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Charakterisierung der Seneszenz-
assoziierten E3-Ubiquitinligase SAUL1
aus Arabidopsis thaliana
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Dissertation
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von Gabriele Drechsel
aus Roth
Als Dissertation genehmigt von der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juni 2011
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter: PD Dr. Stefan Hoth
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Christian Koch
___________________________________________________Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abkürzungsverzeichnis III
1 Zusammenfassung ......................................................................................1
2 Einleitung .....................................................................................................5
2.1 Das Phytohormon Abszisinsäure..........................................................5
2.1.1 Allgemeines......................................................................................5
2.1.2 Wirkungen von ABA .........................................................................6
2.1.3 ABA-Biosynthese..............................................................................6
2.1.4 ABA-Signaltransduktion....................................................................8
2.2 Seneszenz ......................................................................................... 10
2.2.1 Allgemeines.................................................................................... 10
2.2.2 Die Regulation von Seneszenzprozessen ...................................... 10
2.2.3 Veränderungen auf Genexpressionsebene .................................... 11
2.3 Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau .................................................... 13
2.3.1 Ablauf des UPS-vermittelten Proteinabbaus................................... 13
2.3.2 Komponenten des UPS .................................................................. 15
2.3.3 Armadillo-Motiv-Proteine ................................................................ 18
2.3.4 PUB-ARM-Proteine in Pflanzen ...................................................... 18
2.3.5 Die E3-Ubiquitinligase SAUL1 (PUB44).......................................... 19
2.4 Zielsetzung......................................................................................... 22
3 Ergebnisse................................................................................................. 23
3.1 Zusammenhang zwischen SAUL1 und Seneszenz und Zelltod .......... 23
3.1.1 Zelltod in saul1-1-Pflanzen ............................................................. 23
3.1.2 Untersuchungen zur Genexpression in saul1-1-Mutanten .............. 24
3.2 Regulation der ABA-Biosynthese in saul1-Mutanten .......................... 29
3.2.1 Endogene ABA-Level in saul1-2-Mutanten ..................................... 29
3.2.2 Regulation des ABA-Biosyntheseproteins AAO3 ............................ 30
3.2.3 Interaktion zwischen SAUL1 und AAO3.......................................... 33
3.2.4 ABA und Seneszenz....................................................................... 34
3.3 Phänotypische Analysen von saul1-1 Pflanzen .................................. 37
3.3.1 Zwergwachstum von saul1-1 Pflanzen ........................................... 38
3.3.2 Wachstum von saul1-Mutanten unter verschiedenen
Stressbedingungen......................................................................... 40
3.3.3 Pigmentgehalt von saul1-1-Mutanten ............................................. 44
3.4 Putative Interaktionspartner von SAUL1............................................. 46
3.4.1 Überexpression und Anreicherung von MBP-Fusions-proteinen..... 47
3.4.2 Pulldown-Analysen mit SAUL1 und putativen Interaktionspartnern.48
3.4.3 Lokalisierung von putativen Interaktionspartnern von SAUL1 ......... 50
3.5 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1............................................... 51
3.5.1 Analysen zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1 .................... 52
3.5.2 Analyse putativer Membranlokalisierungsdomänen von SAUL1 ..... 55
Inhaltsverzeichnis___________________________________________________
II
3.5.3 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1-Deletionsmutanten ............57
3.5.4 Subzelluläre Lokalisierung von PUB43 ...........................................61
3.5.5 Erstellung von chimären Proteinen aus SAUL1-ARM7-11 und
weiteren PUB-ARM-Proteinen ........................................................63
3.5.6 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 in anderen Pflanzenspezies...
.......................................................................................................64
3.6 Überexpression von SAUL1 in planta .................................................66
3.7 Etablierung eines antiSAUL1-spezifischen Antikörpers ......................67
3.7.1 Generierung und Aufreinigung des AntiSAUL1-Antikörpers............68
3.7.2 Nachweis von SAUL1-Protein in planta ..........................................69
4 Diskussion..................................................................................................71
4.1 ABA und Seneszenz...........................................................................71
4.2 Die Rolle von SAUL1 bei der Regulation der ABA-Biosynthese..........72
4.2.1 SAUL1 interagiert mit AAO3 ...........................................................72
4.2.2 Lichtabhängigkeit des Seneszenzphänotyps von saul1-Pflanzen ...73
4.2.3 Weitere Phänotypen von saul1-Mutanten .......................................75
4.3 saul1-Mutanten als Modellsystem zur Untersuchung des
Seneszenzprogramms auf Transkriptionsebene.................................78
4.4 SAUL1 ist assoziiert mit der Plasmamembran....................................80
4.4.1 Lokalisierung von SAUL1 an der Plasmamembran.........................80
4.4.2 Assoziation von SAUL1 mit der Plasmamembran erfolgt über
Protein-Protein-Interaktionsdomäne ...............................................81
4.4.3 Funktion von SAUL1 an der Plasmamembran ................................83
4.5 Interaktionspartner von SAUL1...........................................................84
5 Material und Methoden ..............................................................................89
5.1 Material ..............................................................................................89
5.1.1 Organismen....................................................................................89
5.1.2 Vektoren.........................................................................................90
5.1.3 Oligonukleotide...............................................................................97
5.1.4 Lösungen........................................................................................99
5.1.5 Chemikalien und Enzyme .............................................................102
5.1.6 Verbrauchsmaterial ......................................................................102
5.1.7 Geräte ..........................................................................................103
5.1.8 Software .......................................................................................103
5.2 Methoden .........................................................................................104
5.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden .................................104
5.2.2 Methoden zur Arbeit mit Bakterien................................................108
5.2.3 Methoden zur Arbeit mit Pflanzen.................................................110
5.2.4 Proteinchemische Methoden ........................................................114
6 Literaturverzeichnis ..................................................................................119
7 Anhang ....................................................................................................135
7.1 Deletionskonstrukte..........................................................................135
7.2 Vektorkarten.....................................................................................135
7.2.1 SAUL1-Konstrukte........................................................................135
7.2.2 PUB43-Konstrukte........................................................................143
___________________________________________________Inhaltsverzeichnis
III
8 Danksagung............................................................................................. 145
9 Lebenslauf ............................................................................................... 147
10 Publikationsliste ....................................................................................... 149
Inhaltsverzeichnis___________________________________________________
IV
______________________________________________Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis
A Adenin
ABA Abszisinsäure (engl.: abscisic acid)
Ac Azetat (engl.: acetate)
Amp Ampicillin
ARM Armadillo
AS Aminosäure(n)
BAR Bastaresistenz
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (engl.: bovine serum albumin)
C Cytosin
CaMV cauliflower mosaic virus
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
(engl.: copy desoxyribonucleic acid)
cds Kodierungssequenz (engl.: coding sequence)
Col-0 Ökotyp Columbia Wildtyp
CTAB Cetyltrimethylammoniumborat
dal days after light
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMF N, N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic
acid)
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraazetat
EtOH Ethanol
G Guanin
Gent Gentamycin
GFP grün fluoreszierendes Protein
Glc Glukose (engl.: Glucose)
Abkürzungsverzeichnis______________________________________________
VI
h Stunde (engl.: hour)
H+ Proton
Hyg Hygromycin
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid
Kan Kanamycin
kbp Kilobasenpaare
l Liter
LE Ökotyp Landsberg erecta
Leu Leucin
M Molar
MBP Maltose-bindendes Protein
MCS multiple cloning site
MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
min Minute
ml Milliliter
mM Millimolar
mRNA Boten-Ribonukleinsäure (engl.: messenger
ribonucleic acid)
Na Natrium
nm Nanometer
nos Nopalinsynthase
OD optische Dichte
P Phosphat
PCR Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain
reaction)
PFD Photonenflussdichte
RFP rot fluoreszierendes Protein
Rif Rifampicin
RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)
RNase Ribonuklease
rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: rounds per minute)
______________________________________________Abkürzungsverzeichnis
VII
RT Raumtemperatur
RT-PCR reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion
(engl.: reverse transcriptase polymerase chain
reaction)
RT-Reaktion reverse Transkriptase Reaktion
s Sekunde (engl.: second)
SDS Natrium-dodecylsulfat (engl.: sodium-
dodecylsulfate)
SEM simple and efficient method
Spec Spectinomycin
Stabw Standardabweichung
Strep Streptomycin
SUC Saccharose (engl.: sucrose)
T Thymin
T-DNA Transfer-DNA
Tris Trihydroxymethylaminomethan
U Units
üN über Nacht
UPS Ubiquitin-26S-Proteasom-System
UTR untranslatierter Bereich (engl.: untranslated region)
UV Ultraviolett
V Volt
WT Wildtyp
YFP gelb (yellow) fluoreszierendes Protein
____________________________________________________Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Aufklärung der PUB-E3-Ubiquitinligase
SAUL1 (senescence-associated E3 ubiquitin ligase 1, auch PUB44 genannt) aus
Arabidopsis thaliana. Hierbei handelt es sich um eine Komponente des Ubiquitin-
26S-Proteasom-Systems (UPS), die als solche an der Übertragung von
Ubiquitinresten auf Zielproteine und somit am gerichteten Abbau dieser Proteine
beteiligt ist. SAUL1 dient als negativer Regulator von Seneszenzprozessen und
verhindert ein verfrühtes Auftreten von Seneszenzsymptomen. Pflanzen der T-
DNA-Insertionslinien saul1-1 und saul1-2 hingegen zeigen unter bestimmten
Lichtbedingungen bereits im frühen Keimlingsalter eine deutliche Gelbfärbung
der Blätter und es kommt zum Absterben der Pflanzen. Diese
Seneszenzsymptome gehen mit einem Anstieg des endogenen Gehalts des
Phytohormons Abszisinsäure (ABA) einher, das neben zahlreichen
Entwicklungsprozessen vor allem an pflanzlichen Reaktionen auf verschiedene
Stressbedingungen beteiligt ist. Darüber hinaus kommt es in seneszenten saul1-
Pflanzen zu einer Zunahme der Protein- und Aktivitätslevel der Aldehyd-Oxidase
AAO3, die in einem letzten Schritt der ABA-Biosynthese die Umsetzung von
Abszisinaldehyd zu Abszisinsäure vermittelt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein direkter Zusammenhang zwischen SAUL1,
der ABA-Biosynthese und dem pflanzlichen Seneszenzprogramm hergestellt
werden. In saul1-Mutanten kam es unter Wachstumsbedingungen mit niedrigen
Lichtintensitäten zu einer Ausbildung von Seneszenzsymptomen, die stets mit
einem Anstieg an AAO3-Proteinleveln und der zugehörigen enzymatischen
Aktivität AOδ führten. Durch Komplementation der saul1-1-Mutation durch ein
P35S:SAUL1-Konstrukt konnten sowohl der Seneszenzphänotyp als auch der
Anstieg an AAO3-Protein verhindert werden. In einem Label-Transfer-Experiment
konnte gezeigt werden, dass SAUL1 direkt mit AAO3 interagiert und dieses
vermutlich zum Proteinabbau über das 26S-Proteasom markiert. Somit ist SAUL1
direkt an der Regulation des endogenen ABA-Gehalts unter
Wachstumsbedingungen mit niedrigen Lichtintensitäten beteiligt. In saul1-
Mutanten kann dieses regulierende Eingreifen nicht mehr stattfinden und es
kommt zu einem Anstieg der endogenen ABA-Level. Dieser erhöhte ABA-Gehalt
führt zu einem Auslösen des Seneszenzprogramms in saul1-Mutanten. In
Wachstumsstudien mit saul1-1abi1-1-Doppelmutanten, die zusätzlich zur
Mutation in SAUL1 eine gestörte ABA-Signaltransduktion aufwiesen, konnte eine
fast vollständige Aufhebung der Seneszenzsymptome beobachtet werden. Es
wurden weitere physiologische Untersuchungen wie Keimungsstudien,
Trockenstressexperimente oder auch Wachstumsstudien unter Salz- und
osmotischen Stressbedingungen durchgeführt. In all diesen Untersuchungen
konnte für saul1-Pflanzen ein ABA-hypersensitives Stressverhalten
nachgewiesen werden, was vermutlich auf eine überschießende ABA-
Biosynthese zurückzuführen war. Diese Ergebnisse deuten auf eine zusätzliche
Zusammenfassung____________________________________________________
2
Rolle von SAUL1 bei der Anpassung auf verschiedene abiotische
Stressbedingungen durch eine Regulation der ABA-Biosynthese hin.
Die Eigenschaft von saul1-Pflanzen als induzierbares Seneszenzsystem wurde in
Expressionsstudien genutzt, um die ersten Schritte des pflanzlichen
Seneszenzprogramms aufzuschlüsseln. In einem pulse-chase-Experiment
konnte gezeigt werden, dass eine Anhäufung von ORE1-Transkript, dem eine
entscheidende Rolle als molekularer Schalter in pflanzlichen
Seneszenzprozessen zukommt, den point-of-no-return im Seneszenzprozess von
saul1-Pflanzen festlegt. Die Anhäufung von ORE1 stellte allerdings nicht die
frühesten Veränderungen auf Transkriptebene dar. In Microarray-Analysen
konnten vielmehr bereits ab sechs Stunden nach einer Induktion des
Seneszenzprogramms in saul1-Mutanten signifikante Veränderungen der
Transkriptlevel der Seneszenz-assoziierten Transkriptionsfaktoren WRKY53,
WRKY6 und AtNAP nachgewiesen werden. Dieser Anstieg der Transkriptlevel
lag dabei deutlich vor einer Anhäufung von ORE1, was auf eine übergeordnete
Rolle dieser Transkriptionsfaktoren sowie SAUL1 innerhalb des
Seneszenzsignalweges hindeutet.
Im Vorfeld dieser Arbeit wurden in Yeast-Two-Hybrid-Studien verschiedene
putative Interaktionspartner von SAUL1 identifiziert. Diese Ergebnisse sollten
durch Interaktionsstudien überprüft und bestätigt werden. In pulldown-
Experimenten konnte allerdings für keines der untersuchten Proteine eine
Wechselwirkung mit SAUL1 nachgewiesen werden.
Ein ganz wesentlicher Punkt dieser Arbeit bestand in der Untersuchung der
subzellulären Lokalisierung von SAUL1. Durch transiente Expression von
SAUL1-GFP- und SAUL1-YFP-Fusionsproteinen sowie in Westernblot-Analysen
konnte eine Assoziation von SAUL1 mit der Plasmamembran nachgewiesen
werden. SAUL1 selbst trägt allerdings keine Sequenzmotive, die eine
Verankerung an der Plasmamembran vermitteln könnten. In Deletionsanalysen
mit verkürzten Proteinvarianten von SAUL1 konnte eine C-terminal gelegene
Domäne charakterisiert werden, die aus insgesamt fünf hintereinander liegenden
Armadillo (ARM)-Wiederholungen besteht. Diese fünf ARM-Wiederholungen sind
notwendig und ausreichend, um eine Assoziation von SAUL1 mit der
Plasmamembran zu vermitteln. Dabei werden alle fünf ARM-Wiederholungen
benötigt, um eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne auszubilden, die durch
Wechselwirkung mit einem bislang unbekannten Membranprotein SAUL1 an der
Plasmamembran verankert. Auch für PUB43, der zu SAUL1 nächst-homologen
PUB-E3-Ligase, konnte eine solche Interaktionsdomäne charakterisiert werden,
die die Assoziation von PUB43 mit der Plasmamembran vermittelt.
SAUL1 spielt somit eine entscheidende Rolle bei der Modifizierung von
Zielproteinen an der Plasmamembran und hat damit unmittelbaren Einfluss auf
frühe Signaltransduktionsereignisse in Seneszenzprozessen in Arabidopsis
thaliana.
____________________________________________________Zusammenfassung
3
Summary The aim of this work was the characterization of the PUB-E3-ubiquitin ligase
SAUL1 (senescence-associated E3 ubiquitin ligase 1, also known as PUB44)
from Arabidopsis thaliana. SAUL1 is part of the ubiquitin-26S-proteasome system
(UPS) mediating the transfer of ubiquitin moieties to target proteins and therefore
marking these proteins for degradation via the 26S proteasome. SAUL1 functions
as a negative regulator of senescence processes and prevents plants from
premature senescence. The T-DNA insertion lines saul1-1 and saul1-2 display a
yellowing of leaves in young seedlings under certain light conditions leading to
the death of the plants. Senescence symptoms coincide with an increase in
endogenous levels of the phytohormone abscisic acid (ABA), which is involved in
the regulation of various developmental processes as well as stress responses.
In addition to the increased ABA content, the levels of AAO3 protein and activity
were elevated. AAO3 is mediating the very last step in ABA biosynthesis by
converting abscisic aldehyde into abscisic acid.
In this work, a direct connection between SAUL1, ABA biosynthesis, and the
regulation of senescence processes in plants is demonstrated. When grown
under low light conditions, saul1 plants displayed premature senescence
symptoms accompanied by an increase in AAO3 protein content and the
resulting enzymatic activity AOδ. Complementation of saul1 with P35S:SAUL1
abolished the senescence phenotype and the alterations in AAO3 protein levels
completely. Direct interactions between SAUL1 and AAO3 protein occurred in
label transfer experiments suggesting a possible role of SAUL1 in protein
degradation of AAO3 via the 26S proteasome. Therefore SAUL1 seems to be
involved in the regulation of ABA biosynthesis under low light conditions. This
regulatory effect can no longer take place in saul1 mutants resulting in
overaccumulation of ABA. These elevated endogenous ABA levels lead to the
onset of senescence in saul1 plants. The introduction of a mutation in ABI1
coding for an essential component of the ABA-dependent signal transduction
pathway led to a reduction of senescence symptoms in saul1-1abi1-1 double
mutants compared to saul1-1 mutant plants. Additional physiological experiments
such as germination assays or growth tests under drought stress, high salinity or
osmotic stress conditions were performed. saul1 Plants showed ABA
hypersensitive responses in all of the tests presumably due to an overshooting
ABA biosynthesis. These results suggested an additional role for SAUL1 in the
regulation of plant responses to various stress conditions by regulation of ABA
biosynthesis.
Gene expression studies were performed using saul1 plants as an inducible
model system to study the onset and progression of senescence. Pulse-chase
experiments demonstrated that the accumulation of ORE1 is involved in setting
the point of no return in saul1 senescence. However, ORE1 accumulation is not
the earliest response in the senescence program. Microarray analyses showed a
significant increase in transcript levels of the senescence associated transcription
Zusammenfassung____________________________________________________
4
factor genes WRKY53, WRKY6, and AtNAP starting 6 h after induction of
senescence in saul1 mutants. These alterations occurred long before the
accumulation of ORE1 suggesting that these transcription factors as well as
SAUL1 may function upstream of ORE1.
In previous yeast-two-hybrid assays putative interaction partners of SAUL1 have
been identified. The aim of this work was to confirm these possible interactions.
However, in pulldown assays no interaction between SAUL1 and the putative
target proteins was detected.
The last aim of this work was the subcellular localization of SAUL1. Transient
expression of SAUL1-GFP and SAUL1-YFP fusion proteins as well as Western
blot analyses showed an association of SAUL1 with the plasma membrane.
However, SAUL1 itself lacks signals mediating a localization at the plasma
membrane. Deletion analyses using truncated SAUL1 proteins identified a novel
C-terminal domain which consists of five tandem oriented armadillo (ARM)
repeats. These five ARM repeats are essential and sufficient to mediate an
association of SAUL1 with the plasma membrane. All five ARM repeats together
are necessary to form a protein-protein interacting domain anchoring SAUL1 at
the plasma membrane most probably by interacting with an unknown membrane
protein. A similar domain has been identified in PUB43 which is the closest
homolog to SAUL1 and also localized at the plasma membrane.
Taken together SAUL1 plays an important role in the modification of target
proteins at the plasma membrane regulating the onset and progression of
senescence processes in Arabidopsis thaliana.
____________________________________________________________Einleitung
5
2 Einleitung Im Laufe ihres Lebens sieht sich eine Pflanze unterschiedlichsten
Herausforderungen gegenübergestellt. Sowohl entwicklungsabhängige Prozesse
als auch die Reaktion auf verschiedenste Umweltfaktoren müssen abgestimmt
und ständig kontrolliert werden. Zur Wahrnehmung und Weiterleitung einzelner
Reize haben Pflanzen eine Vielzahl an Signalnetzwerken entwickelt, die darauf
ausgelegt sind, das pflanzliche Verhalten an veränderte Umweltbedingungen
oder Entwicklungsstufen anzupassen. So konnten einzelne Regelkreise
beispielsweise für pflanzliches Keimungsverhalten, Stressreaktionen oder auch
den Übergang von vegetativem zu reproduktivem Wachstum charakterisiert
werden. Diese Netzwerke sind allerdings alles andere als geschlossene
Einheiten, vielmehr herrscht ein ständiger Austausch der einzelnen Regelkreise
untereinander. Dies stellt Biologen vor die schwierige Aufgabe, immer
komplexere Systeme sowie die Aufgaben einzelner Komponenten in diesen
Systemen zu entschlüsseln. Im Rahmen dieser Einführung sollen einzelne
Aspekte dieser komplexen Signaltransduktionsnetzwerke in der Modellpflanze
Arabidopsis thaliana vorgestellt und verknüpft werden.
2.1 Das Phytohormon Abszisinsäure
2.1.1 Allgemeines Das Phytohormon Abszisinsäure (ABA) wurde erstmals in den sechziger Jahren
des 20. Jahrhunderts als endogener Regulator des pflanzlichen Wachstums
identifiziert. In Baumwolle konnte erstmals ein Wirkstoff beschrieben werden, der
am Blattabwurf (Abszission) beteiligt ist (Ohkuma et al., 1963). Die hierbei
isolierte Substanz wurde erstmals als Abszisin II bezeichnet. In einem weiteren
Screening nach pflanzlichen Inhaltsstoffen, die das Keimungsverhalten
unterdrücken können, wurde Dormin beschrieben. Anschließende chemische
Untersuchungen konnten zeigen, dass es sich bei beiden Substanzen um den
gleichen Wirkstoff handelte, der schließlich in ABA umbenannt wurde (Addicott et
al., 1968). Im Gegensatz zu anderen Phytohormonen konnte ABA mittlerweile
auch außerhalb des Pflanzenreiches in verschiedenen Pilzen und dem tierischen
System - einschließlich dem Menschen - nachgewiesen und mit verschiedenen
Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (zusammengefasst in
Bassaganya-Riera et al., 2010).
Einleitung____________________________________________________________
6
2.1.2 Wirkungen von ABA ABA gilt als das klassische pflanzliche Stresshormon und ist an der Anpassung
des pflanzlichen Verhaltens an ungünstige Wachstumsbedingungen beteiligt.
Unter Stressbedingungen wird ABA dabei als endogener Signalgeber genutzt,
um die pflanzliche Antwort an die veränderten Umweltbedingungen anzupassen
(Zhu, 2002). So steuert das Phytohormon unter Anderem die Regulation von
Pflanzenantworten auf Trockenheit, Versalzung der Böden, Kälte und hohe UV-
Strahlung (Fedoroff, 2002; Xiong et al., 2002; Zhu, 2002; Himmelbach et al.,
2003). Ebenso werden Prozesse der pflanzlichen Pathogenabwehr vermehrt mit
ABA in Verbindung gebracht (Mauch-Mani und Mauch, 2005; Ton et al., 2009).
Neben dieser Regulation von biotischen und abiotischen Stressantworten findet
aber auch während normalen pflanzlichen Entwicklungsprozessen durch ABA –
im Zusammenspiel mit weiteren Phytohormonen – eine Feinabstimmung des
Pflanzenwachstums statt (Cheng et al., 2002; Sharp, 2002; Sharp und LeNoble,
2002; Christmann et al., 2005). Erhöhte endogene ABA-Level unterdrücken zum
einen das Zellteilungs- und Streckungswachstum, zum anderen werden
Schließzellbewegung und somit der pflanzliche Wasserhaushalt reguliert.
Zusätzlich ist ABA an der Regulation von Dormanz und Samenkeimung beteiligt,
weshalb es früher auch den Namen Dormin trug (Finkelstein et al., 2002). Des
Weiteren gibt es auch Hinweise dafür, dass ABA an der Regulation von
Seneszenzprozessen beteiligt ist (Gepstein und Thimann, 1980; Panavas et al.,
1999; He et al., 2005). Ein direkter Zusammenhang von Komponenten der ABA-
Signaltransduktion und Seneszenzprozessen konnte allerdings noch nicht
nachgewiesen werden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass ABA an
der Regulation von Stress- und Entwicklungsprozessen in Arabidopsis beteiligt
ist.
2.1.3 ABA-Biosynthese ABA ist ein Sesquiterpenoid, das aus Karotinvorstufen gebildet wird. Die
Biosynthese läuft dabei zunächst in Plastiden, die späteren Biosyntheseschritte
im Zytosol ab und ist in Abbildung 2.1 zusammengefasst. Durch Zyklisierung und
anschließender Hydroxylierung wird zunächst aus all-trans-Lycopin über die
Zwischenstufe des β-Carotins das Carotinoid Zeaxanthin gebildet. Die
Umwandlung von Zeaxanthin zu all-trans-Violaxanthin erfolgt über die
Zwischenstufe Antheraxanthin und wird von der Zeaxanthin-Epoxidase ABA1
(Marin et al., 1996, Barrero et al., 2005) katalysiert. Nach Isomerisierung zu 9’-
cis-Neoxanthin und 9-cis-Violaxanthin wird dieser C40-Körper oxidativ gespalten
und es entstehen das C15-Molekül Xanthoxin sowie ein C25-Nebenprodukt. Dieser
Schritt wird katalysiert durch die 9-cis-Epoxykarotinoid-Dioxygenase (NCED;
____________________________________________________________Einleitung
7
Schwartz et al., 1997, Iuchi et al., 2001; Schwartz et al., 2003). Anschließend
wird Xanthoxin durch einen bislang noch unbekannten Mechanismus aus den
Plastiden ins Zytosol transportiert. Dort erfolgt dann in zwei enzymatischen
Schritten die Umsetzung von Xanthoxin zu Abszisinsäure. In einem ersten
Schritt, der von AtABA2 katalysiert wird, wird Xanthoxin in Abszisinaldehyd
umgewandelt. Abschließend wird Abszisinaldehyd zu ABA oxidiert, was von dem
Enzym Aldehydoxidase3 aus Arabidopsis (AAO3) vermittelt wird. Für diesen
letzten Schritt der ABA-Biosynthese ist allerdings ein Molybdän-Kofaktor ABA3
unablässig, der die Aktivität der AAO3 reguliert (Nambara und McCourt, 1999;
Seo et al., 2000a; Seo et al., 2000b; Bittner et al., 2001; Melhorn et al., 2008).
Abbildung 2.1 Biosynthese von Abszisinsäure in Pflanzen. Ausgehend von dem
Carotinoid Zeaxanthin erfolgt in den Plastiden dessen Umsetzung zu all-trans-
Violaxanthin, katalysiert von der Zeaxanthin-Epoxidase ABA1. Nach Isomerisierung zu 9-
cis-Violaxanthin und 9’-cis-Neoxanthin werden diese beiden Zwischenstufen durch NCED
oxidativ gespalten und es entsteht der C15-Körper Xanthoxin. Xanthoxin wird durch einen
bislang unbekannten Mechanismus aus dem Plastid ins Zytoplasma transportiert und dort
von ABA2 in Abszisinaldehyd umgewandelt. In einem finalen Schritt erfolgt die Oxidation
von Abszisinaldehyd zu Abszisinsäure durch die Aldehydoxidase AAO3. Für diese
Umsetzung ist der Molybdän-Kofaktor ABA3 unablässig.
Abbildung modifiziert aus Seo und Koshiba, 2002.
Einleitung____________________________________________________________
8
2.1.4 ABA-Signaltransduktion Als Signaltransduktion werden ganz allgemein alle Prozesse bezeichnet, die von
der Wahrnehmung eines Reizes bis hin zu dessen Umsetzung auf
Transkriptions- und Proteinebene und den damit verbundenen Reaktionen auf
diesen Reiz reichen. Im Falle von ABA beginnt die Signaltransduktionskaskade
also zunächst mit der Wahrnehmung des Phytohormons selbst. Dieser Reiz wird
anschließend von verschiedenen Proteinen und second messengern unter
anderem in den Zellkern weitergeleitet und dort in Änderungen des
Transkriptoms umgesetzt. Dies führt schließlich zu einer Anpassung des
pflanzlichen Verhaltens an die veränderten Umweltbedingungen
beziehungsweise Entwicklungsphasen der jeweiligen Pflanze. Das sich hieraus
ergebende Netzwerk der ABA-Signaltransduktion ist hoch komplex und bislang
noch nicht vollständig aufgeklärt.
Zur Aufschlüsselung dieses Signalnetzwerkes wurden zahlreiche genetische
Screenings durchgeführt, die auf die Identifizierung von Arabidopsis-Mutanten mit
veränderten ABA-Antworten ausgelegt waren. Die Screenings waren
beispielsweise ausgerichtet auf die Produktion von nicht-dormanten Samen
(Koornneef et al., 1982), veränderte Sensitivität gegenüber ABA bei der Keimung
(Koornneef et al., 1984; Finkelstein, 1994; Cutler et al., 1996),
Keimlingswachstum (Lopez-Molina und Chua, 2000) oder Wurzelwachstum
(Himmelbach et al., 1998). Als zentrale Komponenten der ABA-
Signaltransduktion konnten hierbei die Proteinphosphatasen ABI1 und ABI2
(ABA insensitiv) identifiziert werden (Koornneef et al., 1984; Leung et al., 1994;
Meyer et al., 1994; Cutler et al., 1996; Leung et al., 1997; Rodriguez et al., 1998),
die inzwischen als negative Regulatoren der ABA-Signaltransduktion
charakterisiert wurden (Leung et al., 1997; Gosti et al., 1999). Die beiden
Pflanzenlinien abi1-1- und abi2-1 weisen jeweils eine Punktmutation auf, was zu
einem Aminosäure(AS)-Austausch auf Proteinebene und somit dem Verlust der
Phosphataseaktivität führt. abi1-1- und abi2-1-Pflanzen zeigen ABA-insensitives
Verhalten in verschiedenen Stressantworten wie eine Reduktion des
Wurzelwachstums oder der Keimungsrate von Samen beziehungsweise einem
erhöhten Wasserverlust unter Trockenstressbedingungen, was auf eine fehlende
Regulation der Schließzellbewegung zurückzuführen ist. Darüber hinaus sind die
Expressionslevel von eigentlich ABA-induzierten Genen in diesen Mutanten in
Anwesenheit von ABA unverändert, was die entscheidende Rolle von ABI1 und
ABI2 in der ABA-Signaltransduktion verdeutlicht (Leung et al., 1997; Leung et al.,
1998, Hoth et al., 2002). Mit ERA1 konnte eine weitere Komponente des ABA-
Signalweiterleitungsnetzwerkes beschrieben werden (Cutler et al., 1996). Hierbei
handelt es sich um eine Untereinheit einer Farnesyltransferase, die an der
____________________________________________________________Einleitung
9
Übertragung von Farnesylresten auf Zielproteine und somit der Verankerung
dieser Proteine in der Plasmamembran beteiligt ist. Pflanzen, die eine Mutation in
ERA1 aufweisen, zeigen ABA-hypersensitives Verhalten in Keimungsstudien und
Trockenstressexperimenten (Cutler et al., 1996, Pei et al., 1998).
Obwohl inzwischen zahlreiche Komponenten der ABA-Signaltransduktion
identifiziert werden konnten, blieb die Frage nach einem ABA-Rezeptor lange
Zeit ungeklärt. Aufgrund verschiedener Studien konnte sowohl die Existenz eines
membranständigen als auch eines intrazellulären ABA-Rezeptors postuliert
werden (Zhang et al., 2001; Hallouin et al., 2002; Zhang et al., 2002). Während
über lange Zeit hinweg Versuche zur Identifizierung von ABA-bindenden
Proteinen erfolglos blieben, wurden in den letzten beiden Jahren verschiedenste
Proteine als mögliche ABA-Rezeptoren charakterisiert (Razem et al., 2006; Shen
et al., 2006; Liu et al., 2007; Ma et al., 2009; Pandey et al., 2009). Einige dieser
Kandidaten werden sehr kontrovers diskutiert, doch die Mitglieder zweier
Proteinfamilien gelten inzwischen als wissenschaftlich anerkannte Rezeptoren
des Phytohormons ABA. Hierbei handelt es sich zum einen um die beiden
membranständigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren GTG1 und GTG2
(Pandey et al., 2009). Für diese Proteine konnte sowohl ABA-Bindefähigkeit als
auch veränderte ABA-abhängige Stressantworten und Genexpression in
gtg1gtg2-Doppelmutanten nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die
Familie der PYR/ PYL/ RCAR-Proteine (Pyrabactin resistant/ regulatory
component of ABA receptor) beschrieben, die durch Interaktion mit
verschiedenen Proteinphosphatasen (darunter auch ABI1 und ABI2) einen ABA-
Rezeptorkomplex ausbilden und ABA-abhängige Genexpression regulieren (Ma
et al., 2009; Park et al., 2009). Diese Familie der PYR/ PYL/ RCAR-Proteine
besteht aus insgesamt 14 Mitgliedern und spannt durch Interaktion mit
verschiedenen Proteinphosphatasen vom Typ 2C (PP2C einschließlich ABI1 und
ABI2) ein komplexes Regulationsnetzwerk der ABA-abhängigen
Signaltransduktion auf. In Abwesenheit von ABA verhindern PP2Cs eine
Autophosphorylierung von so genannten SnRKs (SNF1-related protein kinase)
und dadurch die Aktivierung von ABA-abhängiger Genexpression im Zellkern. In
Anwesenheit von ABA hingegen wird dieses von PYR/ PYL/ RCAR-Proteinen
gebunden, was zu einer Komplexbildung mit PP2Cs und deren Inaktivierung
führt. Infolgedessen kommt es zu einer Phosphorylierung von SnRKs und ABA-
abhängigen Transkriptionsfaktoren, die ihrerseits Einfluss auf
Genexpressionsprozesse nehmen (Melcher et al., 2009). Weitere
Untersuchungen dieser ABA-Rezeptor-Komplexe und der daraus resultierenden
Signalnetzwerke können in der Zukunft genutzt werden, um die ersten Schritte
der ABA-Perzeption und ABA-abhängigen Genregulation weiter aufzuschlüsseln.
Einleitung____________________________________________________________
10
2.2 Seneszenz
2.2.1 Allgemeines Blattseneszenz stellt den letzten Schritt der pflanzlichen Entwicklung dar und ist
somit ein essentieller Teil des pflanzlichen Lebenszyklus’. Hierbei durchlaufen
photosynthetisch aktive Gewebe einen Zersetzungsprozess, wobei wichtige
Nährstoffe aus diesen Geweben remobilisiert und in teilungsaktive Gewebe oder
Samen umverteilt werden, um deren Wachstum sowie die Fortpflanzung
sicherzustellen (Buchanan-Wollaston und Ainsworth, 1997; Quirino et al., 2000;
Hortensteiner und Feller, 2002). Im Laufe des Seneszenzprozesses kommt es
dabei zu einem Abbau des Chlorophylls, was in einer deutlichen Gelbfärbung der
Blätter resultiert, gefolgt von der vollständigen Umstellung des Zellstoffwechsels
bis hin zum Abbau von zellulären Strukturen (Gan und Amasino, 1997;
Buchanan-Wollaston et al., 2003; Thomas et al., 2003; Yoshida, 2003; Lim et al.,
2007). Dabei stellt Seneszenz eine Sonderform des programmierten Zelltods
(PCD für programmed cell death) dar, bei dem meist einzelne Organe wie Blätter,
Petalen oder Früchte betroffen sind oder aber - wie in der einjährigen Pflanze
Arabidopsis - es zu einem Absterben des gesamten Organismus kommt.
2.2.2 Die Regulation von Seneszenzprozessen Im Allgemeinen ist der Beginn des Seneszenzprogramms vom Alter des
jeweiligen Gewebes abhängig (Jiang et al., 1993), allerdings haben auch
verschiedene Umweltfaktoren einen erheblichen Einfluss auf das „gefühlte“ Alter
einer Pflanze. Hierbei lassen sich externe und interne Faktoren unterscheiden.
Zu den externen Faktoren, die den Beginn und das Fortschreiten des
Seneszenzprogramms vermitteln können, zählen unter Anderem
Nährstoffmangel, hohe Temperaturen, Trockenheit, niedrige Lichtintensitäten
oder auch Pathogenbefall (Bohnert et al., 1995). Doch auch pflanzeninterne
Faktoren spielen eine entscheidende Rolle in Seneszenzabläufen. So ist hierbei
vor allem das Zusammenspiel einzelner Phytohormone entscheidend. Während
erhöhte Cytokininproduktion die Blattseneszenz verzögern kann (Gan und
Amasino, 1995), führen reduzierte endogene Cytokininmengen zu beschleunigter
Seneszenz (Masferrer et al., 2002). Mit dem Cytokininrezeptor AHK3
(Arabidopsis Histidin Kinase 3) und ARR2 (Arabidopsis Response Regulator 2)
wurden zwei Faktoren der Cytokinin-Signaltransduktion identifiziert, die bei der
Regulation der Blattseneszenz eine entscheidende Rolle spielen (Kim et al.,
2006). Gibberrellinsäure und Auxin gelten als weitere Phytohormone, die
Blattseneszenz hinauszögern können. Dem gegenüber stehen die Phytohormone
Ethylen, ABA, Jasmonsäure, Salizylsäure und Brassinosteroide, die als
____________________________________________________________Einleitung
11
Induktoren der Blattseneszenz charakterisiert wurden (Gan, 2007). Ethylen
kommt dabei eine besondere Rolle als positiver Regulator der Blattseneszenz zu.
Grbic und Bleecker (1995) zeigten, dass Ethylen spezifisch die Transkription von
Seneszenz-assoziierten Genen (SAGs) fördert. In vivo wurde die Rolle von
Ethylen anhand von Arabidopsis Mutanten studiert, die entweder Störungen in
der Ethylen-Wahrnehmung (etr1, ethylene resistant1), oder Veränderungen in der
Ethylen-abhängigen Signaltransduktion (ein2, ethylene insensitive 2) aufwiesen.
In beiden Fällen kam es zu einer Verzögerung der Blattseneszenz (Grbic und
Bleecker, 1995). Auch dem Phytohormon ABA wird eine Rolle bei der Induktion
von Seneszenzprozessen zugewiesen, allerdings ist der Zusammenhang von
ABA und Seneszenz weitestgehend noch unklar. Bislang konnte in
seneszierenden Pflanzen ein erhöhter ABA-Gehalt nachgewiesen werden
(Gepstein und Thimann, 1980). Darüber hinaus kommt es durch Applikation von
ABA zu einem anstieg der Expressionslevel von Seneszenz-assoziierten Genen
(SAGs, Weaver et al., 1998).
2.2.3 Veränderungen auf Genexpressionsebene Untersuchungen zu pflanzlichen Seneszenzprozessen stützen sich hauptsächlich
auf zwei unterschiedliche Ansätze. Zum einen wurden genetische Mutagenese-
Verfahren und anschließende Screenings verwendet, um Pflanzenlinien mit
verändertem Seneszenzverhalten zu identifizieren. Bei der Mehrzahl der hierbei
identifizierten Mutanten handelte es sich um Pflanzen, die eine verspätete
Seneszenz im Vergleich zu WT-Pflanzen aufwiesen. Bei den betroffenen Genen
und den dadurch kodierten Proteinen handelt es sich also um Seneszenz-
begünstigende Faktoren. Unter diesen auf diese Weise identifizierten
Komponenten des Seneszenznetzwerkes finden sich die oresara-Mutanten
(koreanisch für langlebig), die allesamt verspätetes Seneszenzverhalten
aufweisen (Oh et al., 1997, Woo et al., 2004, Woo et al., 2001; Woo et al., 2002).
Im Rahmen von Genexpressionsstudien konnte gezeigt werden, dass im Laufe
von Seneszenzprozessen das pflanzliche Transkriptom vollständig umgestellt
wird. So finden sich insgesamt etwa 2500 Gene, deren Expression verändert ist
(Guo und Gan, 2005). Mit Einsetzen der Seneszenz werden zahlreichen Gene,
die für Komponenten des Photosyntheseapparats kodieren, herunterreguliert. Im
Gegenzug dazu kommt es zu einer Expressionssteigerung der SAGs. Bislang
konnten in Affymetrix GeneChip Assays mindestens 800 SAGs identifiziert
werden (Buchanan-Wollaston et al., 2003; Gepstein et al., 2003; Lin und Wu,
2004; Buchanan-Wollaston et al., 2005; van der Graaff et al., 2006). Eine Vielzahl
dieser Gene kodiert dabei für Komponenten der Remobilisierungsmaschinerie
verschiedener Makromoleküle. Darunter findet sich auch SAG12, das für eine
Einleitung____________________________________________________________
12
Cysteinprotease kodiert und als klassisches Markergen für pflanzliche
Seneszenz gilt (Noh und Amasino, 1999). Des Weiteren finden sich unter den
SAGs auch zahlreiche Gene, die für regulatorische Proteine wie
Transkriptionsfaktoren, Kinasen und Phosphatasen kodieren und somit der
Regulation des Seneszenzprogramms dienen (Buchanan-Wollaston et al., 2005).
Die Rolle von Transkriptionsfaktoren bei der Regulation von
Seneszenzprozessen
Eine besonders große Gruppe der SAGs stellen Transkriptionsfaktoren dar, die
dann durch Regulation von downstream-Targets ihrerseits weitere
Seneszenzprozesse modulieren können. Insgesamt ist die Expression von 185
Transkriptionsfaktorgenen während der Seneszenz verändert, 41 Gene sind
induziert, 144 Gene reprimiert (Balazadeh et al., 2008). Diese
Transkriptionsfaktoren lassen sich hierbei in einzelne Familien unterteilen, wobei
die beiden größten Gruppen die Familien der NAC (NAM, ATAF1, -2 und CUC2)-
und der WRKY (benannt nach der AS-Sequenz WRKY)-Domänen-
Transkriptionsfaktoren darstellen. Für einige Mitglieder dieser beiden
Proteinfamilien konnte bereits eine Rolle bei der Regulation von
Seneszenzprozessen gezeigt werden.
