3. Steriles Arbeiten• Risikogruppen entsprechen Schutzstufen, Vorsichtsmaßnahmen im

Labor richten sich nach diesen Stufen• beim Arbeiten mit unbekannten Mischkulturen sollte immer

mindestens von Schutzstufe 2 ausgegangen werden (v.a. beim Umgang mit Proben aus Boden, Abfall, Klärschlamm, …)

• (eher) unproblematisch (Stufe 1):– chemolitho-/phototrophe– psychro-/thermophile– acido-/alkaliphile Organismen

• ev. problematisch:– chemoorganotrophe Org.– Mesophile mit Opt. bei 37 °C– Arbeiten mit hohen Zellkonzentrationen– Aerosolbildung durch Ausglühen, Suspendieren, Rühren/Schütteln,

Aufschließen von Zellen,… - häufigste Ursache für Laborinfektionen

3. Steriles Arbeiten

• Grundregeln des sterilen Arbeitens– Arbeitsplatz:

• Luftzirkulation vermeiden (Fenster, Lüftung,…)• Arbeitsraum muss sauber sein (Böden, Ablagen, Arbeitsflächen)• Labor muss aufgeräumt sein/bleiben• vor und nach dem Arbeiten Arbeitsflächen desinfizieren (70% EtOH)

– Person:• Labormantel ist absolute Pflicht (beim Eintritt ins Labor an,

Verlassen aus): lange Ärmel, geschlossen• Haare zusammenbinden• Fingernägel kurz• Händedesinfektion beim Eintritt/Verlassen des Labors• Sprechen, Husten, Niesen vermeiden (ev. Maske)• keine Speisen, Getränke im Labor

3. Steriles Arbeiten

• Grundregeln des sterilen Arbeitens– Geräte, Mikroorganismen

• zügig und genau arbeiten, aber keine Hast• Pipettieren mit dem Mund ist untersagt• Aerosolbildung vermeiden (sprühen)• sterile Geräte auch steril halten• Gefäße nur so lange als unbedingt notwendig öffnen• Vorsicht mit Schimmelpilzkulturen (Sporen)• nicht mehr benötigte Kulturen sammeln und am Ende der Arbeit

beseitigen (autoklavieren)• kontaminiertes Material ebenfalls sammeln und ohne Kontamination

der Umgebung entsorgen (autoklavieren) – Becher bereit halten• bei der Arbeit mit Organismen der Klasse 2 ev. Einwegmaterialien/-

artikel verwenden• bei Hautkontakt sofort desinfizieren (v.a. Kl. 2)

3. Steriles Arbeiten

• die Sterilwerkbank – Laminar-Flow

3. Steriles Arbeiten

• die Sterilwerkbank – Laminar-Flow– HOSCH/HEPA-Filter: Hochleistungsschwebstoffluft-

filter / high efficiency particulate air filter– Abscheidegrad von 99,97% bei einer Teilchengröße

>0,3 µm: bei 10 000 Partikel passieren max. 3 das Filtersystem

– Werkbank je nach Risikostufe der verarbeiteten MO‘s– Systeme:

• reiner Personenschutz (ohne Materialschutz): Kl. 1• reiner Material bzw. Objektschutz• Personen und Materialschutz

3. Steriles Arbeiten

• die Sterilwerkbank – Laminar-Flow

3. Steriles Arbeiten

• die Sterilwerkbank – Laminar-Flow (LF)– Arbeitsregeln in der Sterilwerkbank:

• Luftzirkulation vermeiden (Fenster, Türen,…)• Ventilation des LF mind. 15 vor Arbeitsbeginn einschalten• Arbeitsbereich gründlich reinigen und desinfizieren (70%

EtOH)• EtOH bereit halten• Arbeitsgerät vor Arbeitsbeginn herrichten• Luftansaug-/ Ausblasschlitze freihalten• Becher für Abfälle vor Arbeitsbeginn bereitstellen• kein Schreibwerkzeug im LF• Kopf auf keinen Fall in den Arbeitsbereich stecken• nach Arbeitsende den LF ausräumen, kontaminierte Geräte

etc. und Arbeitsfläche desinfizieren

4. Kultivierung von MO‘s

• Nährmedien– zur Kultivierung von MO‘s braucht man ein

geeignetes Medium, das alle für den/die entsprechenden MO‘s notwendigen Stoffe in ausreichender Konzentration beinhaltet

– Nährstoffe (i.d.R.):• wasserlöslich• niedermolekular• Informationen über die Nährstoffansprüche einzelner MO‘s

findet man z.B. in Büchern wie „Handbook of Mikrobiological Media“oder „Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology“, „The Prokaryotes“

