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stadt, Bundesrepublik Deutschland) punktffrmig auf einem Kreisbogen (Radius 7 mm) um den Platten-Mittelpunkt aufge- tragen. Je Platte wurden 12 oder 24Proben im Winkelabstand von 30 ~ bzw. 15 ~ aufgebracht. Die Platten wurden in der Zir- kular-Entwicklungskammer (,,U-Kammer") der Fa. CAMAG durch 5-mint~tiges Begasen mit Stickstoff konditioniert und anschliel3end mit Isopropanol/Eisessig/Wasser = 45/5/15 (v/v/v) (Laufmittel A) bzw. 90/5/15 (v/v/v) (Laufmittel B) entwickelt.

Bei diesem Ger/it befindet sich der Fliel3mittelvorrat in einer Dosierspritze, die von einem Schrittmotor mittels eines Antriebs- hebels bet/itigt wird. Das Fliel3mittel wird aus der mit der Spritze verbundenen Capillare auf die Mitte der DC-Platte zugeffihrt, von woes sich radial ausbreitet und dabei die ringffrmig um den Plattenmittelpunkt aufgetragenen Proben in ihre Komponenten auftrennt. Die Flul~rate wurde auf 12gl/min eingestellt, das Gesamtvolumen des zu ffrdernden Laufmittels auf600 gl, so dab die Trennung nach 50 rain automatisch beendet wurde (Lauf- strecke der L6sungsmittelfront: 36mm).

Anffrbung und Auswertung. Nach Abtrocknen des Laufmittels wurden die Substanzflecken durch Iod-Bedampfung sichtbar gemacht [3] und sofort mit der Polaroid-Land-Kamera CU-5 im Durchlicht photographiert unter Verwendung der CAMAG ,,Reprostar"-Vorrichtung (Film: Land Typ 107, Blende 11, 60s Belichtung), da die Iod-Anf'~irbung bald verblal3t. Mit dem Densitometer KM 3 der Fa. Zeiss (Oberkochen, Bundesrepublik Deutschland) wurden die auf den Photos abgebildeten Substanz- flecken bei 500 nm in Remission gemessen (Spalt 0,05 mm). Das Mel3signal wurde von einem Analog-Schreiber aufgezeichnet.

Die quantitative Bestimmung der PIPES-Konzentration in den Enzym-Assay-Lfsungen [C(Pr.)] erfolgte durch Vergleich der Peakhfhen von Probe [H(Pr.)] und Standard [H(St.)]

H(Pr.) x C(St.) nach der Formel C (P r . ) - , wobei C(St.) die

H(St.) P1PES-Konzentration in der Standardl6sung ist.

Ergebnisse

Identifizierung der GOOD-Puffersubstanzen. Abbildung 1 A und 1 B zeigt die mit den beiden Laufmitteln erzielte Auftrennung der Puffersubstanzen. Eisessig wurde zur Vermeidung eines Tailing der Substanzflecken zugesetzt. Im Alkalischen (Ammo- niak statt Eisessig) wurde zwar eine Auftrennung der Substanzen erreicht. Die Flecken zeigten aber starkes Tailing, so dab quantitative Bestimmungen nur mit dem essigsauren Laufmittel mfglich sind.

Mit LaufmittelA nehmen die Rf-Werte (in Klammern) der Substanzen in der Reihenfolge HEPES (0,36), ADA (0,39), BICINE (0,46), PIPES (0,50), BES (0,52), MOPS (0,52), ACES (0,55), MES (0,61), TRICINE (0,63), TES (0,71), CHES (0,82) ZU.

Im unpolaren Laufmittel B werden die t~-Werte kleiner und die Reihenfolge/indert sich zum Tell:

ADA (0,17), HEPES (0,19), PIPES (0,20), BICINE (0,24), BES (0,26), MOPS (0,26), ACES (0,28), MES (0,35), TRICINE (0,37), TES (0,48), CHES (0,65).

Es gelang nicht, eine Beziehung zwischen der chemischen Struktur der Substanzen und ihrem verteilungs-chromatographi- schen Verhalten herzustellen. Im Laufmittel A wurden die Paare ADA/HEPES, BES/PIPES/MOPS und TRICINE/MES nicht getrennt.

Im Laufmittel B werden diese Paare mit Ausnahme von BES/MOPS und TRICINE/MES aufgetrennt. Die parallele Durchffihrung beider Trennungen erlaubt somit die eindeutige Identifizierung aller GOOD-Puffer fiber ihre Rf-Werte mit Ausnahme der letztgenannten Paare.