Der NAC-Transkriptionsfaktor AtNAP (NAC2/ ANAC029) gilt dabei als positiver
Regulator von Seneszenzprozessen (Guo und Gan, 2006). So konnte in atnap
Nullmutanten ein deutlich verspätetes Einsetzen von Seneszenz sowie eine
verminderte Expression von SAG12 beobachtet werden. AtNAP-
überexprimierende Pflanzen hingegen zeigten ein verfrühtes Auftreten von
Seneszenzsymptomen. Mit ORE1 (AtNAC2/ ANAC092) konnte eine weitere
Komponente des Seneszenzregulationsnetzwerkes identifiziert werden (Kim et
al., 2009). ORE1 bildet gemeinsam mit miRNA164 und EIN2 (ethylene
insensitive 2) einen molekularen Schalter aus, der altersabhängige
Zelltodprozesse steuert. Hierbei wird in jungen Pflanzen die Expression von
ORE1 durch miRNA164 reprimiert. Mit fortschreitendem Blattalter kommt es zu
einer Abnahme an miRNA164 und damit einem Anstieg von ORE1. EIN2
induziert dabei zusätzlich die Expression von ORE1. Wird ein Schwellenwert der
ORE1-Akkumulation überschritten so wird Seneszenz induziert. Dies findet in
Arabidopsis bei einem Blattalter von 26 bis 28 Tagen statt. Außerdem kommt
ORE1 auch eine Rolle in der Regulation von salzinduzierter Seneszenz zu
(Balazadeh et al., 2010).
Eine zweite Gruppe an Transkriptionsfaktoren, die an Regulationsprozessen der
Seneszenz beteiligt sind, stellen WRKY-Proteine dar. Unter den SAGs finden
sich mindestens sechs WRKY-Gene, nämlich WRKY 4, 6,7,11,53 und WRKY70,
____________________________________________________________Einleitung
13
allerdings konnte bislang nur für WRKY 6, WRKY53 und WRKY70 tatsächlich
eine Funktion in Regulationsprozessen der Seneszenz nachgewiesen werden.
Dabei wurde WRKY70 als negativer Regulator der Seneszenz beschrieben, da in
wrky70-Mutanten ein verfrühtes Einsetzen von Seneszenz beobachtet werden
konnte (Ülker et al., 2007). WRKY6 und WRKY53 gelten hingegen als Förderer
von Seneszenzprozessen. Eine Überexpression von WRKY6 führt in Arabidopsis
zu einer Ausbildung von Blattnekrosen (Robatzek und Somssich, 2002). Des
Weiteren konnte gezeigt werden, dass WRKY6 direkt den Promotor von SIRK
(senescence induced receptor kinase) aktiviert, der nur in seneszentem Gewebe
aktiv ist. Und schließlich konnte für WRKY53 gezeigt werden, dass der Verlust
dieses Gens zu einem verzögerten, Überexpression hingegen zu einem
verfrühten Seneszenzverhalten führt (Miao et al., 2004). Die Hierarchie all dieser
Transkriptionsfaktoren untereinander sowie deren Rolle innerhalb des
Seneszenzsignalnetzwerkes sind jedoch weiterhin unbekannt.
2.3 Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau Alle pflanzlichen Entwicklungsprozesse, also auch die Seneszenz, sowie die
Adaptation an unterschiedliche Umweltbedingungen bedürfen einer ständigen
Anpassung des zellulären Proteinhaushalts und dessen Aktivität. Auf der einen
Seite erfolgt eine Regulation hierbei durch Änderungen in der
Proteinneusynthese sowie durch Modulation von Proteineigenschaften. Auf der
anderen Seite spielen aber auch der gezielte Proteinabbau und daraus
resultierende Signalgebungen eine wichtige Rolle in diesen Entwicklungs- und
Anpassungsprozessen. Dieser gezielte Proteinabbau wird dabei durch das
Ubiquitin-26S-Proteasom-System (UPS) vermittelt.
Das UPS dient dem Abbau von Zielproteinen zur Regulation des intrazellulären
Proteinhaushalts. Hierbei wird das 76 AS-lange Polypeptid Ubiquitin als Signal
zum Abbau der markierten Proteine durch das 26S-Proteasom verwendet. Die
Aminosäuresequenz von Ubiquitin ist dabei in allen Eukaryoten höchst
konserviert. Sie ist in allen höheren Pflanzen identisch und unterscheidet sich in
Hefe und dem Menschen in nur zwei beziehungsweise drei AS-Resten (Callis et
al., 1995). Die Markierung von Zielproteinen durch Anheften von Ubiquitin erfolgt
in einer Ubiquitin-Konjugations-Kaskade, deren Ablauf ebenso in allen
Eukaryoten konserviert ist.
2.3.1 Ablauf des UPS-vermittelten Proteinabbaus Der UPS-vermittelte gezielte Proteinabbau ist ein Vorgang, der in insgesamt vier
Schritte unterteilt werden kann. Die einzelnen Zwischenschritte dieser Reaktion
sind in Abbildung 2.2 schematisch dargestellt. Dabei wird zunächst in einer drei-
Einleitung____________________________________________________________
14
stufigen Ubiquitin-Konjugations-Kaskade Ubiquitin auf das zu markierende
Zielprotein übertragen. In einem ersten Schritt bindet das so genannte E1-Enzym
(auch Ubiquitin-aktivierendes Enzym) energieabhängig das Polypeptid Ubiquitin.
Das an das E1-Enzym gebundene aktivierte Ubiquitin wird in einem zweiten
Schritt auf ein Cystein im aktiven Zentrum des E2-Enzyms (auch Ubiquitin-
konjugierendes Enzym) übertragen, wobei das E1-Enzym freigesetzt wird. In
einem dritten Schritt kommt es schließlich zu einer Proteinkomplexbildung aus
E3-Enzym (Ubiquitin-Ligase), E2-Enzym mit gebundenem Ubiquitin sowie dem
zu markierenden Zielprotein, wobei es zu einer Übertragung des Ubiquitins auf
einen Lysin-Rest des Zielproteins kommt.
Diese Kaskade kann von jedem Zielprotein ein- oder mehrfach durchlaufen
werden. In Einzelfällen wird nur ein einzelnes Ubiquitin-Molekül an das
Zielprotein angeheftet, was entweder als Markierung für proteolytischen Abbau in
Lysosom oder Vakuole oder aber im Zellkern als Signal der
Transkriptionsmodulation dient (Hicke, 2001; Hicke und Dunn, 2003). Wird eine
Kette von mindestens vier Ubiquitin-Molekülen angehängt führt dies zum Abbau
des Zielproteins im 26S-Proteaom. Im 26S-Proteasom findet der letzte Schritt
des UPS-vermittelten Proteinabbaus statt. Dabei wird das Zielprotein zunächst
entfaltet, die angehängten Ubiquitin-Reste abgespalten und das Protein in
Oligopeptide zerschnitten. Die endgültige Zerlegung dieser Peptide in einzelne
Aminosäuren, die für neue Proteinbiosynthese wiederverwendet werden können,
erfolgt dann im Zytoplasma.
Abbildung 2.2 Schematische Darstellung des Ubiquitinylierungs-Prozesses. In einem ersten Schritt wird Ubiquitin unter ATP-Verbrauch energetisiert und an E1 gebunden, anschließend erfolgt die Übertragung des Ubiquitins auf das E2-Enzym. In einem dritten Schritt wird das Ubiquitin mit Hilfe eines spezifischen E3-Enzyms auf das Zielprotein übertragen. Eine Polyubiquitinkette von mindestens vier Ubiquitin-Resten dient zur Markierung für den Proteinabbau mittels 26S-Proteasom. Abbildung modifiziert aus Tisdale, 2002.
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15
2.3.2 Komponenten des UPS Die Relevanz dieses Signalwegs wird deutlich, wenn man die große Anzahl an
beteiligten Komponenten betrachtet. Insgesamt kodieren in Arabidopsis thaliana
über 1600 Gene für Mitglieder des UPS, was ungefähr 6% des gesamten
Arabidopsis Proteoms entspricht (Smalle und Vierstra, 2004). Die Bedeutung der
einzelnen Komponenten für die Spezifität des Prozesses lässt sich auch an der
Anzahl der Vertreter der einzelnen Untergruppen ablesen.
E1 – Ubiquitin aktivierendes Enzym (UBA)
E1-Enzyme initiieren die Übertragung von Ubiquitin auf ein Zielprotein und haben
keinen Einfluss auf die Substratspezifität für das Zielprotein. E1-Enzyme besitzen
neben einer Nukleotid-Bindestelle für ATP beziehungsweise die Ubiquitin-AMP-
Zwischenstufe eine konservierte Cystein-Aminosäure, auf die unter Ausbildung
eines Thioesters das Ubiquitin übertragen wird (Hatfield et al., 1997). In
Arabidopsis gibt es zwei verschiedene E1-Isoformen (AtUBA1 und AtUBA2),
wobei eine davon wahrscheinlich im Zellkern lokalisiert ist (Hatfield et al., 1997).
Beide E1-Enzyme sind in allen Pflanzengeweben exprimiert und zeigen
weitestgehend identische biochemische Eigenschaften, was auf eine redundante
Funktion der beiden Proteine schließen lässt.
E2 – Ubiquitin konjugierendes Enzym (UBC)
Das Arabidopsis-Genom beinhaltet 37 Gene, die für so genannte UBCs kodieren
(Kraft et al., 2005). Diese zeichnen sich vor allem durch eine 150 Aminosäuren
umfassende katalytische Domäne aus, in deren aktiven Zentrum sich das Cystein
befindet, welches das Ubiquitin während der Konjugationskaskade temporär
bindet (Hamilton et al., 2001). Neben dieser katalytischen Domäne tragen
zahlreiche E2-Enzyme N- oder C-terminale weitere funktionale Domänen, die
eine Erkennung von Zielproteinen beziehungsweise Interaktion mit
entsprechenden E3-Enzymen sowie die subzelluläre Lokalisierung vermitteln.
Neben den UBC-Proteinen kodiert das Arabidopsis-Genom für acht so genannte
UEVs (Ubiquitin-konjugierende E2-Enzym Variante), die strukturell zwar mit
UBCs verwandt sind, allerdings im aktiven Zentrum kein Cystein tragen und
somit funktionell nicht aktiv sind (Broomfield et al., 1998; Sancho et al., 1998).
E3 – Ubiquitin-Ligasen
E3-Ezyme stellen die größte Untergruppe der UPS-Komponenten dar. Das
Arabidopsis-Genom kodiert für insgesamt mehr als 1400 putative Ubiquitin-
Ligasen. Diese Proteingruppe vermittelt somit die hohe Substratspezifität des
Einleitung____________________________________________________________
16
UPS. Die Vielzahl an E3-Enzymen lassen sich anhand ihrer Funktionsweisen in
drei Unterklassen aufteilen (Vierstra, 2009, siehe Abbildung 2.3).
Cullin-RING-E3-Ligasen (CRL)
In dieser ersten Gruppe sind alle E3-Ligasen zusammengefasst, die gemeinsam
mit weiteren Proteinen große E3-Ligase-Komplexe bilden. Sie stellen die größte
Gruppe innerhalb der E3-Ligasen dar und umfassen mehr als 880 Proteine. Das
Grundgerüst aller CRLs besteht aus einem Cullin-Protein, das gemeinsam mit
einem gebundenen RING-Finger-Protein (really interesting new gene) die
Interaktionsplattform zur Ausbildung eines hochmolekularen Proteinkomplexes
dient (Petroski und Deshaies, 2005). Entsprechend der darüber hinaus
beteiligten Komponenten lassen sich diese Ligase-Komplexe in vier funktionelle
Untergruppen einteilen, die als SCF- (SKP1/ CUL1/ F-Box), BTB- (bric-a-brac-
tramtrac-broad-complex), DDB- (DNA-damage binding) oder APC- (anaphase-
promoting complex) Komplexe bezeichnet werden (Vierstra, 2009). All diesen E3-
Ligasen ist gemein, dass sie keine direkte Ubiquitinligase-Aktivität besitzen.
Vielmehr bringen sie durch Ausbildung der Proteinkomplexe gebundenes E2-
Enzym und Zielprotein in räumliche Nähe, was eine Übertragung das Ubiquitins
auf das Zielprotein ermöglicht.
HECT-E3-Ligasen
Eine zweite Gruppe bilden HECT-Ligasen, benannt nach dem ersten
charakterisierten Protein, das die so genannte HECT-Domäne trägt, dem
menschlichen E6AP (Homologie zum E6AP C-Terminus). Das Arabidopsis-
Genom kodiert für 7 einzelne Ubiquitin-Ligasen der HECT-Familie (UPL1-7).
Diese E3-Ligasen liegen als Monomere vor und zeichnen sich durch die C-
terminal gelegene, 350 AS unfassende HECT-Domäne aus, die durch
Abbildung 2.3 Schematische Darstellung der verschiedenen E3-Ligase-Untergruppen.
Cullin-RING-E3-Ligasen (CRLs) bilden hochmolekulare Proteinkomplexe aus, die
gemeinsam den E3-Komplex bilden. Als Beispiel ist der SCF-Ligasekomplex aus
Saccharomyces cerevisiae abgebildet. HECT- und U-Box/ RING-Proteine vermitteln die
Ligasefunktion hingegen als Monomere.
Abbildung modifiziert aus Vierstra, 2003.
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Ausbildung einer Thioester-Bindung Ubiquitin kovalent an ein Cystein im aktiven
Zentrum bindet, bevor dieses auf das Zielprotein übertragen wird (Downes et al.,
2003). HECT-Ligasen sind somit die einzige Gruppe an E3-Enzymen, die selbst
Ubiquitin binden können.
U-Box/ RING-Ligasen
Die letzte Gruppe bilden U-Box- und RING-Ligasen, die – anders als die an CRL-
Komplexen beteiligten RING-Proteine - als Monomere aktiv sind. Insgesamt
kodiert das Arabidopsis-Genom für 469 RING-Finger- beziehungsweise 64 U-
Box-Proteine (Mudgil et al., 2004; Stone et al., 2005). Die RING- und die U-Box-
Domäne sind strukturell nah verwandt und dienen als Bindestelle für das E2-
Enzym, während zusätzliche Protein-Protein-Interaktionsdomänen die
Wechselwirkung mit den jeweiligen Zielproteinen vermitteln. Während in RING-
Finger-Proteinen einzelne Cysteine oder Histidine zur Chelatierung von
Zinkionen und damit zur Ausprägung einer Protein-Protein-Interaktionsdomäne
führen, wird angenommen, dass in U-Box-Proteinen (PUB für plant U-box) dieses
Grundgerüst durch Ausbildung von Wasserstoff- und Salzbrückenbindungen
erstellt wird (Aravind und Koonin, 2000).
Ähnlich wie CRL-Komplexe sind auch RING/ U-Box-E3-Ligasen nicht direkt in der
Lage, Ubiquitin zu binden und auf das Zielprotein zu übertragen sondern dienen
vielmehr als Grundgerüst für eine korrekte Positionierung von Ubiquitin-
beladenem E2-Enzym und dem zu markierenden Zielprotein (Jackson et al.,
2000, Hatakeyama et al., 2001).
Vergleicht man die Anzahl an verschiedenen E3-Ligasen der einzelnen
Untergruppen in unterschiedlichen Eukaryoten, so ist auffällig, dass die Gruppe
der U-Box-Proteine in Pflanzen deutlich überrepräsentiert ist. Während in Hefe
oder dem Menschen nur 2 beziehungsweise 21 U-Box-Gene identifiziert werden
konnten (Koegl et al., 1999, Hatakeyama et al., 2001), liegen in Arabidopsis 64
und in Reis insgesamt 77 Gene vor, die für U-Box-Proteine kodieren (Azevedo et
al., 2001, Wiborg et al., 2008, Zeng et al., 2008). PUB-Proteine aus Arabidopsis
lassen sich anhand zusätzlicher Domänen in weitere Untergruppen unterteilen.
So beinhalten 15 Mitglieder der PUB-Proteinfamilie eine Kinase-Domäne und
weitere Proteine besitzen Protein-Protein-Interaktionsdomänen wie TPR-Motive
(tetratricopeptid repeat) oder WD40-Domänen (Wiborg et al., 2008, Yee und
Goring, 2009). Die größte Untergruppe bilden jedoch die PUB-ARM-Proteine mit
41 Mitgliedern, die neben der pflanzlichen U-Box so genannte Armadillo-
Wiederholungen (ARM, aufgrund der Homologie zum Embryosegment-
polaritätsgen Armadillo aus Drosophila melanogaster, Nüsslein-Volhard et al.,
1980) tragen.
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18
2.3.3 Armadillo-Motiv-Proteine Eine einzelne ARM-Domäne ist ein in allen Eukaryoten konserviertes, etwa 42
Aminosäuren umfassendes Sequenzmotiv, das als Sekundärstruktur drei α-
Helices ausbildet. Mehrere in Tandem-Orientierung gelegene ARM-
Wiederholungen falten sich anschließend zusammen und bilden eine
rechtsdrehende Superhelix aus, die als Interaktionsoberfläche für Protein-
Protein-Wechselwirkungen dient (Coates, 2003, Huber et al., 1997, Conti und
Kuriyan, 2000). Die Anzahl der an der Ausbildung dieser Superhelix beteiligten
ARM-Motive kann dabei von Protein zu Protein variieren.
ARM-Motiv-Proteine üben in Eukaryoten verschiedenste Funktionen aus, wobei
ihre Rolle in höheren Pflanzen noch weitgehend ungeklärt ist. Im tierischen
System hingegen ist die Beteiligung von ARM-Proteinen an zellulären Vorgängen
wie Regulation des Zytoskeletts, Zelladhäsion oder Signaltransduktion näher
charakterisiert. Das wohl am Besten untersuchte Protein dieser Gruppe ist β-
Catenin (menschliches Homolog zu Armadillo aus Drosophila), das in
Mehrzellern am Aufbau von Zell-Zell-Verbindungen – den adherens junctions –
beteiligt ist. Dabei interagiert β-Catenin zum einen mittels der ARM-
Wiederholungen mit plasmamembranständigen Cadherinen, zum anderen mit α-
Catenin, das wiederum mit Actin interagiert. Somit dienen α- und β-Catenin als
Adapterproteine zwischen Plasmamembran und Actin-Zytoskelett (Aberle et al.,
1994; Rimm et al., 1995; Aberle et al., 1996). Darüber hinaus hat β-Catenin
allerdings auch Funktion im Wnt-Signaltransduktionsweg (nach wingless und Int-
1). In Abwesenheit von Wnt-Signalen wird zytosolisches β-Catenin phosphoryliert
und damit für den proteolytischen Abbau über das UPS markiert. In Anwesenheit
von Wnt-Signalen wird β-Catenin allerdings stabilisiert, in den Zellkern
transloziert und beeinflusst dort die Transkription verschiedener Regulatoren von
Zellteilung, Entwicklung und Zelladhäsion (Behrens, 2000; Zhurinsky et al.,
2000). Ein zweites gut charakterisiertes ARM-Protein ist Importin-α, für das
homologe Proteine in allen Eukaryoten zu finden sind. Importin-α ist am Import
von Proteinen in den Zellkern beteiligt. Dabei bindet Importin-α über die ARM-
Domänen an Proteine, die eine Kernlokalisierungssequenz tragen, und
gleichzeitig über eine weitere Interaktionsdomäne, die keine ARM-Motive enthält,
an Importin-β. Importin-β interagiert schließlich mit Kernporen, woraufhin der
gesamte Proteinkomplex in den Zellkern transloziert wird (Gorlich, 1997, Conti
und Izaurralde, 2001).
2.3.4 PUB-ARM-Proteine in Pflanzen In Arabidopsis wurden bislang durch Genomanalysen insgesamt 108 Proteine
identifiziert, die ARM-Domänen tragen (Mudgil et al., 2004), worunter sich auch
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19
Homologe zu Importin-α und β-Catenin finden. Aufgrund der zusätzlichen
Domänen, die sich in diesen Proteinen finden, lassen sich die Proteine in weitere
Untergruppen unterteilen. Die dabei mit Abstand größte Untergruppe bilden PUB-
ARM-Proteine mit 41 Mitgliedern.
PUB-ARM-Proteine sind in höheren Pflanzen an unterschiedlichsten
Regulationsprozessen beteiligt. So konnte für das PUB-ARM-Protein PHOR1
(photoperiod responsive 1) aus Kartoffel gezeigt werden, dass es an Licht- und
Gibberellinsignaltransduktion beteiligt ist und in Anwesenheit des Phytohormons
Gibberellin in den Zellkern wandert, um dort putative Zielproteine für den
proteolytischen Proteinabbau zu markieren (Amador et al., 2001). Ein weiteres
gut charakterisiertes PUB-ARM-Protein ist ARC1 (Arm repeat containing 1) aus
Brassica napus (Gu et al., 1998; Stone et al., 1999; Stone et al., 2003). ARC1
stellt einen positiven Regulator der Selbstinkompatibilität dar und es konnte
gezeigt werden, dass ARC1 phosphorylierungsabhängig an membranständige S-
Lokus-Rezeptorkinasen (SRK) bindet und anschließend wichtige Zielproteine für
den Abbau durch das 26S-Proteasom markiert. Doch auch bei weiteren
pflanzlichen Entwicklungsprozessen sowie Stressverhalten spielen PUB-ARM-
Proteine eine wichtige Rolle. So sind die Proteine ACRE276 (Avr/ Cf-9 Rapidly
elicited 276) und CMPG1 aus Tabak sowie PUB17, PUB59/ 60 und das Triplett
PUB22/ PUB23/ PUB24 aus Arabidopsis an der Pathogenabwehr beteiligt
(Gonzalez-Lamothe et al., 2006; Yang et al., 2006; Trujillo et al., 2008;
Monaghan et al., 2009). Für PUB22 und PUB23 ist darüber hinaus auch eine
Funktion in der Trockenstressreaktion von Arabidopsis beschrieben (Cho et al.,
2008). SPL11 aus Reis (spottet leaf 11, OsPUB11) und das im Rahmen dieser
Arbeit näher charakterisierte SAUL1 (senescence associated E3-ubiquitin ligase)
aus Arabidopsis spielen entscheidende Rollen in der Regulation von pflanzlichen
Seneszenzprozessen (Zeng et al., 2004; Raab et al., 2009).
2.3.5 Die E3-Ubiquitinligase SAUL1 (PUB44) Das PUB-ARM-Protein SAUL1 (senescence-associated E3 ubiquitin ligase 1,
auch bezeichnet als PUB44) wurde als E3-Ubiquitinligase charakterisiert, die in
Arabidopsis an der Regulation von Seneszenzprozessen beteiligt ist (Raab et al.,
2009).
2.3.5.1 T-DNA-Insertionslinien zeigen verfrühtes Seneszenzverhalten
Zwei unabhängige saul1-Linien (saul1-1 und saul1-2, charakterisiert in Raab et
al., 2009), die beide eine T-DNA-Insertion in SAUL1 tragen, zeigen ein verfrühtes
Seneszenzverhalten (Abbildung 2.4 A). Bei Wachstum der Pflanzen unter
niedrigen Lichtintensitäten (NL) tritt bereits in einem frühen Keimlingsstadium
Einleitung____________________________________________________________
20
Abbildung 2.4 Seneszenzverhalten von saul1-1- und WT-Pflanzen bei Wachstum unter
verschiedenen Lichtbedingungen. A WT- und SAUL1/ saul1-Pflanzen zeigen keine
Veränderungen im Seneszenzverhalten, saul1/ saul1-Pflanzen dagegen zeigen deutlich
verfrühte Seneszenz. B Seneszenzverhalten von saul1-Mutanten bei Anzucht auf MS-
Festmedium. Unter niedrigen Lichtbedingungen (NL) zeigen saul1-Pflanzen
Seneszenzsymptome bereits im Keimlingsstadium. Bei Wachstum unter höheren
Lichtbedingungen wird das Auftreten von Anzeichen der Seneszenz vollständig
unterdrückt. C Durch ausreichend hohe Lichtintensitäten (> 150 µmol m-2 s-1) können
saul1-Muanten bis zur Samenreife gebracht werden, zeigen hierbei allerdings
Zwergwachstum. Durch weitere Erhöhung der Lichtintensitäten kann auch dieser Effekt
unterdrückt werden. D Zusammenstellung und Definition der für Wachstumsstudien
verwendeten Lichtintensitäten.
Abbildung modifiziert aus Raab et al., 2009.
eine Gelbfärbung der Blätter auf, während Seneszenzsymptome durch hohe
Lichtintensitäten (HL) vollständig unterdrückt werden können (Abbildung 2.4 B).
Werden saul1-Pflanzen zunächst unter diesem permissiven Lichtbedingungen
angezogen und zu einem beliebigen Zeitpunkt in der Pflanzenentwicklung auf
NL-Bedingungen umgestellt, so kommt es innerhalb weniger Tage zu einem
Auftreten von Seneszenzsymptomen in saul1-Pflanzen.
____________________________________________________________Einleitung
21
saul1-Pflanzen können unter entsprechenden Lichtbedingungen bis zur
Samenreife angezogen werden, wobei auch hier die Lichtintensität (angegeben
als Photonenflussdichte, PFD) entscheidend für die pflanzliche Entwicklung ist.
Während bei PFDn von 200 µmol m-2 s-1 saul1-Pflanzen deutlich kleiner bleiben
als WT-Pflanzen, ist bei höheren Lichtintensitäten (PFD > 400 µmol m-2 s-1) kein
Unterschied in der Pflanzenhöhe mehr feststellbar (Abbildung 2.4 C). Allgemein
ist jedoch festzuhalten, dass bei Anzucht von saul1-Pflanzen auf MS-
Festmedium deutlich niedrigere Lichtintensitäten nötig sind, um normales
Wachstum von saul1-Mutanten zu gewährleisten. In Abbildung 2.4 D sind die
jeweiligen Grenzwerte der PFDn zusammengestellt, die auch im Rahmen dieser
Arbeit berücksichtigt wurden.
2.3.5.2 Genexpressionsstudien
Im Rahmen der vorausgegangenen Arbeiten wurden verschiedene
Untersuchungen zur Genexpression in saul1-Mutanten und WT-Pflanzen
durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Expression von
zahlreichen Markergenen in seneszierenden saul1-1-Pflanzen im Vergleich zum
WT dereguliert war. Einzelne Gene, die für Komponenten der
Chlorophyllbiosynthese kodieren, waren dabei deutlich reprimiert,
Chlorophyllabbaugene hingegen induziert. Darüber hinaus zeigten auch
verschiedene SAGs und weitere Markergene von Seneszenzprozessen einen
drastischen Anstieg der Expressionslevel (Raab et al., 2009). Durch
Untersuchungen der Genexpression von SAUL1 in WT-Pflanzen konnte weder
eine Abhängigkeit von der Tageszeit noch von unterschiedlichen Lichtintensitäten
nachgewiesen werden (Raab et al., 2009).
2.3.5.3 Proteinlevel und Aktivität des ABA-Biosyntheseenzyms AAO3
Abschließend wurden verschiedene biochemische Untersuchungen durchgeführt.
In seneszenten saul1-Pflanzen konnte ein deutlicher Anstieg des endogenen
ABA-Levels gemessen werden, was mit einer Zunahme des Transkript- und
Proteinlevels der Aldehydoxidase3 (AAO3) sowie der zugehörigen
enzymatischen Aktivität AOδ einhergeht (Raab et al., 2009). AAO3 stellt das
Protein dar, das als letzten Schritt der ABA-Biosynthese die Umsetzung von
Abszisinaldehyd in Abszisinsäure vermittelt (Seo et al., 2000b). SAUL1 könnte
also durch Abbau von AAO3 direkten Einfluss auf die ABA-Biosynthese ausüben.
Allerdings konnte ein direkter Zusammenhang zwischen SAUL1 und AAO3 nicht
gezeigt werden.
Einleitung____________________________________________________________
22
2.4 Zielsetzung Seneszenz in Pflanzen ist ein genetisch und molekular streng regulierter Prozess
und daher von großem Interesse für die Grundlagenforschung auf dem Gebiet
der Signaltransduktion, aber auch für die agrarwirtschaftliche Anwendung. Die
PUB-ARM-E3-Ubiquitinligase SAUL1 ist ein entscheidender Faktor für die
Suppression von verfrühter Seneszenz in Arabidopsis thaliana. Die
regulatorische Funktion des SAUL1-Signalwegs für Seneszenzprozesse sollte im
Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgeschlüsselt werden. Ein erster wesentlicher
Punkt sollte hierbei die Aufschlüsselung des Zusammenhangs zwischen SAUL1,
der ABA-Biosynthese und den auftretenden Seneszenzsymptomen sein. Darüber
hinaus sollten saul1-Pflanzen aufgrund ihres wohldefinierten lichtabhängigen
Seneszenzphänotyps als induzierbares Modellsystem zur Untersuchung von
kinetisch sehr frühen Schritten des pflanzlichen Seneszenzprogramms etabliert
werden. Mittels Microarray-Analysen sollten hierbei die Veränderungen auf
transkriptioneller Ebene in saul1-Pflanzen nur wenige Stunden bis Tage nach
dem Umstellen auf NL-Bedingungen bestimmt werden. Aufbauend auf
vorausgegangene Yeast-Two-Hybrid-Untersuchungen sollten zudem putative
Zielproteine von SAUL1 auf ihre Interaktion mit der Ubiquitinligase hin untersucht
werden. Von zentraler Bedeutung war darüber hinaus die Aufklärung der
subzellulären Lokalisierung von SAUL1, um dadurch Rückschlüsse auf die
physiologische Funktion von SAUL1 zu gewinnen.
___________________________________________________________Ergebnisse
23
3 Ergebnisse Die PUB-ARM-Ubiquitinligase SAUL1 ist eine Komponente des
Regulationsnetzwerks von Seneszenzprozessen in Arabidopsis thaliana (Raab et
al., 2009). Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Funktionsweise von SAUL1 in
diesem Netzwerk durch Analysen von T-DNA-Insertionslinien, proteinchemischen
Untersuchungen und Versuchen zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1
untersucht werden.
3.1 Zusammenhang zwischen SAUL1 und Seneszenz und
Zelltod
Um die physiologische Funktion von SAUL1 zu charakterisieren, wurden T-DNA-
Insertionslinien untersucht, in denen das SAUL1-Gen ausgeschaltet ist. Wie
bereits beschrieben, zeigt sich für zwei unabhängige Allele von saul1-Mutanten
(saul1-1- und saul1-2) ein verfrühtes, lichtabhängiges Seneszenzverhalten (Raab
et al., 2009). Pflanzen, die homozygot eine T-DNA-Insertion in SAUL1 tragen,
zeigen bei Wachstum auf Erde unter niedrigen Lichtintensitäten (NL,
Photonenflussdichte PFD < 80 µmol m-2s-1; Lichtbedingungen sind in Abbildung
2.4 zusammengefasst) schon im frühen Keimlingsstadium deutliche
Alterungserscheinungen wie Gelbfärbung der Blätter und Einstellen des
Wachstums, die schließlich mit dem Tod der Pflanzen endeten. Es konnte
gezeigt werden, dass saul1-1-Mutanten, die unter niedrigen PFDn angezogen
waren und deutliche Seneszenzsymptome zeigten, erhöhte Protein-Level und
Aktivität der Aldehydoxidase3 (AAO3) aufweisen (siehe Abschnitt 2.3.5.3). Dies
resultiert in einem Anstieg des endogenen Levels des Phytohormons
Abszisinsäure (ABA).
3.1.1 Zelltod in saul1-1-Pflanzen Um den Zusammenhang dieses Anstiegs der ABA-Mengen und dem
Seneszenzverhalten von saul1-Mutanten zu verstehen, wurden verschiedene
Versuche zu Expression, Interaktion und Signaltransduktion durchgeführt. Bereits
im Vorfeld waren die zugrunde liegenden Prozesse auf Transkriptionsebene
charakterisiert worden. Raab et al. (2009) konnten unter anderem durch
Transkriptanalyse von Markergenen zeigen, dass es sich bei den beobachteten
Phänotypen von saul1-Mutanten tatsächlich um ablaufende Seneszenzprozesse
handelt. Seneszenz in Pflanzen geht einher mit dem Tod einzelner Zellen. Ob
Zelltod in saul1-Mutanten abläuft, wurde durch eine Färbung mit Trypanblau
überprüft. Hierbei handelt es sich um einen Diazofarbstoff, der von lebenden
Zellen nicht aufgenommen werden kann und somit als Indikator für Zelltod dient.
Ergebnisse___________________________________________________________
24
Wildtyp (WT)- und saul1-1-Pflanzen wurden hierfür zunächst unter
Hochlichtbedingungen (HL; PFD > 60 µmol m-2s-1) auf MS-Festmedium
angezogen und in einem Keimlingsalter von zwölf Tagen auf NL
(PFD < 25 µmol m-2s-1) umgestellt. Nach sechs Tagen unter diesen
Lichtbedingungen zeigten die Blätter von saul1-1-Pflanzen deutliche
Seneszenzsymptome, während WT-Pflanzen keinerlei Gelbfärbung aufwiesen.
Diese Pflanzen wurden anschließend einer Trypanblau-Färbung unterzogen
(Material und Methoden 5.2.3.10) und die Färbung mikroskopisch ausgewertet.
Die Blätter von WT-Pflanzen zeigten keine Anzeichen von Zelltod unter diesen
Wachstumsbedingungen (Abbildung 3.1 links). Insbesondere die Blätter von
saul1-1-Mutanten hingegen zeigten eine deutliche Blaufärbung entlang der
Leitbündel, was auf massiven Zelltod in diesen Bereichen schließen ließ
(Abbildung 3.1 rechts).
0
3.1.2 Untersuchungen zur Genexpression in saul1-1-Mutanten Seneszenz ist ein Prozess, der nicht nur auf Hormon- und Proteinebene streng
reguliert ist, sondern auch durch Änderungen auf Transkriptionsebene ständig
kontrolliert und angepasst wird. Deshalb wurden bereits im Vorfeld
Untersuchungen zur Expression in saul1-1-Mutanten durchgeführt (Raab et al.,
2009, Drechsel et al., 2010c). Hierbei wurde besonderes Augenmerk auf die
Expressionsregulation von Markergenen für Seneszenzprozesse gelegt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Fragestellungen auf Expressionsebene
näher untersucht werden. Zum einen sollten durch Microarray-Analysen die
frühen Regulationsschritte des Seneszenzprogramms in saul1-1-Pflanzen in
einem zeitlichen Verlauf untersucht werden. Zum anderen sollte gezeigt werden,
Abbildung 3.1 Trypanblaufärbung von WT- (links) und saul1-1-Keimlingen (rechts) zur
Untersuchung von Zelltod. Pflanzen wurden zunächst unter permissiven
Lichtbedingungen zwölf Tage lang auf MS-Festmedium angezogen und anschließend
sechs weitere Tage auf NL-Bedingungen (PFD < 25 µmol m-2s-1) kultiviert. Nach
Auftreten von deutlichen Seneszenzsymptomen wurden die Keimlinge mit Trypanblau
gefärbt. Starke Blaufärbung in Blättern von saul1-1-Mutanten zeigte deutlich
fortschreitenden Zelltod, während WT-Blätter nur leichte Färbung aufwiesen. Die
Messbalken entsprechen 250 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
25
ob durch die Expression des Markergens ORE1 auf Transkriptionsebene ein
point of no return im Seneszenzprogramm definiert werden kann.
3.1.2.1 Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf von
Seneszenzprozessen in saul1-1-Mutanten
Vorangegangene Genexpressionsanalysen in saul1-1-Pflanzen beschränkten
sich auf die Expression einzelner Seneszenzmarkergene, deren Transkriptlevel
eine Charakterisierung des auftretenden Phänotyps von saul1-1-Mutanten als
Seneszenz erlaubten (Raab et al., 2009). Das dabei verwendete
Pflanzenmaterial stammte von Pflanzen, die bereits eine deutlich ausgeprägte
Gelbfärbung der Blätter zeigten, der Seneszenzprozess also schon weit
fortgeschritten war. In dieser Arbeit sollte das Seneszenzprogramm in saul1-1-
Mutanten in einem zeitlichen Verlauf zu weitaus früheren Zeitpunkten nach dem
Umstellen der Pflanzen auf NL-Bedingungen untersucht werden. Dadurch sollte
eine genauere Auftrennung der ersten trankriptionellen Änderungen zu Beginn
der Seneszenz ermöglichet werden. Dabei wurden nicht nur die Expressionslevel
einzelner Markergene untersucht, sondern durch Microarray-Analysen
Änderungen des gesamten Transkriptoms verfolgt (Drechsel et al., 2010c).
Zu diesem Zweck wurden WT- und saul1-1-Pflanzen auf MS-0-Festmedium
ausgebracht, zwölf Tage lang unter HL-Bedingungen (PFD > 60 µmol m-2s-1)
angezogen und anschließend auf Lichtbedingungen mit niedriger PFD
(< 25 µmol m-2s-1) umgestellt. Zu den Zeitpunkten t = 0, 6, 24 und 48 h wurden
Proben zur RNA-Isolierung und anschließende RT-Reaktionen genommen (siehe
Abschnitt 5.2.3.3 und 5.2.1.7). Während zu den Zeitpunkten t = 0 h, 6 h und 24 h
keinerlei Unterschiede im Pflanzenwachstum zu erkennen waren, zeigte sich bei
t = 48 h eine leichte Gelbfärbung als Anzeichen beginnender Seneszenz
(Abbildung 3.2 A). Zur Überprüfung der erhaltenen cDNAs und der gewählten
Parameter wurden die Transkriptlevel des Seneszenzmarkergens WRKY53
bestimmt. Hierbei konnte mittels quantitativer PCR (qPCR; Material und
Methoden 5.2.1.8) bereits zum Zeitpunkt t = 24 h ein hochsignifikanter Anstieg
des WRKY53-Transkriptlevels in saul1-1-Mutanten nachgewiesen werden
(Abbildung 3.2 B), also bereits deutlich vor einem Auftreten von ersten
Seneszenzsymptomen.
Anschließend wurde dieses Material zur Durchführung von Microarray-Analysen
verwendet, um Expressionsänderungen auf Transkriptomebene zu untersuchen.
Die Durchführung der Microarray-Analysen erfolgte in Zusammenarbeit mit Dr.
Katrin Philippar und Prof. Dr. Jürgen Soll (Lehrstuhl für Biochemie und
Physiologie der Pflanzen, Ludwig-Maximilian-Universität München), die
bioinformatische Auswertung wurde von Dr. Julia Engelmann (Institut für
Ergebnisse___________________________________________________________
26
Funktionelle Genomik, Universität Regensburg) durchgeführt (siehe Material und
Methoden 5.2.1.9). Im Rahmen dieser Arbeit konnte allerdings keine vollständige
Auswertung der erhaltenen Array-Daten mehr erfolgen. In Abbildung 3.2 C sind
die Induktionsfaktoren (saul1-1/ WT) der Expression von AAO3 sowie vier
Transkriptionsfaktorgenen (WRKY53, WRKY6, NAP und ORE1), die in
vorherigen Studien als Marker für Seneszenzprozesse charakterisiert worden
waren (Robatzek und Somssich, 2002; Miao et al., 2004; Guo und Gan, 2006;
Kim et al., 2009), zusammengestellt.
Abbildung 3.2 Genexpressionsstudien zum zeitlichen Verlauf von Seneszenzprozessen
in saul1-1-Mutanten. Pflanzen wurden zwölf Tage lang auf MS-0-Festmedium unter HL-
Bedingungen angezogen und anschließend auf NL-Bedingungen umgestellt. Die
Probennahme erfolgte zu den angegebenen Zeitpunkten. A Aufnahmen der Pflanzen zu
den jeweiligen Zeitpunkten. Bei t = 0 h, t = 6 h und t = 24 h waren keinerlei
Seneszenzsymptome oder Veränderungen im Wachstumsverhalten zu erkennen, bei
t = 48 h zeigte sich in saul1-1-Keimlingen leichte Gelbfärbung der Blätter. B qPCR-
Analyse zur Expression von WRKY53 in WT- (schwarz) und saul1-1- (grau) Pflanzen aus
A. Die Expression von WRKY53 in saul1-1-Pflanzen ist 24 h nach Transfer auf NL-
Bedingungen hochsignifikant (Student’s t-test: p < 0,01; dargestellt durch **) erhöht. Für t
= 48 h konnte keine Signifikanz berechnet werden, da n = 2 für WT-Pflanzen. Für alle
übrigen Balken gilt n = 3. C Zusammenstellung der Array-Expressionsdaten für WRKY53,
WRKY6, NAP, ORE1 und AAO3. Werte stellen den Induktionsfaktor in saul1-1-Mutanten
im Vergleich zu WT-Pflanzen dar, in Klammern sind die angepassten p-Werte aufgeführt.
Die Expression von WRKY53 und AAO3 war bereits 6 h nach Umstellen der Pflanzen
signifikant erhöht (p < 0,05), nach 24 h fand deutliche Induktion der Expression von
WRKY6 und NAP statt, die Expression von ORE1 hingegen stiegt erst nach 48 h
signifikant an.
___________________________________________________________Ergebnisse
27
Hierbei zeigte sich, dass bereits sechs Stunden nach Umstellen in saul1-1-
Pflanzen eine deutliche Erhöhung der Expression von WRKY53 zu beobachten
war (Induktionsfaktor im Vergleich zu WT 1,56; p < 0,05). Auch für AAO3 konnte
ein signifikanter Anstieg der Expression in saul1-1-Mutanten nach sechs Stunden
beobachtet werden, wobei der Induktionsfaktor nur bei 1,3 lag. Nach 24 Stunden
war die Expression von WRKY53, WRKY6, NAP und AAO3 in saul1-1-Pflanzen
im Vergleich zu WT-Pflanzen deutlich gesteigert. Die Expression des
Seneszenzmarkers ORE1 hingegen stieg erst nach 48 Stunden an.
Somit konnten schon weit vor einer Ausprägung von Seneszenzsymptomen
deutliche Änderungen auf Transkriptionsebene nachgewiesen werden. Eine
detaillierte Analyse dieser Microarray-Daten könnte somit Aufschlüsse über die
ersten transkriptionellen Regulationsschritte bei Seneszenzprozessen geben.
3.1.2.2 Point of no return von Seneszenzprozessen in saul1-1-Mutanten
In einem weiteren Ansatz zu Genexpressionsstudien sollte untersucht werden, ob
auf Transkriptionsebene ein point of no return im Seneszenzprogramm von
saul1-1-Pflanzen definiert werden kann. Als genetischer Marker wurde hierbei
ORE1 gewählt, da in vorausgegangenen Studien für den Transkriptionsfaktor
ORE1 bereits eine „Schalter“-Funktion in altersabhängigen Seneszenzprozessen
beschrieben worden war (Kim et al., 2009).
