Analyse des MSH6-Gens bei Familien mit erblichem ... · Aus der Abteilung für Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. J. T. Epplen Analyse des MSH6-Gens

Aus der Abteilung für Humangenetik

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. J. T. Epplen

Analyse des MSH6-Gens bei Familien mit erblichem Dickdarmkarzinom

(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC) mittels direkter Sequenzier- und DHPLC-Analyse

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Judith Kötting geb. Vieland

aus Schwerte

2006

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. J.T. Epplen Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. B. Eiben Tag der Mündlichen Prüfung: 25.01.2007

Für Carsten

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG ...............................................................................................1

1.1 ERBLICHES DICKDARMKARZINOM (HEREDITARY NON-POLYPOSIS

COLORECTAL CANCER, HNPCC, LYNCH-SYNDROM)............................................1

1.1.1 Klinische Diagnosestellung............................................................1

1.1.2 Epidemiologie ................................................................................4

1.1.3 Prävention .....................................................................................4

1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN...................................................5

1.2.1 MSH6-Genlocus ............................................................................6

1.2.2 Mismatch repair (MMR-) Enzyme ..................................................6

1.2.3 Pathogenese .................................................................................7

1.3 MOLEKULARGENETISCHE LABORDIAGNOSTIK .............................................8

1.3.1 Mikrosatelliteninstabilität................................................................8

1.3.2 Immunhistochemie.......................................................................12

1.3.3 Keimbahnmutationssuche ...........................................................13

1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT......................................................................14

2 MATERIAL UND METHODEN...................................................................15

2.1 PATIENTEN ...........................................................................................15

2.2 MATERIAL .............................................................................................15

2.2.1 Chemikalien.................................................................................15

2.2.2 Lösungen.....................................................................................16

2.2.3 Kits...............................................................................................17

2.2.4 Verbrauchsmaterialien.................................................................18

2.2.5 Geräte..........................................................................................19

2.2.6 Größenstandard...........................................................................19

2.2.7 DNA .............................................................................................19

2.2.8 Oligonukleotide ............................................................................19

2.3 METHODEN...........................................................................................22

2.3.1 DNA-Amplifikation mittels PCR....................................................22

2.3.1.1 PCR-Bedingungen................................................................22

2.3.1.2 Agarosegelelektrophorese....................................................26

2.3.2 Sequenzier-Analyse.....................................................................26

2.3.2.1 DNA-Elution..........................................................................26

Inhaltsverzeichnis

2.3.2.2 Sequenzier-PCR...................................................................27

2.3.2.3 Äthanol-Präzipitation ............................................................27

2.3.2.4 Sequenziergel.......................................................................28

2.3.3 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ........28

2.3.3.1 Prinzip ..................................................................................28

2.3.3.2 Theoretische Schmelzkurve .................................................29

2.3.3.3 Universalgradient..................................................................30

2.3.3.4 Feineinstellung und endgültige Analysebedingungen...........31

2.3.3.5 Probenanalyse......................................................................32

3 ERGEBNISSE............................................................................................33

3.1 METHODEN...........................................................................................33

3.1.1 Sequenzierung.............................................................................33

3.1.2 WAVE™-Einstellungen................................................................33

3.2 POLYMORPHISMEN ................................................................................35

3.2.1 Polymorphismus c.540C>T..........................................................35

3.2.2 Polymorphismus c.3646+31InsATCT ..........................................36

3.2.3 Weitere Polymorphismen.............................................................37

3.3 MUTATIONEN ........................................................................................39

3.3.1 Familie BO-0503-3.......................................................................40

3.3.2 Familie BO-0509-4.......................................................................42

3.3.3 Familie BO-0540-2.......................................................................45

3.3.4 Familie BO-0613-4.......................................................................47

4 DISKUSSION.............................................................................................51

4.1 SCREENING VERSUS DIREKTE SEQUENZIER-ANALYSE...............................51

4.1.1 Verschiedene Screening-Verfahren.............................................51

4.1.2 Zeitersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse...............51

4.1.3 Kostenersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse .........52

4.1.4 Faktoren beim Etablieren der Analysebedingungen ....................53

4.1.5 Anfälligkeit für Störfaktoren..........................................................55

4.1.6 Nachweis einer Sequenzänderung im DHPLC-Verfahren ...........57

4.1.7 Sensitivität und Spezifität.............................................................59

4.2 KRANKHEITSVERLÄUFE ..........................................................................59

4.2.1 Geringere Penetranz und höheres Erkrankungsalter von Patienten

mit Mutation im MSH6-Gen .........................................................60

Inhaltsverzeichnis

4.2.2 Krankheitsverläufe der untersuchten HNPCC-Patienten .............61

4.2.3 Patienten ohne Mutationsnachweis .............................................61

4.2.4 Mikrosatelliteninstabilität..............................................................62

4.2.5 Immunhistochemie.......................................................................63

5 AUSBLICK .................................................................................................65

6 ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................66

7 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................67

8 Anhang.......................................................................................................74

8.1 FAMILIEN OHNE MUTATIONSNACHWEIS ....................................................74

8.1.1 Familie BO-0549-9.......................................................................74

8.1.2 Familie BO-0634-3.......................................................................76

8.1.3 Familie BO-0541-4.......................................................................78

8.1.4 Familie BO-0629-9.......................................................................79

8.1.5 Familie BO-0531-0.......................................................................80

8.1.6 Familie BO-0613-4, Verwandtschaft von BO-0676-0...................81

9 DANKSAGUNG .........................................................................................83

10 LEBENSLAUF............................................................................................84

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung

ABI Applied Biosystems Incorporated

APS Ammoniumperoxydisulfat

AS Aminosäure

B Bethesda-Kriterium

BDT Big Dye Terminator

bp Basenpaare

Br Bethesda-Kriterium (überarbeitet)

c Codon

°C Grad Celsius

ca. circa

COPD chronic obstructive pulmonary disease chronisch-obstruktive

Lungenerkrankung

CRC kolorektales Karzinom

d Desoxyribo-

dd Didesoxyribo-

DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography

Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

DNA Desoxyribonukleinsäure

dup Duplikation

ED Erstdiagnose

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. und andere

F vorwärts

fs frame shift

g Gramm; Erdbeschleunigung

HNPCC Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer

IDL insertion-deletion-loop Insertions-Deletions-Schleife

Ins Insertion

is in situ

l Liter

M molar


m Milli (10-3)-; Meter

min Minute(n)

MLH Mut L Homolog

MMR mismatch repair

mRNA messenger Ribonukleinsäure

MS Mikrosatelliten

MSI Mikrosatelliteninstabilität

MSI-H MSI-high

MSI-L MSI-low

MSH Mut S Homolog

MSS Mikrosatellitenstabil

MYH Mut Y Homolog

μ Mikro (10-6)-

N normal

n nano (10-9)-

neg. negativ

p kurzer Arm eines Chromosoms; pico (10-12)-; Protein

p. A. pro Analysi

PAA Polyacrylamid

path. pathologisch

PCR polymerase chain reaction Polymerasekettenreaktion

PMS post-meiotic segregation

pos. positiv

q langer Arm eines Chromosoms

R rückwärts

rez. rezidivierend

s. siehe

sec Sekunden

Sol. Solution, Lösung

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

Tab. Tabelle

Taq Thermophilus aquaticus

Tbc Tuberkulose

TBE Tris-Borat/EDTA


TEAA Triethylammonium-Kationen

TEMED Tetramethyldiamin

Temp. Temperatur

TM Schmelztemperatur

™ geschützter Markenname

Tris Trishydroxymethylaminomethan

U unit

UV Ultraviolett

V Volt

v. a. vor allem

(w/v) weight per volume, Gewicht pro Volumen

z. B. zum Beispiel

Nukleobasen/Nukleotide:

A Adenin/Adenosin

C Cytosin/Cytidin

G Guanin/Guanidin

T Thymin/Thymidin

N beliebige(s) Nukleobase/Nukleotid

NTP Nukleosidtriphosphat

ATP Adenosintriphosphat

CTP Cytidintriphosphat

GTP Guanosintriphosphat

TTP Thymidintriphosphat

Einleitung 1

1 EINLEITUNG

1.1 ERBLICHES DICKDARMKARZINOM (HEREDITARY NON-POLYPOSIS

COLORECTAL CANCER, HNPCC, LYNCH-SYNDROM)

Das von Henry Lynch et al. 1966 (Lynch et al., 1966) erstbeschriebene

hereditäre kolorektale Karzinom (CRC) ohne Polyposis stellt mit ca. 1-3% aller

kolorektalen Karzinome die häufigste Entität der monogen vererbten

Dickdarmkrebserkrankungen dar (Cunningham et al., 2001; Lynch and de la

Chapelle, 2003; Hendriks et al., 2004). Der autosomal-dominante Erbgang hat

eine unvollständige Penetranz mit Manifestation im Erwachsenenalter. Nicht

selten finden sich bei den Betroffenen synchrone oder metachrone

Zweitkarzinome des Kolons und Rektums. Bei den kolorektalen Tumoren

handelt es sich häufig um muzinöse oder siegelringzellige Adenokarzinome mit

entzündlicher Infiltration, welche bevorzugt im rechten Hemikolon lokalisiert

sind. Daneben gibt es auch extrakolonische Tumormanifestationen vor allem in

Endometrium, Dünndarm, ableitenden Harnwegen, Magen, hepatobiliärem

System, Ovar, Hirn und Niere (Deutsche Krebshilfe, 2003; Watson and Lynch,

1993; Umar et al., 2004).

1.1.1 Klinische Diagnosestellung

Zur klinischen Diagnosestellung wurden 1990 die Amsterdam-Kriterien für

HNPCC eingeführt (Vasen et al., 1994). Die klassischen Amsterdam-I-Kriterien

(s. Tab. 1.1.1.1) umfassen nur CRC, während die Amsterdam-II-Kriterien (s.

Tab. 1.1.1.2) auch extrakolonische Tumore einschließen (Vasen et al., 1999).

Da nicht alle Familien mit nachgewiesener Keimbahnmutation, v. a. Klein-

familien, die sehr strengen Amsterdam-Kriterien erfüllen, wurde ein erweiterter

Kriterienkatalog definiert, die Bethesda-Kriterien (Rodriguez-Bigas and

Srivastava, 1998) (s. Tab. 1.1.1.3), die 2004 überarbeitet wurden (Umar et al.,

2004) (s. Tab. 1.1.1.4). Zur Diagnosestellung wird bei den Bethesda-Kriterien

auch eine Mikrosatelliteninstabilität gefordert.

Einleitung 2

Tabelle 1.1.1.1 Amsterdam-I-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein)

Tabelle 1.1.1.2 Amsterdam-II-Kriterien (alle Kriterien müssen erfüllt sein)

1. mindestens drei Familienangehörige mit histologisch gesichertem kolorektalem

Karzinom

2. einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen

3. Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen

4. mindestens ein Patient mit der Diagnose des kolorektalen Karzinoms vor dem

50. Lebensjahr

5. Ausschluss einer familiären adenomatösen Polyposis

1. mindestens drei Familienangehörige mit HNPCC-assoziiertem Karzinom

(Kolon/Rektum, Endometrium, Dünndarm, Nierenbecken/Ureter)

2. einer davon Verwandter ersten Grades der beiden anderen

3. Erkrankungen in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Generationen

4. mindestens ein Patient mit der Diagnose eines Karzinoms vor dem 50.

Lebensjahr

5. Ausschluss einer familiären adenomatösen Polyposis

Einleitung 3

Tabelle 1.1.1.3 Bethesda-Kriterien:

Personen, deren Tumoren auf genomische Instabilität zu prüfen sind.

1. positive Familienanamnese entsprechend den Amsterdam-Kriterien

2. synchrone/metachrone Kolon-/Rektumkarzinome oder HNPCC-assoziierte

Karzinomerkrankungen (Endometrium, Nierenbecken/Ureter, Dünndarm,

Magen, Ovar, hepatobiliäres System)

3. zwei erstgradig verwandte Familienmitglieder mit Kolon- und/oder Rektum-

karzinom und/oder HNPCC-assoziierter Tumorerkrankung (einer <45 Jahre)

und/oder Adenom des Kolons oder Rektums vor dem 40. Lebensjahr

4. Kolon-/Endometriumkarzinom vor dem 45. Lebensjahr

5. undifferenziertes rechtsseitiges Kolonkarzinom (solid/cribriform) vor dem 45.

Lebensjahr

6. siegelringzelliges Kolonkarzinom vor dem 45. Lebensjahr

7. Adenom des Kolons oder Rektums vor dem 40. Lebensjahr

Tabelle 1.1.1.4 Überarbeitete Bethesda Kriterien

Der Status der Mikrosatelliten sollte bei Tumoren bestimmt werden bei folgenden

Konstellationen.

1. Auftreten eines kolorektales Karzinom vor dem 50. Lebensjahr

2. Syn- oder metachrones kolorektales Karzinom oder andere HNPCC-assoziierte

Tumore (ohne Altersbegrenzung) ¹

3. Kolorektales Karzinom mit MSI-H-typischer Morphologie vor dem 60.

Lebensjahr²

4. Kolorektales Karzinom und ein oder mehrere erstgradige Verwandte mit

kolorektalem Karzinom oder HNPCC-assoziiertem Tumor, wobei ein Karzinom

vor dem 50. Lebensjahr oder ein Adenom vor dem 40. Lebensjahr aufgetreten

ist

5. Kolorektales Karzinom und zwei oder mehrere Verwandte mit kolorektalem

Karzinom oder HNPCC-assoziiertem Tumor (ohne Altersbegrenzung)

¹HNPCC-assoziiert: Tumoren des Kolon/Rektum, Endometrium, Magen, Ovar,

Pankreas, Ureter, Nierenbecken, Gallengangssystem, Gehirn, Talgdrüsentumoren,

Tumoren des kleinen Becken und Keratoakanthome

²Tumorinfiltrierende Lymphozyten, Crohn's like Lesions, muzinöse oder

siegelringzellige Differenzierung, medulläres Karzinom

Einleitung 4

1.1.2 Epidemiologie

Das CRC ist in der westlichen Gesellschaft die dritthäufigste Todesursache

durch maligne Neoplasien mit einem Kumulativrisiko in der

Allgemeinbevölkerung von 2-4% mit 70 Lebensjahren (Landis et al., 1999;

Wijnen et al., 1998). In 35% der Fälle spielen erbliche Einflüsse eine Rolle

(Lichtenstein et al., 2000), jedoch kann nur bei 5-6% der Patienten mit CRC ein

hereditäres Syndrom mit monogenem Erbgang verantwortlich gemacht werden.

Zu diesen Syndromen zählen u.a. die familiäre adenomatöse Polyposis, die

juvenile Polyposis, das Peutz-Jeghers-Syndrom, das Cowden-Syndrom

(Schmiegel et al., 2004) und die Mut Y Homolog (MYH)-assoziierte Polyposis

(Al-Tassan et al., 2002). 2-3% der CRC treten im Rahmen eines HNPCC-

Syndroms auf (Aaltonen et al., 1998; Cunningham et al., 2001; Lynch and de la

Chapelle, 2003). Träger einer HNPCC-verursachenden Mutation haben ein

kumulatives Lebenszeitrisiko an einem Karzinom zu erkranken, das 58-65% für

ein CRC, 50-62% für ein Endometrium-Karzinom und bis zu 10-15% für andere

Tumoren beträgt (Aarnio et al., 1999; Rüschoff et al., 2004).

1.1.3 Prävention

Im Gegensatz zu anderen Karzinomen besteht beim CRC die Möglichkeit einer

effektiven Vorsorge, da das CRC aus einer adenomatösen Vorstufe (s. Kap.

1.2) entsteht, die bei der Koloskopie erkannt und entfernt werden kann.

Dadurch wird bereits die Entstehung eines Karzinom verhindert (Järvinen et al.,

2000).

Eine Primärprävention speziell für HNPCC-Risikopersonen ist in den Leitlinien

der DGVS nicht verankert, für die asymptomatische Bevölkerung existieren

aber Empfehlungen zu Ernährung und Lebensgewohnheiten (Schmiegel et al.,

2004), die von HNPCC-Risikopersonen ebenfalls befolgt werden können. Ob

die Änderung von Ernährung und Lebensgewohnheiten für HNPCC-

Risikopersonen einen Nutzen haben, wurde noch nicht durch Studien gezeigt.

Für die Sekundärprävention von HNPCC-assoziierten Tumoren gelten die in

Tab. 1.1.3.1 aufgeführten diagnostischen Maßnahmen.

Einleitung 5

Tabelle 1.1.3.1: Früherkennungs- und Vorsorgeuntersuchungen zur Prävention von HNPCC-

assoziierten Tumoren

Alter Untersuchung Frequenz

Komplette Koloskopie einmal

jährlich

Abdomensonographie einmal

jährlich

Gynäkologische Untersuchung

einschließlich transvaginaler Sonographie

einmal

jährlich

ab dem

25. Lebensjahr (bzw.

5 Jahre vor dem

frühesten

Erstmanifestations-

alter in der Familie)

Ösophagogastroduodenoskopie (nur bei

familiär gehäuften Magenkarzinomen)

einmal

jährlich

Das von Järvinen et al. in einer prospektiven 15-Jahres-Studie getestete 3-

jährige Koloskopie-Schema zeigte eine Verminderung der Inzidenz für CRC und

eine 60%-ige Reduktion der Mortalitätsrate (Järvinen et al., 2000). Aufgrund

einer beschleunigten Tumorprogression mit Karzinomentwicklung im Intervall

bei etwa 4% aller Patienten und einer im Vergleich zur

Durchschnittsbevölkerung immer noch erhöhten Mortalität bei zwei-dreijährigen

Untersuchungsabständen wird in Deutschland ein jährliches Koloskopie-

Intervall empfohlen (Järvinen et al., 2000; Cappel et al., 2002; Schmiegel et al.,

2004).

