157

9. Zusammenfassung und Ausblick

Die Aldolreaktion spielt in der organischen Synthesechemie eine wichtige Rolle für

den Zugang zu industriellen Produkten im Großmaßstab aber auch zu

feinchemischen Vorstufen für die Pharmaindustrie. Insbesondere für letztere ist es

im Sinne einer ökonomischen und Ressourcen schonenden Synthese notwendig,

die Reaktionsprodukte reproduzierbar in enantiomerenangereicherter oder gar

enantiomerenreiner Form zu erhalten. Die Menge an einzusetzendem Katalysator

zum Erreichen möglichst schneller Umsetzungen spielt ebenfalls eine erhebliche

Rolle. Die Aldolreaktion ist in der klassischen organischen Synthese als entweder

säure- oder basenkatalysiert bekannt, ohne Gegenwart entweder der einen oder

der anderen Spezies verläuft die Reaktion unmerklich langsam oder sie läuft gar

nicht ab.

Es sind unterschiedliche Ansätze verfolgt worden, um die Aldolreaktion katalytisch

zu beschleunigen und stereoselektiv zu steuern. Sehr häufig werden beispielsweise

vorsynthetisierte Silylenolate in Gegenwart von Lewissäuren wie Titanchlorid in

wasserfreiem Dichlormethan oder THF bei -78°C umgesetzt (Mukaiyama, 1973) [12].

Eine Abwandlung ist die Enolisierung mit LDA (Lithiumdiisopropylamid) bei tiefen

Temperaturen. Verwendet werden außerdem Metalle wie Bor, Magnesium,

Aluminium, Zirconium, Rhodium, Cer, Molybdän, Rhenium, Cobalt, Eisen und Zink.

Andere Methoden bedienen sich nach der Reaktion abzuspaltenden Auxiliaren, wie

z.B. dem Evans-Oxazolidinon [15], des weiteren sind Shibasakis BINOL-Barium-

komplexe [16] oder dinucleare organische Zinkkomplexe nach Trost [17] als Methode

zur direkten Aldolreaktion verbreitet. Die dabei erforderlichen Bedingungen, wie

Abwesenheit von Wasser (auch aufwändig getrocknete Edukte) und tiefe

Temperaturen stellen hohe apparative Ansprüche bei der Durchführung der

Reaktion.

Die Verwendung von teilweise toxischen Metallen verursacht umwelttechnische

Probleme, des weiteren müssen die Metalle später aufwendig recyclisiert werden.

Die dabei üblichen Metallkatalysatoren werden daher zunehmend in neuerer Zeit

durch rein organische, also metallfreie Katalysatoren ersetzt. Ziel dabei ist es unter

anderem auch umweltpolitische Aspekte zu berücksichtigen, was nicht nur die

158

Katalysatoren angeht, sondern auch die verwendeten Reaktionsmedien,

Temperaturen und die Möglichkeit der Gegenwart von Wasser beinhaltet, des

weiteren die einfachere Abtrennbarkeit der Katalysatoren von Reaktionsgemischen

und der damit verbundenen Schonung der Umwelt aufgrund ihrer relativen

toxikologischen Unbedenklichkeit.

Zur Evaluierung der Eigenschaften neuer Katalysatoren für die Aldolkatalyse

wurden in dieser Arbeit eine Reihe nicht natürlicher Aminosäuren synthetisiert, die

als Monomere in Verbindung mit anderen natürlichen Aminosäuren wie L- und D-

Prolin, L-Dopamin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, 4-Trans-L-Hydroxyprolin und β-Alanin

zu Peptidkatalysatoren verknüpft wurden. Hierbei dienten verschiedene

Festphasen-Syntheseharze als Trägermedium während der Synthese nach

bewährten, gängigen und speziell angepassten Festphasen-Peptidsynthese-

protokollen. Eine Übersicht der verwendeten und nicht natürlichen Monomere gibt

Abb. 66 auf der nächsten Seite. Alle Verbindungen sind Abwandlungen von Tyrosin,

da erwartet wird, das die OH-Funktion und das aromatische π-System eine Rolle

bei der Aldol-Katalyse spielen. Diese wurden zunächst in Vortests an

verschiedenen Harzen zu Peptiden synthetisiert und in ihrer Eignung zur

enantioselektiven Aldolkatalyse untersucht, ebenso erfolgten Katalysetests der

freien Monomere (ohne Prolin) in Lösung, um die Konstellation der

Reaktionsvolumina, der erforderlichen zeitlichen Dimension solcher Katalysetests,