WT- und saul1-1-Pflanzen wurden auf MS-Festmedium ausgebracht und elf Tage
lang unter HL-Bedingungen (PFD > 60 µmol m-2s-1) angezogen. Anschließend
wurden die Pflanzen auf NL-Bedingungen (PFD < 25 µmol m-2s-1) umgestellt und
dort weiter kultiviert. Nach fünf, acht und elf Tagen unter diesen
Lichtbedingungen wurden die Pflanzen jeweils wieder auf HL-Bedingungen
zurückgestellt und die weitere Pflanzenentwicklung sowie die Expression von
ORE1 in diesen Pflanzen durch qPCR-Analysen untersucht. Abbildung 3.3 fasst
die Ergebnisse dieser Untersuchungen zusammen.
Nachdem die Pflanzen fünf Tage lang NL-Bedingungen ausgesetzt waren,
zeigten sich in saul1-1-Pflanzen erste Anzeichen von Seneszenz, die sich
allerdings nach Umstellen auf HL-Bedingungen nicht weiter ausprägten. Ein
Fortschreiten des Seneszenzprozesses konnte somit aufgehalten werden
(Abbildung 3.3 A-C). Wurden die Pflanzen insgesamt für acht Tage unter NL-
Bedingungen kultiviert, so waren die Seneszenzsymptome von saul1-1-Pflanzen
zu Beginn der Regenerationsphase deutlich stärker ausgeprägt. Mit
zunehmender Regenerationszeit nahmen diese Symptome zwar noch zu,
allerdings war das Fortschreiten des Seneszenzprozesses deutlich verlangsamt
(Abbildung 3.3 D-F). Wenn saul1-1-Pflanzen allerdings insgesamt elf Tage lang
unter NL-Bedingungen kultiviert wurden, ließ sich der Ablauf des
Ergebnisse___________________________________________________________
28
Seneszenzprogramms nicht mehr durch Wachstum auf höheren PFD aufhalten
(Abbildung 3.3 G-I). WT-Pflanzen hingegen zeigten unter diesen
Wachstumsbedingungen keinerlei Seneszenzsymptome.
Abbildung 3.3 Untersuchungen zum point of no return während der NL-induzierten
Seneszenz in saul1-1-Pflanzen. WT und saul1-1-Pflanzen wurden unter permissiven
Lichtbedingungen auf MS-Festmedium angezogen und nach elf Tagen auf
Lichtbedingungen mit niedriger PFD umgestellt. Nach fünf (A-C), acht (D-F)
beziehungsweise elf (G-I) Tagen erfolgte ein Transfer zurück auf permissive
Lichtbedingungen. Zum Zeitpunkt des Umstellens (A, D, G) und nach sechs (B, E, H)
beziehungsweise 39 h (C, F, I) Regenerationszeit wurde aus diesem Material RNA isoliert
und die Expression des Transkriptionsfaktors ORE1 untersucht. WT-Pflanzen sind jeweils
oben, saul1-1-Mutanten unten abgebildet. J qPCR-Analyse der ORE1-Expression
während Wachstums unter NL-Bedingungen. In schwarz sind jeweils die
Expressionswerte von ORE1 in WT-Pflanzen, in grau die Werte in saul1-1-Mutanten
dargestellt. Die rote Linie definiert den WT-Expressionslevel von ORE1. Während sich in
WT-Pflanzen der Expressionslevel kaum ändert, steigt er in saul1-1-Mutanten signifikant
an. Die Messbalken entsprechen den Mittelwerten und Standardabweichungen aus drei
unabhängigen Einzelmessungen.
___________________________________________________________Ergebnisse
29
Dieses Verhalten ließ sich auch auf Expressionsebene verfolgen. Während die
Expression von ORE1 bei Wachstum auf NL-Bedingungen in saul1-1-Mutanten
zwar deutlich gegenüber der in WT-Pflanzen erhöht war, sank sie doch bei
Regeneration der Pflanzen auf HL-Bedingungen wieder auf WT-Niveau ab. Bei
Wachstum auf NL-Bedingungen für insgesamt acht Tage konnte ebenfalls ein
deutlicher Anstieg ORE1-Expressionslevels nachgewiesen werden. Nach
Umstellen der Pflanzen auf HL-Bedingungen blieb der Transkriptlevel allerdings
auch nach 39 Stunden Regenerationszeit konstant und sank nicht wieder ab.
Wurden die Pflanzen elf Tage lang NL-Bedingungen ausgesetzt, so war auch
hier ein vergleichbarer Anstieg der ORE1-Expression zu verzeichnen. Mit
fortschreitender Regenerationszeit stieg die Expression von ORE1 weiterhin
dramatisch an, das ablaufende Seneszenzprogramm ließ sich durch HL-
Bedingungen nicht aufhalten (Abbildung 3.3 J). Der point of no return schien also
hier überschritten zu sein.
3.2 Regulation der ABA-Biosynthese in saul1-Mutanten
3.2.1 Endogene ABA-Level in saul1-2-Mutanten Wie bereits gezeigt, konnte in seneszenten saul1-1-Mutanten ein drastischer
Anstieg des endogenen ABA-Levels gemessen werden (Raab et al., 2009). Es
sollte im Rahmen dieser Arbeit mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay) überprüft werden, ob auch in dem zweiten unabhängigen Allel, saul1-2,
(Abschnitt 2.3.5.1) ein solcher Anstieg nachgewiesen werden kann.
Hierfür wurden saul1-2- und WT-Pflanzen in der Kurztag-Phytokammer (KT; 8 h
Licht, 70% Luftfeuchtigkeit) 13 Tage lang auf Erde angezogen und anschließend
unter HL-Bedingungen (PFD 250 µmol m-2s-1) in der Langtag-Phytokammer (LT;
16 h Licht, 70% Luftfeuchtigkeit) kultiviert. In einem Pflanzenalter von 17 Tagen
wurde die Hälfte der Pflanzen von HL-Bedingungen auf eine PFD von
60 µmol m-2 s-1 umgestellt und dort für weitere zehn Tage kultiviert. Zu diesem
Zeitpunkt zeigten homozygote saul1-2-Pflanzen eine deutliche Gelbfärbung der
Blätter, während sowohl die jeweiligen WT-Pflanzen als auch die
Kontrollpflanzen, die weiterhin unter HL-Bedingungen wuchsen, keinerlei
Seneszenzsymptome zeigten (Abbildung 3.4).
Blattmaterial wurde geerntet, ABA extrahiert und eine ELISA-Messung mit Hilfe
des Phytodetek®-Kits von AGDIA durchgeführt (siehe Material und Methoden
5.2.4.4). In seneszenten saul1-2-Mutanten war ein deutlicher Anstieg des
endogenen ABA-Levels zu verzeichnen, die Konzentration lag dabei bei etwa
140 pmol/ g Frischgewicht und damit dreimal so hoch wie in WT-Pflanzen. In
Ergebnisse___________________________________________________________
30
saul1-2-Pflanzen, die unter HL-Bedingungen gewachsen waren, konnte hingegen
kein Anstieg des ABA-Levels gemessen werden (Abbildung 3.4). Diese
Beobachtungen stimmten mit den Ergebnissen des unabhängigen Allels saul1-1
überein (Raab et al., 2009).
3.2.2 Regulation des ABA-Biosyntheseproteins AAO3 In vorausgegangenen Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass in
seneszenten saul1-1-Mutanten im Vergleich zu identisch angezogenen WT-
Pflanzen der Proteinlevel der Arabidopsis Aldehydoxidase 3 (AAO3) sowie die
enzymatische Aktivität des gebildeten Homodimers AOδ deutlich erhöht waren
(Raab et al., 2009). AAO3 beziehungsweise das enzymatisch aktive Homodimer
AOδ katalysieren den letzten Schritt der ABA-Biosynthese, nämlich die
Umsetzung von Abszisinaldehyd zu Abszisinsäure (siehe Abschnitt 2.1.3). Der
beobachtete Anstieg in Proteinlevel und Aktivität könnte somit Ursache des
Abbildung 3.4 Bestimmung des endogenen ABA-Gehalts in saul1-2- und WT-Pflanzen
unter verschiedenen Lichtbedingungen. Pflanzen wurden zunächst unter permissiven
Lichtbedingungen angezogen und anschließend unter NL (PFD = 60 µmol m-2s-1) oder HL
(PFD = 250 µmol m-2s-1) kultiviert. Der endogene ABA-Gehalt wurde mittels ELISA
bestimmt. Es sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen
Messungen angegeben. Der ABA-Gehalt in saul1-2-Pflanzen (grau), die unter NL-
Bedingungen angezogen worden waren, war im Vergleich zu WT-Pflanzen (schwarz)
deutlich erhöht. Unter HL-Bedingungen zeigten sich keine Veränderungen im ABA-Gehalt
im Vergleich zum ABA-Gehalt in WT-Pflanzen.
___________________________________________________________Ergebnisse
31
Anstieg des endogenen ABA-Levels in saul1-Mutanten sein (Abschnitt 3.2.1 und
Raab et al., 2009).
Um den Zusammenhang zwischen dem Verlust von SAUL1 in saul1-Mutanten
und der Deregulation der AAO3 näher zu charakterisieren, wurden AAO3-
Proteinlevel und AOδ-Aktivität zum einen in saul1-1/ 35S-SAUL1-Pflanzen
(Komplementation der saul1-1-Mutantion durch Überexpression von SAUL1;
Raab et al., 2009), zum anderen in saul1-1- und WT-Pflanzen entwicklungs- und
lichtabhängig untersucht. Proteinchemische Analysen zu AOδ fanden dabei in
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Florian Bittner (Institut für
Pflanzenbiochemie, Technische Universität Braunschweig) statt. Abbildung 3.5
fasst die Ergebnisse dieser Versuche zusammen.
Zur Bestimmung der Aldehydoxidase-Aktivität in saul1-1-, WT- und saul1-1/ 35S-
SAUL1-Pflanzen wurden die Pflanzen auf MS-Festmedium unter NL-
Bedingungen angezogen, bis sich deutliche Seneszenzsymptome in saul1-1-
Keimlingen zeigten. WT- und saul1-1/ 35S-SAUL1-Pflanzen zeigten unter diesen
Wachstumsbedingungen keine Anzeichen von Seneszenz (nicht gezeigt). Das
Pflanzenmaterial wurde geerntet, Proteinextrakte gewonnen und durch native
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Der Nachweis der
Aldehydoxidase-Aktivität erfolgte durch Umsetzung der Substrate Indol-3-
Carbaldehyd und 1-Naphtaldehyd (Koshiba et al., 1996) in situ (Material und
Methoden 5.2.4.5). Bei dieser Nachweismethode zeigen sich typischerweise drei
unterschiedliche Banden, die den AO-Isoformen AOδ (Homodimer aus AAO3),
AOγ (Homodimer aus AAO2) und dem Heterodimer AAO2/ AAO3 entsprechen.
Während in saul1-1-Mutanten der beschriebene Anstieg an AOδ-Aktivität
beobachten werden konnte, zeigten saul1-1/ 35S-SAUL1-Pflanzen unter diesen
Wachstumsbedingungen WT-Aktivitätslevel (Abbildung 3.5 A). Eine
Komplementation der saul1-1-Mutation konnte also den Anstieg der AOδ-Aktivität
vollständig unterdrücken.
Des Weiteren sollte die Proteinmenge von AAO3 im Verlauf der
Keimlingsentwicklung verfolgt werden. Bei Wachstum von saul1-Mutanten auf
MS-Festmedium unter NL-Bedingungen konnte beobachtet werden, dass sich bis
zu einer Ausbildung der ersten echten Blätter in saul1-Keimlingen keine
Anzeichen der Seneszenz feststellen ließen. Erst in der weiteren Entwicklung trat
eine Gelbfärbung der Blätter auf. Es sollte untersucht werden, ob diese
Entwicklungsanhängigkeit auch auf AAO3-Proteinebene zu beobachten sei.
Hierfür wurden saul1-1- und WT-Samen auf MS-Festmedium ausgebracht, unter
NL-Bedingungen (PFD < 25 µmol m-2s-1) angezogen und in Abständen von
jeweils 2 Tagen Proben zur Proteinextraktion genommen. Die Proteinlevels der
AAO3 wurden in Westernblot-Analysen mit Hilfe von spezifischen anti-AAO3-
Ergebnisse___________________________________________________________
32
Antikörpern bestimmt. Während in einem Keimlingsalter von acht Tagen sowohl
in WT- wie auch in saul1-1-Pflanzen nahezu kein Signal des AAO3-Proteins zu
erkennen war, stiegen die Proteinlevel in den nächsten zwei Tagen deutlich an.
Der Anstieg in saul1-1-Keimlingen war allerdings stärker ausgeprägt als in WT-
Pflanzen. Dieser Unterschied in AAO3-Proteinlevel korrelierte dabei mit dem
Auftreten von ersten Seneszenzsymptomen in saul1-1-Mutanten (Abbildung 3.5
B).
Abschließend sollte untersucht werden, inwiefern das lichtabhängige
Pflanzenwachstum in saul1-1-Pflanzen mit der AOδ-Aktivität zusammenhängt.
Wie in Abschnitt 2.3.5.1 beschrieben, kann das Seneszenzverhalten von saul1-
Mutanten bei Wachstum auf Erde durch hohe PFDn (~ 250 µmol m-2s-1)
unterdrückt werden, was allerdings in einem Zwergwachstum dieser Pflanzen
resultiert. Durch Wachstum unter deutlich höheren Lichtbedingungen
(PFD = 500 µmol m-2s-1) kann allerdings die Pflanzenhöhe des WTs erreicht
werden (Raab et al., 2009). Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Aldehydoxidase-
Aktivität unter diesen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Hierfür wurden
saul1-1- und WT-Pflanzen unter HL-Bedingungen (PFD = 250 µmol m-2s-1) und
unter extremen Starklichtbedingungen (PFD = 500 µmol m-2s-1) angezogen, in
Abbildung 3.5 Bestimmung der AAO3-Proteinlevel und Aldehyoxidase-Aktivitäten in
saul1-1-Mutanten und WT-Pflanzen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen.
A Nachweis der Aldehydoxidase-Aktivität in WT-, saul1-1- und saul1-1/ 35S-SAUL1-
Pflanzen, die unter NL-Bedingungen auf MS-Festmedium angezogen worden waren.
Während in saul1-1-Mutanten ein deutlicher Anstieg an AOδ-Aktivität zu verzeichnen
war, zeigten saul1-1/ 35S-SAUL1-Pflanzen Wildtyp-Aktivitätslevel. B Zeitlicher Verlauf
des Auftretens von Seneszenzsymptomen und AAO3-Proteinleveln. In einem
Keimlingsalter von zehn Tagen konnte erstmals deutlich AAO3-Protein detektiert werden,
allerdings kam es in saul1-1-Mutanten zu einem höheren Anstieg, der mit dem Auftreten
von Seneszenzsymptomen einherging. C AOδ-Aktivität in saul1-1- und WT-Pflanzen, die
unter HL- und extremen Starklichtbedingungen angezogen worden waren. Unter
Starklichtbedingungen (PFD = 500 µmol m-2s-1) zeigten sich keine Unterschiede
zwischen saul1-1- und WT-Pflanzen, während bei Lichtbedingungen von 250 µmol m-2s-1
ein Anstieg an AOδ-Aktivität in saul1-1-Pflanzen zu verzeichnen war.
___________________________________________________________Ergebnisse
33
einem Pflanzenalter von fünf Wochen Pflanzenmaterial genommen und eine
AOδ-Aktivitätsfärbung durchgeführt. Betrachtet man die Aktivität der AOδ, so war
unter Starklichtbedingungen (PFD = 500 µmol m-2s-1) kein Unterschied in der
enzymatischen Aktivität zwischen saul1-1- und WT-Pflanzen zu erkennen. Bei
Wachstum unter HL-Bedingungen lag hingegen eine gesteigerte AOδ-Aktivität in
saul1-1-Pflanzen vor (Abbildung 3.5 C).
Das Auftreten der beschriebenen Phänotypen von saul1-1-Mutanten korrelierte
also stets mit einem erhöhten AAO3-Proteinlevel sowie einem Anstieg der AOδ-
Aktivität. Darüber hinaus konnte der Anstieg der AOδ-Aktivität durch
Komplementation der saul1-1-Mutante unterdrückt werden.
3.2.3 Interaktion zwischen SAUL1 und AAO3 Die erhöhten Protein- und Aktivitätslevel der AAO3 und der daraus resultierende
Anstieg des endogenen ABA-Gehalts wiesen auf ein direktes Zusammenspiel
von SAUL1 und AAO3 hin. Um zu überprüfen, ob eine Interaktion dieser beiden
Proteine stattfindet und somit möglicherweise AAO3 ein erstes Zielprotein für
eine SAUL1-vermittelte Markierung mit Ubiquitin darstellt, sollten
Interaktionsstudien durchgeführt werden. Hierfür wurden zunächst 6xHis-
Fusionen von SAUL1- und AAO3-Protein in E.coli-Zellen synthetisiert und mittels
Ni2+-Affinitätschromatographie gereinigt (Material und Methoden 5.2.4.9) Diese
Arbeiten wurden in der Arbeitsgruppe von Dr. Florian Bittner an der Technischen
Universität Braunschweig durchgeführt. Die gereinigten Proteine wurden für
verschiedene Interaktionsstudien verwendet.
Durchgeführte native Gel-Retardations- und Präzipitations-Versuche sowie ein
direkter Ubiquitinylierungsassay mit AAO3 als Zielprotein der Ubiquitinylierung
blieben ohne Ergebnis (nicht gezeigt). Alle diese Studien setzen allerdings eine
stabile Proteinkomplexbildung voraus. Deshalb wurde ein weiterer Versuch
durchgeführt, mit dessen Hilfe auch transiente Interaktionen von Proteinen
nachgewiesen werden können. Hierbei handelt es sich um einen so genannten
Label-Transfer (Layer et al., 2007). Im Laufe dieses Versuchs wird zunächst der
trifunktionale Marker Mts-Atf-Biotin (2-[N2-(Y-azido-2,3,5,6-tetrafluoro-benzoyl)-
N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]-Ethylmethanthiosulfonat) an eines der
beiden zu untersuchenden Proteine angehängt und das so markierte Protein
gemeinsam mit dem putativen Interaktionspartner inkubiert. Kommen die beiden
Proteine durch Interaktion in enge räumliche Nähe, so wird der trifunktionale
Marker auf das zweite Protein übertragen und ist in einem anschließenden
Immunoblot über das angehängte Biotin nachweisbar. In diesem Versuch wurde
das AAO3-Protein mit dem Mts-Atf-Biotin-Marker versehen und untersucht, ob
nach Inkubation von AAO3 und SAUL1 eine Markierung des SAUL1-Proteins
Ergebnisse___________________________________________________________
34
nachweisbar war. In Abbildung 3.6 sind die Ergebnisse eines Immunoblots, der
mit NeutrAvidin™ (Pierce) zum Nachweis von Biotin durchgeführt wurde (links;
Material und Methoden 5.2.4.6), beziehungsweise dem zugehörigen mit
Coomassie-gefärbten PAA-Gels (rechts) dargestellt. In der linken Spur war
deutlich die Mts-Atf-Biotin-Markierung des AAO3-Proteins (erwartetes
Molekulargewicht MW: 147,5 kDa) und einiger niedermolekularer Bruchstücke zu
erkennen, das SAUL1-Protein (rechte Spur; MW: 89,2 kDa) zeigte keinerlei
Markierung. Inkubierte man allerdings die beiden Proteine miteinander (mittlere
Spur), so ergab sich eine weitere deutliche Bande, die einem Molekulargewicht
von etwa 75 kDa entsprach. Bei Vergleich mit dem Coomassie-gefärbten PAA-
Gel (Abbildung 3.6 rechts) war deutlich erkennbar, dass die erhaltene
Proteinbande auf gleicher Höhe wie SAUL1 detektiert wurde, es sich somit um
markiertes SAUL1-Protein handelte. Es hatte also eine Übertragung des Markers
von AAO3 auf SAUL1 und somit zumindest eine transiente Interaktion dieser
beiden Proteine stattgefunden.
3.2.4 ABA und Seneszenz In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass in seneszierenden
Pflanzen ein erhöhter endogener ABA-Level vorliegt (Gepstein und Thimann,
1980). Ob allerdings dieser erhöhte ABA-Level ausreichend ist, um Seneszenz
Abbildung 3.6 Transiente Interaktion zwischen SAUL1 und AAO3. Das Label-Transfer-
Experiment wurde entsprechend Layer et al., 2007 durchgeführt, wobei AAO3 durch Mts-
Atf-Biotin markiert wurde. Mittels Westernblot-Analyse wurde auf eine transiente
Interaktion zwischen AAO3 und SAUL1 und somit eine Übertragung der Markierung auf
SAUL1 getestet. Westernblot unter Verwendung eines NeutrAvidin™-POD-Konjugats zur
Detektion des Mts-Atf-Biotin-Markers (links). Für markiertes AAO3-Protein alleine zeigen
sich neben der Volllängenbande bei 147,5 kDa kleinere Proteinbanden, die vermutlich
Abbauprodukten von AAO3 entsprechen. Darüber hinaus tritt bei Inkubation mit SAUL1
eine zusätzliche Bande auf (Pfeil), die in keiner der anderen Spuren zu detektieren war.
Im Vergleich mit einem Coomassie-gefärbten PAA-Gel (rechts) zeigte sich, dass diese
Bande in ihrer Größe His-SAUL1 entsprach (MW: 89,2 kDa).
___________________________________________________________Ergebnisse
35
zu vermitteln, konnte noch nicht gezeigt werden. Um dies näher zu untersuchen,
wurden verschiedene ABA-Signaltransduktionsmutanten auf ihr
Seneszenzverhalten hin untersucht. Des Weiteren wurden homozygote saul1-
1abi1-1 Doppel-Mutanten generiert, die neben einer homozygot vorliegenden T-
DNA-Insertion in SAUL1 eine loss-of-function-Mutation in dem
Proteinphosphatasegen ABI1 tragen. Mit Hilfe dieser Doppel-Mutanten sollte der
Einfluss einer gestörten ABA-Signaltransduktion auf die Seneszenzentwicklung
von saul1-Mutanten untersucht werden.
3.2.4.1 Seneszenzverhalten von ABA-Signaltransduktionsmutanten
Um den Einfluss von ABA auf das Seneszenzverhalten von Arabidopsis zu
untersuchen, wurden gut charakterisierte Arabidopsis-Mutanten mit veränderter
ABA-Toleranz täglich mit ABA-haltiger Lösung besprüht, um dadurch Seneszenz
zu induzieren. In zwei getrennten Versuchsansätzen wurden hierbei zum einen
die beiden ABA-insensitiven Mutanten abi1-1 und abi1-2 sowie der WT
Landsberg erecta (LE, genetischer Hintergrund dieser Mutanten), zum anderen
die ABA-hypersensitive Mutante era1-3 und der zugehörige WT Columbia-0 (Col-
0) verwendet (Koornneef et al., 1984; Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994;
Cutler et al., 1996; Leung et al., 1997; Rodriguez et al., 1998). Sollte die ABA-
Signaltransduktion einen Einfluss auf Beginn und Fortschritt der Seneszenz
haben, so sollten diese ABA-Signaltransduktions-Mutanten ein verändertes
Seneszenzverhalten zeigen.
Alle Pflanzen wurden unter KT-Bedingungen angezogen, ab einem Pflanzenalter
von sechs (LE-, abi1-1 und abi2-1) beziehungsweise vier (Col-0 und era1-3)
Wochen täglich mit ABA-haltiger Lösung (50 µM) beziehungsweise einer
Kontrolllösung (methanolhaltig, da ABA in Methanol gelöst wurde) besprüht und
der Seneszenzverlauf untersucht. Generell war in allen Pflanzen, die längere Zeit
mit ABA-haltiger Lösung besprüht worden waren, eine deutliche Reduktion des
Pflanzenwachstums festzustellen.
In LE-WT-Pflanzen traten zusätzlich dazu nach etwa zehn Tagen
Behandlungsdauer die ersten deutlichen Seneszenzsymptome auf, während in
den ABA-insensitiven Mutanten abi1-1 und abi2-1 noch keinerlei Gelbfärbung der
Blätter zu beobachten war (Abbildung 3.7 A). Die ABA-hypersensitive Mutante
era1-3 zeigte bereits nach einer Behandlungsdauer von nur drei Tagen eine
deutliche Gelbfärbung der Blätter, Col-0-Pflanzen hingegen waren zu diesem
Zeitpunkt noch vollständig grün (Abbildung 3.7 B).
Ergebnisse___________________________________________________________
36
3.2.4.2 Seneszenzverhalten von saul1-Mutanten und ABA-Signaltrans-
duktion
Wie bereits beschrieben, konnte in saul1-Mutanten ein erhöhter ABA-Level
gemessen werden (Raab et al., 2009 und Abbildung 3.4). Des Weiteren ist ABA
ausreichend, um Seneszenz in Arabidopsis-Pflanzen auszulösen (Abschnitt
3.2.4.1). Um abschließend zu zeigen, dass ABA tatsächlich notwendig für das
Seneszenzverhalten von saul1-Mutanten ist, wurden saul1-1 abi1-1-
Doppelmutanten generiert. Diese Doppelmutanten sollten dementsprechend bei
Wachstum unter niedrigen Lichtbedingungen keine Seneszenzsymptome mehr
zeigen.
Homozygote saul1-1-Mutanten wurden unter Starklichtbedingungen angezogen
und mit abi1-1-Mutanten gekreuzt. Die Samen der daraus resultierenden T2-
Generation wurden auf MS-Festmedium ausgebracht und unter nichtpermissiven
Lichtbedingungen angezogen. Die Genotypen der jeweiligen Pflanzen wurden
mittels PCR (für saul1-1: Raab et al., 2009) und anschließendem
Restriktionsverdau überprüft. Hilfreich war dabei eine Schnittstelle für das
Restriktionsenzym NcoI, die durch die Punktmutation in abi1-1-Mutanten zerstört
wurde (Leung et al., 1997).
Abbildung 3.7 Seneszenzverhalten von ABA-insensitiven und ABA-hypensensitiven
Arabidopsis-Mutanten. Um Seneszenz zu induzieren, wurden alle Pflanzen täglich mit
ABA-haltiger Lösung (50 µM Endkonzentration) beziehungsweise einer Kontrolllösung
besprüht. A Behandlung der ABA-insensitiven Mutanten abi1-1 und abi2-1 und des
zugehörigen Wildtyps Landberg erecta (LE). Nach zehn Tagen zeigten LE-Pflanzen
deutliche Seneszenzsymptome (Pfeile), während die Blätter von abi1-1- und abi2-1-
Mutanten noch vollständig grün waren. B Besprühen der ABA-hypersensitiven Mutante
era1-3 und des Wildtyps Col-0. Bereits bei drei Tagen Behandlungsdauer kam es in
era1-3-Mutanten zu einer Gelbfärbung der Blätter (Pfeile), während der zugehörige WT
noch keinerlei Anzeichen von Seneszenz zeigte.
___________________________________________________________Ergebnisse
37
Es zeigten sich deutliche Unterschiede im Seneszenzverhalten von saul1-1-,
saul1-1abi1-1- und WT-Pflanzen. Während WT-Pflanzen sich normal
entwickelten, zeigten saul1-1-Mutanten im Alter von zwölf Tagen eine deutliche
Gelbfärbung. Homozygote saul1-1 abi1-1-Mutanten hingegen bildeten einen
intermediären Phänotyp aus. Sie waren zwar in ihrer Entwicklung hinter WT-
Pflanzen zurück, zeigten aber keine Seneszenzsymptome (Abbildung 3.8). Eine
Störung der ABA-Signaltransduktion (durch Einführen der abi1-Mutation) war
also ausreichend, um den Seneszenzphänotyp von saul1-Mutanten zu
komplementieren.
3.3 Phänotypische Analysen von saul1-1 Pflanzen Um die physiologische Funktion von SAUL1 näher zu untersuchen, wurden T-
DNA-Insertionslinien dieses Gens untersucht. Wie bereits beschrieben zeigt sich
für zwei unabhängige Allele von saul1-Mutanten ein verfrühtes, lichtabhängiges
Seneszenzverhalten (Abschnitt 3.1, Raab et al., 2009). Seneszenzsymptome, die
unter NL-Bedingungen (PFD < 600 µmol m-2s-1) auftreten, können allerdings
durch höhere Lichtintensitäten (PFD > 80 µmol m-2s-1 auf MS-Festmedium
beziehungsweise > 200 µmol m-2s-1 bei Anzucht auf Erde) vollständig unterdrückt
werden. saul1-Pflanzen entwickeln sich hierbei bis zur Samenreife, bleiben
allerdings in ihrem Wachstum deutlich hinter WT-Pflanzen zurück. Bei Anzucht
unter noch höheren Lichtbedingungen (PFD > 400 µmol m-2s-1) wird dieser Effekt
jedoch unterdrückt und saul1-1 Pflanzen erreichen dieselbe Höhe wie WT-
Pflanzen.
Während das Seneszenzverhalten von saul1-Mutanten bereits eingehend
untersucht wurde (Raab et al., 2009), sollten im Rahmen dieser Arbeit das
auftretende Zwergwachstum von saul1-Pflanzen beziehungsweise das
Wachstumsverhalten unter verschiedenen Stressbedingungen näher untersucht
werden.
Abbildung 3.8 Seneszenzverhalten von saul1-1, saul1-1 abi1-1- und WT-Keimlingen bei
Wachstum unter NL-Bedingungen. Das Pflanzenalter betrug 12 Tage. saul1-1-Keimlinge
zeigten deutliche Gelbfärbung der Blätter, während WT-Pflanzen keinerlei
Seneszenzsymptome aufwiesen. saul1-1 abi1-1-Doppelmutanten zeigten einen
intermediären Phänotyp. Es kam also zu einer Unterdrückung des Seneszenzverhaltens,
allerdings blieben die saul1-1 abi1-1-Keimlinge in ihrer Entwicklung hinter WT-Pflanzen
zurück.
Ergebnisse___________________________________________________________
38
3.3.1 Zwergwachstum von saul1-1 Pflanzen
T-DNA-Insertionslinien für SAUL1 zeigen neben dem Seneszenzphänotyp auch
ein lichtabhängiges Zwergwachstum (Raab et al., 2009). So bleiben saul1-1
Mutanten unter permissiven Lichtbedingungen (PFD ~ 200 µmol m-2s-1) deutlich
in ihrem Wachstum hinter dem von WT-Pflanzen zurück. Um dieses
Zwergwachstum näher zu charakterisieren, wurden verschiedene
Wachstumstests durchgeführt.
Zunächst wurden einzelne Parameter des Pflanzenwachstums vermessen. So
wurden neben der Pflanzenhöhe auch Rosettendurchmesser, Internodienlänge,
Schotenanzahl und Schotenlänge bestimmt. Für alle untersuchten Parameter
konnte ein signifikanter Unterschied zwischen saul1-1- und WT-Pflanzen
festgestellt werden (Abbildung 3.9 A-C und nicht gezeigt). Das Zwergwachstum
war dabei bereits sehr früh in der pflanzlichen Entwicklung zu beobachten. So lag
bereits bei einem Pflanzenalter von unter vier Wochen ein signifikant reduzierter
Rosettendurchmesser der saul1-1- Pflanzen vor (Abbildung 3.9 B).
Dieses Zwergwachstum könnte zum einen von einer verminderten
Zellteilungsrate und damit einer reduzierten Zellzahl in saul1-1-Pflanzen, zum
anderen von verminderter Zellstreckung herrühren. Um diese Frage zu klären,
wurden mit Hilfe des Vibratoms Stängelquerschnitte von saul1-1- und WT-
Pflanzen angefertigt und mittels der FCA-Färbemethode (Fuchsin-Chrysoidin-
Astrablau) gefärbt, um einzelne Gewebe leichter unterscheiden zu können
(Abbildung 3.9 D und E; Material und Methoden 5.2.3.7). Betrachtete man
Stängelquerschnitte von zwergwüchsigen saul1-1- und WT-Pflanzen im
Vergleich, so waren keine Unterschiede in der Zellzahl festzustellen, lediglich die
Zellgröße war in saul1-1-Pflanzen reduziert. Das Zwergwachstum ist also
vermutlich auf eine Reduktion der Zellstreckung zurückzuführen.
Abschließend sollte untersucht werden, ob dieses Zwergwachstum
möglicherweise mit vermindertem endogenen Gibberelinsäuregehalt (GA) zu tun
haben könnte. Für Arabidopsis-Mutanten mit Defekten in der GA-Biosynthese ist
bekannt, dass deren Keimungs- und Wachstumsdefizit durch exogene Zugabe
von GA3 komplementiert werden kann (Beispiel ga1-Mutanten, Wilson et al.,
1992). Daher wurden saul1-1- und WT-Pflanzen, die unter PFD von
250 µmol m-2s-1 angezogen worden waren, ab einem Pflanzenalter von drei
Wochen weitere 14 Tage lang mit GA3-haltiger Lösung verschiedener
Konzentrationen besprüht. Die exogene Zugabe von GA3 hatte allerdings
keinerlei Einfluss auf die Pflanzenhöhe von saul1-1-Mutanten (Abbildung 3.9 F
und G).
___________________________________________________________Ergebnisse
39
Abbildung 3.9 Zwergwachstumsphänotyp der saul1-1 Pflanzen. Pflanzen wurden neun
Tage unter KT-Bedingungen angezogen und anschließend im LT bei 180 µmol m-2s-1
kultiviert. Soweit nichts anderes angegeben erfolgte die Auswertung in einem
Pflanzenalter von fünf Wochen. A-C Auswertung der Pflanzenhöhe (A), des
Rosettendurchmessers (B) und der Schotenlänge (C) von saul1-1- (graue Balken) und
WT-Pflanzen (schwarze Balken). In allen untersuchten Parametern zeigte sich eine
signifikante Reduktion des Pflanzenwachstums von saul1-1-Mutanten. Die Balken
entsprechen dem Mittelwert aus fünf Einzelpflanzen (in A), 15 Einzelpflanzen (in B)
beziehungsweise 60 einzelnen Schoten (in C). Für alle Messungen gilt p < 0,05
(student’s t-test). D+E FCA-Färbung von saul1-1- (D) und WT- (E) Stängel-
Querschnitten. saul1-1-Mutanten zeigten keine Veränderung der Zellzahl im Vergleich zu
WT-Pflanzen. Die Messbalken entsprechen jeweils 200 µm. F+G GA3-Behandlung von
saul1-1- und WT-Pflanzen. Pflanzen wurden täglich mit GA3-haltigen Lösungen besprüht
und nach zwei Wochen die Pflanzenhöhe ausgewertet. Eine Behandlung mit GA3-haltiger
Lösung hatte keinen Einfluss auf die Pflanzenhöhe. F Aufnahmen von saul1-1- und WT-
Pflanzen ohne (links) beziehungsweise mit (rechts) GA3-Behandlung. G Statistische
Auswertung der Pflanzenhöhen von saul1-1- und WT-Pflanzen, die nicht
beziehungsweise mit 10 µM, 100 µM GA3 oder einer ethanolhaltigen Kontrolllösung
besprüht wurden (n=6).
Ergebnisse___________________________________________________________
40
3.3.2 Wachstum von saul1-Mutanten unter verschiedenen Stressbedingungen
Wie bereits beschrieben, reguliert SAUL1 möglicherweise durch Interaktion mit
der Aldehydoxidase3 (AAO3) den endogenen ABA-Level in Arabidopsis
(Abschnitt 3.2). Bei Fehlen von SAUL1 findet keine Regulation des AAO3-
Proteinlevels unter NL-Bedingungen mehr statt und somit kommt es zu einer
übermäßigen Produktion von ABA, welche in verfrühter Seneszenz resultiert. Um
zu überprüfen, ob eine solche mangelnde Regulation der ABA-Biosynthese auch
unter anderen Wachstumsbedingungen auftritt, wurden verschiedene
phänotypische Analysen unter Stressbedingungen durchgeführt. Es wurden
dabei Bedingungen ausgewählt, von denen bekannt ist, dass Arabidopsis mit
einer Stimulation der ABA-Biosynthese reagiert, wie Trocken-, Salz- und
osmotischem Stress.
3.3.2.1 Keimungsverhalten von saul1-1-Pflanzen
Das Keimungsverhalten von Arabidopsis-Samen ist ein genetisch und hormonell
streng regulierter Prozess, in dessen Verlauf vor allem ABA eine wichtige Rolle
spielt. Während des Keimungsvorganges sinkt der endogene ABA-Level ab, was
dem Samen ein Auskeimen ermöglicht. Durch exogene Zugabe von ABA kann
die Keimung verhindert werden. Des Weiteren wird unter ungünstigen
Umweltbedingungen der endogene ABA-Spiegel hochreguliert, sodass hier eine
Keimung unterdrückt wird.
Um zu untersuchen, ob saul1-1-Mutanten im Vergleich zu WT-Samen ein
verändertes Keimungsverhalten zeigen, wurden jeweils 80 Samen von saul1-1-
und WT-Pflanzen auf MS-Festmedien ausgebracht, die 1 µm ABA, 100 mM NaCl
oder 400 mM Mannit als Osmotikum enthielten. Nach Stratifizierung der Samen
für drei Tage bei 4°C erfolgte die Keimung unter LT-Bedingungen in der
Phytokammer. Die Keimungsrate wurde zweimal täglich bestimmt. In Abbildung
3.10 sind die Ergebnisse von vier beziehungsweise sechs unabhängigen
Versuchen dargestellt. WT- und saul1-1-Samen zeigten unter
Kontrollbedingungen keine Unterschiede in ihrem Wachstumsverhalten. Das
lässt darauf schließen, dass die endogenen ABA-Level unter
Normalbedingungen gleich sind (Abbildung 3.10 A). Wurde man das MS-
Festmedium mit 1 µM ABA versetzt, so konnte generell eine Reduktion der
Keimungsrate beobachtet werden. Es zeigten sich aber keine signifikanten
Unterschiede im Keimungsverhalten zwischen saul1-1- und WT-Samen
(Abbildung 3.10 B). Beobachtete man dahingegen das Keimungsverhalten in
Gegenwart verschiedener Stressbedingungen (Zusatz von NaCl und Mannit) so
___________________________________________________________Ergebnisse
41
zeigten saul1-1-Samen eine deutliche Reduktion der Keimungsrate im Vergleich
zu WT-Samen.
Bei Keimung auf MS-Festmedium mit 100 mM NaCl zeigten saul1-1-Samen im
Zeitraum zwischen 24 und 48 h eine signifikante Reduktion der Keimungsrate
(Abbildung 3.10 C). Auf MS-Festmedium mit Zusatz von 400 mM Mannit traten
diese Unterschiede im Keimungsverhalten noch deutlicher hervor. So lag
beispielsweise 84 h nach Beginn der Keimung die Keimungsrate von WT-Samen
bei 96%, die von saul1-1-Samen hingegen nur bei 40% (Abbildung 3.10 D).
3.3.2.2 Wachstum von saul1-1-Mutanten unter Stressbedingungen
Neben den bereits beschriebenen Effekten ist auch bekannt, dass ABA einen
hemmenden Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Arabidopsis-Pflanzen hat.
Deshalb sollte das Wachstum beziehungsweise das Stressverhalten von saul1-1-
Abbildung 3.10 Keimungsverhalten von saul1-1- und WT-Samen unter
unterschiedlichen Stressbedingungen. Die Keimungsrate wurde ab Umstellen der Platten
ins Licht zweimal täglich bestimmt. A Keimungsverhalten von saul1-1- und WT-Samen
auf MS-Medium. Es zeigten sich keinerlei Unterschiede. B-D Vergleich der
Keimungsraten auf MS-Medium mit 1 µM ABA (B), 100 mM NaCl (C) und 400 mM Mannit
(D). saul1-1-Samen keimten in Anwesenheit von ABA vergleichbar zu WT-Samen (B).
Die Keimungsraten unter Stressbedingungen hingegen waren in saul1-1-Mutanten im
Vergleich zu WT-Samen signifikant reduziert (C und D).
Die Keimungsrate von WT-Pflanzen ist in schwarz, die von saul1-1-Samen in grau
dargestellt. Die Graphen entsprechen den Mittelwerten aus vier (A, C und D)
beziehungsweise sechs (B) unabhängigen Einzelmessungen und zugehörigen
Standardabweichungen.
Ergebnisse___________________________________________________________
42
Pflanzen unter verschiedenen Umweltbedingungen untersucht werden. WT- und
saul1-1-Keimlinge wurden dazu zunächst auf MS-Festmedium ohne Zusätze für
fünf Tage angezogen und anschließend auf MS-Medium mit verschiedenen
Konzentrationen an ABA (10 und 50 µM), NaCl (50, 100 und 200 mM) und
Mannit (100, 200 und 400 mM) umgesetzt. Das Wachstum erfolgte stets unter
Lichtbedingungen von mindestens 80 µmol m-2 s-1, um eine Ausprägung des
Seneszenzphänotyps unter niedriger PFD zu unterdrücken. Nach 24 Stunden
wurden die Platten senkrecht aufgestellt, um ein Wachstum der Wurzeln besser
auswerten zu können. Die Pflanzen wurden zehn Tage lang phänotypisch
beobachtet und schließlich die Wurzellänge als Maß für das Pflanzenwachstum
bestimmt.
In Abbildung 3.11 A ist sind Aufnahmen von saul1-1- und WT-Pflanzen auf MS-
Festmedium ohne Zusatz, 50 mM NaCl, 50 µM ABA und 100 mM Mannit
zusammengestellt. WT- und saul1-1-Pflanzen zeigten unter Salz-
beziehungsweise osmotischen Stress ein reduziertes Wachstum, auf MS-
Abbildung 3.11 Wachstumsverhalten von saul1-1- und WT-Pflanzen auf MS-
Festmedium und unter verschiedenen Stressbedingungen. A Wurzelwachstum von WT-
und saul1-1-Pflanzen bei Wachstum auf MS-Festmedium, MS mit 50 mM NaCl, 50 µM
ABA und 100 mM Mannit. Die Messbalken entsprechen 10 mm. B Statistische
Auswertung der Wurzellängen aus A. Die Wurzellängen von saul1-1-Pflanzen (graue
Balken) waren im Vergleich zu WT-Keimlingen (schwarze Balken) sowohl unter Normal-
als auch unter Stressbedingungen (50 mM NaCl, 50 µM ABA und 100 mM Mannit) nicht
verändert. Der Graph entspricht den Mittelwerten und Standardabweichungen aus n = 9
für MS, n = 14 für NaCl, n = 15 für ABA und n = 8 für Mannit. C Wachstum von saul1-1-
und WT-Pflanzen auf MS-Festmedium mit 100 mM NaCl beziehungsweise 200 mM
Mannit. Es trat eine deutliche Gelbfärbung von saul1-1-Blättern unter diesen
Stressbedingungen auf.
