2. Theoretische Grundlagen - analytik.ethz.ch · planar TLC LSC BPC IEC SEC GC LC/TLC/HPLC . Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften

Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

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2. Theoretische Grundlagen 2.1 Typen von Trennmethoden

Trennung verschiedener Komponenten in der chemischen Analytik beruht auf Unterschieden in der Verteilung zwischen zwei Phasen und/oder in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase der zu trennenden Substanzen. Es werden bevorzugt eindimensionale Trennverfahren eingesetzt, bei denen eine Bewegung aller Komponenten in der gleichen Richtung erfolgt. Die folgenden Bewegungstypen sind relevant.

Elektrophorese (Kap. 5) Gaschromatographie Membrantrenn- Isoelektrische Fokussierung GC (Kap. 3) verfahren Isotachophorese Flüssigchromatographie Dialyse Kapillarzonenelektrophorese HPLC (Kap. 4) Elektrodialyse

Kombinierte Formen: Gelpermeationschromatographie Elektrokinetische Micellarchromatographie SDS-PAGE (Trägerelektrophorese)

Zweidimensionale Trennmethoden sind meist zwei zeitlich hintereinander geschaltete eindimensionale Trennungen. In der Polypeptidanalytik kommen z.B. häufig 2D–Elektrophoresemethoden zur Anwendung (Trennung nach Molmasse und isoelektrischem Punkt).

Trennkriterien: a) Kinetische Eigenschaften b) Gleichgewichtseigenschaften (Phasen- und Verteilungs-)

Oft liegt eine Kombination von a) und b) vor:

a) Trennmethoden unter Ausnutzung von kinetischen Eigenschaften: • Massenspektrometrie • Elektrophorese • Ultrazentrifuge • Enzymatischer Abbau • Trennverfahren mit porösen Membranen (Dialyse, Elektrodialyse, Gasdiffusion)

b) Trennmethoden unter Ausnutzung von Gleichgewichtseigenschaften • Phasengleichgewichte: Phasen gebildet durch zu trennende Komponenten (z.B.

Destillation) • Verteilungsgleichgewichte: Phasen enthalten zum grossen Teil Spezies, die nicht

zum zu trennenden Gemisch gehören (z.B. GC, HPLC).

Beweglichkeit

in Einzelphase

Gleichgewicht &

Beweglichkeit

Eindring-

geschwindigkeit

1 2 1 2 + + +

1

2 m

S

Verteilung

Adsorption/Desorption


8

Übersicht über verschiedene Trennmethoden

2.2 Chromatographie

Chromatographie ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, bei dem die zu trennenden Substanzen zwischen zwei Phasen verteilt werden, von denen die eine, die stationäre Phase, festliegt, während die andere, die mobile Phase, sich in einer bestimmten Richtung bewegt.

Ein sinnvolles Schema ergibt sich, wenn man die Gesamtheit der chromatographischen Techniken zunächst nach der eingesetzten mobilen Phase klassifiziert. Geht man von diesem Ansatz aus, so lässt sich die Chromatographie in die drei Hauptgebiete – Gaschromatographie (GC), überkritische Fluidchromatographie (SFC) und Flüssigchromatographie (LC) einteilen (siehe Schema).

Klassierung der verschiedenen chromatographischen Verfahren (MP: mobile Phase; SP: stationäre Phase)