Methoden zur Ausbeutebestimmung und einzusetzende Substratmengen zu

ermitteln. Gleichzeitig erfolgten Katalysetests in Lösung und unter Einsatz

festphasengebundener Peptide mit Verwendung von L- und D-Prolin. Die

literaturbekannte Katalysereaktion des Prolins oder festphasengebundener

struktureller Analoga des Prolins dienten als Standard bezüglich Lösungsmittel,

Reaktionsdauer und dabei erzieltem Grad an Umsetzung und später nach

Evaluierung zuverlässiger NMR-Methoden unter Zuhilfenahme chiraler NMR-

Shiftreagenzien auch zur Ermittlung und Vergleich erzielter Enantiomeren-

überschüsse bei Katalyse durch eigene Peptide. Als Ausgangspunkt wurde

zunächst eine Peptidbibliothek mit insgesamt 110 verschiedenen Tri- und

Tetrapeptiden hergestellt, um dann nach geeigneten Kandidaten im Hinblick auf

den notwendigen Kompromiss zwischen Reaktionsdauer und Umsetzung an

Edukten zum erwünschten Produkt verbunden mit möglichst geringem Anteil an

Reaktionsnebenprodukten zu suchen.

159

Wesentliches Merkmal aller Peptidtypen der Bibliothek (Abb. 67) ist die

aminoterminal endständige Anordnung eines L- oder D-Prolylrestes, der das

katalytische Zentrum für die Reaktion bildet.

Weiteres Merkmal ist die carboxyterminale Position eines flexiblen β-Alanylrestes,

der als achiraler Linker die Verbindung vom Peptid zum Syntheseharz herstellt.

Abbildung 66: Von L-Tyrosin ausgehend synthetisierte und zum Aufbau einer Peptidbibliothek verwendete Monomere. Weitere Komponenten der Bibliothek sind L-Prolin und D-Prolin, L-Phenylalanin und β-Alanin als Linker zum Harz.

OH

CO2H

H2N

HH

L-Tyrosin (1)

OH

CO2H

H2N

HI

3-Iod-L-Tyrosin (2)

OH

CO2H

H2N

II

3,5-Diiod-L-Tyrosin (3)

OH

CO2H

H2N

HBr

3-Brom-L-Tyrosin (4)

OH

CO2H

H2N

BrBr

3,5-Dibrom-L-Tyrosin (5)

OH

CO2H

H2N

HO2N

3-Nitro-L-Tyrosin (6)

OH

CO2H

H2N

NO2O2N

3,5-Dinitro-L-Tyrosin (7)

OH

CO2H

H2N

BrI

3-Brom-5-Iod-L-Tyrosin (8)

OH

CO2H

H2N

NO2I

3-Iod-5-Nitro-L-Tyrosin (9)

OH

CO2H

H2N

NO2Br

3-Brom-5-Nitro-L-Tyrosin (10)

OH

CO2H

H2N

NH2I

3-Amino-5-Iod-L-Tyrosin (11)

OH

CO2H

H2N

NH2Br

3-Amino-5-Brom-L-Tyrosin (12)

OH

CO2H

H2N

NH2H

3-Amino-L-Tyrosin (13)

OH

CO2H

H2N

OHH

3-Hydroxy-L-Tyrosin (14)

160

Ergänzt wurde die Bibliothek durch den Einsatz von trans-Hydroxyprolin in

gewöhnlicher Peptidbindung und einige über eine Esterbrücke zum Hydroxyprolin

verknüpfte Depsipeptide in somit für Peptide ungewöhnlicher Bindungsform. Eine

solche Bibliothek kann enormen Umfang annehmen, erwähnt werden sollte hierbei,

dass die Bibliothek keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhebt und mit Rücksicht

auf den zu erwartenden Syntheseaufwand auch gar nicht will, da die Peptide ohne

Zuhilfenahme automatisierbarer Hilfsmittel wie Peptidsynthesizer komplett von

Hand hergestellt wurden.

Eine schematische Übersicht der synthetisierten Peptidvarianten gibt Abb. 67 auf

der nächsten Seite.

