ). Alle Werte stellen Mittelwerte aus 3 Einzelmessungen dar.

Substanzen, die mit den Lipidmolekülen interagieren, wie zum Beispiel Cholesterol,

stören die Ordnung der Bilayer in der Gelphase und erhöhen die Flexibilität der

Lipidmoleküle, was zu einer Erniedrigung der Umwandlungstemperatur sowie zu

einer Erniedrigung der Umwandlungsenthalpie führt. Versteht man die Lage des

Vorüberganges also als ein Reinheitskriterium, so ergibt sich, dass die Lipide 2 und 5

einen höheren Reinheitsgrad aufweisen als die Lipide 1, 3 und 4, in denen sowohl

Phasenübergangstemperatur Tp als auch die Umwandlungsenthalpie erniedrigt sind.

Die Unterschiede zwischen den letztgenannten sind nur sehr gering. Es ist eine

Tendenz erkennbar, dass die Reinheit in der Reihenfolge 4 < 3 < 1 leicht zunimmt.

3.3.3 . Ergebnisse der Röntgenkleinwinkeluntersuchungen

Aufgrund der stark veränderten Quellungseigenschaften sowie der deutlichen Er-

niedrigung der Phasenübergangstemperaturen der Lipide 1, 3 und 4 wurde davon

ausgegangen, dass bei den verschiedenen DMPC-Chargen Bilayer mit unterschied-

lichen Eigenschaften vorliegen. Mit Hilfe von Röntgenkleinwinkeluntersuchungen

sollten Differenzen in den Bilayerabständen der Lamellarphase (Lα) detektiert

werden. Dafür wurden die Lipide wie unter 3.3.1 beschrieben hydratisiert und an-

schließend sofort bei 40°C vermessen (Abb. 50). Eine Ausnahme bildet DMPC 5,

welches bereits zu einem früheren Zeitpunkt der Arbeit untersucht wurde. Die

Hydratationsbedingungen sind identisch mit denen der anderen Lipide, jedoch

entstammt das Diffraktogramm einem Temperaturscan von 20°C bis 50°C in 0,6°C-

Schritten. Der Beamstop zum Ausblenden des Primärstrahls endete bei der Messung

von DMPC 5 bei einer etwas kleineren Kanalnummer, woraus die unterschiedlichen

Kurvenbeginne resultieren.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

73

Abb. 50 : Röntgenkleinwinkeldiffrakto-gramme der vollständig hydratisierten DMPC-Chargen. Lipid 5 wurde unab-hängig von den restlichen Lipiden vermes-sen, Messdauer hier nur 15 Minuten (Messdauer für Lipide 1 bis 4: 60 Minu-ten). Die obersten zwei Kurven entspre-chen dem typischen Röntgenkleinwinkel-diffraktogramm einer Lamellarphase.

Die DMPC-Chargen 2 und 5 zeigen die für eine Lamellarphase typischen scharfen

Interferenzpeaks. DMPC 1 zeigt zusätzlich zu einem sehr breiten Interferenzpeak nur

eine sehr schwach angedeutete scharfe Interferenz, während die Diffraktogramme

der Lipide 3 und 4 ausschließlich den breiten Interferenzpeak aufweisen. Anhand der

Peaklagen wurden folgende d-Werte (vgl. 2.2.2.6.) ermittelt: DMPC 2: 6,3 nm; DMPC

5: 7,1 nm und DMPC 1: 6,5 nm. Der d-Wert des DMPC 2 stimmt am besten mit dem

Literaturwert für vollständig hydratisiertes DMPC in der Lα-Phase überein (6,27 nm

bei 30°C, Nagle & Tristram-Nagle, 2000). Da DMPC 5 eine andere Vorbehandlung

erfahren hat sind die d-Werte allerdings nicht direkt miteinander vergleichbar.

Die Ergebnisse dokumentieren, dass sich nur bei den Lipiden 2 und 5 die erwartete

multilamellare Phase ausgebildet hat, während in den Lipiden 3 und 4 Bilayer

vorliegen, die keine lamellare Ordnung aufweisen. DMPC 1 nimmt eine Zwischen-

stellung ein: Hier liegen hauptsächlich ungeordnete Bilayer neben wenigen lamellar

geordneten Bilayern vor. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen von vollständig

hydratisiertem DMPC der Charge 1 (Kapitel 3.2.3, Abb. 24) zeigen ebenfalls Bilayer

(allerdings in der Gelphase), die anstelle einer multilamellaren Ordnung große

Volumina Wasser eingelagert haben, so dass die Abstände zwischen den Bilayern

bis zu 200 nm betragen. Auch in diesem Versuch zeigten die thiomersalhaltigen und

die thiomersalfreien Proben ein identisches Verhalten, ihre Diffraktogramme werden

daher nicht getrennt aufgeführt.

3.3.4 . Hochauflösende Dünnschichtchromatographie

Die auffällig erhöhte Wasseraufnahmefähigkeit, die Erniedrigung der Phasen-

übergangstemperatur des Vorübergangs und die fehlende bzw. verminderte Aus-

bildung einer multilamellaren Phase bei den DMPC-Chargen 1, 3 und 4 deuten

0 200 400 600 800

0

10000

20000

30000

40000

50000

DMPC 5 (MA040722 Astra)

DMPC 2 (562191-1 Lipoid)

DMPC 1 (100/93 Astra)



Inte

nsitä

t

Kanal-Nummer

Beamstop zum Ausblenden des

Primärstrahls

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

74

darauf hin, dass diese Lipide zusätzlich Substanzen enthalten, die mit den Lipid-

molekülen interagieren und deren Eigenschaften stark beeinflussen. Ein voll-

ständiges Analysenzertifikat zur Reinheit lag nur für das Lipid 2 der Firma Lipoid vor.

Der Gehalt an Lysophosphatidylcholin wurde als < 0,1%, freie Fettsäuren < 0,05%

und Unbekannte < 0,1% angegeben (Lipoid GmbH, 2001a). Die Lipide der Firma

Astra Arcus besaßen hingegen keine oder nur sehr unvollständige Zertifikate, waren

bereits mehr als fünf Jahre alt und zum Teil unkontrolliert (z.T. über mehrere Monate

ungekühlt) gelagert. Weiterhin ist nicht bekannt, auf welchem Wege das DMPC der

Firma Astra Arcus synthetisiert wurde, was das Abschätzen von Verunreinigungen,

die aus dem Herstellungsprozess kommen, unmöglich macht. Im Rahmen dieser

Arbeit wurde daher mittels hochauflösender Dünnschichtchromatographie untersucht,

inwieweit Reinheitsunterschiede zwischen den Chargen bestehen. Dabei richtete

sich das Hauptaugenmerk auf die Verunreinigung mit anderen Lipidklassen sowie

Zersetzungsprodukte.

Im ersten Chromatogramm (Abb. 51) erfolgte die Detektion mit Hilfe des Kupfer-

sulfat-Phosphorsäure-Tauchbades, welches nur Lipide mit ungesättigten Fettsäure-

resten und Cholesterol in Form von schwarzen Spots detektiert. Lipidmengen von

0,1 µg können deutlich detektiert werden (vgl. Abb. 51, Laufbahn 9: je 0,1 µg Lipid

verschiedener Klassen).

Abb. 51 : Dünnschichtchromatogramm nach Detektion im Kupfersulfat-Phosphorsäure-Tauchbad zur Detektion ungesättigter Lipide. Die Auftragsmengen der Lipide sind Tab. 17 zu entnehmen. Chol: Cholesterol; GC: Galactocerebroside; Sulf: Sulfatide; PE: Phosphatidylcholin; PG: Phosphati-dylglycerol; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin; PC: Phosphatidylcholin; SM: Sphingo-myelin. Da mit Laufmittel 1 nur bis zur gekennzeichneten Position auf der DC-Platte entwickelt wird (4,8 cm), mit den darauf folgenden Laufmitteln 2 und 3 (unpolarer, trennen die unpolaren Lipide weiter auf) allerdings über die gesamte Länge der Platte, liegt der Spot des Cholesterols oberhalb der Lauf-mittelfront des Laufmittels 1.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Laufmittelfront (Laufmittel 1)

Chol GC Sulf PE PG PI PS PC SM

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

75

SpotNr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Lipid

DMPC1

DMPC1

DMPC2

DMPC2

DMPC3

DMPC3

DMPC4

DMPC4

Std

Std

Std

DMPC1

DMPC2

DMPC3

DMPC4

Men-ge

[µg]

10

100

10

100

10

100

10

100

0,1

0,2

0,3

20

20

20

20

Tab. 17 : Übersicht über Art und Auftragsmengen der in Abb. 51 chromatographierten Lipide. DMPC: Dimyristoylphosphatidylcholin; Std: Standard-Mischung (enthält je 1µg/µl Sphingomyelin, Phos-phatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylethanol-amin, Sulfatide, Galactocerebroside und Cholesterol).

Die untersuchten DMPC-Chargen ergaben keine Färbung. Auch bei einer Auftrags-

menge von 100 µg Lipid pro Spot konnte bei den untersuchten Chargen kein Lipid

detektiert werden, es sind lediglich verschmierte weiße Flecken in Höhe des Phos-

phatidylcholin- bzw. Phosphatidylserinfleckes des Standards zu erkennen. Somit

kann ausgeschlossen werden, dass die vier DMPC-Chargen mehr als 0,1% (m/m)

ungesättigte Phospholipide bzw. Cholesterol enthalten.

Abb. 52 zeigt ein Chromatogramm, in welchem die Detektion mittels Dittmer-Lester-

Reagenz erfolgte. Art und Auftragsmengen der Lipide sind Tab. 18 zu entnehmen.

Cholesterol, Galactocerebroside und Sulfatide der Standard-Mischung können mit

diesem Reagenz nicht detektiert werden (Dittmer & Lester, 1964).

Abb. 52 : Dünnschichtchromatogramm nach Detektion mit Dittmer-Lester-Reagenz. Die Art und Men-gen der aufgetragenen Lipide sind Tab. 18 zu entnehmen. SM. Sphingomyelin; PC: Phosphatidyl-cholin; PS: Phosphatidylserin; PI: Phosphatidylinositol; PG: Phosphatidylglycerol; PE: Phosphatidyl-ethanolamin; Lyso: Lysophosphatidylcholin.

PE PG PI PS PC SM Lyso

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

76

Spot-Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Lipid DM PC 1

DM PC 2

DM PC 3

DM PC 4

DM PC 1

DM PC 2

DM PC 3

DM PC 4

Std+ DMPC

1

Std+ DMPC

2

Std+ DMPC

3

Std+ DMPC

4

Menge [µg]

0,2 0,2 0,2 0,2 100 100 100 100 0,3 + 0,5

0,3 + 0,5

0,3 + 0,5

0,3 + 0,5

Spot-Nr.

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Lipid Std + Lyso

Std Std LM DM PC 1

DM PC 2

DM PC 3

DM PC 4

DM PC 1 +Lyso

DM PC 2 +Lyso

DM PC 3 +Lyso

DM PC 4 +Lyso

Menge [µg]

0,3 + 0,3

0,3 0,5 5 15 15 15 15 12 + 0,2

12 + 0,2

12 + 0,2

12 + 0,2

Tab. 18 : Art und Auftragsmengen der in Abb. 52 chomatographierten Lipide. DMPC: Dimyristoylphos-phatidylcholin; Std: Standard-Lipid-Mischung; LM: reines Lösungsmittel; Lyso: Lysophosphatidylcholin

Das Chromatogramm muss zur Dokumentation nach dem Trocknen des Sprüh-

reagenzes sofort eingescannt werden, da die blauen Flecken sehr schnell wieder

verblassen. Das ist der Grund dafür, warum die Spots der DMPC-Chargen 1 bis 4

(Abb. 52, Positionen 1 bis 4) nur noch schlecht erkennbar sind.

Neben der Standardmischung verschiedener Phospholipidklassen wurde zusätzlich

Lysophosphatidylcholin aufgetragen (Abb. 52, als Zumischung zur Standardmi-

schung in Position 13 und in Position 21 - 24 als Zumischung zu den DMPC-Chargen

1 bis 4). Damit konnte gezeigt werden, dass sich Lysophosphatidylcholin neben

DMPC und anderen Lipidklassen deutlich detektieren lässt, auch wenn der DMPC-

Spot infolge Überladung der Platte breit nach unten verschmiert. Keine der

untersuchten DMPC-Chargen enthält Lysophosphatidylcholin in einer Konzentration

von mehr als 0,2 %. Um den Einfluss von Überladung durch zu hohe Auftrags-

mengen auf die Form bzw. Lage der Spots zu untersuchen, wurden in Position 9 bis

12 zu jeweils 0,3 µg Standard zusätzlich je 0,5 µg DMPC der Charge 1 bis 4 zuge-

geben. Man erkennt, dass der Phosphatidylcholin-Fleck unter Zugabe von 0,5 µg

DMPC im Vergleich zum reinen Standard (Abb. 52, Positionen 13 bis 15) leicht zu

kleineren Rf-Werten verschmiert. Bei höheren Auftragmengen tritt dieser Effekt noch

ausgeprägter auf. Auch bei Auftragsmengen von 100 µg lassen sich keine weiteren

Lipide neben den durch DMPC verursachten Spots detektieren. Das bedeutet, dass

keine der DMPC-Chargen Phosphatidylserin, -inositol, -glycerin oder -ethanolamin in

Konzentrationen von mehr als 0,3% (m/m) enthält. Einzig über das Vorhandensein

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

77

von Sphingomyelin kann wegen der Fleckverbreiterung des DMPC keine Aussage

getroffen werden, allerdings ist die Anwesenheit von Sphingomyelin unwahrschein-

lich.

Weiterhin wurden die DMPC-Chargen auf freie Myristinsäure geprüft. Das Reagenz

nach Dittmer-Lester ist nicht geeignet, freie Myristinsäure anzufärben, allerdings

konnten bei Auftragung von 2 µg, 3 µg und 4 µg Myristinsäure weiße Spots auf dem

hellblauen Untergrund beobachtet werden (vgl. Abb. 53, umrandete Spots an

Position 4 bis 6). Weder in diesem, noch in anderen Chromatogrammen, die bis zu

300 µg DMPC enthielten, waren vergleichbare weiße Spots erkennbar. Damit kann

ausgeschlossen werden, dass in den untersuchten DMPC-Chargen mehr als 0,7 %

freie Myristinsäure vorhanden ist.