Gas Überkritisches Fluid Flüssigkeit MP

flüssig SP

Form

Adsorbens

Gebundene Phase

SFC GSC GLC

fest

Säule Säule

Molekularsieb

Adsorbens

flüssig fest flüssig fest

Säule Säule Säule Säule Säule Säule planar

LLC

Adsorbens Gebundene Phase

Harz Gel

planar

TLC LSC BPC SEC IEC

GC LC/TLC/HPLC


9

Geschichtsübersicht über wichtige chromatographische Methoden

Mobile Phase

flüssig fluid gasförmig

fest Flüssig-Adsorptions-Chromatographie

Tswett, 1906, Kuhn, Winterstein, Lederer, 1931

Superkritisches- Fluid-Adsorptions-Chromatographie

Klesper, 1962 Rijnders, 1966 Novotny, 1981

Gas-Adsorptions-Chromatographie Ramsay, 1905 Cremer, 1951 Janak, 1953

Stationäre Phase

flüssig Flüssigkeits-Flüssigkeits-Chromatographie

Martin, Synge, 1941

Superkritisches-Fluid-Adsorptions-Chromatographie

Klesper, 1962

Gas-Adsorptions-Chromatographie James, Martin, 1952

2.3 Anschauliches Konzept für die Chromatographie:

Gedanklich kann man sich eine chromatographische Trennung als eine Reihe von diskreten Extraktionen vorstellen, bei denen sich die Analyten entsprechend ihrem Verteilungsgleichgewicht (Stoffkonstante) zwischen zwei Phasen verteilen. Vorraussetzung ist, dass sich die zwei Phasen nicht ineinander mischen. Phase 1 (z.B. Wasser) Phase 2 (z.B. organisches Lösungsmittel)

Sind zwei Analyten A und B (mit unterschiedlichem Verteilungsgleichgewicht) in unserem System, haben wir eine Trennung der beiden Analyten erreicht.


10

Eine vollständige Trennung von A und B kann mit einer einmaligen Extraktion nicht erreicht werden. Um eine bessere Trennung zu erreichen, können mehrere Extraktionen hintereinander durchgeführt werden.

=> Beliebige Wiederholungen

Dieses Konzept kann man sich nun kontinuierlich vorstellen:

Die Phasen müssen gegeneinander fliessen, sonst wird das System zu einer einzigen grossen Extraktionsstufe. Sie dürfen aber nicht zu schnell fliessen, damit lokal jeweils Gleichgewichte etabliert werden können. Diese Methode heisst Gegenfluss-Extraktion (Counter Current Extraction).

Da experimentell sehr aufwändig, wird die Gegenfluss-Extraktion jedoch nur selten angewendet. Viel praktikabler ist es, wenn Phase 2 fest statt flüssig ist. In einer solchen Anordnung fliesst eine Flüssigkeit (Phase 1) über die feste Phase 2, was technisch sehr leicht zu realisieren ist.

Definition der Chromatographie: • Physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen

einer feststehenden (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden.

• Im Idealfall verteilen sich alle zu trennenden Substanzen unterschiedlich zwischen den zwei Phasen.

Hauptanwendungen für chromatographische Methoden: • Analytische Anwendungen • Präparative Anwendungen


11

Grundarten der Chromatographie: • Säulenchromatographie • Planare Chromatographie

Prinzip der Chromatographie Alle chromatographischen Verfahren basieren auf einer wiederholten Einstellung des Gleichgewichts in mobiler und stationärer Phase und Transport durch mobile Phase.

Trennung eines Gemisches von A und B in einer Säulenchromatographie und das zeitabhängige Detektorsignal:

2.4 Einflussfaktoren in einem chromatographischen System

1. Der Verteilungskoeffizient K beschreibt das Verhältnis der Konzentrationen der Substanz A in der mobilen und der stationären Phase im thermodynamischen Gleichgewicht (Nernst–Verteilung).

stationäre Phase

(flüssig oder fest)

mobile Phase

(gas oder flüssig) Probe

tR

Transport durch mobile Phase

Stoffaustausch HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate)

Mobile Phase

A + B

B

A

A B

tM t

A t

B

B

A

Mobile Phase

Stationäre Phase

Stoffgemisch

M

!

KA

=A[ ]

S

A[ ]M

!

KM

= 0

KA

< KB

!

K =A[ ]

stationär

A[ ]mobil

[A]m

[A]s

Mobile Phase

Stationäre Phase

Nernst-Verteilung

einstufig


12

Darstellung des Multiextraktionsprozesses (Craig–Verteilung):

Falls verschiedene Substanzen in einem gegebenen chromatographischen System verschiedene K-Werte aufweisen, kann eine Trennung erreicht werden. 2. Die Retentionszeit tR beschreibt die Zeit, die eine Substanz braucht, um ein chromatographisches System zu durchlaufen.