In der folgenden Aufzählung sind die in Abb. 67 aufgeführten und

gekennzeichneten Peptide in der für Peptidsequenzen üblichen Text-Schreibweise

angegeben. (modTyr steht hier für modifiziertes Tyrosin)

A. H-Pro-modTyr-β-Ala-Harz

B. H-Pro-Pro-modTyr-β-Ala-Harz

C. H-Pro-modTyr-Pro-β-Ala-Harz

D. H-Pro-modTyr-modTyr-β-Ala-Harz

E. H-L-Hyp-Pro-modTyr-β-Ala-Harz

F. H-Pro-Pro-β-Ala-Harz

G. H-Pro-(O)-Hyp-modTyr-β-Ala-Harz (Depsipeptid)

H. (H-Pro-modTyr-Pro)2-α,ε-Lys-β-Ala-Harz (verzweigtes Peptid)

Die Peptidtypen A-D (siehe dazu auch nächste Seite) stellen hierbei den Hauptteil

der Bibliothek dar. Peptidtyp E ist eine Erweiterung des Typs B und enthält nur

wenige Mitglieder.

Peptidtyp F dient zum Vergleich längerer und Tyrosin enthaltender Peptide mit rein

aliphatischen Peptiden.

Die Peptidtypen A, C und D beinhalten hierbei die Peptide mit den höchsten in

dieser Arbeit erzielten Enantiomerenüberschüssen.

161

Abbildung 67: In dieser Arbeit synthetisierte Peptidtypen. Die Peptidtypen A, C und D beinhalten die angegebenen Peptide mit den höchsten erreichten Enantiomerenüberschüssen bei Katalyse der Aldolreaktion von Aceton und p-Nitrobenzaldehyd dieser Arbeit.

O

HN*

NH

OH

O

NH

O

O

R2

R1

O

HN*

N

OH

O

NH

O

O

R2

R1

*

ONH

O

NH

O

ON *

O

OH

R2

R1

HN*

O

NH

O

NH

O

O

R2

R1 OH

HN

O

OHR1

R2

NH

*

O

NH

O

NH

O

O

R2

R1 OH

HN

O

N*

O

NH

HO

O

NH

O

O

R2

R1 OH

HN

O

NH

O*

O

NH

O

NH

O

O

HN

HN

O

N

N

O

O

NH

R2

OHR1

NH

HN

O

OHR1

R2

O

HN

O

NH

O

ON **

O

NH

A B

CD

E

F

G

H

z.B. P922-W

z.B. P11-WP31 (freies Peptid)

z.B. P902(freies Peptid)

162

Die festphasengebundenen Peptide wurden nach der Synthese für die

Katalysetests der Reaktion aus p-Nitrobenzaldehyd und Aceton als

Reaktionspartner und Lösungsmittel zugleich verwendet. Die Peptidharze wurden

mit Stammlösungen des Aldehyds und einer genau bemessenen Menge Aceton

versetzt, um einheitliche Bedingungen für die Reaktion zu gewährleisten. Nach

einer festgelegten Zeitspanne zur Reaktion konnte der Reaktionsfortschritt mittels

NMR durch Vergleich der Eduktsignale mit den Produktsignalen erfasst werden.

Die Auswertung zeigte sehr unterschiedliche Ausbeuten von Aldolprodukt

(zwischen 3 % und über 86 %) und ermöglichte eine Unterteilung in schnell

umsetzende und weniger schnell oder langsam umsetzende Peptid-Harze. Bei der

Katalyse spielten die beteiligten Monomere und die Sequenzen der Peptide eine

Rolle. Beispielsweise erwiesen sich Sequenzen mit Diiodtyrosin, Dinitrotyrosin und

L-Dopa als für schnelle Katalyse ungeeignet, wohingegen 3-Nitrotyrosin, 3-Brom-5-

Iodtyrosin und insbesondere 3-Iod-5-Nitrotyrosin in der Sequenz gute bis

hervorragende Umsetzungsraten ermöglichten. Neben 3-Iod-5-Nitrotyrosin und 3-

Nitrotyrosin in der Peptidsequenz erzielen insbesondere Peptide der Anordnung A,

C und D (siehe Abb. 67) hohe Umsetzungsraten, auch innerhalb eines

Sequenztyps lassen sich Tendenzen erkennen, je nach eingesetztem Monomer.

Für die Bestimmung von Enantiomerenüberschüssen wurden chirale NMR-

Verschiebungsreagenzien verwendet, da keine funktionsfähige chirale HPLC zur

Verfügung stand. Dies erforderte eine chromatographische Trennung reiner

Produkte von Hand bei etwa der Hälfte der synthetisierten Mitglieder der Bibliothek

und anschließenden stufenweisen Zusatz der chiralen Lanthanoiden-Shift-

reagenzien.

