47

17. ALLGEMEINE EIGENSCHAFTEN DER DNA-REPLIKATION (Molekulare Zellbiologie: Seiten 493-497)

Methoden um die Replikation zu Studieren in vitro Methoden

zellfreie Replikation (das Kornberg-System; Abb. 17.1.) - Matrize-DNA - DNA-Polymerase - die 4 Typen von den dNTP-Molekülen (wenigstens ein Typ radioaktiv markiert) - Ionen, pH usw. TCA (Trichloressigsäure)-Filter-Präzipitierung

Flüssigkeitsszintillations-Zähler in vivo Methoden

- Dichtemarkierung (z.B. 15NH4Cl) - radioaktive Markierung (z.B. [3H]thymidine)

- Bromdesoxyuridin-Markierung → anti-BrdU → Immuncytochemie, Durchflusscytometrie

Abbildung 17.1. Der Mechanismus der DNA-Synthese im Kornberg-System.

Abbildung 17.2. Das Meselson-Stahl-Experiment.

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Die Replikation ist semikonservativ Meselson-Stahl-Experiment (Abb. 17.2.)

Dichtemarkierung mit 15NH4Cl Die Replikation ist Matrize- und Primer-abhängig Matrizenstrang

Determiniert die Nucleotidsequenz der neusynthetisierten DNA durch komplementäre Basenpaarung

primer (Abb. 17.3.) komplementär zum Matrizenstrang bietet freie 3'-OH-Gruppe für die DNA-Polymerase

Abbildung 17.3. Die Funktion des Matrize-Primer-Komplexes während der DN- Replikation. Die DNA-Replikation ist bidirektional startet bei ori ( = Replikationsurschprung oder Origin) Replikationsblase, Replikationsgabeln Faserautoradiographie (Abb. 17.4.)

Abbildung 17.4. Die bidirektionale Natur der Replikation wurde durch Faserautoradiographie nach

[3H]Thymidin-Markierung demonstriert.

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Die Replikation ist semidiskontinuierlich (Abb. 17.5.) antiparallele Struktur der Matrize Richtung der Elongation (des Kettenwachstums): 5'→ 3' Leitstrang, Folgestrang Okazaki-Fragmente

Abbildung 17.5. Die semidiskontinuierliche Natur der DNA- Replikation. A: Das Problem der

symmetrischen Replikation; B. Synthese des Leitstranges und des Folgestranges.

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18. DER MECHANISMUS DER DNA-REPLIKATION (Molekulare Zellbiologie: Seiten 120-126; 498-511)

DNA-Replikation in E. coli (Abb. 18.1.)

wird vollgebracht von einem Multienzymkomplex (Replisom,Replikationskomplex,Replikationsmaschine )

origin-recognition complex (Replikationsurschprung-Erkennungskomplex) ori

enthaltet kurze Wiederholungssequenzen bindet specifische Proteine (z.B. Initiationsprotein) Topoisomerase I

reversible Endonuclease, die eine DNA-Strang schneidet (verursacht Einzelstrangbrüche) induziert Superhelix Relaxation

DNA-Helikase Löst Wasserstoffbrücke → Entwindung der Doppelhelix

Ssb-Proteine = einzelstrangbindende (single-strand binding) Proteine vorbeugt die Renaturierung der Matrize

Primase spezielle RNA-Polymerase generiert Primers ist in Primosomen anwesend, zusammen mit andere Proteine (z.B. Helikase)

Abbildung 18.1. Der Mechanismus der prokaryotischen DNA-Replikation. A. Formation der

Replikationbslase bei der ori-Region. B. Komponente der Replikationsgabel. DNA-Polymerase III (Abb. 18.2.)

Holoenzym Core-Enzym

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Dimer assoziierte Proteine

γ-Untereinheit fixierte core-Polymerase an dem Folgestrang β-Untereinheit → hohe Prozessivität

5' → 3' Elongationsaktivität 3' → 5' Exonucleaseaktivität – Korrekturlesefunktion (proofreading)

Abbildung 18.2. Funktionales Modell der DNA-Polymerase III. DNA-Polymerase I 5' → 3' Exonucleaseaktivität → beseitigt die Primers 5' → 3' Elongationaktivität → füllt die Lücke ein DNA-Ligase

verknüpft Okazaki-Fragmente miteinander Topoisomerase II (Abb. 18.3.; 18.4.)

reversible Endonuclease → schneidet beide Hälfte des DNA-Doppelstranges→ -Trennung der Tochtermoleküle - Entwirrung - Superspiralisierung

Abbildung 18.3. Separierung der neureplizierten zirkulären DNA-Moleküle durch Topoisomerase II.

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Abbildung 18.4. Separierung der Schwesterchromatiden in der Anaphase der eukaryotische

Zellteilung. Eukaryotische DNA-Replication multiple (zahlreiche) Replikationsurschprünge

~ 104/Genom Replikon

DNA-Polimerasen α, δ, ε - Zellkern-Replikationspolymerasen β - Reparatur-Enzym γ - mitochondriale DNA-Polymerase spezializierte DNA-Polymerasen

replizieren beschädigte DNA (“translesion” DNA-Synthese) Replikation im Chromatin

Histonsynthese in der S-phase Telomerreplikation (Abb. 18.5.; 18.6.)

tandemartige Sequenzwiederholungen Telomerase - RNA als Matrize

Reverse Transcriptase

Abbildung 18.5. Das Problem der Ende-Replikation.

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Abbildung 18.6. Der Funktionsmechanismus der Telomerase.

54

19. DNA-REPARATUR (Molekulare Zellbiologie: Seiten 511-521)

DNA-Schäden verschiedene Typen

- Replikationsfähler → Basenfehlpaarungen (mismatch) - Basendesaminierung → abnormale Base - Depurinierung → AP (Apurin)- Stelle - chemische Mutagene → Basenmethylierung, kovalente Addukte, quervernetzte Stränge

usw. - UV-Strahlung→ Pyrimidindimere - ionisierende Strahlung → Strangbrüche

Direkte Eliminierung der DNA-Schäden z.B. Photolyase

spaltet Pyrimidindimere in Bakterien Excisionsreparatur (Abb. 19.1.)

