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Martina KOEBERL, Bakk. rer. nat.
Analyse von Arzneipflanzen-assoziierten
Mikroorganismen:
Biodiversität und antagonistisches Potenzial
gegen bodenbürtige Phytopathogene
MASTERARBEIT
zur Erlangung des akademischen Grades
Master of Science
der Studienrichtung Molekulare Mikrobiologie
an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Karl-Franzens-Universität Graz
unter der Betreuung von
Univ.-Prof. Dipl.-Biol. Dr. rer. nat. Gabriele Berg
Institut für Umweltbiotechnologie
Technische Universität Graz
veröffentlicht im März 2010
Abstract
SEKEM ist eine ägyptische Kulturinitiative und ein Fair Trade-Unternehmen, wo seit mehr
als 30 Jahren biologisch-dynamische Landwirtschaft betrieben wird. Medikamente, welche
aus ökologisch gezogenen Arzneipflanzen gewonnen werden, werden international
vermarktet. Deren Anbau ist allerdings immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen wie
Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum betroffen, wodurch es zu
erheblichen Ertragseinbußen kommt. Eine mögliche, umweltfreundliche und nachhaltige
Lösung des Problems wäre die Einführung von biologischen Kontrollstämmen (Biological
Control Agents, BCA). Durch die Einbringung von BCAs kann die Vitalität und die
natürliche Biodiversität des Bodens wieder hergestellt werden.
In dieser Arbeit wurden Mikroorganismen aus der Rhizo- und Endorhizosphäre von
ägyptischen Arzneipflanzen (Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum
distichum) sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches Potenzial gegen
die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Potenzielle
Kontrollstämme wurden morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und
identifiziert. Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und
Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und im Boden durch kultivierungsunabhängige
Methoden untersucht. Dabei wurde die Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP)-Analyse von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten verwendet.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ........................................................................................... 1
1.1 SEKEM – Das Wunder der Wüste ...........................................................................1
1.2 Arzneipflanzen ..........................................................................................................2
1.2.1 Matricaria chamomilla ...........................................................................................2
1.2.2 Calendula officinalis ...............................................................................................4
1.2.3 Solanum distichum ..................................................................................................5
1.3 Phytopathogene .........................................................................................................6
1.3.1 Verticillium dahliae .................................................................................................6
1.3.2 Rhizoctonia solani ...................................................................................................6
1.3.3 Fusarium culmorum ................................................................................................7
1.4 Antagonismen: Amensalismus und Parasitismus ....................................................7
1.5 Aufgabenstellung ......................................................................................................8
2. MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 10
2.1 Herstellernachweis .................................................................................................. 10
2.2 Nährmedien ............................................................................................................. 10
2.3 Probennahme .......................................................................................................... 13
2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem Probenmaterial .................................... 14
2.4.1 Bestimmung der Lebendzellzahl ........................................................................... 15
2.4.2 Herstellung von Einzelisolaten .............................................................................. 16
2.4.3 Stammhaltung ....................................................................................................... 17
2.5 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten Mikroorganismen ........... 17
Inhaltsverzeichnis
2.6 Genotypische Charakterisierung der bakteriellen Isolate mit
antagonistischem Potenzial ..................................................................................... 19
2.6.1 Puffer und Lösungen ............................................................................................. 19
2.6.2 Standard DNA Ladders ......................................................................................... 20
2.6.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................................................ 21
2.6.4 Agarosegelelektrophorese ..................................................................................... 22
2.6.5 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) .................................................. 23
2.6.6 BOX-PCR ............................................................................................................. 26
2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung ..................................... 28
2.7 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das Bildungsvermögen
des Phytohormons Indol-3-essigsäure .................................................................... 29
2.8 Isolation der Gesamt-DNA aus dem Probenmaterial ............................................ 30
2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität
mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism
Analysis) .................................................................................................................. 32
2.9.1 DNA-Isolation aus Gelbanden zur Identifizierung von Mikroorganismen .............. 43
3. ERGEBNISSE ......................................................................................... 45
3.1 Mikrobielle Abundanzen in Rhizosphäre, Endorhizosphäre und Boden ............. 45
3.2 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten Mikroorganismen ........... 46
3.2.1 Morphologische Gruppierung der stärksten Antagonisten ...................................... 50
3.3 Genotypische Charakterisierung der bakteriellen Isolate mit
antagonistischem Potenzial ..................................................................................... 51
3.3.1 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) .................................................. 51
3.3.2 BOX-PCR ............................................................................................................. 55
3.3.3 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung ..................................... 58
3.4 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das Bildungsvermögen
des Phytohormons Indol-3-essigsäure .................................................................... 59
Inhaltsverzeichnis
3.5 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität
mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism
Analysis) .................................................................................................................. 60
3.5.1 Analyse der bakteriellen Community..................................................................... 60
3.5.2 Analyse der Pilz-Community ................................................................................ 71
4. DISKUSSION .......................................................................................... 75
4.1 Kultivierungsabhängige Analyse des antagonistischen Potenzials gegen
bodenbürtige Phytopathogene ................................................................................ 75
4.2 Kultivierungsunabhängige Analyse der mikrobiellen Biodiversität ..................... 78
5. ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................... 82
6. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 84
7. DANKSAGUNG ...................................................................................... 92
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
APS Ammoniumpersulfat
A Amper
ARDRA Amplified rDNA Restriction Analysis
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
bzw. beziehungsweise
BCA Biological Control Agent (Biologischer Kontrollstamm)
BSA Bovine Serum Albumine (Rinderserumalbumin)
Co Calendula officinalis
C Celsius
ca. circa
cfu Colony Forming Units (Kolonie-bildende Einheiten)
CDB Czapek Dox Broth
deion. deionisiert
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTPs Desoxyribonukleosid-5‟-triphosphate
dest. destilliert
DMSO Dimethylsulfoxid
DES DNase/Pyrogen-Free Water
ds double-stranded
Re Endorhizosphäre
Eppi Eppendorf Reaktionsgefäß
g Erdbeschleunigung
et al. et alteri (und andere)
etc. et cetera (und so weiter)
EDTA Ethylendiamintetraacetat
f forward
fw Fresh Weight (Frischgewicht)
° Grad
g Gramm
ha Hektar
h Hour (Stunde)
Abkürzungsverzeichnis
HP Hyperparasitismus
IAA Indol-3-acetic acid (Indol-3-essigsäure)
ITS Internal Transcribed Spacer
k kilo
konz. konzentriert
l Liter
Mc Matricaria chamomilla
m Meter
µ mikro
m milli
min Minute
M Molar; mol/Liter
NA Nähragar
NB Nährbouillon
n nano
NCBI National Center for Biotechnology Information
Nr. Nummer
ONC Over Night Culture (Übernachtkultur)
pH pH-Wert; negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PDA Potato Dextrose Agar
PPS Protein Precipitation Solution
% Prozent
RT Raumtemperatur
r reverse
RNA Ribonukleinsäure
r ribosomale
rpm Rounds per Minute (Umdrehungen pro Minute)
Sb SEKEM-Boden
s Sekunde
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
ss single-stranded
Sd Solanum distichum
Abkürzungsverzeichnis
Std. Standard
SD Standard Deviation (Standardabweichung)
SNA Synthetic Nutrient Agar
Tab. Tabelle
TEMED N, N, N, N-Tetramethylethylendiamin
TSM Trichoderma Selective Medium
TAE Tris-Acetat-EDTA
TBE Tris-Borat-EDTA
Tris Tris-Hydroxymethyl-Amminomethan
UV ultraviolett
U Unit
V Volt
v volume (Volumen)
WA Waksman Agar
w weight (Gewicht)
Wb Wüstenboden
ZMF Zentrum für medizinische Grundlagenforschung
z. B. zum Beispiel
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 SEKEM – Das Wunder der Wüste
SEKEM liegt etwa 60 km nordöstlich von Kairo und ist eine ägyptische Kulturinitiative und
ein Fair Trade-Unternehmen. Im Jahr 1977 erschloss der Gründer Dr. Ibrahim Abouleish
70 ha trockenen, heißen Wüstenboden, auf welchem biologisch-dynamische Landwirtschaft
betrieben werden soll. Aus einst reinem Sandboden ist ein ökologisches Paradies gewachsen.
SEKEM umfasst heute nicht nur die Mutterfarm mit 138 zertifizierten Demeter-Höfen und
Kooperationen mit 850 Kleinbauern, die überall in Ägypten auf mehr als 4.100 ha
biologisch-dynamische Landwirtschaft betreiben und die Produkte gemeinsam vermarkten.
SEKEM ist ebenso eine Unternehmens-Holding aus neun erfolgreichen Firmen, die
Lebensmittel, Gewürze und Tees herstellen, verarbeiten und exportieren. Ökologisch
angebaute Baumwolle wird zu gesunder Kinderkleidung verarbeitet und Medikamente,
welche aus den biologisch angebauten Arzneipflanzen gewonnen werden, werden
international vermarktet.
Zur SEKEM-Gemeinschaft, die rund 2.000 Menschen Arbeit gibt, gehören Kindergärten, eine
Polyklinik, Schulen, Behinderteneinrichtungen, Einrichtungen zur Erwachsenenbildung,
Forschungseinrichtungen und eine Universität. Weiters initiiert die SEKEM Development
Foundation Tanz-, Kunst- und Theaterprojekte und Straßenkinderinitiativen. Rund 30.000
Menschen sind in Ägypten an das Netzwerk angeschlossen, die SEKEM-Klinik versorgt
40.000 Ägypter medizinisch.
SEKEM ist ein Entwicklungsimpuls, der zunehmend an regionaler, nationaler und
internationaler Bedeutung gewinnt. Dr. Ibrahim Abouleish wurde 2003 für sein Lebenswerk
mit dem Alternativen Nobelpreis (Right-Livelihood-Award) ausgezeichnet (Abouleish, 2005).
Einleitung
2
1.2 Arzneipflanzen
In SEKEM werden unter anderem Arzneipflanzen angebaut. Deren Anbau ist in letzter Zeit
allerdings vermehrt durch bodenbürtige Phytopathogene betroffen. Für die Probennahme
wurden die 3 Arzneipflanzen Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum
distichum ausgewählt.
1.2.1 Matricaria chamomilla L.
Die Kamille ist aufgrund der phytochemischen, pharmakologischen und klinischen
Forschungsergebnisse sowie ihrer medizinischen Bedeutung seit dem Altertum eine
bemerkenswerte Arzneipflanze. Es gibt nur ganz wenige pflanzliche Drogen, über die eine
ähnlich große Anzahl qualitativ hochwertiger Publikationen existiert (Schilcher, 1987).
Nach der systematischen Nachuntersuchung von Rauschert (Rauschert, 1974) wird die
Gattung Matricaria aufgeteilt in Tripleurospermum Schultz Bip. und Matricaria sensu stricto.
Die Matricaria chamomilla zählt dabei zur Gruppe der Matricaria sensu stricto. Linné scheint
diese Gattungen nicht getrennt zu haben, wobei von ihm der Name Matricaria chamomilla
eher für Matricaria maritima – eine Art der Gattung Tripleurospermum Schultz Bip. – als für
Matricaria chamomilla im modernen Sinne verwendet wurde. Für unsere
medizinisch-pharmazeutisch genutzte Kamille hat Linné den Namen Matricaria recutita
verwendet. Rauschert weist darauf hin, dass bei einer Aufspaltung der von Linné
bezeichneten Gattung Matricaria der abgespaltene Teil mit unserer arzneilich verwendeten
Kamille den Namen Chamomilla A. Gray tragen muss und dass ferner für die Gattung
Tripleurospermum Schultz Bip. die Bezeichnung Matricaria L. sensu stricto richtig wäre. Aus
diesem Grund erscheinen in der Literatur für die medizinisch genutzte Kamille
unterschiedliche Namen: Chamomilla recutita (L.) Rauschert oder Matricaria chamomilla L.
(syn. Matricaria recutita L.) (Tutin et al., 1976).
Es ist noch nicht eindeutig geklärt, ob innerhalb der Art Matricaria chamomilla chemische
Rassen existieren. Untersuchungen verschiedener Arbeitskreise deuten darauf hin, dass es
genetisch bedingte chemische Variationen in lokalen Populationen gibt
(Salamon, 2004; Schilcher, 1985; Honcariv & Repcak, 1979; Franz et al., 1978).
Einleitung
3
Die Kamilleninhaltsstoffe kann man in zwei Gruppen unterteilen:
Lipophile Inhaltsstoffe: dazu gehören die Einzelkomponenten des ätherischen Öles,
Cumarine, methoxylierte Flavonaglyka, Phytosterole sowie lipidische und wachsartige
Substanzen.
Hydrophile Inhaltsstoffe: hierzu zählen Flavonoide, Schleim, Phenylcarbonsäuren,
Aminosäuren und Cholin (Streibel, 1980; Franke & Schilcher, 2005).
Die Kamille ist seit Jahrhunderten bekannt und in der Therapie eingeführt. In der
volksmedizinischen Überlieferung finden wir sie in Form des Kamillentees, der innerlich bei
schmerzhaften, mit Krämpfen verbundenen Magen- und Darmstörungen wie Durchfall und
Blähungen, aber auch bei entzündlichen Magen- und Darmerkrankungen wie Gastritis und
Enteritis getrunken wird. Äußerlich findet die Kamille in Form heißer Kompressen bei
schlecht heilenden Wunden, als Sitzbad bei Abszessen, Furunkeln, Hämorrhoiden und
Frauenkrankheiten, als Mundspülung bei Entzündungen der Mund- und Rachenhöhle, als
Kamillendampfbad zur Behandlung der Akne vulgaris, zur Inhalation bei Schnupfen und
Bronchitis sowie als Zusatz zu Säuglingsbädern Verwendung (Schilcher, 1987).
Die Richtigkeit der empirischen Kamillenanwendung ist in den letzten Jahren durch
eingehende Untersuchungen bestätigt worden. Allerdings hat sich gezeigt, dass ein
haushaltsüblich durch Übergießen von Kamillenblüten hergestellter Kamillentee nur einen
kleinen Bruchteil (10 – 15 %) des in der Droge vorhandenen ätherischen Öles enthält. Der
größte Teil der wichtigen, antiphlogistisch wirkenden Bestandteile des ätherischen Öles wird
mit den überbrühten Pflanzenteilen fortgeschüttet und bleibt ungenutzt. Wohl aber enthält die
Teezubereitung eine Reihe wasserlöslicher Flavonoide mit deutlich krampflösender und, wie
sich in Untersuchungen herausgestellt hat, bei lokaler Anwendung auch
entzündungshemmender Wirkung (Della Loggia, 1985).
Da der therapeutische Wert der Kamille nicht auf einem einzelnen Hauptwirkstoff sondern
auf dem Zusammenwirken vieler Einzelstoffe beruht, deren tierexperimentell und klinisch
nachgewiesene Effekte sich zu der für ein breites Indikationsgebiet geeigneten
Gesamtwirkung vereinigen, ist natürlich ein Kamillenextrakt, das alle Komponenten in
optimaler Konzentration enthält, dem haushaltsüblichen Aufguss vorzuziehen.
Einleitung
4
Die wichtigsten Komponenten sind Chamazulen mit unbestrittener antiphlogistischer
Wirkung (Isaac & Schimpke, 1965) sowie (-)-α-Bisabolol, ein Sesquiterpenalkohol mit
antiphlogistischen, antibakteriellen, antimykotischen sowie ulkusprotektiven und
muskulotrop-spasmolytischen Eigenschaften. Beide sind Hauptbestandteile des ätherischen
Öles. Die Kamillenflavone sind sowohl muskulotrop spasmolytisch als auch bei lokaler
Anwendung antiphlogistisch wirksam. Weitere wichtige Innhaltsstoffe sind die Bisaboloxide,
cis- und trans-Spiroether, Cumarine und Schleim (Schilcher, 1987).
1.2.2 Calendula officinalis L.
Die Ringelblume ist eine alte Kulturpflanze, deren Ursprung in den Höhen des Atlas-Gebirges
im nordwestlichen Afrika vermutet wird. Mit ihren leuchtend gelben oder orangeroten
Blütenköpfchen wird sie in vielen Teilen der Welt als Gartenpflanze kultiviert. Die
Ringelblume stellt geringe Ansprüche an Boden und Düngung. Sie ist wärmeliebend, aber
dennoch wenig kälteempfindlich (Heeger, 1956; Dachler & Pelzmann, 1989).
Seit alters her wird der Ringelblume besonders ein positiver Einfluss auf die Funktionen der
Haut zugeschrieben. Im Vordergrund steht dabei die Anwendung bei schlecht heilenden oder
eiternden Wunden, Verbrennungen, Krampfadern und Venenentzündungen. Aber auch in der
Schönheitspflege als Hauttonikum und zum Schutz empfindlicher Haut spielen
Ringelblumenzubereitungen eine nicht unbedeutende Rolle. So ist es nicht verwunderlich,
dass neben der Selbstmedikation auch die Kosmetik sich der Ringelblume in den letzten
Jahren in erstaunlichem Maße angenommen hat. Die innerliche Anwendung beschränkt sich
auf Magen-Darm-Beschwerden und Frauenkrankheiten (Isaac, 1992).
Mit der Verwendung in der Heilkunde und in der Kosmetik nimmt auch das wissenschaftliche
Interesse an der Ringelblume ständig zu. Die Wirkprinzipien der Calendula sind noch nicht
eindeutig geklärt. Das Augenmerk richtet sich vor allem auf die in den Blüten reichlich
vorhandenen Triterpenalkohole (Adler & Kasprzyk, 1976). Den Triterpendiolen, besonders
den Faradiol-3-monoestern, kommt bei topischer Applikation eine dosisabhängige
antiinflammatorische Aktivität zu. Unter den Calendula-Flavonoiden sind vor allem die
Isorhamnetinglykoside charakteristisch (Vidal-Ollivier et al., 1989). Das ätherische Öl,
welches für den charakteristischen Geruch der Ringelblumen verantwortlich ist, besteht aus
Monoterpenen und Sesquiterpenen (Janssen, 1989; Marczal et al., 1987). Hervorzuheben sind
Einleitung
5
weiters die für Asteraceen ungewöhnliche Abwesenheit von Sesquiterpenlactonen, welche
häufig Kontaktallergien verursachen und das fette Öl der Samen, das zu 50 – 60 % aus
Calendulasäure – einer ungesättigten Fettsäure mit einer ungewöhnlichen Struktur – besteht
(Takagi & Itabashi, 1981).
Die Extrakte der Ringelblume sind antimikrobiell wirksam (Spaich, 1977;
Wolters 1966; Bogdanova et al., 1977), sie hemmen das Wachstum von Bakterien, Pilzen und
Viren. Ein Teil dieser Aktivität ist auf Bestandteile des ätherischen Öles zurückzuführen
(Janssen, 1989). In Tierversuchen sind Calendula-Extrakte gegen mehrere Typen von
Krebszellen wirksam (Boucaud-Maitre et al., 1988). Neben der antiinflammatorischen,
immunstimulierenden und wundheilenden Wirkung wurden weiters ulkusprotektive und
vasoprotektive Effekte nachgewiesen (Isaac, 1992).