Die erreichten Enantiomerenüberschüsse reichen von 0 % Überschuss des einen

gegenüber dem anderen Enantiomer (Racemat) bis zu 56 % Überschuss für das R-

oder S-Aldolisomer. Bei festphasengebundenen Peptiden bewirkt aminoterminal

endständiges L-Prolin in der Regel die Entstehung des R-Aldols, bei D-Prolin ist es

genau umgekehrt. Bei racemischen Produktgemischen der Peptidkatalyse besteht

kein erkennbarer Zusammenhang mit der aminoterminal-endständigen Chiralität

der L-Prolyl- oder D-Prolylreste. Es gibt also sowohl endständig L-Prolin tragende,

das Racemat katalysierende Peptide, als auch endständig D-Prolin tragende

163

Peptide, die ein racemisches Produktgemisch katalysieren. Die Entstehung eines

bestimmten Enantiomerenverhältnisses wird demzufolge auch durch die Sequenz

und die verwendeten Tyrosinderivate stark mitbeeinflusst. Dies bestätigt sich auch

insbesondere durch Ausnahmen, bei denen Peptide mit endständigem L- und D-

Prolin bei ansonsten identischer Restsequenz dasselbe Aldolenantiomer erzeugen

können. Zu Ausnahmen siehe auch Abb. 70.

Sowohl in den Peptiden des Typs A, als auch in den Peptidtypen C und D finden

sich Sequenzen mit hohen Enantiomerenüberschüssen. Einige Beispiele sind in

Abb. 68 gezeigt. Die Länge der Peptide zeigt starke Variationen in der

Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber den erzielten Enantiomerenüberschüssen.

Ein allgemeiner Trend scheint zu sein, dass kürzere Peptide tendenziell höhere

Umsatzraten und etwas höhere Enantiomerenverhältnisse versprechen.

Eine Aldolkatalyse in Lösung sollten 28 zusätzlich an Polystyrol-Wang-Harz in

größerer Menge synthetisierte Peptide ermöglichen. Einige dieser Peptide

beinhalten neue Peptidequenzen, die eine Erweiterung der zuvor erzeugten

Bibliothek darstellen. Diese wurden nach der Synthese bis auf eine kleine

zurückbehaltene Menge für Festphasenkatalysetests vom Trägerharz abgespalten

und in Aldolkatalysetests in Lösung mit freien Peptiden eingesetzt. Bei

Katalysetests in Lösung gelangen Umsetzungen von 50 % bis über 96 % in 24 h

mit Enantiomerenüberschüssen von bis zu 57 % R-Aldol und bis zu 48 % S-Aldol.

Zwei Beispiele sind in Abb. 68 aufgeführt. Festphasengebundene Peptide

katalysieren die Reaktion vermutlich diffusionsbedingt erheblich langsamer,

erreichten jedoch bis zu 70 % R-Aldol und bis zu 62 % S-Aldolprodukt.

Somit lagen die erzielten Enantiomerenüberschüsse bei einigen Peptiden teilweise

erheblich über denen mit L-Prolin oder D-Prolin allein erreichbaren Werten.

Die Suche nach Peptidkatalysatoren für die Aldolreaktion, die das Prolin im Hinblick

auf Enantiomerenüberschüsse übertreffen, kann so als erfolgreich angesehen

werden.

Bei Vergleich der Enantiomerenüberschüsse und insbesondere des favorisiert

katalysierten Enantiomers festphasengebundener Peptide untereinander und im

Vergleich mit Katalysetests in Lösung fallen die Ergebnisse bei festphasen-

mediierter Aldolkatalyse übereinstimmend zusammen und unterscheiden sich

lediglich im Grad des erreichten Enantiomerenüberschusses. Katalysetests in

Lösung weisen dagegen bei 13 von 28 der getesteten Peptide eine Inversion des

164

favorisierten Enantiomers gegenüber der Festphase auf. Vergleiche hierzu Abb. 69

und Abb. 70. Ein besonders auffallendes Beispiel für den Einfluss der

Peptidsequenz und Chiralität auf die ee-Werte ist in Abb. 71 gezeigt, bei dem bei

unterschiedlichen Chiralitäten des endständigen Prolins in beiden Fällen bevorzugt

das R-Aldolprodukt gebildet wird.

Der Versuch, vom Harz abgespaltene Peptide durch Verestern mit Methanol und

Thionylchlorid in eine besser lösliche Form zu überführen und gleichzeitig die

Enantiomerenüberschüsse zu erhöhen war nicht erfolgreich.