Der erste Peak mit der Retentionszeit tM stellt eine Substanz dar, die von der stationären Phase nicht zurückgehalten wird. tM wird als Totzeit bezeichnet. 3. Der Kapazitätsfaktor k (oder Retentionsfaktor) beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit einer Substanz in der Säule.

€

k = K Vs

VM

=Kβ

(2.1a)

€

β =VM

Vs

(2.1b)

wobei K der Verteilungskoeffizient von A, Vs das Volumen der stationären Phase, VM das Volumen der mobilen Phase und β das Phasenverhältnis (LC, 2.1b) bedeuten.

€

k =tR − tMtM

=tR'

tM (2.2)

4. Der Trennfaktor (oder Selektivitätsfaktor) α beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit zweier Substanzen A und B relativ zueinander. α ist definiert als

K = 1

27.3% K = 1

80% K = 9

1.

2.

3.

9.

K = 0.1 80%

0.4% 3.1% 10.9% 21.9% 0 10 20

0

10

20

30

tR Retentionszeit

tR’ reduzierte

retentionszeit

tM Totzeit


13

€

α =KB

KA

(2.3a)

wobei nach Definition A immer jene Substanz ist, die schwächer zurückgehalten wird, sodass α immer grösser als 1 ist.

Ersetzen von KA und KB in Gleichung (2.3a) durch k oder tR’ erhält man eine Gleichung, die den Selektivitätsfaktor als Funktion der Retentionszeiten ausdrückt,

€

α =KB

KA

=kBkA

=tR'( )BtR'( )A

(2.3b)

wobei tR,B die Retentionszeit der Substenz B ist und tR,A die Retentionszeit der Substanz A.

Später in diesem Kapitel sehen wir, dass man α und k benutzen kann, um die Trennleistung einer chromatographischen Säule zu optimieren.

2.5 Effizienz einer chromatographischen Säule

Klassische Theorie Wir können das zu Beginn verwendete Bild der hintereinander geschalteten Extraktionen wieder verwenden, bei denen sich für jede Substanz jeweils das Verteilungsgleichgewicht zwischen den Phasen einstellt. Entsprechend diesem Konzept ist es erstrebenswert, wenn möglichst viele Extraktionen hintereinander durchgeführt werden, um eine möglichst vollständige Trennung zu erhalten. Diese theoretischen Extraktionen werden theoretische Böden N genannt, wobei die Effizienz einer Säule mit der Anzahl der theoretischen Böden N zunimmt.

Um N experimentell aus einem Chromatogramm zu bestimmen, müssen wir uns zuerst die Form eines typischen (idealen) Elutionspeaks in einem Chromatogramm ansehen.

tR ist die Retentionszeit, wb die Basispeakbreite, und σ die Standardabweichung. Für einen idealen gaussförmigen Peak gilt

€

w = 2w12

= 4σ (2.4) ➠

€

σ 2 =w2

16 (2.5)

σ2 nennt man Varianz und stellt ein Mass für die Breite des Peaks dar.

0.0

1.0

norm

iert

e S

ignalh

öhe h

0.607

wb = 4!

2!

0.500

0.134

0.882

4!

wh = 2.354!

!

x

!

y = y0" e

#x2

2$ 2

Idealer gaussförmiger Peak


14

Anzahl theoretischen Böden N und Bodenhöhe H

Die Effizienz einer chromatographischen Säule, ausgedrückt als Anzahl theoretischen Böden N, kann man definieren als

€

N =tR2

σ 2 (2.6a)

Da es oft nicht sehr praktisch ist, σ aus einem Chromatogramm abzulesen, kann man Gleichung (2.5) in (2.6a) einsetzten und erhält

€

N =16 tRw

2

(2.6b)

Die Anzahl der theoretischen Böden nimmt mit zunehmender Säulenlänge zu. Um unterschiedlich lange Säulen dennoch miteinander vergleichen zu können, wurde ein weiterer Parameter definiert, die Bodenhöhe H

€

H =LN

(2.7)

wobei L die Länge der Säule ist, die oft in mm angegeben wird.

