; dadurch ist die Empfindlichkeit besttigt. Der Test wre gltig (die Empfindlichkeit besttigt),wenn der Endpunkt zwischen 0,125 und 0,5 EU/mL (der Fehler der Methode) lge. Um einenEndpunkt von 0,125 EU/mL anzuzeigen, mu der Gehalt 0,06 EU/mL in der Serie vorhandenund negativ sein.

Bei Mehrfachbestimmungen wird die Empfindlichkeit als geometrischer Mittelwert (GM)der einzelnen Empfindlichkeiten ausgedrckt:

GM = Antilog [(e)/f]

wobei e = Summe der Log-Endpunkte und f = Anzahl der Endpunkte bei Mehrfach bestim-mungen ist.

Die LRW-Negativkontrolle sollte einen negativen Test ergeben. Wenn die Negativkontrollegerinnt, sind LRW, Glasbehlter oder Pyrotell kontaminiert. Die Mischung sollte klar sein undkeine erhhte Viskositt zeigen. Schneeflocken oder Ausflockung zeigen eine Endotoxin-Konzentration an, die geringer als die Pyrotell-Empfindlichkeit ist.

Ist keine Endotoxin-Reihe vorhanden (1), kann eine Positivkontrolle mitgefhrt werden. DiePositivkontrolle mit 2 entspricht dem Gehalt von 0,5 EU/mL im oben angefhrten Beispiel.Fllt die Positivkontrolle negativ aus, ist die Pyrotell-Empfindlichkeit geringer als die doppeltegekennzeichnete Empfindlichkeit, und der Test der Probe ist ungltig. Ein Verlust derEmpfindlichkeit kann darauf hindeuten, da das Pyrotell zerfallen ist, das Endotoxin an Aktivittverloren hat (oft aufgrund von Adsorption an die Behlteroberflche) oder der Test nicht ord-nungsgem durchgefhrt wurde.

Beispiel eines Grenzwert-Tests (Pass/Fail - Bestanden/Nicht bestanden)Es ist mglich, die Konzentration einer Probe durch die gegebene Empfindlichkeit von

Pyrotell zu bestimmen, wobei das Ergebnis anzeigt, ob die Test-Probe mehr oder wenigerEndotoxin enthlt als ihr Grenzwert angibt. In diesem Beispiel betrgt die Konzentration derProbe 1 mg/mL und der gewnschte bzw. vorherbestimmte Endotoxin-Grenzwert fr die Probebetrgt 3 EU/mg (siehe Abschnitt Beschrnkungen des Verfahrens). Der Grenzwert, in EU/mLausgedrckt,

(3 EU/mg) (1 mg/mL) = 3 EU/mL

ist hher als die Empfindlichkeit von Pyrotell, 0,25 EU/mL, weshalb die Probe verdnnt werdenmu, damit ein Pass/Fail-Test durchgefhrt werden kann. Die Verdnnung der Probe bestim-men, die ein Bestanden (< 3 EU/mL) oder Nicht bestanden (3 EU/mL) des Tests anzeigt,indem der Endotoxin-Grenzwert in EU/mL durch die Empfindlichkeit des LAL dividiert wird:

3 EU/mL : 0,25 EU/mL = 12.

Ein Teil Probe mit 11 Teilen LRW mischen, um eine Verdnnung von 1:12 zu erhalten, undden Test durchfhren. Das Ergebnis zeigt an, ob die Probe den Test bei einem Grenzwert von3 EU/mL besteht. Positive Produktkontrollen lt man mit derselben Verdnnung wie die Probemitlaufen, um falsch-negative Ergebnisse auszuschlieen.

Beispiel einer ProbenanalyseEndotoxin wird bei einer Analyse quantifiziert, indem der Endpunkt in einer Serie von

Probenverdnnungen bestimmt wird. Im folgenden Beispiel ist die Probe mit LRW verdnnt,und die Verdnnungen in der Tabelle werden getestet; ist 0,25 EU/mL. Die Ergebnisse werdenals positiv oder negativ verzeichnet.

