0ROHNXODUH &KDUDNWHULVLHUXQJ GHV 9DULFHOOD … · 1 0ROHNXODUH &KDUDNWHULVLHUXQJ GHV 9DULFHOOD =RVWHU 9LUXV XQG 8QWHUVFKHLGXQJ YRP ,PSIVWDPP 2ND Dissertation zur Erlangung des akademischen

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Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.)

Vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Schiller-Universität Jena

von Shokoufeh Gawellek

geboren am 30. März 1971 in Shahroud

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2.1. Aufbau des Varicella-Zoster-Virus sowie Unterschiede zwischen

Wild- und Impftyp-Viren 3

2.2. Erkrankungen durch das Varicella-Zoster-Virus sowie Diagnostik

und Therapie 8

2.3. Varizellenimpfung 14

2.4. Aufgabenstellung 18

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3.1. Untersuchungsmaterialien 19

3.1.1. Materialien von Patienten 19

3.1.2. Varicella-Zoster-Virus-Prototypstämme 23

3.2. Zellkulturen 24

3.3. Virusanzüchtung 25

3.4. Virustypisierung 25

3.5. DNA-Präparation 26

3.6. Virus-DNA-Nachweis mittels Polymerasekettenreaktion 29

3.7. Restriktionsenzymanalyse 32

3.7.1. DNA-Quantifizierung mittels Spektrophotometrie 32

3.7.2. Enzymverdau der Amplifikate mit Restriktionsendonukleasen 33

3.8. Darstellung der viralen DNA mittels Agarosegelelektrophorese 34

3.9. Statistische Analyse der Untersuchungsergebnisse 36

3.10. Rezepturen 36

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4

4.1. Varicella-Zoster-Virus-Gene 38 und 54 39 4.2. Varicella-Zoster-Virus-Gen 38 43

4.3. Varicella-Zoster-Virus-Gen 62 46

4.4. Zusammenfassung und Vergleich der Ergebnisse zur Genotypisierung

des Varicella-Zoster-Virus 50

4.5. Ergebnisse der Genotypisierung in Bezug zur klinischen Diagnose und 52

dem Alter der Patienten

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Literatur

Danksagung

Lebenslauf

Ehrenwörtliche Erklärung

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9HU]HLFKQLV�YHUZHQGHWHU�$EN�U]XQJHQ�

AE - Elutionspuffer

AIDS - Acquired immunodeficiency syndrome

AL - Lysispuffer AW 1 - Waschpuffer I

AW 2 - Waschpuffer II

%JOI - Restriktionsendonuklease %JOI bp - Basenpaare

cpE - cytopathischer Effekt

&3*� � �� &RQWUROOHG�SRUH�JODVVHV�DNA - Desoxyribonukleinsäure

dNTP - Desoxynucleotidtriphosphat

E - Early

FITC - Fluoreszeinisothiozyanat

gp - Glykoprotein

HELF - Humane embryonale Lungenfibroblasten

HSV - Herpes-simplex-Virus

IE - Immediate early

IRL - Internal repeats long

IRS - Internal repeats short

i.v. - intravenös

L - Late

LCAA - Long chain allcylamin

MGS - Molekulargewichtsstandard

Oka-Virus - VZV, von dem die Varizellenimpfstoffe abgeleitet sind, bezeichnet mit dem Namen des Kindes, von dem das Virus isoliert wurde

ORF - Open reading frame

PBS - Phosphate buffered saline

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3VWI - Restriktionsendonuklease 3VWI PZN - Postzosterische Neuralgie RFLP - Restriction fragment length polymorphism RNA - Ribonukleinsäure

6

6PD,� � �� 5HVWULNWLRQVHQGRQXNOHDVH�6PD,�7%(� � �� 7ULV�%RUDW�('7$�3XIIHU�TE - Tris-HCl-EDTA-Puffer

TRL - Terminal repeats long

TRS - Terminal repeats short

UL - Unique long

US - Unique short

UV - Ultraviolett

VZV - Varicella-Zoster-Virus

ZNS - Zentralnervensystem

7

�� =XVDPPHQIDVVXQJ�Varizellen gehören in Deutschland zu den häufigsten impfpräventablen

Infektionskrankheiten. Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung unter

Verwendung eines attenuierten Lebendimpfstoffes ist es aus epidemiologischen

Gründen zukünftig erforderlich, eine Surveillance zirkulierender Varicella-Zoster-Virus

(VZV)-Stämme durchzuführen. Die Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren

erweist sich auch als notwendig, um die Ursache auftretender Impfkomplikationen in

Form von Varizellen oder Zoster beurteilen zu können. Bisherige Erfahrungen

belegen, dass eine zweifelsfreie Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren nur

mittels Charakterisierung genetischer Marker möglich ist.

Aufgabe der vorliegenden Promotionsarbeit war es, VZV-Isolate sowie VZV-DNA-

positive Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster mittels

molekularbiologischer Verfahren zu typisieren. Dabei wurde vorrangig eine

Unterscheidung zwischen Wild- und Impftyp-Viren angestrebt. Ausgehend von

diesen Experimenten sollten methodische Fragen sowie die Verteilung bestimmter

Genotypen des VZV abgeklärt werden.

Methodisch wurden mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und nachfolgender

Restriktionsenzymanalyse DNA-Fragmente der offenen Leserahmen (ORF) 38, 54

und 62 des VZV-Genoms charakterisiert. Für die Untersuchungen standen 53 VZV-

Isolate sowie zur Prüfung der direkten molekularen Typisierung 73 VZV-DNA-positive

Proben von Patienten mit VZV-Infektionen zur Verfügung.

Im Ergebnis der Untersuchungen wurden alle 53 VZV-Isolate genetisch typisiert.

Mittels direkter Genotypisierung der viralen DNA in den Patientenproben wurden 63

der 73 Materialien (86,3%) charakterisiert, wenn Primer der ORF 38 und 54

eingesetzt wurden. Im Vergleich dazu erbrachte die PCR zur Amplifikation des Gens

62 in 59 Fällen (80,8%) positive Ergebnisse, die sich mittels nachfolgender

Verdauung durch Endonukleasen weiter spezifizieren ließen. Diese Ergebnisse

belegen, dass die Verwendung von Virusisolaten für die Genotypisierung des VZV

als Methode der Wahl anzusehen ist.

Als dominanter Genotyp wurde der Wildtyp 3VWI+ %JOI¯ bei 93,1% aller Patienten mit

einem Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. 90,7% dieser Patienten

hatten einen Zoster, und 9,3% waren an Varizellen erkrankt. Diese Befunde

entsprechen den bereits publizierten Ergebnissen in den USA und Großbritannien.

8

Bei 6% aller Patienten mit einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der

Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen. Fünf dieser Patienten entwickelten Varizellen und

zwei erkrankten an einem Zoster. Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurde in den

USA und in Großbritannien bei ca. 20% aller Wildtyp-Stämme eine %JOI-Schnittstelle

im ORF 54 gefunden. Da diese Stämme in Großbritannien vor allem bei Immigranten

aus tropischen Ländern nachweisbar waren, könnten diese Resultate aus einem

wesentlich geringeren Anteil an Einwanderern aus diesen Gebieten in Deutschland

resultieren. Allerdings kann der gehäufte Nachweis von %JOI+-Stämmen bei Varizellen

auf eine Zunahme dieses Genotyp in den kommenden Jahren hindeuten.

Nur bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI¯ %JOI+ gefunden. Dies reflektiert

die bislang relativ seltene Durchführung der Varizellenimpfung in Deutschland. Der

Oka-Stamm wurde bei einem Kind nachgewiesen, das 16 Monate nach

Varizellenimpfung an einem Zoster erkrankte. Zoster-Erkrankungen nach Impfung

sind in der Literatur bislang selten dokumentiert worden. Das Zoster-Risiko bei

Impflingen soll erhöht sein, wenn nach Impfung ein Befall der Haut als

impfbegleitender Rash oder in Form milder Varizellen auftritt.

Die eingesetzten Methoden erlauben eine zuverlässige Genotypisierung des VZV.

Eine gemeinsame Charakterisierung der ORF 38/54 gestattet die Unterscheidung

von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild-

oder Impftyp-Stämmen sowie eine Analyse des %JOI-Polymorphismus. Nur mittels

Charakterisierung des ORF 62 ist eine universelle Unterscheidung von VZV-Wild-

und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss japanischer Oka-ähnlicher Wildtyp-

Isolate möglich.

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XQG�,PSIW\S�9LUHQ�Das VZV zählt neben dem Herpes-simplex-Virus (HSV) Typ 1 und 2, dem Epstein-

Barr-Virus, dem Zytomegalievirus und den Humanen Herpesviren 6, 7 und 8 zur

Familie der Herpesviridae. Es ist ein ubiquitär vorkommendes Virus, welches als

Primärinfektion die Varizellen und als endogenes Rezidiv den Zoster hervorruft.

Innerhalb der Familie der Herpesviridae wird das VZV zusammen mit dem HSV in die

Unterfamilie Herpesvirinae eingeordnet.

Das VZV ist der kleinste Vertreter der humanpathogenen Herpesviren. Die Größe

des Genoms beträgt ca. 125.000 Basenpaare (bp). Es besteht aus einer

doppelsträngigen DNA, die eine lange (UL) und eine kurze (US) Untereinheit bildet

und von internalen (IRS, IRL) und terminalen (TRS, TRL) repetitiven Regionen flankiert

wird. Das VZV-Genom kodiert für mindestens 30 Polypeptide. Umgeben wird die

DNA von einem isometrisch aufgebauten Kapsid aus 162 Kapsomeren sowie dem

glykoproteinhaltigen Tegument. Nach außen wird das Virus durch eine dreischichtige

glykoprotein- und lipidhaltige Hülle umschlossen (Abb. 1). Der Durchmesser des VZV

beträgt etwa 200 nm.

Abb. 1: Aufbau des VZV (modifiziert nach einer Darstellung von Rahaus et

al. 1999)

A: Schematische Darstellung des Virusaufbaus B: Aufschnitt-Darstellung der Glykoprotein-Spikes C: Elektronenmikroskopische Aufnahme des VZV

10

Bis heute wurden mindestens 71 ORF des VZV-Genoms identifiziert und über 70

RNA-Transkripte in infizierten Zellen nachgewiesen. Die VZV-DNA besitzt zahlreiche

Sequenzhomologien mit der DNA des HSV, was bei der Primerauswahl für die PCR

und bei der Durchführung von Hybridisierungsexperimenten berücksichtigt werden

muss. Wie bei den übrigen Vertretern der Herpesviren werden in virusinfizierten

Zellen „immediate early“ (IE)-, „early“ (E)- und „late“ (L)-Gene transkribiert. In VZV-

infizierten Zellen können mehr als 30 viruskodierte Polypeptide mit einer Molmasse

von 16,5 bis 200 Kilodalton nachgewiesen werden. Zu ihnen gehören sechs

Glykoproteine (gpI - gpVI). GpI, II und III tragen neutralisierende Epitope, gpI und II

sind außerdem für die zellvermittelte Immunantwort von Bedeutung. Typisch für das

VZV ist, dass es sich nahezu ausschließlich in Zellen repliziert, die vom Menschen

oder Affen stammen.

Vom VZV ist nur ein Serotyp bekannt. Zwischen verschiedenen VZV-Isolaten

konnten nur geringe antigene Unterschiede festgestellt werden. 1974 gelang es der

japanischen Arbeitsgruppe um Takahashi, einen VZV-Lebendimpfstoff zu entwickeln

(Takahashi et al. 1974). Ausgangsvirus war ein japanischer VZV-Wildtyp-Stamm, der

von einem 3-jährigen Windpockenpatienten mit dem Familiennamen Oka isoliert

wurde. Von diesem VZV-Stamm Oka leiten sich sämtliche VZV-Lebendimpfstoffe ab,

die derzeit weltweit verfügbar sind. Impf- und Wildtyp-Stämme vom VZV

unterscheiden sich in ihren biologischen Charakteristika und in den klinischen

Manifestationen der Infektion. Die biologischen Eigenschaften, die für den

Impfstamm beschrieben wurden, reflektieren z.T. die Methode, die gebraucht wurde,

um den Wildtyp-Stamm in ein Impfvirus zu überführen. So wurde eine Attenuierung

vorwiegend durch serienmäßige Kultivierung in humanen embryonalen

Lungenfibroblasten (HELF) bei 34°C sowie durch Passagierung in embryonalen

Fibroblasten vom Meerschweinchen erreicht (Takahashi et al. 1985). Als Ergebnis

bildet der Impftyp-Stamm Oka bei 39°C kleinere Plaques in HELF und vermehrt sich

besser bei 34°C. Im Gegensatz zu Wildtyp-Stämmen lässt sich der Oka-Stamm in

embryonalen Meerschweinchenfibroblasten anzüchten (Takahashi et al. 1974). Bei

einer Infektion mit Wildtyp-Stämmen resultieren Varizellen, die häufig auf

empfängliche Kontaktpersonen übertragen werden können. Die Primärinfektion mit

dem Wildtyp-VZV führt regelmäßig zur Latenz in sensorischen Ganglien, wobei nach

endogener Virusreaktivierung der Zoster entsteht. Eine Infektion mit dem Impftyp-

Virus resultiert primär in der Bildung einer schützenden Immunantwort. Gelegentlich

11

führt sie zu den sog. Impfvarizellen, die nur selten auf empfängliche Kontaktpersonen

übertragen werden. Im Vergleich zum Wildtyp-Virus kommt es beim Impftyp-Virus

wesentlich seltener zur Latenz und zum Zoster (LaRussa und Gershon 2001).� Bezüglich des Genomaufbaus konnten in den letzten beiden Jahrzehnten mit

molekularbiologischen Methoden Fortschritte bei der Typisierung bzw.

Unterscheidung von Virus-Isolaten erzielt werden. Durch Analyse der viralen DNA

mittels Restriktionsendonukleasen wurde der endgültige Beweis dafür erbracht, dass

Windpocken und Gürtelrose durch den gleichen Erreger verursacht werden (Straus

et al. 1984). 1986 konnte die VZV-DNA als erstes Herpesvirusgenom durch Davison

und Scott (1986) komplett sequenziert werden, so dass Sequenzvergleiche für

weitere Studien möglich wurden. Dabei zeigte sich, dass zahlreiche genomische

Differenzen sowohl zwischen Wildtypen des VZV als auch zwischen Wildtyp-Viren

und dem Impftyp-Virus bestehen (LaRussa et al. 1992; Muir et al. 2002). Eine

ausgeprägte genetische Divergenz zwischen Wild- und Impftyp-Viren ist vor allem für

ORF 62 belegt (Gomi et al. 2001, Gomi et al. 2002). Dies führte zur Annahme, dass

das IE-Gen 62 mit hoher Wahrscheinlichkeit für die Veränderungen des VZV-Impftyp-

Virus bezüglich Replikation und Attenuierung verantwortlich ist. Obwohl sich

deutliche biologische Unterschiede zwischen VZV-Oka- und Wildtyp-Stämmen

nachweisen lassen, gelingt eine zweifelsfreie Unterscheidung nur mittels Analyse des

VZV-Genoms. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche molekulare Methoden

zur Genotypisierung des VZV eingesetzt. Die Mehrzahl dieser Verfahren wurde in

Japan und den USA entwickelt. Wesentliche Methoden basieren auf der Amplifikation

mittels PCR und nachfolgender Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten der

ORF 38, 54, 62 sowie der R5 repeat region (Abb. 2) (Adams et al. 1989, LaRussa et

al. 1992, Hawrami et al. 1996, LaRussa et al. 1998, Loparev et al. 2000, Sauerbrei et

al. 2003a). Die Ergebnisse bisheriger Untersuchungen reflektieren geographische

Differenzen bezüglich der Verteilung unterschiedlicher VZV-Genotypen.

In den USA und in Großbritannien lassen sich alle Wildtyp-Stämme durch eine

Schnittstelle mit dem Restriktionsenzym 3VWI im Gen 38 von VZV-Oka unterscheiden

(Abb. 3), der diese Schnittstelle nicht aufweist (Hawrami und Breuer 1997, Gershon

et al. 1999). Bezieht man auch ORF 54 in die Untersuchungen ein (Abb. 3), so

können diese Wildtyp-Stämme aufgrund eines unterschiedlichen

Restriktionsenzymmusters nach Spaltung mit %JOI in %JOI+- und %JOI¯ -Stämme

unterteilt werden. Etwa 20% aller Wildtyp-Stämme in den USA und in Großbritannien

12

besitzen eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 (Hawrami und Breuer 1997, Gershon et

al. 1999), die jedoch ebenfalls in Oka-Stämmen nachweisbar ist.