In der Nachsorge von Patienten mit HNPCC-assoziiertem Tumor sollte die

Tumornachsorge mit dem HNPCC-spezifischen Früherkennungsprogramm

kombiniert werden (Schmiegel et al., 2004).

Bezüglich der Effektivität der gynäkologischen Früherkennung gibt es nur

wenige Daten. Eine prospektive Studie (Boks et al., 2002) konnte keinen

Nutzen des Screenings nachweisen, wies jedoch methodische Schwächen

hinsichtlich der Nachbeobachtungszeit und der Altersverteilung auf. Für

Mutationsträgerinnen über 50 wird von einigen Autoren ein großzügiger

Umgang mit einer prophylaktischen Hysterektomie diskutiert (Hendriks et al.,

2004).

1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN

Bisher wurden sechs Gene (MLH[Mut L Homolog]1, MSH[Mut S Homolog]2,

MSH6, PMS[Post-meiotic segregation]2, PMS1 und MLH3) identifiziert, deren

Einleitung 6

Keimbahnmutationen für das Auftreten von HNPCC verantwortlich sind, wobei

die Bedeutung von Mutationen in den Gene PMS1 und MLH3 bisher nicht

abschließend geklärt ist (Schmiegel et al., 2004). Alle diese Gene kodieren für

mismatch repair (MMR-) Enzyme, deren Aufgabe es ist, bei der Replikation

entstandene falsche Basenpaarungen zu korrigieren (Marra and Schar, 1999).

1.2.1 MSH6-Genlocus

Das hier untersuchte MSH6-Gen ist auf dem kurzen Arm des Chromosoms 2

lokalisiert (2p16) und besteht aus 10 Exons, von denen das Exon 4 mit 2555 bp

das größte ist (s. Abb. 1). Die messenger Ribonukleinsäure (mRNA) ist 4264 bp

lang.

Abbildung 1: Verteilung und relative Größe der Exons im MSH6-Gen (Quelle: Université René Descartes Paris GENATLAS, 2005)

1.2.2 Mismatch repair (MMR)-Enzyme

Der Prototyp des MMR-System ist das bakterielle MutS mit einer Länge von

1361 Aminosäuren (AS), dessen Kristallstruktur von Lamers et al. beschrieben

wurde (Lamers et al., 2000). In der menschlichen Zelle gibt es mehrere

Proteine, die dem MutS ähneln und deshalb MutS-Homologe (MSH) genannt

wurden. Für die postreplikative Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Reparatur

zuständig sind vor allem MSH2, MSH3 und MSH6. Die humanen MutS-

Homologe bilden wie das bakterielle MutS Heterodimere. Man findet Dimere

von MSH2 und MSH6 (MutSα) sowie von MSH2 mit MSH3 (MutSβ), wobei

jeweils MSH3 und MSH6 eine mismatch-binding-Domäne besitzen, während

das MSH2 der MutS-Konformation ohne mismatch-binding-Domäne entspricht.

Die unterschiedlichen Dimere sind auf Erkennung verschiedener

Replikationsfehler spezialisiert. Das MSH2/3-Dimer bindet stärker an

mehrbasige Insertions-Deletions-Schleifen (insertion-deletion-loops, IDL)

während der MSH2/6-Komplex stärker an ein-Basen-IDLs und

Basenaustausche bindet (s. Abb. 2) (Marsischky et al., 1996; Marra and Schar,

1999).

Einleitung 7

Abbildung 2: Gelelektrophorese von rekombinant hergestellten MutSα (bestehend aus MSH2

und MSH6) und MutSβ (bestehend aus MSH2 und MSH3) gebunden an die jeweilige

Basenfehlpaarung (Quelle: Marra and Schar, 1999).

Bezüglich des Erkrankungsrisikos bei Mutationsträgern im MSH2, MLH1 und

MSH6-Gen kamen Hendriks et al. in ihrer 2004 veröffentlichten Studie zu dem

Ergebnis, dass die Wahrscheinlichkeit, mit 70 Lebensjahren an einem HNPCC-

assoziierten Karzinom zu erkranken, für MLH1- und MSH2-Mutationsträger

höher ist als bei Patienten mit Mutation im MSH6-Gen (Hendriks et al., 2004).

Daneben sprechen weitere Studien für ein ca. 10 Jahre späteres

Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz bei Patienten mit Mutation im

MSH6-Gen im Vergleich zu Patienten mit einer Mutation im MLH1- oder MSH2-

Gen (Wagner et al., 2001; Berends et al., 2002; Plaschke et al., 2004).

1.2.3 Pathogenese

Nach der Theorie von Knudson sind für die Entstehung eines Karzinoms zwei

Anstöße von Nöten: Die Mutation des ersten und des zweiten Allels eines

Tumor-Suppressor-Gens, meist eines DNA-Reparaturgens. Ist durch eine

Keimbahnmutation eines der Allele so verändert, dass es nicht mehr für ein

Einleitung 8

funktionsfähiges Protein kodiert, wird das Protein nur noch von dem

unveränderten Allel kodiert, was die Funktion der Zelle jedoch nicht

beeinträchtigt. Wird auch diese Kopie durch eine somatische Mutation

geschädigt, ist das DNA-Reparatursystem teilweise ausgefallen. Bei

hereditären Tumorsyndromen ist das erste Allel bereits in der Keimbahn mutiert

und die Tumorgenese kann mit einer somatischen Mutation des zweiten Allels

beginnen, bei sporadischen Tumoren können beide „Anstöße“ somatische

Mutationen sein (Knudson, 1996).

Bei HNPCC folgt die Karzinogenese dem mutator pathway (Reinacher-Schick,

Schmiegel, 2002). Da beim Ausfall eines Teils des DNA-Reparatursystems

Fehler bei der Replikation in dieser Zelle nur noch unzureichend repariert

werden, weist das Erbgut dieser Zelle und deren Tochterzellen nach und nach

Fehler, vor allem der repetitiven Sequenzen (s. Kap. 1.2.1) auf (Marra and

Boland, 1995). Im Großteil der Fälle führt dies in der Folge zu Fehlfunktionen,

die eine Apoptose auslösen. Finden jedoch Mutationen in sensiblen Bereichen

der Regulation der Zellteilung statt, wie z. B. in den Mononukleotid-

Wiederholungen-enthaltenden Tumor-Suppressor-Genen TGF-βRII, IGF-RII,

BAX, Tcf4 und β-catenin (Perucho, 1996), kann sich diese Zelle den

Regulationsmechanismen der Zellteilung entziehen und sich unkontrolliert

vervielfältigen. Nach dem Modell der Tumorprogression akkumulieren sich in

der Adenom-Karzinom-Sequenz auf dem Weg vom normalen Gewebe zum

Adenom hin zum Adenokarzinom eine Vielzahl genetischer Veränderungen

(Vogelstein et al., 1988). Das Adenom zeichnet sich durch Zellatypien in

unterschiedlichem Maße, aufgehobene Zellarchitektur, aber noch intramurales

Wachstum aus, während das Adenokarzinom die Basalmembran der

Darmschleimhaut durchbricht und sich unkontrolliert über das

Ursprungsgewebe hinaus verteilen kann.

1.3 MOLEKULARGENETISCHE LABORDIAGNOSTIK

1.3.1 Mikrosatelliteninstabilität

Mikrosatelliten sind in tandem sich wiederholende, simple repetitive DNA-

Motive mit einer Länge von 1 bis 6 Basen; ab einer bestimmten Länge sind

Mikrosatelliten meist polymorph. Häufig finden sie sich in intronischen und

intergenischen Bereichen. Bei der Replikation dieser Regionen kann es dazu

Einleitung 9

kommen, dass der Matrizenstrang und der neu replizierte Strang sich aufgrund

der repetitiven Motive gegeneinander verschieben und ein falsch ausgerichtetes

Intermediat entsteht (slippage). Die ungepaarten Basen bilden eine IDL.

Befindet sich die IDL auf dem Matrizenstrang, entsteht bei der weiteren

Replikation eine Deletion, befindet sie sich auf dem replizierten Strang, kommt

es zu einer Insertion (s. Abb. 3). Dies kann sowohl bei Mononukleotid- als auch

bei Mehrbasenrepetitionen auftreten. Je höher die Anzahl der Repetitionen,

desto größer ist die Warscheinlichkeit des Auftretens fehlerhaft gepaarter

Stränge, da die erhöhte Anzahl korrekt gepaarter Basen das falsch

ausgerichtete Intermediat stabilisieren (Kunkel and Bebenek, 2000) (s. Abb. 3).

Einleitung 10

5’-T-T-G-T-A-A-A

5’-T-T-G-T-A-A-A-A-A

5’-T-T-G-T-A-A-A-A-A-A-A

3’-A-A-C-A T-T-T-G-C-G-G-5’

· · · · · · · · ·

· · · · · · ·

· · · · · · · · · · ·

3’-A-A-C-A T-T-T- G-C-G-G-5’T-T-

3’-A-A-C-A T-T-T- G-C-G-G-5’T-T-T-T-

\/

\/

\/

T

T

T

-A-C-G

-C-C-3

’

-A-C-G

-C-C-3

’

-A-C-G

-C-C-3

’

Abbildung 3 : Fehlerhafte Hybridisierung zweier DNA Stränge durch Verrutschen („slippage“)

der Stränge gegeneinander. Je höher die Anzahl der Repetitionen, desto größer die

Stabilisierung der fehlerhaften Bindung (Quelle: Kunkel and Bebenek, 2000).

Ist ein Tumor auf dem Boden eines ausgefallenen Reparaturenzyms

entstanden, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass im Erbgut des entarteten

Gewebes weitere Mikrosatelliteninstabilitäten zu finden sind, die mit der von

Schlegel et al. entwickelten Technik detektiert werden können (Schlegel et al.,

1995). Die Mikrosatellitenmarker weisen im Vergleich von Tumorgewebe und

Normalgewebe, dessen Mikrosatelliten unverändert sind, zusätzliche Allele mit

veränderter Länge auf (s. Abb. 4).

Einleitung 11

1998 wurden die Mononukleotidrepetitionen BAT25 und BAT26 sowie die

Dinukleotidrepetitionen D17S250, D5S346 und D2S123 als Referenzmarker

etabliert, die ggf. durch alternative Loci ergänzt werden können. Ein Tumor ist

dann als MSI-high (MSI-H) zu bezeichnen, wenn sich an mindestens 2 von 5

definierten Mono- und Dinukleotid- Mikrosatellitenmarkern Instabilität, d. h. neue

Allele in der Tumor-DNA im Vergleich zur Normalgewebe-(Keimbahn-) DNA

nachweisen lassen, bei nur einem instabilen Marker spricht man von MSI-low

(MSI-L) und bei unveränderten Markern von mikrosatellitenstabil (MSS) (Boland

et al., 1998). Nur der MSI-H-Status wird als indikativ für HNPCC gewertet

(Alexander et al., 2001; Umar et al., 2004).

Abbildung 4: Elektropherogramme der Mikrosatellitenmarker BAT25 und BAT26 von

unverändertem Gewebe (a) und c)) und Tumorgewebe (b)und d)). Im Tumorgewebe sind

zusätzlich Mikrosatelliten unterschiedlicher Länge zu erkennen (Quelle: Rüschoff et al., 2004).

Eine MSI ist in 12-15% aller CRCs nachweisbar, zumeist findet sich als

Ursache eine Methylierung im Promoterbereich von MLH1, was durch die

somatische Inaktivierung zu einer Instabilität der Mikrosatelliten führt.

Bei HNPCC-assoziierten Tumoren findet sie sich durch die Keimbahnmutation

eines MMR-Gens in 90% (Goel et al., 2001) und ist somit ein wichtiges

Einleitung 12

diagnostisches Kriterium, das sich auch durch seine einfache Durchführung im

Vergleich zur Mutationsanalyse auszeichnet.

1.3.2 Immunhistochemie

Eine Zuordnung auf das ausgefallene Protein in der Diagnostik des HNPCC

liefert die immunhistochemische Färbung des Tumorgewebes, bei der mittels

eines gegen das jeweilige MMR-Protein gerichteten Antikörpers, der in einem

weiteren Schritt angefärbt wird, auf den Ausfall der MMR-Gene geschlossen

werden kann, wenn die Tumorzellkerne nicht angefärbt werden. Als Vergleich

dient das den Tumor umgebene Gewebe, welches eine positive nukleäre

Reaktion zeigt (s. Abb. 5 und 6). Hierbei gilt es zu bedenken, dass die Färbung

nur über das Vorhandensein und nicht über den Funktionszustand der Proteine

Auskunft gibt (Oberhuber und Rüschoff, 2004). Die Übereinstimmung von MSI

und Immunhistochemie beträgt über 90 % (Lindor et al., 2002).

Abbildung 5: Kolorektales muzinöses Adenokarzinom mit einer starken nukleären Anfärbung

(rot gefärbt) der Tumorzellen (siehe Pfeile) für MLH1 (Quelle: Kunstmann et al., 2004).

Einleitung 13

Abbildung 6: Kolorektales muzinöses Adenokarzinom mit fehlender Anfärbbarkeit der

Tumorzellen auf MSH2 (links) und MSH6 (rechts). Als Kontrolle dienen Lymphozyten eines

benachbarten Lymphfollikel (siehe Pfeile), die nukleäre Anfärbbarkeit zeigen. (Quelle:

Kunstmann et al., 2004).

1.3.3 Keimbahnmutationssuche

Eine endgültige Diagnosestellung ermöglicht der Nachweis einer

Keimbahnmutation in der DNA von Leukozyten aus peripher-venösem Blut in

einem der Gene, die für das MMR-System kodieren. Die Auswahl des Gens

richtet sich nach der vorausgegangenen Immunhistochemie.

Bei Nachweis einer Mutation wird dem Patienten in einer Beratung das

Ergebnis mitgeteilt. An nochmalig dem Indexpatienten entnommenen Blut wird

die Mutation endgültig bestätigt, was eine Testung der Blutsverwandten

ermöglicht. Hier wird nur noch der Locus der fraglichen Mutation untersucht.

Anhand des Nachweises oder des Ausschlusses der familientypischen Mutation

kann entschieden werden, ob das jeweilige Familienmitglied vom HNPCC-

Syndrom betroffen ist oder nicht. Letztere Verwandte können auf das

Früherkennungsprogramm für HNPCC-Risikopersonen verzichten.

Einleitung 14

1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT

Ziel der Arbeit ist es, bei Patienten mit Verdacht auf ein erbliches

Dickdarmkarzinom nach einer ursächlichen Keimbahnmutation zu suchen. Hier

wird das Augenmerk auf das MSH6-Gen gelegt, dessen Ausfall oder

Fehlfunktion neben den Genen MSH2 und MLH1 ein seltenerer Auslöser eines

Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC)-Syndroms ist. Es sollen

neue Erkenntnisse über Anzahl, Ort und Art der Tumoren bei Personen mit

MSH6-Genmutationen gewonnen werden und weiteres Wissen über das

Erkrankungsalter dieser Personengruppe gesammelt werden, insbesondere im

Hinblick auf Unterschiede zu Familien mit Mutationen in den Genen MSH2 und

MLH1. Um das Kollektiv einzugrenzen, werden die Patienten mittels der

Amsterdam- oder Bethesda-Kriterien, der Mikrosatellitenanalyse und der

immunhistochemischen Untersuchung von Tumormaterial ausgewählt. Mit dem

Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)-Verfahren

WAVE™ werden für die exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte

des MSH6-Gens die Analysebedingungen bestimmt, ein kostengünstiges und

praktikables Screening-Verfahren eingestellt und mit Hilfe der in der

Sequenzierung gewonnen Daten über Sequenzvariationen vereinfacht und

bestätigt. Zusätzlich wird das MSH6-Gen in der polymerase chain reaction

(PCR) amplifiziert, die Fragmente eluiert, in der Sequenzier-PCR mittels

Kettenabbruch durch ddNTPs in verschieden lange Stränge synthetisiert,

präzipitiert und am Sequenzierautomaten sequenziert. Die durch diese Arbeit

gewonnenen Ergebnisse sollen einen wichtigen Beitrag zur Modifikation des

von der DGVS empfohlenen Früherkennungs- und Vorsorgeschema für

HNPCC-Risikopersonen leisten.

Material und Methoden 15

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 PATIENTEN

Die von ihren behandelnden Ärzten überwiesenen Patienten oder auf

Eigeninitiative ratsuchende Personen wurden im Rahmen der von der

Deutschen Krebshilfe geförderten Multicenter-Studie „familiärer Darmkrebs“ im

Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Universitätsklinikum der Ruhr-

Universität Bochum im interdisziplinären Team (Humangenetiker, Internist,

Psychologe) genetisch beraten mit Erhebung von Anamnese und

Stammbaumdaten. Nach erfolgtem Einverständnis wurde bei Erfüllen der

Amsterdam- oder der Bethesda-Kriterien, wenn möglich, an Tumormaterial eine

Mikrosatellitenanlyse und eine immunhistochemische Färbung auf MSH2,

MLH1 und MSH6 durchgeführt. Beim Vorliegen einer MSI wurde unter

Berücksichtigung des Ergebnisses aus der immunhistochemischen Färbung

eine Keimbahnmutationsanalyse an Leukozyten aus peripher-venösem Blut

durchgeführt.