Verdnnung der Untersuchungsprobe Testergebnisunverdnnt +1 : 2 +1 : 4 +1 : 8 1 : 16 1 : 32 Negativkontrolle

Um die Konzentration des Endotoxins in der Probe zu berechnen, die Pyrotell-Empfindlichkeit () durch den Kehrwert der Verdnnung am Endpunkt dividieren:

Konz. = () (4/1) = (0,25 EU/mL) (4) = 1 EU/mL

Die Konzentration der Mehrfachbestimmungen wird als geometrischer Mittelwert ausgedrckt.Eine positive Produktkontrolle (Untersuchungsprobe mit 2 Standard-Endotoxin versetzt)

mu vorhanden sein und positiv ausfallen, um falsch-negative Ergebnisse auszuschlieen.Wenn die positive Produktkontrolle negativ und die Positivkontrolle positiv ist, strt (hemmt)die Probe den LAL-Test. Die Probe sollte mit einer hheren Verdnnung erneut getestet werden(die MZV nicht berschreiten; siehe Abschnitt Beschrnkungen des Verfahrens).

Beschrnkungen des VerfahrensDas Verfahren wird durch die Fhigkeit von Proben beschrnkt, den LAL-Test zu hemmen

oder zu verstrken. Wenn das Verfahren bei einer Probenkonzentration (MVD) oberhalb derminimal zulssigen Konzentration (MZK) nicht validiert werden kann (1, 2), kann der LAL-Testnicht als Ersatz fr den USP-Pyrogentest dienen. Die MZK wird folgendermaen berechnet:

() (Dosis pro kg Krpergewicht)MZK = ________________________________

Endotoxin-Toleranzgrenze

wobei in EU/mL, die Dosis in Einheiten pro kg Krpergewicht und die Endotoxin-Toleranzgrenze in EU/kg angegeben werden.

Die maximal zulssige Verdnnung (MZV) ist die Verdnnung der Probe, die die MZK (1)enthlt. Dies ist die Ausgangskonzentration der Probe, dividiert durch die MZK.

Die Endotoxin-Toleranzgrenze (1) betrgt 0,2 EU/kg fr Arzneimittel, die intrathekalverabreicht werden, und 5 EU/kg fr alle anderen Parenteralia. Der Grenzwert frMedizinprodukte wird pro mL Extraktionsflssigkeit oder Splvolumen ausgedrckt, wie in derFDA-Richtlinie beschrieben (1). Bei Medizinprodukten, die mit Liquor cerebrospinalis inKontakt kommen, betrgt der Grenzwert 0,06 EU/mL; fr alle anderen Produkte betrgt derGrenzwert 0,5 EU/mL. Der Grenzwert fr flssige Medizinprodukte ist identisch mit dem frArzneimittel.

Trypsin verursacht falsch-positive Ergebnisse, es sei denn, es wird vor dem Test durchHitzebehandlung denaturiert. Stoffe wie Blut, Serum und Plasma sollten vor dem Test behandeltwerden, damit Inhibitoren inaktiviert werden (12).

Zu erwartende WerteEndotoxin kann quantifiziert werden, wenn die Konzentration hher als oder gleich der

Pyrotell-Empfindlichkeit ist. Aus biologischen Quellen gewonnene Stoffe knnen mebareEndotoxinmengen enthalten, sogar nach einer biochemischen Reinigung. Wasser, das mit Hilfevon Destillation, Umkehrosmose oder Ultrafiltration gewonnen wurde, enthlt u. U. wenigerEndotoxin als festgestellt werden kann, solange der Reinigungsvorgang ordnungsgemdurchgefhrt und das Wasser nicht nach der Herstellung kontaminiert wird.

Charakteristika der MethodeDie Fehlerbreite der Festgel-Methode betrgt plus oder minus einer zweifachen Verdnnung

am Endpunkt der Analyse.

Bibliographie1. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin

Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices. U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, Food and DrugAdministration, December 1987.