Abb. 53 : Ausschnitt aus einem Dünnschichtchromatogramm nach Detektion mit Dittmer-Lester-Rea-genz. Art und Menge der aufgetragenen Lipide sind in Tab. 19 zusammengefasst. Lyso: Lysophos-phatidylcholin; SM: Sphingomyelin; PC: Phosphatidylcholin; PI: Phosphatidylinositol; PG: Phos-phatidylglycerol; PE: Phosphatidylethanolamin; MA: Myristinsäure.

Spot-Nr.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Lipid Std Std LM MA MA MA + Lyso

DMPC 1

DMPC 2

DMPC 3

DMPC 3

DPPC

Menge [µg]

0,5 1,0 5,0 2,0 4,0 3,0 + 0,5

50 50 50 50 20

Tab. 19 : Zusammenfassung über Art und Menge der in Abb. 53 chromatographierten Lipide. Std: Standard-Mischung; LM: reines Lösungsmittel; MA: Myristinsäure; DMPC: Dimyristoylphosphatidyl-cholin; DPPC: Dipalmitoylphosphatidylcholin.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit Hilfe der dünnschichtchromato-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

MA PE PG PI PS PC SM Lyso

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

78

graphischen Untersuchungen keine Unterschiede in der Lipidzusammensetzung der

verschiedenen Chargen detektiert werden konnten. In keiner der Chargen konnten

mehr als 0,7% freie Myristinsäure (oder andere langkettige, gesättigte Fettsäuren),

mehr als 0,2% Lysophosphatidylcholin, 0,1% ungesättigte Lipide anderer Klassen

und Cholesterol sowie mehr als 0,2% gesättigte Lipide anderer Klassen nachge-

wiesen werden.

3.3.5 . Einfluss der Lipidvorbehandlung

Da die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen keine Erklärung für die

aufgetretenen Chargenunterschiede lieferten, wurde untersucht, ob die unterschied-

lichen Eigenschaften möglicherweise auf differierende Vorbehandlungsverfahren der

pulverisierten Lipide (bedingt zum Beispiel durch Ausfällung aus verschieden polaren

Lösungsmitteln) zurückzuführen sind. Zu diesem Zweck wurden die Lipide zunächst

getrocknet, gewogen und nachfolgend in einer Mischung aus Chloroform und

Methanol im Verhältnis 2:1 (V/V) gelöst. Unter Vakuum wurde bei 45°C ein Lipidfilm

gebildet und dieser nach vollständiger Trocknung mit Wasser (konserviert mit 0,01%

Thiomersal) versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von 10% (m/m) resultierte. Auf

diese Weise wurden alle Lipide derselben Vorbehandlung unterzogen und somit

vergleichbare Oberflächeneigenschaften geschaffen. Die Hydratation erfolgte analog

zu den vorangegangenen Untersuchungen über 2 Tage bei 40°C. Auch nach dieser

Vorbehandlung ergab sich bei allen Lipiden das gleiche makroskopische Quellungs-

verhalten, thermoanalytische Phasenverhalten sowie exakt dieselben Röntgenklein-

winkeldiffraktogramme, wie bereits bei den nicht vorbehandelten Proben, dargestellt

in Abschnitt 3.3.1, 3.3.2 und 3.3.3. Somit können Unterschiede in den Vorbehand-

lungsmethoden als Ursache für das uneinheitliche Verhalten der DMPC-Chargen

ausgeschlossen werden.

3.3.6 . Zweiwertige Kationen

Da weder lipidartige Verunreinigungen noch Unterschiede in der Oberflächen-

beschaffenheit für das unterschiedliche Verhalten der DMPC-Chargen verantwortlich

gemacht werden konnten, wurde untersucht, ob Kationen die Ursache hierfür dar-

stellen. Mehrwertige Kationen könnten als Rückstände aus dem Herstellungsprozess

der Lipide stammen.

Die Lipide 1, 3 und 4 wurden in etwas Chloroform gelöst und eventuell vorhandene

zweiwertige Kationen mit einer 2%igen (m/V) Natrium-EDTA-Lösung (pH 6,5) ent-

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

79

fernt. Nach Abtrennung durch Zentrifugation wurde die Chloroform-Phase unter

Vakuum bei 40°C über Nacht getrocknet. Die so behandelten Lipide wurden mit Aqua

purificata versetzt, so dass eine Lipidkonzentration von etwa 10% (m/m) resultierte

und 2 Tage bei 40°C hydratisiert. Die Eigenschaften der Lipide wurden mit denen des

Lipids DMPC 2 (562191-1 Lipoid) verglichen (Werte siehe Tab. 15, Tab. 16 sowie

Abb. 50). Alle Proben zeigten nach der Behandlung mit Natrium-EDTA ein mit der

Referenz vergleichbares Verhalten: Nach der Hydratation bildeten die Lipide einen

weißen Niederschlag mit einem wässrigen, leicht trüben Überstand. Die Onset-Werte

der Übergangstemperaturen des Vorübergangs erhöhten sich um etwa 1,3°C. Die

Lage des Hauptübergangs blieb hingegen unverändert (Tab. 20).

Charge


T(Onset) P T(Onset)

M


T(Onset) P T(Onset)

M


T(Onset) P T(Onset)

M

vor Ausschütteln mit Na-EDTA

13,9°C 24,1°C 13,7°C 24,2°C 13,4°C 24,1°C

nach Ausschütteln mit Na-EDTA

15,2°C 24,2°C 15,1°C 24,2°C 15,4°C 24,2°C

Tab. 20 Onset-Temperaturen der Phasenübergänge verschiedener DMPC-Chargen vor und nach dem Ausschütteln mit Natrium-EDTA-Lösung.

Auch die Röntgenkleinwinkelmessungen zeigten eine deutliche Veränderung: Nach

der Behandlung mit Natrium-EDTA konnte bei allen drei Lipiden das Vorliegen einer

mulitlamellaren Phase detektiert werden (Abb. 54).

Abb. 54 : Röntgenkleinwinkeldiffraktogramme vollständig hydratisierter DMPC-Chargen vor (untere Kurven) und nach (obere Kurven) Ausschütteln mit Natriumedetat-Lösung. A: DMPC 1 (100/93 Astra); B: DMPC 3 (201/92 Astra); C: DMPC 4 (200/92 Astra).

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass zweiwertige Kationen in den

Lipiden 1, 3 und 4 zum veränderten makroskopischen Quellungsverhalten, der Er-

niedrigung der Phasenübergangstemperatur des Vorübergangs sowie zur

schwachen bzw. fehlenden Ausbildung der multilamellaren Phase führten.

A B C

0 200 400 600 800

0

10000

20000

30000

40000

50000

Inte

nsitä

t

Kanal-Nummer

DMPC 3 (201/92 Astra)nach Ausschütteln mit Na-EDTA


0 200 400 600 800

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

Inte

nsitä

t

Kanal-Nummer

DMPC 4 (200/92 Astra) nach Ausschütteln mit Na-EDTA


0 200 400 600 8000

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

Inte

nsitä

t

Kanal-Nummer

DMPC 1 (100/93 Astra)nach Ausschüttelnmit Na-EDTA


Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

80

Als Gegenprobe zur Unterstützung dieser Ergebnisse wurden anhand des Lipids

DMPC 2 (562191-1, Lipoid) geprüft, ob durch Zumischung steigender Mengen

Calcium-Ionen die betreffenden Eigenschaften gezielt verändert werden können.

Anstelle von gereinigtem Wasser wurden Calciumchlorid-Lösungen der Konzentra-

tionen 0,08 mmol/l bis 15,10 mmol/l zur Hydratation verwendet. Bereits makrosko-

pisch sind nach der Hydratationsdauer von 2 Tagen Veränderungen zu erkennen: Mit

steigenden Calcium-Konzentrationen geht das hydratisierte Lipid in eine zunehmend

viskose Masse über, in der das gesamte Wasser inkorporiert ist.

Thermoanalytische Untersuchungen (Abb. 55) detektieren im Bereich zwischen

0,08 und 3,78 mmol/l Calciumchlorid eine Verringerung der Phasenübergangstempe-

ratur Tp des Vorübergangs auf etwa 14,3°C. Die Temperatur des Hauptübergangs

verändert sich in diesem Konzentrationsbereich kaum. Ab einer Calciumchlorid-Kon-

zentration von 3,78 mmol/l kommt es allerdings zu einem deutlichen Anstieg der

Onset-Temperaturen sowohl des Vor-, als auch des Hauptüberganges. Die Tempera-

turen beider Phasenübergänge bei 15,1 mmol/l sind im Vergleich zur calciumchlorid-

freien Referenz um etwa 1°C erhöht.

Abb. 55 : Onset-Temperaturen der Phasen-übergänge des Lipids DMPC 2 unter Zusatz steigender Calciumchorid-Konzentrationen.

Die parallel dazu durchgeführten Röntgenkleinwinkelmessungen zeigen, dass durch

Zugabe von Calciumchlorid auch die Ausbildung der multilamellaren Phase unter-

bunden wird (Abb. 56). Bei Konzentrationen von 0,38 mmol/l und 0,76 mmol/l sind

die Peaks der Lamellarphase zwar noch schwach angedeutet, aber bereits von

einem breiten "Buckel" von ungeordnet vorliegenden Bilayern überlagert. Ab Konzen-

trationen von 1,89 mmol/l kann keine Lamellarphase mehr detektiert werden, es wird

nur noch ein diffuser Peak als Zeichen des Vorliegens von Bilayern ohne lamellare

Ordnung detektiert.

0 2 4 6 8 10 12 14 1610

12

14

16

24

26

Ons

et d

er Ü

berg

angs

tem

pera

tur (

°C)

Calciumchlorid-Konzentration (mmol/l)

Tm (Onset) Hauptübergang

Tp (Onset)Vorübergang

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

81

Abb. 56 Röntgenkleinwinkeldiffrakto-gramme von vollständig hydratisiertem DMPC 2 (Charge 562191-1, Lipoid) unter Zusatz steigender Mengen Calciumchlorid.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass durch die Entfernung zweiwertiger

Kationen bei den DMPC-Chargen 1, 3 und 4 ähnliche Hydratationseigenschaften

erzeugt werden konnten, wie sie von den DMPC-Chargen 2 und 5 bekannt waren.

Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Anwesenheit von zweiwertigen

Kationen einen entscheidenden Faktor für die veränderten Eigenschaften der Lipide

1, 3 und 4 darstellt. Da es nicht möglich war, genau die Onset-Temperatur des Vor-

übergangs der Lipide 2 bzw. 5 zu erreichen, gibt es neben den zweiwertigen

Kationen möglicherweise noch weitere Ursachen für das abweichende Phasenver-

halten.

Durch Zugabe von Calciumchlorid konnten das makroskopische Quellverhalten

verändert, die Vorübergangstemperatur gesenkt und die Ausbildung der multi-

lamellaren Phase unterdrückt werden. Dabei sind sehr niedrige CaCl2-Konzen-

trationen zur Verursachung der genannten Effekte ausreichend (Molverhältnis

DMPC:Calcium etwa 80:1), während höhere Calcium-Konzentrationen (ab einem

Molverhältnis DMPC:Calcium von unter 40:1) bezüglich der Phasenübergangs-

temperaturen einen gegenteiligen Effekt erzeugen (Abb. 55). Durch Calciumionen-

Zugabe konnte allerdings keine Senkung der Vorübergangstemperatur auf < 14°C,

wie sie von den Lipiden 1, 3 und 4 ermittelt wurde, erreicht werden. Dieses Ergebnis

korreliert mit der Beobachtung, dass durch Entfernen von zweiwertigen Ionen keine

entsprechende Steigerung der Phasenübergangstemperatur möglich war und

unterstützt die Vermutung, dass in den Chargen 1, 3 und 4 zusätzliche Verunreini-

gungen vorliegen.

Abschließend lässt sich zusammenfassen, dass für die Chargenunterschiede haupt-

sächlich zweiwertige Kationen verantwortlich gemacht werden können. Aus Zeit-

0 200 400 600 8000

100002000030000400005000060000700008000090000

100000110000120000130000140000150000160000170000180000

Inte

nsitä

t

Kanal-Nummer

Aqua purificata

0,08 mmol/l CaCl20,38 mmol/l CaCl20,76 mmol/l CaCl21,89 mmol/l CaCl23,78 mmol/l CaCl27,55 mmol/l CaCl2

15,10 mmol/l CaCl2

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

82

gründen wurde keine weitergehende Analyse zur Identifizierung der Kationen durch-

geführt.

3.4 . Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC im Verhältnis 4:1 (m/m) Eine weitere Fragestellung beinhaltete, wie sich die Lagerstabilität von Dispersionen

bei der Verwendung einer Mischung der beiden gesättigten Phosphatidylcholine

DMPC und DPPC darstellt und ob es zur Gel- bzw. Nanotubebildung kommt. DMPC

und DPPC wurden in einem definierten Massenverhältnis von 4:1 (m/m) eingesetzt.

Die Lipide wurden zusammen in einer Mischung aus Chloroform und Methanol (2:1,

V/V) gelöst und nach dem Trocknen mit konserviertem Wasser (0,1% Thiomersal)

bei 50°C für 2 Tage hydratisiert. Die Dispergierung erfolgte entweder über Hoch-

druckhomogenisation (8 x 500 bar / 50°C) oder über Extrusion (8 x 200 nm / 50°C).

Als Lagerungstemperatur wurde 2 - 8°C gewählt. Für Lipidgehalte von 5% bzw. 10%

(m/m) wurden die Teilchengrößen und die Stabilität der Dispersionen über einen La-

gerzeitraum von 3 Monaten untersucht (Abb. 57).

Abb. 57 : Vergleich der mittleren Teilchengrößen (bestimmt mittels PCS, z-Average) von 5 bzw. 10%igen Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC (Verhältnis DMPC:DPPC 4:1 [m/m]) über einen Lagerungszeitraum von 12 Wochen bei 2 - 8°C. Links: Dispergierung durch Hochdruck-homogenisation; Rechts: Dispergierung durch Extrusion.