2.2 MATERIAL

2.2.1 Chemikalien

Chemikalie Bezugsquelle

Acrylamid Fluka

Agarose Invitrogen life technologies

Ammoniumpersulfat (APS) Baker

AmpliTaq (Thermophilus aquaticus)

Gold

Roche applied science

BDT Perkin-Elmer

Bisacrylamid Fluka

Borsäure Riedel-de-Haën

Bromphenolblau Merck

Desoxyribonukleotidtriphosphate/

dNTP: dAdenosin(A)TP,

dCytidin(C)TP, dGuanidin(G)TP,

MBI


dThymidin(T)TP

Essigsäure Merck

Äthanol Riedel

Ethidiumbromid Sigma

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck

Ficoll Typ 400 Pharmacia

Glycerin Riedel-de-Haën

Harnstoff Baker

Isopropanol Riedel

Tetramethylethyldiamin (TEMED) Riedel-de-Haën

Natriumacetat, wasserfrei Riedel-de-Haën

Oligonukleotide metabion

Taq DNA Polymerase Gene Craft

Taq Polymerase hot star Qiagen

Tris (Trishydroxymethylaminomethan) AppliChem

Tween-20 Sigma

Xylencyanol FF Bio-Rad

wenn nicht anders aufgeführt Merck, in p.-A.-Qualität

2.2.2 Lösungen

Es wurde immer bidestilliertes Wasser verwendet

Lösung Zusammensetzung

Agarosegel-Ladepuffer

APS-Lösung

Ethidiumbromidlösung

Polyacrylamid (PAA)-Stammlösung

(30% (w/v))

0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylencyanol FF

15% Ficoll™ 400

10% (w/v) (NH4)2S2O8

0,5 mg Ethidiumbromid ad 1000ml 1x

TBE (Tris-Borat/EDTA)

29% (w/v) Acrylamid

1% (w/v) Bisacrylamid


PCR-Lösungen:

GeneCraft-Puffer

MgCl2-Lösung:

dNTP-Lösung

TBE

160 mM (NH4)2SO4

670 mM Tris/HCl (pH 8,8)

0,1% Tween-20

50 mM MgCl2

je 2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

89mM Tris

89mM Borsäure

2mM EDTA

2.2.3 Kits

Kit, Zusammensetzung Bezugsquelle

BigDye Cycle Sequenzing Kit PE Biosystems

GFX™PCR DNA and Gel Band

Purification Kit

Amersham

Hot StarTaq™ DNA Polymerase

PCR-Puffer, 10x

Q-Solution, 5x

MgCl2-Lösung, 25mMol

QIAGEN

ampliTaq GOLD

10x PCR GOLD buffer

MgCl2-Lösung, 25mMol

applied biosystems

DHPLC-Lösungen:

DHPLC-Puffer A:

5% 2 M TEAA

95% HPLC-H2O

DHPLC-Puffer B:

5% 2 M TEAA

Transgenomic

Transgenomic


25% Acetonitril

70% HPLC-H2O

Säulen-Wasch-Puffer:

75% Acetonitril

25% HPLC-H2O

Nadel-Wasch-Puffer:

8% Acetonitril

92% HPLC-H2O

Transgenomic

Transgenomic

2.2.4 Verbrauchsmaterialien

Material Bezugsquelle

Formamid Loading Dye für

Sequenziergele

Amersham

Mikrotiter-Platten und -Deckel Thermowell Costar

Reaktionsgefäße (500 μl, 1500 μl,

2000 μl)

Sarstedt

Membranfilter Schleicher&Schuell


2.2.5 Geräte

Gerät Bezugsquelle

Thermocycler TGradient Biometra

Thermocycler Perkin Elmer 9600 PE Biosystems

Dokumentationssystem für die

Archivierung von Agarose- und PAA-

Gelen

Intas

Zentrifuge 5417C Eppendorf

Entgaser Nalgene

DNA-Sequenzierautomat ABI (Applied Biosystems

Incorporated) 377

Data Collection/Analysis Program

(Version 1.2.1)

ABI

Transgenomic WAVE™ Nucleic Acid

Fragment Analysis System

Transgenomic

2.2.6 Größenstandard

Größenstandard Bezugsquelle

pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker

Fragmentlängen (bp): 501, 489, 404,

331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34,

26

MBI Fermentas

2.2.7 DNA

Die DNA wurde aus peripherem Blut nach dem Standardprotokoll (Miller et al.,

1988) isoliert.

2.2.8 Oligonukleotide

Die in der Tab. 2.2.8.1 aufgeführten Oligonukleotide wurden als intronische

Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, um die gesamte

kodierende Sequenz und angrenzende Spleiß-Stellen zu analysieren. Die

jeweilige Schmelztemperatur (TM) setzt sich aus der Summe zusammen, die

entsteht, wenn für jedes enthaltene Adenin (A) und Thymin (T) je 2°C sowie für


jedes Guanin (G) und Cytosin (C) je 4°C angesetzt werden. Die

Annealingtemperatur berechnet sich aus TM-5°C. Im Thermocycler wurden

durch Veränderung der Parameter Temperatur, Zyklenzahl, MgCl2-

Konzentration, Taq-Polymerase und ggf. Konzentration der PCR-Zusätze die

optimalen Bedingungen für die Amplifikation ermittelt (s. Tab. 2.3.1.1.1).


Tabelle 2.2.8.1 Oligonukleotidpaare zur Amplifikation des MSH6-Gens. Die Bezeichnung F

entspricht der Vorwärtssequenz und R der Rückwärtssequenz. Die mit s bezeichneten

Oligonukleotide wurden ausschließlich in der Sequenzierreaktion eingesetzt.

Bezeichnung Primersequenz (5’→3’) Fragmentlänge

MSH6Ex1F

MSH6Ex1R

GCT CCG TCC GAC AGA ACG

GCT ATG CCC CCG CCT

340bp

MSH6Ex2F

MSH6Ex2R

MSH6Ex2Rs

GCC TTT AAG GAA ACT TGA CC

TGC CTG TCT GTC TGT TTC TCT

ACA CAT GGC AGT AGT GAC TC

2F/R: 329bp

2F/Rs: 277bp

MSH6Ex3F

MSH6Ex3R

GGG TTT GCT ATG TTG CCC AG

CTC CCC CTT TCT TCC CCC

331bp

MSH6Ex4aF

MSH6Ex4aR

GGC TGC ACG GGT ACC ATT AT

CAT TCT CTT CCG CTT TCG AG

400bp

MSH6Ex4bF

MSH6Ex4bR

GCC AGA CAC TAA GGA GGA AGG

TAG ATG CAT CAA AAT CGG GG

386bp

MSH6Ex4cF

MSH6Ex4cR

TGG CTT AAG GAG GAA AAG AGA

TCT ACA TCG TGC CTC CAT CA

378bp

MSH6Ex4dF

MSH6Ex4dR

TTC TGG CTT TCC TGA AAT TG

TAA ATC TCG AAC AAT GGC GA

374bp

MSH6Ex4eF

MSH6Ex4eR

TCT GGC CAT ACT CGT GCA TA

AGC ACC TGG GGT AAC ATC AC

329bp

MSH6Ex4fF

MSH6Ex4fR

TCA GGA AGG TCT GAT ACC CG

GCA CCA TTC GTT GAT AGG CT

353bp

MSH6Ex4gF

MSH6Ex4gR

AAG TGA ATT GGC CCT CTC TG

TGG TTC TGA CTC TTC AGG GG

383bp

MSH6Ex4hF

MSH6Ex4hR

TTT TGG TAA GCG GCT CCT AA

TTT CGA GCC TTT TCA TGG TC

375bp

MSH6Ex4iF

MSH6Ex4iR

TTT CTG CTC TGG AAG GAT TC

TCG TTT ACA GCC CTT CTT GG

440bp

MSH6Ex4jF

MSH6Ex4jR

TGA ACA GAG CCT CCT GGA AT

CAG CTG GCA AAC AGC ACT AC

390bp

MSH6Ex5F

MSH6Ex5R

ATA AAA CCC CCA AAC GAT G

GGA GTA ATT TCC CTT TGC TTC

451bp

MSH6Ex6F GAA ACT GTT ACT ACC AGT CA 203bp


MSH6Ex6R CTG AAT GAG AAC TTA AGT GG

MSH6Ex7F

MSH6Ex7R

MSH6Ex7Fs

MSH6Ex7Rs

TGA ATT TAT GTA ATA TGA TTT GCA A

CAC AAT GGT GAG TGC GTG

TGT GAT TTT TTT TTT TTT TAA GGT G

GTC TTC AAA TGA GAA GTT TAA TG

7F/R: 280bp

7Fs/R: 241bp

7Fs/Rs:141bp

MSH6Ex8-9F

MSH6Ex8-9R

MSH6Ex8R

MSH6Ex9F

GTT TTA ATT CCT TTG AGT TAC TTC C

CTT AAG GTC AGT TAG TTA TAA TTC C

TGC CCT CTC AAA AAA CCG AAT TTG

CTG TTG CTA GCA CAT GTA TCG C

8-9F/R: 540bp

8-9F/8R: 251bp

9F/8-9R: 286bp

MSH6Ex10F

MSH6Ex10R

MSH6Ex10Fs

AAG AAA CAG TAA AAG GGG AA

GAA AAT GCA AAA ATG GTC AT

TTA AGG GAA GTT TGC CTG

10F/R: 280bp

10Fs/R: 196bp

2.3 METHODEN

2.3.1 DNA-Amplifikation mittels PCR

2.3.1.1 PCR-Bedingungen

Die jeweilige DNA-Zielsequenz wird in der PCR (Saiki et al., 1988) in

Mikrotiterplatten amplifiziert. Der 12,5-µl-Reaktionsansatz beinhaltet

12,5 ng genomische DNA,

1,25 µl 10xPolymerase-Puffer des jeweiligen Enzyms,

0,5 U Taq Polymerase,

je 0,2 mMol der dNTPs,

12,5 pMol der jeweiligen Primer,

1,5-3 mMol MgCl2 (s. Tab. 2.3.1.1.2) und

autoklaviertes Aqua bidest oder HPLC-H2O ad 12,5 µl.

Zuerst wird die Polymerase der Firma „Gene Craft“ eingesetzt. Für mit diesem

Enzym nicht zu amplifizierende Systeme und die PCRs für die DHPLC-Analyse

wird die Polymerase hot star und die Polymerase ampliTaq Gold mit den im Kit

enthaltenen Puffern verwandt.

PCRs werden in 96-Loch Mikrotiterplatten im Thermocycler TGradient nach der

in Tab. 2.3.1.1.1 aufgeschlüsselten Programmierung durchgeführt.


Tabelle 2.3.1.1.1: Programmierung des Thermocyclers TGradient

Amplifikationsschritt Temperatur Dauer

1 Initiale

Denaturierung und

Enzymaktivierung

95°C 5 min für die Gene-Craft-

Polymerase

7 min für die ampliTaq

Gold-Polymerase

15 min für die hot-star-

Polymerase

2 Erste

Primeranlagerung

Annealingtemperatur der

jeweiligen Primer +6°C

30 Sekunden (sec)

3 Kettenverlängerung 72°C 30 sec

4 Denaturierung 95°C 30 sec

5 Zweite

Primeranlagerung


jeweiligen Primer +3°C

30 sec

6 Kettenverlängerung 72°C 30 sec

7 Denaturierung 95°C 30 sec

8 Dritte

Primeranlagerung


jeweiligen Primer

30 sec

9 Kettenverlängerung 72°C 30 sec, dann von Schritt

7-9 28-38 Zyklen

10 Abschließende

Kettenverlängerung

72°C 5 min

11 Kühlung 4°C bis zur manuellen

Beendigung

Für die WAVE™-PCR ist nach der abschließenden Kettenverlängerung noch

eine Denaturierung bei 95°C und langsame Renaturierung (0,5°C pro min) nach

der abschließenden Polymerisation notwendig, um einen Teil der als

Homoduplices vorliegenden Doppelstränge zu Heteroduplices zu hybridisieren

(s. Abb. 7).


Abbildung 7: Durch Denaturierung werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den

Strängen gelöst, so dass die als Wildtyp und Mutante vorliegenden Homoduplices sich

auftrennen und untereinander mischen. Die dabei entstehenden Heteroduplices können mit

dem WAVE™ detektiert werden (modifiziert nach Kuklin et al., 1997).

Material und Methoden 25 Tabelle 2.3.1.1.2 Optimierte PCR-Bedingungen für die Amplifikation des MSH6-Gens. Exon 1 wurde nicht mittels DHPLC-Verfahren analysiert, da es

zu viele polymorphe Loci enthält (s. Kap. 4.1.3) und die Q-Solution (Sol.) nicht für die Säule zugelassen ist.

Primer Fragment-

größe

[bp]

Annealing-

Temp. [°C]

MgCl2

[mMol]

Zyklen

(s. Tab.

2.3.1.1.1)

Polymerase Zusatz Annealing-

Temp. PCR für

WAVE™ [°C]

MgCl2[mMol]

PCR für

WAVE™ [°C]

Polymerase

PCR für

WAVE™ [°C] Ex1F+R 340 54 1,5 1+1+38 hot star Q-Sol. - - - Ex2F+R 329 50 3 1+1+38 hot star 50 3 hot star Ex3F+R 331 62 1,5 1+1+28 hot star 62 1,5 hot star Ex4aF+R 400 60 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4bF+R 386 62 2 1+1+28 Gene Craft 62 1,5 hot star Ex4cF+R 378 60 2 1+1+28 Gene Craft 56 1,5 hot star Ex4dF+R 374 60 2 1+1+28 Gene Craft 56 1,5 hot star Ex4eF+R 329 64 2 1+1+28 Gene Craft 64 1,5 hot star Ex4fF+R 353 60 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4gF+R 483 64 2 1+1+28 Gene Craft 64 1,5 hot star Ex4hF+R 475 58 2 1+1+33 hot star 52 3 hot star Ex4iF+R 440 62 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex4jF+R 390 62 2 1+1+28 Gene Craft 60 1,5 hot star Ex5F+R 451 50 3 1+1+38 hot star 50 3 hot star Ex6F+R 203 54 1,5 2+2+28 ampliTaq 54 1,5 ampliTaq Ex7F+R 280 54 3 1+1+28 hot star 54 3 hot star Ex8-9F+R 540 58 2 1+1+28 hot star 54 2 hot star

Ex10F+R 368 48 1,5 1+1+28 hot star 48 1,5 hot star


2.3.1.2 Agarosegelelektrophorese

Zur Kontrolle der PCR werden 3 µl Amplifikat mit 2 µl Agarosegel-Ladepuffer

versetzt und in horizontalen 2-prozentigen Agarosegelen im TBE-Laufpuffer bei

ca. 200 V elektrophoretisch aufgetrennt. Zur Kontrolle der Laufgeschwindigkeit

enthält der Ladepuffer Bromphenolblau und Xylenxyanol. Nach 40 min Laufzeit

wird das Gel ca. 10 min in einer Ethidiumbromidlösung (0,5 mg/l) gefärbt,

anschließend ca. 2 min in 1xTBE entfärbt und unter UV-Licht (260 nm)

analysiert. Die durch Fluoreszenz des in den DNA-Doppelsträngen

interkalierten Ethidiumbromids sichtbar gemachten Banden werden mittels

eines Dokumentationssystems festgehalten. Die Abschätzung der

Fragmentgröße und der Quantität des Amplifikates erfolgte anhand des

Vergleichs mit dem parallel zu den Proben aufgetragenem Größenstandard

pUC19.

2.3.2 Sequenzier-Analyse

2.3.2.1 DNA-Elution

Die DNA-Elution wird mit dem „GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit“

von Amersham™ nach dem Protokoll im Beiheft „Purification of DNA from

solution“ durchgeführt, um Primer und andere störende Bestandteile von dem

PCR-Produkt zu trennen.

Die Säule mit der Glasfasermatrix wird auf das Sammelgefäß gesteckt und das

PCR-Produkt zusammen mit 500 µl Einfangpuffer auf die Säule pipettiert. Durch

4-6-maliges Auf- und Abpipettieren wird die Probe gemischt und 30 s lang bei

20800 g zentrifugiert. Die in den Auffangbehälter gepresste Flüssigkeit wird

verworfen, und die Säule wieder auf den Auffangbehälter gesteckt. 500 µl

Wasch-Puffer wird auf die Säule pipettiert und 1 min lang bei 20800 g

zentrifugiert. Die Säule wird nun auf ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß gesteckt und

eventuell an der Säule zurückgebliebene Flüssigkeit mit Zellstoff entfernt. Das

in der Säule verbliebene Amplifikat wird in 30 µl autoklaviertem Aqua bidest

gelöst und für 1 min bei 20800 g zentrifugiert. Zur Überprüfung der Qualität des

Eluates werden 3 μl auf ein Agarosegel aufgetragen, um anhand eines

aufgetragenen Markers bekannter Quantität die DNA-Konzentration


abzuschätzen. Hierauf wird die DNA direkt für die Sequenzier-PCR eingesetzt

oder bis zu Weiterverwendung bei -20°C aufbewahrt.

2.3.2.2 Sequenzier-PCR

In der Sequenzier-PCR wird im Gegensatz zur gewöhnlichen PCR die

Zielsequenz nur in einer Richtung amplifiziert. Zusätzlich enthält der BDT

unterschiedlich farbstoffmarkierter Didesoxynukleotide (dd-) der Basen Adenin,

Guanin, Cytidin und Thymin, so dass an jeder Position ein Kettenabbruch

erfolgen kann und ein mit dem Farbstoff des eingebauten ddNTP markiertes

Fragment entsteht (Sanger et al., 1977). Der Ansatz, bestehend aus

2 µl BDT,

1 µl BDT-Puffer,

25-100 ng DNA-Amplifikat,

autoklaviertem Aqua bidest ad 10 µl,

wird in 96-Loch Mikrotiterplatten im Thermocycler Perkin Elmer 9600 bei der in

Tab. 2.3.2.2.1 aufgeführten Programmierung inkubiert.