___________________________________________________________Ergebnisse
43
Festmedium mit 50 µM ABA eine deutliche Gelbfärbung der Blätter. Allerdings
entwickelten sich hierbei alle Pflanzen identisch, es traten keine Unterschiede
zwischen saul1-1- und WT-Pflanzen auf.
Bei statistischer Auswertung der zugehörigen Wurzellängen waren bei keiner der
gewählten Wachstumsbedingungen Unterschiede zwischen saul1-1- und WT-
Pflanzen festzustellen (Abbildung 3.11 B). Eine Erhöhung der Konzentrationen
an NaCl und Mannit führte bei saul1-1-Pflanzen zu einer deutlichen Gelbfärbung
der Blätter und Einstellen des Wachstums. Bei WT-Pflanzen zeigte sich dieser
Effekt nicht (Abbildung 3.11 C). Die auftretenden phänotypischen Veränderungen
von saul1-1-Pflanzen auf 100 mM NaCl und 200 mM Mannit erinnerten hierbei an
die Seneszenzsymptome bei Wachstum von saul1-1-Mutanten unter NL-
Bedingungen.
3.3.2.3 Verhalten von saul1-Mutanten unter Trockenstress
Um das Verhalten von saul1-Mutanten unter Trockenstressbedingungen zu
testen wurden zunächst saul1-1, saul1-2- und zugehörige WT-Pflanzen für zwei
Wochen unter Kurztagbedingungen angezogen (PFD ~80 µmol m-2 s-1),
anschließend vereinzelt und unter Langtag- und Hochlichtbedingungen
(PFD = 270 µmol m-2 s-1) kultiviert. In einem Pflanzenalter von fünf Wochen
wurde das Gießen der Pflanzen für sechs Tage eingestellt, um
Trockenstressbedingungen zu schaffen. Anschließend wurden die Pflanzen
wieder gewässert, um eine Regeneration zu ermöglichen. In Abbildung 3.12 sind
die Aufnahmen von saul1-1-, saul1-2- und WT-Pflanzen zu den jeweiligen
Zeitpunkten dargestellt. Bei Anzucht unter den gewählten
Wachstumsbedingungen konnte ein Ausbilden von Seneszenzsymptomen in
saul1-Pflanzen unterdrückt werden, allerdings zeigten diese Pflanzen leichte
Wachstumsdefizite gegenüber WT-Pflanzen (Abbildung 3.12 oben). Nach sechs
Tagen Trockenheit war deutlich zu erkennen, dass WT-Pflanzen unter
Trockenstress leiden. Die Blätter dieser Pflanzen waren ausgetrocknet und welk.
Die Blätter von saul1-Mutanten dagegen waren deutlich turgeszenter und grüner,
allerdings zeigten sich an den Blattspitzen deutliche Seneszenzsymptome, die an
den beschriebenen saul1-Phänotyp unter niedrigen Lichtintensitäten erinnerten.
Nach zehn Tagen Regenerationszeit waren WT-Pflanzen nahezu abgestorben,
saul1-Pflanzen überlebten diese Trockenstressbehandlung.
saul1-Mutanten wiesen also eine deutlich erhöhte Trockentoleranz auf, was
möglicherweise auf eine verstärkte ABA-Biosynthese und somit einer
verbesserten Regulation des Wasserhaushalts zurückzuführen sein könnte.
Messungen des endogenen ABA-Gehalts sowie eine Bestimmung des AAO3-
Proteinlevels stehen allerdings noch aus.
Ergebnisse___________________________________________________________
44
3.3.3 Pigmentgehalt von saul1-1-Mutanten Wie bereits in Raab et al., 2009 gezeigt nimmt der Gesamt-Chlorophyllgehalt von
saul1-1-Mutanten mit sinkender Lichtintensität ab, was als deutliches Zeichen der
voranschreitenden Seneszenz betrachtet werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit
sollte darüber hinaus der Chlorophyllgehalt mittels HPLC-Analyse kinetisch
aufgeschlüsselt werden. Zusätzlich wurde auch der Gehalt an weiteren
Pigmenten ermittelt. Es wurden die Mengen der Carotinoide Lutein und β-Carotin
sowie von Neoxanthin, Violaxanthin und Antheraxanthin ermittelt. Die letzten drei
wurden vor allem deshalb ausgewählt, weil es sich hierbei um Zwischenstufen
der ABA-Biosynthese handelt (siehe Abschnitt 2.1.3).
Abbildung 3.12 Wachstum von saul1- und WT-Pflanzen unter Hochlicht- und
Trockenstressbedingungen. Pflanzen wurden zunächst 5 Wochen lang unter permissiven
Lichtbedingungen (> 200 µmol m-2 s-1) angezogen, wobei saul1-Pflanzen keine
Seneszenzanzeichen entwickelten, in ihrem Wachstum aber etwas zurückblieben (Bild
oben). Nachdem das Gießen anschließend für 6 Tage eingestellt worden war, zeigten
WT-Pflanzen starke Anzeichen von Austrocknung, während die Blätter von saul1-
Mutanten deutlich turgeszenzter blieben (Bildmitte). An den Blattspitzen zeigten sich
jedoch erste Anzeichen von Seneszenz. Nach weiteren zehn Tagen Regenerationszeit
waren WT-Pflanzen vollständig abgestorben, saul1-Pflanzen hingegen überlebten diese
Trockenstressbehandlung (Bild unten).
___________________________________________________________Ergebnisse
45
Samen von saul1-1-Mutanten und WT-Pflanzen wurden auf MS-Festmedium
ausgesät und nach Stratifizierung unter unterschiedlichen Lichtbedingungen
(HL ~ 80 µmol m-2 s-1, NL ~ 20 µmol m-2 s-1) angezogen. 12, 15 beziehungsweise
20 Tage nach Keimung wurden jeweils Proben genommen und die Pigmente
entsprechend Anleitung extrahiert (siehe Material und Methoden 5.2.3.9). Die
Bestimmung der Pigmentgehalte erfolgte in Zusammenarbeit mit Peter Jahns
Abbildung 3.13 Bestimmung der Pigmentzusammensetzung in saul1-1- und WT-
Keimlingen in Abhängigkeit des Pflanzenalters. saul1-1- und WT-Pflanzen wurden jeweils
zwölf (A+D), 15 (B+E) und 20 (C+F) Tage unter HL- (~80 µmol m-2 s-1) beziehungsweise
unter NL- (~20 µmol m-2 s-1) Bedingungen kultiviert. Die Pigmentgehalte in nmol/ g FW
wurden mittels HPLC-Analyse bestimmt und statistisch ausgewertet (WT: schwarz;
saul1-1: grau). Die jeweiligen Pflanzenbilder sind oberhalb der zugehörigen Graphen
abgebildet (WT-Keimlinge links, saul1-1-Pflanzen rechts). A-C Bestimmung der
Pigmentgehalte von saul1-1- und WT-Pflanzen bei Anzucht unter HL-Bedingungen. Auch
mit zunehmendem Pflanzenalter zeigten sich keinerlei Unterschiede im Pigmentgehalt
zwischen saul1-1-Mutanten und WT-Pflanzen. D-E Pigmentgehalte bei Wachstum unter
NL-Bedingungen. Ab einem Pflanzenalter von 15 Tagen zeigte sich eine deutliche
Reduktion im Pigmentgehalt von saul1-1-Mutanten.
Die Messbalken entsprechen den Mittelwerten und Standardabweichungen aus drei
unabhängigen Einzelmessungen; student’s t-test: p < 0,05 dargestellt durch *; p < 0,01
dargestellt durch **.
Ergebnisse___________________________________________________________
46
(Institut für Biochemie der Pflanzen, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf). In
Abbildung 3.13 sind die Ergebnisse der HPLC-Analysen zusammengefasst. Bei
Wachstum unter HL-Bedingungen konnten mit fortschreitendem Pflanzenalter
keinerlei Unterschiede im Pigmentgehalt zwischen saul1-1- und WT-Keimlingen
festgestellt werden (Abbildung 3.13 A-C). Unter NL-Bedingungen hingegen
zeigten sich mit fortschreitender Seneszenz deutliche Unterschiede im
Pigmentgehalt von saul1-1-Mutanten und WT-Pflanzen. Während sich nach zwölf
Tagen unter NL-Bedingungen noch keinerlei Abweichungen zeigten, war zum
Zeitpunkt 15 Tage deutlich festzustellen, dass der Pigmentgehalt in saul1-1-
Keimlingen für alle untersuchten Pigmente außer Antheraxanthin signifikant
reduziert ist (Abbildung 3.13 D bzw. E). Mit fortschreitendem Seneszenzprozess
waren nach 20 Tagen unter NL-Bedingungen die Pigmentgehalte aller
untersuchten Komponenten drastisch reduziert (Abbildung 3.13 F).
3.4 Putative Interaktionspartner von SAUL1 Bei der Charakterisierung von SAUL1 als Komponente des Ubiquitin-abhängigen
26S-Proteasom-Systems (UPS) stellte sich die Frage nach Interaktionspartnern
und Zielproteinen von SAUL1. Mit der Aldehydoxidase AAO3 konnte bereits ein
erster Interaktionspartner von SAUL1 identifiziert werden (Abschnitt 3.2.3).
Darüber hinaus sollte nach weiteren Zielproteinen einer SAUL1-abhängigen
Ubiquitinylierung gesucht werden, die möglicherweise Aufschluss über die
raschen Änderungen auf Transkriptionsebene in saul1-1-Mutanten geben sollten.
Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde mit Hilfe der Yeast-two-hybrid-Technik
nach putativen Interaktionspartnern von SAUL1 gesucht. Im Rahmen der
Diplomarbeit von Johannes Bergler wurden unter Verwendung einer N- und C-
terminal deletierten Variante von SAUL1 (siehe Abbildung 3.20; SAUL1∆N∆C)
als Köder-Protein verschiedene putative Interaktionspartner identifiziert (Bergler,
2008). In Tabelle 3-1 sind diese Proteine aufgeführt. Darüber hinaus zeigte die
Arbeitsgruppe von Daphne Goring eine Interaktion von SAUL1 mit dem C-
Terminus der S-Domänen-Rezeptorkinase SD1-29 (Samuel et al., 2008).
___________________________________________________________Ergebnisse
47
Name AGI-
Nummer Biologische Funktion
Subzelluläre Lokalisierung
LINC2 At1g13220 Coiled-coil-Protein, Strukturgebung
des Zellkerns
Lumen des Zellkerns
(Dittmer et al., 2007)
OBE1 At3g07780
PHD-Finger Protein, Aufrechterhaltung von Wurzel- und
Spross-Meristem
Zellkern (Saiga et al., 2008)
SUVR2 At5g43990 SET-Domänen-Protein, Histon-
Modifikation
Zellkern (Thorstensen et al.,
2006)
MAF19.20 A5g61200 unbekannt Abbildung 3.16 (diese Arbeit)
SD1-29 At1g61380 S-Domänen-Rezeptorkinase Abbildung 3.16 (diese Arbeit)
Tabelle 3-1 Zusammenfassung putativer SAUL1-Interaktionspartner nach Bergler (2008)
und Samuel et al., (2008).
3.4.1 Überexpression und Anreicherung von MBP-Fusions-proteinen
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die putativen Zielproteine von SAUL1 bezüglich
ihrer Interaktion mit SAUL1 untersucht werden. Hierfür sollten zunächst diese
Proteine in E.coli-Zellen synthetisiert und anschließend angereichert werden. Die
Anreicherung der jeweiligen Proteine sollte dabei über ein angehängtes Maltose-
bindendes Protein (MBP) erfolgen.
Hierfür wurden die Proteinkodierungssequenzen der jeweiligen Proteine über
angefügte Schnittstellen für das Restriktionsenzym BamHI in den Vektor
pMALc2x kloniert (siebe Abschnitt 5.1.2.5). Für die Rezeptorkinase SD1-29 sollte
wie in Samuel et al. (2008) beschrieben nur ein verkürztes Protein für die
Interaktionsstudien verwendet werden. Bei den übrigen putativen
Interaktionspartnern sollte die Volllänge des jeweiligen Proteins angereichert
werden. Die jeweiligen Kodierungssequenzen wurden mittels PCR amplifiziert, in
den Vektor pJet1.2/ blunt (Material und Methoden 5.2.1.10) kloniert und durch
Sequenzierung überprüft. Für SUVR2 konnte weder unter Standard- noch unter
modifizierten PCR-Bedingungen ein fehlerfreier Klon erhalten werden, weshalb
dieser Ansatz verworfen wurde. Die entstandenen Expressionsvektoren der
übrigen zu untersuchenden Proteine wurden zur Transformation des E.coli-
Stamms Rosetta2(DE3)pLysS (Material und Methoden 5.1.1.1) verwendet.
Zusätzlich wurde der leere pMALc2x-Vektor als Negativkontrolle mitgeführt. Die
Synthese des jeweiligen Fusionsproteins wurde durch Zugabe des Lactose-
Analogons IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) induziert. Zellaufschluss
und Anreicherung der Fusionsproteine erfolgte mittels Affinitätschromatographie
Ergebnisse___________________________________________________________
48
entsprechend den Abschnitten 5.2.4.7 und 5.2.4.9. Der Fortschritt und Erfolg der
Anreicherung wurde durch PAGE und anschließende Coomassie-Färbung der
jeweiligen Gele verfolgt und die Proteinkonzentration mittels Bradford-Test
bestimmt (siehe Material und Methoden 5.2.4.1 und 5.2.4.8). Abbildung 3.14
zeigt exemplarisch das Coomassie-gefärbte Polyacrylamid-Gel (PAA-Gel) der
MBP-MAF19.20-Proteinanreicherung. Hierbei wurden neben den Protein-
Rohextrakten, Durchlauf- und Waschfraktionen die einzelnen Elutionsfraktionen
aufgetragen. Es zeigten sich ab dem Elutionsschritt 3 eine deutliche Bande des
MBP-MAF19.20-Fusionsproteins (MW: 76,0 kDa) sowie kleinere Banden, die
vermutlich Abbauprodukten dieses Proteins entsprachen. Alle übrigen
Fusionsproteine zeigten eine ähnliche Anreicherung (nicht gezeigt). Allerdings
konnte für MBP-SD1-29 nie eine Proteinbande erhalten werden, das
Fusionsprotein schien in E.coli-Zellen nicht gebildet zu werden.
Interaktionsstudien zwischen SAUL1 und SD1-29 waren somit nicht möglich.
Die erhaltenen Fusionsproteine MBP-LINC2, MBP-MAF19.20 und MBP-OBE1
sowie die Negativkontrolle MBP wurden für Interaktionsstudien mit SAUL1
verwendet.
3.4.2 Pulldown-Analysen mit SAUL1 und putativen Interaktionspartnern
Mit den in Abschnitt 3.4.1 beschriebenen angereicherten Fusionsproteinen sowie
der His-getagten Variante von SAUL1 (siehe 3.2.3) wurden verschiedene
pulldown-Versuche durchgeführt. Hierbei wurden zunächst putative
Abbildung 3.14 Coomassie-gefärbtes PAA-Gel zur Überprüfung der
Proteinanreicherung des MBP-MAF19.20-Fusionsproteins. Die Proteinanreicherung
erfolgte über Affinitäts-Chromatographie mittels Amylose. Die Größe des erwarteten
Fusionsproteins liegt bei 76,0 kDa. Ab Elutionsfraktion 3 (E3) war eine deutliche Bande
für MBP-MAF19.20 auf Höhe von etwa 75 kDa (Pfeil) zu erkennen.
Std: Molekulargewichtsstandard; RE: Protein-Rohextrakt; DL: Durchlauffraktion; WF:
Waschfraktion; E1-E11: Elutionsfraktionen.
___________________________________________________________Ergebnisse
49
Interaktionspartner (hier jeweils His-SAUL1 mit MBP-OBE1, MBP-LINC2 oder
MBP-MAF19.20) gemeinsam inkubiert, um eine Interaktion zu ermöglichen.
Anschließend wurde der pulldown mit Hilfe von magnetischen Ni-NTA-beads
(Qiagen) entsprechend Herstellerangaben durchgeführt (siehe Material und
Methoden 5.2.4.10). Dabei band His-SAUL1 über Chelatierung des Ni2+-Ions an
die beads, welche durch einen Magneten präzipitiert wurden. In einem
anschließend Westernblot wurden der Überstand und das Proteinpellet getrennt
aufgetragen und mittels AntiMBP-Antikörper die Lokalisierung der putativen
Interaktionspartner von SAUL1 untersucht. Falls SAUL1 und ein mögliches
Zielprotein miteinander interagierten, so sollte das Protein in der pulldown-
Fraktion zu finden sein. Fand keine Interaktion statt, so wäre das MBP-
Fusionsprotein in der Überstandfraktion zu detektieren.
In Abbildung 3.15 A ist das Ergebnis eines solchen pulldown-Experiments und
anschließenden Westernblots abgebildet. Für die Fusionsproteine waren
Proteinbanden von 107,2 kDa (MBP-OBE1), 88,5 kDa (MBP-LINC2) und 76,0
kDa (MBP-MAF19.20) beziehungsweise 51,0 kDa für MBP zu erwarten. In allen
Proben war eine deutliche Bande auf einer Höhe von etwa 50 kDa zu erkennen,
die vermutlich auf eine Spaltung der Fusionsproteine zurückzuführen war und
somit MBP entsprach. Für MBP-LINC2 konnte mit Hilfe des AntiMBP-Antikörpers
kein Protein nachgewiesen werden, was möglicherweise auf Proteinabbau
zurückzuführen war. Die Fusionsproteine MBP-OBE1 und MBP-MAF19.20
konnten in der pulldown-Fraktion (PD) detektiert werden, was auf eine Interaktion
dieser beiden Proteine mit His-SAUL1 hindeutete. Allerdings war auch für MBP,
welches als Negativkontrolle mitgeführt wurde, eine Bande in der PD-Fraktion zu
erkennen. Eine mögliche Ursache hierfür waren Kreuzreaktionen von MBP mit
den verwendeten Ni-NTA-beads. Deshalb wurde das pulldown-Experiment unter
modifizierten Bedingungen wiederholt, die auf eine Minimierung der
Kreuzreaktion ausgelegt waren (entsprechend Herstellerangaben für Ni-NTA-
beads, Abbildung 3.15 B).
Durch Erhöhung der NaCl- und Imidazol-Konzentrationen während des pulldown-
Experiments konnten putative Kreuzraktionen zwischen MBP und der Ni-NTA-
Matrix zwar unterdrückt werden, allerdings waren auch keine Interaktionen von
SAUL1 mit den MBP-Fusionsproteinen MBP-MAF19.20, MBP-LINC2 und MBP-
OBE1 mehr nachweisbar.
Anhand dieser Ergebnisse konnte keine klare Aussage bezüglich einer
möglichen Interaktion zwischen SAUL1 und OBE1, LINC2 beziehungsweise
MAF19.20 getroffen werden. Interaktionsstudien sollten entweder unter
modifizierten Bedingungen oder mit Hilfe anderer experimenteller Ansätze
wiederholt werden.
Ergebnisse___________________________________________________________
50
3.4.3 Lokalisierung von putativen Interaktionspartnern von SAUL1
In einem abschließenden Experiment sollte die Lokalisierung der putativen
Interaktionspartner von SAUL1 untersucht werden, um auf eine mögliche Co-
Lokalisierung mit SAUL1 zu testen. Da eine Lokalisierung für drei dieser
möglichen Zielproteine bereits gezeigt war (LINC2, OBE1 und SUVR2,
Thorstensen et al., 2006; Dittmer et al., 2007; Saiga et al., 2008), wurde nur die
subzelluläre Lokalisierung von MAF19.20 beziehungsweise der Rezeptorkinase
SD1-29 untersucht.
Die subzelluläre Lokalisierung GFP-Fusionsproteinen von MAF19.20 und SD1-29
sollte mittels transienter Expression in Protoplasten von Arabidopsis WT-
Pflanzen untersucht werden. Hierfür wurden die jeweiligen cDNA-Sequenzen per
PCR amplifiziert und mit Hilfe des Gateway-Vektorsystems verschiedene
Expressionskonstrukte unter Kontrolle des 35S-Promotors generiert (Material und
Methoden 5.1.2.5). Die Vektoren wurden mittels Protoplastentransformation in
Abbildung 3.15 Western-
blot eines pulldown-Experi-
ments zu Interaktions-
studien von His-SAUL1 mit
MBP-OBE1, MBP-LINC2
und MBP-MAF19.20. MBP
alleine und eine Negativ-
kontrolle ohne zweites
Protein wurden mitgeführt.
Der pulldown erfolgte
mittels Ni-NTA-beads, die
Detektion der MBP-Fu-
sionsproteine wurde im
Westernblot mittels ange-
reicherten AntiMBP-Anti-
körpers (1:100) durchge-
führt.
A Durchführung des pull-
down-Experiments unter
Standardbedingungen ent-
sprechend Herstelleran-
gaben. Für MBP-LINC2
konnte kein Protein detek-
tiert werden. Die Fusions-
proteine MBP- OBE1 und
. MBP-MAF19.20 sowie MBP alleine finden sich in der PD-Fraktion B pulldown-
Experiment unter modifizierten Bedingungen zur Minimierung von Kreuzreaktionen mit
der Matrix.
Molekulargewichte: MBP-OBE1: 107,2 kDa; MBP-LINC2: 88,5 kDa; MBP-MAF19.20:
76,0 kDa; MBP: 51 kDa. PD: Pulldown-Fraktion; ÜS: Überstandsfraktion.
___________________________________________________________Ergebnisse
51
Mesophyllzellen zur Expression gebracht und die subzelluläre Lokalisierung der
Fusionsproteine an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (KLSM)
untersucht (Material und Methoden 5.2.3.6).
Die GFP-Fluoreszenz des MAF19.20-GFP-Fusionsproteins konnte innerhalb des
Protoplasten, an der Zellperipherie und um Chloroplasten herum detektiert
werden (Abbildung 3.16 A). Eine solche Verteilung ließ auf eine Lokalisierung
des Fusionsproteins im Zytoplasma schließen. Bei Expression eines P35S:GFP-
SD1-29-Konstrukts in Mesophyllprotoplasten zeigte sich GFP-Fluoreszenz in
netzförmigen Strukturen innerhalb der Zelle, dem Endoplasmatischen Retikulum
(ER; Abbildung 3.16 B).
3.5 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 Um Rückschlüsse auf die Funktion und physiologische Rolle von SAUL1 ziehen
zu können sollte die subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 bestimmt werden.
Besonders in Anbetracht der unterschiedlichsten Lokalisierungen putativer
SAUL1-Interaktionspartner (Zellkern, Zytoplasma und ER, siehe Abschnitt 3.4.3)
war diese Fragestellung von besonderem Interesse. Darüber hinaus würde die
subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 Rückschlüsse auf die beobachtete
schnelle Regulation von Seneszenzprozessen auf Transkriptionsebene (siehe
Abschnitt 3.1.2) zulassen.
Abbildung 3.16 Subzelluläre Lokalisierung putativer Interaktionspartner von SAUL1 in
Mesophyllprotoplasten aus Arabidopsis. A Transiente Expression von P35S:MAF19.20-
GFP. GFP-Fluoreszenz wurde im Zytoplasma detektiert. B Lokalisierung des GFP-SD1-
29-Fusionsproteins im Endoplasmatischen Retikulum.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in rot dargestellt; in A
handelt es sich um eine konfokale Einzelaufnahme, in B um eine Überlagerung mehrerer
optischer Einzelschnitte. Die Messbalken entsprechen 10 µm.
Ergebnisse___________________________________________________________
52
3.5.1 Analysen zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1 Die subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 sollte mittels transienter Expression in
vivo untersucht werden. Hierzu wurden verschiedene SAUL1-Reportergen-
Konstrukte mit Hilfe des Gateway®-Vektorsystems (Invitrogen, Material und
Methoden 5.2.1.10) erstellt. Die für SAUL1 kodierende Sequenz wurde dabei vor
bzw. hinter die Sequenz der Reportergene GFP bzw. YFP (green fluorescent
bzw. yellow fluorescent protein) kloniert. Alle entstanden Konstrukte sind unter
der Kontrolle des 35S-Promotors des Cauliflower Mosaic Virus und wurden
sowohl zur transienten als auch zur stabilen Transformation verwendet (pJB43
entspricht P35S:SAUL1-GFP; pGD41 entspricht P35S:YFP-SAUL1; siehe Material
und Methoden 5.1.2.2).
Transiente Expression in Arabidopsis-Protoplasten und Tabak-Epidermiszellen
In Versuchen zur transienten Expression der SAUL1-Reportergen-Konstrukte
wurde zum einen die Methode der Mesophyllprotoplasten-Transformation, zum
anderen die Infiltration von Nicotiana benthamiana-Blättern gewählt. Die GFP-
bzw. YFP-Fluoreszenz wurde einen Tag nach Transformation am KLSM
detektiert.
In Abbildung 3.17 A-D sind Aufnahmen der transformierten Protoplasten
abgebildet. Befand sich die Fluorophore am C-Terminus von SAUL1, so zeigte
sich die Fluoreszenz des SAUL1-GFP-Fusionsproteins in einem deutlichen Ring
um die Zelle herum, der auch die Chloroplasten umschloss (Abbildung 3.17 A).
Diese GFP-Fluoreszenz deutete also auf eine Lokalisierung des Fusionsproteins
in der Plasmamembran (PM) hin. Bei Überlagerung mehrer konfokaler
Einzelschnitte war eine gleichmäßige Verteilung der GFP-Fluoreszenz über die
gesamte Zelloberfläche zu erkennen (Abbildung 3.17 B). Anschließend sollte
durch Zelllyse zusätzlich ausgeschlossen werden, dass das YFP-SAUL1-
Fusionsprotein in der Tonoplastenmembran vorlag. Durch Zugabe von Lysis-
Puffer (Material und Methoden 5.2.3.5) wurde die PM eines mit pGD41
transformierten Protoplasten aufgebrochen und die Vakuole freigesetzt
(Abbildung 3.17 C). Die YFP-Fluoreszenz fand sich dabei in den Zelltrümmern
des lysierten Protoplasten, der Tonoplast zeigte keinerlei Signal (Pfeil). Wurde
die Fluorophore an den N-Terminus von SAUL1 fusioniert, so war die YFP-
Fluoreszenz zwar weiterhin an der Zellperipherie detektierbar, allerdings zeigte
sich nicht in allen Protoplasten ein geschlossener Ring um die Zelle. Vielmehr lag
in etwa 25% der Protoplasten das YFP-Signal in fleckiger Anordnung von
(Abbildung 3.17 D), wobei diese Ungleichverteilung unterschiedlich stark
ausgeprägt sein konnte. Betrachtete man auch hier eine Überlagerung mehrerer
konfokaler Einzelschnitte, so zeigte sich ein Fleckenmuster, das sich über die
___________________________________________________________Ergebnisse
53
gesamte Zelloberfläche erstreckte (Abbildung 3.17 E). Dieser Effekt trat nicht nur
mit N-YFP, sondern auch mit N-GFP auf (nicht gezeigt).
Abbildung 3.17 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1-GFP- und YFP-SAUL1-
Fusionsproteinen in Arabidopsis Mesophyllprotoplasten und Tabak-Epidermiszellen A
GFP-Fluoreszenz des SAUL1-GFP-Fusionsproteins wurde an der Plasmamembran (PM)
detektiert. B Überlagerung mehrerer konfokaler Einzelschnitte zeigte gleichmäßige
Verteilung von SAUL1-GFP über die gesamte Zelloberfläche. C Lyse eines pGD41-
exprimierenden Protoplasten. YFP-Fluoreszenz verblieb in Zellbruchstücken des lysierten
Protoplasten; der Tonoplast ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. D YFP-SAUL1 war an
der Zellperipherie lokalisiert, allerdings lag keine gleichmäßige Verteilung mehr vor. E
Überlagerung konfokaler Einzelaufnahmen zeigte fleckige Verteilung von YFP-SAUL1 auf
der Zelloberfläche. F Nach Infiltration von N. benthamiana-Blättern mit Agrobakterien, die
das Plasmid pGD41 tragen, war das YFP-SAUL1-Fusionsprotein an der PM lokalisiert. G
und H Plasmolyse von pGD41 exprimierenden Tabak-Epidermiszellen. Die YFP-
Fluoreszenz war deutlich in der sich zurückziehenden PM erkennbar (Pfeile). Die
Fluoreszenz umgab dabei die Chloroplasten (vergrößerter Ausschnitt). G zeigt das
Fluoreszenzbild, H eine Überlagerung mit dem Durchlichtbild.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, YFP in gelb und die Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in
rot dargestellt; bei A, C, D, F, G und H handelt es sich um optische Einzelaufnahmen, bei
B und E um Überlagerungen mehrerer Einzelaufnahmen; alle Messbalken entsprechen
10 µm.
Ergebnisse___________________________________________________________
54
In einem weiteren transienten Expressionsversuch wurden Tabak-Blätter
(Nicotiana benthamiana) mit Agrobakterien infiltriert, die das P35S:N-YFP-SAUL1-
Konstrukt trugen. Ein Tag nach Transformation wurde die YFP-Fluoreszenz am
KLSM detektiert. In Tabak-Epidermiszellen war die Fluoreszenz des YFP-
SAUL1-Fusionsproteins deutlich um die Zelle herum zu erkennen (Abbildung
3.17 F). Bei Plasmolyse der Zellen verblieb die Fluoreszenz in der sich
zurückziehenden PM (Abbildung 3.17 G und H; Material und Methoden 5.2.3.5).
Dabei war deutlich zu erkennen, dass Chloroplasten auf der sich
zurückziehenden Membran auflagen, es sich hierbei also eindeutig um PM
handelt (Abbildung 3.17 G, vergrößerter Ausschnitt).
Co-Lokalisierung von GFP-SAUL1 und UmSRT1-RFP
Um eine PM-Lokalisierung eindeutig zu belegen, wurde darüber hinaus eine Co-
Lokalisierung von SAUL1 und dem PM-ständigen Zuckertransportprotein UmSrt1
aus dem phytopathogenen Pilz Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) durchgeführt.
Wie in Abbildung 3.18 zu sehen ist, kam es bei Co-Transformation von
Arabidopsis Protoplasten mit P35S:GFP-SAUL1 (pGD57) und P35S:UmSRT1-RFP
(pKW45; RFP: red flourescent protein) zu einer klaren Überlagerung der beiden
Signale an der PM (gelbe Fluoreszenz in Abbildung 3.18 C). Für UmSRT1-RFP
ist neben der Lokalisierung an der PM auch Fluoreszenz innerhalb der Zelle zu
erkennen, bei der es sich vermutlich um eine Markierung des Endoplasmatischen
Retikulums und von Golgivesikeln während des Transports des Proteins an die
PM handelt (Abbildung 3.18 B). Ein solches Signal ist für das Fusionsprotein
GFP-SAUL1 allerdings nicht erkennbar (Abbildung 3.18A).
Abbildung 3.18 Co-Lokalisierung von GFP-SAUL1 und UmSrt1-RFP in transient
transformierten Mesophyllprotoplasten. Co-Expression der Konstrukte P35S:GFP-SAUL1
(pGD57) und P35S:UmSrt1-RFP (pKW45). A Lokalisierung des GFP-SAUL1-
Fusionsproteins an der PM. B RFP-Fluoreszenz von UmSrt1-RFP in der PM. C
Überlagerung der GFP- und des RFP-Kanals. D Durchlichtaufnahme.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, RFP in rot und Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in blau
dargestellt; bei allen Aufnahmen handelt es sich um konfokale Aufnahmen und optische
Einzelschnitte; Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
55
3.5.2 Analyse putativer Membranlokalisierungsdomänen von SAUL1
3.5.2.1 In silico Analyse putativer Transmembranspannen und
Lipidmodifikationssequenzen
Um zu klären, durch welchen Mechanismus SAUL1 an der PM verankert ist,
wurde eine in silico Analyse durchgeführt. Zum einen wurde nach
Transmembranspannen (TM-Spannen) in der SAUL1-Proteinsequenz gesucht,
die eine direkte Einlagerung in die PM vermitteln würden. Des Weiteren wurde
nach Lipidmodifikationsmotiven gesucht, die eine Verankerung von SAUL1 an
der PM vermitteln könnten wie zum Beispiel Farnesylierung oder das Anhängen
eines GPI (Glycosylphosphatidylinositol)-Ankers. Die durchgeführten Motiv-
suchen erfolgten mit Hilfe einzelner Suchmaschinen, die unter der Internetseite
der Aramemnon-Datenbank (http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/; Schwacke
et al., 2003) zusammengefasst sind. Hierbei wurden keinerlei Signalsequenzen
zur Lipidmodifikation identifiziert. Die Vorhersagen unterschiedlicher
Suchmaschinen bezüglich der TM-Domänen variierten hingegen zwischen null
(in sieben verschiedenen Suchmaschinen, Beispiel: http://topcons.cbr.su.se/;
Viklund und Elofsson, 2004) und eins (in sechs verschiedenen Suchmaschinen,
Beispiel: http://bioinf4.cs.ucl.ac.uk:3000/psipred/; Jones et al., 1994; Jones,
2007). Somit konnte keine definitive Aussage über die Anzahl an TM-Spannen
getroffen werden. Um diese Fragestellung weiter zu untersuchen wurden
zusätzliche Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung erstellt.
3.5.2.2 Lokalisierung von verkürzten SAUL1-Varianten
Um die Fragestellung nach TM-Spannen und Lipidmodifikationssignalen
abschließend auch in vivo zu klären, wurden verschiedene Konstrukte erstellt.
Zum einen wurde ein Konstrukt kloniert, das für ein SAUL1-GFP-HDEL-Konstrukt
kodiert (siehe Material und Methoden 5.1.2.2). Hierbei wird neben GFP ein ER-
Rückhaltesignal angefügt, das aus der Aminosäurefolge HDEL besteht und dafür
sorgt, dass Proteine, deren Synthese und Verteilung über das ER erfolgen, im
ER zurückgehalten werden. Sollte SAUL1 also TM-Spannen oder ein
Lipidmodifikationssignal tragen und somit die Synthese von SAUL1 über das ER
erfolgen, so würde das SAUL1-GFP-HDEL-Fusionsprotein im ER zurückgehalten
werden und eine Markierung des ERs stattfinden. In einem weiteren Ansatz
wurden N- und C-terminal verkürzte Varianten (genannt SAUL1∆N, SAUL1∆C
und SAUL1∆N∆C bei Deletion beider Termini) von SAUL1 an GFP fusioniert
(siehe Material und Methoden 5.1.2.2 bzw. Abbildung 3.20). Hierbei wurden am
N-Terminus die Aminosäuren 1-92, am C-Terminus die Aminosäuren 762-802
deletiert. Motive für Lipidmodifikationen finden sich normalerweise am N-
Ergebnisse___________________________________________________________
56
terminalen Ende eines Proteins, in seltenen Fällen auch am C-Terminus. Durch
Deletion dieser Bereiche sollte also ein mögliches Lipidmodifikationssignal fehlen
und eine Lokalisierung an der PM nicht mehr zu beobachten sein.
In Abbildung 3.19 ist deutlich zu erkennen, dass sowohl durch N- oder C-
terminale Deletionen des SAUL1-Proteins als auch bei Anhängen des ER-
Rückhaltesignals HDEL (pGD68) die PM-Lokalisierung von SAUL1 nicht zerstört
ist. In allen Fällen ist noch eine klare Lokalisierung an der PM zu erkennen.
Allerdings ist zu bemerken, dass die Deletion des N-Terminus von SAUL1 dazu
führt, dass die GFP-Fluoreszenz nicht mehr gleichmäßig über die gesamte
Membran verteilt vorliegt, sondern sich in klar abgegrenzten Bereichen an der
PM sammelt (Abbildung 3.19 A und C).
Abbildung 3.19 Subzelluläre Lokalisierung von N- und C-terminalen
Deletionskonstrukten von SAUL1 in Mesophyllprotoplasten. A Expression von P35S:GFP-
SAUL1∆N in Protoplasten, das Fusionsprotein ist an der PM lokalisiert. B Lokalisierung
des GFP-SAUL1∆C-Fusionsproteins an der PM. C GFP-Fluoreszenz von GFP-
SAUL1∆N∆C an der PM. D Markierung der PM durch SAUL1-GFP-HDEL (durch
Expression von pGD68).
In grün ist jeweils die Fluoreszenz von GFP, in rot die Eigenfluoreszenz von Chlorophyll
dargestellt; bei allen Bildern handelt es sich um konfokale Aufnahmen und optische
Einzelschnitte; Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
57
Zusammenfassend kann aus diesen Ergebnissen gefolgert werden, dass SAUL1
weder durch TM-Spannen noch durch Lipidmodifikationen an der PM gehalten
wird.
3.5.3 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1-Deletionsmutanten Da SAUL1 weder durch TM-Spannen noch durch Lipidmodifikation an der PM
verankert ist, sollte untersucht werden, ob es möglicherweise durch Protein-
Protein-Interaktion an die PM gebunden wird. Betrachtet man den Proteinaufbau
von SAUL1, so machen so genannte Armadillo-Motive (ARM) den Großteil des
Proteins aus, die Protein-Protein-Interaktions-Domänen bilden können (Mudgil et
al., 2004). SAUL1 enthält insgesamt elf ARM-Motive, deren Anordnung in
Abbildung 3.20 dargestellt ist. Hierbei bilden die ARM-Domänen 1-6 eine
abgegrenzte Einheit, die gemeinsam vermutlich eine Interaktionsdomäne
ausbildet. Die übrigen ARM-Motive sind hingegen räumlich weiter voneinander
getrennt, könnten aber dennoch eine zweite Interaktionsdomäne darstellen.
Um die Lokalisierung des SAUL1-Proteins an der PM und den Einfluss dieser
beiden putativen ARM-Interaktionsdomänen dabei näher zu untersuchen, wurden
verschiedene SAUL1-Deletionskonstrukte erstellt (Abbildung 3.20) und ihre
subzelluläre Lokalisierung in Arabidopsis Protoplasten näher untersucht.
Abbildung 3.20 Schematische Darstellung der erstellten SAUL1-Deletionskonstrukte. In
blau ist die U-Box von SAUL1, in rot die einzelnen ARM-Domänen dargestellt.
Ergebnisse___________________________________________________________
58
3.5.3.1 Lokalisierung von SAUL1∆ARM1-6 und SAUL1∆ARM7-11
Neben den bereits in Abschnitt 3.5.2.2 beschriebenen Deletionen SAUL1∆N und
SAUL1∆C wurden auch Konstrukte erstellt, denen zum einen der gesamte N-
Terminus einschließlich der ARM-Domänen eins bis sechs fehlten
(SAUL1∆ARM1-6; pGD74), zum anderen die ARM-Motive sieben bis elf und der
gesamte C-Terminus (SAUL1∆ARM7-11; pGD66; siehe Abbildung 3.20 und
Material und Methoden 5.1.2.2 für Klonierungsschemata).
Diese verkürzten Formen von SAUL1 wurden an GFP fusioniert und ihre
subzelluläre Lokalisierung in Arabidopsis-Protoplasten untersucht. In Abbildung
3.21 sind die Ergebnisse von Co-Lokalisierungen dieser Konstrukte mit dem PM-
ständigen UmSrt1 dargestellt.
Deletierte man die ARM-Domänen 7-11, so fand sich die GFP-Fluoreszenz des
Fusionsproteins SAUL1∆ARM7-11-GFP innerhalb der Zelle in unförmigen
Abbildung 3.21 Transiente Expression von SAUL1-Deletionskonstrukten in Mesophyll-
protoplasten. A-C Co-Expression der Konstrukte P35S:SAUL1∆ARM7-11-GFP (pGD66)
und P35S:UmSrt1-RFP (pKW45). A GFP-Fluoreszenz des SAUL1∆ARM7-11-GFP-
Fusionsproteins im Zytoplasma. B RFP-Fluoreszenz von UmSrt1-RFP in der PM. C
Überlagerung des GFP- und des RFP-Kanals. Es am zu keiner Co-Lokalisierung der
beiden Signale. D-F Co-Expression der Konstrukte P35S:GFP-SAUL1∆ARM1-6 (pGD74)
und P35S:UmSrt1-RFP (pKW45). D GFP-Fluoreszenz des GFP-SAUL1∆ARM1-6-
Fusionsproteins in großen Flecken an der PM. E RFP-Fluoreszenz von UmSrt1-RFP in
der PM. F Überlagerung des GFP- und des RFP-Kanals. Deutliche Co-Lokalisierung der
beiden Signale an der PM.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, RFP-Fluoreszenz in rot und die Eigenfluoreszenz des
Chlorophylls in blau dargestellt; bei allen Aufnahmen handelt es sich um konfokale
Aufnahmen und optische Einzelschnitte; alle Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
59
Bereichen, die auch die Chloroplasten umgeben, wohingegen die RFP-
Fluoreszenz von UmSrt1-RFP den gesamten Protoplasten umgab und deutlich
die PM markierte. Das GFP-Fusionsprotein befand sich also löslich im
Zytoplasma und es kam zu keiner Co-Lokalisierung mit UmSrt1-RFP (Abbildung
3.21 A-C). SAUL1∆ARM7-11-GFP war also nicht an der PM lokalisiert. Deletierte
man hingegen den N-Terminus, die U-Box und die ARM-Domänen 1-6, so war
eine Fluoreszenz des GFP-SAUL1∆ARM1-6-Fusionsproteins in eng umgrenzten
Bereichen an der Zellperipherie zu erkennen und co-lokalisierte mit dem PM-
Marker UmSrt1-RFP (Abbildung 3.21 D-F). Die dabei auftretenden Flecken
waren wahrscheinlich auf ein Fehlen des N-Terminus zurückzuführen, der wie
bereits oben beschrieben essentiell für eine Gleichverteilung über die PM ist
(Abschnitt 3.5.2).
Anhand dieser Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass die ARM-Motive 7-11
notwendig sind, um eine Lokalisierung von SAUL1 an der PM zu vermitteln.
3.5.3.2 Deletion einzelner ARM-Domänen
Da die ARM-Domänen 7-11 ausreichend sind, um eine PM-Lokalisierung zu
vermitteln, sollte im Einzelnen untersucht werden, ob alle fünf enthaltenen ARM-
Wiederholungen gemeinsam eine funktionelle Interaktionsdomäne bilden oder ob
möglicherweise einzelne ARM-Motive für eine Verankerung von SAUL1 an der
PM verantwortlich sind. Deshalb wurden weitere Konstrukte erstellt, in denen
einzelne ARM-Domänen deletiert sind. Mittels PCR wurden die ARM-Domänen
1, 7/8, 9 und 10/11 entfernt (Abbildung 3.20 und Material und Methoden 5.1.2.2
für Klonierungsschemata). Das SAUL1∆ARM1-Konstrukt diente dabei als
Kontrollansatz, um zu zeigen, dass eine Deletion einzelner ARM-Repeats die
Proteinstabilität nicht grundlegend beeinträchtigt. Die erhaltenen verkürzten
SAUL1-Sequenzen wurden an die für GFP-kodierende Sequenz fusioniert und
die subzelluläre Lokalisierung dieser Fusionsproteine mittels konfokaler
Mikroskopie analysiert.