1.2.3 Solanum distichum Schumach. & Thonn.
Solanum distichum gehört wie z. B. auch die Kartoffel (Solanum tuberosum) zur Familie der
Solanaceae (Nachtschattengewächse). Bei Solanum distichum handelt es sich um eine
semi-domestizierte Art, er ist deshalb als Kultivar-Gruppe des wilden Solanum anguivi
einzuordnen. Solanum distichum besitzt im Gegensatz zu seinem Vorfahren keine Stacheln
mehr und ist wahrscheinlich selbst der Vorfahre der afrikanischen Aubergine Solanum
aethiopicum L. Der Solanum distichum ist in Afrika heimisch und weit über den gesamten
Kontinent verbreitet. Er bevorzugt humide Böden und ist nur sehr selten in trockenen
Gebieten anzufinden. Der Anbau wird bis jetzt selten praktiziert. Solanum distichum ist
widerstandsfähig gegen Krankheiten und Schädlinge, die viele andere Solanum-Arten
befallen.
Bei der Frucht handelt es sich um Beeren mit 7 – 18 mm Durchmesser. Sie sind glatt, wenn
sie reif sind rot und in Gruppen von bis zu 20 Früchten angeordnet. Diese eignen sich nicht
nur zum Verzehr, daraus wird auch ein Medikament gegen hohen Blutdruck hergestellt. Der
Nährwert der Früchte ist noch nicht genau bekannt, aber er ist wohl vergleichbar mit Früchten
der verwandten Art Solanum aethiopicum L. (Grubben & Denton, 2004; Bukenya, 1993). Die
Wurzel beinhaltet Solamargine und Steroid-Alkaloid-Glykoside (Anguivin und Isoanguivin).
Aus den Früchten wurden bereits drei steroidale Glykoside isoliert (Anguivioside A – C)
(Abouzid et al., 2008).
Einleitung
6
Im Gegensatz zu Solanum nigrum und Solanum dulcamara findet Solanum distichum noch
kaum als Arzneimittel Verwendung. Seine blutdrucksenkende Wirkung wurde allerdings
bereits erwiesen (Bahgat et al., 2008).
1.3 Phytopathogene
Die größten Probleme im Arzneipflanzen-Anbau werden durch die bodenbürtigen
Phytopathogene Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum verursacht.
1.3.1 Verticillium dahliae Kleb.
Verticillium dahliae ist ein bodenbürtiges Phytopathogen und gehört zur Klasse der
Ascomyceten. Der Pilz verursacht bei seinen Wirtspflanzen Tracheomykosen, indem er die
Wasserleitungsbahnen der Pflanze verstopft. Dabei kommt es zum Welken und Abfallen von
Blättern und Trieben bis hin zu ganzen Zweigen und Ästen, aus diesem Grund wird die
Krankheit auch als Verticillium-Welke bezeichnet. Bei kritischen Umweltbedingungen ist der
Erreger in der Lage in Form von Mikrosklerotien – seiner Dauerform – über Jahre im Boden
zu persistieren. Das Wirtsspektrum des Pilzes ist relativ breit, darunter befinden sich
z. B. Kulturpflanzen wie Baumwolle, Kartoffel, Raps, Olive und Erdbeere
(Tjamos et al., 2000; Rowe et al., 1987; Svennson & Lerennius, 1987; Talboys, 1970).
1.3.2 Rhizoctonia solani Kühn
Rhizoctonia solani bezeichnet die anamorphe Form von Thanatephorus cucumeris
(A.B. Frank) Donk, welcher zu den Basidiomyceten zählt. Rhizoctonia solani ist ebenfalls ein
bodenbürtiges Phytopathogen, das weltweit verbreitet ist. Der Pilz befällt ein breites
Spektrum an Wirtspflanzen, darunter befinden sich auch einige wichtige Kulturpflanzen wie
z. B. die Kartoffel (Weißhosigkeit) und die Zuckerrübe (Späte Rübenfäule), wodurch es zu
erheblichen Ertragsausfällen kommt (Börner, 2009; Adams, 1988; Davis et al., 1997).
Rhizoctonia solani kann in Form von Sklerotien – der kälte- und austrocknungsresistenten
Dauerform des Pilzes – über viele Jahre überdauern und wächst bei günstigen Bedingungen
wieder aus (Faltin et al., 2004). Der Pilzbefall tritt vor allem in moderat nassen Böden auf.
Einleitung
7
Die Infektionstemperatur liegt meist zwischen 15 und 18 °C, es gibt aber einzelne Stämme,
die Pflanzen bei bis zu 35 °C infizieren können.
Rhizoctonia solani kann in Anastomose-Gruppen (AGs) unterteilt werden. Bisher wurden 13
verschiedene AGs beschrieben (Anderson, 1982; Carling et al., 2003), für die eine gewisse
Wirtsspezifität gezeigt werden konnte. Die unterschiedlichen AGs bevorzugen teilweise auch
unterschiedliche Infektionstemperaturen. Die Anastomose-Gruppen können weiter in
Pathotypen unterteilt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde Rhizoctonia solani AG4
verwendet, dieser ist für die Umfallkrankheiten an Radies und Zuckerrübe verantwortlich
(Scherwinski, 2007).
1.3.3 Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) Sacc.
Fusarium culmorum gehört zu den Schimmelpilzen – also zur großen Gruppe der
Ascomyceten und ist ein weiteres bodenbürtiges Phytopathogen. Die von diesem Erreger
verursachten Pflanzenkrankheiten z. B. an Lebensmitteln oder Getreide werden als Fusariosen
bezeichnet, dabei werden unterirdische Pflanzenteile befallen und es kann bis zum Absterben
der Wirtspflanze kommen (Crüger, 1991). Fusarium culmorum ist in der Lage Mykotoxine
(Schimmelpilzgifte) zu produzieren (Roth et al., 1990), darunter befinden sich mehrere
Trichothecene, Zearalenon, Zearalenol, Moniliformin, Beauvericin, Enniatine und
Fumonisine. Über befallene Lebens- und Futtermittel können bei Mensch und Tier schwere
Vergiftungen verursacht werden, deshalb wurden in der EU Höchstgrenzwerte für diese
Toxine festgelegt (Suchowilska et al., 2010).
1.4 Antagonismen: Amensalismus und Parasitismus
Unter Amensalismus versteht man die Hemmung einer Mikrobenart durch ausgeschiedene
Hemmstoffe einer anderen Art. Antagonistisch wirksame Mikroorganismen können das
Wachstum von Phytopathogenen hemmen indem sie Antibiotika und/oder extrazelluläre
abbauende Enzyme (z. B. Chitinase, Glucanase, Protease) produzieren. Die biologische
Bekämpfung von phytopathogenen Mikroorganismen basiert auf der Grundlage dieser
Hemmstoffe. Die hierfür eingesetzten Kontrollstämme besitzen meist die Fähigkeit sich in der
Rhizosphäre von Pflanzen zu etablieren (Compant et al., 2009). Auch die Eigenschaften
Einleitung
8
bestimmter Böden, Krankheiten zu unterdrücken (disease suppresive soils), begründen sich
vermutlich durch antagonistische Aktivität (Haas & Defago, 2005).
Trichoderma-Pilze leben als Hyperparasiten auf anderen Pilzen. Auch hier handelt es sich um
eine Form von Antagonismus, welcher als Mycoparasitismus bezeichnet wird
(Fritsche, 2002).
1.5 Aufgabenstellung
Die biologisch-dynamische Landwirtschaft, welche in SEKEM in Ägypten betrieben wird, ist
immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen betroffen. Darunter befinden sich die Pilze
Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum, welche zu erheblichen
Ernteausfällen führen. Eine Ursache hierfür ist ein intensiver Anbau von einer begrenzten
Anzahl an Kulturpflanzen in kurzen Rotationen. Die biologisch-dynamische Landwirtschaft
schließt die Anwendung von synthetischem Kunstdünger und Pestiziden aus. Eine mögliche,
umweltfreundliche und nachhaltige Lösung des Problems ist die Einführung von biologischen
Kontrollstämmen (Biological Control Agents, BCA). BCAs sind natürlich vorkommende
Mikroorganismen, die in der Lage sind, effizient Pflanzen zu besiedeln und durch
verschiedene Mechanismen das Wachstum von gesunden Pflanzen zu fördern, sowie das von
Pathogenen zu hemmen.
Das allgemeine Ziel des Projekts „Commercial Production of Enhanced Bio-Control Agents
for Combating Soil Borne Pathogens in Egypt”, in dessen Rahmen diese Arbeit verfasst
wurde, ist es, ein biologisches Präparat herzustellen, womit die Anwendung von chemischen
Pflanzenschutzmitteln und deren Auswirkungen auf Umwelt und Gesundheit verhindert
werden können. Durch die Einbringung von BCAs soll die Vitalität und die natürliche
Biodiversität des Bodens unterstützt werden. Das Präparat soll bezüglich Boden, Wetter,
Pathogen-Spezies, etc. für ägyptische Bedingungen optimiert werden, aus diesem Grund
sollen die BCAs aus ägyptischem Proben-Material isoliert werden.
In dieser Arbeit wurden Mikroorganismen aus der Rhizo- und Endorhizosphäre von
ägyptischen Arzneipflanzen sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches
Potenzial gegen die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Isolate
aus der Rhizo- oder Endorhizosphäre der Pflanzen bringen die optimalen Voraussetzungen für
Einleitung
9
eine Kolonisation der Wirtspflanze des Pathogens mit. Potenzielle Kontrollstämme wurden
morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und identifiziert.
Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und
Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und im Boden durch kultivierungsunabhängige
Methoden untersucht. Dabei wurde die Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP)-Analyse von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten verwendet.
Material und Methoden
10
2. Material und Methoden
2.1 Herstellernachweis
Alle verwendeten Chemikalien und Nährmedien wurden – wenn nicht anders angegeben
– von folgenden Firmen bezogen: Applied Biosystems (Foster City, USA), Fermentas
(St. Leon-Rot, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz), Invitrogen (Lofer, Österreich), Lactan
(Graz, Österreich), Merck (Darmstadt, Deutschland), MP Biomedicals (Eschwege,
Deutschland), Sifin (Berlin, Deutschland), Peqlab (Erlangen, Deutschland), Promega
(Mannheim, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Qiagen (Wien, Österreich),
Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).
2.2 Nährmedien
Alle verwendeten Medien wurden – wenn nicht anders angegeben – mit deionisiertem Wasser
zubereitet und bei 121 °C für 20 min autoklaviert.
R2A-Agar (Roth)
Hefeextrakt 0,5 g/l
Proteosepepton 0,5 g/l
Caseinhydrolysat 0,5 g/l
Glucose 0,5 g/l
Stärke 0,5 g/l
di-Kaliumhydrogenphosphat 0,3 g/l
Magnesiumsulfat 0,024 g/l
Natriumpyruvat 0,3 g /l
Agar 15,0 g/l
pH 7,2 ± 0,2
Material und Methoden
11
Trichoderma Selective Medium (TSM)
Calciumnitrat 1,0 g/l
Kaliumnitrat 0,26 g/l
Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,26 g/l
di-Kaliumhydrogenphosphat 0,12 g/l
Calciumchlorid-Dihydrat 1,0 g/l
Zitronensäure 0,05 g/l
Sucrose 2,0 g/l
Agar 20,0 g/l
Igepal 630 1,0 ml/l
Tetracyclin 0,05 g/l
Captan 0,04 g/l
Vinclozolin 0,0025 g/l
→ Die Antibiotika und Fungizide wurden dem autoklavierten Medium nach dem
Abkühlen auf etwa 50 °C zugesetzt, um das Wachstum von Bakterien und Pilzen
außer Trichodermen zu verhindern.
Nähragar II (NA) (Sifin)
Pepton aus Casein 3,5 g/l
Pepton aus Fleisch 2,5 g/l
Pepton aus Gelatine 2,5 g/l
Hefeextrakt 1,5 g/l
Natriumchlorid 5,0 g/l
pH 7,0 ± 0,2
Agar 15,0 g/l
Potato Dextrose Agar (PDA) (Roth)
Kartoffel-Infus 6,5 g/l
Glucose 20,0 g/l
pH 5,6 ± 0,2
Agar 15,0 g/l
Material und Methoden
12
Waksman Agar (WA)
Pepton aus Fleisch 5,0 g/l
Glucose 10,0 g/l
Fleischextrakt 3,0 g/l
Natriumchlorid 5,0 g/l
Agar 15,0 g/l
Nährbouillon II (NB) (Sifin)
Pepton aus Casein 3,5 g/l
Pepton aus Fleisch 2,5 g/l
Pepton aus Gelatine 2,5 g/l
Hefeextrakt 1,5 g/l
Natriumchlorid 5,0 g/l
pH 7,0 ± 0,2
Pilzkonservierungs-Medium
Glycerol [99 %] 600 ml/l
Glucose [50 %] 200 ml/l
Pepton [20 %] 100 ml/l
Hefeextrakt [10 %] 100 ml/l
→ Die Komponenten werden getrennt autoklaviert und nach dem Erkalten unter sterilen
Bedingungen miteinander vermischt.
Czapek Dox Broth (CDB) (Duchefa Biochemie)
Natrium-Eisen-EDTA 0,01 g/l
Magnesium Glycerophosphat 0,5 g/l
Kaliumchlorid 0,5 g/l
Kaliumsulfat 0,35 g/l
Natriumnitrat 2,0 g/l
Sucrose 30,0 g/l
Material und Methoden
13
Wachstumsmedium für IAA-Test
Glucose 5,0 g/l
Hefeextrakt 0,025 g/l
L-Tryptophan 0,2 g/l
2.3 Probennahme
Die Proben wurden am 8. Oktober 2009 in SEKEM in Ägypten genommen. Auf der
Adleya-Farm in SEKEM wurden die Wurzeln von 3 verschiedene Arzneipflanzen beprobt:
Matricaria chamomilla (Kamille), Calendula officinalis (Ringelblume) und Solanum
distichum. Bei der Probennahme befanden sich Matricaria chamomilla und Calendula
officinalis erst im Sämlings-Stadium (siehe Abb. 1), bei Solanum distichum handelt es sich
um einen ausdauernden verholzten Strauch (siehe Abb. 2). Zusätzlich wurden Proben vom
Boden auf der Adleya-Farm und in der Wüste genommen. Von jeder Pflanzenprobe und vom
Boden der Farm wurden 4 unabhängige Replikate genommen, vom Wüstenboden wurde an
3 unterschiedlichen Standorten eine Probe genommen.
Abb. 1: Beprobte Sämlinge der Abb. 2: Beprobte Pflanzen von
Calendula officinalis. Solanum distichum.
Die Probennahme erfolgte unter semisterilen Bedingungen, vor jeder Probe wurden Hände
und Schaufel mit Ethanol oberflächensterilisiert. Für den Transport wurde das Probenmaterial
in einer Kühltasche verpackt und bis zur Aufarbeitung im Labor bei 4 °C im Kühlschrank
gelagert.
Material und Methoden
14
2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem Probenmaterial
Bei der Probenaufarbeitung im Labor wurden Bakterien und Trichodermen, welche mit
Arzneipflanzen assoziiert sind, getrennt aus der Rhizosphäre und der Endorhizosphäre der
Pflanzen isoliert. Aus den Bodenproben wurden ebenfalls Bakterien und Trichodermen
isoliert.
Pflanzenproben
Rhizosphäre:
Um Mikroorganismen aus der Rhizosphäre zu isolieren, wurden unter semisterilen
Bedingungen je Probe 5 g Wurzelmaterial mit anhaftender Erde in Falcon-Tubes eingewogen.
Es wurden 45 ml steriles NaCl [0,85 %] hinzugegeben und für 5 min am Vortex gemixt. Nach
kurzem Absitzen wurde der Überstand zum Verdünnen und Ausplattieren auf R2A (für
Bakterien) und TSM (für Trichodermen) verwendet.
Endorhizosphäre:
Für die Isolation von Mikroorganismen aus der Endorhizosphäre wurden die 5 g
Wurzelmaterial aus der Rhizosphären-Isolation für 5 min mit NaOCl [4 %] in sterilen Tubes
oberflächensterilisiert. Danach wurden die Wurzeln 3-mal mit sterilem Aqua dest. gewaschen
und zur Kontrolle der Oberflächensterilisation wurde ein Abdruck eines Wurzelstückchens
jeder Probe auf NA gemacht. Nachdem die oberflächensterilen Wurzelstücke in einen
Whirl-Pak® Probenbeutel überführt wurden und 10 ml steriles NaCl [0,85 %] zugegeben
wurden, konnten die Wurzeln mittels Mörser und Pistill zerkleinert werden. Der Mörserbrei
wurde zum Verdünnen und zum Ausplattieren auf R2A und TSM verwendet.
Bodenproben
Bei den Bodenproben wurden unter semisterilen Bedingungen je 5 g Erde bzw. Sand in sterile
Röhrchen eingewogen, mit 45 ml NaCl [0,85 %] aufgeschlämmt und wie bei der Isolation aus
der Rhizosphäre für 5 min gevortext. Nach kurzem Absitzen wurde der Überstand wieder
verdünnt und auf R2A und TSM ausplattiert.
Material und Methoden
15
2.4.1 Bestimmung der Lebendzellzahl
Die nötigen Verdünnungsreihen wurden mit NaCl [0,85 %] hergestellt. Für die
Lebendkeimzahlbestimmung mit Spatelplatten-Verfahren wurden jeweils 100 µl der
entsprechenden Verdünnungen ausplattiert:
Rhizosphäre:
– auf R2A-Medium: 10-4
, 10-5
, 10-6
je Verdünnung 2 Platten
– auf TSM-Medium: 100, 10
-1, 10
-2 je Verdünnung 2 Platten
Endorhizosphäre:
– auf R2A-Medium: 100, 10
-1, 10
-2 je Verdünnung 2 Platten
– auf TSM-Medium: 100, 10
-1, 10
-2 je Verdünnung 2 Platten
Boden von der Adleya-Farm in SEKEM:
– auf R2A-Medium: 10-4
, 10-5
, 10-6
je Verdünnung 2 Platten
– auf TSM-Medium: 100, 10
-1, 10
-2 je Verdünnung 2 Platten
Wüstenboden:
– auf R2A-Medium: 100, 10
-1, 10
-2, 10
-3 je Verdünnung 2 Platten
– auf TSM-Medium: 100, 10
-1, 10
-2 je Verdünnung 2 Platten
Bei R2A handelt es sich um ein Minimal-Medium, welches spezifisch für Bakterien ist. Auf
diesem nährstoffarmen Medium soll eine optimale Artenvielfalt erreicht werden. Die
TSM-Platten dienen speziell zur Anreicherung von Trichodermen, diese Pilze sind für ihr
gutes antagonistisches Potenzial bekannt.
Die Platten wurden bei RT inkubiert und anschließend wurden die gewachsenen Kolonien
ausgezählt. Die R2A-Platten für Bakterien wurden nach 4 Tagen ausgezählt und die
TSM-Platten wurden nach 7 Tagen ausgewertet. Exemplarisch ist hier eine R2A-Platte, auf
welcher Bakterien isoliert wurden, abgebildet (siehe Abb. 3).