Tabelle 2.3.2.2.1 Programmierung des Thermocyclers für die Sequenzier-PCR

1 Initiale Denaturierung 95°C 5 min.

2 Denaturierung 95°C 10 sec.

3 Primeranlagerung 50°C 10 sec

4 Kettenverlägerung 60°C 5 min, dann von Schritt 2-4

25 Zyklen

5 Kühlung 4°C Bis zur manuellen Beendigung

2.3.2.3 Äthanol-Präzipitation

Zu den in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführten Proben werden 1 µl 3 normale

(N) Natriumacetatlösung und 25 µl Äthanol absolut hinzupipettiert. Nach

gründlicher Durchmischung und wenigstens 15 min Inkubationszeit werden die

Proben für 25 min bei 12500 g zentrifugiert. Direkt im Anschluss wird der

Überstand mit einer Pipette abgesaugt und 35 µl 70-prozentiges Äthanol

hinzugefügt. Es erfolgt ein weiterer Zentrifugationsschritt von 15 min bei

12500 g worauf der Überstand erneut abgesaugt wird. Der Niederschlag wird


bei Raumtemperatur getrocknet und bis zur Weiterverarbeitung zum Schutz der

Fluoreszenzfarbstoffe dunkel gelagert.

2.3.2.4 Sequenziergel

Zur Herstellung des Sequenziergels werden

18 g Harnstoff

23 ml H2O

6 ml 10x TBE

7,5 ml PAA 30%

vermischt und in einem mit einem Membranfilter von 0,2 µm Porengröße

versehenen Entgaser filtriert und entgast. Zur Polymerisation werden 300 µl

APS-Lösung (10%) und 20 µl TEMED hinzupipettiert. Das Gemisch wird nun in

einen durch 0,2 mm dicke Spacer erzeugten Spalt zwischen zwei Glasplatten

gegossen. Die Gelelektrophorese wird im DNA-Sequenzierautomat

durchgeführt und die DNA-Fragmente werden über ihre fluoreszenzmarkierten

Terminatoren von einem Laser erfasst. Die Signale werden mittels des „Data

Collection/Analysis“-Programm auf einen angeschlossenen Computer

übertragen und in die entsprechende Basensequenz übersetzt

2.3.3 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Die denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) beruht auf

dem Prinzip der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bei erhöhter

Temperatur (ca. 55 bis 68°C) (Transgenomic 1999). Die Analyse wird mit Hilfe

des Transgenomic WAVE™ Nucleic Acid Fragment Analysis System

durchgeführt, wie es von Kuklin et al. beschrieben wird (Kuklin et al., 1997).

2.3.3.1 Prinzip

Die DNA wird zusammen mit Puffer A und B in unterschiedlichen

Konzentrationen über eine Säule gespült. Die Pufferlösungen enthalten

Triethylammoniumacetat (TEAA), das 3 Ethylketten besitzt und dessen positiv

geladenes Ammoniumion mit dem negativ geladenen Zucker-Phosphat-

Rückgrates der DNA interagiert. Die poröse Säule besteht aus Poly-(Styren-

Divinylbenzen)-Kopolymeren, die mittels hydrophober Wechselwirkungen mit


den Ethylgruppen des TEAA interagieren. Somit verhalten sie sich als Brücke

zwischen der stationären Phase und den DNA-Strängen (Transgenomic 1999).

Während des Laufes wird kontinuierlich die Konzentration an Puffer B, der 25%

Acetonitril enthält, erhöht, was bewirkt, dass die hydrophoben Wechsel-

wirkungen zwischen dem TEAA und der Säule gestört werden und die an das

TEAA gebundene DNA von der Säule gelöst wird. Die abgelöste DNA

duchfließt nun den Detektor, der bei 260nm die Extinktion misst. Jedes DNA-

Fragment hat in Abhängigkeit von der Temperatur eine bestimmte

Schwellenkonzentration von Acetonitril, bei der sich nahezu alle Kopien von der

Säule lösen, so dass der Detektor für jedes Fragment einen einzelnen

Ausschlag registriert.

Bei Temperaturen über 50 °C sinkt mit steigender Temperatur die

Retentionszeit, da die DNA zu denaturieren beginnt, und die Einzelstränge im

Vergleich zum Doppelstrang eine verminderte negative Ladung besitzen (Huber

et al., 1993), wodurch die TEAA-vermittelte Interaktion mit der Säulenmatrix

verringert wird. Heteroduplices enthalten bereits einen einzelsträngigen

Abschnitt, wodurch sie sich eher von der Säule lösen als die

korrespondierenden Homoduplices. Dadurch kann dieses Verfahren zwischen

Homo- und Heteroduplices unterscheiden.

Für eine Messung im DHPLC-Gerät werden 5 µl Probe von einer Nadel

aufgesaugt und über ein Rheodyne-Ventil in das Hochdrucksystem eingespritzt.

Über Schläuche erreicht sie die Vorsäule, die Proteine und Verunreinigungen

abfängt, durchfließt eine Heizspirale und gelangt auf die Hauptsäule. Der Säule

nachgeschaltet ist der DNA-Detektor mit der UV-Lampe und dem

Extinktionsmessgerät. Nach der Messung wird die Probe in einen Abfallbehälter

geleitet. Nach jeder Injektion wird die Nadel mit einer Waschlösung gereinigt.

2.3.3.2 Theoretische Schmelzkurve

Als ersten Schritt erstellt man mit der Software „WAVEMAKER“ eine

theoretische Schmelzkurve, bei der anhand der freien Enthalpie der jeweiligen

Sequenz errechnet wird (SantaLucia and Hicks, 2004), zu welchem Anteil die

Probe bei der jeweiligen Temperatur als Doppel- oder Einzelstrang (denaturiert)

vorliegt (s. Abb. 19). Der Kurvenverlauf dient als Richtwert zur Erstellung der


praktischen Schmelzkurve mittels des Universalgradienten (s. Kap. 2.3.3.3), die

das tatsächliche Schmelzverhalten des jeweiligen Fragments wiedergibt.

2.3.3.3 Universalgradient

Für den Universalgradienten verwendet man einen 20-minütigen Lauf, mit

einem Gradienten von 40-60 % Puffer B, so dass pro Minute die Konzentration

von Puffer B um 1% steigt. Dieser Lauf wird bei um jeweils 1°C steigenden

Temperaturen in dem nach der theoretischen Schmelzkurve zu erwartenden

Umfang der partiellen Denaturierung wiederholt (s. Abb. 8). Da die Verringerung

der Retentionszeit bei steigender Temperatur auf der (partiellen) Denaturierung

der Doppelstränge beruht, kann man das Schmelzverhalten des Fragments

ableiten und eine Schmelzkurve bilden (s. Abb. 20). Für die Mutationsanalyse

am besten geeignet sind die Bedingungen, bei denen die Homoduplices zu 75-

100% als Doppelstrang vorliegen, so dass die Heteroduplices durch ihre

kürzere Retentionszeit gut zu detektieren sind.


Abbildung 8 zeigt einen Universalgradienten am Beispiel des Fragments MSH6 Ex 4a. Zu

erkennen ist die Verringerung der Retentionszeit bei steigender Temperatur.

2.3.3.4 Feineinstellung und endgültige Analysebedingungen

Die Temperaturen, bei denen nach der praktischen Schmelzkurve mit einer

Doppelstrangfraktion von 75-100% zu rechnen ist, werden mit verschiedenen

Proben in einem 8-minütigen Lauf getestet. Die Konzentration des Puffers B

(in %) beträgt zu Beginn 2t+40-8 (t = Retentionszeit des Fragments im

Universalgradienten) und wird kontinuierlich bis auf 2t+40 erhöht. Damit

erscheint das Signal des Fragments bei 4-5 min im gut detektierbaren Bereich.

Messungen mit einem Wildtyp und Fragmenten mit bekannter Basen-

veränderung geben genaueren Aufschluss über die Auftrennung zwischen

Homo- und Heteroduplices. Benutzt man Kontrollproben mit Sequenz-

veränderungen in verschiedenen Bereichen des Fragments, ergibt sich weiterer

Aufschluss, ob sich alle Bereiche des Fragments bei der gleichen Temperatur

analysieren lassen, oder ob es verschiedene Abschnitte gibt, die bei

unterschiedlichen Temperaturen denaturieren, sogenannte Schmelzdomänen.

a 52a 53a 54a 55a 56a 57a 58a 59a 60a 61a 62a 63a 64a 65a 66a 67a 68a 69a 70

MSH6 Ex 4

Time (Minutes)1716151413121110987654321

Abso

rban

ce (m

V)

36

34

32

30

28

26

24

22

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2


Anhand der in der Feineinstellung gewonnen Informationen wählt man unter

Berücksichtigung der theoretischen und praktischen Schmelzkurve die

endgültigen Analysebedingungen aus. Hierbei spielen vor allem eine Rolle,

über welche Temperaturspanne hinweg die Fragmente zu 75-100% als

Doppelstrang vorliegen, ob verschiedene Domänen eine Rolle spielen und wie

deutlich sich bei den jeweiligen Temperaturen Basenveränderungen in

Kontrollproben nachweisen lassen. Lässt sich auf diese Weise die optimale

Analysetemperatur gut eingrenzen, kann das Fragment mit zwei

Analysebdingungen untersucht, bei einem größeren Temperaturbereich erfolgt

eine dritte Messung.

2.3.3.5 Probenanalyse

Nachdem die optimalen Temperaturen und Pufferbedingungen ermittelt sind (s.

Tab. 3.1.2.1), wird für jede Probe bei den ermittelten Analysebedingungen

neben einem Wildtyp und weiteren Kontrollproben das Extinktionsmuster

bestimmt. Jede Probe, deren DHPLC-Chromatogramm sich von dem des

Wildtyps unterscheidet, wird sequenziert, um die Basenveränderung genau

bestimmen zu können.

Ergebnisse 33

3 ERGEBNISSE

3.1 METHODEN

Bei den nach dem klinischen Bild und dem Ergebnis der immun-

histochemischen Untersuchung ausgewählten 11 Patienten wurden die

exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte des MSH6-Gens

sequenziert, und mit Hilfe der ermittelten Sequenzen das DHPLC-Verfahren

WAVE™ etabliert.

3.1.1 Sequenzierung

Das MSH6-Gen wurde mit den in Kap. 2.1.3 aufgeführten Oligonukleotiden

amplifiziert. Es besteht aus 10 Exons, für die jeweils Primer erstellt wurden, die

die flankierenden intronischen Sequenzen mit amplifizieren, um die kodierende

Sequenz und die Spleißregion optimal untersuchen zu können. In Abhängigkeit

von der Beschaffenheit der flankierenden Sequenz wurden für die

Sequenzierreaktion spezielle Oligonukleotide entwickelt. Exon 2 wurde mit den

Primern 2F und 2R amplifiziert. Der Primer 2R liegt 74 bp weiter in 3’ Richtung,

was die bessere Untersuchung des flankierenden intronischen Bereiches

ermöglichte. Für die Sequenzierreaktion wurde auf Grund einer repetitiven GT-

reichen Sequenz in der 5’ Richtung der Primer 2Rs eingesetzt, mit dem sich

das Sequenzbild ohne Überlagerung darstellte.

Mit einer Länge von 2544 bp wurde Exon 4 in 10 Amplikons (4a-4j) aufgeteilt,

die sich um mindestens 100 bp überlappen. Für Exon 7 wurden ebenfalls

Sequenzierprimer benötigt (s. Kap. 3.2.2.) und für Exon 8 und 9 gab es ein

gemeinsames Amplikon. Der zwischen Exon 8 und 9 befindliche intronische

Polymorphismus c.3802-42InsT machte das Erstellen zweier Primer (8R und

9F) nötig, die in der Sequenzierreaktion eingesetzt wurden und bei einer

heterozygoten Insertion ein Sequenzbild ohne Überlagerung im jeweiligen Exon

ergaben.

3.1.2 WAVE™-Einstellungen

Da das MSH6-Gen ein breites Spektrum an Mutationen aufweist, viele 'private’

Mutationen existieren und die DHPLC-Analyse ein in der Mutationionssuche

anerkanntes Verfahren darstellt, wurde die Analyse des MSH6-Gens mit dem

Ergebnisse 34

DHPLC-Gerät WAVE™ etabliert. Anhand der bei der Mutationssuche

entdeckten Polymorphismen, den im untersuchten Patientenkollektiv

gefundenen pathogenen Mutationen, auswärtig gefundenen Mutationen und

Proben ohne Nachweis von Basenveränderungen wurden nach dem unter

Kap. 2.3.2 beschriebenen Vorgehen die unten aufgeführten Bedingungen

ermittelt. Exon 1, das auf Grund repetitiver und extrem GC-reicher flankierender

intronischer Sequenzen nur mit Q-solution™ als PCR-Zusatz amplifiziert

werden konnte, war für die Analyse am WAVE™ nicht zugänglich, da

Bestandteile der Q-Solution die Matrix der DHPLC-Säule schädigen und es zu

viele polymorphe Loci enthält (s. Kap. 4.1.3). Die in Tab. 3.1.2.1 aufgeführten

Bedingungen zeigen die endgültigen Analysebedingungen für das MSH6-Gen.

Tabelle 3.1.2.1 : Ermittelte Temperatur- und Pufferbedingungen für die DHPLC-Analyse der auf

eine MSH6-Genmutation zu testenden Patientenproben. Je nach Anzahl der Schmelzdomänen

pro Fragment und Temperatur des Bereiches, in dem die Fragmente zu 75-100 % als

Doppelstrang vorliegen, wurden jeweils zwei oder drei Temperaturen ausgewählt.

PCR-

System

Bedingung I

(% Puffer B)°C

Bedingung II

(% Puffer B)°C

Bedingung III

(% Puffer B)°C

2 (57-65)55 (55-63)59

3 (58-66)56 (58-66)58 (54-62)60

4a (58-66)55 (56-64)58 (54-62)60

4b (59-67)59 (57-65)61

4c (59-67)58 (57-65)60

4d (59-67)57 (56-64)59

4e (57-65)57 (56-64)58 (53-61)59

4f (58-66)56 (58-66)58

4g (60-68)57 (57-65)59

4h (54-62)56 (53-61)57

4i (60-68)54 (59-67)57

4j (59-67)57 (57-65)59

5 (59-67)55 (57-65)57 (55-63)59

6 (52-60)57 (50-58)59

7 (56-64)52 (55-63)54 (53-61)56

8+9 (60-68)55 (59-67)57 (58-66)58

10 (55-63)53 (53-61)55 (48-56)57

Ergebnisse 35

3.2 POLYMORPHISMEN

Beispielhaft sind die Polymorphismen c.540C>T und c.3646+31InsATCT, von

denen sowohl homozygote als auch heterozygote Träger identifiziert wurden,

als Sequenzbild und als WAVE™-Chromatogramm dargestellt.

3.2.1 Polymorphismus c.540C>T

Für den an Position 540 im Exon 3 befindlichen Polymorphismus waren

homozygote Träger für das C-Allel (z. B. BO-0531-X) und das T-Allel (z. B. BO-

0559-1) vorhanden, ebenso zeigten sich heterozygote Träger (z. B. BO-0518-5)

(s. Abb. 9). Das Hauptsignal im WAVE™-Diagramm von BO-0531-X zeigt links

vom Extinktionsmaximum eine kleine Schulter, die sich bei BO-0559-1 (T/T)

größer darstellt. Deutlich zu unterscheiden ist der heterozygote Zustand des

Polymorphismus bei BO-0518-5, der im WAVE™-Chromatogramm zu einem

breiten Signal mit zwei annähernd gleich hohen Extinktionsmaxima führt.

BO-0531-X

BO-0518-5

BO-0559-1

Abbildung 9: Sequenzelektropherogramme und WAVE™-Chromatogramme (54-62% Puffer B

bei 60°C) der Patienten BO-0531-X, BO-05518-5 und BO-0559-1, die homo- und heterozygote

Träger für den Polymorphismus c.540C>T sind.

Ergebnisse 36

3.2.2 Polymorphismus c.3646+31InsATCT

Für die Insertion von vier Basen 31 bp in 3’-Richtung von Exon 7 wurden in dem

Patientenkollektiv homo- und heterozygote Träger gefunden (s. Abb. 20).

Dieser Polymorphismus machte das Erstellen eines Rückwärtsprimers für die

Sequenzierreaktion (Rs, hellrot in Abb. 10) notwendig. Da er in 5’-Richtung der

Insertion liegt, kommt es in der Sequenzierung nicht zu einer

Signalüberlagerung der beiden Allele. Dies ist hier besonders wichtig, da durch

die repetitive T-Folge unmittelbar in 5’-Richtung von Exon 7 bereits das Signal

der Vorwärtssequenz durch das slipping der Polymerase beeinträchtig ist, was

durch einen Vorwärtsprimer (Fs, hellgrün in Abb. 10), der auf der repetitiven

Sequenz liegt, vermieden wird. Da dieses Oligonukleotid in den exonischen

Bereich hineinragt, ist die Beurteilung der Spleißregion erschwert. Das Exon 7

wurde mit den Oligonukleotiden 7F und 7R amplifiziert, für die

Sequenzierreaktion wurden die Primer 7Fs und 7R bzw. 7Rs eingesetzt.

tgtagctcatgatagctatataacctagaagatgaatttatgtaatatgatttgcaaaat gagtattcatttgtgattttttttttttttaaggtgaaagtacattttttgttgaattaa gtgaaactgccagcatactcatgcatgcaacagcacattctctggtgcttgtggatgaat taggtaagacattaaacttctcatttgaagactatcttaaaaacatttgtacaaataact atttttatagaagattatctgaagtacatctaaacaatatgaatgtttttagagcacgca ctcaccattgtggcacagaccgatagttggagataaaaggtgatattgtgaaaggttttt

Intronische Sequenz

Exonische Sequenz

Oligonukleotid Ex 7F

Oligonukleotid Ex7Fs

Oligonukleotid Ex7R

Oligonukleotid Ex7Rs

INDEL-Polymorphismus c.3646+31InsATCT

Abbildung 10: Position der Oligonukleotide für Exon 7

Da die DHPLC-Analyse für Phasenverschiebung durch Polymerase-slipping

weniger empfindlich ist, konnte das Amplifikat aus 7F und 7R direkt für das

WAVE™-Analyse eingesetzt werden (s. Kap. 4.1.5).