= Excision der beschädigten Region + Substitution durch neusynthetisierte DNA Basen-Excisionsreparatur (Abb. 19.1.)

= Entfernung und Substitution der beschädigten Basen Beteiligte Enzyme

- DNA-Glykosylase → Entfernt die beschädigte Base → AP-Stelle - AP-Endonuclease → spaltet bei der AP-Stelle - DNA-Polymerase → füllt die Lücke ein - DNA-Ligase → schließt den Einzelstrangbruch

Abbildung 19.1. Der Mechanismus der Basen-Excisionsreparatur.

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Nucleotiden-Excisionsreparatur (Abb. 19.2.)

= Entfernung von größeren beschädigten Regionen (z.B. Thymindimere, kovalente Addukte)

Beteiligte Enzyme - Schaden-Erkennungsproteine - Excinuclease → spaltet an beider Seite der Beschädigung - Helikase → Entfernt der Beschädigte Strang - DNA-Polymerase → füllt die Lücke ein - DNA-Ligase → schließt den Einzelstrangbruch

Xeroderma pigmentosum Autosomal-recessiver Erbgang Mutation in einem der the Nucleotiden-Excisionsreparatur-Gene (XPA-XPG)

Abbildung 19.2. Der Mechanismus der Nucleotiden-Excisionsreparatur. Basenfehlpaarungsreparatur (mismatch repair) (Abb. 19.3.)

= Entfernung von nichtkomplementäre Nucleotide Beteiligte Enzyme

- Erkennungsproteine → binden sich an die nichtkomplementäre Base in dem nichtmethylierten Strang

- Endonuclease → schneidet den DNA-Strang - Helikase → entwindet die Doppelhelix - Exonuclease → entfernt die abnormale Nucleotide enthaltende Region - DNA-Polymerase → füllt die Lücke ein - DNA-Ligase → schließt den Einzelstrangbruch

hereditäres nichtpolypöses Colonkarzinom (hereditary nonpolyposis colon cancer, HNPCC)

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autosomal-rezessiver Erbgang Mutation in einem der Basenfehlpaarungsreparatur-Gene → die rate der

Punktmutationen nimmt zu, Mikrosatelliteninstabilität → erhöhtes Risiko des Dickdarmkrebses

Abbildung 19.3. Der Mechanismus der Basenfehlpaarungsreparatur

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20. ALLGEMEINE MERKMALE VON TRANSKRIPTION UND RNA-PROZESSIERUNG

(Molekulare Zellbiologie: Seiten 120-126, 387-397,440-447) DNA-Matrize → Transkription → Primärtranskript → RNA-Prozessierung → reife RNA Methoden für die Untersuchung von Transkription in vitro Methoden

zellfreie RNA-synthetisierende Mischung: DNA-Matrize 4 dNTPs (ein Typ markiert) RNA-Polymerase Ione, pH usw.

Filterpräzipitierung → Radioaktivität bestimmen in vivo Methode

3H-Uridine-Markierung → Autoradiographie Bromuridin-Markierung → Immuncytochemie mit anti-BrU Antikörper

Transkription und RNA-Prozessierung in Prokaryoten allgemeine Merkmale von RNA-Synthese

Promotor, Terminator, Transkriptionseinheit verbundene Transkription- Translation (Chromosom-Polysomkomplex)

Abbildung 20.1. Verbundene Transkription-Translation (Chromosom-Polysomkomplex)

Mechanismus der prokaryotische Transkription

RNA-Polymerase Holoenzym = Sigmafaktor (σ -Faktor )+ Core-Polymerase (α2ββ')

Schritte: - Initiation

Promotor: - 35 Region; -10 Region (Pribnow box) geschlossener und offener Komplex

- Elongation Core-Polymerase Formation von Phosphodiesterbindungen 5' → 3' Richtung Triphosphat-Ende

- Termination ζ (Rho)-Faktor

ζ-abhängige oder ζ-unabhängige Termination

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Abbildung 20.2. Die Hauptschritte der prokaryotischen Transription

Abbildung 20.3. Die Struktur des prokaryotischen Promotors und der RNA-Polymerase

RNA-Prozessierung

charakteristisch für tRNA und rRNA - nucleolytische Spaltung (Endonucleasen, Exonucleasen) - Nucleotid- Addition (-Hinzufügung) (z.B. tRNA) - Nucleosid- Modifikation (z.B. Methyleirung)

Allgemeine Merkmale der Transkription in Eukaryonten - findet im Chromatin statt - RNA-Polymerasen I II III

Produkt

Prä-rRNA

Prä-mRNA snRNAn

5S rRNA tRNAn snRNAn

Lokalisation

Nucleolus

extranucleoläres Chromatin

α-Amanitin-Sensitivität keine

hoche

mäßige

- Transkription und Translation wird durch Kernmembran getrennt - nucleocytoplasmische Transport von RNA

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21. SYNTHESE VON RIBOSOMEN IN EUKARYONTEN (Molekulare Zellbiologie: Seiten 394, 481-484,

Kleine Albert’s: Seiten 272-273) Ribosomen: Orte für Proteinsynthese Warden in Nukleolus zusammengesetzt Nucleolus

wird um tandemartige-geordneten Genen von rRNA geformt electronenmikroskopische Struktur

- perinucleoläres Chromatin - fibrilläres Zentrum

helleste Regionen Nucleolusorganisator

Orte für die Prä-rRNA-Synthese - fibrilläre Komponente

dunkleste Regionen enthält Prä-rRNP

- granuläre Komponente enthält präribosomale Partikeln

granuläreKomponente

perinukleoläresChromatin

fibrilläreKomponente

fibrilläresZentrum

Abbildung 21.1. Die elektronenmikroskopische Struktur des Nukleolus. Ribosom-Biogenese Chromatin-Ausbreitung

→ kann man die Prä-rRNA-Synthese von Genen sichtbar machen ("Feder") Orte für die Initiation und Termination transkribierte und nichttranskribierte Bereiche (Spacer) RNA-Polymerase I

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Abbildung 21.2. Die aktiv transkribierte rRNA-Transkriptionseinheit.