In Abbildung 3.22 sind die Ergebnisse dieser subzellulären Lokalisierung
dargestellt. Bei Deletion der ARM-Wiederholungen 7 und 8 war die GFP-
Fluoreszenz des SAUL1∆ARM7/8-GFP-Fusionsproteins in intrazellulären
Bereichen zu erkennen, es kam also nicht mehr zu einer Assoziation der
verkürzten Form von SAUL1 mit der PM (Abbildung 3.22 A). Eine ähnliche
Lokalisierung im Zytoplasma ließ sich auch bei Deletion der ARM-
Wiederholungen 9 bzw. 10/11 beobachten, wobei auch hier eine GFP-
Fluoreszenz innerhalb der Zelle auftrat und einzelne Zytoplasmafäden zu
erkennen waren (Abbildung 3.22 B und C). In einem Kontrollansatz wurde das
ARM-Motiv 1 deletiert, was allerdings keinen Einfluss auf die PM-Lokalisierung
Ergebnisse___________________________________________________________
60
des entsprechenden GFP-SAUL1∆ARM1-Fusionsproteins hatte (Abbildung 3.22
D).
Zusammenfassend kann gefolgert werden, dass die ARM-Wiederholungen 7-11
gemeinsam eine Protein-Protein-Interaktionsdomäne darstellen, welche eine
Lokalisierung von SAUL1 an der PM vermitteln. Bei Deletion eines einzelnen
ARM-Motivs wird die Funktionalität dieser Interaktionsdomäne zerstört und es
kommt zu einer Lokalisierung des verkürzten SAUL1-Proteins im Zytoplasma.
Die deutet darauf hin, dass Wechselwirkungen dieser Interaktionsdomäne mit
einem weiteren membranständigen Protein oder möglicherweise Membranlipiden
selbst SAUL1 an der PM verankern. Eine Aufschlüsselung dieses Mechanismus
sollte Ziel zukünftiger Untersuchungen sein.
Abbildung 3.22 Deletionen einzelner ARM-Wiederholungen des SAUL1-Proteins und
subzelluläre Lokalisierung von GFP-Fusionsproteinen in Arabidopsis-Protoplasten. A
transiente Expression von P35S:SAUL1∆ARM7/8-GFP (pGD85). Das Fusionsprotein ist im
Zytoplasma lokalisiert. B Lokalisierung des SAUL1∆ARM9-GFP-Fusionsproteins (kodiert
von pGD87) im Zytoplasma. C Expression von P35S:GFP-SAUL1∆ARM10/11 (pGD76).
Fluoreszenz des GFP-SAUL1∆ARM10/11-Fusionsproteins im Zytoplasma. D GFP-
SAUL1∆ARM1 (bei Expression von pGD80) ist an der PM lokalisiert.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in rot dargestellt; bei
allen Aufnahmen handelt es sich um konfokale Aufnahmen und optische Einzelschnitte;
alle Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
61
3.5.4 Subzelluläre Lokalisierung von PUB43 Betrachtet man die Vielzahl an PUB-ARM-Proteinen in Arabidopsis, so ist
auffällig, dass der Großteil dieser Proteine über 5-6 ARM-Wiederholungen
verfügen, die direkt aufeinander folgen und somit vermutlich gemeinsam eine
Interaktionsdomäne bilden (Mudgil et al., 2004). SAUL1 hingegen besitzt darüber
hinaus weitere ARM-Motive (ARM7-11), die gemeinsam eine Interaktionsdomäne
ausbilden und eine Lokalisierung von SAUL1 an der PM vermitteln (siehe
Abschnitt 3.5.3). Neben SAUL1 gibt es allerdings noch zwei weitere PUB-ARM-
Proteine, die eine ähnliche Anordnung von ARM-Wiederholungen zeigen, PUB43
und PUB42. Hierbei handelt es sich um die nächst-homologen Proteine zu
SAUL1, die ähnlich wie SAUL1 einen verlängerten C-Terminus aufweisen
(Mudgil et al., 2004). Für PUB42 und PUB43 konnte bereits eine PM-
Lokalisierung gezeigt werden (Drechsel et al., 2010b). PUB43 weißt dabei
insgesamt 13 ARM-Wiederholungen in ähnlicher Anordnung wie SAUL1 auf
(Abbildung 3.23).
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob auch in PUB43 die
Verankerung an der PM mittels Protein-Protein-Interaktion erfolgt. Dazu wurden
verschiedene verkürzte Varianten von PUB43 erstellt, die von den bereits
untersuchten SAUL1-Deletionskonstrukten abgeleitet wurden. Analog zu SAUL1
wurde das PUB43-Protein in zwei Hälften geteilt, wobei das erste Konstrukt aus
dem N-Terminus, der U-Box und den ARM-Domänen 1-6 bestand
(PUB43∆ARM7-12), das zweite Konstrukt umfasste die ARM-Wiederholungen 7-
12 und den C-Terminus (PUB43∆ARM1-6). Darüber hinaus wurden Konstrukte
erstellt, denen der N-Terminus (PUB43∆N; Deletion der AS 1-108) bzw. die
ARM-Motive 10-12 fehlen (PUB43∆ARM10-12; Abbildung 3.23 und Material und
Methoden 5.1.2.3 für Klonierungsschemata). Alle verkürzten PUB43-Varianten
wurden an GFP fusioniert und Arabidopsis-Mesophyllprotoplasten mit den
jeweiligen Konstrukten transformiert.
Abbildung 3.23 Schematische Darstellung der erstellten PUB43-Deletionskonstrukte. In
blau ist die U-Box von PUB43, in rot die einzelnen ARM-Domänen dargestellt.
Ergebnisse___________________________________________________________
62
In Abbildung 3.24 sind die Ergebnisse dieser Untersuchungen dargestellt. Bei
Deletion des N-Terminus veränderte sich die subzelluläre Lokalisierung von
PUB43 nicht, es zeigte sich weiterhin eine deutliche GFP-Fluoreszenz des
Fusionsproteins in der PM (Abbildung 3.24 A). Anders als bei der N-terminalen
Deletion von SAUL1 (siehe Abschnitt 3.5.2.2) trat hier keine fleckige Verteilung
des GFP-Signals auf, sondern GFP-PUB43∆N fand sich gleichmäßig verteilt in
der PM. Entfernte man zusätzlich die ARM-Wiederholungen 1-6, so zeigte sich
ein deutliches Fleckenmuster, das die Zelle umgibt, die Lokalisierung an der PM
blieb allerdings erhalten (Abbildung 3.24 B). Dieser Effekt stimmte mit den
Beobachtungen zu SAUL1∆ARM1-6 überein (Abbildung 3.21 D-F).
Auch für die Lokalisierung der verkürzten Proteine PUB43∆ARM7-12 und
PUB43∆ARM10-12 kam es zu Übereinstimmungen mit den jeweiligen
Konstrukten für SAUL1. In beiden Fällen ging die Lokalisierung an der PM durch
Abbildung 3.24 Transiente Expression von PUB-43-Deletionsmutanten in Arabidopsis
Protoplasten. A Transiente Expression von P35S:GFP-PUB43∆N (pND7). Das
Fusionsprotein war an der PM lokalisiert. B Lokalisierung von GFP-PUB43∆ARM1-6
(codiert von pND5) in ungleichmäßiger Verteilung an der PM. C Bei Expression von
P35S:GFP-PUB43∆ARM10-12 (pND9) Lokalisierung des Fusionsproteins im Zytoplasma.
D GFP-PUB43∆ARM7-12 (codiert von pND11) war im Zytoplasma lokalisiert.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in rot dargestellt; bei
allen Abbildungen handelt es sich um konfokale Aufnahmen und optische Einzelschnitte;
alle Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
63
Fehlen der hinteren ARM-Wiederholungen verloren, die GFP-Fluoreszenz war im
Zytoplasma detektierbar (Abbildung 3.24 C und D bzw. Abbildung 3.21 A-C und
Abbildung 3.22 C für SAUL1).
Auch in PUB43 findet also die Verankerung des Proteins über Wechselwirkungen
zwischen einer C-terminalen Interaktionsdomäne, die aus mehreren ARM-
Motiven (in diesem Fall sechs) gebildet wird, und einem bisher unbekannten,
vermutlich membranständigen Interaktionspartner statt
3.5.5 Erstellung von chimären Proteinen aus SAUL1-ARM7-11
und weiteren PUB-ARM-Proteinen
Um zu untersuchen, ob die beschriebene Protein-Protein-Interaktionsdomäne
alleine ausreichend ist, um eine Lokalisierung an der PM zu vermitteln, wurden
verschiedene chimäre Proteine erstellt. Hierbei wurden an die PUB-ARM-
Proteine AtPUB27 (At5g64660) und AtPUB30 (At3g49810) die eben
beschriebene Interaktionsdomäne SAUL1ARM7-11 angefügt. Beide PUB-ARM-
Proteine liegen im Zytoplasma im so genannten Ubiquitin-Ligase-Komplex vor
(Drechsel et al., 2010c). Es sollte untersucht werden, ob sich die Lokalisierung
dieser Proteine durch Anhängen von SAUL1ARM7-11 ändert. Hierfür wurden
Chimärenkonstrukte erstellt, wobei an die für PUB27 und PUB30 kodierenden
Sequenzen SAUL1ARM7-11 ohne Verschiebung des Leserasters angefügt
(Material und Methoden 5.1.2.2 für Klonierungsstrategien). Die erhaltenen
Chimärenkonstrukte P35S:PUB27+SAUL1ARM7-11-C-GFP (pGD101) und
P35S:PUB30+SAUL1ARM7-11-C-GFP (pGD109) wurden in Arabidopsis-
Protoplasten zur Expression gebracht und die Lokalisierung der
Chimärenproteine durch konfokale Mikroskopie verfolgt.
In Abbildung 3.25 sind Aufnahmen der subzellulären Lokalisierung dieser
Chimärenkonstrukte dargestellt. Die Fluoreszenz der Fusionsproteine PUB27-
GFP und PUB30-GFP war innerhalb der Zelle detektierbar und umschloss dabei
die Chloroplasten (Abbildung 3.25 A-D). Beide Fusionsproteine waren also im
Zytoplasma lokalisiert. Wurden hingegen an PUB27 und PUB30 die ARM-
Domänen 7-11 von SAUL1 angefügt, kam es zu einer Verschiebung der GFP-
Fluoreszenz an die Zellperipherie. Bei Co-Expression der jeweiligen Konstrukte
mit P35S:UmSrt1-RFP kam es zu einer Überlagerung der grünen GFP-
Fluoreszenz der Chimärenproteine und der roten RFP-Fluoreszenz des PM-
Markers UmSrt1-RFP (Abbildung 3.25 E-H für Chimärenproteine mit PUB27 und
I-L für PUB30). Während ein Teil der Fusionsproteine im Zytoplasma verblieben,
fand sich also der Großteil an der PM.
Ergebnisse___________________________________________________________
64
3.5.6 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1 in anderen
Pflanzenspezies
Um zu untersuchen, wie konserviert die Lokalisierung von SAUL1 an der PM
bzw. die Interaktion mit einem unbekannten Protein in anderen Pflanzenspezies
als Arabidopsis thaliana ist, wurden Epidermiszellen verschiedener Pflanzen
mittels PIG-Beschuss transient transformiert (siehe Material uns Methoden
5.2.3.4). Dabei wurden die Konstrukte P35S:GFP-SAUL1- bzw. P35S:SAUL1-GFP
in Tabak- (Nicotiana tabaccum), Zuckermelone- (Cucumis melo), Zwiebel- (Allium
Abbildung 3.25 Transiente Expression von Chimärenkonstrukten aus SAUL1ARM7-11
und PUB27 beziehungsweise PUB30 in Arabidopsis-Protoplasten A-D Lokalisierung der
PUB27-GFP- (A+B) beziehungsweise PUB30-GFP-Fusionsproteine (C+D) im
Zytoplasma der Zellen. Es ist jeweils die Fluoreszenzaufnahme (A+C) und das
zugehörige Durchlichtbild (B+D) abgebildet. E-H Co-Expression von
P35S:PUB27+SAUL1ARM7-11-GFP und P35S:UmSrt1-RFP in Mesophyll-Protoplasten. E
GFP-Fluoreszenz des PUB27+SAUL1ARM7-11-GFP-Fusionsproteins an der PM. F RFP-
Fluoreszenz von UmSrt1-RFP in der PM. G Überlagerung des GFP- und des RFP-
Kanals. Es kam zur Co-Lokalisierung der beiden Signale. H Durchlichtaufnahme. I-L Co-
Expression von P35S:PUB30+SAUL1ARM7-11-GFP und P35S:UmSrt1-RFP in Mesophyll-
Protoplasten. E GFP-Fluoreszenz des PUB30+SAUL1ARM7-11-GFP-Fusionsproteins an
der PM. F RFP-Fluoreszenz von UmSrt1-RFP in der PM. G Überlagerung des GFP- und
des RFP-Kanals. Es kam zur Co-Lokalisierung der beiden Signale. H
Durchlichtaufnahme
GFP-Floureszenz ist in grün, RFP in rot und Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in blau
dargestellt; bei allen Aufnahmen handelt es sich um konfokale Aufnahmen und optische
Einzelschnitte; Messbalken entsprechen 10 µm.
___________________________________________________________Ergebnisse
65
cepa) und Lauch- (Allium porrum) Epidermiszellen eingebracht. Die
Transformation von Tabak-Epidermiszellen diente dabei als Kontrollansatz, da
bereits vorher eine PM-Lokalisierung von SAUL1 in Tabak gezeigt wurde
(Abbildung 3.17 F). Ein Tag nach Transformation wurde die subzelluläre
Lokalisierung in den jeweiligen Geweben mittels konfokaler Mikroskopie
untersucht.
In Abbildung 3.26 sind Aufnahmen transformierter Zellen abgebildet. Sowohl in
Tabak- als auch in Zuckermelone-Epidermiszellen war eine deutliche GFP-
Fluoreszenz an der Zellperipherie zu sehen, die auch die Chloroplasten
umschließt (Abbildung 3.26 A und B). SAUL1 war also auch in diesen Pflanzen
an der PM lokalisiert. In Zwiebel und Lauch hingegen zeigte sich eine GFP-
Fluoreszenz im Zellkern und im Zytoplasma (Abbildung 3.26 C und D), SAUL1
schien also nicht an der PM verankert zu sein.
Abbildung 3.26 Subzelluläre Lokalisierung von SAUL1-GFP-Fusionsproteinen in
unterschiedlichen Pflanzenspezies nach ballistischer Transformation. A Transiente
Expression von pGD57 (P35S:GFP-SAUL1) in Tabakepidermiszellen. GFP-SAUL1 war an
der PM lokalisiert B Ballistische Transformation einer Epidermiszelle aus Zuckermelone
mit pGD57. GFP-Fluoreszenz konnte an der PM detektiert werden. C Konfokale
Aufnahme einer mit pJB43 (P35S:SAUL1-GFP) transformierten Zelle aus Allium cepa
(Zwiebel). Zytoplasma und Zellkern zeigen GFP-Fluoreszenz D SAUL1-GFP ist in Lauch
(Allium porrum) in Zytoplasma und Zellkern lokalisiert.
Bei den Aufnahmen A, B und D handelt es sich um konfokale Einzelschnitte, Aufnahme
C ist eine Überlagerung aus mehreren Einzelaufnahmen.
GFP-Fluoreszenz ist in grün, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in rot dargestellt. Die
Messbalken entsprechen 20 µm in A, B und D beziehungsweise 100 µm in C
Ergebnisse___________________________________________________________
66
3.6 Überexpression von SAUL1 in planta Für weitere moleklarbiologische Untersuchungen sollten Arabidopsis-
Pflanzenlinien generiert werden, die AtSAUL1 stabil überexprimierten. In
vorausgegangenen Arbeiten waren bereits Pflanzen analysiert worden, die
SAUL1 unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors exprimierten (saul1-1/ 35S-
SAUL1-Pflanzenlinien; Raab et al., 2009). Diese Pflanzen zeigten in RT-PCR-
Analysen eine deutliche Erhöhung des AtSAUL1-Transkriptlevels. Allerdings war
unklar, ob es tatsächlich zu einer Umsetzung in einen erhöhten SAUL1-
Proteingehalt führte. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit Pflanzen generiert
werden, die SAUL1 als Fusionsprotein (mit YFP beziehungsweise
Hämagglutinin-Epitop aus Influenza-Virus; HA) bilden, um in anschließenden
Westernblot-Analysen diese Fusionsproteine detektieren zu können.
Hierbei wurde zum einen das bereits beschriebene Konstrukt P35S:YFP-SAUL1
(pGD41, Abschnitt 3.5.1) verwendet, zum anderen wurde mittels des Gateway®-
Vektorsystems (Invitrogen, siehe Abschnitt 5.2.1.10) ein P35S:HA-SAUL1-
Konstrukt erstellt (pGD42, siehe Abschnitt 5.1.2.2). Beide Konstrukte wurden
mittels floral dip-Methode (siehe Abschnitt 5.2.3.4) in Arabidopis Col-0 Pflanzen
eingebracht (erhaltene Pflanzenlinien: GD41, entstanden durch stabile
Transformation von Arabidopsis mit P35S:YFP-SAUL1, GD42, entstanden durch
stabile Transformation von Arabidopsis mit P35S:HA-SAUL1) und für beide Linien
mehrere transgene Pflanzen durch Selektion auf Basta-Resistenz identifiziert.
Die T2-Generation dieser Pflanzenlinien wurde anschließend mikroskopisch und
phänotypisch untersucht. Betrachtete man die subzelluläre Lokalisierung des
YFP-SAUL1-Fusionsproteins in GD41-Pflanzen, so war YFP-SAUL1 auch in
stabil transformierten Arabidopsis-Pflanzen an der PM lokalisiert. Diese
Lokalisierung war in allen untersuchten Geweben wie Hypokotyl, Kotyledonen,
adulten Blättern und Wurzeln zu finden (Abbildung 3.27 A-C). Darüber hinaus
zeigten sich keine Unterschiede der subzellulären Lokalisierung von YFP-SAUL1
bei Wachstum der GD41-Pflanzen unter HL- oder NL-Bedingungen (Abbildung
3.27 A und B). GD41-Pflanzen zeigten allerdings im Vergleich zu WT-Pflanzen
eine drastische Reduktion des Wachstums (Abbildung 3.27 D und E), gelangten
aber bis zur Samenreife und bildeten dabei pro Pflanze ein bis zwei Schoten aus.
GD42-Pflanzen zeigten ebenfalls ein reduziertes Wachstum, wobei der
Zwergwuchs im Vergleich zu GD41-Pflanzen weniger stark ausgeprägt war
(Abbildung 3.27 F). Bei beiden Pflanzenlinien traten stark eingerollte Blätter auf,
wobei dieser Phänotyp in GD41-Pflanzen wiederum deutlicher ausgeprägt war.
___________________________________________________________Ergebnisse
67
3.7 Etablierung eines antiSAUL1-spezifischen Antikörpers Für weitere biochemische und immunologische Untersuchungen sollte ein
spezifischer AntiSAUL1-Antikörper generiert und gereinigt werden. Bereits im
Vorfeld war versucht worden, einen Peptid-Antikörper zu etablieren, der gegen
ein 18 AS langes Peptid im N-Terminus von SAUL1 gerichtet war (Raab, 2008).
Allerdings konnte mit Hilfe dieses Antikörpers in Westernblot-Experimenten
bislang kein SAUL1-Protein in planta nachgewiesen werden. Daher sollte im
Rahmen dieser Arbeit ein zweiter Antikörper generiert werden, wobei in diesem
Fall das gereinigte Volllängenprotein zur Immunisierung von Kaninchen
verwendet werden sollte, um die Sensitivität des Antikörpers zu erhöhen. Mit
diesem Antikörper sollten anschließend Westernblot-Analysen und Protein-
Protein-Interaktionsstudien durchgeführt werden.
Abbildung 3.27 YFP-SAUL1- beziehungsweise HA-SAUL1-überexprimierende
Arabidopsis-Pflanzen. A-C Konfokale Aufnahmen von GD41-Pflanzen (stabile
Transformation mit P35S:YFP-SAUL1). YFP-SAUL1 war in allen untersuchten Geweben
und unter allen Lichtbedingungen an der PM lokalisiert. A YFP-SAUL1 in Hypokotyl-
Zellen unter HL-Bedingungen. Überlagerung mehrerer konfokaler Einzelaufnahmen. B
Aufnahme eines GD41-Keimblatts unter NL-Bedingungen. Überlagerung mehrerer
konfokaler Einzelaufnahmen. C YFP-SAUL1-Lokalisierung in der Wurzel. Konfokale
Einzelaufnahme. YFP-Fluoreszenz ist in gelb, Eigenfluoreszenz des Chlorophylls in rot
dargestellt. Messbalken entsprechen 150 µm in A und B beziehungsweise 25 µm in C.
D-E Wachstumsvergleich von WT- (D), GD41- (E) und GD42 (F)-Pflanzen. GD41- und
GD42-Pflanzen zeigen eine deutliche Reduktion des Wachstums, die in GD41-Pflanzen
noch weitaus stärker ausgeprägt ist. Das Pflanzenalter betrug zwölf Wochen.
Ergebnisse___________________________________________________________
68
3.7.1 Generierung und Aufreinigung des AntiSAUL1-Antikörpers
Zur Immunisierung von Kaninchen (durchgeführt von Pineda Antikörper-Service,
Berlin) wurde gereinigtes His-SAUL1-Protein verwendet (siehe Abschnitt 3.2.3).
Nach Test der Prä-Seren wurden zwei geeignete Kaninchen und ein
Meerschweinchen für die Immunisierung ausgewählt. Der Fortschritt der
Immunisierung wurde zu den Zeitpunkten t = 60, 90, 120 und 145 Tage mittels
Westernblot überprüft. In Abbildung 3.28 sind die Ergebnisse der Westernblot-
Analyse des 90. Immunisierungstages dargestellt. Als Antigen dienten zum einen
Rohextrakte aus E.coli-Zellen, die ein MBP-SAUL1-Fusionsprotein bildeten
(pSR127; MW: 132 kDa, Raab 2008), zum anderen gereinigtes His-SAUL1-
Protein (siehe Abschnitt 3.2.3; MW: 89,2 kDa) und Protein-Rohextrakte aus
Blättern von Col-0-Pflanzen. Bei Westernblot-Analysen mit Antiseren aus
Kaninchen konnten neben zahlreichen Kreuzreaktionen spezifische Signale für
SAUL1-Fusionsproteine detektiert werden (Banden bei etwa 130 kDa und 90 kDa
entsprechen MBP-SAUL1 beziehungsweise His-SAUL1; Abbildung 3.28 A). In
Proteinextrakten aus Col-0-Pflanzen hingegen konnte kein SAUL1-Protein
nachgewiesen werden.
qwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwwww
Abbildung 3.28 Westernblot-Analyse zum Test von SAUL1-Antiseren. Es wurden die
Antiseren des 90. Immunisierungstages 1:1000 verdünnt im Westernblot eingesetzt. Als
Antigen dienten E.coli-Rohextrakte aus pSR127, His-SAUL1 und Col-0-Proteinextrakte.
A Westernblot unter Verwendung der Antiseren von Kaninchen 1 (links) und Kaninchen 2
(rechts). Neben zahlreichen unspezifischen Kreuzreaktionen Detektion der spezifischen
MBP-SAUL1- beziehungsweise His-SAUL1-Proteinbande (rot markiert). B Westernblot
mit Antiserum aus Meerschweinchen. Es wurde keinerlei Signal detektiert.
MBP-SAUL1: Rohextrakt nach Zellaufschluss von pSR127 (pLac:MBP-SAUL1)-
exprimierenden E.coli-Zellen; His-SAUL1: gereinigtes His-SAUL1-Fusionsprotein; Col:
Proteinrohextrakt aus Col-0-Pflanzen; erwartete Molekulargewichte: MBP-SAUL1: 132,0
kDa, His-SAUL1: 89,2 kDa, natives SAUL1: 88,4 kDa.
___________________________________________________________Ergebnisse
69
Eine entsprechende Bande des SAUL1-Proteins wäre auf einer Höhe von 88,4
kDa erwartet worden. Bei der mit dem Serum von Kaninchen 1 erhaltenen Bande
(etwa 130 kDa) handelt es sich vermutlich um eine Verunreinigung aus Spur 1,
da diese Bande in allen Proben zu finden ist. Die auftretenden Kreuzreaktionen
ließen sich durch die Verwendung von ungereinigtem Serum erklären. Für das
Antiserum aus Meerschweinchen konnten keinerlei Proteinbanden detektiert
werden (Abbildung 3.28 B), auch nach fortschreitender Immunisierung konnte
hiermit kein SAUL1-Protein nachgewiesen werden.
Die Immunisierung wurde bis zum 145. Tag fortgesetzt und anschließend das
Serum von Kaninchen 2 zur Anreicherung von AntiSAUL1-Antikörpern
verwendet. Die Anreicherung von spezifischen AntiSAUL1-Antikörpern erfolgte
dabei über MBP-SAUL1-Protein gemäß Anleitung (siehe Material und Methoden
5.2.4.3).
3.7.2 Nachweis von SAUL1-Protein in planta Der in Abschnitt 3.7.1 beschriebene anti-SAUL1-Antikörper sollte zum
immunologischen Nachweis von SAUL1 in pflanzlichen Proteinextrakten
verwendet werden. Da wie in Abschnitt 3.5.1 gezeigt SAUL1 an der PM vorliegt,
sollte untersucht werden, ob auch in Westernblot-Analysen SAUL1-Protein in
Membranfraktionen nachgewiesen werden kann. Hierfür wurden Proteinextrakte
aus WT-Pflanzen und transgenen Arabidopsis-Pflanzen isoliert, die YFP-SAUL1-
beziehungsweise HA-SAUL1-Konstrukte unter Kontrolle des 35S-Protmotors
überexprimierten (Pflanzenlinien GD41 für YFP, GD42 für HA; Anschnitt 3.6).
Darüber hinaus wurde die Pflanzenlinie Kompl.16-8 mitgeführt, die zur
Komplementation von saul1-1-Mutanten generiert worden war und in
Expressionsanalysen eine deutliche Überexpression von SAUL1 aufwies (Raab
et al., 2009). Die Proteinextrakte wurden anschließend durch Zentrifugation in die
lösliche Protein- und die Gesamtmembran-Fraktion aufgetrennt und für
Westernblot-Analysen mit AntiSAUL1-Antikörper verwendet. In den darauf
folgenden Westernblot-Analysen diente gereinigtes His-SAUL1-Protein als
Positivkontrolle.
Abbildung 3.29 zeigt das Ergebnis der durchgeführten Westernblot-Analysen.
Während in WT-Pflanzen in keiner der Proteinfraktionen SAUL1 nachgewiesen
werden konnte, zeigten sich in Proteinextrakten aus sowohl GD41- wie auch
GD42-Pflanzen deutliche Signale in den Gesamtmembran-Fraktionen, die den
erwarteten Proteingrößen entsprachen (YFP-SAUL1: 120 kDa; HA-SAUL1:
91,2 kDa; Abbildung 3.29 A). In GD41-Proteinextrakten trat darüber noch eine
weitere Bande auf einer Höhe von etwa 90 kDa auf, was SAUL1-Protein
entspricht (88,4 kDa). Diese Proteinbande könnte auf eine proteolytische
Ergebnisse___________________________________________________________
70
Spaltung des YFP-SAUL1-Fusionsproteins zurückzuführen sein. In der
Positivkontrolle (gereinigtes His-SAUL1) konnten neben His-SAUL1-Protein
zahlreiche kleinere Abbauprodukte nachgewiesen werden. Für die Pflanzenlinie
Kompl.16-8 war in Westernblot-Analysen ebenfalls ein deutliches Signal für
SAUL1 in der Gesamtmembran-Fraktion zu erkennen, wobei die Proteinmenge
im Vergleich zu GD41-Pflanzen vermindert war (Abbildung 3.29 B).
Somit konnte auch in Westernblot-Analysen nachgewiesen werden, dass SAUL1
in Arabidopsis membranassoziiert ist, auch wenn in WT-Pflanzen vermutlich
aufgrund der zu geringen Proteinmenge kein SAUL1 nachgewiesen werden
konnte. Der so getestete AntiSAUL1-Antikörper steht für weitere Untersuchungen
wie Interaktionsstudien und weitere Westernblot-Analysen zur Verfügung.
Abbildung 3.29 Westernblot zur immunologischen Detektion von SAUL1-Protein in
Proteinextrakten aus SAUL1-überexprimierenden und WT-Pflanzen. AntiSAUL1-
Antikörper waren aus dem Serum Kan 2 145. Tag angereichert und in einer Verdünnung
von 1:100 in Westernblot-Analysen verwendet worden. A Detektion von SAUL1-
Fusionsproteinen in Membranfraktionen aus GD41- und GD42-Pflanzen. Gereinigtes His-
SAUL1 diente als Positivkontrolle. B Nachweis von SAUL1-Protein in Membranfraktionen
von Kompl.16-8- und GD41-Proteinextrakten.
L: Fraktion der löslichen Proteine; M: Gesamtmembran-Fraktion; erwartete
Molekulargewichte: SAUL1: 88,4 kDa; YFP-SAUL1: 120 kDa; HA-SAUL1: 91,2 kDa; His-
SAUL1: 89,2 kDa.
____________________________________________________________Diskussion
71
4 Diskussion Im Zentrum dieser Arbeit stand die E3-Ubiquitinligase SAUL1, die bereits in
vorangegangenen Arbeiten als negativer Regulator von Seneszenzprozessen in
Arabidopsis charakterisiert worden war. Während zum einen Untersuchungen zur
physiologischen Funktion von SAUL1 durchgeführt wurden, war ein weiterer
Schwerpunkt die subzelluläre Lokalisierung von SAUL1.
4.1 ABA und Seneszenz Die E3-Ubiquitinligase SAUL1 konnte als negativer Regulator von pflanzlichen
Seneszenzprozessen charakterisiert werden (Raab et al., 2009). So zeigten
saul1-Mutanten, die eine T-DNA-Insertion bezüglich AtSAUL1 tragen, einen
deutlich verfrühten, lichtabhängigen Seneszenzphänotyp. Das Auftreten der
Seneszenzsymptome unter Lichtbedingungen mit niedrigen PFDn ging dabei mit
einem starken Anstieg des endogenen ABA-Gehalts einher (Raab et al., 2009
und Abbildung 3.4). Es war allerdings unklar, inwiefern diese erhöhten ABA-Level
für ein Einleiten von Seneszenz in saul1-Pflanzen verantwortlich waren. Bislang
gibt es in Arabidopsis einige Hinweise auf eine Rolle von ABA in
Seneszenzprozessen, ein direkter Zusammenhang konnte allerdings noch nicht
nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass in seneszenten Blättern
der endogene ABA-Gehalt erhöht ist und dass eine exogene Zugabe von ABA
ausreichend ist, um eine Gelbfärbung von Arabidopsis Blättern zu induzieren
(Gepstein und Thimann, 1980; Weaver et al., 1998).
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein direkter Zusammenhang zwischen ABA und
dem Start des Seneszenzprogramms in Arabidopsis aufgezeigt. Tatsächlich
konnte in Arabidopsis-Pflanzen nachgewiesen werden, dass Änderungen in der
ABA-Signaltransduktion zu einem veränderten Seneszenzverhalten führen. In der
ABA-hypersensitiven Mutante era1-3 wurde bei täglicher Applikation von ABA ein
verfrühtes Auftreten von Seneszenzsymptomen beobachtet. Die ABA-
insensitiven Signalmutanten abi1-1 und abi2-1 hingegen zeigten bei dieser
Behandlung im Vergleich zu WT-Pflanzen ein verspätetes Einsetzen der
Seneszenz (siehe 3.2.4.1). Der Startpunkt des Seneszenzprogramms ist also
direkt an ABA-Signaltransduktion gekoppelt.
Einen weiteren Hinweis auf die Rolle von ABA in der Ausbildung von
Seneszenzsymptomen in saul1-Pflanzen lieferten Analysen von saul1-1abi1-1-
Doppelmutanten. Diese zeigten eine zumindest partielle Reduktion des saul1-
Phänotyps unter NL-Bedingungen (siehe Abschnitt 3.2.4.2). Ein Defekt in der
ABA-Signalweiterleitung ist also hinreichend, um die Seneszenzprozesse in
saul1-Mutanten zu verlangsamen.
Diskussion____________________________________________________________
72
Anhand dieser Ergebnisse ist festzuhalten, dass dem Phytohormon ABA und
dessen Signalweiterleitung eine entscheidende Rolle bei der Induktion von
Seneszenzprozessen in Arabidopsis-Pflanzen zukommt.
4.2 Die Rolle von SAUL1 bei der Regulation der ABA-
Biosynthese
In vorausgegangenen Untersuchungen war SAUL1 als eine E3-Ubiquitinligase
charakterisiert worden, die durch gerichteten Proteinabbau die Induktion von
Seneszenzprozessen reguliert (Raab et al., 2009). Darüber hinaus konnte unter
bestimmten Lichtbedingungen (PFD < 60 - 80 µmol m-2 s-1) eine Zunahme des
endogenen ABA-Gehalts in saul1-Pflanzen gemessen werden. Aufgrund des
Anstiegs des Proteinlevels der Aldehydoxidase 3 (AAO3) und der zugehörigen
Enzymaktivität AOδ in saul1-Pflanzen wurde AAO3 dabei als erstes Zielprotein
des SAUL1-abhängigen Proteinabbaus postuliert. Eine direkte Interaktion
zwischen SAUL1 und AAO3 konnte allerdings noch nicht nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein unmittelbarer Zusammenhang zwischen
SAUL1 und der Regulation der ABA-Biosynthese hergestellt.
4.2.1 SAUL1 interagiert mit AAO3 Die Aldehydoxidase-Isoform AOδ (kodiert von AAO3) katalysiert den letzten
Schritt der ABA-Biosynthese, die Umsetzung von Abszisinaldehyd zu
Abszisinsäure (Seo et al., 2000b). Es konnte gezeigt werden, dass sowohl eine
Überexpression von AAO3 als auch von NCED3 (9-cis-Epoxykarotiniod-
Dioxygenase3) unabhängig voneinander ausreichend ist, um die ABA-
Biosynthese zu stimulieren (Iuchi et al., 2001; Melhorn et al., 2008). Somit
scheinen sowohl AOδ als auch NCED3 eine Schlüsselrolle in der Regulation der
ABA-Biosynthese zu besitzen. So zeigen aao3-1-Mutanten, die eine
Punktmutation in AAO3 tragen, einen deutlichen Welkephänotyp, was auf einen
verminderten ABA-Gehalt und damit eine erhöhte Transpirationsrate
zurückzuführen ist (Seo et al., 2000b; Gonzalez-Guzman et al., 2004). Darüber
hinaus konnte unter Trockenstressbedingungen eine Steigerung des AAO3-
Expressionslevels sowie der enzymatischen Aktivität AOδ gemessen werden.
Eine Zunahme des AAO3-Proteinlevels hingegen konnte bislang nicht
nachgewiesen werden (Seo et al., 2000b; Seo und Koshiba, 2002).
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Anstieg des AAO3-
Proteinlevels sowie der Enzymaktivität von AOδ mit dem Auftreten von
Seneszenzsymptomen in saul1-Mutanten korreliert. So zeigen saul1-Pflanzen,
die unter Lichtbedingungen mit niedriger PFD angezogen wurden, einen
deutlichen Anstieg der AOδ-Aktivität. Dieser Anstieg der AOδ-Aktivität konnte
____________________________________________________________Diskussion
73
zum einen durch Komplementation der Mutation in SAUL1, zum anderen durch
Wachstum von saul1-Pflanzen unter hohen Lichtintensitäten unterdrückt werden
(Raab et al., 2009, Abbildung 3.5 C). Auch bei Betrachtung der AAO3-
Proteinmenge in saul1- und WT-Pflanzen in einem zeitlichen Verlauf, korreliert
die Zunahme an AAO3-Protein mit dem Auftreten von ersten Anzeichen von
Seneszenz in saul1-Keimlingen (Abbildung 3.5 B). saul1-Pflanzen entwickeln
sich bis zu einem 4-Blatt-Stadium vergleichbar zu WT-Pflanzen, wobei in beiden
Fällen nur ein sehr niedriger AAO3-Proteinlevel gemessen werden konnte. Diese
Beobachtung stimmt mit bereits veröffentlichten Daten überein (Seo et al.,
2000a). Erst ab einem Entwicklungsalter von etwa 8 Tagen kommt es zu einer
übermäßigen Zunahme an AAO3-Protein in saul1-Keimlingen, was mit dem
Auftreten von Seneszenzsymptomen einhergeht. Diese Korrelationen deuten
darauf hin, dass SAUL1 in Arabidopsis an der Regulation der ABA-Biosynthese
und somit von Seneszenzprozessen durch Regulation des AAO3-Proteinlevels
beteiligt ist. In abschließenden Studien zum Nachweis von transienten Protein-
Protein-Wechselwirkungen konnte tatsächlich eine direkte Interaktion von SAUL1
und AAO3 gezeigt werden (Abbildung 3.6). Scheinbar kommt es dabei aber nicht
zur Ausbildung eines stabilen Proteinkomplexes, da Interaktionsstudien, die auf
eine solche Komplexbildung ausgelegt waren, ohne Ergebnis blieben (nicht
gezeigt).
SAUL1 interagiert also mit AAO3, markiert dieses vermutlich für den gezielten
Proteinabbau über das 26S-Proteasom und hat somit direkten Einfluss auf die
Biosynthese von ABA. In zwei weiteren Fällen konnte ebenfalls eine Funktion des
UPS bei der Regulation von Biosyntheseschritten verschiedener Phytohormone
nachgewiesen werden. So ist ETO1 (ethylene overproducer1) als
substratspezifisches Adapterprotein am Abbau von Typ 2 ACC-Synthasen und
dem E3-Ligasekomplex um CUL3 und somit der Regulation der Ethylen-
biosynthese beteiligt (Wang et al., 2004). Vergleichbar zu SAUL1 scheint auch
das RING-H2-Protein XERICO eine wichtige Rolle bei der Regulation der ABA-
Biosynthese zu spielen, auch wenn hier noch kein direkter Zusammenhang
hergestellt werden konnte (Ko et al., 2006).
4.2.2 Lichtabhängigkeit des Seneszenzphänotyps von saul1-Pflanzen
Die Tatsache, dass der Anstieg des endogenen ABA-Levels in saul1-Mutanten
und die daraus resultierende Einleitung des Seneszenzprogrammes von den
vorherrschenden Lichtbedingungen abhängig ist, wirft eine wesentliche Frage
auf: warum kommt es nur unter niedrigen Lichtbedingungen zu Seneszenz? Oder
anders gefragt: warum kommt es unter hohen Lichtintensitäten nicht zu einem
Diskussion____________________________________________________________
74
Anstieg der ABA-Biosynthese und den damit verbundenen Seneszenz-
symptomen?
Eine mögliche Erklärung für die Lichtabhängigkeit des Seneszenzphänotyps von
saul1-Mutanten beziehungsweise des fehlenden Anstiegs des endogenen ABA-
Gehalts unter HL-Bedingungen wäre eine Verschiebung der ABA-Biosynthese
vom Produkt ABA hin zu den Edukten Violaxanthin, Antheraxanthin und
Zeaxanthin (gemeinsam abgekürzt als VAZ). In Spinat und Tabak konnte bereits
gezeigt werden, dass es bei Wachstum von Pflanzen unter Starklicht-
Bedingungen durch Regulation von Enzymaktivitäten zu einer Verschiebung der
ABA-Biosynthese kommt und der VAZ-Pool deutlich zunimmt (Eskling und
Åkerlund, 1998; Bugos et al., 1999). Gegen diese Möglichkeit sprechen
allerdings drei Punkte. Zum einen trat der beschriebene Effekt in Spinat und
Tabak erst unter sehr hohen PFDn (~900 µmol m-2 s-1) auf. Bei den in dieser
Arbeit verwendeten Lichtintensitäten hingegen sollte es zu keiner Verschiebung
der ABA-Biosynthese kommen. Des Weiteren war bei der Bestimmung des
Pigmentgehalts in saul1-Pflanzen, die unter hohen PFDn angezogen worden
waren und somit keine Seneszenzsymptome zeigten, keinerlei Verschiebung der
Pigmentzusammensetzung festzustellen (Abbildung 3.13 A-C). Und schließlich
müsste in diesen Pflanzen weiterhin ein Anstieg des AAO3-Proteinlevels
festzustellen sein, der auf das Fehlen von SAUL1 zurückzuführen wäre.
Allerdings sind sowohl der AAO3-Proteingehalt als auch die zugehörige
Enzymaktivität unter diesen Wachstumsbedingungen auf WT-Niveau (Abbildung
3.5 C und nicht gezeigt).
Somit scheint SAUL1 vielmehr eine spezifische Rolle bei der Regulation der
ABA-Biosynthese unter NL-Bedingungen zu spielen. In Pflanzen, die für längere
Zeit in vollständiger Dunkelheit angezogen wurden, kam es zu einer Induktion der
ABA-Biosynthese (Weatherwax et al., 1996). Denkbar wäre dass eine solche
Regulation bereits unter NL-Bedingungen induziert wird. Um allerdings ein
Auslösen von Seneszenzprozessen unter diesen - möglicherweise nur
vorübergehenden - Lichtbedingungen zu verhindern, reguliert SAUL1 hier den
Proteinlevel von AAO3 und somit den endogenen ABA-Gehalt. In saul1-Mutanten
kann dieses schützende Eingreifen nicht mehr stattfinden, die ABA-Biosynthese
schießt über und Seneszenz wird in den Pflanzen eingeleitet. Eine ähnliche
Funktion könnte SAUL1 auch unter Stressbedingungen wie hohen
Salzkonzentrationen und osmotischen Stress zukommen. Wie gezeigt werden
konnte, sind diese Wachstumsbedingungen ebenso in der Lage, eine
Gelbfärbung der Blätter in saul1-Mutanten zu bewirken (Abbildung 3.11). Ob es
sich bei dem beschriebenen Phänotyp um Seneszenz handelt und ob es unter
____________________________________________________________Diskussion
75
diesen Bedingungen zu einem Anstieg des endogenen ABA-Gehalts kommt, ist
in zukünftigen Untersuchungen zu zeigen.