2.6 Einfluss von kinetischen Säulenvariablen auf die Bodenhöhe H

In einem chromatographischen System fliesst die mobilen Phase fortlaufend über die stationären Phase, wodurch die Analyten von der mobilen Phase stets weiter getragen werden, bevor sich ein tatsächliches thermodynamisches Verteilungsgleichgewicht einstellen kann. Die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase hat daher einen entscheidenden Einfluss auf die Trenneffizienz einer Säule.

Kinetische Theorie – van-Deemter-Gleichung Mit der folgenden Gleichung kann die Änderung der Effizienz (ausgedrückt als H) in Abhängigkeit der Fliessgeschwindigkeit beschrieben werden (Van-Deemter-Gleichung, hier die modifizierte Form nach Hawkes). Die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase wird mit u bezeichnet.

€

H = A +Bu

+ C ⋅ u (2.8)

wobei A die Eddy-Diffusion, B die longitudinale Diffusion, u die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase, und C die Masstransfer zwischen den zwei Phasen bedeuten.

Der Term A, die Eddy-Diffusion, tritt nur bei gepackten Säulen auf. Wegen der Umwanderung des Analytmoleküls durch die Partikel des Packungsmaterials legen die Analyten unterschiedliche Weglänge zurück. Dieser Vorgang führt zu einer Bandenverbreitung, deren Ausmass von der Partikelgrösse sowie der Homogenität und Dichte der Säulenpackung abhängig.

(diese tritt nur bei gepackten Säulen auf)

Ausmass

Homogenität

Dichte 1

2

1 2


15

€

Bu

=2kDDM

u beschreibt die longitudinale Diffusion des Analyten vom Bandenzentrum

weg, wobei kD der konstante Labyrinthfaktor und DM der Diffusionskoeffizient des Analytmoleküls in der mobilen Phase sind. Dieser Term ist proportional zur Zeit, welche die Substanzen in der Säule verbringen, also umgekehrt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit in der Säule. Der Term ist vor allem in der Gaschromatographie wichtig.

Massentransfer-Effekte:

€

Cs ⋅ u + CM ⋅ u

Die Einstellung des Gleichgewichts zwischen mobiler und stationärer Phase wird vom Massentransfer der Analytmoleküle zwischen den zwei Phasen bestimmt. Man unterscheidet dabei den Anteil in der stationären und in der mobilen Phase.

Die Gleichgewichtseinstellung zwischen stationärer und mobiler Phase benötigt Zeit. Da die mobile Phase aber in Bewegung ist, kann sich der Gleichgewichtszustand nicht vollständig einstellen. Die Höhe eines theoretischen Bodens (HETP) wird dadurch vergrössert.

€

Cs ⋅ u beschreibt die Verzögerung des Massentransfers aufgrund von Eigenschaften der stationären Phase. Die Dicke der stationären Phase hat den weitaus wichtigsten Einfluss auf diesen Term, aber auch der Diffusionskoeffizient des Analyten in der stationären Phase spielt eine Rolle.

€

CM ⋅ u beschreibt den Massentransfer in der mobilen Phase und wird auch Wirbel-Diffusion genannt. Der Term beschreibt u. a. die unterschiedlichen Weglängen, welche die Analytmoleküle in der Säule zurückzulegen. Dieser Faktor ist weitgehend von der Strömungsgeschwindigkeit unabhängig. Er ist in der Flüssigchromatographie wichtig.

Graphische Darstellung der van-Deemter-Gleichung:

Gleichgewichts

einstellung

HETP

u


16

2.7 Auflösung

Die Auflösung (RS) zeigt an, wie gut die Peaks von zwei Substanzen voneinander getrennt sind. Sie kann direkt aus dem Chromatogramm berechnet werden. Eine hohe Auflösung erreicht man, wenn zwei Peaks möglichst weit auseinander liegen und eine scharfe Peakform aufweisen.

€

Rs =tR ,B − tR ,AwA

2+wB

2

(2.9)

Durch weitere Umformungen erhält man eine Beziehung, die RS als eine Funktion der Bodenzahl N, des Selektivitätsfaktors α und des Kapazitätsfaktors

€

kB beschreibt.