Bezüglich der Dispergierungsmethoden ergibt sich ein ähnliches Bild, wie es bereits

für die Dispergierung von reinem DMPC beschrieben wurde. Die mittels Hochdruck-

homogenisation hergestellten Systeme ergeben kleinere mittlere Teilchengrößen (z-

Average) als die extrudierten Dispersionen, was sich auch im makroskopischen

Erscheinungsbild widerspiegelt: Die extrudierten Dispersionen sind bei gleicher

0 2 4 6 8 10 12102030405060708090

100110120

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PCS

Lagerdauer bei 2-8°C (Wochen)

10% DMPC/DPPC-Mischung 5% DMPC/DPPC-Mischung

0 2 4 6 8 10 12102030405060708090

100110120

Dur

chsc

hnitt

. Tei

lche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer bei 2-8°C (Wochen)

10% DMPC/DPPC-Mischung 5% DMPC/DPPC-Mischung

Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40) 8x 500 bar/ 40°C

Extrusion (EmulsiFlex C5) 8x 200 nm/ 40°C

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

83

Phospholipidkonzentration weißer und weniger durchscheinend als die hochdruck-

homogenisierte Dispersionen. Dabei zeigen die Polydispersitätsindices (Hoch-

druckhomogenisation: Um 0,1 bis 0,2; Extrusion: Zwischen 0,05 bis 0,1) eine engere

Partikelgrößenverteilung bei den extrudierten Dispersionen an. Die MSD-Auswertung

der PCS-Daten bestätigt für die hochdruckhomogenisierten Dispersionen breitere

Teilchengrößenverteilungen, die vor allem durch den zusätzlichen Anteil kleinerer

Partikel (zwischen 10 und 30 nm) verursacht werden.

Die Stabilität aller Dispersionen bei 2 - 8°C ist über den beobachteten Zeitraum

hinaus gut. Bei den hochdruckhomogenisierten Dispersionen kommt es innerhalb der

ersten 2 Wochen der Lagerung zum Absetzten von sehr wenig feinem Niederschlag

am Boden, der sich über einen Lagerzeitraum von 10 Monaten jedoch nicht ver-

mehrt. Parallel dazu wird ein Teilchengrößenwachstum beobachtet, welches sich

nach 3 Monaten bei einer mittleren Teilchengröße von etwa 90 nm stabilisiert. Mittels

MSD-Auswertung ist das Verschwinden der sehr kleinen Partikel (10 30 nm) detek-

tierbar, während der Anteil an Partikeln mit Größen > 270 nm leicht zunimmt. Die

extrudierten Dispersionen bleiben sowohl makroskopisch als auch bezüglich der Teil-

chengrößen stabil.

Abb. 58 zeigt Gefrierbruch-TEM Aufnahmen der beiden 10%igen Dispersionen nach

9 Monaten Lagerung bei 2 - 8°C. In beiden Dispersionen dominieren Liposomen,

selten findet man auch größere Partikel (in den gezeigten Ausschnitten nicht abge-

bildet). Die Liposomen der hochdruckhomogenisierten Dispersion sind etwas kleiner

als die der extrudierten Dispersion, was sehr gut mit den Ergebnissen der Teilchen-

größenmessungen korreliert (vgl. Abb. 57). Es kam in keinem Fall zu einer Gelbil-

dung, keine der Dispersionen enthielt Nanotubes.

Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Mischung zweier gesättigter Phosphatidyl-

choline vergleichsweise stabile Dispersionen resultieren, die auch nach mehr-

monatiger Lagerung bei 2 - 8°C keine Nanotubes bilden und keinerlei Anzeichen

einer Gelbildung aufweisen. Wie schon bei reinen DMPC-Dispersionen sind durch

Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 im Vergleich zur Hochdruckhomogenisation

homogenere Dispersionen mit einer verbesserten Lagerstabilität herstellbar.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

84

Abb. 58 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger Dispersionen (DMPC/DPPC 4:1 [m/m] nach 9 Wo-chen Lagerung bei 2 - 8°C. A) Herstellung mittels Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40, 8 x 500 bar / 40°C); B) Herstellung über Extrusion (EmulsiFlex C5, 8 x 200 nm / 40°C). Die mit Hochdruck-homogenisation dispergierten Proben weisen hauptsächlich Partikel mit Größen zwischen 25 nm und 140 nm auf, die mittels Extrusion hergestellten Proben enthalten Partikel mit Größen zwischen 30 nm und 170 nm, wobei der Anteil an kleinen Partikeln (< 50 nm) im Vergleich zu den hochdruck-homogenisierten Proben geringer ist. Größere Lipidpartikel werden nur sehr selten gefunden, Nano-tubes sind nicht enthalten.

3.5 . Dispersionen aus DPPC In diesem Kapitel werden Ergebnisse zur Lagerstabilität von Dispersionen aus

reinem DPPC zusammengefasst. Ziel der Untersuchungen war es zu klären, ob auch

DPPC in der Lage ist, unter vergleichbaren Bedingungen, also bei Lagerung in der

Gelphase, Nanotubes zu bilden. Weiterhin wurde untersucht, ob lagerstabile

Dispersionen aus reinem DPPC herstellbar sind, und wie sich die Dispergierungs-

methode auf die Eigenschaften der Dispersionen auswirkt.

Für alle Untersuchungen wurde DPPC der Charge 105/93 (Astra Arcus) in den

Konzentrationen 2%, 5% und 10% eingesetzt. Die Hydratation erfolgte über 2 Tage

bei 60°C. Die Dispergierung wurde analog der Herstellung von DMPC-Dispersionen

einmal über Hochdruckhomogenisation mit dem Micron Lab 40 (8 x 500bar/ 60°C),

zum anderen über Extrusion mit dem EmulsiFlex C5 (8 x 200 nm / 60°C) durchge-

führt.

In Anlehnung an das Phasenverhalten von vollständig hydratisiertem DPPC wurden

die Dispersionen bei 2 - 8°C (tilted gel, mit der Zeit Übergang in die Lc-Phase), 23°C

(tilted gel) und 38°C (Ripple Phase) gelagert.

In Abb. 59 sind die Dispersionen beider Herstellungsverfahren gegenübergestellt und

die Entwicklung der durchschnittlichen Teilchengrößen (z-Average) aller Disper-

sionen über einen Lagerzeitraum von 3 Monaten zusammengefasst.

100 nm100 nm

A B

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

85

Abb. 59 : Gegenüberstellung der Lagerstabilität von verschieden konzentrierten DPPC-Dispersionen über 12 Wochen in Abhängigkeit von der Lagerungstemperatur. Die Teilchengrößen (PCS mit z-Average Auswertung) stellen Mittelwerte aus mindestens 5 Einzelmessungen dar.

Aus den gezeigten Daten geht hervor, dass die mittels Hochdruckhomogenisation

hergestellten Dispersionen kleinere mittlere Teilchengrößen aufweisen als die durch

Extrusion hergestellten Dispersionen. Die Polydispersitätsindices (nicht gesondert

0 2 4 6 8 10 120

50

100

150

600

800

1000

1200

1400

1600

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PCS

Lagerdauer (Wochen)

38°C 23°C 2-8°C

0 2 4 6 8 10 12

50

100

150

400

500

600

700

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer (Wochen)

2-8°C 23°C 38°C

0 2 4 6 8 10 120

100

200

300

400

500

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer (Wochen)

2-8 °C 23°C 38°C

2 % DPPC

5 % DPPC

10 % DPPC

Hochdruckhomogenisation (Micron Lab 40) 8x 500 bar / 60°C

0 2 4 6 8 10 122030405060708090

100110120130140

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer (Wochen)

2-8°C 23°C 38°C

0 2 4 6 8 10 122030405060708090

100110120130140

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer (Wochen)

2-8°C 23°C 38°C

0 2 4 6 8 10 12405060708090

100110120130140150160

Dur

chsc

hnitt

l. Te

ilche

ngrö

ße (n

m) /

PC

S

Lagerdauer (Wochen)

2-8°C 23°C 38°C

Extrusion (EmulsiFlex C5) 8x 200 nm / 60°C

2 % DPPC

5 % DPPC

10 % DPPC

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

86

aufgeführt) weisen darauf hin, dass die Hochdruckhomogenisation deutlich hetero-

genere Teilchenkollektive hervorbringt (Polydispersitätsindices zwischen 0,12 bis

0,24) als die Extrusion (Polydispersitätsindices von 0,05 bis 0,12). Der Einfluss der

Dispergierungsmethoden bezüglich der Teilchengrößen und der Breite der Verteil-

ungen von DPPC-Dispersionen steht in Analogie zu den Beobachtungen bei Disper-

sionen aus DMPC (Kapitel 3.2.3) und Dispersionen einer Mischung aus DMPC und

DPPC (Kapitel 3.4).

Alle Dispersionen weisen unabhängig von der DPPC-Konzentration und der

Herstellungsmethode eine gute Lagerstabilität bei 2 - 8°C und 23°C auf. Es kommt

im Beobachtungszeitraum von 3 Monaten maximal zu einer Zunahme der mittleren

Teilchengröße um etwa 15 nm, wobei die Teilchengrößen bei 23°C stets etwas

niedriger sind als die Teilchengrößen bei 2 - 8°C (Abb. 59).

Makroskopisch bleiben die extrudierten Dispersionen vollkommen homogen, wäh-

rend die hochdruckhomogenisierten Dispersionen mit 5% und 2% DPPC nach 2 Wo-

chen einen sehr dünnen Schleier eines feinen Niederschlags aufweisen, der sich

über einen Lagerungszeitraum von 10 Monaten jedoch nicht verstärkt. Gefrierbruch-

TEM Aufnahmen (Abb. 60, oben und Mitte), die nach 10-monatiger Lagerung erstellt

wurden, bestätigen die beschriebenen Beobachtungen: Liposomen, aufgrund der

Lagerung in der Gelphase polyedrisch verformt, dominieren in den Proben, größere

Vesikel werden nur extrem vereinzelt in hochdruckhomogenisierten Proben ge-

funden. Die Stabilität der Dispersionen bei Lagerung kurz unterhalb der Ketten-

schmelztemperatur (Lagertemperatur 38°C) ist hingegen gering: Nach einer Lager-

dauer von 2 bis 5 Wochen tritt eine deutliche Viskositätserhöhung auf, bei den hoch-

druckhomogenisierten Proben sind zusätzlich noch Schlieren sichtbar. Das damit

einhergehende Teilchengrößenwachstum ist bei den hochdruckhomogenisierten

Proben stärker ausgeprägt als bei den extrudierten Proben. Gefrierbruch-TEM Auf-

nahmen (Abb. 60, unten) zeigen die Ultrastruktur dieser viskos-schlierigen Systeme:

Liposomen sind nur noch in den extrudierten Proben zu finden, daneben existieren

ausgedehnte Lipidpartikel. Die hochdruckhomogenisierten Proben zeigen nahezu

ausnahmslos ausgedehnte Lipidpartikel, kleinere Liposomen sind hier nur noch sehr

selten zu finden. Die Lagerung bei 38°C führt demnach zu einer Fusion der

Liposomen, wodurch sich ähnliche Lipidsysteme ergeben, wie sie nach der

Hydratation von Bulkmaterial vorliegen. Bei den gemessenen Teilchengrößen

(Abb. 59, Werte für 38°C Lagerung), vor allem bei den hochdruckhomogenisierten

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

87

Proben, handelt es daher mit großer Wahrscheinlichkeit um die Größen von

Vesikeln, die erst durch den notwendigen Verdünnungsschritt aus den sehr großen

Lipidpartikeln entstanden sind.

Im Gegensatz zum DMPC bildet DPPC bei den hier erprobten Lagerbedingungen

keine Nanotubes aus. Auch Versuche, durch Verringerung der Ausgangsliposomen-

größe (durch Ultraschalldispergierung über 30 Minuten) und Variation der Lagerungs-

temperaturen (zusätzlich 13°C und 28°C) eine Nanotubebildung zu erreichen,

brachten keinen Erfolg. Vielmehr erwiesen sich die durch Ultraschall hergestellten

Liposomendispersionen mit mittleren Teilchengrößen von 100 nm bei Lagerungs-

temperaturen von 2 - 8°C, 13°C, 23°C und 28°C als sehr stabil (Daten nicht gezeigt).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Liposomendispersionen aus reinem DPPC

im Vergleich zu DMPC bei Lagerung in der Gelphase eine gute Lagerstabilität

aufweisen. Es wurde gezeigt, dass die Extrusion durch isopore Polycarbonat-

Membranen mit dem EmulsiFlex C5, wie schon bei DMPC-Dispersionen und

Dispersionen aus einer Mischung von DMPC und DPPC beschrieben, homogenere

und stabilere Liposomendispersionen als die Hochdruckhomogenisation mit dem

Micron Lab 40 liefert. DPPC ist unter vergleichbaren Bedingungen, also bei Lagerung

von Dispersionen in der Gelphase, nicht in der Lage, Nanotubes zu bilden; eine

Gelbildung findet nicht statt.

Ergebnisse

_________________________________________________________________________________

88

Abb. 60 : Gefrierbruch-TEM Aufnahmen 10%iger DPPC-Dispersionen, hergestellt mittels Hochdruck-homogenisation (links) bzw. Extrusion (rechts), nach 10 Monaten Lagerung bei 2 - 8°C (oben), 23°C (Mitte) und 38°C (unten). Bei 2 - 8°C und 23°C sind nach einer 10-monatigen Lagerdauer Liposomen dominierend, wobei die Hochdruckhomogenisation kleinere Teilchengrößen (< 100 nm) hervorruft, während die durch Extrusion hergestellten Liposomen etwa 100 bis 200 nm groß sind. Lagerung bei 38°C führt zu einer umfassenden Fusion der Liposomen infolge derer ausgedehnte Lipidpartikel entstehen.

100 nm 100 nm

2-8°C; Hochdruckhomogenisation 2-8°C; Extrusion

100 nm 100 nm

23°C; Hochdruckhomogenisation 23°C; Extrusion

200 nm 100 nm 200 nm

38°C; Hochdruckhomogenisation 38°C; Extrusion

Diskussion

____________________________________________________________________ 89

4. Diskussion In der vorliegenden Arbeit wurde ausgehend von der Frage nach der Lagerstabilität

von DMPC-Dispersionen gesättigter Phosphatidylcholine in der Gelphase ein spezi-

elles Gelbildungsphänomen aufgezeigt. Ziel der Arbeit war es, den Mechanismus der

beobachteten Gelbildung zu klären, wozu umfangreiche elektronenmikroskopische

Untersuchungen durchgeführt wurden. Als Grundbaustein des Gelgerüstes wurde

eine neue Spezies von Nanotubes entdeckt, deren Charakterisierung wegen ihrer

Neuartigkeit sowie ihrer gravierenden Auswirkungen auf die Lagerstabilität der Di-

spersionen ins Zentrum der vorliegenden Arbeit gestellt wurde. Im Hinblick auf eine

potenzielle pharmazeutische Anwendung der DMPC-Nanotubes sollten Einflüsse der

Herstellungsmethode sowie lipidartiger Verunreinigungen auf die Nanotubebildung

untersucht sowie erste Erfahrungen zur Anwendung verschiedener Konservierungs-

mittel gesammelt werden. Reinheitsuntersuchungen an verschiedenen DMPC-Char-

gen bildeten wegen ihrer Relevanz für die Nanotubebildung einen weiteren Schwer-

punkt.