Abbildung 68: Diese freien und festphasengebundenen Peptide zeigten die jeweils höchsten erzielten Enantiomerenüberschüsse bei Aldolkatalysereaktionen mit Aceton und p-Nitrobenzaldehyd. Dargestellt sind die Strukturen der Peptide, die Peptidnummer und die Peptidsequenz. Das freie Peptid P902 ist ein Beispiel für den Fall, dass bei endständigem L-Prolylrest dennoch das S-Aldolisomer katalysiert wird. Solche Abweichungen fanden sich bei 30 % der untersuchten Peptide. Ersetzt man bei P902 das Nitrotyrosin durch Phenylalanin, sinkt bei ebenfalls katalysiertem S-Isomer der Enantiomerenüberschuss auf nur 17 % S-Aldol. Dieser Umstand weist auf die Bedeutung einer aciden Tyrosyl-OH-Gruppe in der Aldolkatalyse hin.

O

HNN

H

OH

O

NH

O

O

I

NO2

O

NH

O

O

NO2

OH

HN

O

OHO2N

NH

O

NH

O

HNN

H

OH

O

NH

O

OH

NO2

O

NH

O

OHN

O

OH

NO2

HN

O

NH

P11L-W 70 % R

P31 57 % RP902 48 % S

P922-W 62 % S

H-D-Pro-3NT-3NT-β -Ala-Wang-Harz H-L-Pro-3I5NT-β -Ala-Wang-Harz

H-L-Pro-3NT-L-Pro-β -Ala-OH H-L-Pro-3NT-β -Ala-OH

165

Abbildung 69: Enantiomerenüberschüsse bei durch TG-Harz-gebundenen Peptiden gegen die ermittelten Enantiomerenüberschüsse durch Katalyse durch Wang-Harz gebundener Peptide. Eine Population des linken unteren und des rechten oberen Quadranten des gewählten Koordinatensystems bedeutet Übereinstimmung des favorisierten Enantiomers bei Katalyse durch die beiden jeweils an verschiedenen Harzen festphasengebundenen Peptide.

ee (Wang-Harz-Peptide)-40 -20 0 20 40 60 80

ee (T

G-H

arz-

Pep

tide)

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60P02-W P02-T P31-W P31-T P102-W P102-T P142-W P142-T P171-W P171-T P192-W P192-T P261-W P261-T P322-W P322-T P351-W P351-T P391-W P391-T P392-W P392-T P421-W P421-T P422-W P422-T P431-W P431-T P461-W P461-T P462-W P462-T

ee(R)

ee(S) ee(R)

Abbildung 70: Auftragung der erzielten Enantiomerenüberschüsse von freien Peptiden in Lösung gegen die erzielten Enantiomeren-überschüsse der entsprechenden am Wang-Harz gebundenen Peptide gleicher Sequenz. Etwa die Hälfte der untersuchten Peptide zeigt Unterschiede bei dem favorisiert katalysierten Enantiomer beim Übergang von festphasengebundenen Peptiden zu Peptiden in Lösung.

ee (Wang-Peptide)-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

ee (f

reie

Pep

tide)

-60

-40

-20

0

20

40

60

80P02-W P02 P31-W P31 P102-W P102 P142-W P142 P171-W P171 P192-W P192 P261-W P261 P322-W P322 P351-W P351 P391-W P391 P392-W P392 P421-W P421 P422-W P422 P431-W P431 P461-W P461 P462-W P462 P11L-W P11L P11D-W P11D P921-W P921 P922-W P922 P931-W P931 P932-W P932 P901-W P901 P902-W P902 P911-W P911 P912-W P912 PLL-W PLL

PDD-W PDD

ee(R)

ee(R)

ee(S)

166

Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit liegt in der Untersuchung der Kinetik von

peptidkatalysierten Aldolreaktionen. Hier wurde erstmals gezeigt, dass sich der

Reaktionsverlauf festphasengebundener und in Lösung befindlicher Peptide

während der Katalysereaktion bei Verwendung von deuteriertem Aceton als

Lösungsmittel (oder anderer deuterierter Lösungsmittel) mittels online-NMR

problemlos verfolgen lässt. Aufgrund von Löslichkeitsproblemen der Peptide bei

Katalysen in Lösung und der Schwierigkeit bei der Realisierung identischer

Reaktionsbedingungen aufgrund stark unterschiedlicher Löslichkeiten wurde mit

festphasengebundenen Peptiden gearbeitet. Obwohl die NMR-Messungen so

praktisch mit Peptidharz in Suspension erfolgten, konnten sehr gute NMR-Spektren

erhalten werden, die eine präzise Angabe über die Menge entstandenen

Aldolproduktes machen.