RRNA-Transkriptionseinheiten

tandemartige Wiederholungen Primärtranskript: 45S Prä-rRNA → Prozessierung → 18S, 5.8S und 28S rRNAn 5S rRNA Gene

außerhalb des Nucleolus wird mit RNA-Polymerase III transkribiert

snoRNAn = kleine Nucleolus-RNAn (small nucleolar RNAs) binden sich zu Prä-rRNA → funktionieren als RNA-Chaperonen

Abbildung 21.3. Tandemartig geordnete rRNA-Genen. Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten

80S Partikel = 45S Prä-rRNA + snoRNAn + Proteinen

60S Prä-Ribonucleoproteinpartikel = unreife groβe Untereinheit

40S Prä-Ribonucleoproteinpartikel = unreife kleine Untereinheit endliche Reifung im Cytoplasma

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Abbildung 21.4. Ribosom-Biogenese

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22. SYNTHESE VON PRE-mRNA, CAP-FORMATION UND POLYADENYLIERUNG

(Molekulare Zellbiologie: Seiten 447-453)

Prä-mRNA = hnRNA (heterogene nucleäre RNA) Synthese von Prä-mRNA

- Initiation - Elongation - Termination

posttranscriptionelle Modifizierungen - RNA-Capping - Polyadenylierung - Spleiβen

Initiation von Prä-mRNA-Synthese Promotor: - “core promoter” Elemente TATA-Box Initiator-Region

- Enhancer-Elemente RNA-Polymerase II

Core-Polymerase + Initiationsfaktoren = Holoenzym Histon-Acetyltransferase Helicase

Abbildung 22.1. Mechanismus der Transkription von protein-codierende Genen in Eukaryoten.

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Abbildung 22.2. Die Struktur des Promotors von RNS-Polymerase II. Elongation Promotor-Ausleerung Polymerase II-Elongationskomplex Formation von 5'-Cap am Triphosphat-Ende Enzyme: - Nucleotide-Phosphohydrolase

- Guanyl-Transferase - Methyl-Transferase

Abbildung 22.3. Die Schritte der 5’-cap-Formation.

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Abbildung 22.4. Die Struktur von 5’-cap. Termination und Polyadenylierung poly(A)-Signalsequenz poly(A)-Polymerase poly(A)-Schwanz

Abbildung 22.5. Prozessierung des 3’-Endes von eukaryontischer Prä-mRNA.

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23. PRE-mRNA-SPLEIßEN (Molekulare Zellbiologie: Seiten 453-459)

viele eukaryontische Protein-codierende Gene sind nicht kontinuierlich: Introne + Exone Spleiβen = Entfernung der Intronen von der Prä-mRNA → Verkettung von Exonen

Abbildung 23.1. Die diskontinuierlich Struktur der protein-codierenden Gene und das Prä-mRNA-

Spleißen. Spleißen der späten mRNAn von Adenovirus Adenoviren linearer, dsDNA-Genom frühe Region → frühe Proteinen späte Region → späte Proteinen (Virion-Proteinen) komplex Transcriptionseinheit einzige Promotor alternatives Spleiβen 5 alternative poly(A)-Anheftungsstellen Exone (leader sequences, body sequence) und Introne

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Abbildung 23.2. Identifizierung der Intronen mit elektronenmikroskopische Analyse von RNA-DNA-

Hybriden. A: Schmematische Darstellunzg einer elektronenmikroskopischen. B: Virus-DNA mit Intronen und Exonen.

Abbildung 23.3. Die späte Prä-mRNA von Adenovirus und die Produkte von alternativem Spleißen.

(Die Abbildung zeigt nur das Spleißen der kürzesten Prä-mRNA.) Der RNA-Spleiβmechanismus 5`-Spleisstelle, 3`-Spleisstelle Spleiβosom Prä-mRNA + snRNAs + Proteinen U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs Lariatbildung (Lasso)

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Abbildung 23.4. Die Schritte von Prä-mRNA-Spleißen. Abnormalität von Spleißen Systemischer Lupus erythematodes (SLE) Autoimmunkrankheiten anti-snRNP Antikörper Thalassämie verminderte α- oder β-Globin Synthese meistens sind Mutationen der Speißstellen

Abbildung 23.5. Die Bildung von Spleißosom und Mechanismus von Spleißen.

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24. DIE PATHOLOGIE DES ZELLKERNS

Objekte für die Untersuchungen - pathologische Veränderungen der Gewebe, Zellen des Körpers - experimentelle Pathologie: Behandlung mit schädligen Substanzen, Chemikalien usw. pathologische Geweben, Zellen sind Modelle der pathologischen Veränderungen

reversibel – irreversibel Veränderungen Haupttypen der pathologischen Veränderungen 1. Chromatin - die früherest Veränderung ist eine reversibel Klumpenbildung - Chromatin Aggregatum bindet * zur Kernmembran (Chromatin-Margination) * zum Nucleolus degenerative Veränderungen Karyopyknose (nucleär pyknose; Abb. 24.1.) - progressiv Schrumpfung des Nucleus LM: wachsende basofil Eigenschaften (basische Farben → basofil, Hämatoxylin) EM: homogen, dens Chromatin

Abbildung 24.1. Karyopyknose. Karyolyse (Kernauflösung; Abb. 24.2.) - LM: abnehmende basofil Eigenschaften - EM: "leeres Kern" - hydrolitische Reaktionen des DNAses (pH ist saueren) Nucleus verschwindt