Material und Methoden
16
Abb. 3: Isolation auf R2A-Agar. Auf dieser Platte wurden Bakterien aus der Rhizosphäre der
Matricaria chamomilla isoliert, gezeigt ist die Verdünnungsstufe 10-4.
Die Berechnung der Lebendzellzahl (cfu/g Frischgewicht bzw. Boden) erfolgte anhand
folgender Formel:
(gezählte Kolonien × Verdünnungsfaktor × ml hinzugefügte NaCl)
(g eingewogenes Material × ml ausplattiertes Volumen)
Für die beiden untersuchten Mikrohabitate jeder Pflanze bzw. für jeden Bodentyp wurden
Mittelwert und Standardabweichung aus den verschiedenen Replikaten und Verdünnungen
bestimmt.
2.4.2 Herstellung von Einzelisolaten
Von den Agarplatten wurden nach der Auszählung einzelne morphologisch möglichst
unterschiedliche Bakterien-Kolonien bzw. Pilze abgenommen und vereinzelt. Wenn möglich
wurden pro Replikat 24 Bakterien-Isolate von den R2A-Platten auf NA und 24 Pilz- bzw.
Hefe-Isolate von den TSM-Platten auf PDA übertragen. Die Isolate wurden bei RT
angezüchtet. Einige der über 1.000 erhaltenen Isolate sind hier gezeigt (siehe Abb. 4 und
Abb. 5)
Material und Methoden
17
Abb. 4: Einzelisolate von Bakterien. Abb. 5: Einzelisolate von Pilzen. Die gezeigten Pilze Die abgebildeten Isolate wurden aus der Rhizosphäre der Matricaria
stammen aus dem Wüstenboden. chamomilla isoliert.
2.4.3 Stammhaltung
Die Bakterien-Isolate wurden auf NA und die Pilz-Isolate auf PDA im Kühlraum bei 4 °C
aufbewahrt. Von allen isolierten Pilzen wurden Gefrier-Konserven angelegt. Hierfür wurden
Agarstückchen mit Myzel-Bewuchs in 1 ml Pilzkonservierungs-Medium eingebracht und bei
-70 °C gelagert. Von den Bakterien wurden aufgrund der großen Anzahl nur jene mit
antagonistischen Fähigkeiten konserviert. Die bakteriellen Isolate wurden hierfür in 700 µl
NB-Medium angeimpft und über Nacht bei 30 °C und 220 rpm im Schüttelinkubator
angezogen. Die so erhaltenen ONCs wurden am nächsten Tag mit 300 µl sterilem
Glycerol [50 %] versetzt und ebenfalls bei -70 °C gelagert. Für die verschiedenen Versuche
wurden üblicherweise die Bakterien- und Pilz-Isolate von den Platten im Kühlraum
verwendet. Nur in Ausnahmefällen wurde die Kultur neu aus der Konserve entnommen.
2.5 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten
Mikroorganismen
Von den Proben, welche in SEKEM genommen wurden, wurden insgesamt 680 Bakterien-
und 327 Pilz-Stämme isoliert. Alle dieser Isolate wurden in Dualkultur in vitro Assays
(Berg & Ballin, 1994) auf ihre antagonistische Aktivität gegen Verticillium dahliae
(Ascomycet), Rhizoctonia solani (Basidiomycet) und Fusarium culmorum (Ascomycet)
getestet. Jedes Isolat wurde 2-mal unabhängig voneinander getestet. Die Antagonisten-Tests
mit Bakterien-Isolaten wurden auf WA und die Tests mit Pilz-Isolaten auf PDA unter sterilen
Bedingungen durchgeführt und bei RT inkubiert. Es wurden die Pathoge Verticillium dahliae
Material und Methoden
18
V25, Rhizoctonia solani AG4 und Fusarium culmorum E1 verwendet. Der Fusarium-Stamm
ist in SEKEM von befallenen Pflanzen isoliert worden.
Zusätzlich wurden alle erhaltenen Isolate auf ihre antagonistische Wirkung gegen 3 weitere
Phytopathogene getestet: Botrytis cinerea, Alternaria alternata and Sclerotinia sclerotiorum
(alles Ascomyceten).
Test gegen R. solani, F. culmorum, B. cinerea, A. alternata and S. sclerotiorum:
Für die Dualkultur-Tests wurden Agarstückchen mit Pilzmyzel direkt von einer Platte mit
dem Pathogen ausgestochen und zwischen 4 aufgeimpfte bakterielle Isolate (siehe Abb. 6)
oder zwischen 4 Agarstückchen von pilzlichen Isolaten auf der Testplatte platziert. Hierfür
wurden ein Korkbohrer und sterile Zahnstocher verwendet.
Abb. 6: Schema eines Antagonisten-Tests.
zur Testung von 4 Bakterien-Isolaten
Test gegen V. dahliae:
Verticillium dahliae wurde für mindestens 2 Wochen in flüssiger Kultur in Czapek Dox
Medium (CDB) angezüchtet. Für die Dualkultur-Tests wurden je 200 µl dieser Suspension
auf Agar-Platten ausplattiert und nach dem Trocknen wurden die Isolate auf die Platte
transferiert.
Bei beiden Methoden erfolgte die Auswertung nach einigen Tagen Inkubation bei RT– je
nach Wachstumsgeschwindigkeit des Pathogens. Um diese zu Beurteilen, wurde stets eine
Referenzplatte ohne Test-Isolate mitgeführt.
Bakterien-Isolat
Pilz-Pathogen
Material und Methoden
19
Für eine quantitative Auswertung wurde die Wachstumshemmung der Pilz-Pathogene
ausgehend von den Teststämmen anhand der gebildeten Hemmhöfe beurteilt
(Berg & Bahl, 1996) und folgendermaßen bewertet:
kein Hemmhof –
Hemmhof 1 – 5 mm +
Hemmhof 5 – 10 mm ++
Hemmhof > 10 mm +++
Bei den Pilz-Isolaten wurde zusätzlich noch Hyperparasitismus (HP) bewertet.
2.6 Genotypische Charakterisierung der bakteriellen Isolate mit
antagonistischem Potenzial
Für die molekularbiologische Charakterisierung wurden jene Bakterien-Isolate verwendet,
welche die stärksten antagonistischen Aktivitäten gegen alle getesteten Phytopathogene
zeigten und auf Gele stets nach Morphologie-Gruppen geordnet aufgetragen.
2.6.1 Puffer und Lösungen
Alle verwendeten Lösungen wurden – wenn nicht anders angegeben – mit deionisiertem
Wasser zubereitet.
TAE-Puffer [50 x]
Tris [99,9 %] 242,0 g/l
Essigsäure [100 %] 57,0 ml/l
EDTA [0,5 M] pH 8 100,0 ml/l
TBE-Puffer [5 x]
Tris [99,9 %] 54,0 g/l
Borsäure [99,8 %] 27,5 g/l
EDTA [0,5 M] pH 8 20,0 ml/l
Material und Methoden
20
Tris-HCl-Stammlösung [1 M]
Tris [99,9 %] 121,0 g/l
konz. HCl pH 8,5
EDTA-Stammlösung [0,5 M]
EDTA 207,2 g/l
NaOH [10 M] 66,7 g/l
NaOH [1 M] 44,4 g/l
pH 8
Taq-&GOTM
[5 x] (Qbiogene)
Magnesiumchlorid 8,5 mM
dNTPs 1,0 mM
Taq DNA-Polymerase 0,15 U/µl
Loading Dye [6 x]
Bromphenolblau 0,25 %
Xylencyanol 0,25 %
Glycerol 30,0 %
EDTA Na2 x 2H2O [0,5 M] 50,0 mM
2.6.2 Standard DNA Ladders
Es wurden die beiden Standards 1kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) und 100 bp DNA Ladder
(siehe Abb. 8) von Fermentas Life Sciences mit einer Konzentration von [0,1 µg/µl]
verwendet. In Agarosegelen wurden 0,5 µg/lane eingesetzt und in Polyacrylamidgelen
0,2 µg/lane.
Material und Methoden
21
1 kb DNA Ladder 100 bp DNA Ladder
Abb. 7: 1 kb DNA Ladder. Abb. 8: 100 bp DNA Ladder.
2.6.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) wird verwendet, um einen
kurzen, genau definierten DNA-Abschnitt zu amplifizieren. Wichtig hierfür ist eine
thermostabile DNA-Polymerase (ausführendes Enzym) und spezifisch bindende Primer
(kurze Oligonukleotide). Die Polymerase kopiert die DNA-Sequenz des Templates
(Original-DNA) ausgehend von einem Primer. Um den zu replizierenden Bereich von beiden
Seiten zu begrenzen, werden 2 Primer (forward und reverse) benötigt, diese bestimmen auf
beiden DNA-Strängen den Startpunkt für die Polymerase (Saiki et al., 1988). Die PCR wird in
einem Thermocycler durchgeführt, welcher die Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur,
welche für den jeweiligen Schritt benötigt wird, erhitzt bzw. kühlt. Am Beginn des
PCR-Prozesses findet ein Denaturierungsschritt von mehreren Minuten statt, dann folgen eine
Anzahl von 12 – 50 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus Denaturierung, Primerhybridisierung und
Elongation besteht. Zuletzt folgt noch ein zusätzlicher längerer Elongationsschritt.
Die PCR-Ansätze wurden stets auf Eis hergestellt. Zur Überprüfung der PCR wurden die
Amplifikate auf einem 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetrennt (Laufzeit je nach
Gelgröße 30 – 40 min bei 100 V).
Material und Methoden
22
In der kultivierungsabhängigen Analyse wurden folgende Primer verwendet (siehe Tab. 1):
Tab. 1: Verwendete Primer. (f ... forward, r ... reverse, * .. IUPAC-Code: Y = T/C; M = A/C)
Bezeichnung Primer-Sequenz * Ziel-Organismus Referenz
Eub1f 5‟ AGA TTT GAT CMT GGC TCA G „3 Eubakterien Liesack et al., 1991
1492r 5‟ TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T „3 Eubakterien
BOX-A1 5' CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3' Martin et al., 1992
2.6.4 Agarosegelelektrophorese
Bei der Agarosegelelektrophorese werden Nukleinsäure-Stränge entsprechend ihrer Länge in
einem Agarosegel, welches in ionischer Pufferlösung liegt, aufgetrennt. Dafür wird ein
elektrisches Feld angelegt, wodurch die negativ geladene dsDNA im Gel von Katode
Richtung Anode transportiert wird. Je kleiner ein Fragment ist, desto schneller kann es sich
im Agarosenetzwerk vorwärts bewegen. Anhand von Vergleichen mit Standards definierter
Fragment-Größe kann die Länge der aufgetrennten Fragmente bestimmt werden
(Adkins & Burmeister, 1996).
Verwendet wurden die beiden Standards 1kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) und 100 bp DNA
Ladder (siehe Abb. 8). Die Netzdichte des Agarosegels kann je nach Größe der zu trennenden
DNA-Fragmente variiert werden. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die
eingesetzten Agarose-Konzentrationen und Puffer (siehe Tab. 2).
Tab. 2: Verwendete Agarosegele. Agarose-Konzentration und Elektrophorese-Bedingungen für
verschiedene Anwendungen
Anwendung Agarose-
Konzentration Puffer Spannung Laufzeit
PCR-Produkte,
genomische DNA
0,8 %
1 x TAE
100 V
30 – 40 min
ARDRA 2 % 0,5 x TBE 120 V 3 h 30 min
BOX-PCR 1,5 % 0,5 x TBE 90 V 4 h
Material und Methoden
23
Zur Auftrennung im Agarosegel wurden Aliquote der Ansätze mit Loading Dye [6 x] versetzt
und auf das Gel aufgetragen. Die Färbung des Gels erfolgte (je nach Gelgröße für
20 – 30 min) in einem Ethidiumbromid-Bad [0,01 %], wonach sie unter UV-Licht fotografiert
wurden.
2.6.5 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis)
Bei dieser Analyse wird ein eubakterieller Abschnitt der hochkonservierten 16S rDNA mittels
PCR amplifiziert und das erhaltene PCR-Produkt wird anschließend einem Verdau mit einer
Restriktionsendonuklease unterzogen. Je nach Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments
gibt es Unterschiede in Anzahl und Lage der Schnittstellen für das verwendete
Restriktionsenzym und somit wird das PCR-Produkt in unterschiedlich viele und verschieden
lange DNA-Sücke geschnitten. Bei der anschließenden Agarosegelelektrophorese resultieren
daraus verschiedene Bandenmuster, wonach Bakterien auf Gattungsebene unterschieden
werden können.
Isolation der chromosomale DNA aus den stärksten Antagonisten
Die DNA-Isolation erfolgte mit der schnellen und kosteneffizienten Aufkochmethode. Dafür
wurde mit sterilen Zahnstochern Zellmaterial der Bakterien-Isolate in je 30 µl H2O
eingebracht. Die Bakterien-Suspensionen wurden für 15 min bei -70 °C eingefroren und
danach für 5 min im Thermocycler auf 100 °C aufgekocht. Anschließend erfolgte eine
Zentrifugation für 5 min bei 13.000 rpm und 4 °C. Der Überstand, welcher nun die
chromosomale DNA der Bakterien enthält, wurde unmittelbar als Template in die PCR
eingesetzt.
Amplifikation der 16S rDNA
Zur Amplifikation der 16S rDNA wurden die eubakteriellen Primer Eub1f und 1492r
verwendet (siehe Tab. 1). Das Eubac-Fragment hat eine Größe von 1492 bp und liegt auf der
16S rDNA. Das erhaltene PCR-Produkt wurde später mit dem Restriktionsenzym HhaI
geschnitten.
Material und Methoden
24
Reaktionsansatz für Eubac-PCR:
Taq-&GOTM
[5 x] 4,0 µl
MgCl2 [25 mM] 1,2 µl
Primer Eub1f [5 µM] 1,0 µl
Primer 1492r [5 µM] 1,0 µl
H2O 11,8 µl
DNA-Template 3,0 µl
Gesamtvolumen 60,0 µl
Temperaturprogramm:
95 °C ................ 5 min
95 °C .................. 30 s
55 °C .................. 30 s
72 °C ......... 1 min 40 s 9 x
95 °C .................. 30 s
52 °C .................. 30 s
72 °C ......... 1 min 30 s 19 x
72 °C .............. 10 min
15 °C ................... end
Als Negativkontrolle wurde anstelle des DNA-Templates Wasser eingesetzt.
Die Kontrolle der PCR erfolgte durch eine Elektrophorese in einem 0,8 %igen Agarosegel in
1 x TAE-Puffer. Es wurden 3 µl des PCR-Produkts mit Loading Dye [6 x] versetzt und auf
das Kontrollgel aufgetragen.
Restriktion der 16S rDNA mit HhaI
Je nach Stärke der Bande am Kontrollgel wurde die Menge des in den Verdau eingesetzten
PCR-Produkts variiert (6 µl, 10 µl oder 15 µl PCR-Produkt). Der Restriktionsverdau erfolgte
für 3 h bei 37 °C im PCR-Cycler.
Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease HhaI: GC*G↓C
↓ .. Stelle des Enzymangriffs; * ... Stelle der Methylierung
Material und Methoden
25
Restriktionsansatz mit HhaI:
HhaI [10 U/µl] 0,25 µl
NEB4 Puffer [10 x] 2,0 µl
BSA [10 mg/ml] 0,2 µl
H2O 11,5 µl 7,5 µl 2,5 µl
PCR-Produkt 6,0 µl 10,0 µl 15,0 µl
Agarosegelelektrophorese
Nach dem Verdau wurden 10 µl des Ansatzes mit Loading Dye [6 x] versetzt und auf ein
2 %iges Agarosegel in 0,5 x TBE-Puffer aufgetragen. Die Laufzeit der Elektrophorese betrug
3 h 30 min bei 120 V.
Die Restriktionsansätze wurden auf zwei 2 %ige Agarosegele genau nach demselben
Auftragsschema aufgetragen. Ein Gel wurde wie sonst auch üblich nach der Elektrophorese in
einem Ethidiumbromid-Bad [0,01 %] gefärbt, dem zweiten Gel wurde vor dem Gießen
Midori Green DNA Stain (genXpress) beigemischt (10 µl auf 200 ml Gel-Solution). Beide
Gele wurden anschließend unter UV-Licht fotografiert. So war ein direkter Vergleich der
beiden Methoden möglich.
Midori Green DNA Stain kann wie Ethidiumbromid zur Detektion von Nukleinsäuren in
Agarosegelen eingesetzt werden. Ethidiumbromid ist erwiesen stark carcinogen,
Midori Green DNA Stain verspricht hingegen eine wesentlich geringere Mutagenitätsrate.
Midori Green DNA Stain würde also eine weniger gefährliche Alternative zum
Ethidiumbromid darstellen.
Material und Methoden
26
Auswertung des ARDRA-Gels mittels GelCompar II
Die Auswertung des ARDRA-Gels erfolgte mit der Software GelCompar II
(Applied Maths). Bei der Erstellung der Dendrogramme wurden folgende Einstellungen
verwendet:
Dendrogram type: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA)
Similarity coefficient: Band based: Dice
Position tolerances: Optimization: 4 %
Position tolerance: 1 %
2.6.6 BOX-PCR
BOX-Elemente sind repetitive hochpolymorphe Sequenzelemente in Genomen, sie
unterscheiden sich in ihrer Länge und ihrer Sequenz. Bei der BOX-PCR wird nur ein Primer
verwendet, der an einen solchen Repeat bindet. Bei Auftrennung der PCR-Produkte im
Agarosegel ergeben sich bei dieser Fingerprint-Methode charakteristische artspezifische
Muster. Somit können die auf Gattungsebene gebildeten ARDRA-Gruppen weiter unterteilt
werden.
Isolation der chromosomale DNA aus den stärksten Antagonisten
Die Isolation der bakteriellen DNA erfolgte erneut mit der Aufkoch-Methode
(siehe 2.6.5 ARDRA).
Material und Methoden
27
BOX-PCR
Zur Amplifikation der repetitiven BOX-Sequenz wurde der Primer BOX A1 verwendet.
Reaktionsansatz für BOX-PCR:
Taq-&GOTM
[5 x] 5,0 µl
MgCl2 [25 mM] 1,5 µl
Primer BOX A1 [5 µM] 5,0 µl
H2O 12,5 µl
DNA-Template 1,0 µl
Gesamtvolumen 25,0 µl
Temperaturprogramm:
95 °C ................ 5 min
95 °C ................ 1 min
53 °C ................ 1 min
65 °C ................ 8 min 35 x
65 °C .............. 16 min
15 °C ................... end
Als Negativkontrolle wurde anstelle des DNA-Templates Wasser eingesetzt.
Agarosegelelektrophorese
Auf das 1,5 %ige Gel in 0,5 x TBE-Puffer wurden 12 µl jedes PCR-Ansatzes versetzt mit
Loading Dye [6 x] aufgetragen. Dabei wurden die Isolate einer ARDRA-Gruppen
nebeneinander gelegt. Die Laufzeit des BOX-Gels betrug 4 Stunden bei 90 V.