Abb. 2: ORF des VZV-Genoms, Quelle: Cohen 1999

Abb. 3: Amplifikation und Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten der

ORF 38 und 54, Quelle: LaRussa et al. 1992, RFLP – Restriction

fragment length polymorphism

13

In Japan zirkulierende Wildtyp-Stämme besitzen zu 20 bis 30% keine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 und sind damit von Oka-Stämmen bezüglich dieses Markers

nicht zu unterscheiden (Takada et al. 1995). Aus diesem Grunde erlaubt die

Beurteilung des 3VWI-Polymorphismus im Gen 38 nur außerhalb Japans oder

japanischer Kommunen eine zuverlässige Unterscheidung von Wildtyp-Stämmen.

Mittels Charakterisierung des ORF 62 ist es möglich, VZV-Oka von allen in und

außerhalb Japans zirkulierenden Wildtyp-Stämmen zu unterscheiden. Ein Verfahren

dazu wurde von Loparev et al. (2000) entwickelt. Es beruht auf der Amplifikation

eines DNA-Fragments des ORF 62 mit einer Größe von 268 bp. Durch eine sich

anschließende Restriktionsenzymanalyse mittels 6PDI-Verdauung gelingt eine

universelle Differenzierung des Oka-Impfstammes von allen Oka-ähnlichen oder

nicht-ähnlichen Wildtyp-Stämmen (Abb. 4).

Abb. 4: Amplifikation und Restriktionsenzymanalyse von DNA-Fragmenten des

ORF 62

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- (SLGHPLRORJLH�XQG�.OLQLN�Der Mensch ist das einzige Reservoir für das als hochkontagiös geltende VZV.

Infektionsquelle für eine VZV-Primärinfektion sind Patienten mit Windpocken oder mit

Zoster. Mit ca. 750.000 Erkrankungen pro Jahr gehören die Windpocken in

Deutschland zu den häufigsten durch Impfung vermeidbaren Infektionskrankheiten

(Verschreibungsindex für Pharmazeutika 2000). In der Regel treten Windpocken

zwischen dem 5. und 9. Lebensjahr auf (Asano et al.1999). Die Durchseuchung mit

dem VZV erreicht in Deutschland bei Vorschulkindern 60 bis 65% und bei 10- bis 12-

Jährigen bereits 94%. Nach dem 4. Dezenium sind nur noch Einzelpersonen ohne

VZV-Antikörper und demzufolge für eine Primärinfektion empfänglich (Wutzler et al.

2001). Exogene Reinfektionen mit dem VZV sind extrem selten (Hawrami et al.

1997). Eine in England und Wales beobachtete Verschiebung der Varizellen in

höhere Lebensjahrzehnte (Fairley und Miller 1996) konnte für Deutschland nicht

bestätigt werden (Wutzler et al. 2001).

Abb. 5: Klinisches Bild der Windpocken, Quelle: Emond, 1976

Windpocken (Abb. 5) sind hochgradig kontagiös, wobei allerdings außerhalb des

Körpers das Virus rasch seine Infektiosität verliert. In den gemäßigten Klimazonen ist

eine jahreszeitliche Häufung in den Winter- und Frühjahrsmonaten zu beobachten.

Die Virusübertragung erfolgt aerogen durch virushaltige Tröpfchen, die beim Atmen

15

oder Husten ausgeschieden werden. Ferner ist die Übertragung durch virushaltigen

Bläscheninhalt bei Kontakt möglich. Im Vergleich zu Varizellen besteht beim Zoster

eine wesentlich geringere Kontagiosität, da das Virus nicht über Sekrete des

Respirationstraktes ausgeschieden wird. Zum Ausbruch von Varizellen kommt es

nach einer Inkubationszeit von ca. 14 (10-23) Tagen. Nach Primärkontakt dringt das

VZV über die Schleimhäute des Nasopharynx bzw. die Konjunktiven und

Tränenwege in den Körper ein. Im Anschluss daran tritt in der frühen Phase der

Inkubationszeit eine erste Virämie auf. Bei der Untersuchung von Monozyten im

peripheren Blut von Kindern, die an Varizellen erkrankten, wurde mittels PCR schon

zu dieser Zeit VZV-DNA nachgewiesen (Ozaki et al. 1994). Nach der Virusreplikation

in den regionären Lymphknoten kommt es zur zweiten Virämie mit anschließender

Organmanifestation an Haut und Schleimhäuten, dem Auftreten des typischen

bunten Varizellenexanthem (Abb. 5). Dabei stehen Effloreszenzen verschiedener

Entwicklungsstadien nebeneinander (Spiess 1986), deren differenzialdiagnostische

Abgrenzung von den echten Pocken bis 1978 von Bedeutung war und gegenwärtig

mit der Möglichkeit bioterroristischer Anschläge mit Pockenviren wieder an Aktualität

gewonnen hat. In der Regel zeigen Kinder mit Windpocken einen komplikationslosen

Verlauf. Zu den häufigsten Komplikationen zählen bakterielle Superinfektionen.

Komplikationen wie Pneumonien, die auch bei Schwangeren einen schweren Verlauf

zeigen können, Hepatopathien und seltener Enzephalitiden oder Myokarditiden

(Bächli et al. 1996) treten vorzugsweise bei Jugendlichen und Erwachsenen sowie

bei immuninkompetenten Kindern auf (Balfour et al. 1988). Kommt es zu Varizellen

während der Schwangerschaft, kann die Erkrankung auch schwere Folgen für das

Kind haben. Bei mütterlichen Windpocken im ersten und zweiten Trimenon besteht

die Möglichkeit kongenitaler Missbildungen, die als fetales Varizellensyndrom

beschrieben werden (Sauerbrei und Wutzler 2003). Varizellen um den Geburtstermin

sind ebenfalls gefürchtet, da beim Neugeborenen dann neonatale Windpocken

möglich sind (Sauerbrei und Wutzler 2001).

Eine Prophylaxe von Varizellen ist mit spezifischem Immunglobulin möglich.

Voraussetzung dafür ist die rechtzeitige Gabe des Präparates innerhalb der ersten

72, maximal 96 Stunden nach Expositionsbeginn. Kommt es dennoch zum Auftreten

von Windpocken, so verlaufen diese mild. Risikogruppen, die für eine passive

Immunprophylaxe in Frage kommen, sind empfängliche, abwehrgeschwächte

Personen, schwangere Frauen ohne Varizellenanamnese, Neugeborene, deren

16

Mütter um den Geburtstermin an Varizellen erkranken, und exponierte Frühgeborene

(Deutsche Gesellschaft für Pädiatrische Infektologie 2003).

Auf eine VZV-Primärinfektion reagiert der Organismus mit einer humoralen und

zellulären Immunantwort. Die humorale Immunreaktion besteht in der Bildung von

virusspezifischen Antikörpern der IgM-, IgA- und IgG-Klasse. Antikörper der IgG-

Klasse persistieren bei immunkompetenten Personen lebenslang und schützen vor

einer klinisch manifesten exogenen Zweitinfektion. In einzelnen Fällen, insbesondere

bei Kindern mit gestörter zellulärer Abwehr, kann es trotz vorausgegangener

Erstinfektion zu einer erneuten Varizellenerkrankung kommen (Heidl et al. 1986,

Terada et al. 1998, Urban, 1982).

Nach der Primärinfektion persistiert das VZV latent in zentralen und spinalen

sensorischen Ganglien und verursacht nach endogener Reaktivierung den Zoster

(Bastian et al. 1974, Gilden et al. 1983, Mahalingeam et al. 1990), der bei bis zu 23%

aller seropositiven Individuen auftritt (Krause und Klinman 2000). Prinzipiell besteht

bei jeder Person, die eine VZV-Primärinfektion durchgemacht hat, die Möglichkeit,

dass das latente Virus reaktiviert wird und einen Zoster verursacht (Hope-Simpson

1965). Ein erhöhtes Risiko findet man bei älteren Menschen, Patienten mit

Immunsuppression, malignen Lymphomen bzw. Leukämien, unter

immunsuppressiver Therapie, nach Transplantationen sowie bei Traumata,

Alkoholabusus, Stress oder AIDS (Baba et al. 1986, Bilgrami et al. 1999, Friedman-

Kein et al. 1986, Wutzler 2002). Auch Kinder, die eine intrauterine

Windpockeninfektion durchgemacht haben, können gehäuft an einem Zoster

erkranken (Brunell und Kotchmar 1981, Dworsky et al. 1980, Sauerbrei und Wutzler

2003). Die Zoster-Inzidenz liegt in Abhängigkeit vom Alter bei Kindern und

Jugendlichen zwischen 42 und 160 pro 100.000 Personen-Jahre, bei 40-jährigen

Erwachsenen zwischen 200 und 300 pro 100.000 Personen-Jahre und nach dem 80.

Lebensjahr bei >1.000 pro 100.000 Personen-Jahre (Guess et al. 1985, Gross 1997,

Petursson et al. 1998). In einer großen epidemiologischen Studie in North Carolina,

USA, wurde festgestellt, dass Menschen mit schwarzer Hautfarbe ein signifikant

geringeres Risiko als „Weiße″ haben, einen Zoster zu entwickeln (Schmader et al.

1995). Dagegen spielten Geschlecht, Bildungsgrad und die Lokalisation des Zosters

keine entscheidende Rolle für das Risiko, an einem Zoster zu erkranken.

17

Im Rahmen der Zoster-Pathogenese kommt es auf neuronalem Weg zum

zentrifugalen Transport des VZV vom Nervenganglion bis ins Innervationsgebiet des

dazugehörigen Nerven. Es folgt das Prodromalstadium� mit unspezifischen

Allgemeinbeschwerden, lokalisierten Parästhesien und brennenden Schmerzen im

befallenen Dermatom. Im Verlauf von einigen Tagen entsteht das typische klinische

Bild, das durch ein unilaterales Bläschenexanthem im sensiblen Versorgungsgebiet

eines Hautnerven (Abb. 6) und z.T. heftigen Neuralgien gekennzeichnet ist. Nahezu

60% aller Infektionen betreffen die Haut des Thoraxbereichs, während die Lumbal-,

Sakral-, Kopf- und Halsregionen seltener befallen sind. Im weiteren Verlauf der

Erkrankung trocknen die Bläschen ein, und es kommt zur Bildung von Krusten, die

nach zwei bis drei Wochen abfallen. Als Komplikationen werden häufig bakterielle

Sekundärinfektionen und seltener Nekrosen, Blutungen und neurologische

Symptome beobachtet (Bredlich et al. 1998). Beim Befall eines Hirnnerven drohen

starke Beschwerden und komplizierte Krankheitsverläufe, da die Gefahr der

Mitbeteiligung von Auge und Innenohr besteht. Mit bis zu 70% der Fälle stellt die

Postzosterische Neuralgie (PZN) die häufigste aller Zoster-Komplikationen dar

(Whitley et al. 1999). Es besteht eine Abhängigkeit vom Alter und Geschlecht der

Patienten, von der Anzahl und Art der Effloreszenzen und vom befallenen Dermatom

(Wutzler und Meister 1997). Eine Disseminierung des Zoster unter Einbeziehung

viszeraler Organe wird bei immuninkompetenten Patienten in 8 bis 15% der Fälle

beschrieben (Balfour et al. 1988, Heidl et al. 1989).

18

Abb. 6: Klinisches Bild eines Zoster im Gesichtsbereich (sensibler Ast des N.

Trigeminus), Quelle: Tusalud, www.tusalud.com.mx

- 'LDJQRVWLN�Varizellen und Zoster werden in den meisten Fällen klinisch diagnostiziert. Unter dem

Aspekt der Differenzialdiagnostik werden virologische Untersuchungen vor allem zur

Abklärung von atypischen Krankheitsbildern bei Patienten mit Immundefizienz, zur

Abgrenzung anderer bläschenbildender Dermatosen sowie zum Nachweis von

Infektionen des Zentralnervensystems (ZNS) oder einer Pneumonie erforderlich

(Sauerbrei und Wutzler 2004). Weitere Indikationen für eine Labordiagnostik

bestehen bei negativer oder zweifelhafter Varizellenanamnese nach VZV-Kontakt

während der Schwangerschaft, zur Abklärung einer intrauterinen Infektion sowie bei

Verdacht auf ein fetales Varizellensyndrom oder bei fraglichen neonatalen Varizellen.

Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung ist es notwendig,

Impfvarizellen von natürlich erworbenen Windpocken zu unterscheiden. Darüber

hinaus müssen empfängliche Personen erkannt werden, um eine Immunprophylaxe

einzuleiten oder eine Impfung vorzunehmen. Eine frühzeitige und sichere

Labordiagnose von Windpocken und Zoster lässt sich nur über den Erregernachweis

19

mittels PCR erreichen (Sauerbrei et al. 1999). Steht keine PCR zur Verfügung, kann

der Nachweis des VZV in Hauteffloreszenzen auch mittels Immunfluoreszenz

erfolgen (Coffin und Hodinka 1995). Eine Virusanzüchtung sollte nur dann versucht

werden, wenn Spezialuntersuchungen wie die molekulare Typisierung des VZV zur

Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren oder die Resistenzbestimmung

gefordert sind. Serologische Untersuchungen haben in erster Linie Berechtigung zur

Bestimmung des Immunstatus. Dafür sind Immunfluoreszenzteste und

Enzymimmunassays geeignet (Sauerbrei et al. 2004).

- $QWLYLUDOH�7KHUDSLH�Für eine kausale antivirale Therapie von VZV-Infektionen stehen verschiedene

Substanzen zur Verfügung (Tab. 1). Die ersten Virostatika zur Behandlung von

Herpesvirus-Infektionen wurden bereits vor über 40 Jahren entwickelt. Der

entscheidende Durchbruch in der antiviralen Therapie von VZV-Infektionen gelang

vor ca. 20 Jahren mit der Einführung von Aciclovir (Zovirax), dessen

Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation jedoch nur 15 bis 30% beträgt (Snoeck et

al., 1999). Erst seit wenigen Jahren stehen mit Valaciclovir (Valtrex), dem L-

Valinester von Aciclovir, und Famciclovir (Famvir), dem oralen Prodrug von

Penciclovir, wesentlich besser enteral resorbierbare Medikamente zur Verfügung, die

sich zur oralen Therapie eignen. Für die antivirale Behandlung von VZV-Infektionen

sind heute Aciclovir (i.v., p.o.), Brivudin (p.o.), Famciclovir (p.o.) und Valaciclovir

(p.o.) zugelassen (Wutzler 2002). Im Falle des Zosters kann bei einem

Therapiebeginn innerhalb von 72 Stunden nach Auftreten der Hauterscheinungen

neben der schnelleren Abheilung der Zoster-Effloreszenzen eine Reduzierung des

Zoster-assoziierten Schmerzes erreicht werden (Gross et al. 2003). Behandelt

werden sollten Immunsupprimierte mit Zoster oder Varizellen, Patienten mit Zoster

ab dem 50. Lebensjahr, Zoster im Kopf-Halsbereich, schwerem Zoster an Stamm

und Extremitäten sowie bei schwerer Dermatitis atopica und ausgedehnten Ekzemen

(Wutzler und Sauerbrei 2004). Eine antivirale Therapie mit Aciclovir ist auch bei

Schwangeren mit Varizellen-Pneumonie, Säuglingen mit neonatalen Varizellen und

bei VZV-Enzephalitis indiziert. Resistenzen gegenüber Aciclovir und verwandten

Substanzen werden selten beobachtet. Sie beruhen meistens auf Mutationen des

20

Thymidinkinase-Gens und seltener des DNA-Polymerase-Gens. Als alternatives

Therapeutikum wird für diese Fälle Foscarnet (Foscavir) vorgehalten.

Tab. 1: Potentielle Angriffspunkte von Virostatika zur antiviralen Therapie von

VZV-Infektionen, nach Weber et al. 2002

:LUNVXEVWDQ]� :LUNXQJVPHFKDQLVPXV�$FLFORYLU� • Aktivierung zu Aciclovir-Monophosphat über virale

Tymidinkinase

• kompetitive Hemmung der DNA-Polymerase

• Kettentermination

9DODFLFORYLU� • Konversion zu Aciclovir in Dünndarm und Leber

)DPFLFORYLU� • Konversion zu Penciclovir in Dünndarm und Leber

%ULYXGLQ� • Aktivierung zu Mono- und Diphosphat durch VZV-

Tymidinkinase

• Abbruch der DNA-Kette durch Einbau von Brivudin-

Triphosphat

)RVFDUQHW� • Pyrophosphatantagonist

• keine vorherige Aktivierung

• nichtkompetitive Inhibition der DNA-Polymerase

�� 9DUL]HOOHQLPSIXQJ�Mit der Isolierung und Attenuierung des VZV-Oka-Stammes vor ca. 30 Jahren in

Japan (Takahashi et al. 1974) wurden die Grundlagen für die spätere Einführung der

Varizellenimpfung in zahlreichen Ländern geschaffen. Das Oka-Impfvirus ist der

einzige von der WHO empfohlene VZV-Stamm für eine Anwendung am Menschen.