€

Rs =α −1α

⋅

kB1+ kB

⋅N4

(2.10)

Die Einflüsse von Trennfaktor (α), Retentionsfaktor (k) und Bodenzahl (N) auf die Auflösung (RS):

Optimale

Fliessgeschwindigkeit

Minimum

von H

Fliessgeschwindigkeit

der mobilen Phase u

Bodenhöhe

(H

) norm

iert

e S

ignalh

öhe h

tM

tA

tB

ZeitwA wB

B

A

!

tA

'

!

tB

'


17

2.8 Optimieren einer chromatographischen Methode

Bei praktischen Anwendungen ist es häufig wünschenswert, die Retentionszeiten zu verringern. Dabei muss jedoch dadurch geachtet werden, dass die Auflösung nicht zu klein wird.

Unter Zuhilfenahme obiger Definitionen kann man die Retentionszeit darstellen als

€

tR =16R2H

u⋅

αα −1

⋅1+ kB( )3

kB2 (2.11)

wobei u die Fliessgeschwindigkeit der mobilen Phase ist.

Aus den Gleichungen (2.10) und (2.11) ist ersichtlich, dass die beiden Parameter Rs und tR von α, k, N, und im Falle von tR auch noch von H abhängen. Alle diese Faktoren können optimiert werden.

N

!

k

R = 1.5

! "


18

α hängt von den Analyteigenschaften ab und kann u.a. verändert werden durch Variieren der Säulentemperatur, der stationären Phase (z.B. Veränderung der Polarität) oder mobilen Phase (z.B. Ändern des pH). Bei einer Veränderung der mobilen Phase kann oft eine bessere Selektivität erreicht werden, ohne dass die k-Werte sich wesentlich ändern.

k ist ein Parameter, der von der stationären Phase und dem Analyten abhängt. Oft erreicht man durch eine höhere Temperatur eine Erhöhung von k und damit eine bessere Auflösung. k-Werte >10 erhöhen die Auflösung Rs meist kaum mehr und haben nur noch eine verlängerte Retentionszeit zur Folge.

Oft ist eine Auflösung bei Kapazitätsfaktoren zwischen 5-10 ideal.

N kann durch die Länge der Säule oder durch die Bodenhöhe verändert werden (siehe unten und Diskussion der van-Deemter-Gleichung).

H wird stark beeinflusst durch die Flussgeschwindigkeit der mobilen Phase, sowie den Parametern, die in die van-Deemter-Gleichung einfliessen (Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen und stationären Phase, Dicke der stationären Phase und Teilchengrösse der Packung).

In der Praxis ist es oft üblich, die Bedingungen während eines chromatographischen Experiments zu ändern, da nicht alle Peaks bei den gleichen Bedingungen genügend

!

tR

=16R

S

2H

u"

#

# $1

%

& '

(

) * "1+ k

2( )3

k2

2

Retentionsfaktor k

Auflösung R

Retentionszeit tR

!

RS

=" #1

"

$

% &

'

( ) *

k2

1+ k2

*N

4

Minimaler H-Wert

Th

eo

retisch

e B

od

en

hö

he

H

!

H = 2" # dp +2kD #DM

u+ u #

f (dp2,dc

2)

DM

+q # k # d f

2

(1+ k)2DS

oder2td # k

(1+ k)2

$

% &

'

( )

optimale u

Minimum H

1.! Kapillarsäulen A = 0

2.! Optimale u => Minimum

der Terme B und C

3.! Dünne L-Filmdicke


19

getrennt werden können. So wird z.B. in der Gaschromatographie sehr häufig die Temperatur während eines Experiments laufend erhöht und in der Flüssigchromatographie die Zusammensetzung der mobilen Phase (sog. Gradientenelution).

Einfluss der verschiedenen Faktoren auf die Auflösung anhand eines Beispiels:

2.9 Nichtideale Elutionspeaks

Symmetrische, gaussförmige Elutionspeaks lassen sich in der praktischen Anwendung leider oft nicht erhalten. Abweichungen von der Gleichgewichtsverteilung zwischen mobiler und stationärer Phase haben eine nichtideale Peakform zur Folge, wie auf folgender Darstellung ersichtlich ist.