4.1. Vorstellungen zur Morphologie der Nanotubes im Vergleich zu bereits bekannten tubulären Strukturen

Mittels Transmissionselektronenmikroskopie konnte unter Anwendung verschiedener

Präparationstechniken die Morphologie der Nanotubes aufgeklärt werden. Beim Be-

stimmen der Nanotubedurchmesser aus den elektronenmikroskopischen Aufnahmen

fallen deutliche Unterschiede zwischen Proben, die mittels Negativkontrastierung

präpariert wurden (40 - 50 nm, vgl. Abb. 15, S. 35) und Proben, die mit Kryo-Elektro-

nenmikroskopie untersucht wurden (35 - 40 nm, vgl. Abb. 17, S. 38), auf. Dieses

Phänomen lässt sich durch den notwendigen Trocknungsschritt während der Nega-

tivkontrastierung erklären, infolge dessen Hohlkörper, wie die hier beschriebenen,

kollabieren können.

Olsen et al. (Olsen et al., 1979) haben für die Negativkontrastierung einen Korrektur-

faktor von 0,75 zur Berechnung von "wahren" Liposomendurchmessern aus ge-

messenen Liposomendurchmessern eingeführt. Sie gingen davon aus, dass die

Liposomen während der Trocknung vollständig zu flachen Scheiben kollabieren. Un-

tersuchungen von Drechsler et al. haben allerdings gezeigt, dass frisch präparierte

kleinere Liposomen (d < 100 nm) nicht vollständig kollabieren, sondern vielmehr als

Halbkugeln bzw. Halbkugeln mit Vertiefungen bestehen bleiben (Drechsler,

Diskussion

____________________________________________________________________ 90

f = 0,75 f = 0,87 f = 0,87

r l

persönliche Mitteilung; Drechsler et al., 1995). Sie haben hierfür einen Korrektur-

faktor von 0,87 errechnet. Es ist allerdings zu beachten, dass bei längerer Lagerung

der Trocknungsprozess fortschreitet, wodurch sich die Morphologie mit der Zeit

weiter verändern kann. Abb. 61 zeigt eine schematische Darstellung der morpho-

logischen Veränderungen am Beispiel eines kugelförmigen Vesikels bei der

Negativkontrastierung mit den entsprechenden Korrekturfaktoren.

Abb. 61: Schematische Darstellung der morphologischen Veränderungen von Liposomen während des Trocknungsprozesses im Rahmen der Negativkontrastierung (nach Drechsler, unveröffentlicht). r l= Radius des Liposoms; r d = Radius der Scheibe; r h = Radius der Halbkugel bzw. einer deformier-ten Halbkugel. Die Darstellung ist übertragbar auf den Querschnitt eines Nanotubes. Der wahre Durchmesser (r l) ergibt sich durch Multiplikation des gemessenen Durchmessers r d bzw. r h mit dem entsprechenden Korrekturfaktor.

Geht man davon aus, dass die mittels Kryo-TEM ermittelten Durchmesser von etwa

35 - 40 nm die wahren Nanotube-Durchmesser darstellen, zeigt sich, dass der von

Drechsler et al. vorgeschlagene Korrekturfaktor von 0,87 eine bessere Korrelation

ergibt. Für die aus der Negative Staining Präparation ermittelten Durchmesser von

40 bis 50 nm ergeben sich unter Annahme des Korrekturfaktors von 0,87 wahre

Durchmesser von 34,4 bis 43,5 nm, was gut mit den mittels Kryo-TEM ermittelten

Durchmessern übereinstimmt. Bei der Annahme eines Korrekturfaktors von 0,75 wür-

den wahre Durchmesser zwischen 30 und 37,5 nm resultieren, diese Werte konnten

mittels Kryo-TEM jedoch nicht bestätigt werden. Es kann daher davon ausgegangen

werden, dass in Analogie zu den Beobachtungen von Drechsler et al. die Nanotubes

bei der Negative Staining Präparation nicht vollständig kollabieren, sondern abhängig

vom Trocknungsgrad als mehr oder weniger intakte halbrunde Schläuche bestehen

bleiben. Der wahre Durchmesser der Nanotubes kann somit auf ca. 35 - 45 nm ein-

gegrenzt werden.

Als Ergebnis der elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit den verschiedenen

Präparationsmethoden kann eine Modellvorstellung für die Morphologie der DMPC-

Nanotubes entwickelt werden (Abb. 62). Die Streifen entlang des Nanotubes kenn-

zeichnen die geschraubte Rippelstruktur (vgl. Abb. 15 und 20).

Diskussion

____________________________________________________________________ 91

Abb. 62: Modellvorstellung für die Morphologie der DMPC-Nanotubes. Die Wand wird von einem ein-zelnen Bilayer gebildet. Die Abmessungen ergeben sich nach Ausmessung der elektronenmikrosko-pischen Aufnahmen. Die Schraubungsrichtung der Rippelstruktur verläuft bezüglich der Ausbreitungs-richtung entlang der Längsachse eines Nanotubes entgegen dem Uhrzeigersinn (= linkshändig). Ein Umlauf einer Rippel ergibt einen Abstand von 2 Rippeln

In Tab. 21 sind die morphologischen Eigenschaften der Nanotubes und anderer,

ausschließlich phospholipidbasierter, tubulärer Strukturen gegenübergestellt (sche-

matische Darstellung der Strukturen: siehe Abb.6, S.12). Die DMPC-Nanotubes sind

aufgrund ihres Aufbaus klar von den anderen Strukturen abzugrenzen: Neben ihrer

Größe unterscheiden sie sich vor allem in der Anzahl der die Tubuluswand bildenden

Bilayerschichten und darin, dass die Enden der DMPC-Nanotubes im Gegensatz zu

allen anderen tubulären Strukturen geschlossen sind.

DMPC-Nanotubes Cochleate Microtubes Nanotubes Lipid(e) DMPC z.B. Phosphatidyl-

serin + Calcium-ionen

DC8,9PC u.a. polymerisierbare Phosphatidylcholine

DC8,9PC + DNPC

Durchmesser ca. 40 nm 200 - 1000 nm 400 - 1000 nm 50 - 60 nm Länge mehrere µm mehrere µm 1 - 200 µm 10 - 100 µm Lamellarität unilamellar multilamellar oligolamellar

(1 - 10 Bilayerschichten)

oligolamellar (2 - 4 Bilayerschichten)

wässriger Innenraum

ja nein ja ja

Aussehen der Enden

geschlossen durch halbrunde Kappen

offen offen offen

Oberflächen-strukturierung

helikal undulierter Bilayer, Ganghöhe ca. 23 nm, Windung linkshändig

keine z.T. helikale Streifung erkennbar

keine

Tab. 21: Gegenüberstellung der Eigenschaften verschiedener tubulärer Lipidstrukturen. DMPC: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin; DC8,9PC (auch DC23PC): 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin; DNPC: 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin.

Charakteristisch und einzigartig ist weiterhin die gleichmäßige helikale Undulierung

des Bilayers, die bezüglich des Aussehens und der Ganghöhe (ca. 23 nm) etwa der

Periodizität eines symmetrisch modulierten Bilayers der Ripple Phase vergleichbar ist

Durchmesser 35 - 45 nm

Ganghöhe ca. 23 nm

Ende durch halbrunde Kappe geschlossen

Drehsinn der linkshändigen

helikalen Windungen

Diskussion

____________________________________________________________________ 92

(25 - 30 nm, Meyer & Richter, 2001). Die DMPC-Nanotubes lassen sich somit in

keine Gruppe der bekannten tubulären Strukturen einordnen und können als neue,

eigenständige Spezies von Vesikeln mit tubulärer, gerippelter Struktur aufgefasst

werden.

4.2. Überlegungen zum Entstehungsmechanismus der Nanotubes

Neben morphologischen Unterschieden zu den bekannten tubulären Strukturen wei-

sen die DMPC-Nanotubes weiterhin Unterschiede hinsichtlich der Bildungsvorausset-

zungen auf, die Vermutungen auf einen möglichen Entstehungsmechanismus zulas-

sen.

Obwohl die Microtubes polymerisierbarer Phospholipide und Cochleaten sich mor-

phologisch voneinander unterscheiden (siehe Abb.6 und Tab. 21), wird für ihre Ent-

stehung, gestützt durch elektronenmikroskopische Beobachtungen, ein vergleichba-

rer Bildungsmechanismus diskutiert (Schnur et al., 1987). Eine zentrale Rolle spielt

für beide Strukturen das Durchlaufen des Phasenübergangs aus der Lα-Phase in die

Gelphase. Dieser Phasenübergang wird im Falle der Microtubes durch langsame

Temperaturerniedrigung knapp unterhalb die Kettenschmelztemperatur, im Falle der

Cochleate isotherm durch Calciumzugabe induziert. Entscheidend scheint in diesem

Zusammenhang die Verringerung der Hydratation der polaren Kopfgruppe zu sein.

Die Vorstufe von Tubes der polymerisierbaren Phospholipide bilden große multi-

lamellare Vesikel. Unterschreiten die Ausgangsliposomen hingegen eine bestimmte

Größe (etwa 1 µm), unterbleibt die Tubebildung (Yager et al., 1985; Rudolph &

Burke, 1987; Schnur et al., 1987). Als Mechanismus gilt ein Aufrollen großer Vesikel

bzw. Bilayer um eine Tubulusachse (Yager et al., 1988). Da gelegentlich eine heli-

kale Streifung der Microtubes beobachtet wird, wird auch eine Bildung über die

Fusion von spiralig gewundenen Lipidbändern diskutiert (Schnur et al., 1994). Ausge-

hend von kleinen unilamellaren Vesikeln ist eine direkte Transformation in Micro-

tubes nicht möglich. Sie fusionieren zunächst bei drastischer Temperaturerniedri-

gung zu großen Bilayerstapeln, die ihrerseits nach Transformation in die Lα-Phase

und anschließendem Durchlaufen des Phasenübergangs aus der Lα-Phase in die

Gelphase Microtubes bilden (Rudolph & Burke, 1987; Burke et al., 1988).

Die Bildung von Cochleaten erfolgt ausgehend von kleinen unilamellaren Vesikeln.

Diese fusionieren bei Anwesenheit von Calcium zu großen Bilayern, die sich an-

schließend ohne Freilassung wässriger Innen- und Zwischenräume zu den Cochle-

Diskussion

____________________________________________________________________ 93

aten Lipidzylindern aufrollen (Papahadjopoulos, 1975). Der Prozess dieser Transfor-

mationen zu Microtubes bzw. Cochleaten vollzieht sich spontan innerhalb von Mi-

nuten. Die entstehenden tubulären Strukturen führen nicht zu einer Gelierung des

Systems.

In den 90er Jahren wurde die Bildung von Lipid-Nanotubes (siehe Abb.6 und

Tab. 21) ausgehend von einer äquimolaren Mischung des microtubebildenden

DC8,9PC mit dem kurzkettigen gesättigten DNPC beschrieben (Markowitz et al.,

1994; Svenson & Messersmith, 1999). Von den Autoren wird ein den Microtubes

ähnlicher Bildungsmechanismus ausgehend von großen Vesikeln vermutet. Der

Prozess der Transformation ist innerhalb von Minuten abgeschlossen. Nach weiterer

Inkubation bei Raumtemperatur transformieren die Nanotubes zu oligolamellaren,

helikal gewundenen Bändern. Diese bilden ein ausgedehntes dreidimensionales

Netzwerk, was sich in einer Gelierung der Dispersion niederschlägt.

Wie bei den oben erwähnten Microtubes und Cochleaten spielt auch bei den hier

erstmalig beschriebenen DMPC-Nanotubes der Übergang in die Gelphase eine

entscheidende Rolle. Im Rahmen der Arbeit wurde deutlich, dass neben der

Teilchengröße die Lagerungstemperatur einen entscheidenden Einfluss auf die

Bildung der Nanotubes hat: Nanotube- und Gelbildung wurden immer dann

beobachtet, wenn die Dispersionen bei 13°C gelagert wurden. Auf den ersten Blick

scheint es so, als sei eine Lagerung der Dispersionen knapp unterhalb des

Vorübergangs (Tp) zwischen der Lβ`-und der Pβ`-Phase von Bedeutung, legt man das

Phasenverhalten von vollständig hydratisiertem Bulkmaterial zu Grunde. Es ist je-

doch zu beachten, dass sich das Phasenverhalten kleiner unilamellarer Vesikel

(SUV) deutlich vom Phasenverhalten des Bulkmaterials bzw. multilamellarer Vesikel

(MLV) unterscheidet: Kodama et al. wiesen nach, dass eine Dispergierung von

DMPC-MLV`s zu SUV`s mittels Ultraschall zu einem Verschwinden des Vorüber-

gangs führt, während sich der Hauptübergang stark verbreitert. Zusätzlich zum ur-

sprünglichen Hauptpeak (Tm, etwa 24°C, hier als primärer Peak bezeichnet) ent-

wickelt sich bei steigendem Anteil an SUV`s ein sehr breiter, so genannter

sekundärer Peak mit einem Maximum bei etwa 19°C. Das Verschwinden des primä-

ren und Wachsen des sekundären Peaks ist ein gradueller Prozess, der mit zuneh-

mender Beschallungszeit fortschreitet. Das DSC Thermogramm einer SUV-Disper-

sion wird schließlich durch den sekundären Peak bei 19°C dominiert, der eine

Diskussion

____________________________________________________________________ 94

schwache Schulter bei niedrigeren Temperaturen aufweist. Der primäre Peak bei

höherer Temperatur ist nur noch schwach als Schulter sichtbar. Der Temperaturbe-

reich des Phasenübergangs liegt zwischen ca. 12°C und 30°C (Kodama et al., 1993).