2. Bacterial Endotoxins Test, USP 26 NF 21. 2003. 3. Howell, W. H. 1885. Observations upon the chemical composition and coagulation of the

blood of Limulus polyphemus, Callinectes hastatus, and Cucumaria sp. Johns HopkinsUniversity Circular 43:4-5.

4. Bang, F. B. 1953. The toxic effect of a marine bacterium on Limulus and the formation ofblood clots. Biol Bull. (Woods Hole, MA) 105:361-362.

5. Levin, J., und F. B. Bang. 1964. A description of cellular coagulation in the Limulus. Bull. JohnsHopkins Hosp. 115:337-345.

6. Levin, J., und F. B. Bang. 1964. The role of endotoxin in the extracellular coagulation ofLimulus blood. Bull. Johns Hopkins Hosp. 115:265-274.

7. Levin, J., und F. B. Bang. 1968. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of itscoagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19:186-197.

8. Novitsky, T. J. 1984. Discovery to Commercialization: The blood of the horseshoe crab.Oceanus 27:13-18.

9. Progress in Clinical and Biological Research Vol. 231, Detection of Bacterial Endotoxins withthe Limulus Amebocyte Lysate Test. 1987. Watson, S. W., J. Levin, und T. J. Novitsky (Hrsg.),Alan R. Liss, Inc., NY.

10. Tsuji, K. und S. J. Harrison. 1978. Dry-heat destruction of lipopolysaccharide: Dry-heatdestruction kinetics. Appl. Environ. Microbiol. 36:715.

11. Sweet, B. H. und J. F. Huxsoll. Depyrogenation by dry heat, ch. 12, p. 101-108. In:Depyrogenation, Technical Report No. 7, 1985. Parenteral Drug Association, Inc.,Philadelphia, PA.

12. Gould, M. C. Endotoxin in vertebrate cell culture: Its measurement and significance, p. 125-136. In: Uses and Standardization of Vertebrate Cell Cultures, In Vitro Monograph number 5,1984. Tissue Culture Association, Gaithersburg, MD.

Unsere erfahrenen Mitarbeiter besprechen gerne mit Ihnen die praktischen und theoretischenAspekte des LAL-Tests. Bitte rufen Sie an, wenn bei der Benutzung von Pyrotell Schwierigkeitenauftreten. Wir leisten Ersatz fr alle Produkte, die nicht den Produktspezifikationenentsprechen. Vor der Rcksendung des Produkts mssen wir jedoch informiert werden.

Italiano

LISATO DI AMEBOCITI DI LIMULUSPYROTELL

Fiala multitestper il rilevamento e la quantificazione di endotossine

batteriche Gram-negative (lipopolisaccaridi)

Il saggio del lisato di amebociti di Limulus (LAL), qualora utilizzato in conformit con ledirettive (1) della Food and Drug Administration (FDA) statunitense, pu sostituire il saggio deipirogeni (test della febbre dei conigli), riconosciuto dalla Farmacopea Statunitense (USP), pertestare prodotti finiti quali i farmaci iniettabili nelluomo (inclusi i prodotti biologici), farmaciiniettabili negli animali e presidi medici. Il LAL test viene raccomandato per quantificare la pre-senza di endotossine nelle materie prime utilizzate in produzione, inclusa lacqua, e per moni-torare i livelli delle endotossine in processo. Lesame delle endotossine batteriche (2) dellaFarmacopea Statunitense (USP Bacterial Endotoxins Test) il test ufficiale di riferimento nellemonografie specifiche della Farmacopea Statunitense.

Riassunto del testIl lisato di amebociti di Limulus un estratto acquoso proveniente dalle cellule sanguigne

(amebociti) del granchio a ferro di cavallo, Limulus polyphemus. Il LAL test viene eseguitoaggiungendo 0,1 mL di Pyrotell ricostituito a 0,1 mL di campione da esaminare allinterno di unaprovetta da saggio in vetro flint (soda calcica) da 10