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Abbildung 24.2. Chromatin-Margination und Karyolyse. - Karyorrhexis (Abb. 24.3.) - Chromatin (Nucleus) brecht in viele Klumpen - Chromatinfragmenten im Cytoplasm (letzter Schritt - Karyolyse)

Abbildung 24.3. Karyorrhexis. 2. Nucleoläre Veränderungen a. nucleoläre Hypertrophie - Vergröβerung des Umfang des Nucleolus - wachsende nucleoläre RNA Synthese - in den Tumorzellen - wachsende Aktivität des Proteinsynthese

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- in den aktiven normalen Zellen (z.B. regenerierende Leber nach der partial Hepatectomie)

b. nucleoläre Segregation (Abb. 24.4.) - Separation der nucleolären F und G Komponenten - experimentelle Pathologie: Hinderung des RNA Polymerase von Actinomycin D:

Segregation des Nucleolus - zytotoxische → zytostatische Chemotherapie

Abbildung 24.4. Segregation von Nucleolus (F = fibrilläre Komponente; G = granuläre

Komponente). 3. Veränderungen der Kernhülle 4. Inclusionen im Nucleus

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25. DIE ROLLE der mRNA, tRNAs UND RIBOSOMEN IN DER PROTEINSYNTHESE

(Molekulare Zellbiologie: Seiten 126-139)

Die mRNA ist die Matrize der Proteinsynthese mRNA = Messenger-RNA (Boten-RNA)

bestimmt die Aminosäuresequenz des Proteins

tRNAs als Adapter tRNA = Transfer-RNA

tragen Aminosäure Die Struktur der tRNA (Abb. 25.1.)

das Kleeblatt-Modell Aminosäureakzeptorstamm oder Akzeptorarm (Aminosäure-Bindungsstelle) am 3`-Ende (CCA) TφCG-Schleife Ribosomenbindung Anticodonschleife Codonbindung D-Schleife Bindung der Aminoacyl-tRNA-Synthetase

Abbildung 25.1. Die Sekundärstruktur (A.) und Tertiärstruktur der tRNAs. Die Synthese der Aminoacyl-tRNA (Abb. 25.2.)

durch Aminoacyl-tRNA-Synthetase Schritt 1 - Aktivierung der Aminosäure Aminosäure + ATP → Aminoacyl-AMP + Pyrophosphat Schritt 2 - Bildung der aminoacyl-tRNA Aminoacyl-AMP + tRNA → Aminoacyl-tRNA + AMP

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Abbildung 25.2. Die Schritte der Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Reaktion: A: Aktivierung der

Aminosäure; B: Aminoacyl-tRNA-Synthese. Ribosomen und Translation (Abb. 25.3.)

Prokaryoten 30S kleine Untereinheit + 50S große Untereinheit = 70S Monomer

Eukaryoten 40S kleine Untereinheit + 60S große Untereinheit = 80S Monomer

Abbildung 25.3. Die Struktur von Ribosomen. Methoden um die Translation zu Studieren in vitro Techniken zellfreies System (das Nirenberg-System) Zellextrakt (Ribosomen, mRNA, tRNAs, Proteinfaktoren) Die 20 typen von Aminosäuren (wenigstens ein Typ radioaktiv markiert) ATP, GTP Ionen, pH,usw.

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Detektion: - Filterpräzipitierung - PAGE

in vivo Techniken - Isolation von Polysomen (Abb. 25.4.) - radioaktive Markierung (z.B. 3H-Leucin) - Autoradiographie - PAGE - Immunopräzipitation

Abbildung 25.4. Saccharose-Dichtegradient-Sedimentogramm von Polysomen. Die mit buchstaben

markierten Spitzen entsprechen den monomerischen Ribosomen (a) , den Polysomen die enthalten 3 (b), oder 5 (c) Ribosomen.

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26. DER GENETISCHE CODE (Molekulare Zellbiologie: Seiten 126-133)

Die Entschlüsselung des genetischen Codes in vitro Translation von synthetischen Polynucleotiden

monotone Polynucleotide, Kopolymere → wurden als Matrizen in Nirenberg-Mixturen benutzt

Aminoacyl-tRNA-Bindungsanalyse (Abb. 26.1) Nirenberg-System → Auslassung des GTPs → Aa-tRNA Bindung, aber keine

Proteinsynthese → Filterbindung

Abbildung 26.1. Das Grundprinzip der Aminoacyl-tRNA-Bindungsanalyse.

Eigenschaften des genetischen Codes (Abb. 26.2.) Triplett Code 61 Sense-Codons (sinnvolle Codons)→ Aminosäure 3 Nonsense-Codons (sinnlose Codons)→ Stoppcodons der Code ist redundant (degeneriert) = eine Aminosäure kann von mehreren Codons codiert sein

Abbildung 26.2. Der genetische Code.

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Wobble-Basenpaarung (Abb. 26.3.) = Ungewissheit an der dritten Position des Codons der Code ist eindeutig = ein Codon codiert eine einzige Aminosäure der Code ist kontinuierlich = lückenlos, nicht überlappend offener Leseraster=open reading frame (ORF) monocistronische und polycistronische mRNAs der Code ist universell = höchst konserviert (bewahrt) in der Natur

Ausnahmen (z.B. der mitochondriale genetische Apparat)

Abbildung 26.3. Die Wobble-Position der Codon-Anticodon Interaktion.

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27. DER MECHANISMUS DER PROTEINSYNTHESE (Molekulare Zellbiologie: Seiten 139-146)

Translation in Prokaryoten Initiation (Abb. 27.1.) Initiatorcodon (=Startcodon) (AUG oder GUG) → fMet-tRNA Shine-Dalgarno-Sequenz → Ribosomenbindung

Initiationsfaktoren 30S-Initiationskomplex = mRNA + 30S Untereinheit + fMet-tRNA + Initiationsfaktoren 70S-Initiationskomplex = 30S-Initiationskomplex + 50S Untereinheit P-Stelle: fMet-tRNA A-Stelle: leer

Abbildung 27.1. Initiation der prokaryotische Translation. A: Bindung von Initiationsfaktoren an die

kleine Untereinheit; B: Der Aufbau des 30S-Initiationskomplexes; C: Der Aufbau des 70S-Initiationskomplexes.