Material und Methoden
28
Auswertung des BOX-Gels mittels GelCompar II
Das BOX-Gel wurde ebenfalls mit GelCompar II ausgewertet. Wobei wieder dieselben
Einstellungen verwendet wurden:
Dendrogram type: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA)
Similarity coefficient: Band based: Dice
Position tolerances: Optimization: 4 %
Position tolerance: 1 %
2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung
Anhand des ARDRA- und des BOX-Gels wurden einige der stärksten Antagonisten zur
Identifizierung ausgewählt. Zur Sequenzierung wurde das 1492 bp lange Eubac-Fragment
verwendet, welches auf der hoch konservierten 16S rDNA liegt. Dieses Fragment wurde mit
den Primern Eub1f und 1492r in einer PCR amplifiziert (siehe 2.6.5 ARDRA). Die
Sequenzierung wurde ausgehend vom Forward-Primer durchgeführt. Zuvor wurden die
PCR-Produkte mit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) laut
Hersteller-Protokoll gereinigt:
1. Das PCR-Produkt wurde mit dem gleichen Volumen an Membrane Binding Solution
versetzt und auf die Minicolumns, welche in Collection-Tubes platziert wurden,
überführt.
2. Inkubation für 1 min bei RT
3. Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT, Collection-Tubes leeren
4. Zugabe von 700 µl Membrane Wash Solution
5. Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT, Collection-Tubes leeren
6. Zugabe von 500 µl Membrane Wash Solution
7. Zentrifugation für 5 min bei 16.000 g und RT, Collection-Tubes leeren
8. Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT ohne vorherige Zugabe von Flüssigkeit
9. Minicolumns in frischen Tubes platzieren
10. 30 µl Nuclease-Free Water auf die Minicolumns geben
11. Inkubation für 1 min bei RT
12. Elution der gereinigten DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT
Material und Methoden
29
Die genaue DNA-Konzentration, welche für die Sequenzierung benötigt wird, wurde mittels
Photometer bestimmt. Im Photometer kann doppelsträngige DNA bei einer Wellenlänge von
260 nm gemessen werden. Hierfür werden 45 µl H2O und 5 µl gereinigtes PCR-Produkt in
eine spezielle Küvette gefüllt und gegen H2O als Leerwert vermessen. Die Verdünnung muss
mit einberechnet werden.
Sequenzierung
Für die Sequenzierung wurden die Proben mit den amplifizierten, gereinigten Fragmenten an
das ZMF (Zentrum für medizinische Grundlagenforschung) der medizinischen Universität
Graz überstellt. Durch Vergleiche der erhaltenen Sequenzen mit der Datenbank des NCBI
(National Center for Biotechnology Information) konnten die Bakterien identifiziert werden,
hierfür wurde blastn (megablast) gegen Nucleotide collection (nr/nt) verwendet.
2.7 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das
Bildungsvermögen des Phytohormons Indol-3-essigsäure
Einige Bakterien sind in der Lage Pflanzenwachstumshormone wie zum Beispiel Auxine,
wozu Indol-3-essigsäure (IAA) zählt, zu produzieren. Diese Bakterien gehören zur Gruppe
der Pflanzen-wachstumsfördernden Bakterien (PGPR, Plant Growth Promoting
Rhizobacteria) (Dube, 2001). PGPR stimulieren durch die Bildung und Exkretion von
Pflanzenhormonen die Mineralstoffaufnahme aus dem Boden und das Wachstum der Pflanze,
insbesondere werden das Wachstum der Wurzel und die Bildung der Wurzelhaare gefördert
(Taiz & Zeiger, 2002). Viele antagonistisch aktive Bakterien verfügen zusätzlich über die
Fähigkeit Phytohormone zu produzieren.
Anhand der ARDRA-Gruppen wurden 8 bakterielle Antagonisten für den Versuch
ausgewählt. Der Test beruht auf einer Farbreaktion zwischen Indol-3-essigsäure und
Eisen(III)-chlorid in halbkonzentrierter Perchlorsäure. 5 ml Wachstumsmedium
(Minimalmedium) wurden mit den entsprechenden Isolaten angeimpft und für 72 h bei 20 °C
und ca. 120 rpm im Dunkeln inkubiert. Ein unbeimpftes Kulturröhrchen wurde als
Negativkontrolle mitgeführt. Zur Bestimmung der gebildeten Indol-3-essigsäure wird von
jeder Kultur 1 ml entnommen und für 10 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. 90 µl
des zellfreien Überstandes werden in eine Mikrotiterplatte überführt und 60 µl
Material und Methoden
30
Salkowski Reagenz dazu gegeben. Nach einer Inkubation von 30 min im Dunkeln kam es bei
positiven Isolaten zu einer rotvioletten Färbung des ausgangs gelblichen Mediums. Mittels
Microplate-Reader wurde die Extinktion gegen den Leerwert (90 µl IAA-Medium + 60 µl
Salkowski Reagenz) bei 530 nm gemessen. Beim erstellten Absorptionsspektrum lag das
Maximum bei 460 nm, aus diesem Grund wurde bei 460 nm ebenfalls eine Messung
durchgeführt.
Salkowski Reagenz
Eisen(III)-chlorid [0,5 M] 20 ml/l
Perchlorsäure [35 %] 980 ml/l
2.8 Isolation der Gesamt-DNA aus dem Probenmaterial
Rhizosphäre:
Für die Isolation der Gesamt-DNA aus der Rhizosphäre wurden 5 g Wurzeln mit daran
haftender Erde und 45 ml NaCl [0,85 %] in sterile Falcon-Tubes gegeben und für 5 min am
Vortex gemixt. Nach kurzem Absitzen wurden 4 ml vom Überstand entnommen und für
20 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Derselbe Überstand wurde auch für die
Isolation von Mikroorganismen verwendet (siehe 2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem
Probenmaterial). Die erhaltenen Pellets wurden für die Isolation der Gesamt-DNA verwendet.
Endorhizosphäre:
Um die Gesamt-DNA aus der Endorhizosphäre zu isolieren, wurden 5 g Wurzelmaterial mit
NaOCl [4 %] für 5 min in einem sterilen Tube oberflächensterilisiert und danach 3 mal mit
sterilem Aqua dest. gewaschen. Nach der Zugabe von 10 ml steriler NaCl [0,85 %] wurden
die Wurzeln mit Mörser und Pistill zerkleinert. Wie bei der Rhizosphäre wurden 4 ml für die
Zentrifugation (20 min, 13.000 rpm, 4 °C) verwendet und aus den erhaltenen Pellets wurde
die Gesamt-DNA isoliert.
Boden von der Adleya-Farm in SEKEM:
5 g Boden wurden unter semisterilen Bedingungen eingewogen und mit 45 ml NaCl [0,85 %]
aufgeschlämmt. Danach wurde für 5 min gevortext und nach kurzem Absitzen wurde
Überstand für die Zentrifugation (20 min, 13.000 rpm, 4 °C) entnommen. Für die
DNA-Isolation wurden die Pellets von 4 ml Überstand benützt.
Material und Methoden
31
Wüstenboden:
Im Wüstenboden wird eine geringere Konzentration an Mikroorganismen und so auch an
DNA erwartet. Deshalb wurden für die Isolation aus dem Wüstensand die Pellets von 10 ml
Überstand verwendet.
Aus den erhaltenen Pellets aller Proben, welche bei -70 °C gelagert wurden, wurde die
Gesamt-DNA der Mischkultur mit FastDNA® SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) laut
Hersteller-Protokoll extrahiert:
1. Die Pellets wurden in 978 µl Natriumphosphat-Puffer aufgenommen und in die dem Kit
beiliegenden Lysing Matrix E-Tubes überführt.
2. Zugabe von 122 µl MT-Puffer
3. Aufschluss im Ribolyzer für 2 x 30 s bei Stufe 5,0. Dazwischen wurden die Proben auf
Eis gekühlt.
4. Zentrifugation für 15 min bei 14.000 g und RT, Überführen der Überstände in frische
Tubes
5. Zugabe von 650 µl PPS (Protein Precipitation Solution) und 10maliges Schütteln der
Tubes per Hand
6. Zentrifugation für 5 min bei 14.000 g und RT, Überführen der Überstände in frische
Tubes
7. Zugabe von 1 ml resuspendierter Binding Matrix Suspension und 2 minütiges Schütteln
der Tubes per Hand
8. 5 min sedimentieren lassen
9. 700 µl Überstand abheben und verwerfen
10. Binding Matrix im verbleibenden Überstand resuspendieren und 600 µl auf den
SPINTM
Filter im Catch-Tube transferieren
11. Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT, Catch-Tubes leeren
12. Überführen der restlichen Suspension auf den SPINTM
Filter
13. Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT, Catch-Tubes leeren
14. 500 µl SEWS-M auf den SPINTM
Filter zugeben und Pellet darin resuspendieren
15. Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT, Catch-Tubes leeren
16. Zentrifugation für 2 min bei 14.000 g und RT ohne vorherige Zugabe von Flüssigkeit
17. SPINTM
Filter in frische Catch-Tubes überführen
18. 5 min bei RT lufttrocknen lassen
Material und Methoden
32
19. Zugabe von 100 µl DES (DNase/Pyrogen-Free Water) (vorgewärmt auf 55 °C) und
resuspendieren
20. Inkubation für 5 min bei 55 °C im Thermoblock
21. Elution der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT.
Die Qualität der extrahierten DNA wurde in einem 0,8 %igen Agarosegel überprüft. Bis zur
weiteren Verwendung wurde die DNA bei -20 °C gelagert.
2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen
Biodiversität mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation
Polymorphism Analysis)
Die SSCP-Analyse ist eine molekulare Methode zur Diversitätsanalyse mikrobieller
Gemeinschaften, dafür werden DNA-Moleküle gleicher Länge aber unterschiedlicher
Sequenz verwendet, die in einer PCR gewonnen werden (Rochelle, 2001). Bei Bakterien
werden dafür kleine Abschnitte der hoch konservierten rRNA-Gene amplifiziert, bei Pilzen
wird ein Fragment zwischen 5,8S rDNA und 18S rDNA amplifiziert, welches ebenfalls hoch
konserviert ist. Für die SSCP-Analyse muss die DNA einzelsträngig vorliegen, die
Doppelstrangmoleküle werden nach der PCR durch die Behandlung mit Lambda-Exonuklease
in Einzelstrangmoleküle überführt. Angriffspunkt für dieses Enzym ist der Phosphatrest am
5‟-Ende des PCR-Produkts, der durch den Reverse-Primer eingeführt wurde. Die
Einzelstränge werden denaturiert und bilden sequenzspezifische Sekundärstrukturen auf
Grund intramolekularer Basenpaarungen aus. DNA-Fragmente gleicher Länge aber
unterschiedlicher Konformation zeigen im nicht denaturierenden
Polyacrylamidgelelektrophorese-Nachweis unterschiedliche Laufweiten. Durch Silberfärbung
können die aufgetrennten DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden. Mit dieser
Fingerprint-Methode ist eine Unterscheidung bis auf Gattungs- oder sogar Artniveau möglich.
Damit ein Mikroorganismus eine erkennbare Bande am Gel erzeugt, muss dessen DNA
mindestens 1,5 % der Gesamt-DNA der Population betragen. Um einzelne bandengebende
Mikroorganismen zu identifizieren, können DNA-Banden aus dem Polyacrylamidgel
ausgeschnitten und sequenziert werden (Tebbe et al., 2001). Es können Primer, die spezifisch
für eine spezielle Organismengruppe sind, gewählt werde. So kann eine Selektion der durch
die SSCP-Analyse erfassten Mikroorganismen erreicht werden.
Material und Methoden
33
Ursprünglich wurde die SSCP-Analyse entwickelt, um Genpolymorphismen in menschlicher
DNA zu erkennen (Orita et al., 1989) und wurde dazu verwendet, Genmutationen
festzustellen (Hayashi, 1991). Erst später wurde erkannt, dass diese Fingerprint-Methode auch
zur kultivierungsunabhängigen Analyse von Mikroorganismen-Populationen in
Umweltproben herangezogen werden kann (Schwieger & Tebbe, 1998). Ein großer Vorteil
dieser kultivierungsunabhängigen Methode ist, dass man damit auch schwierig oder nicht
kultivierbare Mikroorganismen erfassen kann.
SSCP-PCR
Der theoretische Hintergrund der PCR wurde bereits unter 2.6.3 erläutert. Für die partielle
Amplifikation der rDNA wurden folgende Primer verwendet (siehe Tab. 3):
Tab. 3: Verwendete Primer. (f ... forward, r ... reverse, P ... 5‟-Phosphorylierung,
* .. IUPAC-Code: Y = T/C; M = A/C)
Bezeichnung Primer-Sequenz * Ziel-Organismus Referenz
Unibac-II-515f 5‟GTG CCA GCA GCC GC‟3 Eubakterien Lieber et al., 2002
Unibac-II-927rP 5‟ CCC GTC AAT TYM TTT GAG TT‟3 Eubakterien Lieber et al., 2002
F311Ps 5´ CTG GTC TGA GAG GAT GAT CAG T 3´ Pseudomonas Milling et al., 2004
1459rPsP 5´ AAT CAC TCC GTG GTA ACC GT 3´ Pseudomonas Milling et al., 2004
ITS1f 5´ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3´ ITS1 Pilze White et al., 1990
ITS2rP 5´ GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3´ ITS1 Pilze White et al., 1990
ITS4rP 5´ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3´ ITS1+2 Pilze White et al., 1990
Gesamte Bakterien-Community:
Um einen kurzen hochkonservierten Abschnitt der bakteriellen 16S rDNA zu amplifizieren,
wurden in der PCR die universellen eubakteriellen Primer Unibac-II-515f und
Unibac-II-927rP eingesetzt (siehe Tab. 3). Das Unibac-Fragment ist 413 bp lang und liegt auf
der 16S rDNA.
Material und Methoden
34
Reaktionsansatz für Unibac-PCR:
Taq-&GOTM
[5 x] 12,0 µl
MgCl2 [25 mM] 3,6 µl
Primer Unibac-II-515f [5 µM] 2,4 µl
Primer Unibac-II-927rP [5 µM] 2,4 µl
H2O 38,6 µl
Gesamt-DNA-Template 1,0 µl
Gesamtvolumen 60,0 µl
Temperaturprogramm:
95 °C ................ 5 min
95 °C .................. 20 s
54 °C .................. 15 s
72 °C .................. 30 s 31 x
72 °C .............. 10 min
15 °C ................... end
Als Negativkontrolle wurde anstelle des DNA-Templates Wasser eingesetzt.
Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurden 5 µl jedes Ansatzes mit Loading Dye [6 x]
versetzt und in einem 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetrennt.
Pseudomonas-Community:
Um die 16S rDNA der antagonistisch interessanten Pseudomonaden hervorzuheben, wurde
eine nested PCR (verschachtelte PCR) durchgeführt. Dabei wird das Produkt einer PCR als
Template in eine zweite Reaktion eingesetzt, wobei das zweite Amplifikat einen kürzeren
Abschnitt des ersten Produkts darstellt. Mit diesem Verfahren kann die Sensitivität der PCR
erhöht werden, so dass auch kleine Mengen an Template-DNA eine befriedigende Ausbeute
an Produkt ergeben. Außerdem erhöht sich mit der Methode der nested PCR die Spezifität der
Reaktion, indem die 1. PCR Pseudomonas-spezifisch ist. Hierfür wurden die Primer F311Ps
und 1459rPsP verwendet. Um einen Abschnitt des Amplifikats der 1. PCR zu vermehren,
wurden in der 2. PCR die beiden universellen Primer Unibac-II-515f und Unibac-II-927rP
eingesetzt (siehe Tab. 3), welche auch für die gesamte bakterielle Gemeinschaft verwendet
wurden.
Material und Methoden
35
Reaktionsansatz für Pseudomonas-spezifische PCR (1. PCR):
Taq-&GOTM
[5 x] 4,0 µl
MgCl2 [25 mM] 1,8 µl
Primer F311Ps [5 µM] 0,8 µl
Primer 1459rPsP [5 µM] 0,8 µl
BSA [10 mg/ml] 1,0 µl
DMSO [100 %] 0,3 µl
H2O 10,3 µl
Gesamt-DNA-Template 1,0 µl
Gesamtvolumen 20,0 µl
Temperaturprogramm:
94 °C ................ 7 min
94 °C .................. 45 s
56 °C ................ 2 min
72 °C ................ 2 min 30 x
72 °C .............. 10 min
15 °C ................... end
Für jene Proben, wo nach der 1. PCR nach wiederholten Versuchen kein PCR-Produkt am
Agarosegel zu erkennen war, wurde zusätzlich ein Ansatz mit der Phusion® High-Fidelity
DNA-Polymerase (New England Biolabs) versucht, wodurch weitere PCR-Produkte
gewonnen werden konnten. Diese Polymerase ist effizienter als die Taq-Polymerase und
eignet sich besonders für schwierige Templates. Das Temperaturprogramm wurde nicht
verändert.
Material und Methoden
36
Reaktionsansatz für Pseudomonas-spezifische PCR (1. PCR):
Phusion® Polymerase [2 U/µl] 0,5 µl
MgCl2 [25 mM] 1,8 µl
GC-Puffer [5 x] 4,0 µl
dNTPs [2 mM] 2,0 µl
Primer F311Ps [5 µM] 0,8 µl
Primer 1459rPsP [5 µM] 0,8 µl
H2O 5,1 µl
Gesamt-DNA-Template 5,0 µl
Gesamtvolumen 20,0 µl
Je nach Stärke der erhaltenen Bande am Kontrollgel der Pseudomonas-spezifischen PCR
wurde das PCR-Produkt unverdünnt oder in einer 1:50-Verdünnung mit H2O als Template in
die 2. PCR eingesetzt.
Reaktionsansatz für Unibac-PCR (2. PCR):
Taq-&GOTM
[5 x] 12,0 µl
MgCl2 [25 mM] 3,6 µl
Primer Unibac-II-515f [5 µM] 2,4 µl
Primer Unibac-II-927rP [5 µM] 2,4 µl
H2O 33,6 µl H2O 37,6 µl
DNA-Template (1:50) 6,0 µl DNA-Template (unverd.) 2,0 µl
Gesamtvolumen 60,0 µl Gesamtvolumen 60,0 µl
Temperatur-Programm wurde dasselbe wie bei der Unibac-PCR der gesamten
Bakterien-Community verwendet.
Gesamte Pilz-Community:
Für die SSCP-Analyse von Pilzen wird ein ITS-Fragment amplifiziert. ITS steht für „Internal
Transcribed Spacer“. Bei diesem Fragment handelt es sich um ein pilzliches Fragment
zwischen 5,8S rDNA und 18S rDNA. Hier wurde ebenfalls eine nested PCR durchgeführt,
wobei beide Reaktionen Pilz-spezifisch sind und ein Primer in beiden identisch ist. Das
Produkt der zweiten Reaktion liegt also am Rande des 1. PCR-Produkts. In der 1. PCR
Material und Methoden
37
wurden die Primer ITS1f und ITS4rP verwendet. Für die 2. PCR wurde derselbe
Forward-Primer verwendet und mit dem phosphorylierten Reverse-Primer ITS2rP kombiniert.