4.2.3 Weitere Phänotypen von saul1-Mutanten Da gezeigt werden konnte, dass SAUL1 die ABA-Biosynthese unter NL-
Bedingungen reguliert, sollte weiterhin untersucht werden, ob dieser
Regulationsmechanismus auch unter anderen Umweltreizen zum Greifen kommt.
Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Wachstums- und
Stressversuche mit saul1-Pflanzen durchgeführt, für die bekannt ist, dass ABA
bei der pflanzlichen Reaktion auf diese Behandlungen eine wichtige Rolle spielt
(Review in Koornneef et al., 2002, Xiong und Zhu, 2003, Seo und Koshiba,
2002). So wurden unter anderem Keimungs- und Wachstumsverhalten von
saul1-Mutanten unter Stressbedingungen oder die Reaktion auf extreme
Trockenheit untersucht. Grundsätzlich lässt sich zusammenfassen, dass saul1-
Pflanzen in allen durchgeführten Bioassays eine erhöhte ABA-Sensitivität
aufwiesen (Abschnitt 3.3). Da im Vorfeld bereits gezeigt worden war, dass die
ABA- Wahrnehmung und Signalweiterleitung in saul1-Mutanten unverändert ist,
lassen sich diese Änderungen auf eine gesteigerte ABA-Biosynthese
zurückführen.
Trockenstress
Wurden saul1-Pflanzen extremer Trockenheit ausgesetzt, so zeigte sich eine
deutlich erhöhte Toleranz gegenüber dieser Stressbedingung (Abbildung 3.12).
Bereits nach sechs Tagen Trockenheit zeigten WT-Pflanzen im Vergleich zu
saul1-Mutanten einen deutlich stärker ausgeprägten Welke-Phänotyp. Nach einer
Regenerationszeit von zehn Tagen waren saul1-Pflanzen in der Lage, sich von
diesen Stressbedingungen wieder zu erholen, während WT-Pflanzen abstarben
(Abschnitt 3.3.2.3). Diese erhöhte Trockentoleranz lässt sich vermutlich auf die
Deregulation der ABA-Biosynthese zurückführen. Es ist bekannt, dass ABA
entscheidend an der Regulation der Schließzellbewegung und damit des
Wasserhaushalts von Pflanzen beteiligt ist (Schroeder et al., 2001). Das Fehlen
von AOδ-Aktivität in aao3-1-Mutanten führt zu einem deutlich gesenkten ABA-
Level in den Rosettenblättern dieser Pflanzen und einem daraus resultierenden
Welke-Phänotyp, der auf fehlende Regulation des Wasserhaushalts
zurückzuführen ist (Seo et al., 2000b). Im Gegenzug dazu ist eine
Überexpression von ABA-Biosynthesegenen wie AtNCED3 und AAO3 in
Schließzellen von Vicia faba ausreichend, um zu einem Schließen der Stomata
zu führen (Melhorn et al., 2008). Somit kann angenommen werden, dass es in
saul1-Pflanzen auch unter Trockenstressbedingungen zu einer Anhäufung von
Diskussion____________________________________________________________
76
AAO3-Protein kommt, was in einem erhöhten ABA-Level und damit einer
verbesserten Trockentoleranz resultiert. Ein experimenteller Nachweis für diese
Annahme steht allerdings noch aus.
Keimungsverhalten
Ähnlich verhält es sich mit auftretenden Veränderungen im Keimungsverhalten
von saul1-1-Mutanten unter unterschiedlichen Stressbedingungen. Der
hemmende Einfluss von ABA auf das Keimungsverhalten von Arabidopsis-
Samen ist bestens untersucht. So zeigen verschiedene ABA-
Signaltransduktionsmutanten wie abi1-1, abi2-1, era1-3 oder auch azf2-1 ein
verändertes Keimungsverhalten (Leung et al., 1994; Meyer et al., 1994; Cutler et
al., 1996; Leung et al., 1997; Rodriguez et al., 1998; Drechsel et al., 2010a). Bei
AZF2 (Arabidopsis zinc finger protein 2) handelt es sich hierbei um einen
Zinkfingertranskriptionsfaktor, der an der Regulation der Samenkeimung beteiligt
ist (Drechsel et al., 2010a). Doch auch durch exogene Zugabe von NaCl oder
osmotisch-aktiven Substanzen wie Mannit oder Sorbit kann das
Keimungsverhalten beeinträchtigt werden (Finkelstein et al., 2002). saul1- und
WT-Samen wiesen in Keimungstests auf MS-Festmedium sowie bei Zugabe von
exogenem ABA keinerlei Unterschiede im Keimungsverhalten auf (Abbildung
3.10). Dies lässt zum einen auf eine intakte ABA-Signaltransduktion als auch auf
einen unveränderten ABA-Gehalt in saul1-Samen im ungestressten Zustand
schließen. Wurden jedoch Keimungstests unter Stressbedingungen durchgeführt,
so zeigten saul1-Mutanten eine signifikante Reduktion der Keimungsrate
(Abbildung 3.10 C und D), was möglicherweise auf einen erhöhten ABA-Level in
saul1-Samen unter diesen Stressbedingungen zurückzuführen ist. Ähnliches
konnte bereits in anderen Pflanzen mit gesteigerter ABA-Biosynthese beobachtet
werden. So führt eine Überexpression von ABA2, dessen Genprodukt die
Umsetzung von Xanthoxin zu Abscisinaldehyd katalysiert, zu einem Anstieg des
endogenen ABA-Gehalts, was schließlich in einer reduzierten Keimungsrate auf
NaCl-haltigem MS-Festmedium resultiert (Lin et al., 2007). Wurden dagegen
ABA-Biosynthesegene durch Mutationen deletiert, so konnte für aba2- und
nced3-Mutanten gezeigt werden, dass dies zu einer erhöhten Keimungsrate
unter Salz- und osmotischen Stressbedingungen führt (Gonzalez-Guzman et al.,
2004; Ruggiero et al., 2004; Lin et al., 2007). Allerdings zeigten Samen einer
aao3-Nullmutante keinerlei Veränderungen des Keimungsverhaltens (Seo et al.,
2000b). Dieser Befund wurde damit begründet, dass in Samen dieser
Pflanzenlinie keine Unterschiede im ABA-Gehalt zu WT-Pflanzen festgestellt
werden konnten und vermutlich eine andere Isoform der Aldehydoxidasefamilie
für die ABA-Biosynthese in Samen verantwortlich ist.
____________________________________________________________Diskussion
77
Inwiefern SAUL1 an dem gezielten Proteinabbau dieser zusätzlichen
Aldehydoxidasen beteiligt ist, muss in weiterführenden Studien untersucht
werden.
Wachstumsverhalten
Auch in unterschiedlichen Wachstumsstudien konnte ein Zusammenhang
zwischen SAUL1 und der ABA-Biosynthese hergestellt werden. Bei Wachstum
von saul1-1-Mutanten auf Erde und unter Lichtintensitäten von etwa
200 µmol m-2 s-1 zeigten diese Pflanzen im Vergleich zu WT-Pflanzen ein deutlich
ausgeprägtes Zwergwachstum (Abbildung 3.9). Diese Reduktion des Wachstums
war weder auf eine Verminderung der Zellzahl zurückzuführen, noch hatte eine
exogene Zugabe des Phytohormons GA3 eine förderliche Wirkung auf saul1-1-
Mutanten. Einzig eine Erhöhung der Lichtintensität auf > 400 µmol m-2 s-1 konnte
das Wachstumsdefizit komplementieren (Raab et al., 2009). Diese
Beobachtungen korrelieren mit den gemessenen AOδ-Aktivitäten unter diesen
Lichtbedingungen. In kleinwüchsigen saul1-Pflanzen ist im Vergleich zu WT-
Pflanzen eine erhöhte AOδ-Aktivität nachweisbar, die durch gesteigerte
Lichtintensitäten auf WT-Niveau absinkt (Abbildung 3.5). Das beobachtete
Zwergwachstum scheint also ebenfalls auf eine gesteigerte ABA-Biosynthese
zurückzuführen zu sein.
Bei Transfer von saul1-1-Keimlingen auf MS-Festmedium mit unterschiedlichen
Konzentrationen an NaCl oder Mannit, zeigte sich eine deutliche Gelbfärbung der
saul1-1-Blätter, was auf ein Einsetzen des Seneszenzprogramms in diesen
Pflanzen hindeutete. WT-Keimlinge hingegen zeigten keine Anzeichen von
Seneszenz (Abbildung 3.11). Auch dieser Befund könnte auf einen Anstieg der
ABA-Biosynthese zurückzuführen sein, konnte doch gezeigt werden, dass unter
Salz- und osmotischen Stressbedingungen eine rapide Zunahme des endogenen
ABA-Gehalts erfolgt (Übersicht in Xiong und Zhu, 2003). Für beinahe alle ABA-
Biosynthesegene konnte ein Anstieg der Genexpression unter Salzstress-
bedingungen gezeigt werden (Seo et al., 2000b; Iuchi et al., 2001; Xiong et al.,
2001; Xiong et al., 2002), wobei bislang unklar ist, inwiefern sich dies auch in
erhöhte Proteinlevel umsetzt. Im Falle von saul1-Mutanten könnte es durch
fehlende Regulation der AAO3-Proteinmenge zu einer überschießenden ABA-
Biosynthese und damit zu den beobachteten Seneszenzsymptomen kommen.
Ein Anstieg der endogenen ABA-Konzentrationen unter den beschriebenen
Wachstumsbedingungen beziehungsweise ein Nachweis, dass es sich bei der
Gelbfärbung von saul1-Keimlingen unter Stressbedingungen tatsächlich um
Seneszenzsymptome handelt muss allerdings noch gezeigt werden.
Diskussion____________________________________________________________
78
Bei Untersuchungen zum Wurzelwachstum unter verschiedenen
Stressbedingungen hingegen konnten keine Unterschiede zwischen saul1-1- und
WT-Pflanzen festgestellt werden (Abbildung 3.11). Endogene ABA-
Konzentrationen spielen beim Wurzelwachstum eine entscheidende Rolle. So
führt ein zu niedriger endogener ABA-Level zu einem verminderten
Wurzelwachstum, ein erhöhter ABA-Gehalt hingegen zu einem Einstellen des
Streckungswachstums der Wurzel (Xiong et al., 2006). In saul1-1-Mutanten
scheint sich der endogene ABA-Gehalt also auf WT-Niveau zu befinden und es
kommt nicht wie in den übrigen Geweben zu einem Anstieg des ABA-Levels.
Allerdings spielt AAO3 nur eine untergeordnete Rolle in der ABA-Biosynthese in
Wurzeln von Arabidopsis. In diesem Gewebe wird diese Funktion vermutlich von
einem anderen Mitglied der AO-Proteinfamilie übernommen wird (Seo et al.,
2000a; Seo et al., 2000b). Dies deutet darauf hin, dass SAUL1 spezifisch an der
Regulation von AAO3-Proteinmengen, nicht aber an den Proteinleveln der
übrigen AO-Proteine in Arabidopsis beteiligt ist.
Schließlich könnte auch das Zwergwachstumsverhalten der SAUL1-
überexprimierenden Pflanzenlinien GD41 und GD42 (vergleiche Abbildung 3.27)
auf Veränderungen der ABA-Biosynthese zurückzuführen sein. Durch
Überexpression von SAUL1 könnte es zu einem vermehrten Abbau von AAO3-
Protein und damit zu einer Reduktion der ABA-Biosynthese kommen, was in
einem Wachstumsdefizit dieser Pflanzen resultiert. Für aba2-Mutanten, die einen
erheblich reduzierten endogenen ABA-Gehalt aufweisen, konnte ebenso ein
vermindertes Wachstum beobachtet werden (Lin et al., 2007). Allerdings konnte
die Zwergwüchsigkeit von GD41 und GD42 nicht durch eine exogene Zugabe
von ABA komplementiert werden (nicht gezeigt).
4.3 saul1-Mutanten als Modellsystem zur Untersuchung
des Seneszenzprogramms auf Transkriptionsebene
Anhand von Untersuchungen zu molekularen Vorgängen auf transkriptioneller
Ebene konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass in saul1-Mutanten
mit einsetzendem Seneszenzprozess erhebliche Veränderungen auf
Genexpressionsebene einhergehen. Als ein genetischer Marker für
Seneszenzprozesse wurde unter anderem die Expression von ORE1, das für den
Transkriptionsfaktor ORE1 kodiert, genutzt. ORE1 bildet gemeinsam mit
miRNA164 und EIN2 (ethylene insensitive 2) einen molekularen Schalter zur
Regulation von altersabhängigem Zelltod in Blättern (Kim et al., 2009). ORE1-
Expression wird dabei durch miRNA164 reprimiert. Mit zunehmendem Blattalter
kommt es zum einen zu einer Induktion der ORE1-Expression durch EIN2. Zum
____________________________________________________________Diskussion
79
anderen wird die Expression von miRNA164 reprimiert, was zu einer weiteren
Verstärkung der ORE1-Expression führt. Arabidopsis-Blätter sind ab einem Alter
von etwa 28 Tagen in der Lage, altersabhängigen Zelltod zu induzieren. Zu
diesem Zeitpunkt ist ORE1-Expression hoch genug, um die Expression von
verschiedenen seneszenz-assoziierten Genen (SAG’s) und damit Seneszenz zu
induzieren (Kim et al., 2009). Die durchgeführten Untersuchungen zum point of
no return zeigen allerdings, dass dieser Schalter in saul1-1-Pflanzen bereits
wesentlich früher umgelegt ist (siehe Abschnitt 3.1.2.2). In diesem pulse-chase-
Experiment wurden saul1-1-Keimlinge 5, 8 beziehungsweise 11 Tage lang NL-
Bedingungen ausgesetzt und anschließend zur Erholung auf permissiven
Lichtbedingungen weiterkultiviert. Dabei wurde die Expression von ORE1 in
diesen Pflanzen vor und nach der Regenerationszeit gemessen. In allen
untersuchten Proben kam es vor Beginn der Regenerationsphase zu einem etwa
5-fachen Anstieg der ORE1-Expression Die jeweiligen Pflanzenalter betrugen
hierbei 16, 19 und 22 Tage. Ein Anstieg des ORE1-Transkriptlevels konnte in
saul1-1-Pflanzen also bereits vor dem in vorherigen Studien als kritisch
beschriebenen Blattalter erreicht werden. Bei 5 und 8 Tagen NL-Behandlung
konnte durch die anschließende Erholungsphase ein vollständiges Absinken auf
WT-Niveau beziehungsweise ein Arrest der ORE1-Expression erreicht werden
(Abbildung 3.3). Auch auf Pflanzenebene kam es zu einem Arrest des
Seneszenzprogramms. Bei längerem Wachstum unter NL-Bedingungen konnte
das Ablaufen der Seneszenz und somit der Tod der Pflanzen nicht mehr
aufgehalten werden, was sich auch auf Expressionsebene niederschlug. Hierbei
kam es trotz Regeneration auf permissiven Lichtbedingungen zu einer
überschießenden Produktion an ORE1-Transkript. Diese Ergebnisse
unterstreichen die entscheidende Rolle von ORE1 bei der Festlegung eines
point-of-no-returns in saul1-1-Mutanten.
Auch in den durchgeführten Microarray-Analysen kam es zu einem verfrühten
Anstieg der ORE1-Transkriptlevel. Ein signifikanter Anstieg der ORE1-
Expression war dabei in saul1-Mutanten 48 Stunden nach Transfer von
permissiven auf niedrige Lichtbedingungen zu beobachten (siehe Abschnitt
3.1.2.1). Das Pflanzenalter betrug hierbei sogar nur 14 Tage. Betrachtete man
allerdings die Expressionslevel von WRKY53, WRKY6 und AtNAP, so konnte
hier ein signifikanter Anstieg bereits nach sechs beziehungsweise 24 Stunden
nachgewiesen werden. In vorausgegangen Arbeiten konnte bereits
nachgewiesen werden, dass hohe Transkriptlevel dieser Gene ausreichend sind,
um Seneszenz in Arabidopsis zu induzieren (siehe Abschnitt 2.2.3 und Robatzek
und Somssich, 2002; Miao et al., 2004; Guo und Gan, 2006). Diese Ergebnisse
lassen darauf schließen, dass WRKY53, WRKY6 und AtNAP upstream von
Diskussion____________________________________________________________
80
ORE1 aktiv sind und hier den Start des Seneszenzprogramms regulieren.
Weiterführende kinetische Studien zur Aufschlüsselung von ersten Schritten des
Seneszenzprogramms können zukünftig zur Aufklärung der Hierarchie der
einzelnen Transkriptionsfaktoren untereinander und der Position von SAUL1
innerhalb des Seneszenznetzwerkes beitragen. In diesem Zusammenhang sollte
auch besonderes Augenmerk auf die subzelluläre Lokalisierung von SAUL1
gelegt werden (siehe Abschnitt 4.4.3).
Eine weiterführende Auswertung der erhaltenen Microarray-Daten deutet darauf
hin, dass das Phytohormon Salicylsäure (SA) eine ebenso entscheidende -
möglicherweise sogar ABA-übergeordnete - Rolle in der Induktion von
Seneszenzprozessen in saul1-1-Pflanzen spielt (Drechsel et al., 2010c). So
konnte gezeigt werden, dass die Expression von SA-abhängigen Genen bereits
zum Zeitpunkt t = 6 h signifikant erhöht ist, während eine Induktion von ABA-
abhängiger Genexpression erst ab t = 48 h stattfand. Zusätzlich ist eine exogene
Zugabe von SA zu saul1-1-Keimlingen ausreichend, um hier
Seneszenzsymptome auszulösen. Weitere Untersuchungen werden zeigen,
welche Rolle SA und SA-abhängige Signaltransduktion in saul1-Mutanten
spielen.
4.4 SAUL1 ist assoziiert mit der Plasmamembran Die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Proteinen kann Aufschlüsse über
eine potentielle Funktion des jeweiligen Proteins liefern. Betrachtet man die
Familie der PUB-Proteine, so war die Lokalisierung dieser Proteine im Vorfeld
dieser Arbeit nur in Einzelfällen bekannt. Eine Zielsetzung dieser Arbeit bestand
darin, anhand der subzellulären Lokalisierung der PUB-ARM-Ligase SAUL1
nähere Einblicke in deren Funktion während der Regulation von
Seneszenzprozessen in Arabidopsis thaliana zu erhalten.
4.4.1 Lokalisierung von SAUL1 an der Plasmamembran In Lokalisierungsstudien von Fusionsproteinen aus SAUL1 und unterschiedlichen
Fluorophoren sowie in Westernblot-Analysen konnten erste Hinweise erhalten
werden, die auf eine Assoziation von SAUL1 mit Membransystemen der Zelle
hindeuteten (siehe Abschnitt 3.5.1 und 3.7.2). Eine Lokalsierung von SAUL1 an
der Plasmamembran konnte schließlich durch Co-Lokalisierung mit dem
plasmamembranständigen Saccharosetransporter UmSrt1 aus Ustilago maidis
(Wahl et al., 2010) eindeutig nachgewiesen werden. Diese subzelluläre
Lokalisierung ist dabei innerhalb der PUB-ARM-Proteinfamilie auf SAUL1 und
seine beiden nächst homologen Proteine PUB42 und PUB43 begrenzt (siehe
Abschnitt 3.5.4 und Drechsel et al., 2010b) und stellt somit ein Novum dar.
____________________________________________________________Diskussion
81
Bislang konnte für einige Proteine dieser Familie lediglich eine Lokalisierung im
Zellkern (AtPUB9, AtPUB13, BnARC1), im Zytoplasma (BnARC1, AtPUB22 und
AtPUB23) beziehungsweise in proteasomalen Strukturen in Nähe des ERs
(BnARC1) nachgewiesen werden (Stone et al., 2003; Cho et al., 2008; Samuel et
al., 2008). Allerdings wurde bereits im Rahmen einer Proteomstudie zur
Identifizierung von plasmamembranständigen Proteinen für SAUL1 und PUB43
eine Lokalisierung an der Plasmamembran vorhergesagt (Marmagne et al.,
2007).
4.4.2 Assoziation von SAUL1 mit der Plasmamembran erfolgt über Protein-Protein-Interaktionsdomäne
Betrachtet man die Sekundärstruktur von SAUL1, so ist auffällig, dass hier weder
Transmembranspannen noch Lipidmodifikationssequenzen vorliegen, die eine
Membranständigkeit von SAUL1 vermitteln könnten. Zusätzlich zu diesen
Strukturvorhersagen konnte durch Verwendung eines GFPs mit ER-
Rückhaltesignal gezeigt werden, dass die Synthese und Verteilung von SAUL1
innerhalb der Zelle durch einen ER-unabhängigen Mechanismus erfolgen.
Vergleicht man die Proteinstruktur der drei plasmamembranständigen PUB-
Proteine SAUL1, PUB42 und PUB43 mit denen der übrigen PUB-ARM-Proteine,
so zeichnen sie sich durch die Anwesenheit eines verlängerten C-Terminus aus
(Mudgil et al., 2004). Dieser C-Terminus umfasst bis zu sechs zusätzliche ARM-
Wiederholungen, für die bereits eine Funktion in Protein-Protein-Interaktionen
beschrieben werden konnte (siehe Abschnitt 2.3.3). Durch Deletionsanalysen
wurde im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen, dass im Falle von SAUL1 und
PUB43 diese zusätzlichen ARM-Wiederholungen notwendig und ausreichend
sind, um eine Assoziation dieser Proteine mit der Plasmamembran zu vermitteln
(siehe Abschnitt 3.5.3 und 3.5.4). Im Falle von SAUL1 bilden die ARM-
Wiederholungen ARM7-11 gemeinsam eine Membranlokalisierungsdomäne aus.
Entfernt man auch nur eine dieser ARM-Repeats, so wird die Funktion dieser
Domäne und somit die Verankerung an der Plasmamembran zerstört (siehe
Abschnitt 3.5.3.2). Ähnliches konnte bereits bei der Untersuchung des ARM-
Proteins PF16 aus der Alge Chlamydomonas beobachtet werden. Hierbei werden
alle 8 ARM-Wiederholungen von PF16 benötigt, um die Funktionalität und den
Aufbau des Flagellums zu gewährleisten (Smith und Lefebvre, 2000).
ARM-Wiederholungen im Allgemeinen dienen als Protein-Protein-
Interaktionsdomänen (Huber et al., 1997; Conti und Kuriyan, 2000; Coates,
2003). In Arabidopsis thaliana konnten über die Gruppe der PUB-ARM-Proteine
hinaus mindestens 50 weitere Proteine identifiziert werden, die ARM-
Wiederholungen aufweisen (Coates, 2003; Mudgil et al., 2004). Allerdings konnte
Diskussion____________________________________________________________
82
für keines dieser Proteine bislang eine Lokalisierung an der Plasmamembran
gezeigt werden. Eine Vielzahl der untersuchten Mitglieder dieser Proteinfamilie
zeigt eine Lokalisierung entweder im Zellkern (LFR, ARABIDILLO-1,
ARABIDILLO-2, ARIA, ARO1, IMPa-1 und IMPa-4; Kim et al., 2004; Coates et
al., 2006; Bhattacharjee et al., 2008; Gebert et al., 2008; Wang et al., 2009) oder
im Zytoplasma (ARO1, IMPa-1 und IMPa-4; Bhattacharjee et al., 2008; Gebert et
al., 2008). Einzig für ARO1 konnte bisher in wenigen Einzelzellen eine
Lokalisierung an der Plasmamembran gezeigt werden, was auf eine ähnliche
multifunktionale Rolle dieses Proteins wie β-Catenin beziehungsweise Armadillo
aus dem tierischen System hindeutet (siehe Abschnitt 2.3.3 und Gebert et al.,
2008).
In dieser Arbeit konnte eine ARM-Domäne identifiziert werden, die für die
Assoziation von SAUL1 - aber auch anderer Proteine - an der Plasmamembran
verantwortlich ist. So konnte durch Erstellung von Hybrid-Proteinen aus eigentlich
zytoplasmaständigen Proteinen (AtPUB27, AtPUB30 und GFP, siehe Abbildung
3.21 undAbbildung 3.25) und dem C-Terminus von SAUL1 eine Umorientierung
dieser Proteine an die Plasmamembran erfolgen.
Für weitere ARM-Repeat-Proteine konnte nur in Einzelfällen ein direkter
Zusammenhang zwischen ARM-Domänen und der subzellulären Lokalisierung
dieser Proteine nachgewiesen werden. So konnte für die beiden F-Box-Proteine
ARABIDILLO-1 und ARABIDILLO-2 eine Lokalisierung im Zellkern gezeigt
werden. Zwar tragen beide Proteine eine Kern-Lokalisierungssequenz (NLS),
doch die ARM-Motive alleine waren ebenfalls in der Lage, diese subzelluläre
Lokalisierung zu vermitteln (Coates et al., 2006). Auch in anderen Eukaryoten
konnte eine Assoziation von ARM-Proteinen mit verschiedenen Membranen
beschrieben werden. Eines dieser ARM-Proteine ist Vac8p aus Saccharomyces
cerevisiae. Hierbei handelt es sich um ein tonoplastenständiges ARM-Protein,
das durch Interaktion mit dem Zytoskelett an Verschmelzung vakuolärer
Membranen, Weitergabe der Vakuolenmembran an Tochterzellen und bei einer
Verknüpfung des Tonoplasten mit der Kernmembran beteiligt ist (Fleckenstein et
al., 1998; Pan und Goldfarb, 1998; Wang et al., 1998; Pan et al., 2000; Veit et al.,
2001; Wang et al., 2001). Eine Assoziation mit der Plasmamembran findet hierbei
allerdings nicht über die ARM-Wiederholungen, sondern vielmehr über
Lipidmodifikation statt. Das am Besten charakterisierte ARM-Protein ist β-
Catenin, das unter anderem mittels ARM-Wiederholungen als Adapterprotein
zwischen membranständigen Cadherinen und dem Actin-Zytoskelett dient
(vergleiche Abschnitt 2.3.3 und Aberle et al., 1994; Rimm et al., 1995; Aberle et
al., 1996). Zusätzlich kommt β-Catenin eine wichtige Funktion innerhalb des Wnt-
Signalweges zu. In Anwesenheit von Wnt-Signalen wird β-Catenin in den
____________________________________________________________Diskussion
83
Zellkern transportiert und nimmt dort durch Interaktion mit verschiedenen
Transkriptionsfaktoren Einfluss auf Genexpressionsprozesse. Die Bindung dieser
Proteine findet dabei über dieselbe ARM-Interaktionsdomäne statt, die auch für
die Bindung von Cadherinen an der Plasmamembran verantwortlich ist (Graham
et al., 2000; von Kries et al., 2000).
Die ARM-Interaktionsdomäne von SAUL1 und die dadurch vermittelte
Verankerung von SAUL1 an der Plasmamembran stellt somit innerhalb der
bekannten ARM-Proteine ein Novum dar, wobei diese Assoziation mit der
Plasmamembran nur in dikotylen Pflanzen konserviert ist (Abbildung 3.26). In
monokotylen Pflanzen hingegen liegt AtSAUL1-GFP frei löslich im Zytoplasma
vom. Dies deutet darauf hin, dass der benötigte membranständige
Interaktionspartner entweder gar nicht vorhanden oder aber so stark modifiziert
ist, dass eine Wechselwirkung zwischen SAUL1 und diesem Protein nicht mehr
stattfinden kann.
4.4.3 Funktion von SAUL1 an der Plasmamembran
Neben der Lokalisierung von SAUL1 an der Plasmamembran konnte ebenso
gezeigt werden, dass diese Lokalisierung für die Funktion von SAUL1 essentiell
ist. So konnte in Komplementationsversuchen nachgewiesen werden, dass ein
Einbringen des zytoplasmatischen SAUL1∆ARM7-11-GFP in saul1-1-Mutanten
nicht ausreicht, um ein verfrühtes Einsetzen der Seneszenz zu verhindern
(Drechsel et al., 2010b). Durch Transformation von saul1-1-Pflanzen mit
P35S:SAUL1-GFP hingegen konnte der Seneszenzphänotyp vollständig
komplementiert werden. Dies deutet darauf hin, dass SAUL1 an der
Plasmamembran Zielproteine modifiziert, um Seneszenzprozesse in jungen
Pflanzen zu unterdrücken. Eine ähnliche Funktion konnte für die E3-
Ubiquitinligase RING1 (really interesting new gene 1) beschrieben werden, die in
Arabisopsis in lipid raft-ähnlichen Strukturen an der Plasmamembran vorliegt (Lin
et al., 2008). RING1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation von
Zelltodprozessen bei Pathogenbefall. Im tierischen System ist die E3-
Ubiquitinligase CUL3 (cullin 3) an der Vermittlung von extrinsischen Signalen und
der Kontrolle von Apoptose an der Plasmamembran beteiligt (Jin et al., 2009).
Für AAO3, den bislang einzigen bestätigten Interaktionspartner von SAUL1,
konnte hingegen eine Lokalisierung im Zytoplasma nachgewiesen werden
(Melhorn et al., 2008). Ob die Kontaktfläche zwischen Plasmamembran und
Zytoplasma ausreichend ist, um eine Regulation der AAO3-Proteinmenge durch
SAUL1 zu gewährleisten, ist allerdings unklar. Es wäre jedoch denkbar, dass
AAO3 unter bestimmten Umweltbedingungen gezielt an die Plasmamembran
rekrutiert wird. Ähnliches konnte für den Transkriptionsfaktor WRKY53 gezeigt
Diskussion____________________________________________________________
84
werden. Hier findet eine Interaktion des eigentlich kernständigen WRKY53 mit
der E3-Ubiquitin-Ligase UPL5 (ubiquitin protein ligase 5) im Zytoplasma statt
(Miao und Zentgraf, 2010).
Betrachtet man jedoch nach Induktion des Seneszenzprogramms in saul1-
Mutanten die raschen Änderungen auf Transkriptionsebene (Abschnitt 3.1.2.1),
so legt das den Schluss nahe, dass SAUL1 wesentlich direkteren Einfluss auf die
Regulation der Genexpression haben muss. SAUL1 könnte dabei an der
Ubiquitinylierung von Membran-gebundenen Transkriptionsfaktoren (MTFs)
beteiligt sein. Es wird angenommen, dass etwa 10 % aller Transkriptionsfaktoren
in Arabidopsis in einer Membran-gebundenen und somit inaktiven Form vorliegen
(Kim et al., 2007). Auf bestimmte Stimuli hin können diese MTFs von der
Membran abgespalten und in den Kern transportiert werden, wo schließlich eine
Regulation der Genexpression stattfinden. Eine Aktivierung der MTFs kann über
zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen: Im so genannten RIP-Weg
(regulated intramembrane proteolysis) erfolgt die Abspaltung der MTFs von der
Membran durch spezifische Proteasen. Der RUP-Mechanismus (regulated
ubiquitin/ proteasome-dependent proteolysis) benötigt hingegen ein Markierung
und Spaltung der MTFs durch das UPS (Hoppe et al., 2001; Seo et al., 2008).
Unter den putativen MTFs in Arabidopsis finden sich unter anderem mindestens
13 Vertreter der NAC-Transkriptionsfaktorfamilie (NTL1-NTL13; Kim et al., 2007).
Für einige dieser NTLs konnte bereits eine Funktion in Pathogenabwehr (NTL6;
Seo et al., 2009), bei der Regulation des Keimungsverhaltens und des
Blühzeitpunkts (NTL8; Kim et al., 2008) oder auch in Seneszenzprozessen
(NTL9; Yoon et al., 2008) beschrieben werden.
Inwiefern SAUL1 an Vorgängen des RUP-Weges beteiligt ist, sollte in
weiterführenden Untersuchungen zu in vivo-Zielproteinen von SAUL1 aufgeklärt
werden.
4.5 Interaktionspartner von SAUL1 Um die Rolle von SAUL1 innerhalb des komplexen Seneszenzregulationsnetz-
werkes verstehen zu können, ist es wichtig, dessen Interaktionspartner zu
identifizieren. Während mit AAO3 bereits ein erstes Zielprotein des SAUL1-
abhängigen Proteinabbaus identifiziert werden konnte (siehe Abschnitt 4.2),
deuten zahlreiche Ergebnisse dieser Arbeit auf weitere Interaktionspartner von
SAUL1 hin. Ein Modell für putative Protein-Protein-Wechselwirkungen ist in
Abbildung 4.1 zusammengestellt. Mit der Lokalisierung von SAUL1 an der
Plasmamembran (Abschnitt 3.5) stellt sich die Frage nach dem
membranständigen Interaktionspartner, der diese Verankerung von SAUL1
____________________________________________________________Diskussion
85
vermittelt. Eine solche Komplexbildung erfolgt dabei über die Protein-Protein-
Interaktionsdomäne SAUL1ARM7-11 (Abschnitt 4.4.2).
Darüber hinaus ergibt sich aus den durchgeführten Genexpressionsstudien die
Schlussfolgerung, dass neben AAO3 weitere Zielproteine des SAUL1-
abhängigen Proteinabbaus vorliegen müssen (siehe Abschnitt 4.3). Auch wenn
das UPS aufgrund der Vielzahl an E3-Ligasen eine hohe Substratspezifität
aufweist, zeichnen einzelne E3-Ligasen dennoch für den Abbau mehrer
Zielproteine verantwortlich. Mittels Yeast-Two-Hybrid-Verfahren wurden
beispielsweise für AtCHIP (PUB61) einige potentielle Zielproteine identifiziert,
wobei für drei davon (PP2A, ClpP4 und FtsH1) eine Interaktion in vivo verifiziert
werden konnte (Luo et al., 2006; Shen et al., 2007a; Shen et al., 2007b). Im
Rahmen dieser Arbeit konnten die Ergebnisse von vorausgegangenen Yeast-
Two-Hybrid-Experimenten bezüglich SAUL1 noch nicht bestätigt werden
(Abschnitt 3.4). Allerdings ist es denkbar, dass für eine Komplexbildung aus
SAUL1 und dessen Zielproteinen zusätzliche Co-Faktoren benötigt werden und
somit ein Nachweis in Yeast-Two-Hybrid- oder den durchgeführten pulldown-
Experimenten gar nicht möglich war. In verschiedenen Phytohormonsignalwegen
ist beispielsweise die Bindung des jeweiligen Hormons selbst vonnöten, um
einen gezielten Proteinabbau von einzelnen Komponenten des Signalweges zu
vermitteln. Im Falle von Auxin kommt es mit zunehmenden
Hormonkonzentrationen zu einem Abbau der Repressorproteine AUX/ IAA über
die F-Box-Ubiquitinligase TIR1 (Dharmasiri et al., 2005; Kepinski und Leyser,
2005). Hierbei ist eine Bindung von Auxin an TIR1 notwendig, um die Interaktion
mit AUX/ IAA-Proteinen zu gewährleisten. Ähnlich verhält es sich im
Jasmonsäure(JA)-Signalnetzwerk. Hierbei vermittelt das JA-Konjugat Jasmonyl-
Isoleucin die Interaktion zwischen dem JA-abhängigen Transkriptionsfaktor JAZ1
(jasmonate zim-domain) und der F-Box-Ubiquitinligase COI (coronatine-
insensitive 1), was schließlich zu einem Abbau von JAZ1 führt (Thines et al.,
2007). Es wäre also auch im Falle von SAUL1 denkbar, dass die Anwesenheit
eines Co-Faktors, möglicherweise sogar ABA selbst notwendig ist, um eine
Interaktion mit Zielproteinen zu gewährleisten. Für zukünftige Studien zur
Identifizierung von SAUL1-Interaktionspartnern sollte außerdem dessen
Lokalisierung an der Plasmamembran berücksichtigt werden. So könnten
beispielsweise Split-Ubiquitin-Experimente, die speziell auf Interaktionen von
membranständigen Proteinen ausgelegt sind, weitere Kandidaten für SAUL1-
abhängigen Proteinabbau liefern.
Eine Interaktion von SAUL1 und seinen Zielproteinen findet vermutlich über die
ARM-Wiederholungen 1-6 statt. Allerdings steht eine Charakterisierung dieser
putativen Protein-Protein-Interaktionsdomäne noch aus.
Diskussion____________________________________________________________
86
Und schließlich gilt es noch, das mit SAUL1 interagierende E2-Enzyms zu
identifizieren. Wie eingangs beschrieben, beruht die Übertragung von Ubiquitin
auf Zielproteine auf einem drei-stufigen Prozess. Hierbei wird Ubiquitin durch ein
E1-Enzym aktiviert und zunächst an ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym (E2)
gebunden. Schließlich findet in einem Proteinkomplex aus E2- und E3-Enzym
sowie daran gebundenem Zielprotein eine Übertragung des Ubiquitins statt
(siehe Abschnitt 2.3.1). In PUB-Proteinen ist die N-terminal gelegene U-Box für
eine Bindung des E2-Enzyms verantwortlich.
Eine nähere Untersuchung des N-Terminus von SAUL1 ist auch deshalb von
besonderem Interesse, da er in Lokalisierungsstudien scheinbar auch eine Rolle
auf die gleichmäßige Verteilung von SAUL1-GFP an der Plasmamembran spielt.
So kam es bei Deletion oder Maskierung des N-Terminus (durch Anhängen eines
N-terminalen Tags) zum Auftreten einer fleckigen Verteilung von
Fluoreszenzsignalen (Abbildung 3.21). Wurde allerdings die Fluorophore am C-
Terminus von SAUL1 angeheftet, so hatte dies keinen Einfluss auf die
gleichmäßige Verteilung des Fusionsproteins entlang der Plasmamembran.
Inwiefern der N-Terminus hierbei Einfluss auf die Lokalisierung von SAUL1 hat,
muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Abbildung 4.1 Modell der putativen Interaktionspartner von SAUL1. Die E3-Ligase
SAUL1 muss ein E2-Enzym binden, um Ubiquitin auf Zielproteine übertragen zu können.
Diese Interaktion findet hierbei vermutlich über die N-terminal gelegene U-Box statt.
Neben dem bereits charakterisierten AAO3-Protein modifiziert SAUL1 weitere
Zielproteine, die direkt an der Regulation von Seneszenzprozessen beteiligt sind. Bei der
Bindung dieser Zielproteine könnten die ARM-Wiederholugnen 1-6 eine wichtige Rolle
spielen. Eine Verankerung von SAUL1 an der Plasmamembran findet über einen
membranständigen Interaktionspartner statt. Diese Interaktion wird hierbei von den C-
terminal gelegenen ARM-Wiederholungen 7-11 vermittelt.
____________________________________________________________Diskussion
87
Die Identifizierung der Interaktionspartner von SAUL1 wird zukünftig zur
Aufklärung der physiologischen und molekularen Funktion von SAUL1 beitragen.
Auf diese Weise sollte es gelingen, die Signalwege zu verstehen, bei denen
membranständige E3-Ubiquitinligasen wie SAUL1 eine zentrale Position
einnehmen.
Diskussion____________________________________________________________
88
______________________________________________Material und Methoden
89
5 Material und Methoden
5.1 Material
5.1.1 Organismen
5.1.1.1 Bakterienstämme
Escherichia coli:
Stamm Marker Referenz
DH5α F-, endA1, hsdR17(rk-, mk-) supE44, thi-1, recA1,
gyrA96, relA1, f80d, lacZ[∆]M15 Hanahan, 1983
One Shot® Top10
F-, mcrA ∆ (mrr-hsdRMSmcrBC), Φ80 lacZ[∆]M15, ∆lacX74, recA1, araD139, ∆(ara-leu)7697, galU,
galK,rpsL (StrR) endA1 nupG InvitrogenTM
Rosetta 2 (DE3) pLysS
F-, ompT, hsdSB(rB- mB-), gal dcm (DE3) pLysSRARE2 (CamR)
NovagenTM
Tabelle 5-1 Verwendete Escherichia coli-Stämme
Agrobacterium tumefaciens:
Stamm Marker Referenz
GV3101 C58 (RifR), pMP90 (GentR) Koncz und Schell, 1986
C58C1 - Deblaere et al., 1985
Tabelle 5-2 Verwendete Agrobacterium tumefaciens-Stämme
5.1.1.2 Pflanzen
Arabidopsis thaliana
Verwendete Wildtypen:
Name Kurzform Referenz
Columbia-0 Col-0 Arabidopsis Sequenzierungsprojekt, LEHLE SEEDS,
Round Rock, USA Landsberg
erecta LE
NASC European Arabidopsis Resource Center Stock NW20, Nottingham, Großbritannien
Tabelle 5-3 Verwendete Arabidopsis thaliana-Wildtypen
Knock-out-Linien: Referenz: Alonso et al., 2003
Name betroffenes Gen Referenz
abi1-1 At4g26080 Koornneef et al., 1984
abi2-1 At5g57050 Koornneef et al., 1984
era1-3 At5g40280 Cutler et al., 1996
Tabelle 5-4 Verwendete knock-out-Mutanten
Material und Methoden______________________________________________
90
T-DNA-Insertionslinien:
Name NASC-
Stockcode Bezeichnung
interne Bezeichnung
betroffenes Gen
SALK_063974 N563974 saul1-1 SALK#59 At1g20780
SALK_076799 N576799 saul1-2 SALK#43 At1g20780
Tabelle 5-5 Verwendete T-DNA-Insertionslinien
Generierte Pflanzenlinien:
Name Verwendeter
Vektor Transformiert
durch Selektionsmarker
GD41 pGD41 C58C1 BastaR
GD42 pGD42 C58C1 BastaR
Tabelle 5-6 Generierte Pflanzenlinien
Weitere Pflanzen
Tabak: Nicotiana tabaccum
Nicotiana benthamiana
Zuckermelone: Cucumis melo cv. ‚Hale’s Best Jumbo’
Zwiebel: Allium cepa
Lauch: Allium porrum
5.1.2 Vektoren
5.1.2.1 Ausgangsvektoren
Name Resistenz Referenz
pENTRTM/D-TOPO® KanR Invitrogen life technologies
pCR®- Blunt II-TOPO® KanR Invitrogen life technologies
pJET1.2/ blunt AmpR Fermentas
pEARLEYGATE104 KanR Earley et al., 2006
pEARLEYGATE201 KanR Earley et al., 2006
pMDC43 KanR Curtis und Grossniklaus, 2003
pMDC201 KanR Curtis und Grossniklaus, 2003
pK7FWG2.0 StrepR/SpecR Karimi et al., 2002
pMALc2x AmpR New England Biolabs
Tabelle 5-7 Ausgangsvektoren
______________________________________________Material und Methoden
91
5.1.2.2 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1
Referenz: diese Arbeit und Drechsel et al., 2010b
Name Ausgangsvektor Insert Resistenz Pflanzenselektion
pGD40 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1 cds mit Stop KanR ---
pGD41 pEARLEYGATE104 N-YFP-SAUL1 KanR BastaR
pGD42 pEARLEYGATE201 N-HA-SAUL1 KanR BastaR
pGD57 pMDC43 N-GFP-SAUL1 KanR HygR
pGD60 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM1-6 cds
ohne Stop KanR ---
pGD62 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM7-11 cds
ohne Stop KanR ---
pGD63 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM10/11
cds mit Stop KanR ---
pGD66 pK7FWG2.0 SAUL1∆ARM7-11-C-
GFP StrepR/SpecR KanR
pGD68 pMDC201 SAUL1_C-GFP-HDEL KanR HygR
pGD72 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM1 mit
Stop KanR ---
pGD74 pMDC43 N-GFP-SAUL1delta1-
6 KanR HygR
pGD76 pMDC43 N-GFP-
SAUL1∆ARM10/11 KanR HygR
pGD80 pMDC43 N-GFP-
SAUL1∆ARM1 KanR HygR
pGD81 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM7/8 ohne
Stop KanR ---
pGD83 pENTRTM/D-TOPO® SAUL1∆ARM9 ohne
Stop KanR ---
pGD85 pK7FWG2.0 SAUL1∆ARM7/8-C-
GFP StrepR/SpecR KanR
pGD87 pK7FWG2.0 SAUL1∆ARM9-C-
GFP StrepR/SpecR KanR
pGD91 pJET1.2/ blunt SAUL1ARM7-11 ohne
Stop AmpR ---
pGD95 PUB27 ohne Stop
in pENTR SAUL1ARM7-11ohne
Stop KanR ---
pGD99 PUB30 ohne Stop
in pENTR SAUL1ARM7-11 ohne
Stop KanR ---
pGD101 pK7FWG2.0 PUB29+SAUL1ARM7-
11-C-GFP StrepR/SpecR KanR
pGD109 pK7FWG2.0 PUB30+SAUL1ARM7-
11-C-GFP StrepR/SpecR KanR
Tabelle 5-8 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1
Klonierung von Konstrukten zur subzellulären Lokalisierung von SAUL1
pGD40 (SAUL1 cds mit Stop in pENTRTM/D-TOPO®)
Die Amplifizierung der SAUL1 cds erfolgte mittels PCR unter Verwendung der
Primer At1g20780-CACC und At1g20780c+2406r(PacI). Das PCR-Fragment
wurde in den Vektor pENTRTM/D-TOPO® kloniert und das erhaltene Plasmid
mittels Sequenzierung auf seine Richtigkeit hin überprüft.