Quantitative Bestimmung yon PIPES. Das Diinnschicht-Chro- matogramm in Abb. 1 C (Abb. 1 D zeigt die Schreiber-Aufzeich- nung) diente zur Bestimmung des PIPES-Gehalts in einer Enzym-Assay-Lfsung. Die PIPES-Menge dieser Lfsung (3,9 mg/ml) liegt zwischen der der beiden Standardl6sungen (3,8 bzw. 4,0 mg/ml). Da die Eichkurve in diesem Bereich linear ist, sind die Peakh6hen der densitometrisch ausgewerteten Flecken den Substanzmengen proportional. Aufstocken der Probelfsung mit einer fiquivalenten Menge an Standardsubstanz ergab eine Wiederfindung von 102 % (n = 4). Die Probenmatrix st6rt also weder bei der Chromatographie noch bei der quantitativen Auswertung. Eine Probenvorbereitung ist nicht erforderlich. Der VK der quantitativen Bestimmung (4 ParalMwerte auf derselben Platte) liegt bei 1,5 %; der VK von Platte zu Platte bei 3 %. Die Nachweisgrenze ftir PIPES betrfigt 20 ng, das entspricht einer L6sung yon 100 gg/ml, wenn 200nl aufgetragen werden.

Literatur

1. Brimple TW (1981) Kontakte 81:37 2. Good NE u.a. (1966) Biochemistry 5:467 3. Kirchner JG, Thin-layer chromatography. J Wiley & Sons,

New York, 2nd ed, p 225 4. Zlatkis A~ Kaiser RE (1977) HPTLC - High performance

thin-layer chromatography. Elsevier Sci Publ Co, Amster- dam

B 48

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311:456-457 - �9 Springer-Verlag 1982

A Screening Method for Evaluation of Affinity Gels

B. Limbach and R. Helger

Biochemical Research Institute E. Merck, Frankfurter Strage 250, D-6100 Darmstadt, Federal Republic of Germany

Eine neue Sereeningmethode zur Beurteilung von Affinit/itsgelen

Affinity chromatography as a technique for the purification of enzymes is well established. Especially chromatography resins coupled with the triazine dyes known as Procion have been used for the separation of a wide range of proteins. These dyes are

capable of displaying a remarkable degree of specificity for a given enzyme. It has been shown [2] that by Small variations of the substituents in the dye molecule the affinity between enzyme and dye can be influenced distinctly. A great number of triazine dyes are available. Therefore, it is highly probable that one exists with a speclfic ligand for a special purification problem. On the other hand, it is difficult to predict the binding properties of an individual dye. Selection processes such as determination of the inhibitor constants or chromatographic experiments are time consuming.

Therefore, we tried to develop a simple screening method based on a batch procedure with affinity gels.

27 different Procion dyes (gift from ICI, Frankfurt) were covalently attached to agarose gel by usual methods [1]. The affinity gels were assayed batchwise in test tubes containing 1 ml of gel in 2 ml of buffer of different ionic strength; untreated

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"6 ~ LDH

MDH

~2g

I 2 3 ~ 5 6 7 @ 9 I011121314 1516171819 20 2122 23 2~ 25 26 27

affinity gel. No,

Fig. 1 Binding capacity of 27 agarose-Procion-gels for LDH and MDH in batch experiments

agarose gel served as a comparison material. The ionic strength was adjusted so that the untreated agarose showed only little binding capacity, whereas the affinity gels showed maximal differences in binding capacity. As buffer system, 0.02mol/l phosphate pH7.0 with addition of 0.05-0.3 mol/l NaC1 was used. Each gel was mixed with an enzyme solution (3 U/ml) and shaken for 1 h at 4~ After centrifugation the enzyme activity was measured in the supernatant. Under these conditions the gels investigated showed a binding capacity for the added enzyme from 0 - 90 %.

As an example, the separation of LDH (lactate dehydrogenase EC 1.1.1.28) from MDH (malate dehydrogenase EC 1.1.1.37) with affinity gels has been investigated. Figure 1 shows the binding capacity of 27 affinity gels for LDH and MDH under the described conditions. With most of the gels nearly equal binding capacities for both enzymes were measured, only a few showed differences big enough for the separation of the enzymes. With these gels chromatographic experiments were performed (25 ml column, 2,000 U enzyme activity, 0.05 mol/1 phosphate buffer pH 7.0, flow rate 12 ml/h). The results of these experiments and the batch experiments agreed well.