Die Katalysereaktion ist eine zweistufige Reaktion, die im ersten Schritt die Bildung

eines Enamins aus Aceton und der sekundären Aminogruppe des aminoterminalen

Prolylrestes beinhaltet. Der zweite Schritt der Reaktion ist dann der Angriff des p-

Nitrobenzaldehyds auf das Enamin. Da Aceton im riesigen Überschuss vorliegt, ist

anzunehmen, dass der Prolylrest in Enaminform vorliegt. Die Erfassung des

Umsatzes nach der Zeit eröffnete einen Zugang zu wichtigen kinetischen

Konstanten und eine Zuordnung eines kinetischen Modells aus der Enzymkinetik,

der Michaelis-Menten-Kinetik, bei der der eigentlichen Reaktion ein vorgelagertes

Abbildung 71: Zwei Peptidsequenzen,die sich nur in der Chiralität des endständigen Prolins unterscheiden. Dennoch katalysieren sie das gleiche Enantiomer des Aldolproduktes. Dies legt die Vermutung nahe, dass nicht nur Sequenz, sondern die individuell resultierende Sekundärstruktur erheblich mitbestimmend für das favorisierte Aldolenantiomer ist. Hier liegen wahrscheinlich starke strukturelle Ähnlichkeiten beider betrachteter Peptide vor.

O

HNN

H

OH

O

NH

O

OH

I

NO2

P11L 29 % R

H-L-Pro-3I5NT-β -Ala-OH

O

HNN

H

OH

O

NH

O

OH

I

NO2

P11D 45 % R

H-D-Pro-3I5NT-β -Ala-OH

167

Gleichgewicht im Sinne einer Vorkomplexierung voraus läuft. Es wurde für 6

Peptide, deren Katalyseleistungen herausragend waren, die Michaelis-Konstante

bestimmt, die eine Aussage über die Stärke der Assoziation oder Dissoziation

macht, indem die Entstehung der Aldolprodukte nach der Zeit bei 3 verschiedenen

Konzentrationen an Substrat ermittelt wurden. Zu den kinetisch relevanten

Auswertungen siehe Kap. 7 „Auswertung der Kinetikdaten“.

Aus den Kurvenverläufen wurde durch globale nichtlinare Regression für jedes

Peptid bei 3 Konzentrationen der Wert der Anfangsgeschwindigkeit ermittelt und in

verschiedenen Diagrammtypen in nichtlinearisierter und linearisierter Form

aufgetragen. Aus den linearisierten Auftragungen wurde jeweils die Michelis-

Konstante und die sich bei maximaler Sättigung an verfügbarem Substrat

einstellende Maximalgeschwindigkeit erhalten. Aus Km für verschiedene unter-

suchte Peptide folgt, dass die Reaktion über eine für jedes Peptid individuelle,

jedoch relativ geringe Assoziation ablaufen sollte, daher liegen die Konzentrationen

bei Substratsättigung mit 100-400 mM erheblich höher, als für die meisten Enzyme,

bei denen hier bestimmte Konzentrationswerte bereits weit über den physiologisch

anzutreffenden Werten liegen. Es konnten ebenfalls Werte für kcat, der Wechselzahl

oder turnover number, der katalytischen Effizienz kcat / Km und der spezifischen

Aktivität berechnet werden. Die gewonnen Werte wurden bezüglich der erhaltenen

Daten mit Literaturdaten aus Enzymdatenbanken (BRENDA) verglichen und

innerhalb dieser eingeordnet und diskutiert.

Die hier entwickelte und erstmals in der Organokatalyse eingesetzte online-NMR-

Methode zur nichtinvasiven Untersuchung reaktionskinetisch relevanter Vorgänge

bei laufenden Katalysereaktionen ermöglicht so relativ schnell eine Evaluierung der

katalytischen Eigenschaften neuer festphasengebundener Peptidkatalysatoren.

Vorteilhaft dabei ist bei einmal vorbereiteten Proben die Möglichkeit eines relativ

schnell möglichen Austausches der Substrate gegen davon abweichende

Mengenverhältnisse oder andere Substrate. Die einzige Einschränkung ist die

Notwendigkeit der Verwendung deuterierter Lösungsmittel. In verschiedenen

Lösungsmitteln können jedoch so auch Polaritätseinflüsse des Lösungsmittels auf

einfache Art und Weise mit erfasst und studiert werden.