4. Kultivierung von MO

• Nährmedien (NM)– kein Universalmedium für alle MO– Unterscheidung:

• feste/flüssige NM: Nährboden/Nährlösung• synthetische/komplexe NM: chemisch exakt

definierte Bestanteile/komplexe Bestanteile• Minimal-/Vollmedium: absolutes Minimum an NS/

zusätzlich weitere Verbindungen• Universal-/Selektiv- NM: für ein breites

Artenspektrum/ begrenzte Anzahl an MO, ev. auch nur ein bestimmter MO

4. Kultivierung von MO

• Nährmedien (NM)– Unterscheidung:

• Differenzial NM:– meist Nährböden (fest)

– zur Unterscheidung von MO Gruppen

– durch den Zusatz von (zumeist) Farbstoffen wird eine bestimmte Stoffwechseleigenschaft eines MO angesprochen, mit der sich dieser von anderen unterscheiden lässt: Kolonien einer bestimmten Organismen-Art (Gruppe) bekommen eine spezielle Farbe, andere Arten werden gehemmt oder sind farblos – je nach Medium

– Bsp.: Triphenylmethanfarbstoffe (z.B. Kristallviolett, Fuchsin) hemmen Wachstum gram-positiver Bakterien

– v.a. in der medizinischen Diagnostik

4. Kultivierung von MO

• Nährmedien (NM)– Bsp. synth. Medium (Glc-Mineralsalz-NL)

• KH2PO4 0,5 g• NH4Cl 1,0 g• MgSO4 x 7 H2O 0,2 g• FeSO4 x 7 H2O 0,01 g• CaCl2 x 2 H2O 0,01 g• Glucose 10 g• Spurenelementlsg. 1 ml• Vitaminlsg. 1 ml• pH 7

– Bsp. Komplexmedium (Nährbouillon)• Pepton aus Fleisch 5 g• Fleischextrakt 3 g• pH 7

– Zur Herstellung von Nährböden werden ZUSÄTZLICH 15 bis 20 g Agar zugegeben

4. Kultivierung von MO

• Nährmedien (NM)– Differenzialnährboden: Endoagar

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Wasser

• 70 bis 85% der Zellmasse H2O

• dient als Lösungsmittel für alle anderen Medienbestandteile

• Reinheitsgrade für Laborwasser beachten– Leitfähigkeit– Widerstand– Gehalt an Silicat, Natrium, Ammonium, Calcium,

Kohlendioxid, Schwermetall, mikrobiol. Kontam.

4. Kultivierung von MO• Nährmedienbestandteile

– Wasser

4. Kultivierung von MO

– Wasseraufbereitung• Destillation• Deionisation (Entsalzung)

4. Kultivierung von MO

– Wasseraufbereitung• Umkehrosmose:

– Wasser wird mit Druck, der höher ist als osmotischer Druck, durch eine semipermeable Membran gepresst

• Reinstwasseranlagen (hochreines Wasser):– Spurenelementanalysen, HPLC, Molekularbiologie

– Kombination mehrer Verfahren

– bis zu 18 MOhm

– sollte sofort verbraucht werden, nimmt Stoffe aus der Umgebung sehr schnell auf (CO2, NH3, Kunststoffbestanteile)

• Voll- bzw. Komplexmedien mit A. deion.• Synth. Medien mit A. dest.

4. Kultivierung von MO

4. Kultivierung von MO

– Wasseraufbereitung• Umkehrosmose:

– Wasser wird mit Druck, der höher ist als osmotischer Druck, durch eine semipermeable Membran gepresst

• Reinstwasseranlagen (hochreines Wasser):– Spurenelementanalysen, HPLC, Molekularbiologie

– Kombination mehrer Verfahren

– bis zu 18 MOhm

– sollte sofort verbraucht werden, nimmt Stoffe aus der Umgebung sehr schnell auf (CO2, NH3, Kunststoffbestanteile)

• Voll- bzw. Komplexmedien mit A. deion.• Synth. Medien mit A. dest.

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Kohlenstoff- und Energiequellen:

• chemoorgano-heterotroph:– größte Gruppe von MO– Org. Verbindungen als Energiequelle– Oftmals nur eine C-Quelle im NM ausreichend– Pepton und Glukose am häufigsten verwendet– Zugabemenge je nach Fragestellung/Organismus

• lithoautotroph:– benötigen keine organischen C-Quellen– Energiegewinnung aus Licht = phototroph– Energiegewinnung aus anorg. Verbindungen (z.B. CO2)

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Stickstoffquellen:

• als N-Quelle meist NH4Cl verwendet

– Vorsicht bei hohen pH-Werten gast NH3 aus (z.B. beim Autoklavieren) – Verlust der Konz.