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Elongation (Abb. 27.2.) Aa-tRNA-Bindung an die A-Stelle mit der Hilfe von EF-Tu • GTP Entstehung der Peptidbindung Peptidyltransferase (Ribozym) Translokation mit der Hilfe von EF-G • GTP

Abbildung 27.2. Elongation der prokaryotischen Translation. A: Aminoacyl-tRNA-Bindung; B:

Entstehung der Peptidbindung; C: Translokation des Ribosoms. Termination (Abb. 27.3.) Stoppcodon Freisetzungsfaktoren (releasing factors)

Abbildung 27.3. Termination der prokaryotischen Translation.

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Besondere Eigenschaften der eukaryotischen Translation 5`-Cap → Ribosomenbindung Ribosomen - freie Ribosomen → Proteine des Cytosols, des Zellkerns, des Mitochondriums

- gebundene Ribosomen → sekretorische Proteine, Proteine des endoplasmatischen Reticulums, des Golgi-Apparates, der Lysosomen, der Zellmembran

Allgemeine Eigenschaften der Translation - Richtung: 5` Ende → 3` Ende

N-Terminus → C-Terminus - Polysomen bilden sich (Abb. 27.4.) - eine Polypeptidkette/Ribosom - braucht 4 energiereiche Bindungen/Peptidbindung (ATP → AMP, 2GTP → 2GDP)

Abbildung 27.4. Entstehung der Polysomen. Hemmende Wirkstoffe (Inhibitoren) der Proteinsynthese Chloramphenicol Peptidyltransferase Erythromycin Translokation Tetracyclin Aa-tRNA-Bindung Streptomycin 30S Untereinheit Puromycin → frühe Termination

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28. DAS OPERON MODELL

Genexpression - konstitutive - regulierte - Anschaltung (Induktion) - Abschaltung (Repression) Elemente von Genregulation DNA-Sequenz-Elemente cis-aktive Elemente Regulatorproteine binden zu DNA Repressoren oder Aktivatoren trans-aktive Elemente Effektormoleküle kleine Molekülen binden sich zu Genregulatorproteinen Induktoren oder Corepressoren Induzierbare Operons

kodieren für Enzyme des Abbaues Operon = Promotor + Operator + Strukturgene

Lactoseoperon - Regulation durch Lactose

ohne Lactose → lac-Repressor bindet sich an den lac-Operator → blockiert RNA-Polymerase → keine Expression

mit Lactose → bindet sich an Repressor → Affinität für die Operator wird vermindert → Expression von Operon ist möglich (Lactose wirkt als Induktor)

Abbildung 28.1. Negative Regulation der Transkription am lac-Operon: die Rolle der lac-Repressor,

(R=Regulatorgen, P=Promotor, O=Operator, S=Strukturgene) - Regulation durch Glucose

ohne Glucose → viel cAMP → CAP (= Katabolitaktivatorprotein) wird aktivatiert → bindet sich an lac-Promotor → stimuliert die Bindung von RNA-Polymerase → Expression von lac-Operon

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Abbildung 28.2. Regulation der Transkription am Lactoseoperon (G = Glucose, L = Lactose) Repressierbare Operons kodieren für Enzyme des Aufbaues Tryptophanoperon

niedriger Tryptophangehalt → Operator ist nicht blockiert → Operon wird transkribiert hoher Tryptophangehalt → Verbindung mit Tryptophanrepressor → bindet sich an Operator → blockiert RNA-Polymerase

→ keine Expression (Tryptophan wirkt als Corepressor)

Abbildung 28.3. Regulation des Tryptophanoperones

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29. MECHANISMUS DER GENREGULATION IN EUKARYOTEN

Genregulation in Entwicklung Experiment von Gurdon entkernte Froscheizelle → Mikroinjection von Zellkerne der Darmzelle →

einige entwickelten sich zu normal Frösche genetische Identität der Zellen des Organismus Haushaltsgene für Gewebe spezifiche Gene

Abbildung 29.1. Das Experiment von Gurdon Zellkerntransplantation in Säugetiere 1997: Dolly, das Lamm

entkernte Eizelle → Transfer des Zellkernes von einer reifer Euterzelle → Dolly reproduktive und terapeutische Klonierung Wegen von Genregulation in Eukaryoten Transkription - Struktur des Chromatins H1-Phosphorylation Rolle der Nichthistonproteine Histonacetylierung

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- DNA-Methylierung → Geninaktivierung Genomic Imprinting („genetische Prägung”) - Transkriptionsfaktoren

Abbildung 29.2. Normale Entwicklung (A), reproduktive(B) und terapeutische Klonierung (C)

Abbildung 29.3. Formen der Genregulation in Eukaryoten.