Varizellenimpfstoffe werden heute von verschiedenen Firmen hergestellt. Sie

unterscheiden sich in der Anzahl der Viruspassagen in humanen diploiden

Zellkulturen, im Gehalt an vermehrungsfähigem Virus und im Zusatz von

21

Stabilisatoren. Wesentliche Fortschritte brachte die Zubereitung lyophilisierter

Impfstoffe, die erstmals 1995 auf den Markt kamen (Gershon et al. 1999, Gershon

2001).

Bereits 1984 erfolgte in Deutschland und einigen anderen Ländern die Zulassung

eines Oka-Impfstoffes für Hochrisikopatienten und deren Kontaktpersonen. 1995

wurde die allgemeine Varizellenimpfung in den USA zur Prävention von VZV-

Infektionen bei allen Personen ab dem vollendeten 12. Lebensmonat eingeführt. Ein

Jahr später startete ein Programm zur Impfung aller Kinder im Alter von 12 bis 18

Monaten, von älteren empfänglichen Kindern, Jugendlichen und Erwachsenen, von

Kontaktpersonen immunsupprimierter Patienten und Mitarbeitern im

Gesundheitsdienst (Gershon 2001, Watson 2001). Gegenwärtig werden

Lebendimpfstoffe auf der Basis des VZV-Stammes Oka in zahlreichen weiteren

Ländern wie Kanada, Australien, Japan und Südkorea mit Erfolg für Impfungen im

Kindesalter eingesetzt. Mehrere europäische Länder empfehlen die Varizellen-

Schutzimpfung für Personen mit einem hohen Risiko für schwerverlaufende

Varizellen und/oder für seronegative Mitarbeiter im Gesundheitsdienst. In

Deutschland wurden darüber hinaus seit 2001 die nationalen Impfempfehlungen

durch die Ständige Impfkommission am Robert Koch-Institut (STIKO) auf Kinder und

Jugendliche zwischen 12 und 15 Jahren ohne Varizellenanamnese erweitert (STIKO

2001). Im Juli 2003 hat der Freistaat Sachsen als erstes Bundesland eine generelle

Varizellenimpfung im Kindesalter eingeführt. 2004 hat die STIKO die allgemeine

Varizellenimpfung bei Kindern ab dem 2. Lebensjahr für Gesamtdeutschland

empfohlen (STIKO 2004). Mit der Impfung wird das Ziel verfolgt, die hohe Morbidität

der Varizellen und die Rate der vielfältigen Varizellen-assoziierten Komplikationen zu

reduzieren sowie darüber hinaus die Hospitalisierungsrate zu senken. Es wird auch

erwartet, dass bei sinkenden Erkrankungsraten infolge der Herdimmunität Säuglinge,

Schwangere und Personen aus klinisch relevanten Risikogruppen wie Patienten mit

Leukämie bzw. unter immunsuppressiver Therapie von der Impfung profitieren.

Varizellenimpfstoffe induzieren sowohl eine humorale als auch zelluläre

Immunantwort. Die Immunogenität der Impfstoffe ist abhängig vom Alter und von der

Immunkompetenz der Impflinge sowie vom Virusgehalt der verabreichten Vakzine.

Zahlreiche Studien, die vor allem in den USA und Japan durchgeführt worden sind,

belegen, dass der Impfstoff eine gute Immunogenität besitzt (Asano et al. 1994,

Kuter et al. 1995, Asano 1996, Varis and Vesikari 1996, Burges et al. 1999). Die

22

Serokonversionsrate beträgt bei gesunden Kindern sechs bis acht Wochen nach

einer Impfung mehr als 95%. Bei Jugendlichen und Erwachsenen sowie bei

immundefizienten Kindern sind zwei Impfstoffdosen im Abstand von mindestens vier

bis sechs Wochen erforderlich, um Serokonversionsraten von über 90% zu erreichen

(Gershon et al. 1999, Takahashi 2001). Die Varizellenimpfung wird allgemein gut

toleriert. Durch mehrere nichtkontrollierte Studien konnte gezeigt werden, dass die

VZV-Vakzine nur relativ geringe lokale und systemische Nebenwirkungen auslöst.

Dazu gehören Schmerzen an der Einstichstelle bei 25 bis 30% und Fieber bei 10%

der geimpften Kinder, Jugendlichen und Erwachsenen (Weber et al. 1996). Ein

lokalisiertes Exanthem trat in 1 bis 3% der Impflinge auf, und varizellenartige

Hauterscheinungen mit relativ wenigen Effloreszenzen, als Impfvarizellen bezeichnet,

wurden zu ca. 5% nach der ersten Dosis und zu ca. 1% nach der zweiten Dosis im

Abstand von zwei bis vier Wochen nach der Impfung beobachtet (American Academy

of Pediatrics 2000).

Der Oka-Impfstamm kann, ähnlich dem Wildtyp-Virus, zu einer latenten Infektion in

sensorischen Ganglien führen und nach endogener Reaktivierung auch einen Zoster

verursachen (Gershon 2001). Bisherige Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass

der Oka-Stamm wesentlich seltener als das Wildtyp-VZV reaktiviert wird (Gershon

2001). Über das Auftreten eines Zosters nach Varizellenimpfung wurde bei gesunden

Kindern mit einer Inzidenz von 13 bis 18 pro 100.000 Personen-Jahre berichtet

(Gershon et al. 1999, Watson 2001). Damit liegt die Zoster-Inzidenz bei geimpften

Kindern etwa fünffach niedriger als bei Kindern, die natürliche Varizellen

durchgemacht haben. Der Oka-Impfstamm wurde bislang nur in sehr wenigen Fällen

als Ursache für einen Zoster identifiziert (Liang et al. 1998, Sharrar et al. 2000, Uebe

et al. 2002). Ein relatives Risiko, an einem Zoster nach Varizellenimpfung zu

erkranken, scheint bei solchen Impflingen zu bestehen, die entweder ein

Impfexanthem oder sog. Durchbruchsvarizellen entwickelt haben (Hardy et al. 1991).

Auf dieser Grundlage wurde die Hypothese entwickelt, dass Hauteffloreszenzen die

Voraussetzung für das Eindringen des VZV in die Hautnerven und für eine

aszendierende Infektion der Dorsalganglien darstellen.

Wie Fallkontrollstudien belegen, schützt die Varizellenimpfung zu über 95% vor

schwer verlaufenden Windpocken und verhindert zu 70 bis 90% Windpocken

jeglichen Schweregrades (Watson 2001). Japanische Langzeitbeobachtungen haben

ergeben, dass die durch die Impfung induzierte Antikörperantwort für mindestens 20

23

Jahre persistieren soll (Takahashi 2001). Die Folge nachlassender Immunität bzw.

unzureichender Immunreaktion sind Impfdurchbrüche bei immungesunden Personen.

Sie werden jährlich bei ca. 1% der Geimpften beobachtet (Watson 2001). Vorläufige

Daten weisen darauf hin, dass bei älteren Menschen eine Boosterung der VZV-

spezifischen Abwehr durch die Verabreichung von Varizellenimpfstoff einen Zoster

verhindern oder zumindest die klinische Symptomatik abschwächen kann (Färber

2004).

Eine Übertragung von Impfviren auf Kontaktpersonen ist prinzipiell nur möglich, wenn

diese noch keine Varizellen durchgemacht haben und demzufolge seronegativ sind.

Dies trifft in Deutschland auf ca. 3% aller Frauen im gebärfähigem Alter zu (Wutzler

et al. 2001). Da im Unterschied zur natürlichen Infektion mit Wildtyp-Viren das

Impfvirus bei immungesunden Menschen nicht über den Oropharynx ausgeschieden

wird, kann eine Übertragung des Oka-Impfvirus auf empfängliche Kontaktpersonen

nur stattfinden, wenn der Impfling ein Exanthem mit Vesikeln in Form von

Impfvarizellen entwickelt. Bei Exposition im häuslichen Milieu ist die

Wahrscheinlichkeit der Übertragung des Impfvirus auf empfängliche Personen vier

bis fünf mal niedriger, als dies bei dem Wildtyp-Virus der Fall ist (Tsolia et al. 1990).

Wenn es doch zu einer Übertragung kommt, verläuft die Infektion meist subklinisch.

Bisher sind nur wenige gut dokumentierte Fälle von varizelliformen Exanthemen als

Folge der Übertragung des Impfvirus auf Kontaktpersonen bekannt geworden

(Salzman et al. 1997). Bisherige Erfahrungen belegen auch, dass eine Infektion

schwangerer Frauen mit dem Impfvirus nicht zu kongenitalen Fehlbildungen führt

(Shields et al. 2001).

Die Durchführung der Varizellenimpfung bei einer großen Anzahl von Personen hat

auch Konsequenzen für die Surveillance und Diagnostik von VZV-Infektionen. Es ist

zu erwarten, dass einerseits die Anzahl der Personen, die Varizellen durchgemacht

haben und Träger des Wildtyp-Virus sind, abnimmt und andererseits die geimpfte

Population, die z.T. Träger des Impfvirus ist, zunimmt. Damit rücken Fragen nach der

Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-Viren in den Vordergrund. Dies trifft auch für

die Beurteilung von Windpocken- oder Zoster-Erkrankungen zu, die nach Impfung

auftreten können. Bisherige Erfahrungen haben gezeigt, dass eine zweifelsfreie

Unterscheidung zwischen Impf- und Wildtyp-VZV nur mittels Genotypisierung

möglich ist (La Russa et al. 2000, Argaw et al. 2000, Gomi et al. 2001).

24

�� $XIJDEHQVWHOOXQJ�Die Aufgabe der vorliegenden Promotionschrift war es, VZV-Isolate von Patienten mit

Varizellen oder Zoster, die in den vergangenen zehn Jahren am Institut für Virologie

und Antivirale Therape isoliert und archiviert worden waren, mit

molekularbiologischen Verfahren zu typisieren. Darüber hinaus standen zur Prüfung

mittels direkter molekularer Typisierung auch VZV-DNA-positive

Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster zur Verfügung.

Im Rahmen der geplanten Untersuchungen sollten spezielle VZV-Genomabschnitte

in den ORF 38, 54 und 62 charakterisiert werden, die in der einschlägigen Literatur

bislang am häufigsten zur Genotypisierung des VZV mit dem vorrangigen Ziel der

Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren verwendet wurden. Die Auswahl dieser

Genomabschnitte erfolgte auch deshalb, um die eigenen Ergebnisse mit den aus der

Literatur bekannten Typisierungsmustern europäischer, amerikanischer und

japanischer VZV-Stämme vergleichen zu können. Methodisch sollten in die

Untersuchungen die PCR zur Amplifikation viraler DNA und die Charakterisierung der

Amplifikate mittels Restriktionsenzymanalyse einbezogen werden.

Ausgehend von diesen geplanten Experimenten sollten folgende

Hauptfragestellungen bearbeitet werden:

• Welche Methode gestattet eine zuverlässige routinemäßige Genotypisierung des

VZV einschließlich Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren?

• Ist für die Genotypisierung des VZV die Anzüchtung eines Virusisolates

erforderlich oder gelingt auch eine direkte Viruscharakterisierung im

Untersuchungsmaterial?

• Welche Genotypen des VZV werden bei Personen mit VZV-Infektionen in

Thüringen beobachtet? Bestehen dabei Unterschiede zu anderen europäischen

und außereuropäischen Ländern?

• Welche Verbreitung besitzt der Impfstamm Oka in der Population?

25

�� 0DWHULDO�XQG�0HWKRGHQ�� 8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOLHQ�3.1.1. Materialien von Patienten

- 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�6WlPPH�In die vorliegende Arbeit wurden VZV-Stämme von 53 Patienten einbezogen. Diese

Virusstämme waren in den Jahren 1997 bis 2001 am Institut für Virologie und

Antivirale Therapie isoliert worden. Die klinische Diagnose lautete bei 40 Patienten

Zoster sowie bei 11 Patienten Varizellen. Bei zwei Patienten war die Diagnose

unbekannt. Durch Einsicht in die Krankenunterlagen konnte bei 14 Patienten eine

Immuninsuffizienz eruiert werden, wobei zehn Patienten an einem Zoster und vier an

Varizellen erkrankt waren (Tab. 2).

Tab. 2: Klinische Diagnosen der Patienten, von denen VZV-Stämme

angezüchtet worden waren

.OLQLVFKH�'LDJQRVH� $Q]DKO�GHU�LVROLHUWHQ�9=9�6WlPPH�

Varizellen (ohne Immunsuppression) 7

Varizellen (mit Immunsuppression) 4

Zoster (ohne Immunsuppression) 30

Zoster (mit Immunsuppression) 10

Unbekannt 2

Σ 53

- 3DWLHQWHQSUREHQ�

In die Untersuchungen wurden ebenfalls VZV-DNA-positive Proben von 73 Patienten

mit Zoster oder Varizellen einbezogen. Diese Proben waren zwischen 1999 und

2001 aus den Einsendungen an das Konsiliarlabor für HSV und VZV am Institut für

26

Virologie und Antivirale Therapie gesammelt worden. Die präparierte DNA lagerte bei

-80°C.

Die klinische Diagnose war bei insgesamt 52 Patienten mit Zoster und bei 8

Patienten mit Varizellen angegeben. Bei 19 Patienten lagen in der Anamnese

Hinweise auf eine Immunschwäche vor. Davon zeigten alle Patienten eine Zoster-

Erkrankung (Tab. 3).

Der Nachweis von VZV-DNA war mittels PCR unter Anwendung der Primer der VZV-

Gene 4, 28 und 29 geführt worden (Sauerbrei et al., 1999).

Tab. 3: Klinische Diagnosen der Patienten, von denen VZV-DNA-positive

Proben zur Untersuchung kamen

.OLQLVFKH�'LDJQRVH� $Q]DKO�YRQ�3DWLHQWHQSUREHQ� Varizellen (ohne Immunsuppression) 8

Zoster (ohne Immunsuppression) 35

Zoster (mit Immunsuppression) 19

Unbekannt 11

Σ 73

- $UW�GHV�8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOV�Beim Ausgangsmaterial aller Proben handelte es sich um den Inhalt von

Hautbläschen (Bläschenabstriche, Bläschenpunktate), Krusten, Hautabstriche,

Biopsiematerialien der Haut, Liquores und Rachenabstriche (Tab. 4).

27

Tab. 4: Art der Untersuchungsmaterialien der in Tab. 2 und 3 aufgelisteten

VZV-Stämme und Patientenproben

��8QWHUVXFKXQJVPDWHULDO� $Q]DKO� Bläscheninhalt 51

Bläschenabstrich 14

Hautkrusten 2

Liquor 3

Rachenabstrich 2

Biopsiematerial der Haut 1

Unbekannt 53

Σ 126

- +HUNXQIW�GHU�8QWHUVXFKXQJVPDWHULDOLHQ�Bezüglich der behandelnden medizinischen Einrichtungen ergab sich die in Tabelle 5

dargestellte Verteilung. Insgesamt wurden 41 Proben von der Hautklinik, zehn

Proben von der Kinderklinik, zwei Proben vom Institut für Mikrobiologie und eine

Probe von der Klinik für Innere Medizin des Universitätsklinikums Jena eingesandt.

Aus dem Helios-Klinikum Erfurt wurden 27 Proben durch die Hautklinik, 22 Proben

von der Medizinische Klinik, fünf Proben durch die Kinderklinik, eine Probe durch die

HNO-Klinik und eine weitere durch die Klinik für Strahlentherapie geschickt. Weitere

zwei Proben stammten aus Arztpraxen in Erfurt, eine Probe vom Katholischen

Krankenhaus Erfurt und eine weitere vom Klinikum der Universität Halle. Bei 12

Proben war die einsendende medizinische Einrichtung nicht mehr zu bestimmen.