Es wurde auch der Versuch unternommen, mittels einer Modellingstudie mögliche

geometrische Anordnungen verschiedener Peptide in bereits vorgenerierter

168

Enaminform zum Substrat p-Nitrobenzaldehyd zu ermitteln und mit ihrer Hilfe

Vorhersagen zur Enantioselektivität bei der Reaktion zu treffen, die hierbei

auftretenden Schwierigkeiten bei der Auswahl einer günstigen Ausgangsstruktur

wurde durch Vergleich mit bereits literaturbekannten Daten zum Teil verringert. So

konnten Houk et al. durch quantenchemische Berechnungen günstige Kon-

formationen der möglichen Übergangszustände von ungünstigen unterscheiden.

Diese Berechnungen wurden im wesentlichen jedoch an starren Systemen, wie

Prolin oder ähnlich unflexiblen Molekülen durchgeführt, was die Betrachtung

erheblich vereinfacht, da nicht aus verschiedenen möglichen Konformationen

selektiert werden muss. Rechnungen an Systemen ähnlicher Komplexität wie an in

dieser Arbeit vorliegenden Peptidkatalysatoren sind nach dem gegenwärtigen

Kenntnisstand bisher nicht durchgeführt worden. In Analogie zu den Arbeiten von

Houk et al. [77] wurde von einem präformierten Enamin ausgegangen, sowie die für

die Katalyse notwendige Gegenwart einer aciden Funktionalität in unmittelbarer

räumlicher Nähe zum Enamin. Diese unerlässliche Rolle, die bei Prolin von der

Carboxyfunktion übernommen wird, sollte hier vom modifizierten Tyrosin ausgeübt

werden, wobei zusätzliche sterische und elektrostatische Einflüsse der

aromatischen Substituenten eingebracht werden. Eine räumliche Nähe kann hier in

dieser Arbeit nicht nur durch bloße Nachbarschaft des Tyrosin-aryl-OH realisiert

werden, sondern auch konformationsbedingt durch in der Sequenz weiter entfernte

Tyrosyl-Reste. Die bei Peptiden auftretende Problematik erheblicher Unsicherheit

bei der Strukturvorhersage günstiger und ungünstiger Konformationen bei teilweise

nahezu identischen Energieunterschieden, insbesondere bei

festphasengebundenen und weniger bei freien Peptiden macht es schwierig,

analoge Ergebnisse zu erhalten. Die bei (relativ großen) Enzymen mit bekannten

(Kristall)-Strukturen übliche Methode des systematischen Dockings ist hier

aufgrund der unbekannten Bindungsstelle nicht möglich. Es wurden daher durch

systematische Konformationssuchen bei Freilassen und Variation aller relevanten

Torsionswinkel im Peptid eine Reihe durch das OPLS-Kraftfeld energieminimierter

Strukturen erhalten, unter denen diejenigen mit in Einklang mit der Hypothese der

räumlichen Nähe des Aryl-OH zum Enamin stehenden Strukturen selektiert wurden.

In diesen Strukturen wurden Abstände zwischen Enamin und Aryl-OH bestimmt und

mit Literaturwerten aus quantenchemischen Rechnungen verglichen. Ein Beispiel

ist in der Abb. 72 gezeigt. Die in Abb. 72 gezeigt Modellingstruktur kurz vor

169

Erreichen des Übergangszustandes führt zum experimentell gefundenen R-Aldol-

Enantiomer. Vernachlässigt wurde hier der Einfluss des Lösungsmittels, der

literaturbekannt ebenfalls einen starken Effekt bis zur Inversion der

Enantioselektivität haben kann [43], [44], [49].

Welche weiteren Forschungsprojekte ergeben sich aus der vorliegenden Arbeit ?

Einige Möglichkeiten sollen im folgenden aufgezeigt werden.

Aus der Enzymkinetik ist bekannt, dass das schlechteste Substrat für ein Enzym

geringere Michaelis-Konstanten zeigt, als das beste Substrat, gleichbedeutend mit

der Tatsache, dass die Struktur im Grundzustand nicht determinierend für die

Katalyse sein muss. Wahrscheinlicher ist, dass es sich um einen induktiven (und so

schlecht direkt messbaren) Effekt des induced fit handelt, der erst aus dem

Abbildung 72: Energieminimierte Struktur eines katalytisch aktiven Peptids P31.(Siehe Abb. 68 rechts unten) Der Angriff des Peptids P31 erfolgt hier aus der anti-enamin-Konformation des Enamins auf die re-Seite des p-Nitrobenzaldehyds und unter Beteiligung der Phenol-OH-Gruppe unter Ausbildung einer unterstützenden Wasserstoffbrücke. Die Situation mit den resultierenden Atomabständen ist kurz vor Entstehung des Übergangszustandes. Weitere Annäherung hätte bereits partielle Bindungsbildung und Bindungsbruch zur Folge. Kürzere Abstände lassen sich mit den üblichen Modellingprogrammen aufgrund vorgegebener van der Waals-Radien nicht realisieren.

