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Lipid rafts und ihre Funktionin biologischen Membranen

Seminar Biotechnologie 1Lisa Marie FinklerSS 2012Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt

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Gliederung Biologische Membranen

Aufbau Membranlipide Membranproteine

Funktionen einer biologischen Membran Fluid Mosaic Modell

Lipid Rafts Funktionen von Lipid Rafts

Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of

erythrocyte lipid rafts“ “Ca++-dependent viscle release from erythrocytes involves

stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin”

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Biologische Membranen

Grenze zwischen 2 Kompartimenten Intrazellulär (innerhalb einer Zelle) Interzellulär (Inneren einer Zelle zu Zellaußenraum)

Selektiv permeabel

Bestehen hauptsächlich aus: Lipiden Anteil ist je nach Membrantyp Proteinen unterschiedlich

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Aufbau einer biologischen Membran

[1]

5

Aufbau einer biologischen Membran

Membranlipide bilden die Grundstruktur (Doppelschicht) Amphiphatisch

Hydrophiler Kopf Lipophiler Kohlenwasserstoffrest

Permeabilitätsschranke

Phospholipide Sphingolipide Cholesterin

Mizelle Lipiddoppelschicht Liposom [2]

6

Aufbau einer biologischen Membran

Phospholipide Phosphatidylcholin(siehe Abbildung) Phosphatidylserin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylinositol

häufigste Membranlipide

[3]

7

Aufbau einer biologischen Membran

Sphingolipide

„Signalübertragung, Interaktion zwischen einzelnen Zellen, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelltod“ [6]

[4]

8

Aufbau einer biologischen Membran

Cholesterin Steroid-Grundgerüst Hydrophiler Anteil (OH-Gruppe) Membranoberfläche

Hydrophober Rest Innerhalb der Membran

Gehalt an Cholesterin beeinflusst die Fluidität der Membran [5]

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Aufbau einer biologischen Membran

Membranproteine

Integrale Membranproteine

(1-3)

Periphere Membranproteine

(4)

Lipidverankerte Proteine

(5)

[6]

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Aufbau einer biologischen Membran

Integrale Membranproteine Amphiphatisch

Hydrophober Anteil innerhalb der MembranVerankerung durch Wechselwirkung mit Fettsäureketten Hydrophiler Anteil außerhalb der MembranWechselwirkungen mit der Umgebung

Periphere Membranproteine Nichtkovalente Bindungen an Membran bzw. Proteine

Lipidverankerte Proteine Kovalente Bindung an ein Lipid (z.B.: GPI-Verankerung)

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Funktionen einer biologischen Membran

Kompartimierung

Selektive Permeabilität

Transportvorgänge

Signalaufnahme, Weiterleitung, Abgabe

Ort der Energie- sowie Stoffumwandlung (Träger von Enzymen)

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Fluid Mosaic Modell

1972 S.J. Singer und G.L. Nicolson

Modell zum Aufbau der biologischen Membran Flüssig-kristalline Lipiddoppelschicht(Hydrophile „Köpfe“ der Membranlipide außen,Hydrophobe „Fettsäureschwänze“ innen) Membranproteine inselartig eingelagert, lateral frei beweglich

dynamische Struktur

[7]

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Fluid Mosaic Modell Membranfluidität

Lipidzusammensetzung Cholesterinanteil (hoher Anteil erhöhte Viskosität) Temperatur

Stabilität durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den FettsäurekettenWärmezufuhr: Übergang von kristallinem zu flüssig-kristallinem Zustand

[8]

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„Lipid Rafts“- Lipidflöße

[9]

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„Lipid Rafts“- Lipidflöße Unterscheiden sich in

ihrer Zusammensetzung von anderen Membranbereichen Sphingolipide Cholesterin Glycolipide GPI-verankerte Proteine

Stärker geordnet und dichter gepackt

Caveolae Ausbuchtungen der

Membran Caveolin als wichtigste

Strukturelement

hochdynamische StrukturenZusammenlagerungAuflösung

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Funktionen von Lipid Rafts

[8]

17

Funktionen von Lipid Rafts

[9]

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Ergebnisdarstellung

„Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood (2001 97:1141-1143)

Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Lipid Rafts

Verwendete Methoden Isolation der Lipid Rafts aus Erythrozyten durch Extraktion Gelektrophorese, Silberfärbung Membranmarker: Acetylcholinesterase (AChE) Western Blot

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Ergebnisdarstellung

A: diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation

(Spur 1: Pellet, Spur 2: hohe Dichte,Spur 3: mittlere Dichte, Spur 4: Lipid Rafts)B: Extraktion in alkalische Lösung