Eigene DSC Untersuchungen (Daten in der Arbeit nicht gezeigt) frisch hergestellter

Dispersionen bestätigten die vorgestellten Veränderungen des thermoanalytischen

Verhaltens von DMPC infolge Dispergierung. Außerdem zeigte sich ein deutlicher

Unterschied in den DSC Thermogrammen von hochdruckhomogenisierten im Ver-

gleich zu extrudierten Dispersionen: Der sekundäre Peak bei 19°C war bei hoch-

druckhomogenisierten Proben stärker ausgeprägt als bei den extrudierten Proben.

Das bestätigte die Ergebnisse der Teilchengrößenmessungen und elektronenmikro-

skopischen Untersuchungen, nach denen die hochdruckhomogenisierten Disper-

sionen einen höheren Anteil an SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln aufweisen. Da die

Ergebnisse dieser Arbeit darauf hindeuten (wird nachfolgend diskutiert), dass SUV`s

bzw. noch kleinere Lipidpartikel die entscheidende Rolle für die Nanotubebildung

spielen, ergibt sich, dass sich die Lipide der relevanten Vesikel bei 13°C nicht knapp

unterhalb des Vorübergangs zwischen den beiden Gelphasen befinden, sondern

vielmehr im Bereich des Übergangs von der Lα-Phase in die Gelphase.

Im Gegensatz zu den bekannten tubulären Strukturen dauert die Transformation

einer DMPC-Dispersion in ein hauptsächlich aus Nanotubes bestehendes System

allerdings mehrere Tage (erste Nanotubes sind nach etwa einer Woche zu finden)

bis Wochen.

Im Rahmen der Arbeit konnten trotz intensiver elektronenmikroskopischer Unter-

suchungen keine eindeutigen Hinweise auf den Mechanismus der Nanotubebildung

in Form von Übergangsstrukturen gefunden werden. Es gibt keine Anzeichen dafür,

dass vor der Nanotubebildung verstärkt ausgedehnte Bilayer oder große multi-

lamellare Vesikel gebildet werden. Zwar zeigen viele TEM-Aufnahmen von gelierten

Systemen neben Nanotubes auch derartige Strukturen, allerdings konnte ihre Exi-

stenz auch bereits direkt nach der Herstellung nachgewiesen werden. Auch helikale

Bänderstrukturen, wie sie beispielsweise im Zusammenhang mit Nanotubes aus

DC8,9PC / DNPC beschrieben wurden, wurden in reinen DMPC-Dispersionen nie

gefunden. Vielmehr deuten die vorgelegten Ergebnisse der elektronenmikrosko-

pischen Untersuchungen darauf hin, dass im Gegensatz zu den bisher bekannten

tubulären Strukturen kleine unilamellare Vesikel (SUV`s) und kleinste Lipidpartikel

die direkte Vorstufe für die Nanotubes darstellen. Untersuchungen zum Einfluss der

Diskussion

____________________________________________________________________ 95

Herstellungsmethode haben eindeutig gezeigt, dass mit zunehmendem "Feinheits-

grad" der DMPC-Dispersionen die gelierungsverursachende Nanotubebildung forciert

wird. Aus multilamellaren Vesikeln (MLV`s) und großen Lipidpartikeln bzw. Bilayern

von undispergiertem DMPC hingegen wurden innerhalb von 3,5 Monaten nachweis-

lich keine Nanotubes gebildet. Die Irreversibilität der Transformation von Nanotubes

zu großen Vesikeln bzw. Bilayerbereichen durch Temperaturerhöhung unterstützt

diese Hypothese. Dem gegenüber steht eine Beobachtung von Meyer et al. (Meyer

et al., 1998, 2000): Die Autoren beschreiben mittels Gefrierbruch-TEM im Zu-

sammenhang mit konvex-konkaven Bilayerdeformationen bei kalt hydratisiertem (4 -

8°C), undispergiertem DMPC das gelegentliche Auftreten einer den Nanotubes

ähnlichen Struktur. Die Autoren vermuten, dass sich ein solcher "schraubenartig

strukturierter Konus" aus helikal gewundenen Bändern entwickelt (Meyer & Richter,

2001). Weiterführende Untersuchungen zur Charakterisierung dieser Strukturen

sowie ihrer Bildung wurden jedoch nicht beschrieben.

Berücksichtigt man weiterhin den vergleichsweise kleinen Nanotuberadius sowie die

Tatsache, dass die Nanotubes ausnahmslos unilamellar und ihre Enden geschlossen

sind, erscheint es unwahrscheinlich, dass ein den Microtubes und Cochleaten ähn-

licher Entstehungsmechanismus über das Aufrollen von Bilayern zugrunde liegt.

Vielmehr ist als mögliche Zwischenstufe einer direkten Fusion von SUV`s und kleinen

Lipidpartikeln eine perlschnurartige Zusammenlagerung von zwei oder mehreren

Partikeln denkbar. Ein entsprechendes Modell für die Entstehung der DMPC-Nano-

tubes wird in Abb. 63 vorgeschlagen. Dass diese vorgeschlagenen Zwischenstufen

elektronenmikroskopisch nicht nachgewiesen werden konnten, kann zwei Gründe

haben: Für Negativkontrastierung und Kryo-TEM wurden die Proben stark verdünnt

und mechanisch beansprucht, wodurch agglomerierte Vesikel getrennt worden sein

können. Bei der Gefrierbruch-Präparation hingegen wird zwar die native,

unbehandelte Probe verwendet, jedoch verläuft der Bruch durch die Probe rein

zufällig und die Wahrscheinlichkeit, dass die Bruchebene ausgerechnet senkrecht

zur Fusionsebene zweier kleiner Vesikel verläuft, muss als gering eingeschätzt

werden.

Die Möglichkeit, dass Nanotubes über die Assoziation gelöster DMPC-Monomere

gebildet werden, kann wegen der extrem niedrigen CMC (critical micelle

concentration) von Phosphatidylcholinen mit gesättigten Fettsäureketten (weniger als

10-9 M) ausgeschlossen werden.

Diskussion

____________________________________________________________________ 96

Abb. 63: Modellvorstellung zur Entstehung von DMPC-Nanotubes aus SUV`s und kleinen Lipidparti-keln und ihrem Abbau durch Temperaturerhöhung. Auf die Darstellung der geschraubten Rippel-struktur der Nanotubes wurde aus Gründen der Vereinfachung in dieser Modellzeichnung verzichtet. SUV`s: kleine unilamellare Vesikel; MLV`s: multilamellare Vesikel; MVV`s: multivesikuläre Vesikel.

Es ist allgemein bekannt, dass kleine unilamellare Vesikel wegen der starken

Krümmung ihrer Bilayer und Packungsdefekten vergleichsweise instabil sind und

daher stärker als große Vesikel zur Fusion neigen. Die Frage, aus welchem Grund

die Nanotubes und nicht LUV`s (große unilamellare Vesikel) oder MLV`s (multi-

lamellare Vesikel) das offensichtlich bevorzugte Produkt der Fusion von fein disper-

giertem DMPC bei Lagerung bei 13°C darstellen, lässt sich bis jetzt nur hypothetisch

beantworten. Ein Anhaltspunkt ergibt sich bei der Berücksichtigung des so genann-

ten Lipid Flip-Flops. Der Flip-Flop, d.h. der Platzwechsel eines Lipidmoleküls zwi-

schen dem äußeren und inneren Monolayer der Doppelschicht, ist in der Gelphase

extrem gehemmt und benötigt Wochen (Lasic, 1993). Für die Fusion von SUV`s und

kleinsten Lipidpartikeln zu größeren Vesikeln mit geringerer Krümmung des Bilayers

ist aber genau dieser Flip-Flop notwendig, da sich in kleinen Vesikeln im äußeren

Monolayer deutlich mehr Moleküle befinden als im inneren Layer (Verhältnis

zwischen äußerem zu innerem Monolayer etwa 2:1 in SUV`s). In großen Vesikeln ist

dieses Verhältnis etwa 1:1. In einer exemplarischen Überschlagsrechnung kann ge-

zeigt werden (Abb. 64), dass für die Fusion von 20 SUV`s (d = 30 nm) zu einem

zylindrischen Nanotube nahezu gleicher Molekülzahl (Durchmesser = 40 nm, Län-

ge = 386 nm) etwa 25% DMPC-Moleküle weniger den Flip-Flop vom äußeren in den

inneren Layer durchführen müssen, als wenn diese 20 SUV`s zu einem kugelförmi-

gen LUV ebenfalls nahezu gleicher Molekülzahl (Durchmesser = 121 nm) fusionieren

würden.

Für die Berechnung wurde ein Platzbedarf eines DMPC-Moleküls innerhalb eines

Monolayers in der Lβ´-Phase von 0,46 nm2 sowie eine Bilayerdicke von 4,2 nm zu-

MLV`s, MVV`s, ausgedehnte Lipidpartikel Nanotube

T ≤ 13°C

SUV`s und Lipidpartikel

< 50 nm

T ↑ T > 15°C

mögliche Zwischenstufen (Agglomerate)

Diskussion

____________________________________________________________________ 97

grunde gelegt (Cevc, 1993). Gemäß der Berechnung der Oberfläche einer Kugel (für

SUV und LUV) bzw. der Mantelfläche eines Zylinders zuzüglich der Oberfläche

zweier Halbkugeln (geschlossenes Nanotube) lässt sich die Anzahl der DMPC-

Moleküle im äußeren und inneren Layer abschätzen. Es wird ersichtlich, dass die

Fusion von SUV`s bzw. kleinsten Lipidpartikeln zu Nanotubes unter dem Gesichts-

punkt des in der Gelphase gehemmten Flip-Flops vorteilhafter ist als die Fusion zu

LUV`s.

Anzahl Moleküle im äußeren Layer (= äL)

99 941

122 860

105 395

Anzahl Moleküle im inneren Layer (= iL)

86 546

63 700

81 450

Gesamtzahl Moleküle (äL+iL)

186 487 186 560 186 845

Verhältnis äL / iL 1,15 : 1 1,9 : 1 1,3 : 1

Abb. 64: Ergebnisse der Überschlagsrechnung zum notwendigen Platzwechsel (Flip-Flop) von DMPC-Molekülen bei der Fusion von SUV`s zu einem Nanotube im Vergleich zur Fusion zu einem LUV in der Gelphase. Die Gesamtzahl an DMPC-Molekülen ist in alle drei Fällen nahezu gleich. Die Oberfläche einer Kugel errechnet sich nach A = 4 π r2. Für den äußeren Layer wird der Vesikelradius r = d / 2 eingesetzt, für den inneren Layer der Vesikelradius abzüglich 4,2 nm (Dicke des Bi-layers = 4,2 nm ). Die Oberfläche eines Nanotubes wird vereinfacht aus der Mantelfläche eines Zylinders (M = 2 π r l mit l = lN - 2r) zuzüglich der Oberfläche zweier Halbkugeln berechnet. Für den inneren Layer wird der Radius r abzüglich 4,2 nm eingesetzt. Durch Division der errechneten Ober-flächen durch den Platzbedarf eines einzelnen DMPC-Moleküls erhält man die Anzahl an DMPC-Molekülen im äußeren und inneren Layer.

Betrachtet man außerdem die durch eine Fusion bedingte Vergrößerung der von den

Bilayern umschlossenen wässrigen Volumina wird deutlich, dass die Fusion von 20

SUV`s zu einem Nanotube eine geringere Penetration von Wasser durch die Lipid-

doppelschicht erfordert (nur etwa die Hälfte) als eine Fusion zu einem LUV. Da die

Lipiddoppelschichten kleiner unilamellarer Vesikel allerdings wegen der Packungs-

Flip-Flop: ca. 22 900 Moleküle

Flip-Flop: ca. 17 400 Moleküle

LUV mit d = 121 nm

Nanotube mit d = 40 nm,

lN = 386 nm

20 SUV`s mit d = 30 nm

Diskussion

____________________________________________________________________ 98

defekte sehr gut wasserdurchlässig sein dürften, erscheint dieses Argument im Ge-

gensatz zur Relevanz des Lipid Flip-Flops für die Nanotubebildung von untergeord-

neter Bedeutung zu sein.

Dass die Nanotubes die "Grundbausteine" für ein dreidimensionales Gelgerüst dar-

stellen, konnte in der Arbeit durch elektronenmikroskopische Nachweise netzartig

verwobener Nanotubes sowie durch die Beobachtung, dass eine Verflüssigung der

Gele durch Temperaturerhöhung mit dem Verschwinden der Nanotubes zu Gunsten

großer multilamellarer Vesikel einhergeht, belegt werden. Die Gelgerüststruktur

ähnelt der von Markowitz et al. und Svenson & Messersmith gezeigten Gelstruktur

aus vernetzten, helikal gewundenen Bändern (Markowitz et al., 1994; Svenson &

Messersmith, 1999). Im Unterschied zu den erwähnten Bänder-Gelen wurden in

DMPC-Gelen keine Anzeichen dafür gefunden, dass die Nanotubes an ihren Kon-

taktstellen miteinander fusioniert sind.

Aufgrund der starken Krümmung des Bilayers an den Enden der Nanotubes und der

damit verbundenen höheren Energie im Vergleich zum zylindrischen Abschnitt eines

Tubes ist es vorstellbar, dass die Nanotubes theoretisch einem permanenten Län-

genwachstum unterliegen können. Dagegen ist die Fusion eines SUV`s mit dem

zylindrischen Abschnitt des Tubes unwahrscheinlich, da seitens des Nanotubes neue

gekrümmte Flächen geschaffen werden müssten, was energetisch ungünstig ist. Tat-

sächlich traten nie verzweigte Nanotubes auf. Eine Grundvoraussetzung für das

"Wachstum" der Nanotubes gemäß der oben beschriebenen Hypothese ist ein aus-

reichendes Angebot an SUV`s, Lipidpartikeln oder anderen Nanotubes, um eine aus-

reichende hohe Kollisionswahrscheinlichkeit als ersten Schritt für eine Fusion zu ge-

währleisten. Tatsächlich belegen die Untersuchungen zum Einfluss der Herstellungs-

methode, dass Dispersionen mit einem höheren Anteil kleiner, packungsfrustrierter

Vesikel bzw. Lipidpartikel bereits innerhalb eines kürzeren Zeitraums eine ausge-

prägtere Gelierung zeigen als Dispersionen mit geringerem "Feinanteil", woraus eine

Korrelation zwischen der Anzahl an kleinen fusionsrelevanten Partikeln und Lipo-

somen (und damit ihrer Kollisionswahrscheinlichkeit) und der die Gelierung verur-

sachenden Nanotubeentstehung abgeleitet werden kann. Allerdings dauert das

Auftreten der Gelierung als makroskopisch wahrnehmbarer Effekt der in ausgedehn-

ten Netzwerken verflochtenen Nanotubes auch hier mindestens 2 Wochen, was

Diskussion

____________________________________________________________________ 99

ebenfalls die Hypothese vom "schrittweisen" Längenwachstum der Nanotubes unter-

stützt (vgl. Abb. 63).