On gel No. 4 (agarose-Procion Blue HERD), for which in the batch experiment a high binding capacity for both enzymes was observed, 100% of LDH and MDH could be bound. With gel No. 6, (agarose-Procion Brown H4RD), a gel with a low binding capacity according to batch experiments, no binding of LDH and MDH was observed. With gel No. 16 (agarose-Procion Orange MX2R) a total separation could be obtained; LDH was bound to 100 %, whereas MDH was recovered by more than 95 % within 2h.

In a similar manner other enzymes were examined. These experiments confirmed the practicability of the described pro- cedure as a screening method for selecting affinity gels. The procedure is fast and easy to perform. It is possible to evaluate a great number of affinity gels in order to find out the optimal gel for a specific separation problem.

References 1. Dudman WF, Bishop CT (1968) Can J Chem 46:3079 2. Lowe CR, Hans M, Spibey N, Drabble WT (1980) Anal

Biochem 104: 23

B49

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311:457-458 - �9 Springer-Verlag 1982

Apparatur und Methode zur priiparativen Anreicherung von Testosteron-AntikOrpern mit Hilfe der Affinitiits-Chromatographie und elektrophoretischer Desorption

R. Palluk, R. Mtiller und M. Kempfle

Physiologisch-Chemisches Institut der Universitfit Bonn, Nugallee 11, D-5300 Bonn 1, Bundesrepublik Deutschland

Apparatus and Method for the Preparative Concentration of Antibodies to Testosterone by means of Affinity Chromatography and Electrophoretic Desorption

Die Anreicherung bzw. Isolierung yon bindenden Proteinen erscheint im Rahmen vieler Fragestellungen yon Bedeutung. Insbesondere beim fluorimetrischen Nachweis yon Wechselwir- kungen mit Liganden im homogenen System [6] (Bindungsstu- dien, Mengenbestimmungen) ist sie aus zwei Grfinden erforder- lich: Zum einen miissen ausreichend hohe Konzentrationen der bindenden Proteine erreicht werden, zum anderen st6rt in der Regel die Eigenfluorescenz der tibrigen Serumbestandteile [7].

Die spezifischste Form der Anreicherung yon bindenden Proteinen stellt die Affinitfits-Chromatographie dar. Dazu wird der ,,passende '~ Ligand an eine unl6sliche Matrix geknfipft. Der so immobilisierte Bindungspartner adsorbiert die bindenden Proteine spezifisch aus einer L6sung. St6rende Beimengungen werden eluiert und der Ligand anschliel3end desorbiert.

Aufgrund der hydrophoben Natur [8] und der hohen Affinitfit der Wechselwirkungen erweist sich diese Desorption im Falle

von Steroid-bindenden Antik6rpern als sehr schwierig. Konven- tionelle Methoden, wie pH-Verschiebung und kompetitive Ver- dr~ingung mit freiem Steroid versagen in der Regel. Chaotrope Reagentien, wie Trichloracetat, beeintr/ichtigen die Bindungs- eigenschaften der gewonnenen Antik6rper stark [6]. Einen Aus- weg bietet die elektrophoretische Desorption der Antik6rper vom Affinit~itssorbens [3, 4], die als schonende Methode gilt.

Wfihrend die Desorption analytischer Mengen von Antik6r- pern relativ problemlos erseheint [3, 4], bot die prS~parative Gewinnung jedoch noch Schwierigkeiten. Diese betreffen die Wahl der geeigneten Materialien, die zweckmfigige Auslegung der Apparatur und die erhebliche zeitliche Dauer der Desorption gr66erer Mengen affiner Antik6rper sowie die damit verbunde- nen thermischen und elektrochemischen Einflfisse.

Es wurden eine Apparatur (Abb. 1) sowie Verfahren zur schonenden elektrophoretischen Desorption pr/iparativer Men- gen yon Testosteron- und 5~-Dihydrotestosteron-Antik6rpern entwickelt. Die Anreicherung der Antik6rper erfolgte zum Zwecke der fluorimetrischen Untersuchung von Wechselwirkun- gen mit 4,6,8(14)-Androstatrien-3-on (6,8-Dehydrotestosteron) [6].

Als Matrix fiir das Affiniditssorbens diente Sepharose CL-6B. Nach Oxidation mit Natriumperiodat [2] erfolgte die Kupplung yon Hexamethylendiamin als Spacer dutch reduktive Aminie- rung mit Natriumcyanoborhyrid bei pH 4,5 [5]. Danach wurde 5c~-Dihydrotestosteron in methanolischer L6sung ebenfalls mit Natriumcyanoborhydrid gekuppelt.

Vor der Affinit~its-Chromatographie wurde das Antiserum filtriert und die 7-Globuline durch F/illung in 40 %ig gesS.ttigtem Ammoniumsulfat angereichert.