Ergebnisse 37

3.2.3 Weitere Polymorphismen

Bei der Sequenzierung zeigten sich weitere Basenänderungen, die in der

Datenbank (ICG-HNPCC, 2003) und von verschiedenen Autoren (Nicolaides et

al., 1996; Kolodner et al., 1999; Plaschke et al., 2000; Wijnen et al., 1999) als

nicht pathogen eingestuft werden (s. Tab. 3.2.3.1). Die aufgeführten

Basenaustausche führen zu keiner Änderung der Aminosäurenabfolge,

ausgenommmen der Polymorphismus c.116G>A, der zum Ersatz der kleinsten

Aminosäure Glycin durch die negativ geladene Aminosäure Glutamat und somit

zu einer deutlichen Änderung der Primärstruktur führt. Da die Allelfrequenz

jedoch zwischen 0,15 und 0,2 liegt, ist diese Basenänderung als apathogener

Polymorphismus einzustufen (Kolodner et al., 1999). Der Basenaustausch

c.457+13A>G, der bei einer Person in heterozygotem Zustand vorkam, wurde

von Kolodner et al. 1999 als Polymorphismus charakterisiert, er fand ihn mit

einer Allelfrequenz von 0,3%. Da er sich nicht in der kodierenden Region

befand und keine Spleiß- oder branching-sites betroffen waren, ist eine

funktionelle Relevanz unwahrscheinlich. Für alle übrigen gefundenen

Basenaustausche wurde eine Allelfrequenz von über 1% ermittelt, weshalb sie

mit großer Sicherheit als Polymorphismus zu charakterisieren sind.

Ergebnisse 38 Tabelle 3.2.3.1 nachgewiesenen Polymorphismen im untersuchten HNPCC-Patienten-Kollektiv

MSH6 Polymorphismus AS-

Änderung

BO-

0531-X

BO-

0518-5

BO-

0503-2

BO-

0666-7

BO-

0532-1

BO-

0559-1

BO-

0572-6

BO-

0714-2

BO-

0676-0

BO-

0694-4

BO-

0701-3

Exon 1 c.108T>G A>A T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T T/T

Exon 1 c.116G>A G>E G/G G/G G/A G/A G/A G/A G/G G/A G/A G/A G/A

Exon 1 c.186C>A A>A C/A C/A C/C C/A C/A C/C C/A C/C C/C C/C C/C

Intron 1 c.260+22C>G Intron C/G C/G C/C C/G G/C C/C C/G C/C C/C C/C n.d.

Intron 1 c.261-36A>G Intron A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/A A/G A/A A/A A/A

Exon 2 c.276A>G P>P A/G A/G A/A A/G A/G A/A A/G A/A A/A A/A A/A

Intron 2 c.457+13A>G Intron A/A A/A A/A A/A A/A A/G A/A A/A A/A A/A A/A

Intron 2 c.458-52T>G Intron G/G G/G T/G T/G T/G T/G G/G T/G T/G T/G G/G

Exon3 c.540T>C D>D C/C T/C T/T T/C T/C T/T T/C T/T C/T T/T T/C

Intron 3 c.628-56C>T Intron C/T C/T C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T C/C C/T

Exon4 c.642C>T Y>Y C/T C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T

Intron 5 c.3438+14A>T Intron A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/T A/A n.d. n.d.

Intron 7 c.3646+31 insATCT

Intron -/- Ins/- -/- -/- -/- -/- Ins/- Ins/Ins -/- -/- Ins/-

Intron 7 c.3646+87C>T Intron C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/C C/T C/C C/T C/C

Intron 8 c.3802-42insT Intron Ins/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- -/- Ins/- -/- Ins/-

Intron 8 c.3802-40G>C Intron G/G G/C G/G G/G G/G G/G C/G C/G G/G G/G G/C

Ergebnisse 39

3.3 MUTATIONEN

In dem Patientenkollektiv wurde in 4 Familien eine krankheitsverursachende

Mutation nachgewiesen. Im Folgenden werden die Mutationen gemeinsam mit

dem klinischen Bild und dem Familienstammbaum beschrieben. Für die

Stammbäume werden die in Abb. 11 erläuterten Symbole verwendet.

=

=

=

=

99 verstorben,erreichtes Alter

99 derzeitigesAlter

Gentest auf Mutationnegativ=

ED = Erstdiagnose

= Indexpatient

Gentest auf Mutationpositiv=

männlichePerson

weiblichePerson

? = unsichereAngabe

Abbildung 11: Legende der Stammbäume

Ergebnisse 40

3.3.1 Familie BO-0503-3

CRC

Bronchial-Karzinom

CRC(ED40?)

64 55 60

38

rezdiv.kolorektaleAdenome(ED39)

5 7

40Polyp(ED40)

15 12

3241

I

II

III

IV

V

1

1

1

1

1 2

2

2

3

3

3

4

4

Abbildung 12: Stammbaum der Familie BO-0503-3

Tabelle 3.3.1.1 Tumormanifestationen der Familie BO-0503-3

Manifestation

(Alter in

Jahren bei

Erstdiagnose

(ED))

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile

Marker/

getestete

Marker)

Immun-

histochemie

Index-

patientin

(IV3)

tubuläre und

tubulovillöse

Adenome

(39,44)

B(Bethesda)7 MSI-H (4/4) MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 neg.

Schwester

(IV1)

Polyp

unbekannter

Histologie (40)

Groß-

mutter (II1)

CRC (40) Br(Bethesda

überarbeitet)1

Ergebnisse 41

In Familie BO-0503-3 fiel die Indexpatientin mit zwei tubulären Adenomen und

einem tubulovillösen Adenom mit herdförmig schweren Epitheldysplasien im

Rektum auf (s. Abb. 12 und Tab. 3.3.1.1). Bei Kontrollkoloskopien wurde ein

weiteres tubulo-villöses Adenom entfernt. Bei ihrer älteren Schwester (IV1)

wurde mit 40 Jahren ein Polyp unbekannter Histologie entdeckt. Auffallend war

das frühe Erkrankungsalter der Großmutter, die bereits mit 40 Jahren an einem

CRC verstarb.

Dieser Stammbaum entspricht nicht den Amsterdam-Kriterien, da nur ein

Familienmitglied vom CRC betroffen ist, hingegen erfüllt die Indexpatientin das

Bethesda-Kriterium (B) 7, da bei ihr ein tubulovillöses Adenom vor dem 40.

Lebensjahr diagnostiziert wurde. Von den überarbeiteten Bethesda-Kriterien

trifft das erste Kriterium (Br1) auf die Großmutter zu, die mit 40 Lebensjahren

am CRC verstorben war. Die Mikrosatellitenanalyse des tubulo-villösen

Adenoms, das mit 39 Lebensjahren bei der Indexpatientin diagnostiziert wurde,

ergab einen im Vergleich zum umgebenden Gewebe in vier von vier Markern

instabilen Tumor. Die Immunhistochemie von MSH2 und MLH1 zeigte eine

positive nukleäre Reaktion und einen Verlust für MSH6. Da durch die fehlende

nukleäre Anfärbbarkeit auf MSH6 eine Mutation im zugehörigen Gen am

wahrscheinlichsten war, wurde die Sequenzierung des MSH6-Gens

durchgeführt. Dabei fiel die Mutation c.1421-1422dupTG durch die

Signalüberlagerung der Elektropherogramme in der Sequenz von Exon 4c und

4d auf. Das DHPLC-Verfahren WAVE™ zeigte einen deutlich zweigeteiltes

Signal im Vergleich zur Kontrollprobe (s. Abb. 13). Die Insertion c.1421-

1422dupTG führt zur Verschiebung des Leserahmens und somit auf

Proteinebene an der Position 475 zum fälschlichen Einbau der Aminosäuren:

Cys, Arg, Arg, Ala, Ile, Lys und einem Stopp-Codon an der Position 480

(p.C475fsX480). Da das Protein um mehr als die Hälfte verkürzt ist, muss man

von der Bildung eines funktionslosen Proteins ausgehen, somit kann diese

Mutation als auslösend für das HNPCC-Syndrom angesehen werden.

Ergebnisse 42

Kontrollperson

BO-0531-X

Abbildung 13: Sequenz-Analyse und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.1421-

1422dupTG des Patienten BO-0531-X bei 59-67 % Puffer B und 58°C im Vergleich zu einer

Kontrollperson ohne Basenänderung.

3.3.2 Familie BO-0509-4

1 2 3 4

19

51 45

16 1417

1/1249

65

26

56 82

60

Karzinom mitunbekanntem

PrimariusCRC(58)

TbcHerz-insuffizienz

CRC(43)Pankreas-

Karzinom (45)

Infektion(4Wo)

Bronchial-Karzinom

I

II

III

IV

1 2

1 3

3

4 5

1 2


Ergebnisse 43

Tabelle 3.3.2.1:Tumormanifestationen in der Familie BO-0509-4

Manifestation

(Alter in

Jahren bei ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile Marker/

getestete Marker)

Immun-

histochemie

Index-

patient

(III1)

CRC (43)

Pankreas-

karzinom (45)

B4/Br1,2 MSI-H (2/5) MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 neg.

Vater (II2) CRC (58)

Mutter

(II3)

Karzinom mit

unbekanntem

Primarius,

hepatisch und

ossär

metastasiert

In obigem Stammbaum fällt der bereits verstorbene Indexpatient mit einem

rechtsseitigen CRC im Alter von 43 und einem metachronen Pankreaskarzinom

im 45. Lebensjahr auf (s. Abb. 14 und Tab. 3.3.2.1). Die beim Indexpatienten

auf Grund eines positiven Hämokkult-Tests durchgeführte Koloskopie erbrachte

das Bild eines stenosierenden Prozesses im Kolon aszendens, dessen

feingewebliche Untersuchung nach Hemikolektomie neben des Befundes

zweier kirschgroßer tubulovillöser Adenome die Diagnose eines Adenokarzinom

mit Infiltration der Subserosa (pT3, pN0, M0) erbrachte. Im Rahmen der

Tumornachsorge fiel zwei Jahre später ein Anstieg des Tumormarkers CA 19-9

auf, in der bildgebenden Diagnostik zeigte sich ein Pankreasprozess. Nach der

Pankreaslinksresektion erwies sich der Befund als Adenokarzinom, dessen

histologische Morphologie sich jedoch deutlich von dem früheren CRC

unterschied, so dass von einer Zweitneoplasie (pT3, pN1b) ausgegangen

wurde. Im Verlauf kam es zur weiteren Verschlechterung, der Indexpatient

verstarb kurz darauf.

Da neben dem 58-jährig an einem CRC erkrankten Vater kein Familienmitglied

an einem HNPCC-assoziierten Tumor erkrankt ist, entspricht dieser Stamm

ebenfalls nicht den Amsterdam-Kriterien, jedoch erfüllt der Indexpatient das B4

durch das CRC vor dem 45. Lebensjahr. Br1 ist durch das CRC vor dem 50.

Ergebnisse 44

Lebensjahr und Br2 durch das metachrone Auftreten des CRC und des

Pankreas-Karzinoms als HNPCC-assoziierte Tumoren erfüllt.

In der Mikrosatellitenanalyse zeigte sich ein MSI-H-Status mit 2 (von 5)

instabilen Markern, die immunhistochemische Färbung zeigte einen Ausfall des

MSH6-Proteins. Da der immunhistochemische Befund keine nukleäre

Expression des MSH6-Proteins zeigte, wurde die Sequenzierung des MSH6-

Gens durchgeführt. Dabei wurde ein Basenaustausch c.3202C>T gefunden, der

den genetischen Code CGA für Arginin zu TGA, einem Stop-Codon ändert und

somit nach 1068 Aminosäuren einen Kettenabbruch hervorruft. Das

Elektropherogramm zeigt die Überlagerung eines blauen (C) und eines roten

(T) Signals. Das WAVE™-Chromatogramm zeigt eine deutlich breiteren und

mehrgipfligen Verlauf (s. Abb. 15). Nach Bestätigung des Befundes wurde der

Bruder prädiktiv getestet, bei dem die Mutation c.3202C>T im MSH6-Gen nicht

nachgewiesen wurde.

Ebenfalls wünschten die beiden Kinder des Indexpatienten nach Vollendung

des 18. Lebensjahres eine molekulargenetische Untersuchung, die in beiden

Fällen die familientypische Mutation im MSH6-Gen ausschließen konnte.

Kontrollperson

BO-0502-0

Abbildung 15: Sequenz- und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.3202C>T des

Indexpatienten im Vergleich zu einer Kontrollperson ohne Basenveränderung. Das WAVE™-

Chromatogramm wurde unter den Bedingungen 56-64% Puffer B bei 59°C erstellt.

Ergebnisse 45

3.3.3 Familie BO-0540-2

66

53

24

55

72

49

57

64

CRC(47)

CRC(ED38),rez. Polypen

CRCCOPD +

Herz-insuffizienz

60

57

malignesMelanom(ED23)

Prostata-Karzinom

(ED?)

27

I

II

III

IV1

1

1

1

2

2

2

2

3

3

3

3 4

4

4

4

5

5


Tabelle 3.3.3.1: Tumormanifestationen in der Familie BO-0540-2

Beim Indexpatienten wurde im Alter von 38 Jahren neben einem tubulären

Adenom ohne Atypien ein Rektumkarzinom (pT3, pN0) diagnostiziert. Die

jährlichen Kontrollkoloskopien zeigten erneute Adenome, die vollständig im

Manifestation

(Alter in

Jahren bei

ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile Marker/

getestete Marker)

Immun-

histochemie

CRC (38) Amsterdam I MSI-H (2/5) MSH2 pos.

MLH1 pos.

MSH6 nicht

auswertbar

Index-

patient

(III3)

tubuläre

Adenome

(50,52)

Mutter (II2) CRC (47)

Bruder der

Mutter (II1)

CRC (ED?)

Ergebnisse 46

Gesunden entfernt werden konnten. Bei der Mutter wurde mit 47 Jahren ein

CRC diagnostiziert, der Bruder der Mutter verstarb mit 60 Jahren am CRC (s.

Abb. 16 und Tab. 3.3.3.1). Somit erfüllt der Stammbaum die Amsterdam-I-

Kriterien. Die am Rektumkarzinom des Indexpatienten im Vergleich zum

umgebenden Normalgewebe durchgeführte Mikrosatellitenanalyse ergab

Instabilität an zwei von fünf Markern, somit ist der Tumor als MSI-H zu werten.

Die für MLH1 und MSH2 durchgeführte immunhistochemische Färbung

erbrachte eine positive nukleäre Reaktion, die Untersuchung für MSH6 zeigte

kein Ergebnis. Auf Grund der MSI und der nicht auszuwertenden

immunhistochemischen Färbung wurde die Sequenzierung des MSH6-Gens

begonnen, bei der die Mutation c.3261_3262insC diagnostiziert wurde. Die

Insertion eines Cytosins im Exon 5 führt zur Verschiebung des Leserahmens,

somit auf Proteinebene an Position 1087 zum fälschlichen Einbau der

Aminosäuren Prolin und Serin und einem Kettenabbruch an Position 1092

(p.P1087fsX1092). Im Sequenzelektropherogramm kommt es nach acht

Cytosins zu einer Phasenverschiebung, das WAVE-Chromatogramm zeigt

einen im Vergleich zur Kontrollprobe verbreiterten Kurvenverlauf (s. Abb. 17).

Da das MSH6-Protein durch die Basenveränderung um mehr als 200 AS

verkürzt wurde, ist diese Mutation als auslösend für das HNPCC-Syndrom

anzusehen.

Nach der Ergebnisbekanntgabe wünschte die Tochter des Indexpatienten den

genetischen Test. Sie war mit 23 Lebensjahren an einem malignen Melanom

erkrankt, das nicht zu den HNPCC-assoziierten Tumoren gezählt wird. Es

wurde eine prädiktive Testung durchgeführt, bei der die Mutation

c.3261_3262insC ausgeschlossen werden konnte.

Ergebnisse 47

Kontrollperson

BO-0569-5

0 1 2 3 4 5 6 retention time (min)

1

2

3

4

0

Inte

nsity

(mV)

0 1 2 3 4 5 6 7 retention time (min)

12

34

5

0

Inte

nsity

(mV

)Abbildung 17: Sequenz- und WAVE™-Chromatogramm der Mutation c.3261_3262insC des

Patienten BO-0569-5 im Vergleich zu einer Kontrollperson ohne Basenveränderung. Das

WAVE™-Chromatogramm wurde unter den Bedingungen: 56-64% Puffer B bei 59°C erstellt.

3.3.4 Familie BO-0613-4

3537 30 3143

63 CRC(ED50)

Koloskopieohne path.

Befund

CRC(ED74)

CRC(ED45,58)

tubuläreAdenome(ED28)

12 <5<5 <5

32

1

62

74

tubuläreAdenome(ED32)

I

II

III

IV

1

1

1

1 2

2

2

2

3

3

3

4

4

5

5

6


Die beim Indexpatienten im Alter von 50 Jahren auf Grund eines zweifach-

positiven Hämokkults durchgeführte Koloskopie ergab den Befund eines CRC

nahe der linken Flexur (pT3, pN0 M0), bei Kontrollkoloskopien wurde ein

tubuläres Adenom von 3mm Durchmesser entfernt. Bei der Mutter wurde im

Alter von 74 CRC identifiziert und der Bruder (II3) des Indexpatienten erkrankte

zweimal am CRC, das mit 45 bzw. 58 Lebensjahren diagnostiziert wurde (s.