• Nitrat: manche Pilze, Cyanobakterien

• molekularer Stickstoff (N2): Stickstofffixierer (z.B. Azotobacter chroococcum auch in aeroben Milieu)

• Aminosäuren, Peptide als org. N-Quellen

– Schwefelquellen:• meist Sulfat (assimilatorische Schwefelreduktion – Anabol.)• Schwefelwasserstoff (z.B. Schwefelpurpurbakterien)

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Mineralstoffe

• Phosphor: meist mit anorganischen Phosphaten (z.B. KH2PO4), aber auch org.: Natriumglycerinphosphat (Hydrolyse: sterilfiltrieren!!!)

• Metallionen: K, Mg, Ca, Fe• Spurenelemente: Mn, Co, Cu, Mo, Zn; tw. Ni, B, Se, Wo (µM

bis nM Bereich)• für synthetische Medien• Herstellung von Spurenelementlsg.

– die Zugabereihenfolge beachten: Ausfällungen– sterilfiltrieren– ev. mit Chelatoren (z.B. Hydroxysäuren (Citrat)): bilden mit

zwei/dreiwertigen Metallionen stabile Komplexe: Eisencitrat– metabolisch inerte Komplexbildner: NTA, EDTA

(Ethylendiamintetraacetat)

4. Kultivierung von MO

• Nährmedien (NM)– Bsp. synth. Medium (Glc-Mineralsalz-NL)

• KH2PO4 0,5 g• NH4Cl 1,0 g• MgSO4 x 7 H2O 0,2 g• FeSO4 x 7 H2O 0,01 g• CaCl2 x 2 H2O 0,01 g• Glucose 10 g• Spurenelementlsg. 1 ml• Vitaminlösung 1 ml• pH 7

– Bsp. Komplexmedium (Nährbouillon)• Pepton aus Fleisch 5 g• Fleischextrakt 3 g• pH 7

– Zur Herstellung von Nährböden werden ZUSÄTZLICH 15 bis 20 g Agar zugegeben

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Wachstumsfaktoren

• Vitamine: Coenzyme und prosthetische Gruppen von Enzymen• Aminosäuren: Proteinaufbau• Purine und Pyrimidine: Nucleinsäuresynthese

– Verfestigungsmittel:• Agar:

– aus marinen Rotalgen (Naturprodukt)– am häufigsten eingesetzt– Zugabe 15 bis 20 g pro Liter: fest; für Weichagar: 8 g/l (überschichten)– verschiedene Reinheitsgrade beachten!!! Preis– löst sich nicht – muss aufgekocht werden (autoklavieren)– Agar bleibt nach dem Aufkochen bis ca. 45 °C flüssig und geliert dann– einmal erstarrt, bis 65 °C fest bleibend– durch erneutes Aufkochen wieder zu verflüssigen – nach und nach

Verlust der Gelstabilität– pH Wert!!!

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Verfestigungsmittel:

• Gellan:– aus Bakterien gewonnen: Sphingomonas

– Heteropolysaccharid

– Gelbildung mit Kationen (+) gelöster Salze

– geht bei ca. 90 °C in Lösung

– Gelbildung bei 40 bis 50 °C (je nach Konzentration)

– Zugabe: 6 bis 10 g/l

– geringere Abnahme der Gelstabilität als bei Agar

– niedriger vikos als Agar (Vorteil beim Pipettieren)

– hpts. für die Langzeitkultivierung eingesetzt

– für thermophile Inkubation (bis 80 °C) verwendbar

4. Kultivierung von MO

• Nährmedienbestandteile– Verfestigungsmittel:

• Gelatine:– aus tierischen Kollagenen (Säureaufschluss)– Zugabe 120 -150 g/l– geht bei ca. 50 °C in Lsg.– erstarrt bei ca. 23 °C und kann ab 25 °C wieder

verflüssigt werden (Inkubation nur bis 23°C)

• Kieselgel– frei von org. Bestandteilen– nur für Sonderfälle (z.B. Vitaminbedarfsbestimmung)

4. Kultivierung von MO

• pH Wert– jeder MO hat optimalen

pH-Bereich: Bsp. E. coli– Bakt: neutrales bis

alkalisches Milieu– Hefen u. Plize: schach

saures Milieu– bei Nährmedien muss der

pH-Wert immer eingestellt werden (Ausnahme: Fertignährböden)

– pH-Wert sinkt beim Autoklavieren meist um 0,2 bis 0,4 Eh

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00

pH

OD600