(Na2CO3)(Spur T: Suspension vor Extraktion,Spur S: Überstand, Spur P: Pellet)

Stomatin, Flotillin-1 und -2 Integrale lipid raft assoziierte

Membranproteine Protein 4.1 und 4.2, Spectrin, Actin Periphere Membranproteine

Methode A Methode B

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Ergebnisdarstellung

Immunblot der isolierten Lipid Rafts

Oligomere Komplexbildung von Flotillin-1 und -2 sowie Stomatin

Spur 1 und 2: Erythrozytenmembraneines OHSt krankem Patienten;Spur N: gesunde Person Stomatin ist nicht in Spur 1 und

2 nachweisbar (OHSt)

OHSt: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis

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Ergebnisdarstellung

“Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood (2002 99: 2569-2577)

Erkenntnisse über die Bestandteile von Lipid Raftssowie über die calciumabhängige Vesikulation

Verwendete Methoden Rasterkraftmikroskopie Calciumabhängie Vesikulation Trennung der Mikro- und Nanovesikel durch Zentrifugation Gelektrophorese, Silberfärbung Western Blot

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Ergebnisdarstellung

Methode A und B unterscheiden sich Zentrifugationsmethoden A) Spur 1: Erythrozytenmembran

Spur 2: MikrovesikelSpur 3: Nanovesikel

B) Spur 1: ErythrozytenmembranSpur 2 und 3: MikrovesikelSpur 4: Nanovesikel

Stomatin in Mikrovesikel Synexin und Sorcin in Nanovesikel Carboanhydrase ( CA) und

Hämoglobin (Hb) in beiden nachweisbar

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Ergebnisdarstellung

A sowie B: Auswirkung von Ca2+ bzw. EDTA-Zugabe

S: Überstand; P: Pellet nach Zentrifugationaq: aquatisch; dt: detergent nach Phasenseperation

Synexin und Sorcin nach Ca2+ Zugabe im Pellet, nach EDTA Zugabe im Überstand

Stomatin: keine Auswirkungen Stomatin nach

Phasenseperation durch Triton X-114 nur noch in der detergenten Phase

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Ergebnisdarstellung Periphere Membranproteine

Durch hydrophobe Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen an Membran gebunden

Ablösen durch Veränderung des pH-Wertes, des Puffers, der Salzkonzentration (EDTA)

Integrale Membranproteine Ablösen durch Detergenz

(Triton X-114)

Stomatin Integrales Membranprotein, Cytoskelettanker

beteiligt am Kationentransport (Na+/K+)

Abwesenheit: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis

Synexin Peripheres, calciumbindendes Protein Exozytoseprozesse, Membranfusion

Sorcin Peripheres, calciumbindendes

Membranprotein Signaltransduktion

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Abbildungsverzeichnis

[1] http://www.biokurs.de/skripten/bilder/membr3.jpg[2] Biochemie: Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten

von Philipp Christen,Rolf Jaussi, Springer (2005)[3] www.chemgapedia.de [4] http://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelin[5] http://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.html[6] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan

Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005)[7] http://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singer-

and-Nicholson-resized-150x150.jpg[8] http://www.uni-marburg.de/fb20/cyto/lehre/Jacob/membranen.pdf[9] Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas

Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [10]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html[11]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html

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Quellen[1] Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3. Auflage (2010)[2] Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg

Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005)[3]http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/transport/membranentransport.vlu/

Page/vsc/de/ch/8/bc/transport/membran_aufbau_funktion.vscml.html[4] http://de.wikipedia.org/wiki/Lipide#Membranbildende_Lipide[5] www.lipidsignalling.de/lipidimfocus/sphingolipide.php[6] Biochemie von H. Robert Horton,Laurence A. Moran,K. Gray Scrimgeour,J. David Rawn,Marc D.

Perry, Pearson Studium, 4. Auflage (2008)[7] Biochemie Zellbiologie von Katharina Munk, Thieme (2008)[8] Kurzlehrbuch Histologie von Norbert Ulfig, 3. Auflage, Thieme (2003)[9] Molekulare Zellbiologie von Gerald Karp,Sebastian Vogel,Susanne Kuhlmann-Krieg, Springer, 4.

Auflage (2005)[10]www.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../9783804721074_p.pdf[11]http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304[12]Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang

Höhne, Thieme (2011)[13]http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a004697.full[14]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html[15]http://www.fwf.ac.at/de/abstracts/abstract.asp?L=D&PROJ=P15486[16]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html[17]http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907[18]http://www.uniprot.org/uniprot/P20073