28

Tab. 5: Herkunft der Patienten, von denen Materialien zur Untersuchung kam

(LQULFKWXQJ� $Q]DKO�GHU�3UREHQ�Hautklinik, Universitätsklinikum Jena 41

Hautklinik, Helios-Klinikum Erfurt 27

Medizinische Klinik, Helios-Klinikum Erfurt 22

Kinderklinik, Universität Jena 10

Kinderklinik, Helios-Klinikum Erfurt 5

Institut für Mikrobiologie, Universitätsklinikum

Jena

2

Arztpraxen, Erfurt 2

Klinik für Innere Medizin, Universitätsklinikum

Jena

1

HNO-Klinik, Helios-Klinikum Erfurt 1

Katholisches Krankenhaus Erfurt 1

Klinik für Strahlentherapie, Helios-Klinikum

Erfurt

1

Klinikum, Universität Halle 1

Unbekannt 12

Σ 126

- $OWHUVYHUWHLOXQJ�GHU�3DWLHQWHQ��Die Altersverteilung der Patienten, von denen Materialien zur Untersuchung kamen,

ist aus Tabelle 6 ersichtlich. Nahezu alle Patienten mit Varizellen stammten aus der

Altersgruppe bis 20 Jahre, während die häufigsten Fälle mit Zoster bei den 50- bis

80-Jährigen zu finden waren.

29

Tab. 6: Altersverteilung der Patienten (n = 126)

$OWHU�GHU�3DWLHQWHQ� +HUSHV�]RVWHU� 9DUL]HOOHQ�0-9 4 9

10-19 12 6

20-29 9 0

30-39 7 1

40-49 5 0

50-59 19 0

60-69 23 0

70-79 14 0

80-89 8 0

90-99 1 0

Unbekannt 8 0

Σ 110 16

3.1.2. Varicella-Zoster-Virus-Prototypstämme

Folgende VZV-Prototypstämme aus der Sammlung des Konsiliarlabors für HSV und

VZV am Institut für Virologie und Antivirale Therapie wurden als Kontrollen

verwendet:

• VZV Wildtyp-Stamm YS-R, TK-, Herkunft: Rega Institute for Medical Research,

Katholicke Universiteit Leuven, Belgien

• VZV Impftyp-Stamm Oka: American Type Culture Collection (ATCC) VR-795

• VZV Impftyp-Stamm Oka 07-1, Herkunft: Rega Institute for Medical Research,

Katholicke Universiteit Leuven, Belgien

• VZV Impftyp-Stamm Oka, 1991 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix

(SmithklineBeecham, München)

30

• VZV Impftyp-Stamm Oka I, 1995 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix

(GlaxoSmithKline, Großbritannien)

• VZV Impftyp-Stamm Oka II, 1999 isoliert aus dem Impfstoff Varilrix, Ch. B.:VA

212 A 44B-1 (GlaxoSmithKline, Großbritannien)

�� =HOONXOWXUHQ�Alle VZV-Stämme wurden entweder in Kulturen frisch aufbereiteter primärer

Zellsuspensionen menschlicher Strumazellen oder in HELF-Kulturen angezüchtet

und vermehrt. Insbesondere die Strumazellkulturen wurden zur Isolierung und

Passagierung des VZV genutzt.

Alle Primärkulturen humaner Strumazellen wurden nach einer Methode von

Schweizer (Schweizer 1968) präpariert, als Monolayerzellkulturen kultiviert und

kryokonserviert. Die Herstellung frischer Zellsuspensionen erfolgte durch kurzes

Überfluten von drei bis vier Tage alten primären Monolayerzellkulturen mit Chelaplex-

Trypsin-Lösung (Rp. 4). Nach Einstellung der Zelldichte auf ca. 5 x 105 Zellen/ml

wurden die Strumazellen in einem Medium kultiviert, das sich aus folgenden

Komponenten zusammensetzte:

- 50% Lactalbuminydrolysat in HANKS-Lösung (Rp. 1),

- 40% Zellzuchtmedium 199 nach PARKER (Biochrom KG, Berlin) und

- 10% L-15-Medium nach LEIBOVITZ (Biochrom KG, Berlin).

Der pH-Wert wurde mittels 5%iger Natriumbicarbonatlösung auf 7,2 eingestellt.

Zusätzlich enthielt das Medium

- 10% fetales Kälberserum (Biochrom KG, Berlin)

- 100.000 IU/l Penicillin und

- 0,1 g/l Streptomycinsulfat.

Für die Kultivierung von HELF der 5.-15. Passage als Monolayerzellkulturen wurde

ein Medium aus

- 50% Lactalbuminhydrolysat in HANKS-Lösung (Rp. 1) und

- 50% L15 Medium nach Leibovitz (Biochrom KG, Berlin) verwendet.

31

Das Medium wurde durch folgende Zusätze ergänzt:

- 10% fetales Kälberserum,

- 100.000 IU/l Penicillin,

- 0,1 g/l Streptomycinsulfat und

- 200 mM L-Glutamin.

Zur Passagierung wurden sieben Tage alte Lungenfibroblasten mittels Trypsin-

Lösung (Rp. 3) vom Gefäßboden abgelöst und suspendiert. Anschließend wurden

die Zellen in frisches Medium aufgenommen und in neue Zellkulturflaschen eingesät,

wobei der Gehalt an Kälberserum auf 5% reduziert wurde.

�� 9LUXVDQ]�FKWXQJ�Zur Virusanzüchtung und Passagierung erfolgte die Beimpfung einer 5 ml-

Zellsuspension mit einer Zelldichte von ca. 4 x 105 Zellen/ml in T 25-

Zellkulturflaschen (Sarstedt, Nümbrecht) mit ca. 300 µl der Abstrichmaterialien bzw.

mit ca. 1 ml Suspension VZV-infizierter Zellen. Während der Inkubation über 10 bis

14 Tage bei 35°C wurden die Kulturen täglich mikroskopisch unter dem

Umkehrmikroskop Telaval (Carl Zeiss, Jena) hinsichtlich des Auftretens

cytopathischer Effekte (cpE) befundet. Nach Erreichen eines cpE von 75% wurde der

Zellrasen mechanisch abgeschabt, zentrifugiert und in neues Zellkulturmedium

aufgenommen.

Das Abfüllen der infizierten Zellsuspension in Ampullen zwecks Lagerung in der

Stammsammlung bei –80°C wurde nach der Virustypisierung durchgeführt.

�� 9LUXVW\SLVLHUXQJ�Zur Virustypisierung wurde ein Teil der infizierten und pelletierten Zellen in

phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Rp. 5) gewaschen und in einer Dichte von

ca.105 Zellen/ml auf Objektträger getropft. Nach Trocknung der Präparate und

Fixierung in Azeton für 1 h bei –20°C erfolgte die Überschichtung mit dem

monoklonalen Antikörper Anti-VZV Glycoprotein l, Mab, lgG 2b (Paesel/Lorei,

Frankfurt) in einer Verdünnung von 1:300. Zum Ausschluss von HSV-Isolaten wurden

in separater Weise die Präparate mit monoklonalen HSV-1- und 2-Antikörpern von

32

der Maus (DAKO, Hamburg) überschichtet. Es folgte eine Inkubation für 2 h in einer

feuchten Kammer bei 37°C. Danach wurden die Präparate zur Entfernung

nichtgebundener Antikörper in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Rp. 5) gespült,

mit Fluoreszeinisothiozyanat (FITC)-markiertem Anti-Maus-Globulin (DAKO,

Hamburg) in einer Verdünnung von 1:2 überschichtet und wiederum für 1 h in einer

feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Spülen in Phosphatpufferlösung (Rp. 5)

schloss sich die Bewertung der Präparate unter dem Fluoreszenzmikroskop Olympus

BH2-RF CA (Olympus, Japan) an. Typischerweise zeigte sich bei positivem Befund

eine charakteristische brillantgrüne Fluoreszenz der intranukleären Einschlüsse

sowie des Zytoplasma in VZV-infizierten Zellen.�� '1$�3UlSDUDWLRQ�Zur Präparation der VZV-DNA wurde der QIAampDNA Blood Kit (Qiagen, Hilden)

verwendet. In Anlehnung an das vom Hersteller empfohlene Präparationsprotokoll

wurden die zu untersuchenden Virusstämme, Isolate und Abstrichmaterialien in

identischer Weise behandelt. Im Einzelnen wurden folgende Arbeitsschritte

durchgeführt (Abb. 7):

• Zum Lyseansatz wurden 20 µl Qiagen-Protease, 200 µl virushaltiges Material und

200 µl Lysispuffer AL aufeinanderfolgend in ein Safelock-Eppendorf-Röhrchen

pipettiert, ca. 15 sek mit dem Vortexer gemischt und dicht verschlossen. Nach

kurzer Zentrifugation für 12 sek erfolgte eine Wärmebehandlung für 10 min bei

56°C in einem Thermomixer (Eppendorf Hamburg). Hierbei wurden die Zellwände

aufgelöst und die DNA freigesetzt.

• Durch Zusatz von 200 µl 96 bis 100%igem Äthanol und gutes Durchmischen

wurde die Lyse gestoppt und die DNA präzipiert.

• Es folgt die Aufzentrifugation der entstandenen Mischung auf eine QIAamp-

Minisäule bei 6.000 x g für 1 min. Durch diesen Arbeitsschritt wird die DNA von

der Lösung getrennt und in eine der Reinigung zugängliche Form überführt. Die

DNA bleibt in der Minisäule fixiert, und die abzentrifugierte Flüssigkeit wird

verworfen.

• Zwecks Reinigung der DNA wurde die Minisäule nacheinander mit 500 µl des

mitgelieferten Waschpuffers I AW 1 und Waschpuffers II AW 2 bestückt und

33

jeweils 1 min bei 6.000 x g zentrifugiert. Hierbei wurde das Auffanggefäß

gewechselt. Zur Restpufferentfernung erfolgte eine hochtourige Zentrifugation bei

16.000 x g über 1 min.

• Abschließend wurde mit 50 µl Elutionspuffer AE die gereinigte DNA von der

Minisäule gelöst. Zu diesem Zweck wurde die mit dem Elutionspuffer versehene

Minisäule in ein Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen platziert, für 1 min bei

Raumtemperatur belassen und anschließend für 1 min bei 6.000 x g zentrifugiert.

Um eine restlose Wiedergewinnung des Eluats zu erreichen, wurde abschließend

nochmals 1 min bei einer vollen Drehzahl von 16.000 x g zentrifugiert.

Die auf diese Weise gewonnenen DNA-Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung

entweder für wenige Tage im Kühlschrank bei 4°C oder für mehrere Wochen bei

-20°C in den Auffanggefäßen aufbewahrt.

34

Abb. 7: Schema zur Präparation der Virus-DNA für die PCR mittels QIAamp

Blood Kit (Qiagen), PBS – Phosphate buffered saline

/\VHDQVDW]�

��O�YLUXVKDOWLJHV�0DWHULDO N ��O�4LDJHQ�3URWHDVH��O�/\VLVSXIIHU�$/�

��VHN�9RUWH[��PLQ�,QNXEDWLRQ�EHL�� O &�LP�7KHUPREORFN��7KHUPRPL[HU��

�bWKDQROIlOOXQJ�

0LQL�6lXOHQ�5HLQLJXQJ

hEHUI�KUXQJ�GHV��/\VH�bWKDQRO��*HPLVFKHV�DXI��4,$DPS�0LQLVlXOH�� $XI]HQWULIXJDWLRQ��PLQ�EHL��[�J�

��:DVFKHQ�GHU�6lXOH�PLW��O�:DVFKSXIIHU�$:��=HQWULIXJDWLRQ��PLQ�EHL��[�J��QHXHV�$XIIDQJJHIl��

��:DVFKHQ�GHU�6lXOH�PLW��O�:DVFKSXIIHU�$:��QHXHV�$XIIDQJJHIl��

=HQWULIXJDWLRQ��PLQ�EHL��[�J�

5HVWSXIIHU�(QWIHUQXQJ��=HQWULIXJDWLRQ��PLQ�EHL�YROOHP�6SHHG��[�J�

=XJDEH�YRQ��O�bWKDQRO��

��³�9RUWH[�

'1$�(OXWLRQ��O�(OXWLRQVSXIIHU�$(�

�ELV��O��DXI�4,$DPS�0LQLVlXOH��QHXHV�$XIIDQJJHIl��VWHULO��PLW�'HFNHO��

$E]HQWULIXJDWLRQ��PLQ�EHL��[�J�XQG��PLQ�EHL�

YROOHP�6SHHG��[�J��

$XIEHZDKUXQJ�GHU�(OXDWH�EHL�� O &�

N *HZHEHNXOWXU�EHUVWDQG��$EVWULFKPDWHULDO�LQ�3%6�

35

�� 9LUXV�'1$�1DFKZHLV�PLWWHOV�3RO\PHUDVHNHWWHQUHDNWLRQ�Folgende PCR-Techniken wurden in Rahmen der vorliegenden Untersuchungen

durchgeführt:

1. Multiplex-PCR unter Verwendung von Primer-Paaren aus den ORF 38 und 54

(Larussa et al. 1992),

2. PCR mit einem Oligonukleotid-Primer-Paar aus dem ORF 38 (Mori et al. 1998),

3. PCR mit einem Oligonukleotid-Primer-Paar aus dem ORF 62 (Loparev et al.

2000).

Die Nukleotidsequenz der verwendeten Primer, ihre Lokalisation im VZV-Genom

sowie die Größe des Amplifikationsproduktes sind in der Tab. 7 zusammengefasst.

Die Synthese der Primer erfolgte im Institut für Virologie und Antivirale Therapie. Zur

Herstellung der DNA-Primer diente der ExpediteTM DNA/RNA Synthesizer, Modell

8909 (Applied Biosystems, Framingham, USA; Software-Version 2.4). Für das nach

der Festphasen-Phosphoramidit-Methode arbeitende System wurden Cyanoethyl-

Phosphoramidit, CDI-Aktivator (Di-cyanomidazol), Cappingreagens, Oxidationsmittel,

Detritylierungsmittel und Acetonitril (Proligo Biochemie GmbH, Hamburg) verwendet.

Als Festphasenträger dienten bei der Herstellung der Primer spezielle Säulen des

Typs CPG-500 Å LCAA (Proligo Biochemie GmbH) mit den entsprechenden

Startnukleosiden. Zur Abspaltung vom Träger und zur Entschützung wurde die Säule

1,5 h mit 28%igem wässrigem Ammoniak und anschließend 20–24h bei 55°C

behandelt. Die Aufreinigung der Oligonukleotide erfolgte mittels Shimadzu HPLC LC

10AT Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Mono Q MR 5/5

Anionaustauschsäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einem linearen

Salzgradienten bis 1 M NaCl und 10 mM NaOH. Zur Entsalzung diente Sephadex G

25 (Pharmacia).

36

Tab. 7: Primer-Design zur Amplifikation von VZV-DNA mittels PCR

3ULPHU�VSH]LILWlW� 1XNOHRWLGVHTXHQ]�

� P ��!�P �1XNOHRWLGH�GHV�9=9�*HQRPV�

$PSOLIL�NDWLRQV�SURGXNW��ES��

/LWHUDWXU�

Gen 38

Primer 1: TTGAACAATCACGAACCGTT Primer 2: CGGGTGAACCGTATTCTGAG

69250 bis

69269

69599 bis 69580

350

LaRussa

et al. 1992

Gen 54

Primer 1: TCCCTTCATGCCCGTTACAT Primer 2: GGAACCCCTGCACCATTAAA

95109 bis

95128

95330 bis 95311

222

LaRussa

et al. 1992

Gen 38

Primer 1: AAGTTTCAGCCAACGTGCCAATAAA Primer 2: AGACGCGCTTAACGGAAGTAACG

69060 bis

69084

69706 bis 69684

648

Mori et al.

1998

Gen 62

Primer 1: TTCCCACCGCGGCACAAACA Primer 2: GGTTGCTGGTGTTGGACGCG

106036 bis

106055

106303 bis 106284

268

Loparev

et al. 2000

Die PCR-Protokolle zur Amplifikation der entsprechenden Genabschnitte wurden

unter Verwendung von Komponenten des HotStarTaq Master Mix Kits (Qiagen) in

Anlehnung an die Originalliteratur gestaltet. Hierbei waren grundsätzlich im

Mastermix folgende Komponenten enthalten.

- PCR-Puffer (50 mM KCl, 15 mM Tris-Hydrochlorid pH 8, 1,5 mM MgCl2)

- Desoxynukleotidtriphosphat (200 µM Endkonzentration jedes dNTP’s)

- Q-Solution (2 µl)

- HotStarTaq DNA-Polymerase (2,5 Einheiten)

- Primer (jeweils 100 pmol)

37

- Steriles Aqua dest. (ad 90 µl)

Als Template waren 10 µl mit ca. 500 ng DNA vorgesehen.

Die einzelnen Mastermixe unterschieden sich lediglich anhand der differenten

Konfigurationen der zugesetzten Primer (siehe Tab. 7).