Die DMPC-Gele bilden unter mechanischer Beanspruchung (z.B. kräftiges Schütteln)

inhomogene, fließfähige Systeme, die sich auch nach mehrmonatiger Lagerung nicht

wieder verfestigen. Ähnlich wie bei der mechanischen Beanspruchung während des

Verdünnens für die Präparation zur Negativkontrastierung oder Kryo-TEM ist ein

"Zerbrechen" von Nanotubes sehr wahrscheinlich, worauf größere Gelstücke entste-

hen, die sich nun gegeneinander verschieben können und innerhalb derer die netz-

artige Struktur noch intakt ist. An den aufgebrochenen Enden der Nanotubes sind die

hydrophoben Kohlenwasserstoffketten der Lipidmoleküle nun dem direkten Kontakt

mit Wasser ausgesetzt, was energetisch ungünstig ist. Zur Energieminimierung sind

zwei Mechanismen denkbar: Einerseits könnten die Nanotubeenden durch Fusion

mit entsprechenden SUV`s oder Lipidpartikeln geschlossen werden. Die Geschwin-

digkeit dieses "Heilungsprozesses" hängt von der Verfügbarkeit fusionsrelevanter

Partikel ab. Das Resultat wären weiterhin voneinander getrennte Bereiche vernetzter

Nanotubes, die Probe bliebe makroskopisch fließfähig. Andererseits ist auch eine

Fusion von zwei offenen Nanotubeenden denkbar. Im Ergebnis könnten die ge-

trennten Nanotubebereiche zumindest teilweise wieder "zusammenwachsen", was

eine Verfestigung des Systems zur Folge haben würde. Allerdings ist aufgrund der

erhöhten Viskosität ein "passgenaues" Zusammentreffen zweier Nanotubeenden ver-

hältnismäßig unwahrscheinlich. Die Beobachtung, dass sich durch Schütteln ver-

flüssigte Gele auch nach mehrmonatiger Lagerung nicht wieder verfestigen, deutet

auf eine untergeordnete Bedeutung der letztgenannten Möglichkeit hin. Den Prozess

mittels Elektronenmikroskopie zu verfolgen, ist wegen der bereits (im Ergebnisteil)

erwähnten unterschiedlichen Präparationsmanipulationen und der damit verbun-

denen Probleme nicht möglich; eine Verfolgung des Prozesses mittels Lichtmikrosko-

pie verbietet sich aufgrund der Dimensionen der beteiligten Vesikel. Somit können

keine verbindlichen Aussagen über eine mögliche "Heilung" zerstörter Nanotubes

nach mechanischer Belastung getroffen werden.

Über die molekulare Organisation der Lipidmoleküle innerhalb der Nanotubes kann

nur spekuliert werden, da im Rahmen der vorliegenden Arbeit keine Untersuchungen

zur Klärung der molekularen Struktur durchgeführt wurden. Die erarbeiteten Erkennt-

nisse über die DMPC-Nanotubes zeigen jedoch einige Parallelen zu den Microtubes,

Diskussion

____________________________________________________________________ 100

so dass ähnliche Ordnungsphänomene als treibende Kraft für die Nanotubeent-

stehung angenommen werden können.

Innerhalb der Microtubes wird, basierend auf fluoreszenzmikroskopischen Beobach-

tungen, spektroskopischen Befunden (Raman-Spektroskopie, 1H-NMR, FTIR) und

Polymerisationsexperimenten ein hoher Ordnungsgrad der Acylketten angenommen

(Schoen et al., 1987; Rudolph et al., 1989; Plant et al., 1990). Spätere Röntgenunter-

suchungen haben ergeben, dass bei der Microtubebildungstemperatur die lamellare

Lα-Phase (fluide Fettsäureketten) und die Lβ`-Phase (kristalline Fettsäureketten,

geneigt bezüglich der Bilayernormalen) koexistent sind. Die Autoren schlußfolgern,

dass die wesentliche Triebkraft der Tubebildung die Kristallisation der Acylketten dar-

stellt (Thomas et al., 1995). Wie bei den Microtubes findet - unter Annahme der

Hypothese über die Fusion von SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln - die Bildung der

DMPC-Nanotubes im Bereich des Übergangs von der Lα-Phase in die Gelphase

statt, was ein Indiz dafür ist, dass auch hier die Kristallisation der Fettsäureketten von

Bedeutung ist.

Viele Vorstellungen zur Entstehung tubulärer Strukturen gehen außerdem davon

aus, dass die Chiralität der Lipidmoleküle eine wichtige Rolle spielt (Chappell &

Yager, 1991; Thomas et al., 1995). Schnur et al. konnten anhand Zirkulardichroismus

Untersuchungen zeigen, dass die molekulare Packung der Lipidmoleküle innerhalb

eines Microtubes chiral ist, während die Packung der Lipidmoleküle innerhalb sphä-

rischer Vesikel nicht chiral ist (Schnur et al., 1994). Alle DMPC-Nanotubes zeigen

eine Rippelstruktur, die linkshändig geschraubt ist. Daher scheint auch hier die

Chiralität der eingesetzten Lipidmoleküle für die resultierende Struktur eine Rolle zu

spielen. Weiterführende Untersuchungen könnten zeigen, ob sich mit dem D-

Enantiomer des DMPCs Nanotubes mit einer im Uhrzeigersinn geschraubte Rippel-

struktur (rechtshändig) ergeben würden.

Aufbauend auf den dargelegten Erkenntnissen über die Nanotubes eröffnet sich ein

weites Feld für weiterführende Strukturuntersuchungen, die dazu beitragen können,

die Natur dieser für gesättigte Phosphatidylcholine einzigartigen Struktur besser zu

verstehen.

4.3. Der Einfluss von Zusätzen auf die Nanotubebildung

Im Rahmen der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Konservierungsmittel sowie

lipidartiger Verunreinigungen auf die Nanotubebildung untersucht.

Diskussion

____________________________________________________________________ 101

Für keines der untersuchten Konservierungsmittel (Thiomersal, Parahydroxybenzoe-

säureester und Natriumazid; Strukturformeln siehe Abb.36, S. 55) wurde ein Einfluss

auf die Bildung der Nanotubes festgestellt, obwohl im Gegensatz zu Thiomersal bei

den Parahydroxybenzoesäureestern und auch bei der Verwendung von Natriumazid

Veränderungen des thermoanalytischen Verhaltens des undispergierten Bulkmaterial

nachgewiesen wurden. Obwohl die Parahydroxybenzoesäureester und Natriumazid

in vergleichbaren Molmengen eingesetzt wurden (DMPC / Natriumazid etwa 20:1;

DMPC / Parabene etwa 24:1), beeinflussten sie das Phasenverhalten unterschiedlich

stark, was wahrscheinlich in ihrer unterschiedlichen chemischen Struktur begründet

ist. Die Parahydroxybenzoesäureester sind lipophil, was eine Einlagerung in die

Lipiddoppelschicht begünstigt. Sie erniedrigten sowohl den Vor- als auch den Haupt-

übergang, was dafür spricht, dass die Wechselwirkungen der organischen Moleküle

mit den Bilayern eine Störung der Ordnung innerhalb der Bilayer bewirken.

Der Einfluss von Natriumazid war nur schwach ausgeprägt und äußerte sich in einer

leichten Verschiebung des Peakmaximums des Vorübergangs zu höheren Tempera-

turen, während jedoch die Onset-Temperatur unverändert bleib. Für einwertige Kat-

ionen wie Natrium ist beschrieben, dass sie keine signifikanten Effekte auf das

Phasenverhalten gesättigter Phosphatidylcholine, wie beispielsweise DPPC, verur-

sachen (Jain & Wu, 1977).

Dass Thiomersal keine Effekte auf das Phasenverhalten ausübt, liegt wahrscheinlich

zum einen an seiner guten Wasserlöslichkeit, die einer Einlagerung in die Lipiddop-

pelschicht entgegenwirkt, und zum anderen an der geringen Konzentration: Bei der

üblicherweise eingesetzten Konzentration von 0,01% (m/V) bezogen auf die Wasser-

phase kommen bei einer 10%igen DMPC-Dispersion auf ein Thiomersalmolekül ca.

600 DMPC-Moleküle, bei 0,1% Thiomersal sind es dementsprechend ca. 60 DMPC-

Moleküle.

Ungeachtet der beschriebenen Wechselwirkungen zeigten alle Dispersionen unab-

hängig vom verwendeten Konservierungsmittel im Beobachtungszeitraum von 2 Mo-

naten ähnliche Eigenschaften und bildeten gelig-stückige Niederschläge bei 13°C, in

denen die Nanotubes nachgewiesen werden konnten.

Weiterhin wurde untersucht, ob geringe Mengen anderer Lipide oder ähnlicher Sub-

stanzen einen Einfluss auf die Eigenschaften der Dispersionen und die Nanotubebil-

dung haben. Als "Verunreinigungen" wurden Lysophosphatidylcholin, Myristinsäure

Diskussion

____________________________________________________________________ 102

(als mögliche Abbauprodukte infolge Hydrolyse) oder hydriertes Soja-Lecithin in je-

weils 1%iger Konzentration (m/m) bezogen auf den DMPC-Gehalt zugesetzt.

Die Untersuchungen ergaben, dass bei der Lysophosphatidylcholin enhaltenden Pro-

be nach der Dispergierung neben Liposomen auch fadenförmige Mizellen vorlagen.

Sie wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie identifiziert; eine quanitative

Aussage anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen zu treffen, war wegen

der Präparationsmanipulationen nicht möglich.

Obwohl die Lysophosphatidylcholin enthaltende Probe im Gegensatz zu den rest-

lichen drei Dispersionen makroskopisch nahezu klar war, was für das Vorliegen von

Mizellen typisch ist, schlug sich dieser Effekt in den Teilchengrößenmessungen nicht

nieder. Vielmehr ist in allen Proben, auch in der reinen DMPC-Dispersion, der über-

wiegende Anteil der Teilchen (ca. 98%) zwischen 5 und 50 nm groß. Dieser hohe

Anteil an extrem kleinen Teilchen liegt im hohen Homogenisierdruck (1000 bar) be-

gründet. Wie erwartet, sind die Dispersionen (mit Ausnahme der Lysophosphati-

dylcholin enthaltenden Probe) extrem instabil und gelieren bei 13°C innerhalb von 4

Wochen vollständig. Zum Vergleich: Bei der Verwendung desselben Lipids (DMPC 1)

führt ein Homogenisierdruck von nur 500 bar unter gleichen Lagerungsbedingungen

zwar zur Bildung inhomogen-stückiger Systeme, allerdings nie zu einer vollständigen

Gelierung, was wiederum die Hypothese von einer direkten Beteiligung kleinster

Lipidpartikel und SUV`s an der gelierungsverursachenden Nanotubebildung unter-

stützt.

Der Zusatz von Lysophosphatidylcholin bewirkt offenbar eine teilweise Transforma-

tion von DMPC-Vesikeln in fadenförmige Mischmizellen (vgl Abb. 48). Diese Trans-

formation lässt sich mit einem einfachen Modell in Anlehnung an die Theorie des

Packungsparameters von Israelachvili (siehe Abb. 2, S.3) beschreiben (Israelachvili

et al., 1977 & 1980). DMPC hat einen Packungsparameter von ~ 1, da der Volumen-

anteil der polaren Kopfgruppe und der beiden Alkylketten etwa gleich groß ist. In

Liposomen ist er wahrscheinlich wegen der Krümmung der Bilayer im äußeren

Monolayer etwas kleiner als 1, im inneren Monolayer etwas größer als 1. Lyso-

phosphatidylcholin hat einen Packungsparameter P < 1/3, was bedeutet, dass hier

der Volumenanteil der hydrophilen Kopfgruppe deutlich größer ist als der Volumen-

anteil der hydrophoben Kette. Die Einlagerung von Lysophosphatidylcholin in die

DMPC-Bilayer bewirkt eine wesentliche Verkleinerung des Packungsparameters in

der Umgebung des Lysophosphatidylcholins, so dass einige Liposomen "aufgelöst"

Diskussion

____________________________________________________________________ 103

werden und Mischmizellen entstehen (Abb. 65). Höchstwahrscheinlich würden höhe-

re Lysophosphatidylcholin-Konzentrationen zu einer vollständigen Überführung der

Phospholipidvesikel in ein mischmizellares System führen.

Abb. 65: Schematische Darstellung der Packungsverhältnisse eines SUV`s aus DMPC und einer fadenförmigen Mischmizelle aus DMPC und Lysophosphatidylcholin. Die Moleküle sind schematisch entsprechend ihres Packungsparameters dargestellt; die hydrophile Kopfgruppe ist durch einen ver-stärkten schwarzen Strich gekennzeichnet.

Der Zusatz von Myristinsäure oder auch hydriertem Soja-Lecithin führte hingegen zu

keiner vergleichbaren Vesikel-Mizell-Transformationen. Für Myristinsäure ist davon

auszugehen, dass sie, da die wässrige Phase neutral bis schwach sauer war, haupt-

sächlich in ihrer protonierten Form vorlag. Als lipophiles Molekül kann sie vor allem in

den lipophilen Teil des Bilayers eingelagert werden, ohne die Packungsgeometrie

entscheidend zu verändern. Hydriertes Soja-Lecithin stellt ein Gemisch verschie-

dener Phospholipidklassen dar, wobei laut Herstellerangaben Phosphatidylcholin mit

65 - 70% den Hauptanteil darstellt. Daneben sind etwa 7 - 10% Phosphatidylethanol-

amin, maximal 3% Lysophosphatidylcholin sowie maximal 3% Triglyceride enthalten

(Lipoid GmbH, 2001b). Alle Fettsäureketten sind gesättigt, für die enthaltenen

Phospholipide ist ein Packungsparameter von etwa 1 anzunehmen. Der Anteil an

Lysophosphatidylcholin ist vergleichsweise gering, so dass von dieser Seite bei der

eingesetzten niedrigen Konzentration keine gravierenden Veränderungen des

Packungsparameters zu erwarten sind.