Material und Methoden______________________________________________
92
pGD41 (P35S:YFP-SAUL1), pGD42 (P35S:HA-SAUL1), pGD57 (P35S:GFP-SAUL1)
Ausgehend von dem Vektor pGD40 erfolgte über die Gateway®-Technik (siehe
Abschnitt 5.2.1.10) durch Rekombination die Erstellung der
Expressionskonstrukte P35S:YFP-SAUL1 (pGD41), P35S:HA-SAUL1 (pGD42) und
P35S:GFP-SAUL1 (pGD57). Die Rekombination erfolgte hierbei in die Zielvektoren
pEARLEYGATE104, pEARLEYGATE201 und pMDC43 (siehe Tabelle 5-7).
pGD62 und pGD66 (P35S:SAUL1∆ARM7-11-GFP)
Die Amplifizierung der verkürzten SAUL1 cds erfolgte mittels PCR unter
Verwendung der Primer At1g20780-CACC und AtSAUL1_d7-11_3’ wob_rev. Das
erhaltene PCR-Fragment wurde in den Vektor pENTRTM/D-TOPO® kloniert
(pGD62) und das erhaltene Plasmid mittels Sequenzierung auf seine Richtigkeit
hin überprüft. Durch Rekombination wurde die SAUL1∆ARM7-11 cds in den
Expressionsvektor pK7FWG2.0 (siehe Tabelle 5-7) transferiert (pGD66).
pGD68 (P35S:SAUL1-C-GFP-HDEL)
Ausgehend von dem Vektor SAUL1 ohne Stop in pENTR erfolgte über die
Gateway®-Technik (siehe Abschnitt 5.2.1.10) durch Rekombination die
Erstellung des Expressionskonstrukts P35S:SAUL1-GFP-HDEL (pGD68). Die
Rekombination erfolgte hierbei in den Zielvektor pMDC201 (siehe Tabelle 5-7).
pGD60 und pGD74 (P35S:GFP-SAUL1∆ARM1-6)
Die kodierende Sequenz für SAUL1∆ARM1-6 wurde mittels PCR unter
Verwendung der Primer AtSAUL1_d1-6_5'_CACC_fw und SAUL1_VL_3'_wob
amplifiziert und das erhaltene PCR-Fragment in den Vektor pENTRTM/D-TOPO®
kloniert. Das erhaltene Plasmid pGD60 wurde durch Sequenzierung überprüft
und ein fehlerfreier Klon für weitere Klonierungsschritte verwendet. Durch
Rekombination in den Zielvektor pMDC43 wurde der Expressionsvektor pGD74
generiert, der das Konstrukt P35S:GFP-SAUL1∆ARM1-6 trägt.
pGD63 und pGD76 (P35S:GFP-SAUL1∆ARM10/11)
Unter Verwendung der Primer At1g20780-CACC-primer und AtSAUL_d10/11_3'
wob_rev wurde mittels PCR die Kodierungssequenz für SAUL1∆ARM10/11
amplifiziert, das erhaltene PCR-Fragment in den Vektor pENTRTM/D-TOPO®
kloniert (pGD63) und die Basenfolge durch Sequenzanalyse überprüft. Mittels
Gateway-Technik wurde das DNA-Fragment in den Zielvektor pMDC43 überführt,
was in dem Expressionsvektor pGD76 resultierte.
pGD81 und pGD85 (P35S:SAUL1∆ARM7/8-GFP)
Die Erstellung der mutierten SAUL1 cds erfolgte mittels PCR. Hierbei wurden
zunächst zwei unabhängige PCR-Amplifikationen durchgeführt, die zum einen
die Sequenz vor den ARM-Wiederholungen 7/8 (Verwendung der Primer
At1g20780-CACC-primer und AtSAUL1_deltaARM7-8_rev) und zum anderen
den Bereich dahinter (Verwendung der Primer AtSAUL1_deltaARM7-8_fw und
SAUL1_VL_3'_wob) umschlossen. Die erhaltenen PCR-Fragmente wurden in
______________________________________________Material und Methoden
93
einer dritten PCR als Matritzen eingesetzt und mit Hilfe der Primer At1g20780-
CACC-primer und SAUL1_VL_3'_wob die vollständige Sequenz von
SAUL1∆ARM7/8 amplifiziert. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in den Vektor
pENTRTM/D-TOPO® kloniert und mittels Sequenzierung auf Richtigkeit überprüft
(pGD81). Durch Rekombination wurde die SAUL1∆ARM7/8 cds in den
Expressionsvektor pK7FWG2.0 übertragen (pGD85)
pGD83 und pGD87 (P35S:SAUL1∆ARM9-GFP)
Analog zu pGD85 wurde auch dieses Konstrukt durch PCR-Mutagenese erstellt.
In den ersten beiden PCR-Ansätzen wurden die Primer At1g20780-CACC-primer
und AtSAUL1_deltaARM9_rev bzw. AtSAUL1_deltaARM9_fw und
SAUL1_VL_3'_wob verwendet und die erhaltenen PCR-Fragmente in einer
weiteren PCR als Matritzen verwendet. Als Primer dienten hierbei At1g20780-
CACC-primer und SAUL1_VL_3'_wob. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in
den Vektor pENTRTM/D-TOPO® kloniert und durch Sequenzierung (pGD83).
Rekombination mit dem Vektor pK7FWG2.0 führte zum Expressionsvektor
pGD87.
pGD 72 und pGD80 (P35S:GFP-SAUL1∆ARM1)
Analog zu pGD85 wurde dieses Konstrukt ebenfalls mittels PCR erstellt. In den
ersten beiden PCR-Ansätzen wurden die Primer At1g20780-CACC-primer und
AtSAUL1_deltaHEAT_rev bzw. AtSAUL1_deltaHEAT_fw und SAUL1_VL_3'_wob
verwendet und die erhaltenen PCR-Fragmente in einer weiteren PCR als
Matritzen verwendet. Als Primer dienten hierbei At1g20780-CACC-primer und
SAUL1_VL_3'_wob. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in den Vektor
pENTRTM/D-TOPO® kloniert und durch Sequenzierung (pGD72). Rekombination
mit dem Vektor pMDC43 führte zum Expressionsvektor pGD80.
pGD91 (SAUL1ARM7-11 cds in pJET1.2/ blunt)
Die Kodierungssequenz für SAUL1ARM7-11 wurde mittels PCR unter
Verwendung der Primer AtSAUL1ARM7-11_fw (BamHI) und AtSAUL1_3’_rev
(BamHI) amplifiziert. Dabei wurde an die SAUL1-Sequenz an beiden Enden für
weitere Klonierungen jeweils eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym BamHI
angefügt. Das erhaltene PCR-Fragment wurde in den Vektor pJET1.2/ blunt
kloniert und das erhaltene Plasmid pGD91 durch Sequenzierung überprüft.
pGD95 (PUB27+SAUL1ARM7-11 in pENTRTM/D-TOPO®) und pGD99
(PUB30+SAUL1ARM7-11 in pENTRTM/D-TOPO®)
Die Sequenz für SAUL1ARM7-11 wurde mittels Restriktionsverdaus mit BamHI
aus dem Vektor pGD91 herausgeschnitten und anschließend durch Ligation in
Frame hinter AtPUB27 bzw. AtPUB30 gefügt. Die erhaltenen Plasmide pGD95
und pGD99 wurden anschließend durch Sequenzierung überprüft.
Material und Methoden______________________________________________
94
pGD101 (P35S:PUB27+SAUL1ARM7-11-GFP) und pGD109
(P35S:PUB30+SAUL1ARM7-11-GFP)
Ausgehend von den Vektoren pGD95 und pGD99 erfolgte über die Gateway®-
Technik (siehe Abschnitt 5.2.1.10) durch Rekombination die Erstellung der
Expressionskonstrukte P35S:PUB27+SAUL1ARM7-11-GFP (pGD101) und
P35S:PUB30+SAUL1ARM7-11-GFP (pGD109). Die Rekombination erfolgte
hierbei jeweils in den Zielvektor pK7FWG2.0 (siehe Tabelle 5-7)
5.1.2.3 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von PUB43
Referenz: diese Arbeit und Drechsel et al., 2010b
Name Ausgangsvektor Insert Resistenz Pflanzenselektion
pND01 pENTRTM/D-TOPO® PUB43∆N KanR ---
pND02 pENTRTM/D-TOPO® PUB43∆10-12 KanR ---
pND03 pENTRTM/D-TOPO® PUB43∆ARM1-6 KanR ---
pND04 pENTRTM/D-TOPO® PUB43∆ARM7-12 KanR ---
pND05 pMDC43 GFP-
PUB43∆ARM1-6 KanR HygR
pND07 pMDC43 GFP-PUB43∆N KanR HygR
pND09 pMDC43 GFP-PUB43 ∆ARM10-12
KanR HygR
pND11 pMDC43 GFP-PUB43 ∆ARM7-12
KanR HygR
Tabelle 5-9 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von PUB43
Klonierung von Konstrukten zur subzellulären Lokalisierung von PUB43
pND01 (PUB43∆N in pENTRTM/D-TOPO®) und pND07 (P35S:GFP- PUB43∆N)
Die Amplifizierung der PUB43∆N cds erfolgte mittels PCR unter Verwendung der
Primer At1g76390c+331_CACC_fw und At1g76390c+2436_wob_rev. Das PCR-
Fragment wurde in den Vektor pENTRTM/D-TOPO® kloniert und das erhaltene
Plasmid mittels Sequenzierung auf seine Richtigkeit hin überprüft. Das Plasmid
pND07 entstand schließlich durch Rekombination von pND01 in den
Expressionsvektor pK7FWG2.0 (siehe Tabelle 5-7).
pND02 (PUB43∆ARM10-12 in pENTRTM/D-TOPO®) und pND09 (P35S:GFP-
PUB43∆ARM10-12)
Die Klonierung erfolgte analog zu pND01 und pND07 unter Verwendung der
Primer AtPUB43c+1f(CACC) und At1g76390c+1969_wob_rev zur Amplifizierung
von PUB43∆ARM10-12.
pND03 (PUB43∆ARM1-6 in pENTRTM/D-TOPO®) und pND05 (P35S:GFP-
PUB43∆ARM1-6)
Die Klonierung erfolgte analog zu pND01 und pND07 unter Verwendung der
Primer At1g76390c+1189_CACC_fw und At1g76390c+2436_wob_rev zur
Amplifizierung von PUB43∆ARM1-6.
______________________________________________Material und Methoden
95
pND04 (PUB43∆ARM7-12 in pENTRTM/D-TOPO®) und pND11 (P35S:GFP-
PUB43∆ARM7-12)
Die Klonierung erfolgte analog zu pND01 und pND07 unter Verwendung der
Primer AtPUB43c+1f(CACC) und At1g76390c+1195_wob_rev zur Amplifizierung
von PUB43∆ARM7-12.
5.1.2.4 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von putativen
SAUL1-Interaktionspartnern
Referenz: diese Arbeit
Name Ausgangsvektor Insert Resistenz Pflanzenselektion
SD1-29 in pENTR
pENTRTM/D-TOPO®
SD1-29 cds KanR ---
MAF19.20 in pENTR
pENTRTM/D-TOPO®
MAF19.20 cds KanR ---
GFP-SD1-29
pMDC43 GFP-SD1-29 KanR HygR
pND16 pK7FWG2.0 MAF19.20-GFP StrepR/SpecR KanR
Tabelle 5-10 Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung von putativen SAUL1-
Interaktionspartnern
Klonierung von Konstrukten zur subzellulären Lokalisierung von putativen SAUL1-Interaktionspartnern
SD1-29 in pENTR (SD1-29 in pENTRTM/D-TOPO®) und GFP-SD1-29 (P35S:GFP-
SD1-29)
Die Amplifizierung von SD1-29 erfolgte mittels PCR unter Verwendung der
Primer AtSD1-29c+1f CACC und At1g61380g+3252bp_rev (BamHI). Das PCR-
Fragment wurde in den Vektor pENTRTM/D-TOPO® kloniert und das erhaltene
Plasmid mittels Sequenzierung auf seine Richtigkeit hin überprüft. Der Vektor
GFP-SD1-29 entstand schließlich durch Rekombination von pND01 in den
Expressionsvektor pMDC43 (siehe Tabelle 5-7).
MAF19.20 in pENTR (MAF19.20 in pENTRTM/D-TOPO®) und pND16
(P35S:MAF19.20-GFP)
Mittels PCR wurde unter Verwendung der Primer AtMAF19.20c+1f CACC und
AtMAF19.20c+852r die für MAF19.20-kodierende Sequenz amplifiziert, in den
Vektor pENTRTM/D-TOPO® eingebracht und durch Sequenzierung auf ihre
Richtigkeit hin überprüft. Im Anschluss erfolgte eine Rekombination in den
Expressionsvektor pK7FWG2.0 (pND16).
Material und Methoden______________________________________________
96
5.1.2.5 Konstrukte für Interaktionsstudien zu SAUL1
Referenz: diese Arbeit
Name Ausgangsvektor Insert
pGD49 pJET 1.2/ blunt SD1-29 cds
pGD54 pJET 1.2/ blunt LINC2.1 cds
MAF19.20 in pJet pJET1.2/ blunt MAF19.20.1 cds
OBE1 in pJet pJET1.2/ blunt OBE1 cds
SD1-29∆ in pMAL pMALc2x SD1-29∆ cds
LINC2.1 in pMAL pMALc2x LINC2.1 cds
MAF19.20 in pMAL pMALc2x MAF19.20.1 cds
OBE1 in pMAL pMALc2x OBE1 cds
Tabelle 5-11 Konstrukte für Interaktionsstudien zu SAUL1
Klonierung von Konstrukten für Interaktionsstudien zu SAUL1
pGD49 (SD1-29 cds in pJET 1.2/ blunt) und MBP-SD1-29 (PlacI:MBP-SD1-29)
Die Amplifizierung der SD1-29 cds erfolgte mittels PCR unter Verwendung der
PrimerAt1g61380g+121bp_fw (BamHI) und At1g61380g+3252bp_rev (BamHI)
unter Anfügung von Schnittstellen für das Restriktionsenzym BamHI. Das PCR-
Fragment wurde in den Vektor pJET1.2/ blunt kloniert und das erhaltene Plasmid
mittels Sequenzierung auf seine Richtigkeit hin überprüft. Anschließend wurde
SD1-29 über die angefügten BamHI-Schnittstellen durch Restriktionsverdau aus
pGD49 herausgeschnitten und durch Ligation in den Vektor pMALc2x
eingebracht (MBP-SD1-29).
pGD54 (LINC2.1 cds in pJET 1.2/ blunt) und MBP-LINC2.1 (PlacI:MBP-LINC2.1)
Die Klonierung erfolgte analog zu pGD49 und MBP-SD1-29 unter Verwendung
der Primer AtLINC2.1g+55bp_fw (BamHI) und AtLINC2.1g+1810bp_rev (BamHI).
Durch Ligation des LINC2.1-Fragments in pMALc2x entstand der Vektor MBP-
LINC2.1.
MAF19.20 in pJet (MAF19.20.1 cds in pJET 1.2/ blunt) und MBP-MAF19.20
(PlacI:MBP-MAF19.20.1)
Die Klonierung erfolgte analog zu SD1-29 unter Verwendung der Primer
AtMAF19.20.1g+152_fw(BamHI) und AtMAF19.20.1g+1198_rev(BamHI). Durch
Ligation des MAF19.20.1-Fragments in pMALc2x entstand der Vektor MBP-
MAF19.20.
OBE1 in pJet (OBE1 cds in pJET 1.2/ blunt) und MBP-OBE1 (PlacI:MBP-OBE1)
Die Klonierung erfolgte analog zu SD1-29 unter Verwendung der Primer
AtOBE1g+1_fw(BamHI) und AtOBE1g+2399_rev(BamHI). Durch Ligation des
OBE1-Fragments in pMALc2x entstand der Vektor MBP-OBE1.
______________________________________________Material und Methoden
97
5.1.2.6 Sonstige Plasmide
Name Ausgangsvekt
or Insert Resistenz Referenz
pKW45 pH7RWG2.0 UmSrt1 StrepR/ SpecR Wippel,
unveröffentlicht
SAUL1
ohne Stop
in pENTR
pENTRTM/D-
TOPO® SAUL1 cds KanR
Drechsel et al.,
2010b
pJB43 pK7FWG2.0 SAUL1 cds StrepR/SpecR Drechsel et al.,
2010b
PUB27 in
pENTR
pENTRTM/D-
TOPO® PUB27 cds KanR
Drechsel et al.,
2010b
PUB30 in
pENTR
pENTRTM/D-
TOPO® PUB30 cds KanR
Drechsel et al.,
2010b
Tabelle 5-12 Sonstige Plasmide
5.1.3 Oligonukleotide
Oligonukleotide für SAUL1-Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung Name Sequenz
At1g20780-CACC-primer CAC CAT GGT TGG AAG CTC GGA TG
At1g20780c+2406r(PacI) GTT TTA ATT AAC TAT GCG ATG TTT GGG AAT
ATA C
AtSAUL1_d1-6_5'_CACC_fw CAC CAT GAT TAG CAA CAC AGG TC
AtSAUL1_d7-11_3' wob_rev GGA TCM TAG ATG GAG CAG ATT CTC
AtSAUL_d10/11_3' wob_rev GGA TCM CAC ACA CGA AAA GAT C
SAUL1_VL_3'_wob GGA TCM TGC GAT GTT TGG GAA TAT AC
SAUL1_deltaHEAT_f CAG GAC CAT CCG ATC AAA TAG GCA TGA TGA
GAG CAA GGC GAT AGT AGC TGA AGG GGA CAC
SAUL1_deltaHEAT_r CTA CTA TCG CCT TGC TCT CAT CAT GCC TAT
TTG ATC GGA TGG TCC TGC AAA TC
AtSAUL1_deltaARM7-8_fw CTC ACC AGT TGC CCA AAA TTG CCA GAT AGG
GAT TTG GGT CTT ACT CAG
AtSAUL1_deltaARM7-8_rev CAA ATC CCT ATC TGG CAA TTT TGG GCA ACT
GGT GAG TCC AAC AAG AAC CTC
AtSAUL1_deltaARM9_fw CTA GGA TTA CTT TTG TTT TCA ACG AGT CTA
TAA AGC TGA CAC GGA TGC CTG ATC
AtSAUL1_deltaARM9_rev CAT CCG TGT CAG CTT TAT AGA CTC GTT GAA
AAC AAA AGT AAT CCT AGC AAG TAT AC
AtSAUL1ARM7-11_fw
(BamHI) CAG GAT CCA TTA GCA ACA CAG GTC CAG
AtSAUL1_3’_rev (BamHI) CTT GGA TCC TGC GAT GTT TGG GAA TAT AC
Tabelle 5-13 Oligonukleotide für SAUL1-Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung
Material und Methoden______________________________________________
98
Oligonukleotide für PUB43-Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung Name Sequenz
AtPUB43c+1f(CACC) CAC CAT GGC TGG AAG TGG AAG TTG
At1g76390c+331_CACC_fw CAC CAT GTC ACT TTA TTT GGG AAA TG
At1g76390c+1189_CACC_fw CAC CAT GCC TGT TGG ACC TCA TCA C
At1g76390c+1195_wob_rev GGA TCM AAC TTT GTC GAA GTC GTA C
At1g76390c+1969_wob_rev GGA TCM GCT CAG ACA TGA AAA GAT G
At1g76390c+2436_wob_rev GGA TCM ACC AAT GTT GGT GAA TAT AC
Tabelle 5-14 Oligonukleotide für PUB43-Konstrukte zur subzellulären Lokalisierung
Oligonukleotide für Expressionsanalysen Gen Name Sequenz
AtACT2g+846f ATT CAG ATG CCC AGA AGT CTT GTT ACT2
AtACT2g+1243r GGA GAT CCA CAT CTG CTG GAA TGT
At4g23810c+278_f * ATC CCG GCA GTG TTC CAG AAT C WRKY53
At4g23810c+357_r * AGA ACC TCC TCC ATC GGC AAA C
AtORE1.1c+192f_RT * CTT ACC ATG GAA GGC TAA GAT GGG ORE1
AtORE1.1c+306r_RT * TTC CAA TAA CCG GCT TCT GTC G
Tabelle 5-15 Oligonukleotide für Expressionsanalysen
Mit * gekennzeichnete Oligonukleotide wurden mit Hilfe von Quantprime erstellt
(Arvidsson et al., 2008).
Oligonukleotide zur Genotypisierung von Arabidopsis-Mutanten Mutante Primername Sequenz
At1g20780c+1771f GCG TCA CTC TTC CTT CAT C saul1-1
At1g20780g+2873r CTG GAT GCC TAT TAA CAA GTA ATC
SALK43_FW GAA GCA TTC ATC TGC CC saul1-2
SALK43_BW GCA AAT GAA GTA GAG AGC G
ABI1g+48bp_fw GAA ACC CAG ATG GAT TTC AC abi1-1
ABI1g+1570bp_rev CTC CGA GGC TTC AAA TCA AC
Tabelle 5-16 Oligonukleotide zur Genotypisierung von Arabidopsis-Mutanten
Oligonukleotide zur Klonierung von MBP-Fusionsproteinen Gen Name Sequenz
AtMAF19.20.1g+152_
fw(BamHI) AGG ATC CAT GAA CGA CCT GAG TGA AC
MAF19.20 AtMAF19.20.1g+1198_
rev(BamHI) GTG GAT CCT TAT ACA GCA GGA AGA G
AtLINC2.1g+55bp_fw
(BamHI) CTA AGG ATC CAT GTT CAC GCC ACA G
LINC2.1 AtLINC2.1g+1810bp_
rev (BamHI) GAT GGA TCC TAC AAT CTA CAA AAG
AtOBE1g+1_fw
(BamHI) GAG GAT CCA TGG GCA CAT CAT CTG
OBE1 AtOBE1g+2399_rev
(BamHI) GTG GAT CCC AAA CAT CTA AGG ATT G
______________________________________________Material und Methoden
99
At1g61380g+121bp_fw
(BamHI) CAG GAT CCA TGG GTA TGG TTT TAT TTG
SD1-29 At1g61380g+3252bp_
rev (BamHI) GTG GAT CCT TAG GCT TAC CTT CCT TG
Tabelle 5-17 Oligonukleotide zur Klonierung von MBP-Fusionsproteinen
Oligonukleotide zur Klonierung von Konstrukten zur subzellulären Lokalisierung
von putativen SAUL1-Interaktionspartnern Gen Name Sequenz
AtMAF19.20+1f CACC CAC CAT GAA CGA CCT GTG TGA ACA TG MAF19.20
AtMAF19.20c+852r CGA TAC AGC AGG AAG AGG AAC TAA GC
AtSD1-29c+1f CACC CAC CAT GGG TAT GGT TTT ATT TGC
SD1-29 At1g61380g+3252bp_
rev (BamHI) GAT GAA TTC GAT GGT TAT GTA GTG AG
Tabelle 5-18 Oligonukleotide zur Klonierung von Konstrukten zur subzellulären
Lokalisierung von putativen SAUL1-Interaktionspartnern
5.1.4 Lösungen
5.1.4.1 Puffer und Lösungen
DNA – Extraktionspuffer (DEB) 1,4 M NaCl 20 mM EDTA 0,1 M Tris/ HCl pH 8,0 3% (w/v) CTAB Blockierungspuffer (für Westernblot) 50 mM Tris / HCl pH 7,5 150 mM NaCl 1% Magermilchpulver 0,1% Triton x 100 (bei 4°C lagern) Coomassie – Färbelösung 25% Isopropanol 10% Essigsäure 0,05% Coomassie R 250 Elutionspuffer1 für Interaktionsstudien 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl 20 mM Imidazol pH 8,0 Elutionspuffer1 für Interaktionsstudien 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl 250 mM Imidazol 0,005% Tween 20 pH 8,0
Material und Methoden______________________________________________
100
Ethidiumbromid – Stammlösung 10 mg/ ml, gelöst in H2O FCA-Färbelösung 0.1g Neufuchsin
0.143g Chrysoidin 1.25g Astrablau 20ml Eisessig auf 1l mit H2O auffüllen
Interaktionspuffer 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl 20 mM Imidazol 0,005% Tween 20 pH 8,0 Lösung I (Alkalische Lyse) 50 mM Glukose 25 mM Tris/ HCl pH 8,0 10 mM EDTA pH 8,0 (bei 4°C lagern) Lösung II (Alkalische Lyse) 0,2 M NaOH 1% SDS frisch ansetzen Lösung III (Alkalische Lyse) 3 M NaAc pH 4,8 (bei 4°C lagern) Loading Dye (10x) 70% Glyzerin 0,25% Bromphenol Blau 0,25% Xylen Cyanol Lysis-Puffer 200 mM Sorbitol
10% Ficoll 20 mM EDTA (pH mit KOH!)
10 mM HEPES pH 8 mit KOH einstellen bevor Ficoll-Zugabe; Lösung bei 4°C herstellen
Sammelgelpuffer 0,139 M Tris/HCl pH 6,8 0,11% SDS (bei 4°C lagern) SDS Laufpuffer 25 mM Tris 0,1% SDS 192 mM Glycin TAE – Puffer (50x) 2 M Tris/ Azetat 0,05 M EDTA TB – Puffer 10 mM Pipes 55 mM MnCl2 15 mM CaCl2 250 mM KCl
______________________________________________Material und Methoden
101
alles außer MnCl2 mischen, pH mit HCl auf 6,7 einstellen, MnCl2 zugeben, sterilfiltrieren
TBS (10x) 0,5 M Tris/HCl pH 7,5 1,5 M NaCl TE – Puffer 10 mM Tris/ HCl pH 7,5 1 mM EDTA TE/ RNase 10 mM Tris/ HCl pH 7,5 1 mM EDTA RNase A (100 µg/ ml) (bei 4°C lagern) Trenngelpuffer (3 x) 1,126 M Tris / HCl pH 8,8 0,3% SDS (bei 4°C lagern) Western Transfer Puffer 20 mM Tris 150 mM Glycin 0,02% SDS 20% Methanol
5.1.4.2 Antibiotika zur Selektion transgener Organismen
Organismus Antibiotikum Konzentration
Kanamycin 50 µg/ ml
Ampicillin 50 µg/ ml
Spectinomycin 100 µg/ ml
Streptomycin 50 µg/ ml
Escherichia coli
Chloramphenicol 34 µg/ ml
Gentamycin 25 µg/ ml
Rifampicin 50 µg/ ml
Kanamycin 50 µg/ ml
Spectinomycin 100 µg/ ml
Agrobacterium tumefaciens
Streptomycin 50 µg/ ml
Kanamycin 50 µg/ ml Arabidopsis thaliana
Hygromycin 50 µg/ ml
Tabelle 5-19: Antibiotika zur Selektion transgener Organismen
Zur Selektion von transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurde außerdem
das Herbizid Basta in einer Konzentration von 12 µg/ ml verwendet.
Material und Methoden______________________________________________
102
5.1.5 Chemikalien und Enzyme • Abscisinsäure (SIGMA- ALDRICH, Deisenhofen) • Agar–Agar (Difco Laboratories, Detroit) • Agarose, (Invitrogen, UK) • Ampicillin (Roth, Karlsruhe) • BSA (Albumin Fraktion V, Biolabs, Schwalbach) • Bacto®-Trypton (DIFCO LABORATORIES, Detroit) • Bacto® - Yeast Extract (DIFCO LABORATORIES, Detroit) • Basta Pflanzenschutzmittel (Hoechst Schering AgrEvo GmbH) • DEPC (Diethylpyrocarbonat), (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Desoxynukloetide (Boehringer, Mannheim) • DMF (N, N-Dimethylformamid) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DMSO (Dimethylsulfoxid) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DNase I, RNase-frei (Boehringer, Mannheim) • Gentamycin (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande) • Kanamycin (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande) • Ligase, T4 DNA – Ligase (Biolabs, Schwalbach) • Lysozym (Boehringer, Mannheim) • MES (SIGMA-ALDRICH,Deisenhofen) • MSMO (Murashige & Skoog Minimal Organics Media) (DUCHEFA,
Haarlem, Niederlande) • NEB–Puffersystem für Restriktionsverdau (Biolabs, Schwalbach) • Oligonukleotide (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Oligo-dT-Primer (GIBCO BRL, Karlsruhe) • Phosphatase, alkalische (Boehringer, Mannheim) • Phytagar (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande) • Qia Quick Gel Extraktion Kit (Qiagen, Hilden) • Qia Quick PCR Purifikation Kit (Qiagen, Hilden) • Restriktionsenzyme (Biolabs, Schwalbach) • Reverse Transkriptase, M-MuLV Reverse Transkriptase (MBI
FERMENTAS, St. Leon-Rot) • Rifampicin (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • RNase A (Roth, Karlsruhe) • RNase Inhibitor (Roche) • PWO-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) • Sequenzier-Mix (Perkins Elmer, Überlingen) • Silwet (Lehle Seeds, Round Rock, USA) • Spectinomycin (Roth, Karlsruhe) • Taq–DNA Polymerase (Biolabs, Schwalbach) • Triton X-100 (Serva, Heidelberg) • TRIZOL® Reagent (Invitrogen life technologies, UK) • Tween 20 (SIGMA-Aldrich, Deisenhofen) • Chemikalien zur Herstellung von Medien (Difco Laboratories, Detroit)
Nicht speziell genannte Chemikalien wurden von der Firma Roth, Karlsruhe bezogen.
5.1.6 Verbrauchsmaterial
• Filter-Tips (Roth, Karlsruhe) • Leukopor Klebeband (BSN medical, Hannover)
______________________________________________Material und Methoden
103
• Schraubdeckelröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht) • Eppendorf Einweg-UVetten (Eppendorf, Hamburg) • PCR- Reaktionsgefäße ultradünn (Biolabs, Schwalbach) • Petrischalen (Roth, Karlsruhe) • Qiagen Maxi Highspeed Plasmid Kit (Qiagen, Hilden) • QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) • QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) • Spritzenfilter (Roth, Karlsruhe) • Centricon-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg)
Nicht speziell genannte Verbrauchsmaterialien wurden von der Firma Roth, Karlsruhe bezogen.
5.1.7 Geräte
• CCD Videokamera Sony MC-3255P (AVT Horn, Aalen) • Konfokales Laser Scanning Mikroskop Leica TCS SP2 (Leica, Bensheim) • Digitalkamera Panasonic Lumix DMC-FZ18 (Panasonic Corporation,
Osaka, Japan) • Epifluoreszenzmikroskop Axioskop (Zeiss, Göttingen) • Eppendorf BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) • Kühlzentrifuge Avanti J-25 (Beckman Instruments, Palo Alto, USA) • Mikroskop CCD-Kamera ColorView II (Soft Imaging System, Münster) • Photodokumentationssystem IP-910 (Vilber Lourmat, Torcy, Frankreich) • Sequenzierer ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkins Elmer,
Überlingen) • Speed Vac Plus SC 110A (Savant Instruments, Holbrook, USA) • Spektralphotometer Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech, Cambridge,
Großbritannien) • Spektralphotometer ND-1000 nanoDrop (nanoDrop Technoligies, Inc,
Willington USA) • Stereomikroskop MZFLIII (Leica Microsystems, Bensheim) • Stereomikroskop Stemi SV 11 (Zeiss, Göttingen) • Thermocycler GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Überlingen) • Thermocycler T-Gradient (Biometra, Göttingen) • Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg) • Thermoschrank Function line (Heraeus instruments, Hanau) • Tischzentrifuge 5417C (Eppendorf, Hamburg) • TopTablePro, Aufnahmetisch für fotografische Arbeiten (Kaiser
Fototechnik, Buchen) • Vibratome® 1500 Tissue Sectioning System (The Vibratome Company,
St. Louis, USA) • Ultrazentrfuge L 8-60 M (Beckman, München)
Neben diesen Geräten wurde auf die Standardausstattung molekularbiologischer Laboratorien zurückgegriffen.
5.1.8 Software
• Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems, San Jose/USA)
• analySIS Doku 3.2 (Soft Imaging System, Münster)
• cellD (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster)
Material und Methoden______________________________________________
104
• EndNote 9.0 (Thomson, Carlsbad/USA)
• Leica Confocal Software, 2.5 (Leica Microsystems, Bensheim)
• Microsoft Office 2003 (Microsoft Corporation, Redmond, USA)
• SigmaPlot 8.0 (Systat Software Inc., San Jose, USA)
• vectorNTI 9.0 (InforMax, Frederick/USA)
5.2 Methoden
5.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden Molekularbiologische Standardmethoden wie Restriktionsverdau von Plasmid-DNA, Auftrennung von DNA-Fragmenten mittels Agarose-Gelelektrophorese, Ligation von DNA-Fragmenten und Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase wurden nach Herstellerangaben bzw. gemäß den Anleitungen aus dem Handbuch „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“ durchgeführt (Sambrook et al., 1989).
5.2.1.1 Herstellung von Dauerkulturen
Bakteriendauerkulturen wurden mit sterilem 80%igem Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 20% Glycerin versetzt (450 µl Bakteriansuspension und 150 µl 80% Glycerin) und in flüssigem Stickstoff schockgefrostet. Die Lagerung der Dauerkulturen erfolgt bei -80°C.
5.2.1.2 Amplifizierung von DNA-Fragmenten mittels PCR
Die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR: Polymerase Chain Reaction) wurde von Kary B. Mullis entwickelt (Mullis und Faloona, 1987) und ermöglicht durch spezifische primerdefinierte enzymatische in vitro Reaktion eine millionenfache Vervielfältigung einer Zielsequenz. Je nach Zielsetzung wurden unterschiedliche Versuchsansätze gewählt. Amplifikation von DNA-Fragmenten für Klonierungen:
1 ng Plasmid-DNA 1x Phusion-HF-Puffer 0,2 mM dNTPs 1 µM 5΄-Primer 1 µM 3΄-Primer 2,5 U Phusion-Polymerase ad 20 µl H20
Genotypisierung von T-DNA-Insertions-Mutanten:
1 µl genomische DNA 1x Thermopolymerase-Puffer 0,2 mM dNTPs 1 µM 5΄-Primer 1 µM 3΄-Primer 0,5 U NEB-Taq-DNA-Polymerase ad 20 µl H20
Das PCR-Programm wurde je nach verwendeten Primern entsprechend angepasst.
______________________________________________Material und Methoden
105
5.2.1.3 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA aus Agarosegelen erfolgte mit Hilfe des QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Dazu wurde unter UV-Licht die gewünschte DNA-Bande aus dem Gel ausgeschnitten und gemäß Anleitung aus der Gelmatrix isoliert. Die Konzentration der erhaltenen DNA wurde mittels Photometer bestimmt.
5.2.1.4 DNA-Reinigung
Um bei Bedarf Verunreinigungen zu entfernen, wurde DNA über QIAquick-Säulen der Firma Qiagen nach dem „PCR Purification Kit Protocol“ aufgereinigt.
5.2.1.5 Bestimmung von DNA- bzw. RNA-Konzentrationen
Die Konzentration von DNA- bzw. RNA-Lösung wurden mit Hilfe des Photometers Nanodrop (ND-1000, nanoDrop Technologies, Inc. Willington USA) bestimmt. Dabei wurde das Absorptionsspektrum der jeweiligen unverdünnten Nukleinsäurelösung in einem Wellenlängenbereich von 220 und 320 nm gemessen und die zugehörige Konzentration errechnet (DNA: 1 OD260 entspricht 50 µg DNA/ ml, RNA: 1 OD260 entspricht 40 µg RNA/ ml).
5.2.1.6 Sequenzanalyse von DNA
Die Analyse von DNA-Sequenzen beruht auf einem modifizierten Prinzip der Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger et al., 1977) unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden. Die Analyse von DNA-Sequenzen wurde von der Firma GATC, Biotech in Konstanz durchgeführt. Die Proben wurden dazu auf eine Endkonzentration von 50-100 ng/ µl in einem Volumen von 30 µl eingestellt und per Kurier an die Firma GATC geschickt. Dort erfolgte die Sequenzanalyse und innerhalb von 1 bis 2 Tagen waren die entsprechenden Sequenzen und Chromatogramme auf der Homepage von GATC (http://www.gatc-biotech.de) einsehbar. Die Auswertung der erhaltenen Sequenzen erfolgte mit Hilfe der Software VectorNTI-Suite.
5.2.1.7 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Für das Umschreiben von mRNA in cDNA mit Hilfe einer Reversen Transkriptase wurde der ‚RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit’ (Fermentas)verwendet. Die folgenden Reaktionen wurden in 200 µl-PCR Reagiergefäßen mit dem Thermocycler T-Gradient durchgeführt.
5 µg RNA 3 µl 5x MuLV-RT Puffer 0,5 µl DNaseI [1U/ µl] 0,5 µl RNase-Inhibitor [20 U] ad 12,5 µl H2O (RNase frei)
Dieser Ansatz wurde 20 min bei 37°C inkubiert, um eventuell vorhandene Kontaminationen mit genomischer DNA mittels DNase-Verdau zu entfernen. Anschließend wurde die DNase bei 70°C für weitere 20 min inaktiviert. Dann wurden zugegeben:
Material und Methoden______________________________________________
106
1,5 µl 5x M-MuLV-Puffer 1,5 µl H2O (RNase frei) 2 µl 10 mM dNTPs 0,5 µl RNase-Inhibitor [40U/µl] 1 µl M-MuLV Reverse Transkriptase [200U/µl] 1 µl Oligo(dT)18-Primer [1µg/µl]
Zur cDNA-Synthese wurde der Ansatz 60 min bei 42°C inkubiert, anschließend folgte eine Inaktivierung der M-MuLV Reversen Transkriptase für 10 min bei 70°C. Die erhaltene cDNA wurde bei -20°C gelagert.
5.2.1.8 Quantitative PCR (qPCR)
Die Methode der qPCR erlaubt eine Quantifizierung der Genexpression. Sie wurde unter Verwendung des QuantiTectTM SYBR Green® PCR Kits (Qiagen) am RotorGene 2000 (Corbett Research) durchgeführt. Bei SYBR Green handelt es sich um einen interkalierenden Farbstoff, der doppelsträngige DNA unspezifisch bindet und anschließend vom Gerät detektiert werden kann. Die Anregung dieses Markers erfolgt bei einer Wellenlänge von 470 nm, die Detektion der Fluoreszenz bei 585 nm. Mittels der Schmelzkurvenanalyse am Ende der Reaktion kann die Reinheit der Probe überprüft werden. In jeder Reaktion wurde eine Eichgerade mit einem Plasmid erstellt, welches die Aktin2 cDNA trägt. Dafür wurden Standardverdünnungen (1:10 Verdünnungsreihe), die eine definierte Anzahl von Kopien (106-101 Kopien) enthielt, verwendet. Mit Hilfe der Eichgerade konnte in den zu untersuchenden cDNA-Proben die Kopienzahl von Aktin2 und den getesteten Genen bestimmt werden und daraus ein relativer Expressionswert errechnet werden. Die PCR-Reaktionen wurden in 10 µl Ansätzen durchgeführt, die wie folgt pipettiert wurden:
1 µl Standardverdünnung, cDNA oder H2O 0,3 µM 5´Primer 0,3 µM 3´Primer 5 µl QuantiTectTM SYBR Green® 3,4 µl H20
Folgendes Programm wurde verwendet: 1) 94°C 15 min initialer Aktivierungsschritt für die HotStarTaqTMDNA-Polymerase 2) 94°C 20 s Denaturierung 3) 56°C 30 s Annealing 4) 72°C 30 s Extension Schritt 2-4 wurde in 45 Zyklen wiederholt
5.2.1.9 Microarray-Analysen und Auswertung
Microarray-Analysen wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Katrin Philippar und Prof. Dr. Jürgen Soll (Ludwig-Maximilian-Universität München) durchgeführt. Hierfür wurden WT- und saul1-1-Pflanzen auf MS-Festmedium angezogen, zu den angegeben Zeitpunkten Proben genommen und RNA isoliert (5.2.3.3). Zur Durchführung der Microarray-Analysen wurden jeweils 5 µg Gesamt-RNA für eine Hybridisierung an den GeneChip® Arabidopsis ATH1 Genome Array der Firma Affymetrix eingesetzt. Eine Markierung der RNA erfolgte dabei unter Verwendung des One-Cycle Labeling and Control (Target) Kits von Affymetrix
______________________________________________Material und Methoden
107
entsprechend der Herstellerangaben. Die Durchführung und Auswertung des Microarrays erfolgte entsprechend den Angaben in Duy et al., 2007. Die statistische Auswertung der erhaltenen Microarray-Daten wurden von Dr. Julia Engelmann (Universität Regensburg) durchgeführt, die dabei verwendeten Parameter orientierten sich an Deeken et al., 2006.