Mittels Vortexer wurde das Amplifikationsgemisch nach Zugabe von 10 µl DNA für

10 sek gemischt. Die Realisierung der Temperaturprofile zu den einzelnen

Amplifikationsschritten, bestehend aus Denaturierung, Hybridisierung und

Polymerisierung, erfolgte in einem T4-Thermozykler (Whatman/Biometra, Göttingen).

Dem eigentlichen Startzyklus musste eine Temperaturphase von 95°C für 15 min

vorgeschaltet sein, um die HotStarTaq-Polymerase zu aktivieren. Am Ende aller

durchlaufenen Zyklen schloss sich eine Final-Extension für 5 min bei 72 °C an, bevor

die Proben im Thermozykler auf 4°C abgekühlt wurden. Abfolge und Dauer der

einzelnen PCR-Schritte sind in Tab. 8 dargestellt.

Tab. 8: Zeitlicher Verlauf der einzelnen PCR-Methoden

3&5�0HWKRGH� =\NOXVDQ]DKO� 9RUJDQJ� 7HPSHUDWXU� 'DXHU��

Gen 38/54

(LaRussa et al.

1992)

30

Denaturierung

Hybridisierung

Polymerisierung

94 °C

52 °C

72 °C

1 min

1 min

2 min

Gen 38

(Mori et al. 1998)

35

Denaturierung

Hybridisierung

Polymerisierung

95 °C

56 °C

72 °C

20 sek

20 sek

30 sek

Gen 62

(Loparev et al.

2000)

30

Denaturierung

Hybridisierung

Polymerisierung

94 °C

72 °C

72 °C

1 min

1 min

3 min

38

Bis zur weiteren Aufarbeitung für die Restriktionsanalyse wurden die Amplifikate

entweder für 24 h bei Kühlschranktemperatur oder darüber hinaus bei –20°C

aufbewahrt.

Zur Vermeidung von Kontaminationen der PCR-Versuchsansätze mit Fremd-DNA

wurden die Arbeiten nach den derzeitig als zweckmäßig und allgemeingültig

anerkannten Arbeitsregeln für die PCR durchgeführt. Dazu gehören:

- Tragen von Gummihandschuhen,

- Verwendung von Einwegmaterialien (Mikrozentrifugationsröhrchen,

Pipettenspitzen),

- Räumliche Trennung der einzelnen Arbeitsschritte: Herstellung des

Amplifikationsgemisches, Vorbereitung der Untersuchungsmaterialien für die

PCR sowie Durchführung der PCR-Ansätze an speziellen, dekontaminierten

Arbeitsplätzen.

�� 5HVWULNWLRQVHQ]\PDQDO\VH�3.7.1 DNA-Quantifizierung mittels Spektrophotometrie

Die Quantifizierung der amplifizierten DNA wurde mit Hilfe des UV-

Spektralphotometers Ultrospec Plus, (Pharmacia) bei einer Wellenlänge von 260 nm

vorgenommen.

Unter Zugrundelegung der Tatsache, dass bei einer Schichtdicke von 1 cm eine

Lösung von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA bei 260 nm eine optische Dichte von 1

aufweist (Maniatis et al., 1982), wurden die DNA-Gehalte in µg/µl berechnet. Als

Verdünnungs- und Leerwertpuffer diente zweckmäßigerweise der Elutionspuffer AE

des Qiagen DNA-Präparationskits, mit dem am Ende der Präparation die DNA eluiert

worden war (Qiagen). Bei einer Vorverdünnung der Messproben von 1:5 ergab sich

ein Faktor von 0,2 zur Umrechnung der Extinktionswerte in µg/µl. Die Verwendung

von Mikrovolumen-Messküvetten mit einem maximalen Messvolumen von 100 µl

gestattete es, dass mit einem Aliquot von 20 µl der zu kalibrierenden DNA-Lösung

auf sparsame Weise gemessen werden konnte.

39

3.7.2. Enzymverdau der Amplifikate mit Restriktionsendonukleasen

Zur Bestimmung von DNA-Sequenzunterschieden in den durch PCR amplifizierten

Genomabschnitten wurden Restriktionsfragmentanalysen mit den

Restriktionsenzymen %JOI��3VWI sowie 6PDI durchgeführt (Tab. 9):

Tab. 9: Restriktionsendonukleasen zum Enzymverdau der PCR-Amplifikate

5HVWULNWLRQV�HQGRQXNOHDVH�

(UNHQQXQJVVHTXHQ]�GHU�(QGRQXNOHDVH�

+HUVWHOOHU��

�%JOI

GCC(N)4↓NGGC

Roche Diagnostics,

Mannheim

�3VWI

CTGCA↓G

Roche Diagnostics,

Mannheim

�6PDI�

CCC↓GGG

Jena Bioscience, Jena

Unter Verwendung des vom Hersteller mitgelieferten 10-fach konzentrierten

Reaktionspuffers wurde der Reaktionsansatz für den Endonuklease-Verdau durch

Mischung folgender Komponenten als 50 µl-Ansatz in einem Eppendorf-

Reaktionsgefäß vorgenommen:

- 10-fach konzentrierter Enzympuffer 5,0 µl,

- quantifizierte Amplifikat-DNA 2 µg,

- Endonuklease 10 U,

- H2O ad 50 µl.

Das Volumen der zugegebenen DNA wurde aus den Daten der durch

Spektrophotometrie bestimmten DNA-Konzentration im jeweiligen PCR-Amplifikat

berechnet (siehe 3.7.1). In der Regel wurden pro Ansatz 2 bis 6 µg DNA verwendet.

40

Nach zweistündiger Inkubation des Verdauungsansatzes im Thermoschüttler bei 650

rpm und 37°C war im allgemeinen die Spaltung in die Restriktionsfragmente

vollständig und konnte durch die anschließende Elektrophorese in einem 2%igen

Agarosegel (siehe 3.8.) sichtbar gemacht werden. Bei Anwendung der Methode nach

Loparev et al. (2000) wurde die Inkubation auf 3 bis 4 h verlängert. Die DNA-

Spaltung wurde durch Zugabe von 100%igem Äthanol gestoppt und die DNA

präzipitiert. Dazu wurde der Verdauungsansatz mit 2,5 µl einer 4-molaren LiCl-

Lösung sowie 125 µl kaltem 100%igem Äthanol versetzt und für 15 min bei –80°C

aufbewahrt. Zur Gewinnung des DNA-Pellets wurde nach Zentrifugation bei 14.000 x

g das Sediment mittels SpeedVAC-Vakuumtrockner DNA 110 (Savant, USA)

vollständig von Äthanolresten befreit und in 30 µl TE-Puffer pH 8,0 (Rp. 9)

aufgenommen.

��'DUVWHOOXQJ�GHU�YLUDOHQ�'1$�PLWWHOV�$JDURVHJHOHOHNWURSKRUHVH�Das verwendete Verfahren der Agarosegelelektrophorese zur Darstellung der

Amplifikate entsprach dem Standardprotokoll nach Maniatis et al. (1982). Es wurde

unter Verwendung einer Minielektrophoresekammer (Serva, Heidelberg)

durchgeführt.

Zunächst wurde der benötigte TBE-Puffer als Stocklösung in einer Konzentration von

5x TBE (Rp. 7) zubereitet. Die Verdünnung erfolgte kurz vor seiner Verwendung.

Entsprechend der zu erwartenden Größe der Amplifikate und Restriktionsfragmente

(Angaben in base pairs, bp) wurde eine 2%ige Agarose für DNA-Zwecke (Serva),

aufgenommen in 1x TBE, verwendet. Diese wurde, in 35 ml-Portionen abgefüllt, als

Vorrat im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt. Die Zubereitung des Elektrophoresegels

erfolgte durch Verflüssigung der Agarose in einem Mikrowellengerät. Nach

Abkühlung auf ca. 50°C wurden zum späteren Sichtbarmachen der DNA unter UV-

Licht 2 µl Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml hinzugegeben

und das Gelbett mit Hilfe des zur Elektrophoresekammer gehörenden Gel-Gieß-Kits

blasenfrei zubereitet. Die Schichtdicke des Gels betrug 5 mm, die Gelfläche 65 x 10

mm. Zum Formieren der Probenreservoirs wurde ein Teflonkamm mit einer

Zahngrösse von 2 x 4 mm in das noch flüssige Gel eingehängt. Dieser sorgte für acht

bzw. zwölf Vertiefungen mit einem Fassungsvolumen bis zu 20 µl im Agarosegel. Vor

dem Beladen des Gels mit den DNA-Proben wurde das erstarrte Gel im Gelträger

41

aus der Gießvorrichtung herausgenommen und in die Elektrophoresekammer

umgesetzt. Es folgte die Zugabe von 1x TBE–Puffer bis ca. 3 mm über die

Geloberfläche.

Die zu analysierenden DNA-Proben wurden mit 6 x Ladepuffer (Rp. 8) im Verhältnis

von 1:6 versetzt und vorsichtig in die Gelvertiefungen pipettiert. Zur

Größenbestimmung der darzustellenden DNA-Fragmente dienten

Molekulargewichtsstandards in einer Konzentration von 250 µg/ml (Roche

Diagnostics), die bei jeder Elektrophorese mitgeführt wurden (Tab. 10).

Tab. 10: Eingesetzte Molekulargewichtsstandards

0HWKRGH� 0ROHNXODUJHZLFKWV�VWDQGDUG�

(QWKDOWHQH�'1$�)UDJPHQWH��ES��

ORF 38 und 54 (LaRussa

et al. 1992)

ORF 62 (Loparev et al.

2000)

V

(Roche Diagnostics)

64, 80, 89, 104, 124, 184,

192, 213, 234, 267, 434,

458, 504, 540, 587

ORF 38 (Mori et al. 1998) IX

(Roche Diagnostics)

72, 118, 194, 234, 271,

281, 310, 603, 872, 1078,

1353

Jeweils 5 µl des Molekulargewichtsstandards wurden mit 1 µl 6x Ladepuffer gemischt

und ebenfalls in die Gelvertiefungen pipettiert. Nach Schließen des Deckels der

Elektrophoresekammer wurde eine Spannung von 80 V Gleichstrom über 1 h

angelegt, wobei die Wanderung der DNA-Fragmente entsprechend ihrem

Molekulargewicht erfolgte. Anschließend wurden die DNA-Banden im Gel durch UV-

Licht mit einer Intensität von 9,4 mW pro cm² unter Verwendung eines

Transilluminators (HSI Hoefer Scientific Instruments, Atlanta, USA) sichtbar gemacht.

Diese Ergebnisse wurden mit einer Polaroid MP4-Kamera (Polaroid MP4+ Instant

42

Camera System, USA) fotografisch dokumentiert. In Auswertung der Befunde

erfolgte die Größenbestimmung der DNA-Amplifikate und -Fragmente im Vergleich

zu den DNA-Fragmenten des mitgelaufenen Molekulargewichtsstandards.

�� 6WDWLVWLVFKH�$QDO\VH�GHU�8QWHUVXFKXQJVHUJHEQLVVH�Die Ergebnisse der Methoden zur Genotypisierung des VZV wurden statistisch

mittels χ2-Test bei unabhängigen Variablen miteinander verglichen. Darüber hinaus

wurde die Sensitivität der eingesetzten Verfahren ermittelt. Diese wurde als Anteil der

Untersuchungsmaterialien definiert, der korrekt als positiv durch die jeweilige

Methode erkannt werden konnte.

�� 5H]HSWXUHQ�Rp. 1: Laktalbuminhydrolysat in HANKS-Lösung

Glucose 4,00

Laktalbuminhydrolysat 5,00

Hefeextrakt 0,10

L-Glutamin 0,20

NaHCO3 0,35

Salzlösung nach HANKS (Rp. 2) ad 2000,0 ml

Rp. 2: Salzlösung nach HANKS

NaCl 8,00

KCl 0,40

MgSO4 x 7 H2O 0,20

CaCl2 0,07

KH2PO4 0,06

Na2HPO4 x 12 H2O 0,06

NaHCO3 0,35

Glucose 1,00

Aqua dest. ad 1000,00 ml

43

Rp. 3: Trypsin in Phosphatpufferlösung

NaCl 8,00

KCl 0,20

Na2HPO4 x 12 H2O 2,90

Phenolrot 0,20

Trypsin (1:250) 1,00


Rp. 4: Chelaplex-Trypsin-Lösung

1 Teil 0,25%iges Trypsin in Phosphatpufferlösung

4 Teile 0,02%iges Chelaplex in Phosphatpufferlösung

Chelaplex in Phosphatpufferlösung (PBS)

NaCl 8,00

KCl 0,20

Na2HPO4 x 12H2O 2,90

KH2PO4 0,20

Chelaplex 0,20


Rp. 5: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

NaCl 8,00

KCl 0,20

Na2HPO4 x 12H2O 2,90

KH2PO4 0,20

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

Rp. 6: PCR-Puffer, 10-fach (pH 8,3)

KCl 500 mM

MgCl2 15 mM

Tris HCl 100 mM

44

Rp. 7: TBE-Puffer (5x)

Tris 54,0 g/l

Borsäure 27,5 g/l

EDTA 0,5M (pH 8,0) 20,0 ml

Rp. 8: Ladepuffer (6x)

Bromphenolblau 0,25%

Saccarose (in H2O) 40,0%

Andere Möglichkeit für Herstellung des Ladepuffers:

Bromphenolblau 10 mg

Xylencyanol 10 mg

Glycerin 5 ml

10mM EDTA 38,02 mg


Rp. 9: Tris-HCl EDTA (TE)-Lösung (pH 8,0)

1,0 M Tris-HCl 10,0 ml

0,5 M EDTA 0,2 ml

Aqua bidest. ad 1000,00 ml

45

�� (UJHEQLVVH�� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQH��XQG��Unter Anwendung von Primern für die Gene 38 und 54 (LaRussa et al. 1992)

enthielten die Amplifikate nach der Multiplex-PCR im positiven Falle

erwartungsgemäß zwei verschieden große DNA-Fragmente, die nach Auftrennung in

der Agarosegelelektrophorese eine Größe von 350 bp (ORF 54) und 222 bp (ORF

38) aufwiesen (Abb. 8).

QSRUTWVUXZY\[U]\^_Qa`_Q2QUQaR

Abb. 8: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese im Anschluss an die PCR

nach LaRussa et al. (1992) (Gene 38/54) mit Darstellung der

Amplifikate von zehn Untersuchungsmaterialien (Position 1 bis 10).

Position 11: VZV-Labor-Wildtyp-Stamm; Position 12: VZV-Impftyp-

Stamm. Nach der Elektrophorese sind stets zwei Banden mit einem

Molekulargewicht von 350 bp (ORF 54) und 222 bp (ORF 38) sichtbar.

Trennbedingungen: 2%ige Agarose; Laufzeit 1 h; 80 V

350 bp

222 bp

46

Bei den Ergebnissen zeigte sich, dass alle 53 angezüchteten VZV-Stämme in der

Multiplex-PCR auch als „VZV-positiv“ beurteilt werden konnten, d.h. es kamen in der

Agarosegelelektrophorese stets DNA-Fragmente mit einer Größe von 350 bp und

222 bp zur Darstellung. Im Vergleich dazu zeigte bei den 73 Patientenproben die

PCR in 60 Fällen (84,5%) ein positives, bei drei Proben (4,2%) ein schwach positives

und in zehn Fällen ein negatives Ergebnis (11,3%) (Tab. 11).

Tab. 11: Untersuchungsergebnisse von 53 VZV-Stämmen und 73

Patientenproben nach Durchführung der Multiplex-PCR zur

Amplifikation von DNA-Fragementen der ORF 38/54 nach LaRussa et

al. (1992)

�3&5�SRVLWLY�

��

3&5�VFKZDFK�SRVLWLY�

�

�3&5�QHJDWLY�

�8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��

Anzahl

%

Anzahl

%

Anzahl

%

VZV-Stämme (53)

��

��

��

��

��

��

Patientenproben (73)

��

��

��

��

��

��

Σ = 126

��

��

��

��

��

��

Beim anschließenden Restriktionsenzymverdau mit den Enzymen 3VWI� und� %JOI�ergaben sich die in Abb. 9 dargestellten Banden-Muster. Die Einordnung der

dazugehörigen Patienten-Abstrichproben und VZV-Stämme in Impf- und Wildtyp-

Stämme wurde nach der von LaRussa et al. (1992) beschriebenen Nomenklatur

vorgenommen. Bei VZV-Wildtyp-Stämmen wird prinzipiell das DNA-Fragment des

ORF 54 mit 350 bp durch 3VWI� in zwei Fragmente mit einer Größe von 250 bp und

100 bp zerschnitten. Im Gegensatz dazu besitzen VZV-Impftyp-Stämme keine

47

Schnittstelle für 3VWI im ORF 54. Bei VZV-Impftyp-Stämmen lässt sich das

amplifizierte DNA-Fragment des ORF 38 durch %JOI in zwei Fragmente zerteilen, die

eine Größe von 85 bp und 137 bp besitzen. VZV-Wildtyp-Stämme können diese

Schnittstelle aufweisen. Demzufolge lassen sich %JOI-positive und %JOI-negative

Wildtyp-Stämme unterscheiden.