Lineare Isotherme (Idealfall): Konzentrationsunabhängige Verteilung zwischen mobiler und stationärer Phase. Folgen: Symmetrisches Signal; Retentionszeit nicht von injizierter Probenmenge beeinflusst

unvollständige

Auflösung

k erhöhen

N erhöhen

! erhöhen

Peaksymmetrie

Überlagerung und Reinheit Auflösung Trennleistung

Tailing Fronting


20

Tailing (häufig Normalfall) – überladene Säule mit Komponenten relativ niedriger Retention: Wegen Übersättigung der stationären Phase werden grosse Probenkonzentrationen zu wenig stark zurückgehalten. Folgen: Verschiebung des Peakmaximums in Richtung kleinerer Retention, asymmetrisches Signal und Verkürzung der Retentionszeit bei hohen Probenkonzentrationen.

Fronting (leading) – überladene Säule mit Komponenten relativ hoher Retention: Tritt z.B. dann auf, wenn grosse Mengen von Probekomponenten in der stationären Phase kondensieren. Folgen: Asymmetrisches Signal und eine Zunahme der Retentionszeit bei grossen Probenkonzentrationen.

2.10 Quantitative Methoden

Chromatographische Methoden hätten in den letzten Jahrzehnten wohl nicht die Wichtigkeit erlangt, wenn nicht sehr präzise quantitative Aussagen möglich wären. Man unterscheidet im wesentlichen drei Quantifizierungsmethoden: Die Quantifizierung mittels externem Standard, mittels internem Standard und die Standardaddition.

Externer Standard In den Analyseproben werden die Peakhöhen oder Peakflächen der zu quantifizierenden Substanzen ermittelt, die dann anhand der Kalibrationsgerade (Konzentration–Signalintensitäts–Beziehung) in Konzentrationen umgerechnet werden.

Ein Nachteil dieser Methode ist, dass die aufgetragenen Probemengen für die Standardproben und die Analyseproben genau übereinstimmen müssen. Da oft sehr kleine Mengen (µl) eingesetzt werden, kann dies zu grossen Fehlern führen.

Chromatogramm einer Probe!

Qualitativ! Quantitativ!

Strukturaufklärung! Identifizierung mit !bekanntem Stoff!

Kalibrieren!Kopplung mit IR, UV/Vis, NMR, MS!

Peakzuordnung!Fragmentierung!

Spektrendatenbank!

Retentionszeiten!Retentionsindizes!

selektiver Detektor!

mit externem Standard!mit internem Standard!

Standardaddition!

Mengenbestimmung!


21

Vom zu bestimmenden Stoff (Analyt) werden bekannte, verschieden konzentrierte Lösungen hergestellt, die als Standardproben dienen. Sie werden vermessen und zur Aufstellung der Kalibrierfunktion genutzt. Der Analytgehalt der Proben wird dann unter denselben Bedingungen wie die Standards gemessen und errechnet.

In den eigentlichen Proben können unter Umständen Störungen auftreten, welche die Elution, oder Detektion des Analyten beeinträchtigen, die aber in den Standardproben nicht vorhanden waren und somit auch in der Kalibrationsgerade nicht berücksichtigt werden konnten.

Interner Standard Bei dieser Methode werden den Standardproben eine oder mehrere zusätzliche Substanzen beigegeben, die man nicht in den Analyseproben erwartet (oft verwendet man markierte Verbindungen z.B. mit 13C–oder 2H-Atomen). Diese Substanzen nennt man Interne Standards.

Ein Beispiel: Bestimmung von Coffein in schwarzem Tee mittels HPLC. Standardlösung: 100 mgL–1 Coffein in Wasser als Stammlösung, 100 mgL–1 interner Standard Theophyllin. Probelösung: 1g Schwarzteepulver in 25 ml Theophyllin-Lösung kochen, durch einen Feinfilter reinigen und 100fach verdünnen.