5.2.1.10 Spezielle Klonierungstrategien
pGEM®-T easy Klonierung Die in der PCR eingesetzte Taq-DNA-Polymerase produziert am 3΄-Ende des amplifizierten Fragments Einzel-A-Überhänge. Der im Kit enthaltene pGEM®-T Easy Vektor besitzt Einzel-T-Überhänge am 5΄-Ende, wodurch eine direkte Ligation möglich wird. Die Klonierung erfolgte nach Angaben des Herstellers (Promega). TOPO® Klonierung PCR-Produkte, die mit der Phusion-Polymerase amplifiziert wurden, wurden in den pCR®-BluntIITOPO®-Vektor kloniert. Diese PCR-Produkte weisen aufgrund der Exonukleaseaktivität der Polymerase blunt ends (glatte Enden) ohne Überhänge auf und eignen sich damit für die Klonierung in den TOPO-Vektor. Die Reaktion beruht auf der Wechselwirkung der DNA mit der Topoisomerase I. Die Klonierung erfolge nach Anleitung des Herstellers, jedoch wurde nur ein halber Ansatz verwendet. CloneJET™-PCR-Klonierung Falls die Restriktionsschnittstellen des pCR®-BluntIITOPO®-Vektors für eine weiter Klonierung ungünstig waren, wurde der Vektor pJET1.2/ blunt verwendet. Eine Ligation in diesen Vektor erfolgte dabei mittels T4-DNA-Ligase nach Herstellerangaben. Gateway® Klonierung Die Gateway® Technologie ist eine universelle Methode, die sich der Eigenschaften der seitenspezifischen Rekombination der Bakteriophage Lambda bedient. Ein bestimmtes Gen wird zuerst in den Ausgangsvektor („Entry vector“) (pENTR™/D- Topo®) kloniert, wobei das 5´Ende für das gerichtete Klonieren die Anfangssequenz CACC enthält. Dieser Ausgangsvektor verfügt über zwei Rekombinationsstellen (attL1 und attL2), welche die zu klonierende Sequenz flankieren. Der Zielvektor („Destination vector“) enthält auch zwei Rekombinationsstellen (attR1 und attR2), die an das Gen für eine negative Selektion (ccdB) angrenzen und Eigenschaften im Interesse der weiteren Verwendung des zu bearbeitenden Gens (z.B. GFP-Fusion) enthält. Die Rekombination an den Rekombinationsstellen dieser beiden Vektoren wird durch die LR Clonase™ bewerkstelligt. Die Klonierung des Gens sowie die LR Reaktion wurden nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
5.2.1.11 Entfernen von RNasen aus Lösungen und Verbrauchsmaterialien
Um RNase-frei zu arbeiten, wurden Glaswaren mindestens 8 h bei 200°C im Backofen gebacken. Plastikwaren wie Reagiergefäße und Pipettenspitzen wurden nur aus ungeöffneten, RNase-freien Beuteln mit Handschuhen entnommen und in ebenfalls RNasefreien Gefäßen gelagert. Wässrige Lösungen
Material und Methoden______________________________________________
108
wurden über Nacht mit 0,1% DEPC behandelt und anschließend autoklaviert, um das giftige DEPC zu zerstören.
5.2.2 Methoden zur Arbeit mit Bakterien
5.2.2.1 Anzucht von Bakterien
Escherichia coli Zellen wurden bei 37°C, Agrobacterium tumefaciens bei 29°C angezogen. Dabei wurde jeweils LB-Medium verwendet. Die Inkubation von Flüssigkulturen erfolgte gut belüftet in geeigneten Gefäßen. Zur Selektion transgener Organismen wurden den Medien die entsprechenden Antibiotika zugesetzt. Die jeweiligen Endkonzentrationen sind der Tabelle 5-19 zu entnehmen.
5.2.2.2 Herstellen kompetenter Bakterien
Herstellung kompetenter E. coli-Zellen Die Herstellung kompetenter E. coli DH5α-Zellen erfolgte nach der SEM-Methode Inoue et al., 1990: • Zellen in 250 ml LB bei 18°C bis OD600= 0,6 anziehen, 10 min auf Eis stellen • Zellen bei 4°C und 2500xg 10 min abzentrifugieren • Pellet in 80 ml eiskaltem TB-Puffer aufnehmen, 10 min auf Eis inkubieren • Zellen wie oben pelletieren, dann vorsichtig in 20 ml eiskaltem TB-Puffer resuspendieren • Langsam DMSO bis zu einer Endkonzentration von 7% zusetzen, 10 min auf Eis stellen • Aliquots abfüllen, in flüssigem Stickstoff schockfrieren und bei -80°C lagern Herstellung kompetenter Agrobakterien Die Präparation kompetenter Agrobakterium tumefaciens-Zellen (C58C1) orientiert sich an der Anleitung von Hofgen und Willmitzer, 1988: • 2 ml LB-Übernachtkultur in 200 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika überimpfen und bis OD600= 0,5 - 1 wachsen lassen (ca. 6 h) • 20 min bei 4°C und 5300 rpm ernten, dann Pellet in 200 ml kaltem TE-Puffer aufnehmen • Zellen wie oben zentrifugieren, anschließend Pellet in 20 ml LB-Medium resuspendieren • 500 µl-Aliquots in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80°C aufbewahren
5.2.2.3 Transformation von Bakterien
Escherichia coli
Die kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut und zu jeder Plasmidlösung je 100 µl Zellen zugegeben. Die Transformationsansätze wurden für 5-30 min auf Eis inkubiert und ein Hitzeschock bei 42°C für 45 s durchgeführt. Anschließend wurden die Ansätze sofort auf Eis gestellt, jeweils 750 µl LB-Medium zugegeben und die Bakteriensuspensionen bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer Stunde wurden die Ansätze zentrifugiert, der Überstand abgekippt, das Pellet im Rücklauf resuspendiert und schließlich auf Selektivmedium ausplattiert. Die Inkubation der Transformationsansätze erfolgte über Nacht bei 37°C.
______________________________________________Material und Methoden
109
Agrobacterium tumefaciens
Kompetente Agrobakterien-Zellen wurden auf Eis aufgetaut, ca. 1,0 µg Plasmid-DNA zugegeben, 5 min auf Eis, 5 min in flüssigem Stickstoff und 5 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde 1 ml LB-Medium hinzupipettiert und der Ansatz 4 h schüttelnd bei 28°C inkubiert. Schließlich wurden die Bakterien pelletiert, ein Großteil des Überstandes abgezogen und die Zellen im restlichen Medium resuspendiert, auf Selektivmedium ausplattiert und für etwa 2 Tage bei 29°C inkubiert.
5.2.2.4 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien
Isolierung aus E. coli: Zur Isolierung der Plasmid-DNA aus den E. coli wurde die im Labor etablierte TENSPlasmid-Minipräparation nach folgendem Protokoll durchgeführt: • 1,5 ml der LB-Übernachtkultur für 30 s abzentrifugieren • Überstand bis auf 50-100 µl entfernen, Zellen im Rücklauf resuspendieren • 300 µl TENS-Puffer zugeben, vortexen • sobald die Suspension viskos geworden ist (nicht länger als 10 min) 150 µl 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zugegeben, vortexen • 5 min bei 14.000 rpm zentrifugieren, Überstand in neues Cup überführen • 400 µl eiskalten Isopropanol zum Fällen der DNA zugeben, vortexen • DNA 4 min bei 14.000 rpm pelletieren • DNA-Pellet mit 70% Ethanol waschen, trocknen und in 50 µl TE/RNase durch 10 min Schütteln bei 65°C resuspendieren Zur Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNA wurde eine Midi-Plasmidisolierung unter Verwendung von NUCLEOBOND®-Säulen AX100 (Machery-Nagel, Düren) durchgeführt. Die Isolierung der DNA erfolgte dabei nach Angaben des Herstellers. Isolierung aus Agrobakterien: DNA aus Agrobakterien wurde durch eine abgewandelte alkalische Lyse präpariert: • 3 ml Kultur ernten (3 min, 14.000 rpm) • Pellet in 100 µl eiskalter Lösung I resuspendieren, vortexen, 10 min bei RT inkubieren • 200 µl Lösung II zufügen, mischen durch Invertieren, 10 min bei RT inkubieren • 150 µl kaltes 3 M NaOAc pH 4,8 zugeben, schütteln, 3-5 min auf Eis • 5 min bei 14.000 rpm zentrifugieren, Überstand in neues Cup überführen • 1 Vol (ca. 400 µl) Phenol:Chloroform zugeben, vortexen • 5 min bei 14.000 rpm zentrifugieren, Überstand in neues Cup überführen • 800 µl eiskalten 100%igen Ethanol zum Fällen der DNA zugeben, 2 min bei RT inkubieren • DNA 5 min bei 14.000 rpm pelletieren • DNA-Pellet mit 70% Ethanol waschen, trocknen und in 50 µl TE/RNase durch 10 min Schütteln bei 65°C resuspendieren
Material und Methoden______________________________________________
110
5.2.3 Methoden zur Arbeit mit Pflanzen
5.2.3.1 Anzucht und Selektion von Arabidopsis Pflanzen
Anzucht auf Erde Einige Samen wurden auf angefeuchtetem Bodensubstrat ausgebracht und für 3 Tage bei 4°C stratifiziert. Die Keimung erfolgte anschließend bei Kurztagbedingungen (ca. 22°C, 60 % Luftfeuchtigkeit, 8 h Licht) in der Phytokammer. Im 4- bis 6-Blatt-Stadium wurden die Pflanzen vereinzelt und nach ca. 5 Wochen erfolgte die weitere Kultivierung unter Langtagbedingungen (ca. 22°C, 60 % Luftfeuchtigkeit, 16 h Licht). Im Laufe ihres Wachstums wurden die Pflanzen zweimal im Abstand von zwei Wochen mit Voxal-Dünger gedüngt. Für eine erfolgreiche Kultivierung von saul1-Pflanzen wurden die Pflanzen in einem Alter von 12-14 Tagen vereinzelt und direkt unter Langtag-Bedingungen weiter angezogen. Die Lichtintensität musste dabei mindestens 180 µmol m-2 s-1 betragen. Besonderheiten sind im Ergebnisteil einzeln angegeben. Anzucht auf MS-Festmedium Zur Anzucht von Arabidopsis-Pflanzen auf MS-Festmedium wurden die Samen zunächst in 1 ml Sterilisierungslösung (50% DanKlorix, 0,05% Tween 20) für 5 Minuten unter ständigem Schütteln gewaschen. Anschließend wurde die Sterilisierungslösung durch dreimaliges Waschen in jeweils 1 ml sterilem H2O unter der Sterilbank entfernt. Die Samen wurden schließlich in 1 ml 0,1%iger Agaroselösung aufgenommen. Mit sterilen Plastik-Pasteurpipetten wurden die Samen auf MS-Festmedium ausgebracht und mit Leukopor verswchlossen. Nach drei Tagen Keimruhe bei 4°C wurden die Platten in die Langtag-Phytokammer umgestellt. Selektion transgener Pflanzen Die Selektion transgener Pflanzen erfolgte entweder auf Erde oder auf entsprechendem MS-Selektionsmedium. Zur Selektion mit dem Herbizid Basta wurden Pflanzen auf Erde ausgebracht, eine Woche lang unter Kurztagbedingungen angezogen und anschließend dreimal im Abstand von je 3 Tagen mit einer Liberty SL 200g/ l-Lösung (Konzentration 0,1%) besprüht. Zur Selektion mit Hygromycin oder Kanamycin wurden Samen auf MS-Medium mit den in Tabelle 5-19 Konzentrationen des jeweiligen Antibiotikums ausgebracht und für 2-3 Wochen unter Langtagbedingungen kultiviert. Resistente Pflanzen wurden vereinzelt und auf Erde weiterkultiviert.
5.2.3.2 Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana
Die Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis erfolgte entsprechend Aitchitt et al., 1993: • Blätter in einem Eppendorfcup in flüssigem N2 eingefrieren • mit dem Akkubohrer und einem geeigneten Aufsatz oder im Tissue Lyser (Qiagen) mit Hilfe von Tungsten Carbide Beads zerkleinern • 400 µl DEB-Puffer und 4 µl 10%iges DTT zugeben, mixen, 30 min bei 65°C inkubieren • 400 µl Chloroform zugeben, vortexen, 15 min bei 14.000 rpm zentrifugieren • obere Phase in ein neues Reagiergefäß überführen • 1 Vol Isopropanol zugeben, invertieren, 15 min bei 14.000 rpm zentrifugieren
______________________________________________Material und Methoden
111
• Überstand vollständig abziehen, DNA-Pellet mit 70% Ethanol waschen, trocknen und in TE/RNase aufnehmen
5.2.3.3 Isolierung von Gesamt-RNA aus Arabidopsis thaliana
Bei allen Arbeiten mit RNA wurden die üblichen Maßnahmen getroffen, um eine höchstmögliche RNase-Freiheit zu gewährleisten (Abschnitt 5.2.1.11). • Pflanzenmaterial abwiegen und in flüssigem N2 eingefrieren • Material entweder mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff pulverisieren oder, ebenfalls gefroren, im 1,5 ml Eppendorfcups im Tissue Lyser (Qiagen) zerkleinert • im ersten Fall das Material in Schraubdeckelröhrchen überführen, im zweiten in den verwendeten Reaktionsgefäßen lassen • 10 ml Trizol pro g Gewebe zugeben, vortexen bis das Gemisch homogen ist, 5 min bei RT inkubieren • 2 ml Chloroform pro g Gewebe zufügen, 15 s kräftig schütteln, 5 min bei RT inkubieren • 15 min bei 12.000xg (4°C) zentrifugieren • wässrige, obere Phase in ein frisches Tube überführen • zum Fällen 5 ml Isopropanol pro g Gewebe zugeben, 10 min bei RT inkubieren • wie oben zentrifugieren, Pellet mit 75% EtOH (verdünnt in DEPC-H2O) waschen (5 min, 7.500xg, 4°C) • RNA-Pellet trocknen, in DEPC-H2O aufnehmen, zum Lösen 10 min bei 55°C inkubieren Die Lagerung der RNA erfolgte bei -80°C.
5.2.3.4 Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana mit
Agrobakterien
Die Transformation ("floral dip") erfolgte nach einem Protokoll von Clough und Bent, 1998, die eine Methode von Bechtold und Pelletier, 1998 modifiziert hatten. Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden wie folgt transformiert: Mit 5 ml einer Agrobacterium tumefaciens-Vorkultur wurden 0,2 l LB-Medium (mit Antibiotika zur Selektion) angeimpft und üN bei 29°C angezogen. Am nächsten Tag wurden 6 g Saccharose und 150 µl Silwet zugegeben und die Kultur in ein hohes Becherglas überführt. Für die Transformation wurden Pflanzen herangezogen, die möglichst viele sich öffnende Blüten und reife Knospen und keine Schoten besaßen. Diese Pflanzen wurden kopfüber für 1 min in die Agrobakteriensuspension getaucht. Anschließend kamen die Pflanzen für 1-2 Tage in ein Minigewächshaus, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten und wurden im Gewächshaus weiter kultiviert. Nach Reife der ersten Schoten wurden Papiertüten über die oberirdischen Pflanzenteile gesteckt und noch etwa eine Woche weiter gegossen. Nach dem vollständigen Austrocknen wurden die Samen geerntet, ausgesät und transgene Samen durch Selektion der Keimlinge bestimmt (Abschnitt 5.2.3.1).
5.2.3.5 Transiente Tranformation von Pflanzenzellen
Transformation von Pflanzenmaterial mittels particle inflow gun (PIG) Für die transiente Expression von SAUL1-GFP-Konstrukten wurde die entsprechende Plasmid-DNA an Goldpartikel fixiert und mittels Particle Inflow
Material und Methoden______________________________________________
112
Gun (PIG) in das jeweilige Pflanzengewebe eingebracht. Dazu wurden 35 mg Goldpartikel eingewogen, mit 500 µl 70% EtOH gewaschen, 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Goldpartikel in der SpeedVac getrocknet. Das Goldpellet wurde anschlißend in 350 µl H20 aufgenommen und im Ultraschallbad vollständig resuspendiert. 50 µl dieser Goldstammlösung wurden in ein neues Cup überführt, 10 µl Midi-DNA (1 µg/µl), 50 µl 2,5 M CaCl2 und 20 µl 0,1 M Spermidin zupipettiert. Der Ansatz wurde für 3 min gevortext, 100 µl 100% EtOH (-20°C) zugegeben, erneut gevortext, weitere 200 µl 100% EtOH (-20°C) zugegeben und für mind. 30 min bei -20°C inkubiert. Nach Zentrifugation für 1 min mit ausgeschalteter Bremse wurde der Überstand abgenommen und die Goldpartikel mit der anhaftenden Plasmid-DNA in 50 µl Wasser resuspendiert. Als Pflanzenmaterial wurden mit dem Lochstanzer (Ø 2,5 cm) Disks aus Tabak, Melone, Zwiebel und Lauch ausgestanzt, die mit der unteren Epidermis nach oben in kleine Petrischalen mit MS-Mannit-Medium gelegt wurden. Pro Petrischale wurden 9 µl Gold-DNA-Suspension zum Beschuss verwendet, dr Beschuss erfolgte bei 8 bar. Infiltration von Nicotiana benthamiana Zur transienten Expression von Konstrukten in pflanzliche Gewebe wurden Agrobakterien, welche das gewünschte Konstrukte trugen, in Blätter von Nicotiana benthamiana infiltriert. Dazu wurden ca. 3 ml einer üN-Kultur von entsprechenden Agrobakterien in einer 5 ml-Spritze aufgezogen, an der Blattunterseite angesetzt und die Agrobakterien mit leichtem Druck in das Blattgewebe gepresst. Die Tabakpflanzen wurden für einen weiteren Tag unter weiter kultiviert und anschließend die Fluoreszenz durch konfokale Mikroskopie analysiert. Zur Plasmolyse der transformierten N. benthamiana-Epidermiszellen wurde zunächst die Epidermis abgezogen und auf einen Tropfen 1 M Saccharose-Lösung gegeben. Transformation von Arabidopsis Mesophyllprotoplasten Zur Transformation von Arabidopsis Mesophyllprotoplasten wurden die Blätter von 3-4 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen zunächst mit Sandpapier angeraut und die Blätter anschließend in Verdaupuffer für 2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln bei leichtem Schütteln inkubiert. Durch enthaltene Zellulasen und Pektolyasen wurden hierbei die Zellwände angelöst und die Protoplasten konnten sich aus umgebendem Blattmaterial lösen. Durch Filtration durch ein Nylon-Netz (Maschengröße 50 µm) und anschließende Zentrifugation bei 100 x g wurden die Protoplasten gereinigt und angereichert. Das Zellpellet wurde in MaMg-Puffer aufgenommen und nach Bestimmung der Zellzahl auf eine Konzentration von 5000 Protoplasten pro µl eingestellt. Die anschließende Transformation erfolgte nach dem Protokoll von Abel und Theologis von 1994. Transformierte Protoplasten wurden über Nacht bei 22°C im Dunkeln in kleinen Petrischalen inkubiert. Die Auswertung erfolgte am nächsten Tag durch konfokale Mikroskopie. Eine Lyse der Protoplasten erfolgte durch Zugabe von Lysis-Puffer auf den Objektträger in einem Verhältnis von 1:1.
______________________________________________Material und Methoden
113
5.2.3.6 Konfokale Mikroskopie
Die Fluoreszenz von YFP-, GFP- und RFP-Fusionsproteinen wurde mittels
konfokaler Laserscanning Mikroskopie (KLSM; Leica TCS SP II) detektiert. Die
Wellenlängen des Laseranregungslichts betrugen dabei 488 nm (GFP), 514 nm
(YFP und 543 nm (RFP). Detektion der Fluoreszenz erfolgte bei 497-527 nm
(RFP), 525-575 nm (YFP) und 570-625 nm (RFP).
5.2.3.7 FCA-Färbemethode
Für eine Färbung von unterschiedlichen Gewebeschichten in Querschnitten von
Arabidopsis-Stängeln wurden diese zunächst in 5%iger LMP-Agarose eingebettet
und anschließend mit Hilfe des Vibratoms (Vibratome® 1500 tissue sectioning
system, The Vibratome Company, St. Louis, USA) Querschnitte angefertigt. Zu
diesen Pflanzenschnitten wurde auf einem Objekträger ein Tropfen FCA-
Färbelösung (Fuchsin-Chrysoidin-Astrablau) gegeben und der Objektträger 10
Sekunden lang leicht. Schließlich wurde die Färbelösung abgezogen und alle
Farbstoffreste durch Spülen mit ausreichend Wasser entfernt. Die Färbung der
einzelnen Zellschichten wurde anschließend mikroskopisch ausgewertet.
5.2.3.8 Proteininsolierung aus Arabidopsis thaliana
Zur Isolierung von pflanzlichen Proteinextrakten wurde das Material zunächst durch Mörsern in flüssigem Stickstoff aufgebrochen und mit Mörserpuffer versetzt (3 ml Puffer pro g Gewebe). Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3500 x g und 4°C abgetrennt und der Überstand abgenommen. Zur Isolierung von Gesamt-Membran-Fraktionen erfolgte anschließend ein Zentrifugationsschritt für 1 h bei 100000 x g und 4°C, der die löslichen Proteine von einem Gesamt-Membranpellet antrennt. Sowohl der Überstand als auch das Membranpellet wurden in SDS-Probenpuffer aufgenommen und für Westernblot-Analysen verwendet (siehe 5.2.4.2).
5.2.3.9 Pigmentisolierung aus Arabidopsis-Keimlingen
Zur Bestimmung des Pigmentgehalts in Arabidopsis-Keimlingen wurden 10-20 mg Gewebe zunächst in flüssigem Stickstoff zerrieben und nach Zugabe von 1 ml Aceton weiter gemörsert, bis das Gewebe vollständig aufgelöst war. Nach Zentrifugation für 2 min bei 14000 rpm wurde der Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und die Proben bis zur HPLC.Analyse in bei -70°C gelagert. Die HPLC-Analysen erfolgten durch die Arbeitsgruppe von Dr. Peter Jahns an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf durchgeführt.
5.2.3.10 Trypanblau-Färbung
Um absterbende und tote Zellen zu färben, wurden einzelne Blätter
abgeschnitten und in Lactophenoltrypan-Lösung gelegt (0,03% Trypanblau, 33%
(W/ v) Lactat, 33% wassergesättigtes Phenol und 33% Glycerin). Die Proben
wurden zunächst eine Minute bei 99°C und anschließend 24 Stunden bei
Material und Methoden______________________________________________
114
Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden in Chloralhydrat (2,5 g/ ml)
entfärbt, um eine Hintergrundfärbung zu minimieren. Schließlich wurde die
Färbung der Blätter am Stereomikroskop Leica MZL III dokumentiert.
5.2.4 Proteinchemische Methoden
5.2.4.1 SDS-PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung von Proteinen wurde nach Laemmli, 1970 durchgeführt. Proben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und über 10%ige SDSPolyacrylamidgele bei 100-200 V aufgetrennt. Als Größenmarker diente PageRulerTM prestained protein ladder (Fermentas). Gele für den Western Blot wurden geblottet und alle anderen zur Detektion der Proteine mit Coomassie-Lösung gefärbt (15 min, RT), mit H2O gewaschen, für 10 min mit ausreichend H2O bedeckt in der Mikrowelle und über Nacht in 7%iger Essigsäure entfärbt und abschließend vakuumgetrocknet.
5.2.4.2 Western Blot
Proteine aus Polyacrylamidgelen wurden in einer Western Blot-Apparatur bei 400 mA 25 min lang auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet Burnette, 1981. Die Nitrocellulose wurde dann für ca. 10 min mit Ponceau S gefärbt. Nach Waschen mit H2O wurden die Spuren markiert und die Membran nach Bedarf zurechtgeschnitten. Anschließend wurde die Nitrocellulose 30 min in Blockierungspuffer geschwenkt. • Wurde der Western Blot mit einem primären und sekundären Antikörper durchgeführt, erfolgte Inkubation mit dem primären Antikörper (verdünnt mit Blockierungspuffer) üN bei 4°C. Dann wurden die Membranstücke zweimal kurz mit Blockierungspuffer gewaschen bevor sie 10 min in Blockierungspuffer geschwenkt wurden. Es folgte eine einstündige Inkubation bei RT mit dem Peroxidase-gekoppelten sekundären Antikörper (1:4000 verdünnt mit Blockierungspuffer). • Bei Verwendung des monoklonalen anti-His-Antikörpers war keine Inkubation mit einem sekundären Antikörper nötig, da dieser Antikörper bereits als Peroxidase-Konjugat vorliegt. Nach Inkubation mit dem jeweiligen Peroxidase-gekoppelten Antikörper, wurde die Nitrocellulose erneut im Blockierungspuffer zweimal kurz, anschließend für 10 min und dann viermal ebenfalls kurz in H2O gewaschen. Anschließend wurde sie für 2 min in einer 1:1 Mischung der Lösungen A und B des Lumi-Light Kits inkubiert (Roche). Die Chemolumineszenzsignale wurden durch Auflegen eines Röntgenfilms detektiert. Der Western Blot zur Detektion von AAO3 Proteinmenge wurde von Florian Bittner (Institut für Pflanzenbiologie, Technische Universität Braunschweig) durchgeführt. Hierbei wurden 50 µg Proteinrohextrakt auf einem 7,5%igen nativen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Detektion erfolgte mit einem polyklonalen anti-AAO3 oder anti-AAO1 Antikörpern aus Kaninchen und Anti-Kaninchen-IgG-alkalische-Phosphatase-Isomeren. Proteinbanden wurden mit 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylphosphat und Nitroblau Tetrazolium als Substrate visualisiert.
______________________________________________Material und Methoden
115
5.2.4.3 Anreicherung von Antikörpern
Die Anreicherung von spezifischen Antikörpern erfolgte gegen MBP-getaggtes gereinigtes SAUL1-Protein. Dabei wurde zunächst MBP-SAUL1 auf eine Nitrozellulose-Membran getropft und die Membran anschließend für 30 min in Blockierungspuffer inkubiert, um die Membran abzusättigen. Nach einem 60-minütigen Inkubationsschritt in ungereinigtem Antiserum erfolgte die Elution von gebundenen Antikörpern entsprechend dem Protokoll beschrieben in Sauer und Stadler, 1993. Die Fraktionen auf sechs Elutionsrunden wurden in Centricon-Röhrchen (Eppendorf) mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa auf ein Endvolumen von 100 µl eingeengt. Nach Abnehmen des Überstandes wurde die Säule nochmals mit 100 µl 1xTBS-Puffer gewaschen und die Überstände vereinigt. Die so angereicherte Antikörperlösung wurde 1:100 verdünnt in Westernblot-Analysen eingesetzt.
5.2.4.4 ABA-ELISA
Zur Bestimmung des ABA-Gehaltes in Blattmaterial wurde ein ABA-ELISA durchgeführt. Hierbei wurde zunächst Blattmaterial in flüssigem Stickstoff zerrieben und in H2O-bidest in einem Verhältnis von 1:7 (w/v) aufgenommen. Es folgte ein Inkubationsschritt über Nacht bei 4°C und im Dunkeln, um das enthaltene ABA zu lösen. Nach Zentrifugation für 10 min bei 4°C und 10000 x g wurde der Überstand in einem Verhältnis von 1:3 in TBS verdünnt. Die so vorbereiteten Proben wurden in den ABA-ELISA Phytodetek der Firma Agdia eingesetzt und der ELISA wurde entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt.
5.2.4.5 Bestimmung der AO-Aktivität
Die Detektion der AO-Aktivität wurde von Florian Bittner (Institut für Pflanzenbiologie, Technische Universität Braunschweig) vorgenommen. Pflanzenproben wurden bei 4°C in 2 Volumen einer Lösung (100 mM Kaliumphosphat, 2,5 mM Ethylendiamintetrasäure; 5 mM Dithiothreitol pH 7,5) aufgenommen und sonifiziert. Nach Zentrifugation wurden 50 µg des Rohextrakts auf einem nativen 7,5%iges Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Detektion der AO-Aktivität erfolgte mit den beiden Substraten Indol-3-Carboxaldehyd und 1-Naphtalaldehyd wie in Koshiba et al., 1996 beschrieben.
5.2.4.6 Label-Transfer
Die Expression und Aufreinigung der rekombinanten Proteine AAO3 und SAUL1
erfolgte innerhalb der Arbeitsgruppe von Florian Bittner (TU Braunschweig) und
wie in Raab et al., 2009 beschrieben. Das Label-Transfer-Experiment wurde
entsprechen Layer et al., 2007 durchgeführt. Hierbei war AAO3 mit dem tri-
funktionalen Mts-Atf-Biotin-Label (2-[N2-(Y-azido-2,3,5,6-tetrafluoro-beuzoyl)-N6-
(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl] Ethylmethane-Thiosulfonate (Pierce/Perbio,
http://www.piercenet.com) markiert. Es wurden äquimolare Mengen an SAUL1
(11,1 µg) und AAO3 (21,6 µg) gemeinsam inkubiert. Anschließend wurde die
Übertragung des Labels von AAO3 auf das SAUL1-Protein in einem Westernblot
detektiert.
Material und Methoden______________________________________________
116
5.2.4.7 IPTG-Induktion von Fusionsproteinen (MBP) und Zellaufbruch
Der pLac-Promotor des pMAL-c2x normalerweise reprimiert durch den Lac- Repressor (lacI Gen), sorgt nach Induktion mit dem Laktose-Analog IPTG (Isopropyl-ß-Dthiogalactopyranosid) für eine starke Expression des Fusionsproteins. Dieses wird aufgrund der fehlenden Signalsequenz nicht in den periplasmatischen Raum des Bakteriums transportiert, sondern im Zytoplasma angereichert. Induktion im kleinen Maßstab Induktions- sowie Antiserentests wurden in Eppendorfcups im kleinen Maßstab durchgeführt. Für diese wurden üN-Kulturen der transformierten E. coli-Stämme zusammen mit einer Kontrollkultur (enthält den leeren pMAL-c2x) 1:10 in LBAmp verdünnt. Nach 1 h bei 37°C wurden die Proben in zwei Portionen aufgeteilt. Zu einer Portion wurde IPTG (0,5 mM) zugegeben, die andere Portion ohne IPTG diente als Negativkontrolle. Das anschließende zweistündige Wachstum der Zellen erfolgte bei 37°C. Nach der Zellernte (2 min bei 6.000 rpm) wurde das Pellet in 1x Probenpuffer (1/5tel des Ursprungsvolumen) aufgenommen, die Zellen durch eine fünfminütige Inkubation bei 95°C aufgebrochen und 1 min bei 14.000 rpm abzentrifugiert. 10 µl der Überstände wurden auf SDS-Proteingelen analysiert. Induktion im großen Maßstab Für Interaktionsstudien mit putativen Interaktionspartnern von SAUL1 wurden größere Mengen an MBP-Fusionsproteinen benötigt. Dazu wurden 250 ml LBAmp-Medium mit 2,5 ml üN-Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer OD600=0,5 inkubiert. Es folgte eine zweistündige Induktion mit 0,5 mM IPTG. Nach der Ernte der Zellen (20 min, 4.000xg, 4°C), wurde das Pellet in 3 ml PBS (+Complete Mini Proteaseinhibitoren, Roche) resuspendiert. Der Zellaufbruch in Eiswasser gekühlter Proben erfolgte durch pulsweises Sonifizieren (ca. 5x20 s bei 200 W) und wurde mittels Bradfordtest verfolgt. Zelltrümmer wurden 30 min bei 9.000xg abzentrifugiert, der Überstand abgezogen und für weitere Analysen verwendet.
5.2.4.8 Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Bestimmung des Proteingehalts einer Proteinlösung wurden 10 µl Probe zu 990 µl 1x Bradford-Färbelösung gegeben, gemischt und nach fünfminütiger Inkubation bei RT die OD bei 595 nm bestimmt. Je nach Proteingehalt erfolgte mehr oder weniger Bindung des Farbstoffs Coomassie Blue G-250 an die Proteine und somit eine Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 zu 595 nm. Die quantitative Auswertung erfolgte über eine Eichgerade, die mit 0 bis 15 µg BSA erstellt wurde.
5.2.4.9 Reinigung von Fusionsproteinen
Für Interaktionsstudien von SAUL1 und putativen Interaktionspartnern sowie zur Generierung von AntiSAUL1-Antikörpern wurden größere Mengen gereinigten Proteins benötigt. Daher folgten auf den in Abschnitt 5.2.4.7 beschriebenen Zellaufschluss und der Isolierung von Proteinrohextrakten weitere Reinigungsschritte.
______________________________________________Material und Methoden
117
Reinigung von MBP-Fusionsproteinen MBP-Fusionsproteine wurden mittels Amylose-Säulen (NEB) gereinigt. Hierbei wird zunächst das Säulenmaterial durch Spülen mit 8 Volumen Säulenpuffer äquilibriert und anschließend der in Abschnitt 5.2.4.7 erhaltene Proteinrohextrakt auf die Säule gegeben. Das fusionierte MBP kann die an die Sepharose-Matrix gebundene Amylose (Maltose-Analog) binden, die Fusionsproteine werden somit in der Säule zurückgehalten. Nachdem die Säule mit 12 Volumen Säulenpuffer gewaschen wurde, erfolgt die Elution der gebundenen MBP-Fusionsproteine durch Zugabe von Säulenpuffer (+10 mM Maltose). Die gelöste Maltose kompetitierte mit gebundener Amylose um die MBP-Bindung, die Fusionsproteine wurden vom Säulenkörper gelöst. Das Eluat wurde in Fraktionen von 500 µl aufgefangen und der Proteingehalt und Reinigungsgrad mittels SDS-PAGE und anschließender Coomassie-Färbung überprüft. Die Proteinkonzentration der einzelnen Fraktionen wurde mittels Bradford-Test bestimmt (5.2.4.8) Reinigung mittels His-Tag Die Reinigung von His-getaggten Proteinen (SAUL1 und AAO3) und die Klonierung der jeweiligen Konstrukte erfolgten in der Arbeitsgruppe von Dr. Florian Bittner (Technische Universität Braunschweig).
5.2.4.10 Pulldown-Experimente
Pulldown-Experimente wurden über NiNTA-Beads entsprechend der Anleitung Ni-NTA Magnetic Agarose Beads Handbook (Qiagen) zur Aufreinigung von His-getaggten Proteinen durchgeführt. Hierbei wurden zunächst 50 µl NiNTA-Beads-Lösung mit 1 µg SAUL1-His-Protein (entspricht 11,2 nmol) und 500 µl Elutionspuffer1 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) versetz und für 1 h bei RT schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden die Beads über ein Magnet-Rack präzipitiert und der Überstand verworfen. Nach Resuspendierung der Beads in 100 µl Interaktionspuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 0,005% Tween 20, pH 8,0) wurden äquimolare Mengen an putativen Interaktionspartnern zugegeben (MBP 0,57 µg, MBP-OBE1 1,2 µg, MBP-LINC2 0,99 µg, MBP-MAF19.20 0,85 µg) und die Suspension für 1 h bei RT inkubiert. Die Beads wurden erneut präzipitiert und der Überstand abgenommen (ÜS-Fraktion). Nach drei Waschschritten in jeweils 500 µl Interaktionspuffer erfolgte die Elution der an die Beads gebundenen Proteine durch Zugabe von jeweils 50 µl Elutionspuffer2 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, 0,005% Tween 20, pH 8,0). Die so erhaltenen PD-Franktionen wurden gemeinsam mit den ÜS-Fraktionen in Westernblot-Analysen eingesetzt.
Material und Methoden______________________________________________
118
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Literaturverzeichnis_________________________________________________
134
_______________________________________________________________Anhang
135
7 Anhang
7.1 Deletionskonstrukte
Verkürzte Proteinvarianten von SAUL1
Konstruktname Unfasst die Aminosäuren Proteinlängen
SAUL1 Volllänge 1 - 801 801 AS
SAUL1∆N ∆1 - 93 709 AS
SAUL1∆C ∆761 - 801 760 AS
SAUL1∆N∆C 94 - 760 668 AS
SAUL1∆ARM1 ∆133 - 173 760 AS
SAUL1∆ARM1-6 ∆1 - 408 394 AS
SAUL1∆ARM7-11 ∆409 - 801 408 AS
SAUL1∆ARM7/8 ∆433 - 518 715 AS
SAUL1∆ARM9 ∆577 - 619 758 AS
SAUL1∆ARM10/11 ∆644 - 801 643 AS
Tabelle 7-1 Zusammenfassung der verkürzten Proteinvarianten von SAUL1
Verkürzte Proteinvarianten von PUB43
Proteinname Unfasst die Aminosäuren Proteinlängen
PUB43 Volllänge 1 - 811 811 AS
PUB43∆N ∆1 - 110 702 AS
PUB43∆ARM1-6 ∆1 - 396 416 AS
PUB43∆ARM7-12 ∆397 - 811 396 AS
PUB43∆ARM10-12 ∆655 - 811 654 AS
Tabelle 7-2 Zusammenfassung der verkürzten Proteinvarianten von PUB43
7.2 Vektorkarten
7.2.1 SAUL1-Konstrukte
Anhang_______________________________________________________________
136
_______________________________________________________________Anhang
137
Anhang_______________________________________________________________
138
_______________________________________________________________Anhang
139
Anhang_______________________________________________________________
140
_______________________________________________________________Anhang
141
Anhang_______________________________________________________________
142
_______________________________________________________________Anhang
143
7.2.2 PUB43-Konstrukte
Anhang_______________________________________________________________
144
__________________________________________________________Danksagung
145
8 Danksagung Abschließend möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser
Arbeit beigetragen haben. Mein besonderer Dank gilt:
uHerrn Dr. Stefan Hoth für die kompetente, engagierte und stets
freundschaftliche Betreuung dieser Arbeit und die Freiheit und das
Vertrauen, eigene Ideen und Projekte entwickeln und umsetzen zu
können. Durch rege wissenschaftliche Diskussion und andauernden
fachlichen Rat hat er wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen.
uHerrn Prof. Dr. Christian Koch für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
uHerrn Prof. Dr. Norbert Sauer für die Aufnahme in seinem Lehrstuhl und
die Möglichkeit, in diesem außerordentlich interessanten Gebiet
arbeiten zu können.
uallen Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe und den Mitarbeitern des
Lehrstuhls der Molekularen Pflanzenphysiologie für das schöne
Arbeitsklima und die unzähligen, nicht immer nur fachlichen
Diskussionen. Ganz besonders ist dabei Frau Angelika Wolf zu
erwähnen, die sich liebevoll um die Aufzucht aller Pflanzen gekümmert
hat.
u.meinen Kooperationspartnern, die entscheidend zu dieser Arbeit
beigetragen haben:
• Dr. Florian Bittner und Maryam Zarepour (Institut für
Pflanzenbiologie, Technische Universität Braunschweig)
für die biochemischen Untersuchungen zu AAO3.
• Dr. Peter Jahns (Institut für Biochemie der Pflanzen,
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) für die
durchgeführten HPLC-Analysen.
• Dr. Katrin Philippar und Prof. Dr. Jürgen Soll (Lehrstuhl für
Biochemie und Physiologie der Pflanzen, Ludwig-
Maximilian-Universität München) für die Durchführung der
Microarray-Analysen sowie Dr. Julia C. Engelmann (Institut
für Funktionelle Genomik, Universität Regensburg) für
deren Auswertung
udem Evangelischen Studienwerk Villigst e.V. für das erhaltene
Promotionsstipendium und die weit mehr als nur finanzielle Förderung.
umeinen Laborkollegen Kathrin Wippel und Katja Vogelmann für die
gemeinsame Bewältigung des täglichen Wahnsinns.
uSusanne Wolfenstetter für deine Geduld und den vielen Spaß, Jensen,
Barney und alles, was hier keinen Platz mehr findet.
uLena und Jenny. Ihr seid die Besten.
umeiner Familie für das immerwährende Verständnis, die liebevolle
Unterstützung in allen Lebenslagen und das unerschöpfliche Vertrauen
in mich.
Danksagung__________________________________________________________
146
___________________________________________________________Lebenslauf
147
9 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name: Gabriele Susanne Drechsel
Geburtsdatum: 16. Juli 1980
Geburtsort: Roth
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulbildung 09/1991 bis 06/2000 Wolfram-von-Eschenbach-Gymnasium, Schwabach
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Hochschulstudium
10/2000 bis 12/2005 Studium der Biologie
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Abschluss: Diplom-Biologin Univ
01/2005 bis 12/2005 Diplomarbeit
Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Thema:
Analyse von Proteinkomponenten im Netzwerk der
ABA-Signaltransduktion in Arabidopsis thaliana
Seit 03/2006 Promotion
Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
08/2006 bis 07/2008 Promotionsstipendium
Evangelisches Studienwerk Villigst e.V.
Lebenslauf___________________________________________________________
148
_____________________________________________________Publikationsliste
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10 Publikationsliste Identification of a novel E3 ubiquitin ligase that is required for suppression of premature senescence in Arabidopsis Sabine Raab*, Gabriele Drechsel*, Maryam Zarepour, Wolfram Hartung, Tomokazu
Koshiba, Florian Bittner, Stefan Hoth
Plant Journal, Juli 2009
Arabidopsis zinc-finger protein 2 is a negative regulator of ABA signaling during seed germination Gabriele Drechsel, Sabine Raab, Stefan Hoth
Journal of Plant Physiology, Juli 2010
C-terminal ARM repeats are essential and sufficient for association of the PUB-ARM E3 ubiquitin ligase SAUL1 with the plasma membrane Gabriele Drechsel, Johannes Bergler, Kathrin Wippel, Norbert Sauer, Katja Vogelmann,
Stefan Hoth
Journal of Experimental Botany, Januar 2011
Ubiquitin ligase knockout makes young plants feel old Gabriele Drechsel, Katja Vogelmann, Kathrin Wippel, Norbert Sauer, Johannes Bergler,
Stefan Hoth
Plant Physiology, eingereicht September 2010