1 2 3

�

Abb. 9: Beispiel des Restriktionsenzymverdaus mit 3VWI� und� %JOI von PCR-

Amplifikaten der ORF 38 und 54�� Nr. 1: Wildtyp-Stamm 3VWI b%JOI b ��Nr. 2: Wildtyp-Stamm 3VWI b %JOI c ��Nr. 3: Oka-Impftyp-Stamm 3VWI c ��%JOI b �

⇐ Start 9HUGDXXQJ�PLW�3VW,�� ⇐ Start 9HUGDXXQJ�PLW�%JO,�

3VW�, d��%JO, e�2ND�,PSIW\S��6WDPP��3VW�, e��%JO, d�:LOGW\S�6WDPP��3VW�, e�%JO, e�:LOGW\S�6WDPP

�

��ES� ��ES��ES� ��ES�

��ES� ��ES�

137 p

85 p

��ES�

��ES��ES�

��ES��ES�

��ES�

��ES��ES�

��ES��ES�

48

Die Auswertung aller 116 Untersuchungsmaterialien, bei denen ein positives

Ergebnis erzielt werden konnte, ergab die in Tabelle 12 aufgelisteten Resultate. Als

dominanter Genotyp wurde der Typ 3VWI b �%JOI c nachgewiesen (Abb. 10). Dieser VZV-

Genotyp lag in 108 (93,1%) von 116 Materialien vor. Dabei handelte es sich um 47

VZV-Stämme und um 61 Patientenproben. Der Genotyp 3VWI b �%JOI b (Abb. 10) bildete

mit sieben (6,0%) von 116 Untersuchungsmaterialien, fünf VZV-Stämmen und zwei

Patientenproben, die zweithäufigste Gruppe. Unter allen untersuchten Materialien

wurde nur in einem Fall (0,9%) ein Oka-Virus mit dem Genotyp 3VWI c �%JOI b gefunden

(Abb. 10). Es stammte aus der Gruppe der VZV-Stämme.

fhgjilkjmonjprqtsufavwf�fxfagufaiwfykzfymzfanwf{pwf{qwfas��

Abb. 10: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese nach Verdauung der PCR-

Amplifikate des ORF 54 mit 3VWI� (obere Bildhälfte) und� %JOI� (untere

Bildhälfte). Position 1-14: Genotyp 3VWI b %JOI c , Position 15-18: Genotyp

3VWI b %JOI b , Spur 19: Oka-Impftyp 3VWI c %JOl b

i2m�v�|%}g2m�v�|%}g�g2g�|%}

f{v2v�|%}

i2m�v�|%}

g�g2g�|%} f{i2p�|%}

q~m�|%}

9HUGDX�PLW�3VW,

9HUGDX�PLW�%JO,

49

Tab. 12: Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten der

VZV-Gene 38/54 bei 53 VZV-Stämmen und 63 Abstrichproben von

Patienten mit VZV-Infektionen

�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, � �

�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, � �

�9=9�*HQRW\S�3VW, � �%JO, �


Anzahl

%

Anzahl

%

Anzahl

%

VZV-Stämme (53)

��

��

��

��

��

��


��

��

��

��

��

��

Σ = 116

��

��

��

��

��

��

�� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQ��Unter Anwendung von Primern zur Amplifikation von Gensequenzen aus dem ORF

38 nach der Methode von Mori et al. (1998) wurde ein Amplifikat produziert, das nach

der elektrophoretischen Auftrennung im Agarosegel unabhängig vom VZV-Genotyp

eine Größe von 647 bp aufwies (Abb. 11).

50

��

1353

Abb. 11: Amplifikate nach der PCR mit Primern aus dem VZV-Gen 38.

Positionen 1-4: unverdaute PCR-Amplifikate mit einer Größe von 647

bp. Position 5: Molekulargewichtsstandard (MGS) IX (Roche).

Positionen 6-9: mit 3VWI�verdaute PCR-Amplifikate. 6-7: Entstehung von

DNA-Fragmenten mit einer Größe von 357 bp und 290 bp. 8-9: keine

Verdauung durch 3VWI Die Auswertung der Untersuchungen zeigte, dass bei allen 53 einbezogenen VZV-

Stämmen ein DNA-Fragment von 647 bp amplifiziert werden konnte. Dies war bei

den 73 Patientenproben in 71 Materialien (97,3%) der Fall (Tab. 13). Davon war die

PCR in 60 Proben (82,2%) deutlich positiv und in 11 (15,1%) schwach positiv. In zwei

Proben war nach der PCR kein Amplifikat nachweisbar (2,7%). Diese wurden als

negativ bewertet.

��ES�

��ES�

��ES�

0*6�,;��ES�

fai2m�ifav�p2qq2p�gn2v�i

i/f{vg2q�f�� g2p�fg2i~kfas~k

p2g

51


Patientenproben nach Durchführung der PCR zur Amplifikation eines

DNA-Fragements des ORF 38 entsprechend Mori et al. (1998)

3&5�SRVLWLY��


�

�3&5�QHJDWLY�


Anzahl

%

Anzahl

%

Anzahl

%

VZV-Stämme (53)

��

��

��

��

��

��


��

��

��

��

��

��

Σ = 126

��

��

��

��

��

��

� Als Ergebnis der Restriktionsenzymverdauung mittels 3VWI� wurde zwischen 3VWI-positiven und 3VWI-negativen VZV-Genotypen unterschieden (Abb. 11). Nach

erfolgreicher Verdauung mittels 3VWI konnten in der Agarosegelelektrophorese zwei

DNA-Fragmente mit einer Größe von 357 und 290 bp dargestellt werden. Die

Stämme, deren Amplifikate sich durch 3VWI nicht spalten ließen, wurden dem Oka-

Genotyp zugerechnet. Aus Tab. 14 ist ersichtlich, dass sich nur einer von 53 VZV-

Stämmen (1,9%) als Oka-Typ erwies, was den Ergebnissen unter 4.1. entsprach. Bei

den übrigen in die Untersuchungen einbezogenen 52 VZV-Stämmen (98,1%) sowie

bei allen 60 Patientenproben (100%) wurde der VZV-Genotyp 3VWI b nachgewiesen.

��

52

�Tab. 14:� Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten des

ORF 38 bei 53 VZV-Stämmen und 62 Abstrichproben von Patienten

mit VZV-Infektionen

�

*HQRW\S�3VW, � �

*HQRW\S�3VW, � ��2ND�7\S��

8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��

Anzahl

%

Anzahl

%

�VZV-Stämme (53)

��

��

��

��

�Patientenproben (62)

��

��

��

��

Σ = 115

��

��

��

��

�� 9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�*HQ��Unter Anwendung der PCR zur Amplifikation eines DNA-Fragmentes aus dem VZV-

Gen 62 in Anlehnung an die Methode von Loparev et al. (2000) wurden nach

Untersuchung aller 53 VZV-Stämme positive Ergebnisse nachgewiesen. Dabei

erfolgte stets mittels Agarosegelelektrophorese die Darstellung eines Amplifikats, das

die Größe von 268 bp aufwies (Tab. 15). Bei zwei der 53 Virusstämme (4%)

erbrachte die PCR jedoch nur ein schwach positives Ergebnis. Im Vergleich dazu

waren von den 73 Patientenproben 59 (80,8%) positiv. Davon zeigten sieben

Patientenproben (9,6%) schwach positive Resultate. 14 Proben (19,2%) waren in der

PCR negativ und konnten deshalb durch Restriktionsenzymanalyse nicht weiter

untersucht werden.

�

53


Patientenproben nach Durchführung der PCR zur Amplifikation eines

DNA-Fragements des ORF 62 entsprechend Loparev et al. (2000)

�3&5�SRVLWLY�

��


�

�3&5�QHJDWLY�


Anzahl

%

Anzahl

%

Anzahl

%

VZV-Stämme (53)

��

��

��

��

��

��


��

��

��

��

��

��

Σ = 126

��

��

��

��

��

��

Bei der sich anschließenden Restriktionsenzymanalyse mit 6PDI zeigte nach

Agarosegelelektrophorese der häufigste Genotyp drei charakteristische DNA-

Banden, die einem Molekulargewicht von 153 bp, 79 bp und 36 bp entsprachen

(Abb. 12). Dies war mit dem Bandenmuster des VZV-Wildtyps vergleichbar,

unabhängig davon, ob es sich dabei um Wildtyp-Stämme aus Europa oder

Nordamerika oder um Oka-ähnliche Wildtyp-Stämme aus Japan handelte. Der VZV-

Wildtyp war bei 52 der 53 (98,1%) untersuchten VZV-Stämmen zu finden (Tab. 16).

Bei einem VZV-Stamm handelte es sich um den Oka-Impftyp-Stamm, bei dem nach

Enzymverdau die vier DNA-Banden 112 bp, 79 bp, 41 bp und 36 bp dargestellt

werden konnten. Dabei waren die DNA-Fragmente mit einer Größe von 41 bp und 36

bp meist nicht getrennt nachweisbar (s. auch Abb. 12), was jedoch auf die

Ergebnisauswertung keinen Einfluss hatte. In allen 59 Patientenproben, die in der

PCR positiv waren, konnte der VZV-Wildtyp nachgewiesen werden (Tab. 16).

54

Tab. 16: Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse von PCR-Amplifikaten des

ORF 62 bei 53 VZV-Stämmen und 59 Abstrichproben von Patienten

mit VZV-Infektionen

��

9=9�:LOGW\S

�2ND�,PSIW\S�

8QWHUVXFKXQJV�PDWHULDOLHQ��Q��

Anzahl

%

Anzahl

%

VZV-Stämme (53)

��

��

��

��


��

��

��

��

Σ = 112

��

��

��

��

��

55

��

� ��

Abb. 12: Beispiel einer Agarosegelelektrophorese nach PCR-Amplifikation von

DNA-Sequenzen des ORF 62. Positionen 1-3: Amplifikate mit 268 bp,

Position 4: Molekulargewichtsstandard (MGS) V (Roche). Positionen 5-

10: Restriktionsenzymanalyse mit 6PDI. 5-6, 9-10: Oka-Impftyp. 7-8:

VZV-Wildtyp.

��ES�

��ES��ES�

��ES��ES�

��ES�

0*6�9��ES��

56

�� =XVDPPHQIDVVXQJ� XQG� 9HUJOHLFK� GHU� (UJHEQLVVH� ]XU� *HQRW\SLVLHUXQJ�� GHV�9DULFHOOD�=RVWHU�9LUXV�Alle VZV-Stämme konnten mittels PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten der

ORF 38, 54 und 62 sowie anhand der sich anschließenden

Restriktionsenzymanalyse genotypisiert werden. Die direkte Genotypisierung von

viraler DNA in den Abstrichmaterialien der Patientenstämme war anhand von

Sequenzen der Gene 38/54 in 63 von 73 DNA-Proben (86,3%) erfolgreich (Tab. 17).

Unter Anwendung anderer Primer des Gens 38 wurden bei 62 von 73

Patientenproben (84,9%) positive Ergebnisse erzielt. Die PCR zur Amplifikation von

Fragmenten des ORF 62 einschließlich Restriktionsenzymanalyse war in 59 der 73

Proben positiv (80,8%). Prinzipiell war nach erfolgreicher Amplifikation, unabhängig

davon, ob es sich um ein deutlich positives oder schwach positives Ergebnis

handelte, stets eine erfolgreiche Analyse der DNA-Fragmente durch

Restriktionsenzyme möglich.

Der Ergebnisvergleich aller Untersuchungsmaterialien, d.h. der VZV-Stämme und

Patientenproben, zeigte, dass es unter Verwendung des ORF 62 wesentlich mehr

schwach positive sowie negative Ergebnisse gab, als dies bei den ORF 38 und 54

der Fall war. Die Anzahl der schwach positiven Resultate in der PCR betrug unter

Einbeziehung aller Materialien beim ORF 62 7,1%, beim ORF 38 1,6% und bei der

Multiplex-PCR zur Amplifikation von Sequenzen der ORF 38/54 2,4% (Tab. 17). Die

meisten negativen Ergebnisse waren beim ORF 62 mit 11,1% der Patientenproben

zu verzeichnen, während beim ORF 38 zu 8,7% und beim ORF 38/54 zu 7,9%

negative Ergebnisse zu finden waren. Sowohl die Unterschiede bezüglich schwach

positiver Resultate als auch die Differenzen hinsichtlich positiver und negativer

Ergebnisse aller drei Methoden waren statistisch nicht signifikant und damit relativ

gering.

Für die Multiplex-PCR zum Nachweis von DNA-Sequenzen der ORF 38/54 wurde mit

92,1% die höchste Sensitivität ermittelt, gefolgt von der Methode zur Amplifikation

des ORF 38 mit 91,3%. Das Verfahren zur Darstellung von DNA-Sequenzen des

ORF 62 wies mit 88,8% die niedrigste Sensitivität auf (Tab. 17).

57

Tab. 17: Vergleich der Ergebnisse zur Genotypisierung von 53 VZV-Stämmen

und 73 Abstrichmaterialien von Patienten mit VZV-Infektionen nach

PCR und Restriktionsenzymanalyse der ORF 38, 54 und 62

�25)��XQG��

��

�25)��

�25)��


Anzahl

%

Anzahl

%

Anzahl

%

�9=9�6WlPPH��Positiv Schwach positiv Negativ �

53

0

0

100

0

0

53 0 0

100 0 0

51 2 0

96,2

3,8 0

�3DWLHQWHQSUREHQ��Positiv Schwach positiv Negativ�

60

3

10

82,2

4,1

13,7

60 2

11

82,2

2,7

15,1

52 7

14

71,2

9,6

19,2

�6��Positiv Schwach positiv Negativ �

��

113

3

10�

��

��

��

��

��

113 2

11�

��

��

��

��

��

103 9

14�

��

��

��

��6HQVLWLYLWlW��

��

��

��

��

58

�� (UJHEQLVVH�GHU�*HQRW\SLVLHUXQJ�LQ�%H]XJ�]XU�NOLQLVFKHQ��'LDJQRVH�XQG�� GHP�$OWHU�GHU�3DWLHQWHQ�Die dominierende Erkrankung in dieser Studie war der Zoster bei 101 von 116

einbezogenen Patienten, was einem Anteil vom 87,1% entspricht (Tab. 18). Das

Durchschnittsalter dieser Patienten lag bei 47 Jahren. Von den VZV-Stämmen

wurden 44 und von den Patientenproben 57 der klinischen Diagnose Zoster

zugeordnet. 98 dieser Erkrankungen wurden durch Wildtyp-VZV mit dem Genotyp

3VWI b %JOI c � (97%), zwei durch Wildtyp-VZV 3VWI b %JOI b (2,0%) und ein Fall durch den

Oka-Impftyp 3VWI c �%JOI b �(1,0%) verursacht.

Die klinische Diagnose bei den restlichen 15 Patienten (22,9%) lautete Windpocken,

wobei neun VZV-Stämme und sechs Proben von Patienten mit Windpocken

stammten. Das durchschnittliche Alter dieser Patienten betrug neun Jahre.

Dominanter Genotyp war bei den Patienten mit Varizellen in zehn Fällen ebenfalls

der Wildtyp 3VWI b �%JOI c (66,7%). Bei insgesamt fünf Patienten kam der��Wildtyp 3VWI b%JOI b (33,3%) vor. Der Oka-Impftyp 3VWI c %JOI b wurde bei keinem Patienten mit

Windpocken beobachtet.

Berücksichtigt man alle einbezogenen Patienten, so wurde der VZV-Wildtyp 3VWI b%JOI c �bei 93,1% mit einem Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. Bei 6%

der Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 14 Jahren war der Wildtyp %JOI b �3VWI b vorhanden und ein Patient war im Alter von zwei Jahren an einem Zoster durch

den Oka-Impftyp 3VWI c �%JOI b � erkrankt.

Die Genotypen der als Kontrollen mitgeführten VZV-Prototypstämme sind in der

Tabelle 19 zusammengefasst.