Die Kalibrierstandards werden hergestellt, indem die Stammlösung des Coffeins verdünnt wird. Das Auffüllen mit Wasser wird erst nach der Zugabe des internen Standards zu allen Verdünnungen ausgeführt (beispielsweise: 80 µl Coffein-Stammlösung + 50 µl Theophyllin-Standardlösung + 870 µl Wasser = 1 ml Kalibrierstandard). Kalibrierstandards messen, Probe messen. Stets ist die Fläche unter dem Coffein-Peak und dem Theophyllin-Peak zur Auswertung heranzuziehen.

Für die Kalibrationsgerade wird nun das Verhältnis der Peakhöhen oder Peakfläche von Analyt und internem Standard gegen die Konzentration des Analyten aufgetragen, wobei

N

NN

N

O

O

CH3

CH3

H3C

N

NN

HN

O

O

CH3

H3C

Coffein Theophyllin

Externer Standard Interner Standard

[KS] A[KS] [IS] A[IS] A[KS]/A[IS]

KS 0 0 5 293 0

“ 4 212 5 307 0.690

“ 8 443 5 310 1.429

“ 12 650 5 309 2.103

“ 16 844 5 306 2.760

Probe ? 567 5 248 2.295


22

für alle Messungen der Kalibrationsgerade die Konzentration des internen Standards gleich gross ist und die Konzentration der zu quantifizierenden Substanzen variiert wird.

Zu den Analyseproben wird nun dieselbe Menge an Internem Standards zugegeben. Aus dem Verhältnis von Analyt und Internem Standard kann die gesuchte Konzentration des Analyten mit Hilfe der Kalibrationsgerade ermittelt werden. Diese Methode ist viel weniger anfällig auf Änderungen der Analysemengen.

€

AAnalyt

AIntS

= b + a ⋅CAnalyt (2.13)

Die Gehaltsberechung ergibt 33 mg⋅g–1.

Standardaddition Bei der Standardaddition werden mehrmals immer gleiche Probemengen von bekannten Konzentrationen des Analyten der Probe beigegeben.

Durch Extrapolation der Messkurve auf den Schnittpunkt der Konzentrationsachse kann die Konzentration der Probelösung bestimmt werden.

Blindwert Zu jeder quantitativen Bestimmung gehört neben der Konzentrationsbestimmung der Probe auch eine Bestimmung des Blindwertes, womit Spuren des Analyten im Lösungsmittel und weiteren Reagenzien (z.B. Puffer) bezeichnet werden, sowie Verunreinigungen, die durch die Aufbereitung in die Probe gelangen. Zur Bestimmung des Blindwertes wird die Konzentration des Analyten in einer sogenannten Blindprobe bestimmt, die genau gleich zusammengesetzt ist (Lösungsmittel, Standards, ev. weiter Zusätze) und aufgearbeitet wird wie eine echte Probe, jedoch keine Probelösung enthält. Die Analytkonzentration in der Blindprobe muss von der Konzentration der Probelösung abgezogen werden um ein korrektes Messergebnis zu erhalten.

!

AP

AP +IS

=CP

CP

+ CIS

!

AP +IS = A

P" (1+

CIS

CP

)

AP – Peakfläche der Probe

AP+IS – Peakfläche der Probe und

Standardzusatz

CP – [C] des Analyten in der

Probe

CIS – [C] des Analyten aus Zusatz

!

CIS

= 0,

!

AP +IS = A

P

!

AP +IS = 0,

!

CpC(internStandard)

Peakfläche


23

Zusammenfassung der quantitativen Analysen:

Methode Bemerkung Formula

identisch mit Analyt Kalibrierung mit externem Standard Analytenstandardlösung

€

A = A0 + f ⋅Cs tan dard

sehr ähnlich wie Analyt

Analytenstandardlösung Kalibrierung mit internem Standard

viele systematische Fehler wie Verluste bei Anreicherung-, Wäge- und Volumenfehler

€

AAnalyt

AIntS

= b + a ⋅CAnalyt

identisch mit Analyt Kalibrierung mit Standardaddition Analytenstandardlösung

€

AP

AP +IS

=CP

CP + CIS

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