Abbildende Massenspektrometrie an

biologischen Proben

Bernhard Lendl

Institut für chemische Technologien und Analytik

– Motivation – Anwendungsbereiche

– Gerätetechnik (MALDI, SIMS, DESI) • Probennahme, Probenvorbereitung

• Messung

• Auswertetechniken

– Beispiele • Lipide

• Peptide/Proteine

– Zusammenfassung und Ausblick • Stärken/Schwächen

• Zukünftige Entwicklungen

Inhalt der Vorlesung

• Vermittlung eines grundlegenden Verständnisses über die Funktionsprinzipien moderner Techniken der abbildenden Massenspektrometrie

• Kennenlernen der Stärken/Schwächen der vorgestellten Techniken

• Beispiele sollen auch Interesse hervorrufen diese Techniken in der eigenen Forschung anwenden zu wollen

Ziele der Vorlesung

Motivation – Anwendungsbereiche

• Ortsaufgelöste Information bzgl. der chemischen Zusammensetzung einer biologischen Probe

• Massenspektrometrie: – Identifizierung von Atomen, kleinen und

großen Molekülen:

• Medikamente , Lipide, Peptide, Proteine, Metabolite, Polymere, Kohlenhydrate,...

– Markierungsfrei

• Anwendungsbereiche – Verständins von biochemischen Vorgängen in

biologischen Systemen

– Wirkstoffentwicklung und Wirkstofflokalisierung

– Medizinische Diagnostik

100 kDa

Historische Entwicklung analytischer Messgeräte

Protocols for Mass Microscopy, Ed. M. Setou, Springer 2010

S. Luxembourg, Anal. Chem. 2004, 76, 5339-5344

Experimentelle Realisierung

• MALDI (matrix assisted laser desorption ionisation)

• SIMS (secondary ion mass spectrometry)

• DESI (desorption electrospray ionisation)

Wichtigste MS Techniken für die bildgebende Analyse von biologischen Proben

MALDI SIMS DESI

Druck Vakuum Vakuum Atmospährendruck

Massenbereich < 40 kDa < 1 kDa < 5 kDa

Probenvorbereitung hoch mittel gering

Ortsauflösung ~10-20 µm Sub-µm bis 50 nm ~200 µm

MALDI

• Aufgabe der Matrix – Isolierung des Analyten durch Verdünnung, Verhinderung der Aggregatbildung

– Stabilisierung des Matrix-Analyt Co-Kristalls im Vakuum

– Absorption der Laserenergie

– Schonender Zerfall des Co-Kristalls

• Wichtige Matrixmaterialien – Sinapinsäure, SA (3,5-dimethoxy-4-hydroxy-Zimtsäure)

• Geringe Löslichkeit in H2O, löslich in MeOH/ H2O sowie in polaren org. LM

• Proteine (4-30 kDa), hohes S/N

– CHCA (a-Cyano-4-hydroxy-Zimtsäure) • Geringe Löslichkeit in H2O, löslich in MeOH/ H2O sowie in polaren org. LM

• Lipide und Peptide (~8 kDa)

– DHB (2,5-dihydroxy-Benzoesäure) • löslich in H2O, sowie in MeOH/ H2O u. polaren org. LM

• Qualität des Massenspektrums hängt von der „Qualität“ des Matrixkristalls ab

• Lipide und Peptide (~5 kDa)

MALDI – Time of Flight Mass Spectrometry

MALDI

DESORPTION

IONISIERUNG

BESCHLEUNIGUNG

TRENNUNG

Laser

Linear TOF

Linearer Modus DETEKTION

Reflectron Modus DETEKTION VERZÖGERTE EXTRAKTION (DELAYED EXTRACTION)

Unterschiede zu konventionellem MALDI

• Analyten liegen nicht getrennt vor

– Ionenunterdrückungseffekte

– Probenvorbehandlung oftmals notwendig

• Konzentrationsverhältnis Matrix/Analyt

• Nicht konstante Oberflächeneigenschaften

– Rauhigkeit

– Permitivität der Probe

Orthogonale MALDI - MS

• Apparative Trennung der Prozesse:

– Generation von Analytionen

– Massenanalyse

• zB.:

Beispiel zum Ionenunterdrückungseffekt

Probe jeweils 0.5 µl 100 nM ACTH Matrix: gesprayt 10 mg/ml a-CHCA in 50% ACN und 0.1% TFA

Protocols for Mass Microscopy, Ed. M. Setou, Springer 2010

ITO: Indium Tin Oxide (leitend)

Work flow für MALDI Imaging - Herausforderungen

Schritt Herausforderung – Ziele - Kommentare

Probennahme: dünne, gut erhaltenen (repräsentative) Probe

Kompatibilität mit Referenzmethoden (histologischen Untersuchungen) Unterbindung von post-mortem Enzymaktivität

Waschschritte Entfernung von Interferenten

Zugabe von Reagentien Erhöhung der Selektivität

MALDI Matrix Applikation Einlagerung des Analyten in den Kristall / Konzentrationsverhältnis Analyt/Matrix

Diffusion des Analyten – laterale Auflösung

Datenaufnahme Rasch, jedoch oft Minuten bis Stunden

Von Daten zur Information GB bis TB Datenmenge muss reduziert werden, multivariate Methoden

Abgleich mit Referenzinformation

Techniken zur Aufgabe der Matrix

• Makrodroplets (Pipette)

• Sprayen, manuell oder automatisch

• Sublimation

• Mikro/nanospotting (ChIP 1000)

Techniken zur Aufgabe der Matrix

• Makrodroplets (Pipette)

• Sprayen, manuell oder automatisch

• Sublimation

• Mikro/nanospotting (ChIP 1000)

Techniken zur Aufgabe der Matrix

• Makrodroplets (Pipette)

• Sprayen, manuell oder automatisch

• Sublimation

• Mikro/nanospotting (ChIP 1000)

Spray Nano

spotting Dried

droplet

defined

volume & pitch size

matrix droplet: 87pl

Courtesy of M. Marchetti-Deschmann, S. Fröhlich

Messabläufe

Extraktion des Gewebes

Schneiden des Gewebes

Waschen mit org. LM

Trocknen im Vakuum

Applikation der Matrix

Messung

Proteine, Peptide

Extraktion des Gewebes

Schneiden des Gewebes

Applikation der Matrix

Messung

Kl. Moleküle • Endogene Moleküle ( zB Lipide) • Exogene Lipide (zB Medikamente)

Applikation von Trypsin

Messung von Amyloid beta Peptiden in Mäsuehirnschnitten

• Matrix: SA in 70:30 ACN/0.1% TFA und 500 fmol/µl insulin (interner Standard)

Mech. Aging and Develop 126 (2005) 177

Parietallappen

Hinterhauptslappen

Proteine nach „enzymatischen Verdau“

• „Molecular Scanner Approach“ – Kombination von Elektroblotting mit Enzymverdau an trypsinhältiger

Membran

• Applikation von Trypsinlösung vor Aufgabe der Matrix

Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI TOF

FFPE

Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie

Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie

• IMS erlaubt das Auftrennen von Isobaren nach Substanzklassen sowie Konformeren

• Funktionsweise

Kombination von Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS) und bildgebender Massenspektrometrie

• IMS erlaubt das Auftrennen von Isobaren nach Substanzklassen sowie Konformeren

Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS

„Driftscope“

Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS

740

760

m/z

1040

1000

m/z

Drift time

Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS

Rattenhirn (FFPE) Gefriergetrocknetes menschliches Kleinhirn

Proteinidentifizierung und bildgebende Analyse von Geweben mittels MALDI - ion mobility - TOF - IMS

Verteilung von Phosphatidylcholinen in Mäusehirn

• Kein Waschschritt => Bildung von Na+, K+ Addukten

• Matrix: DHB, 20 mM Kaliumazetat 70% MeOH

J. Lipid Research 50 (2009) 1776

Verteilung von Phosphatidylcholinen (PCs) in Mäusehirn

• Lokalisierung der unterschiedlichen PCs korreliert mit definierten Bereichen unterschiedlicher Funktion

J. Lipid Research 50 (2009) 1776

Imaging mit TOF-SIMS

• Ursprüngliche Hauptanwendungsgebiete: Halbleiterindustrie, Mikrolelektronik,..