Reaktionsansatz ITS1-PCR (1. PCR):
Taq-&GOTM
[5 x] 4,0 µl
MgCl2 [25 mM] 1,2 µl
Primer ITS1f [5 µM] 0,8 µl
Primer ITS4rP [5 µM] 0,8 µl
H2O 12,2 µl
Gesamt-DNA-Template 1,0 µl
Gesamtvolumen 20,0 µl
Temperaturprogramm:
94 °C ................ 5 min
94 °C .................. 30 s
54 °C .................. 35 s
72 °C .................. 40 s 36 x
72 °C .............. 10 min
15 °C ................... end
Bei Proben, wo nach der 1. PCR am 0,8 %igen Agarosegel kein Produkt zu erkennen war,
wurde das Amplifikat wieder unverdünnt in die nachfolgende PCR eingesetzt. War eine
Bande sichtbar, wurde das PCR-Produkt zuvor 1:50 verdünnt.
Reaktionsansatz ITS2-PCR (2. PCR):
Taq-&GOTM
[5 x] 12,0 µl
MgCl2 [25 mM] 3,6 µl
Primer ITS1f [5 µM] 2,4 µl
Primer ITS2rP [5 µM] 2,4 µl
H2O 33,6 µl H2O 37,6 µl
DNA-Template (1:50) 6,0 µl DNA-Template (unverd.) 2,0 µl
Gesamtvolumen 60,0 µl Gesamtvolumen 60,0 µl
Material und Methoden
38
Temperaturprogramm:
95 °C ................ 5 min
95 °C .................. 30 s
58 °C .................. 35 s
72 °C .................. 40 s 37 x
72 °C .............. 10 min
15 °C ................... end
Aufreinigung des PCR-Ansatzes
Alle erhaltenen PCR-Produkte wurden vor dem Einzelstrang-Verdau für die SSCP-Analyse
mit Wizard®
SV Gel and PCR Clean-Up System laut Hersteller-Protokoll gereinigt
(siehe 2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung). Dies diente dazu,
störende Salze, Proteine und Nukleotide zu entfernen. Die gereinigten PCR-Produkte wurden
bis zum Weiterarbeiten bei -20°C gelagert.
Verdauung des am 5’-Ende phosphorylierten Einzelstranges
Die PCR-Produkte, welche als Doppelstränge vorliegen, müssen für die SSCP-Analyse einem
Einzelstrang-Verdau unterzogen werden. Die Exonuklease verdaut spezifisch jene Stränge,
deren Enden durch die phosphorylierten Reverse-Primer markiert wurden.
Reaktionsansatz mit Lambda-Exonuklease:
Lambda Exonuklease [5 U/µl] 2,4 µl
Lambda Exon.-Puffer [10 x] 3,6 µl
Gesamtvolumen 6,0 µl
Für den Einzelstrang-Verdau wurden 30 µl der gereinigten PCR-Produkte mit 6 µl der
Reaktionslösung versetzt. Die Inkubation bei 37 °C wurde im Thermocycler durchgeführt.
Temperaturprogramm:
37 °C .................... 1 h
4 °C ................... end
Material und Methoden
39
Die einzelsträngigen DNA-Proben konnten so bis zur Denaturierung und Faltung bei -20 °C
gelagert werden.
Denaturierung und Faltung der Einzelstränge
Für die Denaturierung wurde jede ssDNA-Probe mit 30 µl SSCP-Ladepuffer versetzt.
Anschließend erfolgte eine 3 minütige Denaturierung bei 95 °C im Thermocycler, wonach die
Proben sofort für mindestens 5 min auf Eis gestellt wurden. Dadurch falten sich die
DNA-Einzelstränge in ihre charakteristischen Sekundärstrukturen, wobei schon geringste
Sequenzunterschiede zu einer unterschiedlichen Faltung führen können.
SSCP-Ladepuffer
Formamid [95 %] 950 µl
NaOH [2,5 M] 4 µl
Bromphenolblau [0,025 %] 5 µl
Aqua deion. 41 µl
→ Die Lösung muss frisch hergestellt werden (höchstens 2 Wochen bei 4 °C
aufbewahrt).
Temperaturprogramm:
98 °C ................ 3 min
4 °C ................... end
Herstellung des Polyacrylamidgels
Bevor das Polyacrylamidgel hergestellt wurde, wurden Grund- und Abdeckplatte der
Gießvorrichtung gründlich mit Ethanol [70 %] gereinigt. Nach etwa jedem fünften Gel wurde
die Grundplatte nach dem Reinigen mit Acryl-Glide behandelt, um das Anhaften des Gels zu
verhindern. Die Trägerfolie wurde mit einigen Tropfen Aqua dest. auf der Abdeckplatte
adhäriert, dabei wurden Luftblasen sorgfältig ausgestrichen. Zwischen Abdeckplatte mit
Trägerfolie und Grundplatte, worauf die Spacer und Slots angebracht sind, wurde eine
Silikondichtung gelegt und die Platten mit Metall-Klammern aneinander befestigt
(siehe Abb. 9).
Material und Methoden
40
Abb. 9: Schematischer Ablauf zum Aufbau der Gießvorrichtung. links: Vorbereitung der
Grund- und Abdeckplatte; rechts: fertige Gießvorrichtung
Der Vernetzungsgrad des Gels und die Laufzeit wurden nach der Größe des aufzutrennenden
DNA-Fragments gewählt. Zur Auftrennung der bakteriellen Unibac-Fragmente (413 bp) mit
unterschiedlicher Sekundärstruktur wurden 8 %ige Polyacrylamidgele verwendet. Für die
pilzlichen ITS-Fragmente (250 – 300 bp) wurden 9 %ige Gele eingesetzt. Die Laufzeit der
8 %igen Gele betrugt 26 h, jene der 9 %igen Pilz-Gele 17 h.
SSCP-Gellösungen: 8 % 9 %
Aqua deion. 23,1 ml 20,8 ml
TBE-Puffer [5 ×] 10,4 ml 10,4 ml
MDE-Solution [2 ×] 18,2 ml 20,5 ml
TEMED 24,5 µl 27,5 ml
APS [10 %] 245,0 µl 275,0 ml
Die Polymerisationsstarter TEMED und APS wurden als letztes zugegeben. Anschließend
wurden die Bestandteile der Gellösung gut durchmischt, mit einer motorischen Pumpe
zwischen Abdeckplatte mit anhaftender Trägerfolie und Grundplatte gegossen und für
mindestens 1,5 h bei RT auspolymerisiert. Dafür wurde das gegossene Gel mit Ethanol
überschichtet.
Material und Methoden
41
Polyacrylamidgelelektrophorese
Für die Elektrophorese wurde das TGGE Maxi System (Biometra) verwendet. Die
Puffer-Kammern der SSCP-Anlage wurden mit je 500 ml TBE-Puffer [1 x] befüllt und die
Trägerfolie mit dem Polyacrylamidgel im Gerät platziert. Um gleichmäßige
Wärmeübertragung zu gewährleisten, wurden zuvor einige Tropfen Aqua dest. auf der
Teflonplatte verteilt. Das Gel wurde mit einer Abdeckfolie bedeckt und 2 mit Puffer
durchtränkte Cellulosemembranen, welche als Buffer-Wicks dienen, wurden auf die Gelenden
gelegt und leicht angedrückt (siehe Abb. 10).
Abb. 10: Schematischer Aufbau der SSCP-Elektrophorese-Apparatur. links: Seitenansicht;
rechts: Aufsicht
Nach einem Vorlauf von 10 min bei 400 V, 50 mA und 20 °C, um das Gel an die
Elektrophorese-Bedingungen anzupassen, wurden die Proben auf das Gel geladen. Von den
Proben wurden jeweils 10 – 12 µl aufgetragen, vom Standard wurden pro Slot nur 2 µl
eingesetzt. Nach dem Gellauf über 17 bzw. 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C wurde das Gel
wie folgt behandelt:
Material und Methoden
42
Silberfärbung
Fixierung: 300 ml Essigsäurelösung [10 %] 30 min
Waschen: 3 × 5 min mit je etwa 300 ml Aqua dest. 15 min
Silberfärbung: 300 ml Silbernitratlösung [0,1 %] (frisch angesetzt)
+ 1,5 ml Formaldehyd [37 w/v %] (Schale abgedunkelt) 30 min
Waschen: unter fließendem Aqua dest. abspülen 10 s
Entwickeln: 500 ml NaOH-Lösung [3 %]
+ 2 ml Formaldehyd [37 w/v %] (Schale abgedunkelt)
erst mit 200 ml kurz spülen,
dann mit restlicher Lösung entwickeln bis Banden sichtbar
Stoppen: 300 ml Essigsäurelösung [10 %] 30 min
Konservieren: 300 ml Ethanol [10 %] + Glycerol [13 %] 30 min
All diese Schritte wurden in einer Plastikwanne durchgeführt, in welcher das Gel zur besseren
Umspülung auf einer Plattform geschwenkt wurde. Die Silberfärbung ist nötig, um die
aufgetrennten DNA-Fragmente im Gel sichtbar zu machen (Bassam et al., 1991). Um die
Gele haltbar zu machen, wurden sie nach der Entwicklung in Ethanol [10 %] + Glycerol [13
%] konserviert, mit einer Cellophan-Folie abgedeckt und zum Trocknen zwischen zwei
Kunststoff-Platten eingespannt. Vor der Konservierung wurde mit einem Flachbettscanner mit
Durchlichtfunktion ein Bild des Gels angefertigt, welches später zur graphischen Auswertung
herangezogen wurde.
Auswertung der SSCP-Gele mittels GelCompar II
Die Auswertung der SSCP-Gele erfolgte mit Hilfe der Software GelCompar II
(Applied Maths) – wie bereits für ARDRA- und BOX-Gel. Dabei wurden aus den
Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen Dendrogramme erstellt, wobei folgende
Einstellungen verwendet wurden:
Dendrogram type: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA)
Similarity coefficient: Band based: Dice
Position tolerances: Optimization: 4 %
Position tolerance: 1 %
Material und Methoden
43
2.9.1 DNA-Isolation aus Gelbanden zur Identifizierung von
Mikroorganismen
Die ausgewählten Banden wurden mit einem Skalpell aus dem konservierten Gel
ausgeschnitten und jeweils mit 150 µl Crush and Soak-Puffer versetzt. Die Proben wurden
anschließend für 5 Tage bei 4 °C gekühlt. Danach wurden die gekühlten Gel-Ausschnitte für
10 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand, worin sich nun die DNA
befand, wurde in ein frisches Eppi transferiert und mit dem doppelten Volumen an Ethanol
[70 %] versetzt. Diese Ansätze wurden für mindestens 1 h bei -20 °C eingefroren.
Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 20 min bei 13.000 rpm und 4 °C. Der Überstand
wurde abgehoben und die erhaltenen DNA-Pellets unter der Clean-Bench getrocknet. Die
isolierte DNA wurde in 50 µl TrisHCl [10 mM] pH 8,5 aufgenommen. Die so extrahierte
DNA wurde direkt als Template in die nachfolgende PCR eingesetzt.
Crush and Soak-Puffer
Magnesiumacetat 2,12 g/l
Ammoniumacetat 38,6 g/l
EDTA pH 8 0,37 g/l
SDS [20 %] 5,0 ml/l
Vorbereitung der Unibac-Fragmente für die Sequenzierung
Um die isolierte DNA aus den ausgeschnittenen SSCP-Gelbanden zu vermehren, wurde mit
der extrahierten DNA eine PCR durchgeführt. Das Temperaturprogramm erfolgte analog der
Unibac-PCR, welche vor der SSCP-Analyse durchgeführt wurde
(siehe 2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität mittels
SSCP-Analyse).
Material und Methoden
44
Reaktionsansatz für Unibac-PCR:
Taq-&GOTM
[5 x] 6,0 µl
MgCl2 [25 mM] 1,8 µl
Primer Unibac-II-515f [5 µM] 1,2 µl
Primer Unibac-II-927rP [5 µM] 1,2 µl
H2O 16,8 µl
DNA-Template 3,0 µl
Gesamtvolumen 30,0 µl
Zur Kontrolle der PCR wurden erneut 5 µl des PCR-Produkts mit Loading Dye [6 x] versetzt
und auf ein 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetragen. Bei erfolgreicher PCR
wurde das verbleibende PCR-Produkt mit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System laut
Hersteller-Protokoll gereinigt und die DNA-Konzentration mittels Photometer bestimmt
(siehe 2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung).
Sequenzierung
Zur Sequenzierung wurden die Proben wieder an das ZMF (Zentrum für medizinische
Grundlagenforschung) der medizinischen Universität Graz überstellt und mit den erhaltenen
Sequenzen wurden BLAST-Suchen gegen die NCBI-Datenbank durchgeführt. Hierfür wurde
wiederum blastn (megablast) gegen Nucleotide collection (nr/nt) verwendet. Die
Sequenzierung wurde ausgehend vom Forward-Primer Unibac-II-515f durchgeführt.
Ergebnisse
45
3. Ergebnisse
3.1 Mikrobielle Abundanzen in Rhizosphäre, Endorhizosphäre und
Boden
Für Bakterien wurden aus den R2A-Platten die folgenden Colony Forming Units
(cfu, Kolonie-bildende Einheiten) pro Gramm Frischgewicht bzw. Boden ermittelt. Es handelt
sich dabei um die Mittelwerte aller auswertbaren Platten eines Mikrohabitats. Um die
Streuung der einzelnen Auszählungen zu beurteilen, wurde die dazugehörige
Standardabweichung ermittelt. In der folgender Grafik werden die Abundanzen von den
Bakterien als log cfu/g Probenmaterial dargestellt (siehe Abb. 11).
0
1
2
3
45
6
7
8
9
Mat
ricaria
Cale
ndula
Solan
um
Mat
ricaria
Cale
ndula
Solan
um
SEK
EM
-Bod
en
Wüst
enbo
den
log
cfu
/g P
rob
e
Abb. 11: Abundanzen von Bakterien in den einzelnen Mikrohabitaten. Dargestellt sind die
Mittelwerte der Lebendkeimzahlen pro Gramm Probenmaterial als log10.
Erwartungsgemäß konnten sehr hohe Abundanzen an Bakterien in der Rhizosphäre der
Pflanzen ermittelt werden. Auffallend hoch ist der Wert der Bodenproben der Adleya-Farm in
SEKEM, dies könnte sich dadurch begründen, dass ein frisch gepflügt und gedüngter Acker
beprobt wurde. Die ermittelten Abundanzen für die Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und
für den Wüstenboden liegen deutlich darunter.
Für Pilze wurde die Lebendzellzahl nicht ermittelt, da eine Pilz-Isolation nur auf TSM-Platten
stattgefunden hat. Es konnten zwar auch zahlreiche Pilze, wobei es sich nicht um
Trichodermen handelte, isoliert werden, aber durch die im Medium enthaltenen Antibiotika
Ergebnisse
46
und Fungizide, hat eine starke Selektion stattgefunden und die tatsächlichen Abundanzen der
Pilze wäre wesentlich höher. Hierfür wäre eine Pilz-Isolation auf SNA-Medium notwendig.
Laut morphologischer Merkmale konnten 5 Trichodermen-Isolate kultiviert werden. Alle
Isolate stammen aus der Rhizosphäre, je 2 von Matricaria chamomilla und Calendula
officinalis und ein Isolat von Solanum distichum.
3.2 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten
Mikroorganismen
Es wurden 680 Bakterien- und 327 Pilz-Isolate getestet. In der folgenden Tabelle sind die
Prozentzahlen jener Isolate an den gesamt getesteten Bakterien- bzw. Pilz-Isolaten angegeben,
welche eine antagonistische Aktivität gegen das entsprechende Pathogen gezeigt haben
(siehe Tab. 4). Hier wurde nur bewertet, ob eine Hemmwirkung ausgehend vom Isolat
vorhanden war, die Stärke dieser wurde für die Berechnung des Anteils an antagonistisch
wirksamen Isolaten nicht berücksichtigt. Von jedem getesteten Phytopathogen ist
exemplarisch ein Dualkultur-Test mit einem positiven Isolat gezeigt (siehe Abb. 12, Abb. 13
und Abb. 14)
Tab. 4: Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Antagonisten-Tests. Angegeben sind die
Prozentwerte aller positiv getesteten Isolate.
Verticillium dahliae Rhizoctonia solani Fusarium culmorum
Bakterien 10,6 % 9,9 % 14,0 %
Pilze 3,1 % 1,5 % 0,6 %
Abb. 12: Antagonistentest gegen Verticillium dahliae V25. Hier wird ein antagonistisch aktives
Isolat aus dem Wüstenboden gezeigt (Wb2n-23).
Ergebnisse
47
Abb. 13: Antagonistentest gegen Rhizoctonia solani AG4. Dieses positiv getestete Isolat wurde aus
der Rhizosphäre von Solanum distichum isoliert (Sd3-12).
Abb. 14: Antagonistentest gegen Fusarium culmorum E1. Das hier gezeigte Isolat mit
antagonistischer Aktivität stammt aus der Rhizosphäre von Matricaria chamomilla (Mc1-3).
In Prozent an den getesteten Isolaten eines Mikrohabitats ergaben sich für Bakterien mit
antagonistischer Aktivität Werte zwischen 0 und 23 % (siehe Abb. 15). Aus der
Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla konnten prozentuell die meisten bakteriellen
Antagonisten isoliert werden, gefolgt vom Boden, der auf der Adleya-Farm in SEKEM
beprobt wurde.
Ergebnisse
48
0
20
40
60
80
100
120
Iso
late
Mat
ricaria
Cale
ndula
Sol
anum
Mat
ricaria
Cale
ndula
Sol
anum
SEK
EM
-Bod
en
Wüst
enbo
den
Verticillium dahliae
Rhizoctonia solani
Fusarium culmorum
insgesamt getestet
Rhizosphäre Endorhizosphäre
Abb. 15: Antagonistisch wirkende Bakterien-Isolate gegen die einzelnen Pathogenen. gezeigt in
Anzahl an Isolaten
Unter den Pilz-Isolaten konnten nur wenige mit antagonistischen Fähigkeiten gefunden
werden (siehe Abb. 16). Es darf aber nicht vergessen werden, dass durch die Isolation auf
TSM bereits eine starke Selektion der Pilze stattgefunden hat. Aus dem Wüstenboden und aus
der Endorhizosphäre der Pflanzen konnten kaum Pilze isoliert werden. Prozentuell an den
getesteten Isolaten eines Mikrohabitats lagen die Werte für antagonistisch aktive Pilze bei
maximal 4 %. Gegen Fusarium culmorum konnten insgesamt nur 2 Pilze mit schwacher
Wirkung gefunden werden, da es bei diesem Pathogen auch zu keinem Hyperparasitismus
durch die isolierten Trichodermen gekommen ist.
0
20
40
60
80
100
Iso
late
Mat
ricaria
Cale
ndula
Sol
anum
Mat
ricaria
Cale
ndula
Sol
anum
SEK
EM
-Bod
en
Wüst
enbo
den
Verticillium dahliae
Rhizoctonia solani
Fusarium culmorum
insgesamt getestet
Rhizosphäre Endorhizosphäre
Abb. 16: Antagonistisch wirkende Pilz-Isolate gegen die einzelnen Pathogenen. gezeigt in Anzahl
an Isolaten
Ergebnisse
49
Es wurde eine Auswahl der stärksten bakteriellen Antagonisten getroffen (siehe Tab. 5),
welche morphologisch, physiologisch und genotypisch genauer charakterisiert wurden.