Ergebnisse 48

Abb. 18 und Tab. 3.3.4.1), auch hier wurde bei Kontrollkoloskopien ein

tubuläres Adenom entfernt. Die an Tumorgewebe des Bruders (II3)

durchgeführte Mikrosatellitenanalyse erbrachte einen in drei von drei Markern

instabilen Tumor (MSI-H), die immunhistochemische Färbung wies eine gute

nukleäre Reaktion für MSH2 und MLH1 nach, die Anfärbbarkeit für MSH6

zeigte einen Verlust diese DNA-Reparaturproteins. Die Tochter des Bruders

war bereits mehrfach von kolorektalen Adenomen betroffen, die immer im

Gesunden entfernt werden konnten. Auch beim Sohn des Bruders (III5) wurden

seit dem 28. Lebensjahr regelmäßig tubuläre Adenome diagnostiziert.

Beim Indexpatienten wurde auf Grund des immunhistochemischen

Untersuchungsergebnisses eine DNA-Analyse des MSH6-Gens durchgeführt,

die die bereits in der Familie BO-0540-2 gefundenene Mutation c.3261_3262

insC erbrachte. Bei der prädiktiven Testung der Verwandten wurde beim älteren

Sohn des Indexpatienten (III1), seiner Tochter (III3), seinem Bruder (II3) sowie

dessen Tochter (III6) und Sohn (III5) dieselbe Mutation nachgewiesen. Beim

jüngeren Sohn des Indexpatienten (III2) konnte die Mutation ausgeschlossen

werden.

Ergebnisse 49

Tabelle 3.3.4.1.: Tumormanifestationen in der Familie BO-0613-4

Manifestation

(Alter in

Jahren bei

ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile Marker/

getestete Marker)

Immun-

histochemie

Indexpatient

(II1)

CRC (50)

tubuläres

Adenom (68)

Amsterdam I

Bruder (II3) CRC (45,58)

tubuläres

Adenom (63)

MSI-H (3/3) MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 neg.

Sohn des

Bruders

(III5)

tubuläre

Adenome

(28,29,30,31)

Tochter des

Bruders

(III6)

tubuläre

Adenome

(32,33)

Mutter (I2) CRC (72),

tubulovillöses

Adenom (72)

Ergebnisse 50

Weitere Stammbäume, bei denen keine Mutation nachweisbar war, befinden

sich im Anhang.

Diskussion 51

4 DISKUSSION

4.1 SCREENING VERSUS DIREKTE SEQUENZIER-ANALYSE

4.1.1 Verschiedene Screening-Verfahren

Der Mutationsnachweis im MSH6-Gen erfolgte mittels Sequenzier-Analyse. Da

die Sequenzierung ein sehr aufwändiges und teures Verfahren ist, wurde in

dieser Arbeit ein Screening mit dem DHPLC-Verfahren WAVE™ etabliert, das

eine Sequenzierung nur noch bei Auffälligkeiten im WAVE™-Chromatogramm

erforderlich macht. Die Anforderungen an ein Screeningverfahren sind beim

MSH6-Gen besonders hoch, da das Spektrum der Mutationen über alle Exons

verteilt ist und ein Großteil an Punktmutationen zu erwarten ist (Human Gene

Mutation Database Cardiff 2005). Einige Autoren haben als Screening-

Verfahren die single strand conformation polymorphism (SSCP)-Methode

verwandt (de Leon et al., 1999; Park et al., 1999), die in vergleichenden

Untersuchungen mitunter als zu insensitiv bewertet wird (Gross et al., 1999;

Yamanoshita et al., 2005), wohingegen die DHPLC-Methode sich als ein

zuverlässigeres Screening-Verfahren erwies (Gross et al., 1999; Takashima et

al., 2001; Yamanoshita et al., 2005). Die Voruntersuchung der Patientenproben

mittels der WAVE™-Technologie hat viele Vorzüge und gewisse Nachteile

gegenüber der direkten Sequenzier-Analyse des Gens, die in den folgenden

Kapiteln erläutert werden.

4.1.2 Zeitersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse

Der Arbeitsaufwand für die DHPLC-Analyse ist ca.10-fach geringer als für die

Sequenzierung (Takashima et al., 2001), wobei die Zeitersparnis vor allem bei

hohem Probendurchsatz zum Tragen kommt, da bis zu 192 Proben in einem

Arbeitsgang untersucht werden können. Im Unterschied zum DHPLC-

Verfahren, bei dem ein PCR-Ansatz direkt für die Analyse verwendet werden

kann, sind dem Sequenziergel die Aufreinigung des Amplifikats, die

Sequenzierreaktion und eine Präzipitation vorgeschaltet (s. Kap. 2.3.2).

Der Aufwand für die Sequenzier-Analyse kommt sowohl durch die reine

Arbeitszeit zustande, als auch durch die zahlreichen Verzögerungen während

der Geräteläufe und Inkubationszeiten, die vor allem bei den

Diskussion 52

Zentrifugationsschritten nur geringfügig variieren dürfen, was die Möglichkeiten

des Erledigens andere Tätigkeiten während der Wartezeiten einschränkt. Hinzu

kommt, dass sich die Anzahl der Proben, bedingt durch das Erstellen von

mindestens einer Vorwärts- und Rückwärts-Sequenz pro Amplikon ab der

Sequenzier-PCR verdoppelt.

Die Probenzahl pro Arbeitsschritt ist bei der direkten Sequenzierstrategie

deutlich limitierter einerseits durch die Anzahl der Spuren auf dem

Sequenziergel, die am ABI 377 maximal 96 beträgt, andererseits durch die Zahl

der Steckplätze pro Zentrifuge sowie bei der Äthanol-Präzipitation nach der

Zentrifugation durch die Resuspension des Präzipitats der zuletzt verarbeiteten

Proben, so dass die in einem Durchgang zu verarbeitende Probenzahl in

Abhängigkeit des Experimentators nur bis zu 12 beträgt.

Die Analyse der DHPLC-Chromatogramme nimmt weniger Zeit in Anspruch, da

für jede Probe je nach Anzahl der durchgeführten Messungen nur zwei bis drei

Signale zu beurteilen sind, während die Sequenzelektropherogramme deutlich

mehr Informationen enthalten und letztendlich doch Base für Base kontrolliert

werden müssen.

Die Zeitersparnis der DHPLC-Analyse wird dadurch eingeschränkt, dass sie bei

allen Auffälligkeiten durch nachgeschaltete Sequenzierung ergänzt werden

muss, um die Basenveränderung genau zu klassifizieren (s. Kap. 4.1.6).

4.1.3 Kostenersparnis durch Screening mittels DHPLC-Analyse

Die Kosten für die DHPLC-Analyse betragen laut Takashima et al. nur ein

Fünftel im Vergleich zur Sequenzierung (Takashima et al., 2001), wobei pro

Injektion 0,9 $ für die WAVE™-Analyse mit Transgenomic-Reagentien und 5-

7 $ für die Sequenzierung mit dem ABI 377-Sequenzierautomaten veranschlagt

wurden. Beim WAVE™-Verfahren sind die Puffer und die Säule die größten

Kostenfaktoren, während bei der Sequenzierung die Reagentien der

Sequenzier-PCR hauptsächlich ins Gewicht fallen. Da in dieser Arbeit 2-3

DHPLC-Analysen pro Probe, also 2-3 Injektionen à 0,9$, durchgeführt wurden,

betragen die Kosten noch die Hälfte im Vergleich zum Sequenzierverfahren.

Die Kostenersparnis wird ebenfalls durch die notwendige Sequenzierung bei

Auffälligkeiten eingeschränkt. Dies führt in Abhängigkeit von der Anzahl und

Häufigkeit von Polymorpismen in der jeweiligen exonischen und der

Diskussion 53

flankierenden intronischen Sequenz dazu, dass in Exon 1 praktisch jede Probe

nach der DHPLC-Analyse sequenziert werden muss. Exon 2, 3, 5, 7 und 8

müssen in einem Teil der Fälle nachuntersucht werden, während Exon 4, 6, 9

und 10 nur vereinzelt sequenziert werden müssen.

4.1.4 Faktoren beim Etablieren der Analysebedingungen

Die verschiedenen Schritte zur Sequenzier-Analyse einer amplifizierten Probe

waren im Labor bereits optimiert und verlaufen für jedes Fragment in der

gleichen Weise. Bereits im ersten Durchgang kann die Basenfolge analysiert

und ausgewertet werden. Im DHPLC-Verfahren sind für jedes Fragment

Informationen über die Retentionszeit, den Verlauf der Schmelzkurven und ggf.

das Verhalten von Kontrollproben notwendig. Die Erstellung eines

Universalgradienten ist hierbei unabdingbar, da das praktische Denaturierungs-

verhalten von der theoretischen Schmelzkurve abweichen kann. Der Anteil der

Doppelstränge wird in der praktischen Schmelzkurve durch die Retentionszeit

wiedergegeben, die durch das unterschiedliche Bindungsverhalten der DNA an

die Säule (s. Kap. 2.3.3.1) mit dem Anteil der Doppelstränge korreliert (s. Abb.

19 und 20).

Diskussion 54

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

52 54 56 58 60 62 64 66 68 70

Temperatur (°C)

Ret

entio

nsze

it(m

in)

X

X

Abbildung 19: Theoretische Schmelzkurve des Fragments: Ex 4a. Hier fällt auf, dass die

Absorptionskurve zwei Wendepunkte (X) durchläuft, die dadurch zustande kommen, dass

innerhalb des Fragments einzelne Abschnitte des Doppelstrangs sich schon bei niedrigeren

Temperaturen zu Einzelsträngen denaturieren lassen als der Rest des Fragments. In diesem

Zusammenhang spricht man daher auch von verschiedenen Schmelzdomänen.

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

Temperatur (°C)

Ret

enti

onsz

eit(

min

)

Abbildung 20: Die anhand des Universalgradienten (s. Abb. 8) erstellte praktische

Schmelzkurve zeigt im Vergleich zur theoretischen Schmelzkurve (s. Abb. 19) einen um 2-3°C

nach rechts verschobenen Beginn und Abschluss der Denaturierung, die zwei

Schmelzdomänen der theoretischen Schmelzkurve finden sich nur leicht angedeutet.

Gründe für die Differenzen von theoretischer und experimentell ermittelter

Schmelzkurve können eine Ungenauigkeit der Formel, ein dekalibrierter Ofen,

Ablagerungen an der Säule, eventuelle Verunreinigungen der Probe wie z. B.

Nebenprodukte in der PCR oder Primerdimere sein.

Diskussion 55

4.1.5 Anfälligkeit für Störfaktoren

Wie auch bei der in-vivo-Replikation von Mikrosatelliten (s. Kap. 1.3.1), kann es

unter Laborbedingungen bei repetitiven Sequenzen zum slippage kommen. Da

für die Replikation im Labor eine Polymerase ohne Exonuklease-Funktion

benutzt wird und die in der Zelle vorhandenen Reparaturenzyme in dem PCR-

Ansatz nicht vorhanden sind, kann unter Laborbedingungen im Gegensatz zur

in vivo-Situation bereits eine bedeutend geringere Anzahl von Repetitionen zu

fehlerhaften Amplifikaten führen. Faktoren wie Anzahl der PCR-Zyklen, das

Polymerase-Enzym, die flankierenden Sequenz und weitere Bestandteile des

PCR-Ansatzes, die das Bindungsverhalten der Polymerase zur DNA

beeinflussen, spielen ebenfalls eine Rolle (Kunkel and Bebenek, 2000).

Wird bei der PCR eine solche simple repetitive Sequenz amplifiziert, entstehen

auf Grund der durch slippage entstandenen Deletionen und Insertionen

unterschiedlich lange Stränge („Stotterbanden“), die Probleme bei der

anschließenden Längenanalyse bereiten können. In der Sequenzierung wird

durch die Überlagerung der Elektropherogramme die Zuordnung der

Farbsignale zu den Basen im Bereich hinter der repetitiven Sequenz erschwert.

Dadurch können Sequenzvariationen manchmal nur in einer Richtung detektiert

werden.

Im DHPLC-Verfahren werden die kürzeren Fragmente bei geringerer

Acetonitrilkonzentration von der Säule gespült, so dass das Chromatogramm

ein verbreitertes Signal zeigt. Dennoch ist das DHPLC-Verfahren für repetitive

Sequenzen besser geeignet als die Sequenziermethode, da das

Chromatogramm einen verbreiterten, innerhalb eines Laufes jedoch uniformen

Verlauf zeigt. Zusätzliche Sequenzänderungen erzeugen weitere

Veränderungen des Extinktionsmusters, die sich deutlich abgrenzen lassen (s.

Abb. 21). Das ist dadurch bedingt, dass die Sekundärstruktur der Fragmente ab

der 2. Base vor und hinter den Insertionen und Deletionen nahezu unverändert

vorliegt (SantaLucia and Hicks, 2004). Liegen in diesen Bereichen jedoch

Basenänderungen in heterozygotem Zustand vor, führen sie zu einer

Veränderung der Sekundärstruktur auch dieser Abschnitte, die im DHPLC-

Verfahren erfasst werden kann.

Im Sequenziergel werden die Fragmente der Länge nach aufgetrennt, so dass

eine Größenveränderung durch slippage hier besonders ins Gewicht fällt.

Diskussion 56

Problematisch ist dies vor allem bei mehreren repetitiven Sequenzen innerhalb

eines Amplikons, wodurch der Bereich zwischen den repetitiven Sequenzen

sowohl in der Vorwärts- als auch in der Rückwärtssequenz beeinträchtigt ist.

Deutlich wird das am Vergleich der Sequenz- und der WAVE™-

Chromatogramme des Polymorphismus c.3646+31InsATCT in Exon 7. In dem

Sequenzelektropherogramm ist die Insertion in heterozygotem Zustand an der

nachfolgenden Signalüberlagerung zu erkennen, während die Proben mit

homozygoter Basenänderung nur durch den Vergleich der Basenfolge mit der

Wildtypsequenz zu beurteilen sind. Für die Darstellung der Basenänderung mit

der Sequenziermethode mussten spezielle Oligonukleotide benutzt werden (s.

Kap. 3.2.2).

Das WAVE™-Chromatogramm ist auf Grund von 14 aufeinanderfolgenden

Thymidin-Resten in der intronischen Sequenz in 5’-Richtung kurz vor Exon 7

verändert (s. Abb. 21) und zeigt durch slippage bereits im Wildtyp (BO-0676-0)

ein zweigipfliges Vorsignal, das in der Probe BO-0714-2 mit der homozygoten

Insertion die Höhe des 4-Minutensignals übersteigt und dreigipflig wird. Durch

die Insertion in heterozygotem Zustand bekommt das Vorsignal vier Maxima

und nimmt im Vergleich zum Wildtyp und zur "homozygoten" Insertion deutlich

an Breite zu, ähnelt jedoch im Extinktionsverhältnis zum 4-Minutensignal dem

Wildtyp. Hier zeigt sich, dass der Polymorphismus c.3646+31InsATCT trotz

slippage im WAVE™-Chromatogramm gut darzustellen ist.

Diskussion 57

BO-0572-6

BO-0714-2

BO-0676-0

Abbildung 21: Der Polymorphismus c.3646+31InsATCT ohne Insertion beim Patienten BO-

0676-0 (Wildtyp), mit einer Insertion in heterozygotem Zustand bei dem Patienten BO-0572-6

und im homozygoten Zustand bei dem Patienten BO-0714-2. Links sind die Sequenz- und

rechts die WAVE™- Chromatogramme mit der Pufferkonzentration 55-63 % Puffer B bei 54°C

abgebildet.

4.1.6 Nachweis einer Sequenzänderung im DHPLC-Verfahren

Ein entscheidender Faktor in der Beurteilung der Zeit- und Geldersparnis des

DHPLC-Verfahrens ist die Frage, in welchen Fällen es durch Sequenzanalyse

ergänzt werden muss. Verschiedene Autoren (Yu et al., 2005; Gross et al.,

1999) setzen das DHPLC-Verfahren als Diagnostikum für Polymorphismen ein,

indem sie eine sequenzierte Kontrollprobe, die in dem gleichen Lauf analysiert

wird, mit dem Kurvenverlauf des Chromatogramms der Patientenprobe

vergleichen und bei Übereinstimmung die gleiche Sequenzänderung

diagnostizieren. Das Erkennen einer weiteren Sequenzänderung, die in dem

gleichen Amplikon wie der Polymorphismus liegt, ist ebenfalls möglich (Gross et

al., 1999), jedoch zeigen die Chromatogramme von Ex 4a (s. Abb. 22), in

dessen Bereich zwei Polymorphismen liegen, dass der Kurvenverlauf von

Patienten mit beiden in der Sequenzierung nachgewiesenen Polymorphismen

Diskussion 58

in heterozygotem Zustand sich nicht wesentlich von dem der Patienten mit nur

einem einzigen Polymorphismus unterscheidet.

Kontrolle

BO-0518-5

BO-0559-1

BO-0572-6

BO-0714-2

BO-0676-0

BO-0694-4

BO-0701-3

Abbildung 22: WAVE™-Chromatogramme von Ex 4a bei 55°C und 58-66 % Puffer B. Die

Wildtyp-Proben (BO-0559-1, BO-0714-2, BO-0694-4) unterscheiden sich von den Proben mit

Basenveränderung (2.und 4. Zeile). Die Proben BO-0518-5 und BO-0572-6 sind heterozygot für

den Polymorphismus c.628-56C>T; die Proben BO-0676-0 und BO-0701-3 sind heterozygot für

die Polymorphismen c.628-56C>T und c.642C>T. Hier fällt die Unterscheidung zwischen den

Proben mit einer und zwei heterozygoten Basenänderungen schwer.