• Energetische Primärionen schlagen über Stosskaskade Material (Neutrale Moleküle, Cluster als auch Molekülionen) aus < 1 nm Probentiefe

J. Phys. Chem. B, Vol. 104, No. 29, 2000 http://www.geobiologie.uni-goettingen.de/people/vthiel/tof_sims/index_e.shtml

Imaging mit TOF-SIMS

• Emission von größeren, intakten Molekülen benötigt kollektive Bewegung der Probe (in MALDI der Matrix, in DESI der Flüssigkeit)

• Durch den Einschlag eines Primärions wird dieser Bereich geschädigt „damage cross-section“, bei 1013 Ionen/cm2 ist ~ 1% der Oberfläche betroffen => stationäre SIMS (bei Verwendung von einatomigen Primärionen)

• Neuerdings: Clusterionenquellen (Aun, Bin) oder polyatomige Primärionen (SF5/6), kürzlich auch C60

• Geringere Beeinflussung unterer Schichten

Beispiel: Beobachtung der Verschmelzung von Membranen von Tetrahymena (Protozoon)

50 µm 50 µm

m/z 69 (C5H9+) m/z 184

SEM Lichtmikroskop

2 µm

• Durch die hohe räumliche Auflösung (hier 200 nm) erlaubte SIMS imaging erstmals diesen Prozess beobachten zu können

Science 305(2004)71

Linescan

Beispiel: Beobachtung der Verschmelzung von Membranen von Tetrahymena (Protozoon)

Repr. Spektrum aus Körper

Repr. Spektrum aus Verbindungsbereich

3-dimesionales Imaging mittels TOF-SIMS einer unreifen Eizelle (Xenopus laevis Oozyte)

• Die Verwendung von C60 + Primärionen erlaubt schonendes Erodieren

• Xenopus laevis als Modellsystem (d.: 0.8-1.3 mm), hier Untersuchung der ersten 75 µm

• Trend zur kombinierten Verwednung von C60 + (nur zum Erodieren), und

LMIG (liquid metal ion guns, zB Bi3+) zum imagen

Current Opinion in Chemcial Biology 15 (2011) 733

Prinzip von Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry

• kann bei Normaldruck betrieben werden

• Je nach Analyt Wahl des LM Systems (MeOH:H2O, ACN:H2O)

• Einsatz: Lipidanalyse, Screening

Beispiel: Aufnahme von „latenten“ Fingerabdrücken

A Fingerabdruck von Kokain C „normaler“ Fingerabdruck

Science 2008 (321) 805

Die Autoren behaupten so auch überlagernde Fingerabdrücke noch lesen zu könnnen da man sich auf unterschiedliche m/z Werte konzentrieren kann.

Zusammenfassung

MALDI SIMS DESI

Druck Vakuum Vakuum Atmospährendruck

Massenbereich < 40 kDa < 1 kDa < 5 kDa

Probenvorbereitung hoch mittel gering

Ortsauflösung ~10-20 µm Sub-µm bis 50 nm ~200 µm

• Aufwendige, teure Gerätetechnik welche ortsaufgelöst die chemische Zusammensetzung einer biologischen Probe ermitteln kann

• Es können je nach gerätetechnischem Aufwand fast beliebig viele Moleküle identifiziert werden -> Qualitative Information

• Derzeit ist es jedoch noch schwer verläßliche quantitative Information zu erhalten

• Aus Daten muss Information und dann noch Wissen gewonnen werden

• Wichtige zukunftsweisende Techniken in der modernen (bio)chemischen und medizinischen Forschung

• Sehr dynamische Entwicklungen neuer Messgeräte