Ausgewählt wurden Bakterien-Isolate, welche im Dualkultur-Assay gegen Verticillium
dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum eine antagonistische Aktivität zeigten
und mindestens gegen ein Phytopathogen wenigstens mit einem Doppel-Plus bewertet wurden
– also einen Hemmhof von mindestens 5 mm erzeugten. So wurden 37 der insgesamt 680
Bakterien-Isolate für genauere Untersuchungen herausgefiltert.
Tab. 5: Auswahl der stärksten Antagonisten mit Intensität der Hemmwirkung. Vorausgesetzt
wurde eine antagonistische Aktivität gegen alle getesteten Pathogene.
(Mc ... Matricaria chamomilla, Co ... Calendula officinalis, Sd .... Solanum distichum, Re ... Endorhizosphäre, Sb .... SEKEM-Boden, Wb ... Wüstenboden)
Isolat Verticillium dahliae V25 Rhizoctonia solani AG4 Fusarium culmorum E1
Co1-6 ++ ++ ++
Co4-9 ++ ++ ++
Sd2Re-10 ++ ++ ++
Sb3-1 +++ ++ +
Wb2n-11 +++ +++ +
Wb2n-23 ++ +++ +
Mc1-3 + ++ ++
Mc2-9 ++ ++ +
Mc3-4 + ++ ++
Co1-24 + ++ ++
Sd1-14 + ++ ++
Sd4-9 + ++ ++
Mc1Re-3 + ++ ++
Sb1-16 + ++ ++
Sb1-20 + ++ ++
Sb3-10 ++ ++ +
Wb1-12 + ++ ++
Mc3-10 + + ++
Co2-14 + + ++
Co4-15 + + ++
Co4-16 + + ++
Co4-22 + + ++
Sd3-12 + + ++
Sd3-21 + ++ +
Sd4-11 + + ++
Mc2Re-2 + ++ +
Mc2Re-9 + + ++
Mc2Re-10 + + ++
Mc2Re-18 + + ++
Sb3-5 + ++ +
Sb3-13 + ++ +
Sb3-21 + ++ +
Sb3-24 + ++ +
Sb4-5 + ++ +
Wb1n-4 + ++ +
Wb1n-18 ++ + +
Wb2n-1 + ++ +
Ergebnisse
50
3.2.1 Morphologische Gruppierung der stärksten Antagonisten
Anhand einer makroskopischen Beurteilung morphologischer Merkmale konnten die stärksten
Antagonisten (siehe Tab. 5) in 3 Morphogruppen unterteilt werden (siehe Tab. 6). Dabei war
der überwiegende Teil der ausgewählten Antagonisten der Morphogruppe 1 zuzuordnen,
außer aus der Endorhizosphäre von Calendula officinalis waren aus jedem untersuchten
Mikrohabitat Isolate dabei. Morphogruppe 2 besteht ausschließlich aus Isolaten aus dem
Wüstenboden. Morphogruppe 3 beinhaltet nur ein einziges Isolat, welches aus der
Rhizosphäre von Matricaria chamomilla isoliert wurde.
Tab. 6: Die stärksten Antagonisten unterteilt in ihre 3 Morphogruppen.
Morphogruppe 1 Morphogruppe 2 Morphogruppe 3
Co1-6 Wb2n-11 Mc1-3
Co4-9 Wb2n-23
Sd2Re-10 Wb1n-4
Sb3-1 Wb1n-18
Mc2-9
Mc3-4
Co1-24
Sd1-14
Sd4-9
Mc1Re-3
Sb1-16 Sb1-20
Sb3-10
Wb1-12
Mc3-10
Co2-14
Co4-15
Co4-16
Co4-22
Sd3-12
Sd3-21
Sd4-11
Mc2Re-2 Mc2Re-9
Mc2Re-10
Mc2Re-18
Sb3-5
Sb3-13
Sb3-21
Sb3-24
Sb4-5
Wb2n-1
Ergebnisse
51
3.3 Genotypische Charakterisierung der bakteriellen Isolate mit
antagonistischem Potenzial
Die selektierten stärksten Antagonisten der bakteriellen Isolate wiesen 3 unterschiedliche
Morphotypen auf (siehe Tab. 6). Um zu überprüfen, ob es sich bei den Isolaten einer
Morphogruppe um dieselben Bakterien handelt, wurden diese einer ARDRA und einer
BOX-PCR unterzogen. ARDRA dient zur Unterscheidung auf Gattungsebene und mit Hilfe
der BOX-PCR ist eine Unterscheidung bis auf Artebene möglich.
3.3.1 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis)
Am 0,8 %igen Agarosegel zur Überprüfung der Eubac-PCR war ersichtlich, dass bei allen
ausgewählten Antagonisten das entsprechende Fragment amplifiziert werden konnte. Eine
Voraussetzung dafür war die erfolgreiche Isolation der DNA mittels Aufkoch-Methode.
Das amplifizierte Eubac-Fragment der selektierten stärksten Antagonisten wurde mittels der
Restriktionsendonuklease HhaI verdaut, dabei wird das PCR-Produkt je nach Sequenz in
unterschiedliche DNA-Fragmente geschnitten, welche anschließend durch Elektrophorese in
einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt wurden. Für einen direkten Vergleich zwischen der
Färbung mit Ethidiumbromid und jener mit Midori Green DNA Stain (genXpress) wurden die
Verdauansätze auf beide Gele nach exakt dem gleichen Auftragsschema geladen
(siehe Abb. 17 und Abb. 18). Auch Laufzeit und Volt wurden bei beiden Gelen exakt gleich
gehalten (3 h 30 min bei 120 V).
Ergebnisse
52
Abb. 17: ARDRA-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten gefärbt mit Ethidiumbromid.
2 %iges Agarosegel, Std.: ....1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) Std.: ....100 bp DNA Ladder (siehe Abb. 8)
Abb. 18: ARDRA-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten gefärbt mit Midori Green.
2 %iges Agarosegel, Std.: ....1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Std.: ....100 bp DNA Ladder (siehe Abb. 8)
Ergebnisse
53
Beide Gelbilder zeigen erwartungsgemäß exakt dasselbe Banden-Muster (siehe Abb. 17 und
Abb. 18). Obwohl Kontrast und Helligkeit beider Fotos bestmöglich bearbeitet wurden, zeigt
Midori Green DNA Stain auch bei der eingesetzten Maximalkonzentration eine wesentlich
geringere Intensität der DNA-Färbung. Die Gruppierung der Antagonisten nach Gattungen
kann auf beiden Gelen abgelesen werden. Errechnet man die Summe aller Banden eines
Isolats, muss sich wieder das verdaute Eubac-Fragment mit einer Größe von etwa
1500 bp ergeben. Unvollständig verdaute Fragmente konnten so ausgeschlossen werden.
Die morphologische Gruppierung hat sich größtenteils bestätigt. Allerdings innerhalb der
großen Morphogruppe 1 fallen 3 Isolate heraus, welche ein abweichendes Banden-Muster zu
den restlichen Isolaten dieser Gruppe zeigen. Die 3 Isolate stammen aus unterschiedlichen
Mikrohabitaten (SEKEM-Boden, Matricaria chamomilla Rhizosphäre und Solanum
distichum Rhizosphäre) und gehören also nicht derselben Gattung an wie der Rest der
Morphogruppe 1. In der Morphogruppe 2 weisen alle 4 Isolate dieselben DNA-Fragmente
auf. Morphogruppe 3 beinhaltet ohnehin nur ein Isolat, dessen Bandenmuster unterscheidet
sich deutlich von allen anderen.
Das ARDRA-Gelbild wurde mittels der Software GelCompar II ausgewertet. Dabei wurden
die Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen miteinander verglichen und daraus folgendes
Dendrogramm erstellt (siehe Abb. 19).
Ergebnisse
54
Abb.
19:
A
us
dem
AR
DR
A-G
el a
bg
elei
tete
s D
end
rogra
mm
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stä
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gra
mm
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mit
Gel
Com
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II
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ellt
.
Äh
nli
chk
eit
[%]
Ergebnisse
55
Es ergaben sich also 4 ARDRA-Gruppen (siehe Tab. 7), innerhalb der Gruppen ist die
Ähnlichkeit der Banden-Muster zu 100 % identisch (siehe Abb. 19). Die Nummerierung der
ARDRA-Gruppen wurde von den Morphogruppen abgeleitet und so wurde die gebildete
Morphogruppe 1 für die Bildung der ARDRA-Gruppen in 1a und 1b unterteilt. Die Isolate
einer ARDRA-Gruppe gehören vermutlich derselben Gattung an. Um auf Artebene
differenzieren zu können, wurde mit denselben Isolaten eine BOX-PCR angeschlossen.
Tab. 7: Die stärksten Antagonisten unterteilt in ihre ARDRA-Gruppen. Morphogruppe 1 wurde
in ARDRA-Gruppe 1a und 1b unterteilt.
ARDRA-Gruppe 1a ARDRA-Gruppe 1b ARDRA-Gruppe 2 ARDRA-Gruppe 3
Co1-6 Sb3-1 Wb2n-11 Mc1-3
Co4-9 Mc2-9 Wb2n-23
Sd2Re-10 Sd4-11 Wb1n-4
Mc3-4 Wb1n-18
Co1-24
Sd1-14 Sd4-9
Mc1Re-3
Sb1-16
Sb1-20
Sb3-10
Wb1-12
Mc3-10
Co2-14
Co4-15
Co4-16
Co4-22 Sd3-12
Sd3-21
Mc2Re-2
Mc2Re-9
Mc2Re-10
Mc2Re-18
Sb3-5
Sb3-13
Sb3-21
Sb3-24
Sb4-5 Wb2n-1
3.3.2 BOX-PCR
Durch die Auftrennung der BOX-PCR-Produkte in einem 1,5 %igen Agarosegel können die
auf Gattungsebene gebildeten ARDRA-Gruppen auf Artebene unterteilt werden
(siehe Abb. 20).
Ergebnisse
56
Abb. 20: BOX-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten.
1,5 %iges Agarosegel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Anhand des BOX-Gels konnte die große ARDRA-Gruppe 1a in mehrere Untergruppen
unterteilt werden, wobei es sich um unterschiedliche Arten derselben Gattung handelt. Die
abgespaltene ARDRA-Gruppe 1b ist im Box-Muster einigen Isolaten der ARDRA-Gruppe 1a
wieder sehr ähnlich. Die Fingerprints der Isolate aus ARDRA-Gruppe 2 zeigen sehr ähnliche
Banden, wobei sich das Isolat Wb2n-11 etwas von den anderen unterscheidet. Das
Banden-Muster des einzigen Isolats der ARDRA-Gruppe 3 weicht stark von allen anderen ab.
Ergebnisse
57
Abb. 21: Aus dem BOX-Gel abgeleitetes Dendrogramm der stärksten Antagonisten. Dieses
Dendrogramm wurde mit GelCompar II erstellt.
Auch im Dendrogramm des BOX-Gels (siehe Abb. 21) clustern sich die vormals gebildeten
ARDRA-Gruppen 3 und 2 deutlich von den Isolaten der Morphogruppe 1 ab. Setzt man die
Ähnlichkeits-Grenze für eine BOX-Gruppe bei 70 %, so ergeben sich innerhalb der großen
Morphogruppe 1 10 Cluster. Auffallend ist, dass Isolate, deren Bandenmuster sowohl im
ARDRA- als auch im BOX-Gel zu 100 % identisch sind, also dadurch als Bakterien derselben
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
BOX
100
80
60
40
20
G@images@Box@038
G@images@Box@036
G@images@Box@037
G@images@Box@035
G@images@Box@034
G@images@Box@007
G@images@Box@012
G@images@Box@025
G@images@Box@015
G@images@Box@008
G@images@Box@032
G@images@Box@033
G@images@Box@019
G@images@Box@021
G@images@Box@017
G@images@Box@018
G@images@Box@020
G@images@Box@002
G@images@Box@003
G@images@Box@026
G@images@Box@009
G@images@Box@004
G@images@Box@006
G@images@Box@010
G@images@Box@013
G@images@Box@014
G@images@Box@016
G@images@Box@030
G@images@Box@011
G@images@Box@029
G@images@Box@024
G@images@Box@022
G@images@Box@023
G@images@Box@005
G@images@Box@031
G@images@Box@027
G@images@Box@028
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
Solanum distichum Rhizosphäre
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Calendula officinalis Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
SEKEM-Boden
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Solanum distichum Endorhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
SEKEM-Boden
Wüstenboden
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Wüstenboden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
BOX
100
80604020
G@images@Box@038
G@images@Box@036
G@images@Box@037
G@images@Box@035
G@images@Box@034
G@images@Box@007
G@images@Box@012
G@images@Box@025
G@images@Box@015
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G@images@Box@032
G@images@Box@033
G@images@Box@019
G@images@Box@021
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G@images@Box@018
G@images@Box@020
G@images@Box@002
G@images@Box@003
G@images@Box@026
G@images@Box@009
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G@images@Box@006
G@images@Box@010
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G@images@Box@030
G@images@Box@011
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G@images@Box@027
G@images@Box@028
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
Solanum distichum Rhizosphäre
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Calendula officinalis Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
SEKEM-Boden
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Solanum distichum Endorhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
SEKEM-Boden
Wüstenboden
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Wüstenboden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Ähnlichkeit [%]
Ergebnisse
58
Art identifiziert werden konnten, sowohl im Boden als auch in der Rhizo- und
Endorhizosphäre der Arzneipflanzen auftraten. Daraus kann geschlossen werden, dass von
den Pflanzen Bakterien aus dem Boden aufgenommen werden. Dies wäre eine optimale
Voraussetzung für den Einsatz von BCAs als biologischen Pflanzenschutz. Innerhalb der
Morphogruppe 2, deren Isolate alle aus dem Wüstenboden stammen, gibt es 2
unterschiedliche Cluster.
3.3.3 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung
Anhand von ARDRA- und BOX-Gel wurde eine repräsentative Auswahl der stärksten
Antagonisten getroffen, deren 16S rDNA partiell sequenziert wurden. Mit den erhaltenen
Sequenzen wurden Abgleiche gegen die Datenbank des NCBI durchgeführt. Die meisten
Isolate konnten einer Gattung zugeordnet werden, teilweise war sogar die Bestimmung der
Art möglich (siehe Tab. 8).
Tab. 8: Identifizierung antagonistisch interessanter Isolate. Diese erfolgte anhand der
Sequenzierung der Eubac-Fragmente.
Isolat
Identifizierung
Accession
Number
Maximale
Identität
Taxonomische
Zugehörigkeit
Mc3-4 Bacillus subtilis GU191901.1 94 % Firmicutes
Mc1Re-3 Bacillus subtilis GU191901.1 98 % Firmicutes
Sd3-21 Bacillus subtilis GQ303255.1 97 % Firmicutes
Mc2-9 Paenibacillus polymyxa EF488174.1 98 % Firmicutes
Sd4-11 Sporosarcina psychrophila D16277.1 82 % Firmicutes
Wb1n-4 Streptomyces flavidovirens
Streptomyces albidochromogenes
FJ486395.1
AB249953.1
97 %
97 % Actinobacteria
Mc1-3 Lysobacter sp. EF471226.1 98 % γ-Proteobacteria
Die Übereinstimmung der Query-Sequenz mit dem ähnlichsten gefundenen Isolat der
Datenbank war teilweise sehr niedrig. Dennoch konnte durch die Identifizierung der
ausgewählten Isolate das Ergebnis der ARDRA bestätigt werden. Die Isolate Mc3-4,
Mc1Re-3 und Sd3-21 wurden der Morphogruppe 1 (siehe Tab. 6) und der ARDRA-Gruppe 1a
zugeordnet (siehe Tab. 7). Bei allen 3 Isolaten wurde Bacillus subtilis als das ähnlichste
Bakterium identifiziert. Die Antagonisten Mc2-9 und Sd4-11 wurden bei der
Ergebnisse
59
morphologischen Gruppierung ebenfalls der Morphogruppe 1 zugeordnet, wiesen aber ein
abweichendes Bandenmuster in der ARDRA auf und wurden in ARDRA-Gruppe 1b
abgespalten. Die Isolate unterschiedlicher Gattung waren also morphologisch nicht zu
unterscheiden. Durch die Sequenzierung wurde das Isolat Mc2-9 als Paenibacillus polymyxa
identifiziert. Als ähnlichste 16S rDNA-Sequenz zu jener des Isolats Sd4-11 wurde
Sporosarcina sp. herausgefunden, wobei das Isolat mit einer maximalen Identität von nur
82 % auch einer anderen Gattung der Firmicutes angehören kann. Paenibacillus und
Sporosarcina gehören wie auch Bacillus dem Stamm der Firmicutes und der Ordnung der
Bacillales an. Das Isolat Wb1n-4 aus der ARDRA-Gruppe 2 wurde als Streptomyces sp.
identifiziert, was auch die Morphologie der Kolonien bestätigte. Streptomyceten gehören zum
Stamm der Actinobacteria. Das Isolat der Morphogruppe 3 mit deutlich abweichendem
ARDRA- und BOX-Muster wurde als Lysobacter sp. identifiziert, welche zur Klasse der
Gamma-Proteobacteria gehören.
3.4 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das
Bildungsvermögen des Phytohormons Indol-3-essigsäure
In diesem Test wurden einige der stärksten bakteriellen Antagonisten auf die Fähigkeit zur
Produktion des Phytohormons Indol-3-essigsäure untersucht. Dafür wurden im
Mikroplate-Reader die Extinktionen bei 530 nm (siehe Tab. 8) und 460 nm (siehe Tab. 9)
gegen leeres Wachstumsmedium gemessen.
Tab. 8: Extinktionen bei 530 nm. Der Leerwert wurde bereits subtrahiert.
ARDRA-Gr. 1a ARDRA-Gr. 1b ARDRA-Gr. 2 ARDRA-Gr. 3
Co1-6 Co4-9 Sb3-1 Mc2-9 Sd4-11 Wb2n-11 Wb2n-23 Mc1-3
-0,0059 0,0569 -0,0128 -0,0006 -0,0011 0,0985 -0,0004 -0,0020
Tab. 9: Extinktionen bei 460 nm. Der Leerwert wurde bereits abgezogen.
ARDRA-Gr. 1a ARDRA-Gr. 1b ARDRA-Gr. 2 ARDRA-Gr. 3
Co1-6 Co4-9 Sb3-1 Mc2-9 Sd4-11 Wb2n-11 Wb2n-23 Mc1-3
-0,0056 0,1181 -0,0101 -0,0005 -0,0027 0,1989 -0,0017 -0,0037
Durch die Verfärbung des Mediums und die Extinktionsmessung im Mikroplate-Reader
konnten 2 positive Isolate identifiziert werden. Ein Isolat der ARDRA-Gruppe 1a, welches
aus der Rhizosphäre der Calendula officinalis isoliert wurde, zeigte eine positive Reaktion.