170

entstehenden Enzym-Substrat-Komplex im Moment der Entstehung des

Übergangszustandes die eigentliche katalytisch aktive Spezies erzeugt. Dieser

Vorgang ist mit einer Konformationsänderung verbunden. Da solche Vorgänge stark

temperaturabhängig sein sollten, könnte eine Variation der Reaktionstemperatur in

mehreren Stufen und die damit verbundene Änderung von Reaktions-

geschwindigkeit und erzieltem Enantiomerenverhältnis das Verständnis solcher

Vorgänge verbessern. Eine Erweiterung dieses Themenbereiches wäre eine

Verwendung verschiedener, anderer Substrate für enaminkatalysierte Reaktionen,

sowie die Ausdehnung der Katalysetests auch auf andere Reaktionstypen, z.B.

Mannich-Reaktion.

Im Falle des Tyrosins können zusätzliche Untersuchungen, die eine Modifikation

der Tyrosyl-OH-Gruppe zum Ziel haben den Einfluss dieser Funktionalität zu tunen

und die Auswirkungen daraus zu ermitteln.

Zusätzlich wäre eine Modifikation an anderer Position des Tyrosins, zum Beispiel

durch Einbau größerer Gruppen an Position der Tyrosyl-β-Protonen mit der Folge

einer geringeren sterischen Freiheit des aromatischen Tyrosyl-Ringes denkbar.

Zukünftige Forschungen auf diesem Gebiet sollten neben dem Einsatz einer

schnellen chiralen HPLC, die den Experimentator von aufwändigen, sich ständig

wiederholenden Tätigkeiten entlastet, auch den Zusatz verschiedener löslicher

Additive zu den Reaktionsansätzen beinhalten. Der Zusatz komplexierender

Metallkationen, wie zum Beispiel löslicher Zinksalze sollte eine erhöhte strukturelle

Komplexität ermöglichen, die eine Steigerung der Enantiomerenausbeute und

vielleicht der Umsatzgeschwindigkeiten zur Folge haben kann. Auch der Einfluss

von unterschiedlichen Mengen Wasser auf die Katalysereaktion kann zu einer

Verbesserung der katalytischen Fähigkeiten führen, wie kürzlich von einigen

Arbeitsgruppen bei Aldolreaktion und anderen organokatalytisch durchgeführten

Reaktionen gezeigt wurde [84], [85], [86].

Eine weitere Möglichkeit schließt die Verwendung auf Naturstoffen basierender

möglichst preiswerter chiraler Additive ein, beispielsweise aus natürlichen

Aminosäuren gewonnene peraminomethylierte quartäre Ammoniumverbindungen,

deren besondere Eigenschaft zur Ausbildung starker π-aryl-Kation-

Wechselwirkungen als lösliches chirales Auxiliar für ansonsten festphasen-

gebundene katalytisch aktive Peptide dienen kann. Solche Wechselwirkungen sind

bei Acetylcholin mit den aromatischen Strukturbereichen von Tryptophan und

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Phenylalanin an der Bindungsstelle bekannt. Der Vorteil einer quartären

Ammoniumverbindung wäre eine relativ einfache Rückgewinnung des extrem

polaren Moleküls durch Ionenaustauschchromatographie. Dies wiegt die bekannte

Toxizität quartärer Ammoniumverbindungen durch Verwendung geschlossener

Kreisläufe vollständig auf. Die Edukte und Produkte der Aldolkatalyse sollten durch

ihre doch erheblich apolarere Natur einen solchen Reinigungsvorgang unverändert

überstehen und die Säule unbeeinflusst passieren können.

Ziel zukünftiger Untersuchungen können Systeme sein, die als primar katalytisch

aktives Zentrum kein endständiges Prolin tragen, sondern achirale lineare oder

cyclische sekundäre Amine beinhalten, so wäre auch der Einsatz von Foldamer-

teilen und Rotameren in der Struktur zum Erreichen einer sterischen Komplexität

denkbar.