Die Schwierigkeit in der Chromatogramm-Analyse steigt mit der Zahl der

Polymorphismen innerhalb eines Amplikons, da die Verwechselungsgefahr mit

einer unbekannten Mutation größer wird. Vor allem solche Mutationen, die in

der gleichen Schmelzdomäne wie die Polymorphismen liegen, könnten einen

ähnlichen Kurvenverlauf im DHPLC-Chromatogramm hervorrufen. Allerdings

wird die freie Enthalpie der Watson-Crick-Basenpaare ab der 2. Base vor und

hinter einem mismatch nicht mehr signifikant beeinflusst und auch an direkten

Nachbarpositionen führt ein Basenaustausch zu einer Veränderung der freien

Enthalpie. In obigem Beispiel liegen die beiden Basenänderungen in

benachbarten Schmelzdomänen, die sich im Denaturierungsverhalten um 3°C

unterscheiden, was erwarten ließe, dass der jeweilige Basenaustausch bei

Diskussion 59

verschiedenen Analysetemperaturen detektiert werden kann. Dies zeigte sich in

den Messungen jedoch nicht.

Der Polymorphismus c.628-56C>T führt zu einer Zunahme der freien Enthalpie

bei 37°C um 2,94 kcal·mol-1, der Polymorphismus c.642C>T zu einer weiteren

Zunahme von 3,21 kcal·mol-1 (berechnet nach SantaLucia and Hicks, 2004),

was zu einer weiteren Verkürzung der Retentionszeit der Heteroduplices führen

müsste. Somit ist es überraschend, dass obwohl die Änderung der freien

Enthalpie für beide Basenaustausche etwa gleich groß ist, die Kombination

beider Veränderungen nicht von dem Auftreten eines Einzelnen zu

unterscheiden ist. Es findet sich kein kausaler Zusammenhang für den kaum

erkennbaren Unterschied der Chromatogramme.

Aus diesem Zusammenhang wird deutlich, dass es für die Diagnostik von

unbekannten Mutationen sinnvoll ist, jede Änderung vom Wildtyp im WAVE™-

Chromatogramm zu sequenzieren.

4.1.7 Sensitivität und Spezifität

Wichtig für eine zuverlässige Voruntersuchung der Proben mittels DHPLC-

Verfahren ist eine hohe Sensitivität im Vergleich zum (derzeitigen)

Referenzverfahren der Sequenzier-Analyse. In vergleichenden Untersuchungen

an verschiedenen Genen wurde für DHPLC eine Sensitivität von 97-100%

ermittelt. Die Spezifität des Verfahrens wurde je nach Untersuchung mit 85-

100% beziffert (Holinski-Feder et al., 2001; Gross et al., 1999; Takashima et al.,

2001; Yamanoshita et al., 2005). In dieser Arbeit konnte, bis auf die

zusätzlichen heterozygoten Polymorphismen in Exon 4 (s. Abb. 22), jede

Basenänderung mit der WAVE™-Technologie nachgewiesen werden, was

einer Sensitivität von annähernd 100% entspricht. Bei den Proben, die in der

Sequenzier-Analyse keine Basenänderung zeigten, wurden auch im DHPLC-

Verfahren Wildtypen nachgewiesen entsprechend einer Spezifität von 100%, so

dass vorbehaltlich des Fehlens eines dritten Vergleichsverfahrens von einer

hervorragenden Aussagekraft der Ergebnisse im DHPLC-Verfahren

auszugehen ist.

4.2 KRANKHEITSVERLÄUFE

Träger einer HNPCC-auslösenden Genmutation haben gegenüber der

Allgemeinbevölkerung ein erhöhtes Risiko, kolorektale und andere Tumoren zu

Diskussion 60

entwickeln. Dabei varriert die Ausprägung der Tumordisposition in Abhängigkeit

von dem betroffenen Gen. Für Personen mit einer Mutation im MSH6-Gen wird

von verschiedenen Autoren ein durchschnittlich 10 Jahre höheres

Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz (Kolodner et al., 1999; Wagner

et al., 2001; Rüschoff et al., 2004) als für Personen mit Mutation im MSH2 bzw.

MLH1-Gen angegeben.

4.2.1 Geringere Penetranz und höheres Erkrankungsalter von Patienten mit Mutation im MSH6-Gen

Eine mögliche Erklärung für die geringere Penetranz und das höhere

Erkrankungsalter von Patienten mit Mutationen im MSH6-Gen bietet die unter

Kap. 1.2 beschriebene Dimer-Bildung. Während bei einer Mutation im MSH2-

Gen sowohl das Dimer MutSα (MSH2/MSH6) als auch das Dimer MutSβ

(MSH2/MSH3) ausfallen, ist bei einer Mutation im MSH6-Gen nur der Komplex

MutSα betroffen, dessen Funktion teilweise von MutSβ übernommen werden

kann (s. Abb. 2).

Ist nach der unter Kap. 1.2 beschriebenen Theorie von Knudson bei HNPCC

durch eine Keimbahnmutation eines DNA-Reparaturenzyms und zusätzlich

durch eine somatische Mutation ein Teil des "DNA-Reparatursystems"

funktionell weniger effizient, so müsste die Latenz vom Ausfall bis zum

Auftreten einer malignen Entartung bei mutiertem MSH6-Gen größer sein als

bei Mutation im MSH2-Gen, da durch den noch vorhandenen Komplex MutSβ

weniger Mutationen im Genom durch das "Reparatursystem" unentdeckt

bleiben.

Darauf deuten auch Beobachtungen von MSH6- bzw. MSH2-defizienten

Mäusen hin. Während die mittlere Lebensdauer der MSH2-defizienten Mäuse

bei 5-6 Monaten lag (Reitmair et al., 1995) überlebten die MSH6-defizienten

Mäuse im Durchschnitt 10 Monate (Edelmann et al., 1997).

Überraschenderweise entwickelten die Mäuse überwiegend Lymphome, die

sich auch bei einzelnen Fallbeispielen von Personen mit homozygoter Mutation

in einem der MMR-Gene zeigen (Menko et al., 2004; Bandipalliam, 2005). Bei

der überwiegenden Zahl von Menschen mit Mutation in heterozygotem Zustand

gehören Lymphome nicht zum Spektrum der HNPCC-assoziierten Tumoren.

Diskussion 61

4.2.2 Krankheitsverläufe der untersuchten HNPCC-Patienten

Die in dieser Arbeit untersuchten Patienten mit nachgewiesener MSH6-

Genmutation in heterozygotem Zustand zeigten syn- oder metachrone

Tumorentstehung sowie ein früheres Auftreten von Tumoren, als es aus

verschiedenen Studien an HNPCC-Patienten mit MSH6-Genmutation zu

erwarten wäre. Dort wurden ein durchschnittlich 10 Jahre späteres

Erkrankungsalter und eine geringere Penetranz im Vergleich zu Patienten mit

Mutation im MSH2- oder MLH1-Gen nachgewiesen (Kolodner et al., 1999;

Wagner et al., 2001; Rüschoff et al., 2004). In der Familie BO-0613-4

entwickelte der Indexpatient ein CRC mit 50, der Bruder mit 45 und 58 Jahren,

bei dessen Sohn und Tochter wurden seit dem 28. bzw 32. Lebensjahr

wiederholt tubuläre Adenome entfernt. Beim Indexpatienten der Familie BO-

0540-2 wurde im Alter von 38 Jahren CRC entdeckt. Seitdem wurden bei ihm

regelmäßig neue Dickdarmpolypen endoskopisch entfernt. Die Großmutter der

Familie BO-0503-3 verstarb mit 40 am CRC. Bei der Indexpatientin wurden

erstmalig mit 39 Jahren Adenome im Kolon diagnostiziert. In der Familie BO-

0509-4 erkrankte der Indexpatient mit 43 am CRC und verstarb mit 45 am

Pankreaskarzinom (s. Kap. 3.3). Damit findet sich in jeder Familie ein

Familienmitglied mit frühem Krankheitsbeginn bzw. eine mehrfach betroffene

Person.

Die Patientenzahl ist insgesamt noch zu gering, um eine valide statistische

Aussage treffen zu können. Dennoch machen diese Verläufe deutlich, dass

auch bei Familien mit MSH6-Genmutation mit vergleichsweise schweren

Krankheitsbildern zu rechnen ist. Das unter Kap. 1.1.4 aufgeführte

Früherkennungsprogramm sollte somit für Personen mit Keimbahnmutation im

MSH6-Gen beibehalten werden. Gründe für die unerwartet schwerwiegenden

Verläufe können eine zufällige Häufung schwerer Verläufe sein oder eine

Selektion schwerer betroffener Familien durch die Diagnosekriterien.

4.2.3 Patienten ohne Mutationsnachweis

Bei sieben der elf Patienten wurde keine Mutation des MSH6-Gens gefunden.

Eine Erklärung hierfür ist, dass andere Gene des MMR wie zum Beispiel MSH2,

MLH1 und PMS2 (s. Kap. 1.2) ursächlich für HNPCC sind, was bei einigen

Patienten bereits vorher ausgeschlossen worden war. Bei den Proben ohne

Diskussion 62

Mutationsnachweis konnte die immunhistochemische Analyse aus

organisatorischen Gründen erst nach der Mutationsanalyse durchgeführt

werden. Hier ergab sich in Übereinstimmung zum Sequenzbefund kein Ausfall

des MSH6-Proteins.

Des Weiteren können außerhalb des MMR-Systems weitere Gene für familiäre

Tumordisposition verantwortlich sein, wie z. B. das APC-, MYH-, STK11/LKB1-

Gen (Schmiegel et al., 2004, s. Kap. 1.1.2), die auf Grund der unterschiedlichen

Symptomatik nicht untersucht wurden und die einen MSS-Phänotyp gezeigt

hätten. Ein MSI-H-Phänotyp könnte jedoch durch Promotermethylierung von

MLH1 bedingt sein, wie es im Großteil der sporadischen CRC mit MSI-H-

Phänotyp der Fall ist (Umar et al., 2004). Weitere Syndrome, deren genetischer

Hintergrund noch nicht aufgeklärt ist, kommen als Ursache ebenso in Frage.

Darüber hinaus ist zu bedenken, dass auch "sporadischer" Darmkrebs ohne

vorhandene Keimbahnmutationen in einer Familie gehäuft auftreten kann, so

dass die Diagnosekriterien für HNPCC erfüllt werden, insbesondere wenn durch

eine somatische Inaktivierung eine MSI vorliegt, wie es in 12-15% der

sporadischen Kolontumoren der Fall ist (s. Kap. 1.3.1).

Möglich ist ebenfalls, dass eine Mutation im MSH6-Gen vorlag, die mit den hier

verwendeten Verfahren nicht nachgewiesen werden konnte, wie z. B. eine

große Deletion, die zum Fehlen eines oder mehrerer Exons des Gens führt. Der

Promoterbereich wurde von den hier verwendeten Primern ebenfalls nicht

erfasst. Veröffentlichungen, in denen über genomische Deletionen im MSH6-

Gen berichtet wird, zeigen zahlreiche große Deletionen im MSH2-Gen, jedoch

nur sehr vereinzelte oder gar keine im MSH6-Gen oder MLH1-Gen

(Charbonnier et al., 2002, Wagner et al., 2003, van der Klift et al., 2005). Dies

lässt vermuten, dass dieser Mutationstyp im MSH6-Gen selten ist.

4.2.4 Mikrosatelliteninstabilität

Laut den Kriterien für HNPCC (s. Kap. 1.1.1) ist nur ein MSI-H-, nicht aber ein

MSI-L-Tumor als Kriterium für HNPCC zu werten. Wie in Kap. 4.2.1 erwähnt,

gibt es Gründe für mildere Erkrankungsbilder bei Patienten mit Mutationen im

MSH6-Gen als bei Patienten mit Mutationen in den MSH2- oder MLH1-Genen.

Aus den gleichen Gründen wäre es möglich, dass auch die Mikrosatelliten bei

Tumoren mit ausgefallenem MSH6 weniger stark verändert sind als bei

Diskussion 63

Tumoren mit dysfunktionellem oder ausgefallenem MSH2- oder MLH1-Protein.

Einen ersten Hinweis darauf liefert die MSH6-defiziente Maus, deren Tumoren

nur geringe Mikrosatelliten-instabilität aufweisen. Wu et al. entdeckten in einer

Untersuchung an 18 Patienten mit klinischen Verdacht auf ein HNPCC-

Syndrom und MSI-L- Tumoren 4 Patienten mit MSH6-Keimbahnmutation (Wu et

al., 1999). In einer anderen Untersuchungen an Patienten mit MSI-L Tumoren

wurde wiederum keine Mutation im MSH6-Gen nachgewiesen, allerdings waren

in das untersuchte Kollektiv Patienten mit MSI-L Tumoren unabhängig von den

klinischen Diagnosekriterien eingeschlossen, was die Wahrscheinlichkeit des

Auffindens einer MSH6-Keimbahnmutation erheblich vermindert (Cunningham

et al., 2001). In die hier untersuchte Patientengruppe wurde nur ein Patient mit

einem MSI-L Tumor (BO-0701-3) eingeschlossen, bei dem ebenfalls keine

Mutation im MSH6-Gen nachgewiesen wurde. Die Mutationen wurden nur bei

Patienten mit MSI-H-Tumoren nachgewiesen.

Die derzeitigen Empfehlungen der überarbeiteten Bethesda-Kriterien beinhalten

jedoch, dass lediglich bei MSI-H-Tumoren eine genetische Testung erfolgen

sollte, wobei der Status der MSI-L-Tumoren noch nicht völlig geklärt ist (Umar

et al., 2004). Zur besseren Einordnung von MSI-L-Tumoren werden die

etablierten fünf Mikrosatellitenmarker bei MSI-L-Status auf zehn erweitert,

wovon für einen MSI-H-Status drei instabil beurteilt sein müssen. Damit ist die

Gefahr des Ausschließens von Patienten mit Keimbahnmutation eines MMR-

Gens deutlich minimiert (Boland et al., 1998, Engel et al., 2006).

4.2.5 Immunhistochemie

An den hier untersuchten Patienten konnte die immunhistochemische

Untersuchung aus organisatorischen Gründen teilweise erst durchgeführt

werden, als die Mutationsanalyse bereits begonnen worden war. Die Personen,

bei denen noch Tumormaterial vorhanden war und die ohne Mutationsnachweis

im MSH6-Gen blieben, zeigten in der immunhistochemischen Färbung positive

nukleäre Reaktionen auf MSH6. Bei den Personen mit Mutationsnachweis war

das MSH6-Protein in den Tumoren ausgefallen. Damit zeigt sich, dass die

immunhistochemische Testung auf MSH6 ein weiteres Mittel zur Eingrenzung

des in der Keimbahnmutationsanalyse zu untersuchenden Gens ist, deren

Sensitivität und Spezifität sich hier als gut erwies.

Diskussion 64

Engel et al. haben im Hinblick auf Kosten- und Zeitersparnis eine

Vorgehensweise für das diagnostische Verfahren vor der Mutationsanalyse

entwickelt, die zu einer 25%-igen Kostenreduktion führen soll. Nach Selektion

durch die klinischen Kriterien wird bei zuerst erfolgter Mikrosatellitenanalyse

Immunhistochemie nur im Falle eines MSI-H-Status durchgeführt wird, bei

zuerst vorgenommener immunhistochemischer Färbung schließt sich beim

Ausfall eine Mutationsanalyse direkt an, bei unauffälligen Färbungsresultaten ist

das Ergebnis der Mikrosatellitenanalyse entscheidend. Die Autoren weisen

jedoch ausdrücklich darauf hin, dass diese Vorgehensweise nicht zur

zuverlässigen Selektion von Personen mit Mutation im MSH6-Gen dient (Engel

et al., 2006).

Ausblick 65

5 AUSBLICK Durch die Sequenzierung des MSH6-Gens ist es möglich, eine kausal-

pathogenetische Ursache für HNPCC zu identifizieren. Bei nachgewiesener

Mutation besteht darüber hinaus die Möglichkeit, Blutsverwandte auf die gleiche

hin Mutation zu untersuchen und prädiktiv, d. h. vor dem Auftreten klinischer

Symptome, die Diagnose HNPCC zu stellen oder auszuschließen.

Da die Sequenzierung des gesamten Gens sehr aufwändig ist, wurde hier ein

screening-Verfahren etabliert, das die Arbeitszeit und -kosten reduziert. Eine

weitere Reduzierung des Aufwands für die Keimbahnmutationsanalyse kann

dazu führen, dass ein größerer Personenkreis in die Untersuchungen

eingeschlossen werden kann. Insbesondere im Hinblick auf die geringere

Penetranz und das höhere Erkrankungsalter bei MSH6-Keimbahnmutation wäre

es möglich, die klinischen Diagnosekriterien zu erweitern, die Technik der

immunhistochemischen Färbung für die MMR-Enzyme zu optimieren und

weitere MMR-Enzyme mit einzuschließen und so die Gefahr des Ausschließens

von Mutationsträgern weiter zu vermindern. Eine routinemäßige Genanalyse bei

klinischem Verdacht auf HNPCC ohne Voruntersuchungen ist in absehbarer

Zeit noch zu zeit- und kostenintensiv.

Für den häufigsten HNPCC-assoziierten Tumor, das CRC, besteht bereits eine

effektive Früherkennung. Die Erkennung von Tumoren in Magen, Endometrium,

Ovar, den ableitenden Harnwegen, im hepatobiliären System und dem Gehirn

bietet jedoch weniger Möglichkeiten, Tumoren im Frühstadium zu erkennen, so

dass der Zeitpunkt einer möglichen operativen Therapie mit kurativer

Zielsetzung häufig überschritten ist. Da die Inzidenz dieser Tumoren bei

HNPCC jedoch deutlich geringer ist, fallen diese Karzinome bei der Mortalität

kaum ins Gewicht, jedoch sollten für alle HNPCC-assoziierten Tumoren

effektive und praktikable Früherkennungsmöglichkeiten entwickelt werden. Um

die Wirksamkeit der Früherkennungsmaßnahmen zu untersuchen, ist es

unabdingbar, ein umfangreiches und gut charakterisiertes Patientenkollektiv zu

betreuen und weiter auszubauen.