Das zweite positive Isolat gehört zur ARDRA-Gruppe 2 und wurde aus dem Wüstenboden
Ergebnisse
60
isoliert. Allerdings wies jeweils das andere Isolat derselben ARDRA-Gruppe keine
IAA-Bildung auf. Laut BOX-Fingerprint (siehe Abb. 20) gehören die beiden getesteten
Isolate der ARDRA-Gruppe 1a bzw. der ARDRA-Gruppe 2 auch nicht derselben Art an.
3.5 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen
Biodiversität mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation
Polymorphism Analysis)
Für die Analyse der bakteriellen Biodiversität in den beprobten Mikrohabitaten wurde ein
Bereich der hoch konservierten 16S rDNA verwendet. Zur Untersuchung der pilzlichen
Communities wurde ein hoch konservierter ITS-Abschnitt zwischen 5,8S rDNA und
18S rDNA verwendet. Die amplifizierten Fragmente wurden als Einzelstränge mit
sequenzspezifischer Sekundärstruktur über ein Polyacrylamidgel aufgetrennt. Dabei wurden
die unabhängigen Replikate eines Mikrohabitats stets nebeneinander gruppiert. Die erhaltenen
Gelbilder wurden optisch ausgewertet und die Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen wurden
zusätzlich mit der Computer-Software GelCompar II verglichen und daraus Dendrogramme
erstellt.
3.5.1 Analyse der bakteriellen Community
Zur Analyse der gesamten bakteriellen Community der beprobten Mikrohabitate wurde das
unspezifische eubakterielle Unibac-Fragment amplifiziert. Die Auftrennung der ssDNA
erfolgte auf einem 8 %igen Polyacrylamidgel für 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C
(siehe Abb. 22 und Abb. 23).
Ergebnisse
61
Abb. 22: Gesamte bakterielle Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt
wurde die ssDNA der Unibac-Fragmente.
8 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Dieses SSCP-Gel zeigt die Biodiversität von Bakterien, welche an und in den Wurzeln der
beprobten Arzneipflanzen zu finden sind. Die vertikale Position jeder einzelnen Bande
korrespondiert mit einer Bakterienart.
In der Rhizosphäre ist die bakterielle Gemeinschaft hoch divers, als Resultat davon sind am
SSCP-Gel kaum dominante Banden zu erkennen. Es war also nötig, spezifischere PCRs für
bestimmte Bakterien-Gruppen durchzuführen (z. B. für Pseudomonaden). Aber bereits auf
diesem Gel sind manche Banden zu erkennen, welche bei den 4 Replikaten einer
Arzneipflanze identisch auftraten bei den anderen Pflanzen hingegen nicht. Es handelt sich
dabei also um Bakterien, welche spezifisch für die Rhizosphäre der entsprechenden Pflanze
sind.
Ergebnisse
62
Bei der Endorhizosphäre zeigen besonders die 4 unabhängigen Replikate von Solanum
distichum ein identisches Bandenmuster, welches sich deutlich von jenen der beiden anderen
Arzneipflanzen unterscheidet. Matricaria chamomilla und Calendula officinalis weisen
Fingerprints mit teilweise identischen Banden auf. Das Dendrogramm gibt nähere
Informationen über die Ähnlichkeit bzw. Verschiedenheit der bakteriellen
Community-Strukturen in den Endorhizosphären der beprobten Arzneipflanzen
(siehe Abb. 25). Aber bereits vom Gel kann eine Abhängigkeit der Struktur der bakteriellen
Gemeinschaft von der Pflanze abgelesen werden.
Abb. 23: Gesamte bakterielle Community der Böden und der Endorhizosphäre. Aufgetrennt
wurde die ssDNA der Unibac-Fragmente. Die eingekreisten Banden wurden aus dem Gel
ausgeschnitten und sequenziert.
8 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Ergebnisse
63
Auch die Bodenproben, welche auf der Adleya-Farm in SEKEM genommen wurden, zeigen
eine hoch diverse bakterielle Community mit kaum dominanten Banden am Gel. Auch hier
werden PCRs in denen bestimmte Bakterien-Gruppen hervorgehoben werden, bessere
Ergebnisse liefern. Äußerst interessant sind die beiden dominanten Banden in allen Proben
des Würstenbodens (siehe Abb. 23, mit Pfeilen gekennzeichnet), welche sich auch in der
Endorhizosphäre aller 3 Arzneipflanzen wiederfinden. Aus den ausgeschnittenen dominanten
DNA-Banden (siehe Abb. 23, eingekreiste Banden) wurde die DNA extrahiert und mittels
PCR wurde das entsprechende Fragment amplifiziert und schließlich sequenziert
(siehe Tab. 9).
Abb. 24: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community der Rhizosphäre. Dieses
Dendrogramm wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Abb. 25: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community der Endorhizosphäre. Dieses
Dendrogramm wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
SSCP1
100
80
60
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
SSCP1
100
80
60
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Ähnlichkeit [%]
Ähnlichkeit [%]
Ergebnisse
64
Abb. 26: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community des Bodens. Dieses
Dendrogramm wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Die Dendrogramme bestätigen die optische Auswertung der Gele. Die bakterielle
Gemeinschaft der Rhizosphäre ist ebenso pflanzenspezifisch wie jene der Endorhizosphäre.
Die artenreichen Rhizosphären-Replikate einer Pflanze clustern sich im Dendrogramm
zusammen (siehe Abb. 24). Am Dendrogramm der Endorhizosphäre spiegelt sich auch die
Ähnlichkeit der bakteriellen Community in der Wurzel der Matricaria chamomilla und in
manchen Proben der Calendula officinalis wider (siehe Abb. 25). Bei den Bodenproben
clustert sich der SEKEM-Boden mit hoher bakterieller Biodiversität deutlich vom artenarmen
Wüstenboden ab (siehe Abb. 26).
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
SSCP2
100
80
60
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
Ähnlichkeit [%]
Ergebnisse
65
Tab. 9: Identifizierung der ausgeschnittenen Gelbanden. Diese erfolgte anhand der
Sequenzierung der amplifizierten Unibac-Fragmente.
Nr.
Identifizierung
Accession
Number
Maximale
Identität
Taxonomische
Zugehörigkeit
1 Ochrobactrum sp. EU165529.1 83% α-Proteobacteria
2 Ochrobactrum sp. NR_028901.1 98% α-Proteobacteria
3 Ochrobactrum sp. NR_028901.1 99% α-Proteobacteria
4 Ochrobactrum sp. NR_028901.1 99% α-Proteobacteria
5 Unkultiviertes Bakterium GQ070391.1 83%
6 Pseudomonas sp. FM881813.1 81% γ-Proteobacteria
7 Pseudomonas sp. EU097134.1 88% γ-Proteobacteria
8 Artemisia annua Chloroplast EZ230745.1 96% Pflanzen-DNA
9 Artemisia annua Chloroplast EZ230745.1 96% Pflanzen-DNA
10 Xanthomonadales EU404026.1 98% γ-Proteobacteria
11 Lactuca sativa Chloroplast AM411199.1 99% Pflanzen-DNA
12 Lactuca sativa Chloroplast AM411199.1 99% Pflanzen-DNA
13 Rhodococcus sp. EU196301.1 99% Actinobacteria
14 Unkultiviertes Bakterium GQ108869.1 95%
15 Solanum tuberosum Chloroplast DQ386163.2 99% Pflanzen-DNA
Die beiden Banden, welche im Wüstenboden und in allen Endorhizosphären-Proben auftraten,
wurden als Ochrobactrum sp. und Rhodococcus sp. identifiziert. Als ähnlichste Sequenz der
Banden 6 und 7 wurde Pseudomonas sp. herausgefunden. Die entsprechende Bande trat bei
der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla in Replikat 2 und 4 und bei der
Endorhizosphäre von Calendula officinalis in Replikat 2 auf. Bestätigend für das
Vorhandensein von Pseudomonaden in diesen Proben war auch das 0,8 %ige Agarosegel,
welches zur Kontrolle der Pseudomonas-spezifischen PCR (1. PCR zur Analyse der
Pseudomonas-Community) gefahren wurde (siehe Abb. 27). Bei den entsprechenden Proben
konnte auch auf diesem Gel ein Pseudomonas-spezifisches Fragment nachgewiesen werden.
Bande 10 wurde als Bakterium der Ordnung Xanthomonadales identifiziert. Diese Bande ist
nur bei Replikat 1 der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla aufgetreten. Ein Vertreter
der Xanthomonadales ist z. B. Lysobacter sp., welcher auch aus der Rhizosphäre dieser Probe
isoliert werden konnte. Bei den Banden 8, 9, 11, 12 und 15 handelte es sich um
Plastiden-DNA der Pflanzen. Da sich diese Zellorganellen aus Endosymbionten entwickelt
Ergebnisse
66
haben, wird deren verbleibendes Genom von den eubakteriellen Primern als Template erkannt
und amplifiziert.
Abb. 27: Elektrophoresegel des amplifizierten Pseudomonas-Fragments. Das Fragment wurde aus
der Gesamt-DNA mit den Primern F311Ps und 1459rPsP amplifiziert.
0,8 %iges Agarosegel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
3.5.1.1 Analyse der Pseudomonas-Community
Für eine genauere Analyse der biotechnologisch interessanten Pseudomonas-Community
wurde ebenfalls das Unibac-Fragment verwendet, allerdings wurde dieser PCR eine für
Pseudomonaden spezifische PCR vorangestellt. Die Einzelstränge wurden ebenfalls auf
einem 8 %igen Gel aufgetrennt, die Laufzeit betrug 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C.
Ergebnisse
67
Abb. 28: Pseudomonas-Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt wurde
die ssDNA der Unibac-Fragmente, dieser PCR wurde eine Pseudomonas-spezifische PCR vorangestellt.
8 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Durch die spezifische Amplifikation der 16S rDNA von Pseudomonaden treten in der
Rhizosphäre bereits einige stärkere Banden auf, Matricaria chamomilla und Calendula
officinalis sind sich in den dominanten Banden sehr ähnlich, in den schwachen Banden
unterscheiden sich die beiden analysierten Rhizosphären allerdings. Solanum distichum weist
einige dieser dominanten Banden nicht auf, andere Banden treten wiederum nur bei Solanum
auf. Diese pflanzenspezifische Pseudomonas-Community der Rhizosphäre spiegelt sich auch
im Dendrogramm wieder (siehe Abb. 30).
Bei den Proben der Endorhizosphäre konnte in manchen Fällen nach der
Pseudomonas-spezifischen PCR kein Produkt nachgewiesen werden (siehe Abb. 27), hier
wurde wenn möglich das entsprechende Fragment mit der effizienteren Phusion®-Polymerase
amplifiziert, wenn dies auch zu keinem Produkt führte, wurde das PCR-Produkt aus der
Ergebnisse
68
1. PCR mit der Taq-Polymerase unverdünnt in die universelle Unibac-PCR eingesetzt. Die
Pseudomonas-spezifischen PCR-Produkte wurden bei den Proben der Endorhizosphäre von
Calendula 3 und 4 mit der Phusion®-Polymerase hergestellt. Bei der Endorhizosphäre von
Matricaria 3 und Calendula 1 wurde das PCR-Produkt unverdünnt in die universelle PCR
eingesetzt, wodurch es möglicherweise auch zur Amplifikation der 16S rDNA von
Nicht-Pseudomonaden gekommen sein könnte. Jene Proben von Matricaria chamomilla und
Calendula officinalis, wo problemlos ein Pseudomonas-Fragment amplifiziert werden konnte
(Mc2, Mc4, Co2) weisen ein beinahe identisches Bandemuster auf. Es kann auch für die
Pseudomonaden abgeleitet werden, dass sich die Communities in der Endorhizosphäre der
Kamille und der Ringelblume ähnlich sind und sich von jener in der Wurzel von Solanum
deutlich unterscheiden. Je nachdem ob nach der 1. PCR ein Produkt vorhanden war oder die
DNA unverdünnt in die unspezifische PCR eingesetzt wurde, clustern sich auch die Gruppen
im Dendrogramm (siehe Abb. 31).
Ergebnisse
69
Abb. 29: Pseudomonas-Community des Bodens. Aufgetrennt wurde die ssDNA der
Unibac-Fragmente, dieser PCR wurde eine Pseudomonas-spezifische PCR vorangestellt.
8 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Die Pseudomonas-Gemeinschaft im Boden der Adleya-Farm in SEKEM ist abweichend zu
jener im Wüstenboden. Auffallend ist das Pseudomonas-arme Replikat 3 des Wüstenbodens,
welches von einer Düne nahe SEKEM stammt. Die hohe Anzahl an Pseudomonaden in den
anderen Wüstenproben ist erstaunlich. Möglicherweise handelt es sich bei den Amplifikaten
auch um andere Vertreter der taxonomischen Gruppe der Gamma-Proteobacteria, wozu auch
einige mesophile (10 °C – 45 °C) und thermophile (40 °C – 65 °C) Bakterien gehören
(Alves et al., 2003; Fritsche, 2002). Eine Sequenzierung der DNA-Banden würde hier
genaueren Aufschluss geben. Im Dendrogramm der Pseudomonas-Community im Boden
werden die Ähnlichkeiten der einzelnen Gel-Bahnen miteinander verglichen (siehe Abb. 32).
Ergebnisse
70
Abb. 30: Dendrogramm der Pseudomonas-Community der Rhizosphäre. Dieses Dendrogramm
wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Abb. 31: Dendrogramm der Pseudomonas-Community der Endorhizosphäre. Dieses
Dendrogramm wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Abb. 32: Dendrogramm der Pseudomonas-Community des Bodens. Dieses Dendrogramm wurde
aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
Pseu2
100
80
60
40
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
Pseu1
100
80
60
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
Pseu1
100
90
80
70
60
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Ähnlichkeit [%]
Ähnlichkeit [%]
Ähnlichkeit [%]
Ergebnisse
71
3.5.2 Analyse der Pilz-Community
Um die Pilz-Gemeinschaft in den Proben zu untersuchen, wurde ein ITS-Fragment
amplifiziert. Hier wurde ebenfalls eine verschachtelte PCR durchgeführt, wobei allerdings
beide PCRs spezifisch für Pilze waren. Die einzelsträngige DNA wurde auf einem 9 %igen
Polyacrylamidgel für 17 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C aufgetrennt.
Abb. 33: Pilz-Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt wurde die ssDNA
der Pilz-spezifischen ITS-Fragmente.
9 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Ergebnisse
72
Sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre ist eine hohe Diversität an Pilzen
vorhanden (siehe Abb. 33). Bei der Rhizosphäre gibt es einige dominante Banden die bei
allen Proben auftreten. In der Endorhizosphäre treten manche Banden nur bei den Replikaten
einer beprobten Arzneipflanze auf. Allerdings ist bei anderen Banden wiederum eine relativ
hohe Variabilität innerhalb der Replikate einer Pflanze ersichtlich.
Abb. 34: Pilz-Community des Bodens. Aufgetrennt wurde die ssDNA der Pilz-spezifischen
ITS-Fragmente.
9 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)
Ergebnisse
73
Der SEKEM-Boden zeigt eine hohe Diversität an Pilzen (siehe Abb. 34). Die einzelnen
Replikate ähneln sich untereinander kaum, was bei Bodenproben meist die Regel ist. Auch im
Wüstenboden ist eine erstaunlich hohe Anzahl an Pilzen nachweisbar, wobei sich wiederum
Replikat 3 als das artenärmste erwies. Auch hier würde ein Ausschneiden der DNA-Banden
mit anschließender Sequenzierung nähere Informationen geben. Interessant wäre auch eine
gesonderte Analyse der Ascomyceten.
Auch bei der Pilz-Gemeinschaft werden die Ähnlichkeiten der Bahnen auf den SSCP-Gelen
durch Dendrogramme für Rhizosphäre, Endorhizosphäre und Boden dargestellt
(siehe Abb. 35, Abb. 36 und Abb. 37).
Abb. 35: Dendrogramm der pilzlichen Community der Rhizosphäre. Dieses Dendrogramm wurde
aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
ITS1
100
90
80
70
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Solanum distichum Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Matricaria chamomilla Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Calendula officinalis Rhizosphäre
Ähnlichkeit [%]
Ergebnisse
74
Abb. 36: Dendrogramm der pilzlichen Community der Endorhizosphäre. Dieses Dendrogramm
wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Abb. 37: Dendrogramm der pilzlichen Community des Bodens. Dieses Dendrogramm wurde aus
dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
ITS2
100
80
60
Wüstenboden
Wüstenboden
Wüstenboden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
SEKEM-Boden
Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
ITS1
100
90
80
70
60
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Calendula officinalis Endorhizosphäre
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Matricaria chamomilla Endorhizosphä.
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Solanum distichum Endorhizosphäre
Ähnlichkeit [%]
Ähnlichkeit [%]
Diskussion
75
4. Diskussion
4.1 Kultivierungsabhängige Analyse des antagonistischen Potenzials
gegen bodenbürtige Phytopathogene
Zur Ermittlung der bakteriellen Abundanzen wurde das Spatelplatten-Verfahren angewendet.
Die quantitativen Untersuchungen müssen unter dem Aspekt betrachtet werden, dass der
überwiegende Teil an Bakterien in vitro nicht kultivierbar ist. Mit dieser Methode werden nur
etwa 1 – 10 % der vorhandenen Bakterien erfasst (Hemming, 1990). Dadurch, dass das
Bakterienwachstum stark von der Zusammensetzung des Nährmediums, des pH-Werts und
der Temperatur beeinflusst wird, findet eine zusätzliche Selektion statt. Zur Isolation von
Bakterien wurde in dieser Arbeit R2A-Medium verwendet. Dabei handelt es sich um ein
nährstoffarmes Medium, auf dem eine optimale Artenvielfalt erreicht werden soll. Die Anzahl
der real in den einzelnen Mikrohabitaten vorhandenen Mikroorganismen liegt allerdings weit
über den ermittelten Werten und die möglichen Fähigkeiten der nicht kultivierbaren Bakterien
können nicht untersucht werden.
Die ermittelten Abundanzen für Bakterien in der Rhizosphäre der Arzneipflanzen lagen im
Bereich von 108 cfu/g fw. Die Rhizosphäre stellt ein beliebtes Mikrohabitat für Bakterien und
Pilze dar, dies ist auf die gute Nährstoffversorgung durch Wurzelausscheidungen und
abgestorbene Wurzelteile zurückzuführen (Sørenson, 1997). Die Förderung des mikrobiellen
Wachstums im Wurzelbereich wird als Rhizosphären-Effekt bezeichnet. Jene Bakterien, die
das Wachstum der Pflanze fördern, werden Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR)
genannt (Dube, 2001). Ihre fördernde Wirkung ist auf die Bildung von pflanzlichen
Wachstumsregulatoren und Siderophoren zurückzuführen. Die Siderophore binden das
vorhandene Eisen in der Rhizosphäre, dadurch können phytopathogene Mikroorganismen auf
Grund des Eisenmangels nicht wachsen (Fritsche, 2002).
In der Endorhizosphäre der Arzneipflanzen lagen die ermittelten Abundanzen im Bereich von
104 cfu/g fw. Eine auffallend hohe Anzahl an Bakterien konnte aus dem Boden der
Adleya-Farm in SEKEM isoliert werden. Die ermittelten Colony Forming Units lagen wie in
der Rhizosphäre bei 108 cfu/g. Im Wüstenboden lag der ermittelte Wert erwartungsgemäß
deutlich darunter bei 103 cfu/g.