59

Tab. 18: Genotypisierung der viralen DNA von 53 VZV-Stämmen und 63

Proben von Patienten mit VZV-Infektion in Abhängigkeit von der

klinischen Diagnose und dem Alter

�:LOG�7\S�3VW, � �%JO, �

�:LOG�7\S�3VW, � %JO, � �

�,PSI�7\S�3VW,� � �%JO, � �


�'XUFKVFKQLWWV��

DOWHU�GHU�3DWLHQWHQ�

� �n

%

n

%

N

%

�9=9�6WlPPH��Varizellen (9) Zoster (44)

11

53

47 4

43

88,7

44,4

97,7

5 5 0

9,4

55,5

97,7

1 0 1

1,9

0

2,3

3DWLHQWHQSUREHQ�� Varizellen (6) Zoster (57)

7

38

61 6

55

96,8

100

96,5

2 0 2

3,2

0

3,5

0 0 0

0 0 0

�6��Varizellen (15) 22,9% Zoster (101) 87,1%

9

47

108

10

98

��

��

��

7 5 2

��

��

��

1 0 1

��

��

60

Tab. 19: Genotypen der als Kontrollen mitgeführten VZV-Prototypstämme

�9=9�3URWRW\SVWDPP�

�*HQRW\S�

VZV Wildtyp-Stamm YS-R, TK-

Wildtyp 3VWI b �%JOI c

VZV Impftyp-Stamm Oka ATCC VR-795

Impftyp 3VWI c �%JOI b

VZV Impftyp-Stamm Oka 07-1


VZV Impftyp-Stamm Oka, Varilrix 1991


VZV Impftyp-Stamm Oka I, Varilrix 1995


VZV Impftyp-Stamm Oka II, Varilrix

1999


61

�� 'LVNXVVLRQ�Mit der Einführung der allgemeinen Varizellenimpfung macht sich eine

epidemiologische Surveillance zirkulierender VZV-Stämme erforderlich. Wesentliche

Gründe dafür sind, dass das Impfvirus auch in der Lage ist, einen Zoster auszulösen

(Gershon et al. 2001) und in seltenen Fällen von Geimpften auf empfängliche

Personen übertragen werden kann (Tsolia et al. 1990). Darüber hinaus muss bei

Varizellen oder Zoster nach Impfung eine Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV

erfolgen. Da eine zuverlässige Differenzierung von Wild- und Impftyp-Viren nur

mittels Genotypisierung möglich ist, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit,

Methoden zur Charakterisierung des VZV-Genotyps zu etablieren und sie hinsichtlich

ihres Einsatzes in der virologischen Routinediagnostik zu testen. Aufgrund der

Tatsache, dass in der Literatur bislang keine Daten zur molekularen Epidemiologie

des VZV in Deutschland existieren, sollten erstmals grundlegende Erkenntnisse über

die Verteilung verschiedener Genomtypen des VZV in Thüringen gewonnen werden.

Dazu war die Einbeziehung einer repräsentativen Anzahl an VZV-Isolaten und

Untersuchungsmaterialien von Patienten mit Windpocken oder Zoster notwendig.

In den vorliegenden Untersuchungen wurden 53 VZV-Isolate und 73 Proben von

Patienten mit VZV-Infektionen hinsichtlich genetischer Marker der ORF 38, 54 und 62

unter Einbeziehung der PCR sowie der Restriktionsenzymanalyse untersucht. Alle

geprüften Virusisolate waren zuvor unter Verwendung monoklonaler Antikörper

gegen das virale Glykoprotein I zweifelsfrei als VZV-Stämme identifiziert worden

(Sauerbrei et al. 1999). In allen Patientenproben, bei denen es sich meistens um

Bläscheninhalt von Hauteffloreszenzen handelte, konnte im Vorfeld der

Untersuchungen mittels PCR unter Einbeziehung von Primern der ORF 4, 28 und 29

(Sauerbrei et al. 1999) der Nachweis von VZV-DNA geführt werden. Wie die

Ergebnisse der Experimente belegen, wurden alle 53 VZV-Isolate genetisch typisiert.

Mittels direkter Genotypisierung der viralen DNA in den Patientenproben wurden 63

der 73 Materialien (86,3%) charakterisiert, wenn Primer der ORF 38 und 54

eingesetzt wurden. Im Vergleich dazu erbrachte die PCR zur Amplifikation des Gens

62 in 59 Fällen (80,8%) positive Ergebnisse, die sich mittels nachfolgender

Verdauung durch Endonukleasen weiter spezifizieren ließen. Diese Ergebnisse

belegen eine reduzierte Sensitivität der Methoden zur Genotypisierung im Vergleich

zur hochsensitiven diagnostischen PCR. Die Ursache dafür kann in der Amplifikation

differenter DNA-Fragmente des VZV-Genoms gesehen werden. Ergebnisse aus der

62

Literatur unter Einbeziehung von DNA-Oligonukleotiden der ORF 4, 13, 28, 29, 36,

62, 63 und 68 belegen eine unterschiedliche Sensitivität von PCR-Methoden zum

Nachweis von VZV-DNA (Dlugosch et al. 1991, Kido et al. 1991, Sauerbrei et al.

1999).

Die zur Genotypisierung eingesetzten PCR-Methoden zeigten in den eigenen

Untersuchungen auch Unterschiede bezüglich ihrer Sensitivität, wobei die Multiplex-

PCR zur Amplifikation von DNA-Fragmenten der Gene 38/54 die höchste

Empfindlichkeit aufwies. Insgesamt waren die Sensitivitätsunterschiede jedoch

statistisch nicht signifikant und damit relativ gering. Um die Frage beantworten zu

können, welche Methode eine zuverlässige routinemäßige Genotypisierung des VZV

einschließlich Unterscheidung von Wild- und Impftyp-Viren gestattet, ist es

notwendig, Vor- und Nachteile der eingesetzten Verfahren zu analysieren (Tab. 20).

Zunächst bleibt festzustellen, dass alle Methoden Erfahrungen bei der Durchführung

molekularbiologischer Untersuchungen sowie einen relativ hohen apparativen

Aufwand erfordern. Diese Voraussetzungen sind meist nur an virologischen

Speziallaboratorien gegeben. Von allen eingesetzten Verfahren gestattet nur die

Analyse des ORF 62 (Loparev et al. 2000) eine universelle Unterscheidung von VZV-

Wild- und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss japanischer Oka-ähnlicher

Wildtyp-Isolate. Die beiden anderen Methoden zur gemeinsamen Charakterisierung

der ORF 38/54 (LaRussa et al. 1992) bzw. nur zur Analyse des ORF 38 (Mori et al.

1998) erlauben eine Unterscheidung von europäischen und nordamerikanischen

Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild- oder Impftyp-Stämmen. Da Oka-ähnliche

Wildtyp-Stämme in Europa und Nordamerika mit Ausnahme japanischer Kommunen

nicht vorkommen, wurden in Großbritannien und in den USA bislang meist nur die

ORF 38/54 in entsprechenden Untersuchungen charakterisiert (Hawrami und Breuer

1997, Gershon et al. 1999). Die gemeinsame Charakterisierung der ORF 38/54 hat

den Vorteil, den %JOI-Polymorphismus des Gens 54 mit in die Untersuchungen

einzubeziehen. Die alleinige Analyse des ORF 38 entsprechend der Methode nach

Mori et al. (1998) bringt im Vergleich dazu keinen Erkenntnisgewinn, so dass auf sie

verzichtet werden kann. Für Genotypisierungsversuche in Deutschland sollte in der

Regel die Einbeziehung des Verfahrens nach LaRussa et al. (1992) ausreichen.

Beim Nachweis 3VWI-negativer Stämme ist jedoch für eine zweifelsfreie Abgrenzung

des Oka-Impfstammes die Analyse des ORF 62 in Anlehnung an die von Loparev et

al. (2000) beschriebene Methode notwendig.

63

Tab. 20: Vor- und Nachteile der eingesetzten Methoden zur Genotypisierung des

VZV

�0HWKRGH�

�9RUWHLOH�

��

1DFKWHLOH��

$QDO\VH�25)��/D5XVVD�HW�DO��

�

Unterscheidung der Oka-Impfstämme und Oka-ähnlichen Stämme von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Stämmen Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54 Höchste Sensitivität in der vorliegenden Studie

Keine universelle Genotypisierung unter Einschluss japanischer Wildtypstämme

�$QDO\VH�25)��0RUL�HW�DO��

�

Keine Vorteile im Vergleich zur Analyse ORF 38/54

Keine universelle Genotypisierung unter Einschluss japanischer Wildtypstämme Keine Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54

�$QDO\VH�25)��

�/RSDUHY�HW�DO��

Universelle Unterscheidung von VZV-Wild- und Impftyp-Stämmen unter Einschluss japanischer Wildtypstämme

Keine Unterscheidung der Oka-Impfstämme und Oka-ähnlichen Stämme von europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Stämmen Keine Charakterisierung des %JOI-Polymorphismus des ORF 54 Niedrigste Sensitivität in der vorliegenden Studie

64

Aus den vorliegenden Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die

Genotypisierung von VZV-Isolaten als Methode der Wahl anzusehen ist. Die

Verwendung von Virus-Isolaten ist auch deshalb von Vorteil, weil eine große Menge

an viraler DNA für die Untersuchungen bereitgestellt werden kann. Dies ermöglicht

auch eventuelle Sequenzierungsexperimente zum detaillierten Nachweis

genomischer Veränderungen. Allerdings sollte in zusätzlichen Untersuchungen

abgesichert werden, ob sich die zu analysierenden viralen Genomabschnitte auch

stabil verhalten, wenn das Virus über mehrere Zellkulturpassagen geführt wird. Des

weiteren ist bei der Virusanzucht in Zellkulturen zu berücksichtigen, dass die

Viruskultur wenig sensitiv und sehr zeitaufwendig ist sowie ein hohes Maß an

Erfahrung von Seiten des Untersuchers erfordert (Dlugosch et al. 1991, Coffin und

Hodinka 1995, Sauerbrei et al. 2002). Unter optimalen Abnahme-, Transport- und

Kulturbedingungen lässt sich die Sensitivität der Virusanzüchtung jedoch verbessern.

Eine große Bedeutung kommt dabei einer sorgfältigen und frühzeitigen Gewinnung

von Bläschenabstrichen zu. Trotz geringerer Erfolgschancen im Vergleich zur

Genotypisierung von Virusisolaten sollte eine direkte Genotypisierung in

Patientenproben versucht werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn das

Ergebnis schnell verfügbar sein soll oder kein geeignetes Untersuchungsmaterial wie

z.B. Bläscheninhalt für die Virusisolierung in Zellkulturen zur Verfügung steht. Wie die

eigenen Untersuchungen gezeigt haben, ist bei zweifelhaften Ergebnissen eine

Versuchswiederholung meist nicht möglich, da die präparierte DNA-Ausbeute aus

den Patientenproben relativ gering ist.

Die vorliegenden Ergebnisse belegen weiterhin, dass alle typisierten DNA-

Materialien bis auf eine Ausnahme eine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 aufwiesen. Dies

entspricht den bereits publizierten Ergebnissen in den USA und Großbritannien

(Hawrami und Breuer 1997, Gershon et al. 1999). Der dominante Genotyp besaß die

Wildtyp-Marker 3VWI+ %JOI¯ . Er wurde bei 93,1% aller Patienten mit einem

Durchschnittsalter von 47 Jahren nachgewiesen. 90,7% dieser Patienten hatten

einen Zoster, und 9,3% waren an Varizellen erkrankt. Bei 6% aller Patienten mit

einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen.

Fünf dieser Patienten entwickelten Varizellen und zwei erkrankten an einem Zoster.

Bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI¯ %JOI+ gefunden. Es handelte sich

dabei um ein Kind, das 16 Monate nach Varizellenimpfung einen Zoster entwickelte

(Uebe et al. 2002).

65

Im Ergebnis der Untersuchungen ließen sich alle Wildtyp-Stämme durch eine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 vom Oka-Impfstamm unterscheiden, der diese Schnittstelle

nicht aufweist. Im Gegensatz dazu besitzen Wildtyp-Stämme, die in Japan

zirkulieren, zu 20 bis 30% keine 3VWI-Schnittstelle im Gen 38 und sind damit von

Oka-Impftyp-Stämmen bezüglich dieses Markers nicht zu unterscheiden. Für 3%

aller Wildtyp-Stämme wurden im Vergleich zum VZV-Stamm Oka identische

polymorphe Marker nachgewiesen (Takada et al. 1995). Aus diesem Grunde erlaubt

die Beurteilung des 3VWI-Polymorphismus im Gen 38 nur außerhalb Japans oder

japanischer Kommunen eine zuverlässige Unterscheidung von Oka-ähnlichen

Stämmen und Wildtyp-Isolaten. In den vergangenen Jahren gelang es der

japanischen Arbeitsgruppe um Gomi (Gomi et al. 2001), zahlreiche Mutationen bei

Oka-Impfstämmen im Vergleich zu Oka-ähnlichen und –nichtähnlichen Wildtyp-

Stämmen im ORF 62 nachzuweisen. Aufgrund dieser Veränderungen im IE-Gen des

VZV ist es möglich, Oka-Impfstämme von allen in und außerhalb Japans

zirkulierenden Wildtyp-Stämmen mittels Charakterisierung des ORF 62 zu

unterscheiden. Ein Verfahren, das auf der Amplifikation eines 268 bp großen DNA-

Fragmentes des ORF 62 mit nachfolgender Restriktionsenzymanalyse beruht

(Loparev et al. 2000), wurde auch im Rahmen dieser Arbeit etabliert und an allen

einbezogenen VZV-Stämmen und VZV-DNA-positiven Patientenproben getestet. Wie

die eigenen Ergebnisse und Befunde aus der Literatur belegen, gelingt durch die

Verdauung des PCR-Amplifikates mit der Endonuklease 6PDI eine universelle

Differenzierung des Oka-Impfvirus von Wildtyp-Stämmen, die sowohl in Europa und

Nordamerika als auch in Japan zirkulieren (Loparev et al. 2000).

Wird das ORF 54 ebenfalls in die Untersuchungen einbezogen, so können Wildtyp-

Stämme aufgrund eines unterschiedlichen Restriktionsenzymmusters nach Spaltung

mit %JOI in %JOI+- und %JOI -̄Stämme unterteilt werden (Hawrami und Breuer 1997,

Gershon et al. 1999). Wild-Stämme des %JOI+-Genotyps ließen sich im Rahmen der

eigenen Untersuchungen nur mit einem Anteil von 6% nachweisen. Dieser Anteil

könnte auch als repräsentativ für Thüringen bzw. für Deutschland angesehen

werden, wobei in weiterführenden Untersuchungen eine Absicherung dieser Befunde

an einer größeren Anzahl von Patientenproben mit unterschiedlicher regionaler

Verteilung angestrebt werden sollte. Im Vergleich zu diesen Ergebnissen wurden in

den USA und in Großbritannien bei ca. 20% aller Wildtyp-Stämme eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 gefunden (Hawrami und Breuer 1997, Gershon et al. 1999).

66

Eine stetige Zunahme der Prävalenz von %JOI+-Stämmen zeigte sich in den

vergangenen Jahren in Großbritannien. Diese genetische Variante des VZV wurde

vor allem bei Personen mit Zoster nachgewiesen, die aus tropischen Ländern Asiens,

Afrikas und der Karibik eingewandert waren (Hawrami et al. 1997). In diesen

Ländern, die auch als Niedrig-Prävalenz-Gebiete bezeichnet werden, besteht im

Unterschied zu Europa und Nordamerika eine relativ geringe VZV-Durchseuchung im

Erwachsenenalter. Bis zu 50% der jungen Erwachsenen haben noch keine VZV-

Primärinfektion durchgemacht und sind für das Virus empfänglich (Garnett et al.

1993). Diese spät einsetzende Durchseuchung wird damit erklärt, dass die

Übertragung des VZV im feuchten und heißen Klima weniger effektiv erfolgt als in

gemäßigten Klimazonen. %JOI+-Stämme wurden in Großbritannien aber auch

zunehmend bei Kindern mit Varizellen nachgewiesen, was für eine vermehrte

Zirkulation dieser genetischen Variante spricht. Insgesamt führten diese Befunde zur

Annahme, dass %JOI+-VZV-Wildtyp-Stämme aus tropischen Ländern eingeschleppt

werden und nicht das Ergebnis von Stamm-Mutationen sind.

Aus den in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnissen sowie den in der Literatur

dokumentierten Befunden kann die Schlussfolgerung abgeleitet werden, dass

Wildtyp-Stämme mit einer %JOI-Schnittstelle im Gen 54 in Deutschland bedeutend

seltener vorkommen als in den USA und Großbritannien. Dies könnte auf einen

wesentlich geringeren Anteil an Einwanderern aus Ländern mit geringer

Antikörperprävalenz im Erwachsenenalter zurückzuführen sein.