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pre-mRNA-Prozessierung - alternatives Spleißen

= eine Prä-mRNA → mehrere mRNAn - RNA-Edition

= Deletion, Insertion oder Substitution von eine Nucleotide in mRNA RNA-Transport nukleocytoplasmatischer RNA Export kann reguliert sein mRNA-Degradierung Rolle von 5′-Cap

poly(A)-Schwanz 3′-nichttranslatierter Bereich

Translation z.B. Phosphorylation der Initiationsfaktoren

Abbildung 29.4. Alternatives Spleißen der Prä-mRNA

Proteinabbau - lysosomale Proteolyse Autophagosom → Phagolysosome - ubiquitinabhängiges Proteolysesystem Proteine mit "destruction box" → Ubiquitinierung → Abbau durch

Proteasomen Funktion der Proteine - allosterische Regulation durch kleine Molekülen z.B. cAMP, GTP usw. - kovalente Modifikation z.B. Phosphorylierung Proteinkinasen und Phosphatasen - Protein-Protein Wechselwirkungen z.B. Cyclin-Cdk-Komplex

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30. TRANSKRIPTIONSFAKTOREN

Transkriptionsfaktoren (TF) = DNA-bindende Proteine, welche die Transkription regulieren allgemeine TFs → Promotor Elemente spezifische Faktoren→ Verstärkerelemente (Enhancer)

Transkriptionsfaktor-Familien

Struktur: - DNA-Bindungsdomäne - Aktivierungsdomäne

Helix-Knick-Helix-Proteine (helix-turn-helix Proteine) z.B. Homöodomänenproteine

kodierten von homöotische Gene enthalten eine Homöodomäne (kodiert von a Homöobox-Region)

Zinkfingerproteine binden als Dimer z.B. Steroidrezeptoren

amphipatische Helix-Proteine Dimerisationsdomäne bilden Leucin-Zipper (Leucinreißverschluss) Leucin-Zipper-Proteine z.B. AP1-Faktor (= Fos/Jun Dimer) Helix-Schleife-Helix-Proteine (helix-loop-helix (HLH) Proteine) z.B. MyoD-Genregulatorprotein

Abbildung 30.1. Transkriptionsfaktor-Familien: A: Helix-Knick-Helix Proteine, B: Zinkfingerproteine, C: Amphipatische Helix- Proteine

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Steroidrezeptorsuperfamilie Steroide binden zu intrazellulären Rezeptoren

z.B. Steroidhormone, Vitamin D3, Retinsäure Wirkung von Glucorticoidhormon

Glucocorticoidhormon → bindet sich an cytosolischem Rezeptor → hemmende Chaperone wird freigesetzt → Hormon-Rezeptor Komplex translokiert nach den Zellkern → bindet sich zu Glucocorticoid-Response-Element → Genaktivierung

Abbildung 30.2. Der Mechanismus der Aktion des Glucocorticoidhormones Transkriptionsfaktor-Krankheiten verursacht durch TF-Mutationen Geburtsfehler der Entwicklung

kombinierter hypophysär Hormonmangel verursacht durch Mutation in dem Pit-1 TF hypophysär Zwergwuchs, mentale Retardation

endokrine Syndromen testikuläre Feminisierung

keine funktionsfähige Androgenrezeptoren → männliche Phänotyp entwickelt sich nicht Vitamin-D-resistente hypophosphatämische Rachitis

Tumore onkogenische TF-en

z.B. Myc, Fos, Jun Tumorsuppressorproteine

z.B. p53, WT-1

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31. LIPID- UND PROTEINBIOSYNTHESE IM ENDOPLASMATISCHEN RETICULUM

Endoplasmatisches Reticulum rauhes und glattes endoplasmatisches Reticulum Fraktion von Mikrosomen cytoplasmatische und exoplasmatische Oberflächen Proteinsynthese am rauhen endoplasmatischen Reticulum (Abb. 31.1.) freie und gebundene Ribosomen Kotranslationaler Transport von Proteinen

N-terminale Signalssequenz Signalerkennungspartikel (SRP)

RNP-Partikel SRP-Rezeptor Translokationskanal Signalpeptidase Orientierung von Membranproteinen (Abb. 31.2.)

Abbildung 31.1. Synthese und Translokation von sekretorischen Proteinen in das endoplasmatisches

Reticulum.

Abbildung 31.2. Topologie von an dem endoplasmatischen Reticulum synthetisierte Membran-

proteine (a� Untereinheit von Insulinrezeptor; b. Transferrinrezeptor; c. Glucose-transportprotein; d. �-adrenerger Rezeptor

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Posttranslationale Modifikationen - Protein Glykosylierung - Bindung von Disulfidbindungen

im Lumen des endoplasmatischen Reticulum Protein-disulfid-isomerase (Abb. 31.3.)

- Stabilisierung der Konformation Chaperonproteine (z.B. BiP, Calnexin) Qualitätskontrolle Pathologischer Standpunkt (z.B. cystische Fibrose, familiär Hypercholesterolemia)

Abbildung 31.3. Umordnung von Disulfidbrücken durch Protein-Disulfid-Isomerase.

Lipidsynthese am glatten endoplasmatischen Reticulum Synthese von Phospholipiden (Abb. 31.4.)

in der cytoplasmatischer Schicht Translokation von Phospholipid Flippase Transport zu anderen Organellen:

- Vesikel Transport - Phospholipiden-Wechsel-Proteinen Synthese von Steroiden

Abbildung 31.4. Translocation der Phospholipiden an der Membran des endoplasmatischen

Reticulum.

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32. DER SEKRETORISCHER TRANSPORTWEG. PROTEINGLYCOSYLIERUNG UND

SORTIERUNG Sekretorischer Transportweg Vesikel Transport

Transport von sekretorischen, Membran- und Lysosomproteinen Kann bei Pulsemarkierung mit eine [3H]Aminosäure studiert werden →

Autoradiographie Lumen des endoplasmatischen Reticulum → Transportvesikeln→ cis-Golgi Zisternen→ medial Golgi-Zisternen → trans-Golgi-Zisternen→ trans-Golgi Netzwerk → Protein-Processierung → Sortierung

Sortierungssignals - Signalsequenz - Signalflecken - Oligosaccharide (z.B. Mannose-6-Phosphate → Lysosomen)

Sekretion (Abb. 32.1.)