Bezüglich der Nanotubebildung konnte gezeigt werden, dass weder Myristinsäure

noch hydriertes Soja-Lecithin in der verwendeten Konzentration einen Einfluss auf

die Nanotubebildung ausüben: Makroskopisch und auch bezüglich der Ultrastruktur

sind keine Unterschiede zur reinen DMPC-Dispersion feststellbar.

Beim Zusatz von Lysophosphatidylcholin hingegen bleibt die Gelbildung nach etwa 4

Wochen aus; erst nach 8 Wochen verfestigt sich die Probe. Die Ultrastruktur der

Probe wird neben den Nanotubes von zwei neuen Bänderstrukturen dominiert (vgl.

SUV d ~ 20 nm

Mischmizelle d ~ 5 nm, l ~ 50 nm

DMPC

Lysophos-phatidylcholin

Diskussion

____________________________________________________________________ 104

Abb. 49, S.68): Die Bänder sind entweder 20 - 25 nm oder 50 - 60 nm breit und in re-

gelmäßigen Abständen verdrillt. Ähnlich wie die Nanotubes sind die Bänder in der

Lage, ausgedehnte Netzwerke und somit ein Gel zu bilden. Aufgrund der beschriebe-

nen Ausgangsdispersion ergibt sich die Vermutung, dass sich die Nanotubes aus

verbliebenen "reinen" DMPC-Vesikel gebildet haben, während Lysophosphatidylcho-

lin an der Entstehung der Bänderstrukturen beteiligt zu sein scheint. So ist es

beispielsweise denkbar, dass die Bänder endliche DMPC-Bilayer darstellen, deren

Ränder durch Lysophosphatidylcholin vom umgebenden wässrigen Medium

abgeschirmt und somit stabilisiert werden. Offenbar herrscht innerhalb der Bänder

ein gewisser Twist-Winkel vor, der dazu führt, dass die Bänder in regelmäßige

Abständen verdrillt vorliegen.

4.4. Einfluss von zweiwertigen Kationen auf die Hydratations- und Dispersions- eigenschaften von DMPC

Im Rahmen der Arbeit wurden verschiedene DMPC-Chargen (siehe 2.2.1., Tab. 2)

zur Dispersionsherstellung verwendet, wobei Systeme mit zum Teil sehr unterschied-

lichen Eigenschaften resultierten. Aus Gründen der Reproduzierbarkeit im Hinblick

auf eine mögliche pharmazeutische Nutzung der Nanotubes war es wichtig, die Ursa-

che für diese chargenabhängigen Unterschiede zu klären.

Wichtig sind in diesem Zusammenhang bereits die makroskopischen Beobachtungen

während der Hydratation der Phospholipide: DMPC 2 und 5 bildeten einen weissen

Niederschlag mit nahezu klarer wässriger Phase als Überstand, DMPC 1, 3 und 4

bildeten bei gleicher Behandlung eine schleimig-zähe Masse, in die die gesamte

wässrige Phase inkorporiert war. Die DSC-Untersuchungen zeigten, dass die Über-

gangstemperatur des Vorübergangs bei den Lipiden 1, 3 und 4 deutlich niedriger ist

als bei den Lipiden 2 und 5. Parallel dazu durchgeführte Röntgenkleinwinkelmessun-

gen ergaben, dass sich bei Hydratation im Wasserüberschuss nur bei den Lipiden

2 und 5 eine multilamellare Phase ausbildet, während die Bilayer des Lipids 1 nur

teilweise eine lamellare Ordnung zeigen und bei den Lipiden 3 und 4 überhaupt

keine lamellare Ordnung festzustellen ist (vgl. Abb. 50, S. 73). All diese Befunde

sprechen für die Anwesenheit von Verunreinigungen in den Lipiden 1, 3 und 4, die

mit den hydrophilen Kopfgruppen interagieren, die Hydratation verbessern und die

Einarbeitung großer Mengen Wasser zwischen die Bilayerschichten ermöglichen, so

Diskussion

____________________________________________________________________ 105

dass diese auseinanderdriften, was auch in elektronenmikroskopischen Aufnahmen

des undispergierten DMPC 1 gezeigt werden konnte (Abb. 24, S.43).

Die dünnschichtchromatographischen Reinheitsuntersuchungen ergaben, dass zwi-

schen den Chargen hinsichtlich lipidartiger Verunreinigungen im Rahmen der Nach-

weisgenauigkeit keine Unterschiede bestehen. Im vorangegangenen Kapitel wurde

bereits gezeigt, dass Zusätze von Myrisinsäure bzw. hydriertem Soja-Lecithin in

1%iger Konzentration keine Veränderungen der Eigenschaften der Dispersionen her-

vorrufen. Auch eine unterschiedliche Vorbehandlung der Lipide kann als Versuracher

des unterschiedlichen Hydratations- und Dispergierverhaltens von DMPC ausge-

schlossen werden, da sich die Chargenunterschiede nach Anwendung einer für alle

Lipide gleichen Vorbehandlungsprozedur (Filmbildung aus Chloroform / Methanol)

nicht eliminieren ließen.

Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass zweiwertige Kationen eine ent-

scheidende Rolle für die Eigenschaften der verwendeten DMPC-Chargen spielen.

Bereits makroskopisch sind nach dem Entfernen von zweiwertigen Kationen mittels

Natrium-EDTA Unterschiede im Hydratationsverhalten der DMPC-Chargen 1, 3

und 4 festzustellen: Die Lipide bildeten im Wasserüberschuss nach zweitägiger Hy-

dratation analog zu den Chargen 2 und 5 weisse Niederschläge mit einem nahezu

klaren Überstand der wässrigen Phase. Die DSC-Untersuchungen der hydratisierten

Lipide haben gezeigt, dass die Phasenübergangstemperatur des Vorübergangs nach

Natrium-EDTA-Behandlung auf > 15°C ansteigt, was in etwa der ermittelten Phasen-

übergangstemperatur für die Lipide 2 und 5 entspricht. Analog ergaben die Röntgen-

kleinwinkelmessungen, dass die Lipide 1, 3 und 4 nach Natrium-EDTA-Behandlung

im Wasserüberschuss eine multilamellare Phase ausbilden. Diese Ergebnisse bele-

gen eindeutig, dass zweiwertige Kationen die Hauptursache für die variierenden Ei-

genschaften der verwendeten DMPC-Chargen darstellen.

Der beispielhafte Zusatz steigender Mengen Calciumionen zu DMPC der Charge 2

zeigt (vgl. Abb.55 und 56, S. 80, 81), dass möglicherweise bereits extrem geringe

Mengen an Kationen für die Verursachung der beschriebenen Abweichungen von

dem für DMPC zu erwartenden Phasenverhalten ausreichend sind: Eine Cal-

ciumchlorid-Konzentration von 1,89 mmol/l (entspricht einem Molverhältnis DMPC:

Calcium von etwa 80:1) bewirkt eine Senkung des Onsets der Vorübergangstempe-

ratur von 15,9°C auf 14,3°C sowie eine vollständige Unterbindung der Ausbildung

der multilamellaren Phase; das gequollene Phospholipid bildet eine viskose Masse

Diskussion

____________________________________________________________________ 106

ohne wässrigen Überstand. Die Wechselwirkungen des Kations mit der Kopfgruppe

von DMPC führt demnach zu einer weitreichenden Störung der Kettenordnung

innerhalb des Bilayers, wodurch die Konformationsumwandlung zwischen den

beiden Gelphasen erleichtert wird. Daraus ergibt sich die Erniedrigung der Tempera-

tur des Vorübergangs; die Temperatur des Hauptübergangs bleibt jedoch

unbeeinflusst. Die Einführung der Ladung in die Bilayer durch Wechselwirkungen des

Calciums mit einer oder meheren Kopfgruppen induziert durch verstärkte Hydratation

eine Bilayerkrümmung (Abb. 66), infolge derer die lamellare Schichtung der Bilayer

aufgeweitet bzw. zerstört wird. Weiterhin ist eine elektrostatische Abstoßung der

positiv geladenen Bilayer wahrscheinlich, was zusätzlich die Einlagerung von Wasser

zwischen die Bilayerschichten fördert. Das erklärt sowohl die makroskopischen

Veränderungen sowie das in den Röntgenkleinwinkelmessungen detektierte

Verschwinden der Peaks für die multilamellare Phase bei steigender Calciumchlorid-

Konzentration.

Abb. 66: Modellvorstellung zum Einfluss von Calciumionen auf das Hydratationsverhalten von DMPC und die Eigenschaften der Liposomen. Die Calciumionen sind schematisch mit ihrer Hydrathülle dargestellt.

+ Ca2+

Dispergierung

bzw.

Dispergierung

+ Na-EDTA

Nanotube Nanotube

Diskussion

____________________________________________________________________ 107

Die Dispergierung der verschiedenen DMPC-Chargen ergab, dass die resultierenden

Dispersionen mit abnehmendem "Reinheitsgrad" des DMPCs (wenn man davon aus-

geht, dass die Erniedrigung der Vorübergangstemperatur des hydratisierten Bulkma-

terials mit zunehmender Kationenkonzentration fortschreitet) kleinere durchschnitt-

liche Teilchengrößen aufwiesen, und dass die Neigung zur Gel- und Nanotubebil-

dung bei 13°C abnahm. Offensichtlich vermögen die zweiwertigen Kationen größere

Bilayerkrümmungen und somit kleinere Teilchengrößen zu stabilisieren. Carasso et

al. haben vergleichbare Auswirkungen der Wechselwirkungen von Calciumionen mit

Phospholipiden beschrieben. Sie konnten zeigen, dass der Zusatz steigender Men-

gen Calciumionen zu phospholipidstabilisierten Emulsionen zunächst zu einer Ver-

minderung der ursprünglich negativen Ladung der Emulsionstropfen führt, was mit

einer Vergrößerung der mittleren Teilchengröße einhergeht. Dieser Effekt erreicht am

isoelektrischen Punkt sein Maximum. Nach Ladungsumkehr nimmt mit steigender

positiver Ladung die mittlere Teilchengröße wieder ab (Carasso et al., 1995).

Da der Bilayer durch die Interaktion der Kopfgruppen mit den Kationen eine positive

Nettoladung besitzt (Abb. 66), ist eine Annäherung der nun geladenen Liposomen

und Lipidpartikel als notwendige Vorstufe für eine Fusion infolge elektrostatischer Ab-

stoßung behindert. Das erklärt die verminderte Neigung zur gelierungsverursachen-

den Nanotubebildung. Untersuchungen von Mosharraf et al. zum Einfluss von Calci-

umionen auf die Oberflächenladung und Agglomerationsneigung von DPPC haben

ergeben, dass eine Korrelation zwischen der Ladung der Liposomen und ihrer Agglo-

merationsneigung besteht: Die Agglomerationsrate ist am höchsten, wenn die Vesi-

kelladung minimal ist (Mosharraf et al., 1995).

Über die Identität der zweiwertigen Kationen kann keine Aussage gemacht werden,

da weiterführende Untersuchungen zur Identifizierung des Kations bzw. möglicher-

weise verschiedener Kationen nicht durchgeführt wurden. Bezüglich des Instabilitäts-

phänomens "Gelbildung" lässt sich schlussfolgern, dass durch das Einführen von

Ladungen in den Bilayer, beispielsweise durch Zusatz von zweiwertigen Kationen

oder möglicherweise auch geladenen Phospholipiden, die Gelbildung während der

Lagerung bei 13°C zurückgedrängt werden kann.

Diskussion

____________________________________________________________________ 108

4.5. Fazit und Ausblick

Eine wichtige pharmazeutisch-technologische Fragestellung beinhaltet die Lagersta-

bilität pharmazeutischer Zubereitungen bzw. Arzneistoffträgersysteme.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf ein spezielles,

in der Literatur bisher nicht beschriebenes Instabilitätsphänomen bei der Lagerung

kolloidaler DMPC-Dispersionen gelegt: Die Gelierung von DMPC-Dispersionen nach

etwa vierwöchiger Lagerung bei 13°C. Die Ursache für diese gravierende Instabilität

- eine neue Spezies von Nanotubes, die dreidimensionale Netzwerke ausbildet -

wurde aufgeklärt und ein möglicher Mechanismus für ihre Bildung vorgeschlagen.

Durch die Wahl der Herstellungsmethode kann die Nanotubebildung entscheidend

beeinflusst werden. So ist es möglich, diese gelierungsverursachende Nanotubeent-

stehung zu verhindern, indem die Herstellung der Dispersionen über Extrusion durch

Membranen der Porengröße 200 nm erfolgt, infolge derer relativ eng verteilte Teil-

chengrößenkollektive ohne nennenswerten "Feinanteil" entstehen. Der hohe Energie-

eintrag während der Hochdruckhomogenisation und der Ultrabeschallung bewirkt

hingegen die Entstehung kleinster Partikel und forciert so die Nanotubeentstehung

und somit die unerwünschte, wenngleich intellektuell spannende Gelbildung. Weiter-

hin wurde gezeigt, dass die Einführung kleinster Mengen an zweiwertigen Kationen

sowie der Zusatz von DPPC stabilisierend auf die DMPC-Dispersionen und so der

Nanotube- und Gelbildung entgegen wirken. Aus den hier vorgestellten Ergebnissen

ergeben sich also sowohl Richtlinien für die gezielte Herstellung als auch Ansätze für

die Verhinderung der Entstehung von Nanotubes und der durch sie bedingten

Gelbildung.

Ein weiterer Aspekt der pharmazeutischen Technologie ist die Suche nach neuen

Arzneistoffträgersystemen. Es wäre theoretisch denkbar, die Nanotubes als Vehikel

für hydrophile Arzneistoffe zu nutzen. Aus den folgenden Gründen wurde dieser

Gedanke im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht weiterverfolgt:

Eines der Probleme stellt der verhältnismäßig enge und unphysiologische Tempera-

turbereich dar, innerhalb dessen die Nanotubes entstehen bzw. stabil sind und ober-

halb dessen sie irreversibel zerstört werden: etwa 2°C bis 15°C. Der Versuch, durch

Nutzung von DPPC unter vergleichbaren Bedingungen Nanotubes mit einem Exi-

stenzbereich bei entsprechend höheren Temperaturen herzustellen, brachte unter

den hier gewählten Bedingungen jedoch keinen Erfolg. Die Empfindlichkeit der Nano-

Diskussion

____________________________________________________________________ 109

tubes gegenüber mechanischer Beanspruchung, infolge derer sie "brechen" und so-

mit den eingeschlossenen Arzneistoff freigeben würden, stellt ein weiteres Hindernis

dar. Und schließlich lässt der hier vorgeschlagene Mechanismus der Nanotubebil-

dung über die Fusion von SUV`s bzw. kleinsten Lipidpartikeln nur sehr niedrige Ein-

schlusseffizienzen für hydrophile Arzneistoffe erwarten.