Überraschenderweise hatten jedoch fünf der sieben Patienten mit %JOI-positiven

Stämmen Varizellen und nur bei zwei dieser Patienten wurde ein Zoster

diagnostiziert. Das Durchschnittsalter der Patienten mit %JOI+-Stämmen war mit 14

Jahren auch bedeutend niedriger als das der Patienten mit %JOI -̄Stämmen, die im

Durchschnitt 47 Jahre alt waren. Der gehäufte Nachweis von %JOI+-Stämmen bei

Varizellen könnte darauf hindeuten, dass dieser Genotyp des VZV in Zukunft auch

vermehrt in Deutschland auftreten wird. Für eine zweifelsfreie Absicherung dieser

Befunde wäre jedoch die Untersuchung einer größeren Anzahl von Patienten mit

Varizellen notwendig. Bis heute ist nicht bekannt, ob der %JOI-Polymorphismus von

VZV-Stämmen auch mit Differenzen hinsichtlich der Pathogenese und Virulenz

verbunden ist.

Bei Oka-Impfstämmen lässt sich im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen, die nur teilweise

%JOI+ sind, prinzipiell immer eine %JOI-Schnittstelle im ORF 54 nachweisen. Aufgrund

67

dieser Befunde stellt sich die Frage, ob Wildtyp-Stämme diese Mutation von Impftyp-

Stämmen durch genetische Rekombination erworben haben, wie dies beispielsweise

von den Influenza A-Viren bekannt ist. Da der %JOI-Polymorphismus des ORF 54 in

klinischen Isolaten jedoch bereits vor der Einführung der Varizellen-Schutzimpfung

nachgewiesen werden konnte, geht man davon aus, dass diese genetischen

Veränderungen höchstwahrscheinlich als Ergebnis einer Basenpaar-Mutation

entstanden sind (LaRussa et al. 1992). Sie haben ihre Ursache deshalb vermutlich

nicht in genetischen Rekombinationen zwischen dem Oka-Impftyp- und Wildtyp-VZV,

obwohl ein Austausch von Genen zwischen unterschiedlichen VZV-Stämmen sowohl

LQ� YLWUR (Dohner et al. 1988) als auch LQ� YLYR (Shiraki et al. 1991) belegt werden

konnte.

In der Literatur werden weitere Genmarker des VZV für eine mögliche

Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV beschrieben. Dazu gehören vor allem

Regionen des VZV-Genoms wie die R2 und R5 repeat regions, die eine

unterschiedliche Anzahl sich wiederholender DNA-Fragmente enthalten (Takada et

al. 1995). Am besten untersucht ist bislang die R5 repeat region, die zwischen den

ORF 60 und 61 des VZV-Genoms lokalisiert ist (Abb. 13). Entsprechend dem

Vorkommen von sich wiederholenden DNA-Fragmenten mit einer Größe von 24 bp

und 88 bp können die VZV-Allele R5A, R5B und R5C unterschieden werden.

Bisherige Daten sprechen dafür, dass die R5-Region von Oka-Stämmen polymorph

sein kann und deshalb nicht für eine molekulare Charakterisierung von Oka-

Impfstämmen geeignet ist (Sauerbrei et al. 2003a). Prinzipiell haben Oka-

Impfstämme, die aus Japan stammen, zwei sich wiederholende R5-Einheiten, was

als R5B-Allele bezeichnet wird (Yoshida und Tamura 1999). In Übereinstimmung

damit lassen sich 75% aller Wildtyp-Stämme in Japan der R5B-Allele zuordnen

(Takada et al. 1995). Bei Oka-Impfstämmen, die außerhalb Japans produziert

wurden, kann nur eine R5-Einheit existieren, was der R5A-Allele entspricht (Hawrami

und Breuer 1997). Da sich die R5 repeat region auch nach zahlreichen

Zellkulturpassagen stabil verhalten soll (Hondo und Yogo 1988), sind die Gründe für

die Variabilität der R5-Region von Oka-Impfstämmen bislang unbekannt.

68

Abb. 13: Struktur der R5 repeat region, nach Yoshida und Tamura (1999)

Nur ein Virusisolat wurde im Rahmen dieser Arbeit als VZV-Oka-Impfstamm

charakterisiert. Diese Ergebnisse belegen, dass das Oka-Impfvirus in Deutschland

bislang sehr selten bei Personen nachweisbar ist. Dies ist auch nicht verwunderlich,

da die Varizellenimpfung in den vergangenen Jahren nur in relativ wenigen Fällen

durchgeführt wurde. Der nachgewiesene Oka-Virusstamm war von einem 2-jährigen

Kind mit Zoster isoliert worden, der 16 Monate nach der Varizellenimpfung

aufgetreten war. Mit hoher Wahrscheinlichkeit handelt es sich um das weltweit

bislang erste Virusisolat von einem Zoster nach Impfung. Insgesamt wurde das Oka-

Impfvirus bis heute nur bei wenigen Kindern mit Zoster nachgewiesen (Liang et al.

1998, Brunell und Argaw 2000, Sharrar et al. 2000). In einer 2001 veröffentlichten

Studie zur Bewertung des Varizellenimpfstoffes durch Merck Research Laboratories

(USA) wurde über 205 Zoster-Fälle pro 16,1 Millionen Impfungen (1,3/100.000) mit

dem Impfstoff Varivax berichtet (Sharrar et al. 2000). Davon traten 143

Erkrankungen bei Kindern unter fünf Jahren auf, was einem Anteil von 77%

entspricht. In den Untersuchungsmaterialien, die für eine Genotypisierung des

Erregers zur Verfügung standen, wurde in 22 Fällen der Oka-Impfstamm und in zehn

Fällen das Wildtyp-VZV nachgewiesen (LaRussa et al. 2000). Diese Ergebnisse

zeigen, dass ein Zoster bei geimpften Kindern selten auftritt. Zur zweifelsfreien

Unterscheidung eines Zosters durch Wild- oder Impftyp-Viren ist jedoch eine

virologische Diagnostik einschließlich Genotypisierung zu fordern.

69

In dem beobachteten Fall trat die Zoster-Erkrankung bei einer 27 Monate alten

Patientin im Bereich des rechten Unterarms und Handrückens auf (Abb. 14) (Uebe et

al., 2002). Das Kind wurde im Alter von 11 Monaten mit dem Impfstoff Varilrix

(GlaxoSmithKline) gegen Varizellen geimpft. Die Impfung erfolgte nicht in

Übereinstimmung mit den zu dieser Zeit geltenden Impfempfehlungen der STIKO

(STIKO 2001) als Postexpositionsprophylaxe zwei Tage nachdem die Schwester an

Varizellen erkrankt war. Bei dem geimpften Kind bestanden keine Hinweise auf eine

angeborene oder erworbene Immundefizienz. Unter intravenöser antiviraler Therapie

mit Aciclovir in einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht dreimal täglich über 7

Tage heilte der Zoster innerhalb von zwei Wochen komplikationslos ab. Serologische

Untersuchungen ergaben die für einen Zoster „typische Antikörperkonstellation“, d.h.

den Nachweis von VZV-spezifischen IgA-Antikörpern in hohen Titern (Sauerbrei et al.

2002). Während spezifische IgM-Antikörper mittels ELISA (Virion/Serion, Würzburg)

nicht nachweisbar waren, konnte innerhalb von 14 Tagen nach Krankheitsbeginn ein

signifikanter Anstieg der spezifischen IgG-Antikörper belegt werden. Auch dies sind

oft zu findende serologische Befunde bei Zoster. Aus dem Bläscheninhalt, gewonnen

am 4. und 7. Tag der Erkrankung, gelang sowohl der VZV-DNA-Nachweis mittels

PCR als auch die Virusanzüchtung in primären humanen Strumazellen (Sauerbrei et

al. 2003b).

Abb. 14: Typisches klinisches Bild eines Zoster am rechten Arm und der Hand

(C6 – C8) 4 Tage nach Krankheitsausbruch, Quelle: Uebe et al. 2002

70

Das Virusisolat wies im Gegensatz zum in Deutschland vorkommenden Wildtyp-VZV

keine Schnittstelle für 3VWI im ORF 38 auf. Im ORF 54 war eine Schnittstelle für %JOI vorhanden. Beide Befunde zusammen sprechen für einen Oka-Stamm. Durch die

Amplifikation des ORF 62 und anschließende Verdauung mit 6PDI entsprechend der

Methode von Loparev et al. (2000) konnte zweifelsfrei belegt werden, dass es sich

bei dem Zoster-Isolat um ein Oka-Impfvirus handelte.

Über die Ursachen, warum das attenuierte Oka-Impfvirus in seltenen Fällen in der

Lage ist, einen Zoster auszulösen, ist bis heute wenig bekannt. In der Literatur wurde

postuliert, dass das Zoster-Risiko erhöht ist, wenn nach Impfung ein Befall der Haut

entweder als impfbegleitender Rash oder in Form milder Varizellen auftritt (Hardy et

al. 1991). Anlass dafür waren Beobachtungen, dass Impflinge, bei denen ein

Impfexanthem aufgetreten war, häufiger einen Zoster bekamen als diejenigen ohne

Hauterscheinungen. Durch eine Beteiligung der Haut soll das Impfvirus in der Lage

sein, die proximalen Nervenenden zu erreichen und eine Viruslatenz zu etablieren.

Im beschriebenen Fall konnte keine Beteiligung der Haut beobachtet werden (Uebe

et al. 2002). Darüber hinaus bestand kein klinisch und labordiagnostisch fassbarer

Immundefekt. Dies könnte darauf hinweisen, dass auch mögliche Faktoren von

Seiten des Impfstoffes die Entstehung eines Zosters begünstigen können.

Zusammenfassend und schlussfolgernd lässt sich sagen, dass in der vorliegenden

Arbeit wesentliche Erkenntnisse über das methodische Vorgehen bei der

Genotypisierung von VZV-Isolaten gewonnen werden konnten. Unter Einbeziehung

der beschriebenen molekularbiologischen Untersuchungen gelang es, Impftyp-

Stämme von Wildtyp-Stämmen sicher abzugrenzen. Durch die Analyse von VZV-

Isolaten und VZV-DNA-positiven Materialien von Patienten mit Varizellen oder Zoster

konnten erstmals Daten zur Verteilung verschiedener VZV-Genotypen in

Deutschland gewonnen und Unterschiede zu anderen europäischen und

außereuropäischen Ländern aufgezeigt werden. Die gewonnenen

Untersuchungsergebnisse stellen eine gute Grundlage für weiterführende gezielte

Untersuchungen an einer größeren Anzahl von Patientenproben dar.

71

�� 6FKOXVVIROJHUXQJHQ�• Mit der Einführung der Varizellenimpfung ist eine epidemiologische Surveillance

zirkulierender VZV-Stämme erforderlich. Darüber hinaus muss bei Varizellen oder

Zoster nach Impfung eine Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV erfolgen.

• Eine zuverlässige Unterscheidung von Impf- und Wildtyp-VZV ist nur mittels

Genotypisierung möglich. Dies setzt Erfahrungen bei der Durchführung

molekularbiologischer Arbeiten sowie einen relativ hohen apparativen Aufwand

voraus.

• Unter Einbeziehung der ORF 38, 54 und 62 gelingt mittels PCR und

nachfolgender Restriktionsenzymanalyse die zuverlässige Genotypisierung des

VZV. Als Methode der Wahl ist die Genotyp-Bestimmung von VZV-Isolaten

anzusehen.

• Eine direkte Genotypisierung der viralen DNA in Patientenproben sollte versucht

werden, wenn das Ergebnis schnell verfügbar sein soll und kein geeignetes

Untersuchungsmaterial für die Virusisolierung zur Verfügung steht.

• Die höchste Sensitivität weist die Multiplex-PCR zur gleichzeitigen Amplifikation

von DNA-Fragmenten der ORF 38 und 54 auf.

• Die gleichzeitige Analyse der ORF38/54 erlaubt eine Unterscheidung von

europäischen und nordamerikanischen Wildtyp-Isolaten von Oka-ähnlichen Wild-

oder Impftyp-Stämmen. Parallel dazu kann der %JOI-Polymorphismus des Gens

54 mit abgeklärt werden.

• Mittels Charakterisierung von DNA-Fragmenten des ORF 62 ist eine universelle

Differenzierung von VZV-Wild- und Impftyp-Stämmen auch unter Einschluss

japanischer Oka-ähnlicher Wildtyp-Isolate möglich.

• Alle typisierten VZV-Wildtyp-Stämme enthielten eine 3VWI-Schnittstelle im ORF

38. Dies entspricht den publizierten Ergebnissen in den USA und in

Großbritannien.

• Der dominante Genotyp besaß die Wildtyp-Marker 3VWI+ %JOI .̄ Er wurde in über

90% der Fälle bei Patienten mit Zoster und einem Durchschnittsalter von 47

Jahren nachgewiesen.

72

• Bei 6% aller Patienten mit einem Durchschnittsalter von 14 Jahren ließ sich der

Wildtyp 3VWI+ %JOI+ nachweisen, wobei die Mehrzahl dieser Patienten an

Varizellen erkrankt war.

• Wildtyp-Stämme mit einer %JOI-Schnittstelle im Gen 54 kommen in Deutschland

bedeutend seltener vor als in den USA und Großbritannien. Der gehäufte

Nachweis bei Varizellen könnte darauf hindeuten, dass dieser Genotyp in Zukunft

auch vermehrt in Deutschland auftreten wird.

• Bei einem Patienten wurde der Oka-Impftyp 3VWI ̄ %JOI+ gefunden. Diese

Ergebnisse sprechen dafür, dass das Oka-Impfvirus in Deutschland bislang sehr

selten bei Personen nachweisbar ist.

• Das Oka-Impfvirus ließ sich bei einem Kind nachweisen, das nach

Varizellenimpfung einen Zoster entwickelte.

• Ein Zoster kann bei geimpften Personen auftreten, wenn es nach Impfung zu

einem Befall der Haut als impfbegleitendes Exanthem oder zu mild verlaufenden

Windpocken kommt.

��

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varicella-zoster virus DNA by polymerase chain reaction. J Virol Methods, 80: 213-

215.

81

'DQNVDJXQJ��Bedanken möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. med. habil. P. Wutzler, Direktor

des Instituts für Virologie und Antivirale Therapie des Universitätsklinikums Jena,

dass er mir für die Durchführung des experimentellen Teils meiner Arbeit sehr gute

Arbeitsbedingungen gewährt hat.

Mein besonderen Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. med. habil. A. Sauerbrei für das

zur Verfügung gestellte Thema, für die fachliche Beratung und Unterstützung bei der

Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Abfassung des Manuskripts.

Ich danke Herrn Dr. med. U. Eichhorn für die Unterstützung bei der Durchführung der

praktischen Tätigkeiten sowie bei der Abfassung des Manuskripts und Frau M. Alexi

für die Unterstützung bei der Durchführung der Laborversuche.

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/HEHQVODXI��Shokoufeh Gawellek

Geburtsdatum: 30.03 1971 Geburtsort: Shahroud

1977-1980 Grundschule in Shahroud

1980-1985 Grund- und Mittelschule in Karadj

1985-1989 Oberschule mit Berufsabschluss als Grundschullehrerin in Karadj

1989 Abitur

1989-1993 Lehrerin der Grundschule und Psychologie-Studium in Karadj

1993 Abschluss: Diplompsychologe

1993-1996 Lehrerin und Schulpsychologin in Karadj

1996 Einreise nach Deutschland

1996-1998 Deutschkurs in Mainz

1998-2003 Studium der Zahnmedizin, Friedrich-Schiller-Universität Jena

16.12.2003 Staatsexamen, Friedrich-Schiller-Universität Jena

ab 2001 Arbeiten zur Promotion am Institut für Virologie und Antivirale

Therapie des Universitätsklinikums Jena

seit 2002 verheiratet mit Mario Gawellek

2004 Geburt der Tochter Jasmin Gawellek

Jena, im November 2004

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(KUHQZ|UWOLFKH�(UNOlUXQJ��Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist.

Ich habe die vorliegende Dissertationsschrift selbstständig und nur unter

Verwendung der angegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt.

Herr Privatdozent Dr. med. habil. A. Sauerbrei und Herr Dr. med. U. Eichhorn haben

mich bei der Auswahl und Auswertung des Materials und bei der Abfassung des

Manuskripts unterstützt.

Die Hilfe eines Promotionsberaters wurde nicht in Anspruch genommen und Dritte

erhielten weder unmittelbar noch mittelbar von mir geldwerte Leistungen für Arbeiten,

die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe diese Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder

eine andere wissenschaftliche Prüfung eingereicht.

Ebenso habe ich diese Arbeit nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation

eingereicht.

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Jena, im November 2004

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Documents

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