Abbildung 32.1. Der sekretorische Weg: Formation von Lysosomen, regulierte und konstitutive

Sekretion. - regulierte

Sekretorische Granulumen Processierung (z.B. Proinsulin → Insulin)

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Exocytose z.B. Secretion des Insulins

- konstitutive z.B. extracelluläre Matrixproteine, Antikörpermoleküle

gezielte Sekretion (Abb. 32.2.) in polarizierten Zellen (apikale and basolaterale Membran) vektorieller Transport (z.B. transepithelialer Transport)

Abbildung 32.2. Vesicularer Transport in polarisierten Epithelzellen des Darmes. Proteinglycosylierung (Abb. 32.3.) = Addition der Oligosacchariden Glycosyl-Transferase Zucker-Nukleotid Komplexe

Abbildung 32.3. N-gekoppelte und O-gekoppelte Proteinglykosilierung.

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N-gekoppelt Glycosylierung (Abb. 32.4.) Dolichol → 2 N-Acetylglucosaminen + 9 Mannosen + 3 Glucosen → Oligosaccharid-

Proteintransferase → Glycosylierung an Asparagin → Oligosaccharid Processierung

mannosereich, komplex und hybrid Oligosacchariden (Abb. 32.5.)

O-gekoppelt Glycosylierung Glycosyl-Transferase

Abbildung 32.4. Die Oligosaccharidproteintransferase Reaktion.

Abbildung 32.5. Prozessierung von N-glykosidisch gebundener Oligosaccharid-Precursor während

Maturierung.

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33. DER ENDOCYTOTISCHER TRANSPORTWEG Vesiculärer Transport - sekretorischer Transportweg - endocytotischer Transportweg Endocytotischer Transportweg Das Geschick des aufgenommene Material (Abb. 33.1.)

Verdauung endocytotische Vesikel → Fusion mit primären Lysosomen → secundär Lysosom →

hydrolytische Degradation/Verdauung Speicherung

in Speicher-Vesikeln Transcytose

Endocytose → Exocytose an der anderer Seite der Zelle

Abbildung 33.1. Das Geschick von endocytotische Vesikeln: 1. Degradation; 2. Speicherung; 3.

Transcytose. Typen des Endocytose

Phagocytose Aufnahme der großen Partikeln, Viren, Bakterien usw.

Pinocytose Aufnahme der gelöster Molekülen unspezifische, nicht-reguliert

Rezeptorvermittelte Endocytose (Abb. 33.2.) z.B. Aufnahme der LDL-Partikeln

LDL = Low-Density-Lipoproteine Cholesterol-Ester + Phospholipid Monolayer + Apolipoprotein B (apoB)

LDL-Rezeptoren im clathrin-coated pit/clathrinbedeckte Mundle → LDL-Bindung → Endocytose → bedeckte (coated) vesikel → Abtrennung von Clathrin → frühes Endosom → LDL dissoziiert von seinem Rezeptor (Recyclisierung zur Zellmembran) →

Transport-Vesikel → LDL transportiert zum spätes Endosom → Fusion mit primären Lysosom → secundäres Lysosom

familiäre Hypercholesterolemie hereditär Defekt des LDL Receptors → hoch Serum LDL → Atheriosklerose

erworbene Hypercholesterolemie

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Abbildung 33.2. Rezeptor-vermittelte Endocytose von LDL-Partikeln. Der Mechanismus des vesiculären Transport

In beiden Richtungen (bidirectional) = anterograde und retrograde

Sortiersignale zielende Proteine

Komponenten des Transport Donorkompartiment → Knospung des bedecktes Transportvesikel (ARF Protein,

Adaptinproteinen) → Abtrennung der Decke (coat) → Fusion mit Acceptormembran (Zielmembran) (zielende Proteine, Fusionproteinen, Rab Proteinen)

Typen der bedeckten Vesikeln clathrinbedeckte (coated) Vesikeln

z.B. Rezeptorvermittelte Endocytose Formierung der Lysosomen

andere bedeckte Vesikeln z.B. COP-coated (coatomerbedeckte) Vesikeln

= coat Protein zwischen endoplasmatischen Reticulum und Golgi-Apparat

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Abbildung 33.3. Schritte des vesikulären Transports: 1. Bindung des „coated“ Vesikles von Donormembran; 2. Bildung von „coated“ Vesikel; 3. „Docking“ an der Zielorganelle; 4. Abtrennung der Hülle (coat); 5. Fusion von Vesikel mit der Akzeptormembran.

Abbildung 33.4. Protein von Membranfusion.

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34. DIE VERTEIDIGUNGSMECHANISMEN DER ZELLE

Biotransformation der Xenobiotika xenobiotika = Chemikalien mit nichtbiologischen Ursprung Cytochrom P450 System

heme Proteinen oxidative Enzymen in der Membran des endoplasmatischen Reticulum codient von einer Gen-Familie (CYP Genen)

Biotransformation Phase I: Hydroxylation der Moleküle → wachsende Wasserlöslichkeit Phase II: Konjugation mit Glucuronsäure, Schwefelsäure usw. → Excretion Epoxide-Formation → wachsende Giftigkeit, Mutagenigkeit → bösartige Transformation

der Zelle z.B. polycyclic aromatic hydrocarbons (Abb. 34.1.)

Induction der CYP Genen z.B. Phenobarbital Hypertrophie des glatten endoplasmatischen Reticulum

Abbildung 34.1. Verwandlung des polyzyklisches aromatisches Hydrocarbon Benzopyren zu

Karzinogen Metabolit. Lysosomen Typen der Lysosomen

primäre Lysosomen enthalten saure Hydrolasen (Phosphatase, Nuclease, Protease usw.) aktive Proton-Pumpe → pH 5

secundäre Lysosomen Fusion der primären Lysosomen mit Vesikeln Funktion der Lysosomen

Heterolysis Endo-, Phagocytose → Phagosom → + pr. Lysosomen → Phagolysosom

Autolysis Autophagolysosom → + pr. Lysosomen → sec. Lysosom Formation der Lysosomen

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rauhe endoplasmatische Reticulum → lysosomale Enzyme → N-gekoppelt Glycolysierung → Golgi-Apparat → Mannose-6-Phosphate (M6P)-Synthese → Bindung zu M6P-Rezeptor → clathrin-coated Vesikeln → primäre Lysosomen

N-Acetylglucosamin-phosphat

Mannose-6-phosphat

lysosomales Protein

Abbildung 34.2. Synthese von Mannose-6-Phosphate Sortirungsignal der lysosomales Enzyme.