Diskussion
76
Für Pilze wurde die Lebendzellzahl – wie bereits erwähnt – nicht ermittelt. Die
SSCP-Analyse der Pilz-Community zeigte in allen Mikrohabitaten eine sehr hohe Diversität,
möglicherweise hätten auch bessere pilzliche Antagonisten gefunden werden können, wenn
die Selektion durch das verwendete TSM-Medium nicht durchgeführt worden wäre.
Allerdings konnten durch diese Methode laut morphologischer Charakterisierung 5
Trichoderma-Isolate kultiviert werden, welche sich auf SNA-Medium vermutlich gegen die
große Konkurrenz nicht durchsetzten hätten können. Die isolierten Trichodermen zeigten
zwar Hyperparasitismus auf Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani, wiesen aber keine
antagonistische Aktivität gegen Fusarium culmorum auf.
Insgesamt wurden 680 Bakterien- und 327 Pilz-Isolate auf ihre antagonistischen Fähigkeiten
getestet. Unter den Bakterien wiesen 10 – 14 % eine antagonistische Fähigkeit gegen die
unterschiedlichen Phytopathogene (Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium
culmorum) auf, wobei die meisten bakteriellen Antagonisten gegen Fusarium culmorum
gefunden werden konnten. Bei den Pilzen konnten außer den Trichoderma-Isolaten nur
wenige Isolate mit antagonistischen Fähigkeiten gefunden werden, dies begründet sich
vermutlich durch die starke Selektion auf dem TSM-Medium. Die Werte für antagonistisch
wirksame Pilze lagen zwischen 0 und 3 %, wobei noch die meisten antagonistischen Pilze
gegen Verticillium dahliae gefunden werden konnten.
Eine Auswahl der stärksten bakteriellen Antagonisten wurde morphologisch, physiologisch
und genotypisch genauer charakterisiert und schließlich durch partielle Sequenzierung der
16S rDNA identifiziert. Durch makroskopische Charakterisierung wurden diese ausgewählten
Isolate in 3 Morphogruppen unterteilt. Diese Einteilung hat sich durch die
Fingerprint-Methode ARDRA größtenteils bestätigt und durch die anschließend
durchgeführte BOX-PCR konnten die Gruppen in mehrere Cluster unterteilt werden. ARDRA
dient zur Unterscheidung auf Gattungsebene und durch die BOX-PCR ist eine
Unterscheidung bis auf Artebene möglich. Bakterien-Isolate, welche derselben Art zugeordnet
wurden, traten sowohl im Boden, als auch in Rhizo- und Endorhizorphäre der Arzneipflanzen
auf.
Diskussion
77
Durch die Untersuchung der selektierten stärksten Antagonisten auf das Bildungsvermögen
von Indol-3-essigsäure konnten einige der Isolate als Plant Growth Promoting Rhizobacteria
(PGPR) identifiziert werden, was bei antagonistisch wirksamen Bakterien keine Seltenheit ist
(Berg, 2009). Indol-3-essigsäure gehört zu den Auxinen, welche zu den
Pflanzenwachstumshormonen gehören.
Durch Sequenzvergleiche der partiell sequenzierten 16S rDNA mit der NCBI-Datenbank
konnte als ähnlichstes Bakterium der großen Gruppe 1a Bacillus subtilis identifiziert werden.
Bacillus subtilis ist ein bekannter BCA, es sind bereits mehrere biologische
Pflanzenschutzmittel mit Bacillus subtilis im Einsatz (Schisler et al., 2004). Jene
Antagonisten, welche morphologisch nicht von denen der Gruppe 1a getrennt werden
konnten, allerdings in der ARDRA ein abweichendes Banden-Muster zeigten, wurden als
Paenibacillus polymyxa und Sporosarcina sp. identifiziert. Diese beiden Gattungen gehören,
wie auch Bacillus, der phylogenetischen Gruppe der Firmicutes und der Ordnung der
Bacillales an. Es handelt sich dabei um gram-positive Bakterien. Bacillus und Paenibacillus
sind begeißelte Stäbchen, wohingegen es sich bei Sporosarcina um Kokken handelt, die sich
zu Tetraden zusammenschließen. Alle 3 Arten sind zur Bildung von hitzeresistenten
Endosporen fähig. Bacillus-Arten sind weit verbreitete Bodenbakterien, einige von ihnen
produzieren Antibiotika und extrazelluläre Enzyme. Bacillus subtilis produziert Amylasen
und Proteasen. Paenibacillus polymyxa gehört ebenfalls zu den Boden besiedelnden Bacillen
und produziert das Antibiotikum Polymyxin. Für Paenibacillus polymyxa wurde auch bereits
eine antagonistische Aktivität gegen ein breites Spektrum an Mykotoxin-produzierenden
Pilzen wie z. B. Fusarium culmorum beschrieben (Tupinamba et al., 2008). Sporosarcina
urea kommt z. B. bevorzugt in alkalischen Böden vor, die mit Urin kontaminiert sind
(Fritsche, 2002).
Die Antagonisten der Gruppe 2, welche alle aus dem Wüstenboden isoliert wurden, konnten
als Streptomyces sp. identifiziert werden, dies wurde durch die charakteristische Morphologie
auch bereits vermutet. Streptomyceten gehören zum Stamm der Actinobacteria, sie sind
gram-positiv und kommen vor allem in Böden vor. Sie sind mehrzellig und bilden ein Myzel.
Die meisten Streptomyceten sind zur Bildung von Sporen fähig und verschiedene Antibiotika
werden von ihnen produziert – unter anderem Streptomycin (Dworkin et al., 2006;
Stackebrandt et al., 1991).
Diskussion
78
Das antagonistisch aktive Isolat der Gruppe 3, welches sich durch seine Morphologie deutlich
von den anderen abhebt, wurde als Lysobacter sp. identifiziert, welche zur Klasse der
Gamma-Proteobacteria gehören. Lysobacter ist ein gram-negatives Stäbchen und zur
Produktion von Antibiotika fähig (Hashizume et al., 2001), z. B. für Lysobacter capsici wurde
bereits eine breite antimikrobielle Aktivität festgestellt (Park et al., 2008).
Die Eignung der isolierten in vitro antagonisischen Bakterien für den Einsatz im biologischen
Pflanzenschutz müsste in Gewächshaus- und anschließend in Freilandversuchen bestätigt
werden.
4.2 Kultivierungsunabhängige Analyse der mikrobiellen Biodiversität
Zur Analyse der mikrobiellen Biodiversität in der Rhizo- und Endorhizosphäre sowie im
Boden wurde die SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism Analysis)
verwendet. Für die Analyse der bakteriellen Biodiversität in den beprobten Mikrohabitaten
wurde ein Bereich der hoch konservierten 16S rDNA amplifiziert. Zur Untersuchung der
pilzlichen Communities wurde ein hoch konservierter ITS-Abschnitt zwischen 5,8S rDNA
und 18S rDNA verwendet. Die Polyacrylamidgele wurden optisch und mit der
Computer-Software GelCompar II ausgewertet.
Die bakteriellen Abundanzen sind in der Rhizosphäre durch den bereits erwähnten
Rhizosphären-Effekt sehr hoch. Auf dem SSCP-Gel der gesamten bakteriellen Community
waren kaum dominante Banden ersichtlich, was auf eine hoch diverse Gemeinschaft in der
Rhizosphäre schließen lässt. Es konnte allerdings auch für die Gesamt-Community der
Bakterien eine Abhängigkeit von der Pflanze festgestellt werden, wobei sich die
Community-Strukturen von Matricaria chamomilla und Calendula officinalis ähnlich sind
und sich deutlich von jener von Solanum distichum unterscheiden. Bei den Proben der
Endorhizosphäre waren deutliche Banden erkennbar, welche ausgeschnitten und sequenziert
wurden. Auch in der Endorhizosphäre ähneln sich die bakteriellen Communities von
Matricaria und Calendula und auch die bakterielle Gesamt-Community der Endorhizosphäre
ist pflanzenspezifisch. Diese Pflanzenspezifität der mikrobiellen Communities in der Rhizo-
und Endorhizosphäre ist bereits bekannt (Berg & Smalla, 2009).
Diskussion
79
Der Boden der Adleya-Farm in SEKEM zeigt am SSCP-Gel eine ähnlich hohe Diversität wie
die Rhizosphären-Proben. Besonders interessant war die Analyse des Wüstenbodens, bei allen
Replikaten traten 2 dominante Banden auf, welche auch in allen Proben der Endorhizosphäre
zu finden waren. Dies war eine äußerst interessante Entdeckung, lässt es doch darauf
schließen, dass die Arzneipflanzen Bakterien aus dem Boden aufnehmen, was auch bereits
durch die BOX-PCR der stärksten Antagonisten vermutet wurde. Dies ist eine optimale
Voraussetzung für biologischen Pflanzenschutz durch antagonistische Bakterien. Auch die
beiden bandengebenden Bakterien im Wüstenboden konnten durch Sequenzierung der
ausgeschnittenen DNA-Fragmente identifiziert werden. Die optische Auswertung der Gele
wurde stets durch die erstellten Dendrogramme bestätigt.
In einer interessanten Studie wurden Umweltbedingungen wie Durchschnittstemperatur,
Verdunstung und Breitengrad als untergeordnete Faktoren für das Bakterienreichtum
identifiziert. Stattdessen war der pH-Wert des Bodens entscheidend. Saure Böden mit
geringem pH-Wert – zu finden etwa im Regenwald – bieten den Mikroorganismen offenbar
schlechtere Lebensbedingungen als Böden mit neutralem pH-Wert, wie sie in trockenen
Wüsten vorkommen (Fierer & Jackson, 2006).
Die beiden dominanten Bakterien im Wüstenboden konnten als Ochrobactrum sp. und
Rhodococcus sp. identifiziert werden. Ochrobactrum ist ein gram-negatives Stäbchen,
welches zur Klasse der Alpha-Proteobakterien zählt. Bei Ochrobactrum anthropi wurde
bereits die Produktion von Pflanzenwachstumshormonen und Siderophoren nachgewiesen
und außerdem eine antifungale Aktivität gegen mehrere Phytopathogene beschrieben
(Chakraborty et al., 2009). Rhodococcus gehört zum Stamm der Actinobacteria. Dieses
gram-positive unbewegliche Stäbchen ist ein weltweit verbreiteter Bodenbewohner.
In einigen Proben der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla und Calendula officinalis
trat eine Bande auf, welche als Pseudomonas sp. identifiziert wurde. Diese Bande trat genau
in jenen Wiederholungen auf, in denen auch nach der Pseudomonas-spezifischen PCR ein
Produkt nachgewiesen werden konnte. Pseudomonaden gehören zur Klasse der
Gamma-Proteobakterien. Vertreter dieser Gruppe wie z. B. Pseudomonas fluorescens sind
bereits erfolgreich im biologischen Pflanzenschutz im Einsatz
(Prieto & Mercado-Blanco, 2008).
Diskussion
80
Eine Bande, welche nur in einem Replikat der Endorhizosphäre der Kamille auftrat, wurde als
Bakterium der Ordnung Xanthomonadales identifiziert. Ein Vertreter der Xanthomonadales
ist z. B. Lysobacter sp., welcher auch aus der Rhizosphäre dieser Probe isoliert werden konnte
und ein sehr gutes antagonistisches Potenzial gezeigt hat.
Einige Banden wurden leider auch als Plastiden-DNA der Pflanze identifiziert. Da sich diese
Zellorganellen aus Endosymbionten entwickelt haben, besitzen sie noch ein eigenes kleines
Genom, worauf unter anderem die rRNAs für die eigenen prokaryontischen Ribosomen
codiert sind. Diese DNA wird von den eubakteriellen Primern als Template erkannt und
amplifiziert (Madigan & Martinko, 2006).
Durch spezifischere PCRs wurden die biotechnologisch interessanten Pseudomonaden
hervorgehoben. Sowohl die Rhizo- als auch die Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla
und Calendula officinalis sind sich in den dominanten Banden auch in dieser Analyse wieder
sehr ähnlich und unterscheiden sich deutlich von Solanum distichum. Es kann auch für die
Pseudomonas-Community eine Abhängigkeit von der Arzneipflanze festgestellt werden.
Bei der Analyse der Pseudomonas-Community in den Böden ist die relativ hohe Anzahl an
Pseudomonaden im Wüstenboden erstaunlich. Es wäre möglich, dass die 16S rDNA von
anderen Vertretern der Gamma-Proteobakterien amplifiziert wurde, wozu auch einige
mesophile (10 °C – 45 °C) und thermophile (40 °C – 65 °C) Bakterien gehören
(Alves et al., 2003; Fritsche, 2002). Das Ausschneiden und Sequenzieren der DNA-Banden
würde hier genaueren Aufschluss geben.
Besonders interessant wäre noch eine Analyse der Firmicutes-Community. Die Bacillen,
welche zu dieser taxonomischen Gruppe gehören, sind wie auch die Pseudomonaden für ihre
biotechnologische Relevanz bekannt. Und viele der identifizierten Isolate mit besonders hoher
antagonistischer Aktivität sind dem Stamm der Firmicutes zuzuordnen.
Die Pilz-Community weist sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre der
Arzneipflanzen eine sehr hohe Diversität auf. Teilweise ist auch eine Variabilität innerhalb
der Replikate zu erkennen, was bei Pilzen nicht erstaunlich ist.
Diskussion
81
Auch in den Böden zeigte sich eine hohe Diversität an Pilzen. Dies ist besonders beim
Wüstenboden erstaunlich. Eine Sequenzierung der bandengebenden Pilze würde interessante
Informationen liefern. Es ist bekannt, dass im Wüstenboden extrem austrocknungstolerante
Pilze auftreten, welche bevorzugt in einer Mykorrhiza-Symbiose leben, z. B. Piriformospora
indica (Varma et al., 1999). Pflanzen, welche mit solchen Pilzen kultiviert werden, sind
vitaler, wachsen schneller und besser und sind toleranter gegen Austrocknung. Zur
Verifizierung der erläuterten Resultate wäre eine weitere Probennahme nötig.
Zusammenfassung
82
5. Zusammenfassung
SEKEM ist eine ägyptische Kulturinitiative und ein Fair Trade-Unternehmen, wo seit mehr
als 30 Jahren biologisch-dynamische Landwirtschaft betrieben wird. Medikamente, welche
aus ökologisch gezogenen Arzneipflanzen gewonnen werden, werden international
vermarktet. Deren Anbau ist allerdings immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen wie
Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum betroffen, wodurch es zu
erheblichen Ertragseinbußen kommt. Eine Ursache hierfür ist ein intensiver Anbau von einer
begrenzten Anzahl an Kulturpflanzen in kurzen Rotationen. Die biologisch-dynamische
Landwirtschaft schließt die Anwendung von synthetischem Kunstdünger und Pestiziden aus.
Eine mögliche, umweltfreundliche und nachhaltige Lösung des Problems wäre die Einführung
von biologischen Kontrollstämmen (Biological Control Agents, BCA). BCAs sind natürlich
vorkommende Mikroorganismen, die in der Lage sind, effizient Pflanzen zu besiedeln und
durch verschiedene Mechanismen das Wachstum von gesunden Pflanzen zu fördern.
Das allgemeine Ziel des Projekts „Commercial Production of Enhanced Bio-Control Agents
for Combating Soil Borne Pathogens in Egypt”, in dessen Rahmen diese Arbeit verfasst
wurde, ist es, ein natürliches Präparat herzustellen, womit die Anwendung von chemischen
Pflanzenschutzmitteln und deren Auswirkungen auf Umwelt und Gesundheit verhindert
werden können. Durch die Einbringung von BCAs soll die Vitalität und die natürliche
Biodiversität des Bodens wieder hergestellt werden. Das Präparat soll bezüglich Boden,
Wetter, Pathogen-Spezies, etc. für ägyptische Bedingungen optimiert werden, aus diesem
Grund sollen die BCAs aus ägyptischem Proben-Material isoliert werden.
In dieser Arbeit wurden Mikroorganismen aus der Rhizo- und Endorhizosphäre von
ägyptischen Arzneipflanzen (Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum
distichum) sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches Potenzial gegen
die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Potenzielle
Kontrollstämme wurden morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und
durch partielle Sequenzierung der 16S rDNA identifiziert. Dabei konnten Isolate der
Gattungen Bacillus, Paenibacillus, Streptomyces sowie Lysobacter als besonders gute
Antagonisten identifiziert werden. Es konnten antagonistisch aktive Isolate nicht nur aus dem
Boden sondern auch aus Rhizo- und Endorhizosphäre der Pflanzen isoliert werden. Isolate aus
Zusammenfassung
83
Mikrohabitaten an der Pflanze eignen sich besonders gut für den Einsatz im biologischen
Pflanzenschutz, da diese eine optimale Voraussetzung für die Kolonisation der Wirtspflanze
des Pathogens mitbringen.
Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und
Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und im Boden durch kultivierungsunabhängige
Methoden untersucht. Mittels Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-Analyse
von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten konnte eine Pflanzenspezifität der
mikrobiellen Communities sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre
festgestellt werden. Durch identische Banden in Bodenproben und Proben der
Endorhizosphäre kann angenommen werden, dass Bakterien von den Pflanzen aus dem Boden
aufgenommen werden, was eine optimale Voraussetzung für den biologischen Pflanzenschutz
durch den Einsatz von BCAs ist. Diese Beobachtung wurde auch durch die BOX-PCR der
stärksten Antagonisten bestätigt, wo identische Isolate sowohl in Boden- als auch in
Pflanzenproben nachgewiesen wurden.
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Danksagung
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7. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Masterarbeit
beigetragen haben.
Mein spezieller Dank gilt meiner Betreuerin Frau Univ.-Prof. Dr. Gabriele Berg. Ihr danke
ich für die Möglichkeit, diese Masterarbeit in ihrer Arbeitsgruppe anzufertigen und für die
wissenschaftliche Betreuung. Ein besonderes Erlebnis für mich war die Probennahme in
SEKEM, für diese Ermöglichung ich mich ebenfalls ganz herzlich bedanken möchte.
Weiters möchte ich mich bei Dr. Henry Müller und Dr. Christin Zachow für die tatkräftige
wissenschaftliche Unterstützung im Laufe meiner praktischen Arbeit bedanken. Ein großes
Dankeschön gilt auch Mag. Michael Fürnkranz für die gute Einarbeitung am Institut.
Außerdem bedanke ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe für die angenehme
Zusammenarbeit, wobei ich speziell die optimale Vorbereitung und die Hilfe bei meiner
Probenaufarbeitung hervorheben möchte.
Bei meinem Freund Michael möchte ich mich für seine liebevolle Unterstützung und
Motivation bedanken.
Zu guter Letzt bedanke ich mich ganz herzlich bei meinen Eltern, dass sie mir das Studium
der Molekularbiologie und der Molekularen Mikrobiologie ermöglicht haben und mich dabei
in jeglicher Hinsicht unterstützt haben.
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
Ich erkläre an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst, andere als die
angegebenen Quellen/Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich und
inhaltlich entnommene Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Graz, März 2010 ___________________________
Martina Köberl