Aufbauend auf dieser Arbeit ergeben sich jedoch verschiedene Ansatzpunkte für

weiterführende Arbeiten. Ein wichtiger Aspekt wäre die Untersuchung von Möglich-

keiten für die Stabilisierung der Nanotubes einerseits gegenüber mechanischer Be-

anspruchung und andererseits gegenüber Temperaturerhöhung, um eine Applikation

in den menschlichen Organismus grundsätzlich zu ermöglichen. Interessant wäre in

diesem Zusammenhang auch die Frage nach der Übertragbarkeit der beschriebenen

Ergebnisse auf andere gesättigte Phosphatidylcholine, wie DLPC, DPPC (bei ande-

ren, als den in dieser Arbeit untersuchten Bedingungen) oder DSPC, wobei beson-

ders DPPC und DSPC wegen des möglichen Existenzbereiches bei Körpertempera-

tur interessant wären.

Möglicherweise mehr als für die eher anwendungsbezogenen Disziplinen dürften die

Nanotubes derzeit jedoch für die grundlagenorientierten Fächer von Interesse sein.

Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass es trotz intensiver Forschung in der Klasse

der Phosphatidylcholine seit nunmehr drei Jahrzehnten - DMPC gehört neben DPPC

zu den meist untersuchten Lipiden weltweit (Koynova & Caffrey, 1998) - immer noch

große Lücken bei der Kenntnis der Eigenschaften der Lipide gibt. Wünschenswert

wären hier beispielsweise weiterführende Arbeiten zur Aufklärung der molekularen

Organisation der DMPC-Moleküle innerhalb der Nanotubes sowie die Entwicklung

eines Modells für die Bildung dieser tubulären Vesikel.

Zusammenfassung 110

__________________________________________________________________________________

5. Zusammenfassung

Der Ausgangspunkt der Arbeit beinhaltete die Aufklärung eines speziellen, in der Li-

teratur bisher nicht beschriebenen Instabilitätsphänomens: Die Gelbildung in Disper-

sionen des gesättigten Phospholipids 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcho-

lin (DMPC).

Das Gelbildungsphänomen tritt anhängig von der Phospholipidkonzentration, der La-

gerungstemperatur und der Lagerdauer auf: Nur bei 13°C kommt es bei 10%igen

(m/m) Dispersionen innerhalb von etwa 3 - 4 Wochen zu einer kompletten Gelierung.

Niedrigere Lagerungstemperaturen (2 - 8°C) sowie geringere Lipidkonzentrationen

verursachen lediglich stückig-inhomogene Niederschläge. Bei höheren Temperatu-

ren bleibt die Gelbildung aus.

Unter Nutzung unterschiedlicher Präparationsmethoden für die Transmissionselek-

tronenmikroskopie konnte als Ursache für die Instabilität eine neue Spezies von Na-

notubes, die dreidimensionale Netzwerke bildet, eindeutig aufgeklärt werden. Die

Nanotubes wurde umfassend morphologisch charakterisiert. Sie zeichnen sich durch

eine hohe Lagerstabilität aus. Infolge von Temperaturerhöhung kommt es jedoch zu

irreversiblen Strukturveränderungen, die mit einer vollständigen Zerstörung der

Nanotubes zu Gunsten großer multilamellarer und multivesikulärer Vesikel

(einhergehend mit einer makroskopischen Verflüssigung der Probe) abschließen.

Die Dispergierung des Lipids ist essentiell für die Nanotubebildung, wobei der

Herstellungsmethode eine Schlüsselrolle zukommt: Über die Höhe des Energieein-

trags bei der Dispergierung und die damit verbundene Teilchengröße der Ausgangs-

dispersion lässt sich die Nanotube- und damit Gelbildung gezielt fördern oder verhin-

dern. Dispersionen mit einem hohen Anteil an SUV`s und kleinsten Lipidpartikeln,

hergestellt durch Hochdruckhomogenisation oder Ultraschall, gelieren, während

durch Extrusion hergestellte Dispersionen ohne diesen "Feinanteil" nahezu frei von

Nanotubes bleiben und keine Gelierung zeigen. Undispergiertes Lipid, LUVs (large

unilamellar vesicles) und MLV`s (multilamellar vesicles) können als Grundlage für die

Nanotubeentstehung ausgeschlossen werden.

Auf der Basis der erarbeiteten Erkenntnisse über die Bedingungen, die zur Bildung

der Nanotubes führen sowie elektronenmikroskopischer Untersuchungen wurde ein

Mechanismus für ihre Bildung über die Fusion von SUV`s (small unilamellar vesicles)

und kleinsten Lipidpartikeln vorgeschlagen.

Zusammenfassung 111

__________________________________________________________________________________

Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung der Nanotubes unabhängig von der Art

des verwendeten Konservierungsmittels der wässrigen Phase ist. Auch geringe "Ver-

unreinigungen" mit Myristinsäure oder hydriertem Soja-Phosphatidylcholin beeinflus-

sen die Nanotubebildung nicht. Der Zusatz kleinster Mengen Lysophosphatidylcholin

hingegen bewirkt in der Ausgangsdispersion eine teilweise Transformation von Lipo-

somen in Mischmizellen. Diese Systeme bilden bei 13°C neben Nanotubes verdrillte

Bänder, die wie die Nanotubes ausgedehnte Netzwerke bilden und eine Gelierung

verursachen. Der Zusatz größerer Mengen Fremdlipide verhindert hingegen die Na-

notubebildung, wie am Beispiel des Zusatzes des Homologen 1,2-Dipalmitoyl-sn-gly-

cero-3-phosphatidylcholin (DPPC) gezeigt werden konnte.

Im Verlauf der Arbeit wurden unterschiedliche DMPC-Chargen verwendet, die in

ihren physikochemischen Eigenschaften sowie bezüglich der Eigenschaften der

Dispersionen und im Ausmaß der Nanotube- bzw. Gelbildung deutliche Unterschiede

zeigten. Im Zuge von Reinheitsuntersuchungen konnten Unterschiede in der Vorbe-

handlung der Lipide und mittels hochauflösender Dünnschichtchromatographie eine

Verunreinigung mit Fremdlipiden verschiedener Klassen als Ursachen ausgeschlos-

sen werden. Es konnte hingegen mittels thermoanalytischer Untersuchungen und

Röntgenkleinwinkelstreuung eindeutig nachgewiesen werden, dass Verunreinigun-

gen mit zweiwertigen Kationen die Hauptursache für die chargenabhängigen Unter-

schiede darstellen.

Neben DMPC wurde außerdem DPPC auf seine Fähigkeit zur Nanotubebildung

untersucht. Unter den hier gewählten Bedingungen haben sich jedoch keine Hinwei-

se darauf ergeben, dass DPPC ebenfalls Nanotubes bildet.

Die hier vorgestellten DMPC-Nanotubes sind aus pharmazeutisch-technologischer

Sicht vor allem als Verursacher der beschriebenen Instabilität während der Lagerung

von Interesse. Dabei ist neben liposomalen Zubereitungen beispielsweise auch an

phospholipidstabilisierte kolloidale Emulsionen zu denken, in denen Liposomen häu-

fig als Nebenprodukt anfallen. Vorschläge für eine pharmazeutische Nutzung der

Nanotubes als Arzneistoffträgersystem scheinen wegen der Vielzahl noch offener

Fragen bezüglich der molekularen Struktur und den für einen Arzneistoffträger

ungünstigen Eigenschaften der Nanotubes derzeit verfrüht.

Literaturverzeichnis _____________________________________________________________________________________

112

6. Literaturverzeichnis

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Anhang

i

A.1. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

DC23PC 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (= DC8,9PC)

DC8,9PC 1,2-bis(10,12-tricosadinoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (=DC23PC)

DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

DNPC 1,2-bis(dinonanoyl)-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

DSC Dynamische Differenzkalorimetrie

DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin

DSPG 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylglycerol

Ei-PC Phosphatidylcholin, aus Eigelb gewonnen

HPTLC Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (high performance thin layer chromatographie)

LD Laserdiffraktometrie

LUV großes unilamellares Vesikel (large unilamellar vesicle)

MLV multilamellares Vesikel (multilamellar vesicle)

MPEG-DSPC

Methoxypolyethylenglycol-Distearoylphosphatidylcholin

MSD Multi Size Distribution

MVV multivesikuläres Vesikel (multivesicular vesicle)

Na-EDTA Natriumedetat; Dinatriumsalz der (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure

OLV oligolamellares Vesikel (oligolamellar vesicle)

PC Phosphatidylcholin

PCS Photonenkorrelationsspektroskopie

PIDS Polarization Intensity Differential Scattering

Soja-PC Phosphatidylcholin, aus der Sojabohne gewonnen

SUV kleines unilamellares Vesikel (small unilamellar vesicle)

Tab. Tabelle

TEM Transmissionselektronenmikroskop(ie)

Tm Temperatur des Hauptübergangs, Kettenschmelztemperatur

Tp Vorübergangstemperatur

Ts Subübergangstemperatur

vgl. vergleiche

ii

A.2. Anmerkungen zu den verwendeten Teilchengrößenbestimmungs- methoden

In der vorliegenden Arbeit wurden zur Charakterisierung der Dispersionen die Teil-

chengrößen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) und teilweise mittels

PIDS-gekoppelter Laserdiffraktometrie (LD/PIDS) bestimmt. Zusätzlich wurden zur

Überprüfung der Aussagekraft der durch die Laserverfahren ermittelten Teilchengrö-

ßen und zur Bestimmung der Morphologie der Nanotubes transmissionselektronen-

mikroskopische Untersuchungen durchgeführt.

Als Standardmethode zur Charakterisierung der Teilchengrößen wurden die Photo-

nenkorrelationsspektroskopie (PCS) eingesetzt. Für die mittels Hochdruckhomogeni-

sation hergestellte Dispersionen zeigte sich, dass der mit Hilfe der PCS ermittelte z-

Average als Maß für die mittlere Teilchengröße häufig nur unzureichend die tatsächli-

chen Verhältnisse innerhalb der Probe widerspiegelt. Die Bestimmung des z-Average

erfolgt unter der Annahme, dass es sich um eine monomodale Verteilung handelt.

Gefrierbruch-TEM Aufnahmen belegen allerdings, dass diese Dispersionen neben

vielen zum Teil extrem kleinen Teilchen (< 50 nm) auch immer wenige z.T. sehr

große Partikel bis in den µm-Bereich enthalten (siehe Kapitel 3.1.1. und 3.2.3.1.).

Umfassendere Informationen erhält man bei Auswertung der PCS-Daten unter Ver-

wendung der MSD-Auswertung (MSD: Multi Size Distribution), die sehr gut die große

Bandbreite der aus Gefrierbruch-TEM ermittelten Teilchengrößen erfasst: Es wurden

sowohl die große Anzahl kleiner als auch die wenigen sehr großen Partikel detektiert.

Bezüglich der LD/PIDS-Messungen muss gesagt werden, dass hier trotz elektronen-

mikroskopisch detektierter und teilweise sogar makroskopisch sichtbarer Partikel

diese in den Messungen meist nicht erfasst wurden. Die Ursache liegt höchstwahr-

scheinlich in der Wahl der Messkonzentration begründet: So wurden für die

Messungen die erforderlichen Messkonzentration im PIDS-Bereich zwar erreicht,

jedoch waren die Probenmengen für eine weitere Messung unter Beachtung der

erforderlichen Messkonzentration zur Detektion großer Partikel meist zu gering, so

dass darauf verzichtet werden musste. Die ermittelten Teilchengrößenverteilungen

reichten bei frisch hochdruckhomogenisierten Dispersionen von 40 bis 200 nm. Da

Partikel < 40 nm mittels LD/PIDS nicht detektiert werden können, lagen die mittleren

Teilchengrößen meist über den mittels PCS ermittelten z-Average Werten. Für

Proben ohne "Feinanteil" und mit durchschnittlichen Teilchengrößen um 100 nm (z.B.

verbliebener flüssiger Überstand über einem Bodensatz von Nanotubes) ergab sich

iii

hingegen eine gute Übereinstimmung von dem z-Average aus PCS-Messungen

und der mittleren Teilchengröße aus LD/PIDS-Messungen (siehe Kapitel 3.2.3.2.3.).

Anhand der transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen und auch der

PCS-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Dispergierung mittels Extrusion zu

deutlich homogeneren Teilchengrößenkollektiven führt (siehe Tab. 4, S.44; Tab. 5

sowie Abb. 27, S.47). Bei diesen Dispersionen lässt sich die Teilchengrößenvertei-

lung sehr gut mit dem z-Average unter Angabe des Polydispersitätsindex beschrei-

ben. Die Elektronenmikroskopie lieferte zusätzlich die Information, dass die Liposo-

men häufig nicht kugelförmig, sondern länglich verformt sind (siehe Kapitel 3.2.3.1.).

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Ulrike Lauf

Geburtsdatum: 09.02.1973

Geburtsort: Magdeburg

Familienstand: ledig

Kinder: keine

Nationalität: Deutsch

Schulausbildung

September 1979 - August 1989 Polytechnische Oberschule in Magdeburg

September 1989 - Juni 1991 Erweiterte Oberschule in Magdeburg

Juni 1991 Abitur

Berufsausbildung

Oktober 1992 - November 1996 Pharmazie-Studium an der Technischen

Universität Carolo Wilhelmina in Braunschweig

September 1994

November 1996

1. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung


Dezember 1996 - Mai 1997 1. Teil des praktischen Jahres an der Friedrich-

Schiller-Universität Jena

Juni 1997 - November 1997 2. Teil des praktischen Jahres in der „Apotheke

im MSZ“ in Magdeburg

Dezember 1997

Januar 1998


Approbation als Apotheker

seit Februar 1998 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für

Pharmazeutische Technologie der Friedrich-

Schiller-Universität Jena

Ulrike Lauf

Jena, den 24.06.2003

Selbstständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter

Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt habe.

Ulrike Lauf

Jena, den 24.06.2003

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- DMPC-Nanotubes - Untersuchungen einer neuartigen ... · Molekül-geometrie Packungs-parameter Molekülassoziat bzw. Phase Beispielsubstanzen P < 1/3