Lysosomale Speicherkrankheiten specifischen lysosomalen Enzymdefizienzen

e.g. Gaucher Krankheit - Cerebrosidose Tay-Sachs Krankheit - Gangliosidose

I-Zell Krankheit = Abnormalität in M6P-Synthese oder M6P-Rezeptor Enzymsubstitution-Therapie Freie Radikalen Reactiv Oxygen Spezies (ROS)

z.B. Superoxidanionradikel, Wasserstoffperoxid, Hydroxyd-Radikal

Abbildung 34.3. Metabolismus und die Rolle der reaktive Oxygen „Species“ in Phagocytose. Phagocytose (Abb. 34.3.)

NADPH Oxidase → generiert Superoxidanionradikel

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Ras Protein chronische granulomatose Krankheit

abnormal NADPH Oxidase → Rekurrensinfektionen ROS-induzierter macromolekulärer Verlust

DNA Verlust → Mutationen, Carcinogenese Lipid Peroxidation → Membranverlust

Antioxidanten Enzymen

z.B. Superoxide-Dismutase (SOD), Catalase, Peroxidase Amyotrophische Lateral Sclerose

Kleine Moleküle (z.B. Vitamin C, Vitamin E, Karotene, Selen, etc.)

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35. DIE STRUKTUR UND FUNKTION DES MITOCHONDRIUMS Der Abbau der Glucose (Abbildung 35.1.) C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O 32 ATP Moleküle/Glucose Molekül werden produziert

3 Schritte: 1. Glykolyse Glucose → 2 Pyruvat Moleküle im Cytosol

2. Zitronensäurezyklus in dem Mitochondrium 3. oxidative Phosphorylierung

Abbildung 35.1. Die Struktur und metabolische Vorgänge des Mitochondriums.

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Struktur des Mitochondriums 2 Membrane, 2 Kompartimente Aussenmembran

Porin → bis zu 5000 Dalton durchlässig Intermembranraum Innenmembran

Cristae großer Cardiolipin-Gehalt → undurchlässig Proteine: - Transportproteine

z.B. H+/Pyruvat-Symporter, H+/Phosphat-Symporter, ADP/ATP-Antiporter

- Atmungskette = Elektronentransportkette

- ATP-Synthase mitochondriale Matrix

hochkonzentrierte Mischung von Enzymen Zitronensäurezyklus genetische Apparat

Energieumwandlung in Mitochondrien

Pyruvat → Acetyl-Coenzym A Zitronensäurezyklus (Citratzyklus)

Ac-CoA + Oxaloacetat → Zitronensäure → Zyklus Ergebnisse: GTP wird produziert

reduzierte Coenzyme (NADH, FADH2) werden hergestellt oxidative Phosphorylierung

chemiosmotische Kopplung (Chemiosmose) reduzierte Coenzyme → transportieren Elektronen zum Atmungskette →

elektrochemischen Protongradien entsteht (Spannungsgradient + pH-Gradient) → ATP-Synthase (F0F1-Komplex) → ATP

Abbildung 35.2. Elektrochemische Potenzialgradient durch die Innenmembrane

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Abbildung 35.3 Die Struktur der ATP-Synthase

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36. DIE MITOCHONDRIALE DNA Extrachromosomale DNA in Eukaryonten - mitochondriale DNA (mtDNA) - Chloroplasten-DNA (in Pflanzen) Endosymbiosis-Theorie Das genetische System der Mitochondrien mtDNA

kleine, zirkuläre, doppelsträngige DNA 2-10 Kopien/Mitochondrium H-Strang, L-Strang (heavy (H) und light (L) chain) meistens kodierende Sequenzen kodierende Sequenzen an beiden Ketten Gene kodieren für:2 rRNAn

22 tRNAn 13 mRNAn (kodieren für Untereinheiten der Atmungskette, ATP-

Synthase) symmetrische Transkription, kein Spleißen kein RNA-Import oder Export Proteinimport (kein Export) Groβe Mutationsrate (freie Radikale, keine Histone, keine Reparatur)

Abbildung 36.1. Genkarte der menschlichen mtDNA (rRNA Gene /schwarze Regionen/, für Protein

kodierende Gene /grau/ und tRNA Gene /markiert mit zugehörige Aminosäuren/ sind eingezeichnet)

Mitochondrial Proteinimport posttranslational bestimmt von Zielsteuerungssequenz

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Proteinsynthese on freie Polysomen → Bindung an signal-specifischen Chaperone → andere cytosolishe Chaperone → Bindung an Rezeptor in mitochondriale Aussenmembran → Transportkanäle → Import in die Matrix → Bindung von mitochondriale Chaperone → Spaltung durch Matrixprotease → „targeting“ zu specifischer Kompartiment (Matrix, Innenmembrane usw)

Abbildung 36.2. Proteinimport in die mitochondriale Matrix Mitochondriale Krankheiten Mutationen der mtDNA→ verminderte ATP-Produktion erbliche Krankheiten

mtDNA Mutationen in Keimzellen → mütterliches Vererbungsmuster Homoplasmie und Heteroplasmie z.B. Leber-Opticusatrophie

erworbene Krankheiten somatische mtDNA Mutationen → somatische Heteroplasmie z.B. Parkinson-Syndrom

Alzheimer-Krankheit Diabetes mellitus natürliche Alterung

mitochondriale Krankheiten hervorgeruft von Mutationen in nukleären Genen 99 % von mitochondrialen Proteine werden von nukleären Genen kodiert verminderte ATP-Produktion Mendelscher Vererbungsmuster

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