Zusammenfassung 66

6 ZUSAMMENFASSUNG Die erbliche Darmkrebserkrankung HNPCC (Hereditary Non-Polyposis

Colorectal Cancer) bildet mit 2-3% aller kolorektalen Karzinome die größte

Entität der erblichen Darmkrebserkrankungen. Sie wird meist durch Mutationen

in den Genen MSH2 und MLH1 verursacht. Seltener findet man eine Mutation

im MSH6-Gen, das hier bei Patienten mit HNPCC-Syndrom untersucht werden

sollte. Für MSH6-Mutationsträger wird in der Literatur ein ~10 Jahre höheres

Erkrankungsalter und geringere Penetranz angegeben. Für diese

Mutationsträger gilt jedoch andererseits dasselbe Früherkennungs- und

Vorsorgeschema wie für Patienten mit Mutationen in anderen HNPCC-

auslösenden Genen. In dieser Arbeit wurde nach Vorauswahl durch klinische

Diagnosekriterien, Mikrosatellitenanalyse und immunhistochemische Tests im

Tumormaterial bei 11 Patienten die MSH6-Keimbahnanalyse durchgeführt. Die

exonischen und flankierenden intronischen Abschnitte des Gens wurden sowohl

mit denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) untersucht

wie auch sequenziert. Die DHPLC-Technologie WAVE™ wurde zur

zuverlässigen und vergleichsweise kostengünstigen Voruntersuchung der

Proben etabliert. Im Patientenkollektiv fanden sich bei der

Keimbahnmutationsanalyse alle bekannten häufigen Polymorphismen. Bei vier

der elf Indexpersonen waren die für HNPCC pathogenetisch relevanten

Mutationen nachweisbar. Die Mutationen betrafen Exon 4 (1X) und 5 (3X).

Patienten mit MSH6-Mutation sowie deren Familienangehörige wiesen den

typischen HNPCC-Phänotyp auf. Insbesondere zeigten einzelne Personen

frühe Tumorentwicklung und metachrone Tumorentstehung. Damit ist neben

den MLH1- und MSH2-Mutationsträgern auch bei Patienten mit MSH6-Mutation

mit schwereren Krankheitsverläufen zu rechnen. Die von der Deutsche

Gesellschaft für Verdauungs- und Stoffwechselkrankheiten (DGVS)

veröffentlichten Leitlinien zur Früherkennung bei HNPCC-Familien sollte folglich

für Patienten und Angehörige mit Mutation im MSH6-Gen keinesfalls gelockert

werden.

Literaturverzeichnis 67

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Wijnen, J. T., Leeuw, W. D., Vasen, H., Klift, H. V. D., Møller, P., Stormorken, A., Meijers-Heijboer, H., Lindhout, D., Menko, F., Vossen, S., Möslein, G., Tops, C., Bröcker-Vriends, A., Wu, Y., Hofstra, R., Sijmons, R., Cornelisse, C., Morreau, H. and Fodde, R. (1999). Familial endometrial cancer in female carriers of MSH6 germline mutations. nature genetics 23, 142-144.

Wijnen, J. T., Vasen, H. F. A., Khan, P. M., Zwinderman, A. H., van der Klift, H., Mulder, A., Tops, C., Moller, P., Fodde, R., Menko, F., Taal, B., Nagengast, F., Brunner, H., Kleibeuker, J., Sijmons, R., Griffioen, G., Brocker-Vriends, A., Bakker, E., van Leeuwen-Cornelisse, I., Meijers-Heijboer, A., Lindhout, D., Breuning, M., Post, J., Schaap, C., Apold, J., Heimdal, K., Bertario, L., Bisgaard, M. L. and Goetz, P. (1998). Clinical findings with implications for genetic testing in families with clustering of colorectal cancer. New England Journal of Medicine 339, 511-518.

Wu, Y., Berends, M. J. W., Mensink, R. G. J., Kempinga, C., Sijmons, R.H., van der Zee, A. G. J., Hollema, H., Kleibeuker, J. H., Buys, C. and Hofstra, R. M. W. (1999). Association of hereditary nonpolyposis colorectal cancer-related tumors displaying low microsatellite instability with MSH6 germline mutations. American Journal of Human Genetics 65, 1291-1298.

Yamanoshita, O, Kubato, T., Jun, H., Ping, Y. M., Zhang, X. L., Li, X. P., Li, S. S., Li, X. X., Zhu, D. C., Fukushima, Y. and Nakajima, T. (2005). DHPLC is superior to SSCP in screening p53 mutations in esophageal cancer tissues. International Journal Of Cancer 114, 74-79.

Yu, B., Sawyer, N. A., Caramins, M., Yuan, Z. G., Saunderson, R. B., Pamphlett, R., Richmond, D. R., Jeremy, R. W. and Trent, R. J. (2005). Denaturing high performance liquid chromatography: high throughput


mutation screening in familial hypertrophic cardiomyopathy and SNP genotyping in motor neurone disease. Journal of Clinical Pathology 58, 479-485.

Anhang 74

8 Anhang

8.1 FAMILIEN OHNE MUTATIONSNACHWEIS

8.1.1 Familie BO-0549-9 Tabelle A8.1.1.1: Tumormanifestationen in der Familie BO-0549-9

Manifestation

(Alter in Jahren bei

ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status Immun-

histochemie

Indexpatient CRC (36) Amsterdam I/II kein

Material

kein

Material

Mutter CRC (68)

Großmutter Unterleibskrebs

(ED?)

7 Geschwister

der Mutter

CRC (ED?)

Neffe der

Mutter

CRC (ED?)

Nichte der

Mutter

Ovarialkarzinom

Nichte der

Mutter

CRC (55)

Großneffe der

Mutter

Gehirntumor (†21)

Großneffe der

Mutter

Gehirntumor (†20)

Anhang 75

A)68.LJ 32J

A)36.LJ

26JA)39.LJ

A)50.LJ A)84.LJ A)47.LJ A)48.LJ A)59.LJ A)50.LJ

C)50.LJ

D)21.LJ

A)?LJ

D)20.LJ

Legende:A)= CRCB)= UnterleibskrebsC)= OvarialkarzinomD)= Gehirntumor

Abbildung A1 : Stammbaum der Familie BO-0549-9

Die bei dem Indexpatienten im Alter von 36 Jahren auf Grund eines mehrfach

positiven Hämokkult-Tests, ziehender Schmerzen im Unterbauch sowie eines

Gewichtverlustes von 3kg innerhalb des letzten Monats durchgeführte

Koloskopie zeigte einen exophytisch wachsenden Prozess, der sich

histologisch als Adenokarzinom (pT3, pN0, M0) erwies. In dieser Familie waren

bereits zahlreiche Mitglieder an einem HNPCC-assoziierten Tumor erkrankt, die

Mutter an einem CRC mit 68 Lebensjahren, die Großmutter an einem

"Unterleibskrebs" (ohne nähere Angaben). Sieben Geschwister und ein Neffe

der Mutter erkrankten an CRC, eine Nichte der Mutter am Ovarialkarzinom und

zwei Großneffen der Mutter an einem Gehirntumor (s. Abb. 23 und Tab.

10.1.1.1), womit die Amsterdam I/II-Kriterien erfüllt sind. Da kein Tumormaterial

mehr vorhanden war, konnte weder eine Mikrosatellitenanalyse, noch eine

immunhistochemische Färbung durchgeführt werden. Die Sequenz der MSH2-,

MLH1- sowie MSH6-Gene zeigte keine pathogene Mutation.

Anhang 76

8.1.2 Familie BO-0634-3

7376

CRC (46)Corpus-

karzinom(55)CRC (61)

71CRC (61)Mamma-

karzinom(61)

~40 ~30 CRC(?)52 43

Unterleibs-karzinom

(30)?? ? ?

61 64

34

6 4

Buphthalmus,Koloskopieohne path.

Befund

Corpus-karzinom

(36)CRC (37)Mamma-karzinom

(53)rez.

Polypen

83 80 CRC(50) CRC (?)58 47 CRC

(45) 58 CRC(?) >80 46 66 >80Unterleibs

-Ca (?)

~55 ~65 ~60 ? ?? ? ? ? ? ?

>7560 CRC(?)

?

Abbildung A2: Stammbaum der Familie BO-0634-3

Tabelle A8.1.2.1 Tumormanifestationen in der Familie BO-0634-3

Manifestation

(Alter in

Jahren bei

ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile Marker/

getestete Marker)

Immun-

histochemie

Index-

patientin

Corpus-

karzinom (36)

CRC (37)

Mamma-

karzinom (53)

rez. Polypen

Amsterdam I/II MSI-H (5/6) MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 pos.

Schwester CRC (46)

Corpus-

karzinom (55)

CRC (61)

tubulovillöses

Adenom (76)

Schwester CRC (61)

Mamma-

karzinom (61)

Anhang 77

Tochter

der

Schwester

CRC (ED?)

Vater CRC (50)

Bruder

des Vaters

CRC (ED?)

Bruder

des Vaters

CRC (~45)

Schwester

des Vaters

CRC (ED?)

Schwester

des Vaters

Unterleibs-

karzinom

(ED?)

Vater des

Vaters

CRC (ED?)

Bei der Sequenzierung des MSH2, MLH1 und des MSH6-Gens wurde keine

pathogene Mutation nachgewiesen.

Anhang 78

8.1.3 Familie BO-0541-4

<1 7 3

4042 31 43 35

62

31

68

7287

62

chronischeGastritis

benigner Ovarialtumor (20)Cervix-Dysplasie (40)

CRC (61)Dickdarmpolyp (68)

64 80

CRC (71)Pankreas-karzinom(87)

Magen-karzinom (61)

Magenkarzinom (40)Lungentumor (50)

DarmverschlusspostOP Lungenembolie

CRC (69)

6850


Tabelle A8.1.3.1.: Tumormanifestationen in der Familie BO-0541-4

Manifestation


ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile

Marker/

getestete

Marker)

Immun-

histochemie

Index-

patientin

benigner

Ovarialtumor (20)

Cervix-

Dysplasie (40)

CRC (61)

Dickdarmpolyp (68)

Amsterdam I MSI-H

(2/5)

MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 pos.

Mutter CRC (71)

Anhang 79

Schwester

der Mutter

Pankreas-

karzinom (87)

Bruder der

Mutter

Magen-

karzinom (61)

Sohn des

Bruders der

Mutter

Magen-Ca (40)

Lungentumor (50)

Cousin der

Großmutter

CRC (69)

8.1.4 Familie BO-0629-9

25

40

20

66

23

73

6762

68

62 69 67

6385

CRC (39)

Ösophagus-karzinom (61)

Polyp (53)Adenom (67)

Polyp(55)

Blasenkarzinom (64)myelodysplastisches

Syndrom (65)67 65

Lungenkrebs(70)



Manifestation


ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile

Marker/

getestete

Marker)

Immun-

histochemie

Index-

patientin

CRC (39) B3/4,Br1 MSI-L MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 pos.

Mutter Dickdarmpolyp (53)

Anhang 80

Adenom (67)

Schwester

der Mutter

Blasenkarzinom (64),

myelo-dysplastisches

Syndrom (65)

Schwester

der Mutter

Dickdarmpolyp (55)

Großvater

mütterlicher

-seits

Lungenkrebs (70)

Großvater

väterlicher-

seits

Ösophagus-Ca (61)

8.1.5 Familie BO-0531-0

16

43

7675 80

50

8073 64

43 50

5848

CRC in situ (43)

CRC(72)

CRC Tumorim Kopf?

Infektion Trisomie21

Corpus-karzinom,Hautkrebs

CRC(75)

Lungen-karzinom57 78

Tumor inund hinter

demUterus?

Legende zu Stammbaum IX:

= Zwillinge, zweieiig


Anhang 81


Manifestation

(Alter in

Jahren bei

ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status

(instabile

Marker/

getestete

Marker)

Immun-

histochemie

Indexpatientin CRC in situ

(43)

Amsterdam I MSI-H

(2/5)

MLH1 pos.

MSH2 pos.

MSH6 pos.

Mutter CRC (72)

Schwester der

Mutter

CRC (75)

Großmutter

mütterlicherseits

CRC (48)

Die Sequenzierung des MSH2- und des MSH6-Gens blieb ohne Nachweis einer

pathogenen Mutation.

8.1.6 Familie BO-0613-4, Verwandtschaft von BO-0676-0

62

37

64

63

Säug-ling

~8022 18 ~75

2Polypen(ED60)

81

84

CRC(ED50)

Koloskopieohne path.

Befund43

12

CRC(ED31)Leukä

mie

Hirn-aneurysma

63

37 35

Ösophagus-karzinom Apoplex

>70

583,5

nachgewiesene Mutationin der Familie des

Ehemannes=

Legende zuStammbaum X:

= Zwillinge,eineiig

Abbildung A6: Verwandtschaft von BO-0676-0 mit Teilen der Familie des Ehemannes

Anhang 82

Tabelle A8.1.6.1 Tumormanifestationen in der Verwandtschaft der Patientin BO-0676-0 der

Familie BO-0531-0

Manifestation

(Alter in Jahren

bei ED)

klinische

Diagnose-

kriterien

MS-Status Immun-

histochemie

Indexpatientin CRC (31) B4, Br1 kein Material kein Material

Zwillings-

schwester

Leukämie (3,5)

Bruder 2 Polypen (62)

Mutter Hirnaneurysma

Großvater

mütterlicherseits

Ösophagus-

karzinom

Danksagung 83

9 DANKSAGUNG Mein Dank gilt...

...Herrn Prof. Dr. med. Jörg T. Epplen für die Bereitstellung des interessanten

Themas und seine umfangreiche Beratung.

...Frau PD Dr. Erdmute Kunstmann für die enge Betreuung und

uneingeschränkte Unterstützung während meiner Arbeit.

...Frau Manuela Scholz für die exzellente Unterstützung bei der praktischen

Durchführung der Experimente.

...allen Mitarbeitern der Abteilung für Humangenetik für die ausgesprochen

angenehme Arbeitsatmosphäre und die große Hilfsbereitschaft.

...allen Mitarbeitern des Zentrums für familiären Darmkrebs Bochum.

...meinem Ehemann Carsten Kötting für die große Geduld und moralische

Unterstützung, ohne die mir vieles nicht möglich gewesen wäre.

Lebenslauf 84

10 LEBENSLAUF Persönliche Daten

Name Judith Kötting geb. Vieland

Geburtsdatum/-ort 02. April 1980, Schwerte

Familienstand verheiratet, keine Kinder

Staatsangehörigkeit deutsch

Schulbildung

08/86 - 07/90 Grundschule Hennen

08/90 - 06/99 Märkisches Gymnasium Iserlohn

Abitur: Leistungsfächer Mathematik und

Erziehungswissenschaften

Praktika

07/99 zweiwöchiges Pflegepraktikum auf der urologischen

Station des evangelischen Krankenhauses Iserlohn

08/99 - 09/99 sechswöchiges Pflegepraktikum auf der chirurgischen

Privatstation des Clemenshospital Münster

03/02 vierwöchige Famulatur in der Radiologie des hôpital civil

in Straßburg

08/02 vierwöchige Famulatur in der kinderchirurgischen

Notaufnahme des hôpital Hautepierre in Straßburg

03/04 vierwöchige Famulatur im Labor der molekularen

Humangenetik an der Ruhr-Universität Bochum

04/04 zweiwöchige Hospitation in der Praxis für Allgemein-

medizin Dr. D. Loeser, Iserlohn

08/04 zweiwöchige Famulatur in der chirurgischen Ambulanz

des St. Josef-Hospitals, Klinikum der Ruhr-Universität

Bochum

Studium

seit 10/99 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität

Bochum

Lebenslauf 85

09/01 Ärztliche Vorprüfung (Physikum) an der Ruhr-Universität

Bochum, Note: 2

09/01 - 07/02 akademisches Auslandsjahr an der université Louis

Pasteur in Straßburg, Stipendiatin der deutsch-

französischen Hochschule

08/02 erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung in Straßburg

03/05 zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung an der Ruhr-

Universität Bochum

04/05 - 08/05 1. Tertial des praktischen Jahres: Wahlfach Neurologie an

der neurologischen Universitätsklinik des Universitäts-

spital Basel

08/05 - 11/05 2. Tertial: Innere Medizin in der medizinischen Klinik des

Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Klinikum der

Ruhr-Universität Bochum

11/05 – 03/06 3. Tertial: Chirurgie in der chirurgischen Abteilung des

Knappschaftskrankenhaus Langendreer, Klinikum der

Ruhr-Universität Bochum

05/06 dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung an der Ruhr-

Universität Bochum

Promotion:

10/02 - 10/04 Forschungsarbeiten zur Promotion im Labor der

Humangenetik der Ruhr-Universität/Zentrum für familiären

Darmkrebs Bochum zum Thema: “Analyse des MSH6-

Gens bei Familien mit erblichem Dickdarmkarzinom

(Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer, HNPCC)

mittels direkter Sequenzier- und DHPLC-Analyse“

06/04 Kunstmann E, Vieland J, Brasch FE, Hahn SA, Epplen

JT, Schulmann K, Schmiegel W.

HNPCC: Six new pathogenic mutations.

BMC Med Genet. 2004, 5:16.

09/04 Posterpräsentation auf der Jahrestagung der DGVS:

„Variabilität klinischer Verläufe von vier Familien mit

MSH6-Genmutation“

vorr. 06/06 Einreichung der Dissertationsschrift

Documents

Analyse des MSH6-Gens bei Familien mit erblichem ... · Aus der Abteilung für Humangenetik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. J. T. Epplen Analyse des MSH6-Gens