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HS 2008 Xiangyang Zhang 1
Analytische Chemie für Biologie Pharmazie Bewegungs-
wissenschaften und Sport
Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren
Zusammenfassung
HS 2008 Xiangyang Zhang 2
Überblick Trennmethoden
Beweblichkeit
in Einzelphase Gleichgewicht
Beweblichkeit
1 2 + + +
1
2 m
S
Verteilung
Adsorption/Desorption
Beruht auf
Unterschied in Gleichgewicht / Kinetische Eigenschaften
HS 2008 Xiangyang Zhang 3
Ein Chromatogramm
norm
iert
e S
ignalh
öhe h
tM
tA
tB
ZeitwA wB
B
A
HS 2008 Xiangyang Zhang 4
Klassische Grundlage
!
K =A[ ]
S
A[ ]M
!
v =L
tR
!
u =L
tM
!
k = KVs
VM
!
k =tR" t
M
tM
=tR
'
tM
!
" =K
B
KA
!
" =kB
kA
!
" =(tR
')B
(tR
')A
!
N = Neff "k +1
k
#
$ %
&
' (
2
=tR'
)
#
$ %
&
' (
2
"k +1
k
#
$ %
&
' (
2!
N =L
H=tR
2
" 2=16
tR
w
#
$ %
&
' (
2
!
tR
'= t
R" t
M
Trennfaktor / Selektivätsfaktor
Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor
Retentionszeit / Geschwindigkeit
Verteilungskoeffizient
Auflösung !
H =L
16
w
tR
"
# $
%
& '
2
Bodenzahl und Bodenhöhe
!
R =tB" t
A
wB
+ wA
2
=2(t
B" t
A)
wB
+ wA
!
R =" #1
"
$
% &
'
( ) *
kB
1+ kB
*N
4
HS 2008 Xiangyang Zhang 5
Kinetischer Bodenhöhe
Minimaler H-Wert
Theore
tische B
odenhöhe H
!
H = 2" # dp +2kD #DM
u+ u #
f (dp2,dc
2)
DM
+q # k # d f
2
(1+ k)2DS
oder2td # k
(1+ k)2
$
% &
'
( )
optimale u
Minimum H
1.! Kapillarsäulen A = 0
2.! Optimale u => minimum
von Terme B und C
3.! Dünne L-Filmdicke
HS 2008 Xiangyang Zhang 6
Gaschromatographie (GC) Mobile Phase: He, N2 und H2 als Träger Stationäre Phase: entweder feste Adsorbentien oder flüssige Film
Analyten: •! ausreichenden Dampfdruck und •! stabil bei Arbeitstemperatur •! Kleine, neutral und nicht-zu polare Moleküle
Gekoppelt: •! mit MS zur qualitativen Analysen (Strukturaufklärung) •! mit FID (und TCD, unselektiv) und ECD (Cl-), FPD (P-/S-)
(selektiv) zur quantitativen Analysen
Zur Anwendungen: •! Säulenparameter, T–Gradient und u •! Derivatisierung
HS 2008 Xiangyang Zhang 7
Flüssige Stationäre Phase in GC
Physikalisch adsorbiert auf poröse Kieselgur (diatomite) mit grossen Oberfläche
Chemikalische Modifizierung von OH-gruppen durch organische Seitengruppen
Si
CH3
CH3
O
n
Si
CH3
CH3
O
n
Si
Ph
Ph
O
m
Si
CH3
CH3
O
n
Si
Ph
O
m
CN
Si O
n O
O
COOH
OO
OOC
n
Polysiloxan
unpolar polar
mit Phenylgruppe mit Cyanogruppe
Ethyleneglycol Ethyleneglycol, Phenyl, und Ester-gruppen
Polare Flüssigkeitsfilm
HS 2008 Xiangyang Zhang 8
k N Säulenparameter
und Bedingung Kapazität Geschwindigkeit
R
! ! ! L ! ! "
!
" ! " ID ! ! "
"
! ! " df ! ! "
! "
" ! ! T ! ! !
" !
! ! opt u ! ! !
opt
Optimierung zur GC
Polarität und Flimdicke der SP, u der MP, T und Säulenparameter
HS 2008 Xiangyang Zhang 9
HPLC: Apparatur, Typen und MP
300 – 400 bar
LM 10 ml/min
He/Ar
LM Behälter
Detektor
Vorsäule
Pumpe
Injektorvalve
LM Aufteilungsvalve
Trennsäule
!! Adsorptions-Chromatographie
!! Verteilungs-Chromatographie
!! Umkehrphasen-Chromatographie
"! Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)
"! Ionenpaaren-Chromatographie
"! Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)
#! Affinitäts-Chromatographie
#! Komplexierungschromatographie
#! Chirale Chromatographie
Mobile Phase:
Reinheit, Siedepunkt, Preis, Inert,
Korrosions-beständigkeit,
Toxizität, UV–Durchlässigkeit,
Brechungsindex, Mischbarkeit,
Puffer, Haltbarkeit
"! Viskosität
"! Elutionsstärke
"! Selektivität
HS 2008 Xiangyang Zhang 10
Normalphase (NP) und Umkehrphase (RP)
Si
O
OH
O Si
Si
O
OH
O Si
O
OH
OH
SiSi O OO Si
OH
OH
OH
single silanol group
two silanol group
three silanol group
Si
OH
Si
R2
ClR
R1Modifikation:
Si
R1
R2
R
Si
O
NP: SiO2, Al2O3 und modifizierte
polare Gruppen
O Si
R1
R2
CNO Si
R1
R2
NH2
O Si
R1
R2
O OH
OH
RP: unpolare straight-chain hydrocarbons (C18, C12, C8, C6, C4, C3, C2, C1) und
cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl
O Si
R1
R2
R
R = C1 – C18 O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
O Si
R1
R2
HS 2008 Xiangyang Zhang 11
HPLC: Ionenchromatographie Ionenaustauschchromatographie: um ionische Verbindunen zu trennen
•! SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14
•! COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14
•! NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10
•! NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei niedrigem, pH 0 – 6.
Ionenpaar: um die organische
grösse Ionen zu trennen
ein Ionenpaarbildner (sogenanntes
Gegenion) als Hilfskomponente wird der
mobilen Phase zugesetzt, um neutral
Ionenpaar zu bilden, dann kann man die
Umkehrphasen-Säule benutzen.
$! das Anion der Heptansulfonsäure für
kationische Proben
$! das Tetrabutylammoniumion
(Phosphat) für anionische Proben
HS 2008 Xiangyang Zhang 12
HPLC: Größenausschlusschromatographie
!
tR"
1
log10 MW
CH3(CH2)nCOOH
SP: 5 nm – 0.1 mm Ausschluss-/Eindringen-grenze, Kein Wechselwirkung Geeignet für 10% Unterschied in MW; Biopolymer, Polymer, Organische Moleküle
Mechanismus: Grösse / Mol Radius
Ausschluss Eindringen
HS 2008 Xiangyang Zhang 13
Dünnschichtchromatographie (HP–TLC)
Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates
C18-50 (50% silanization) and C18-100 (100%
silanization) with fluorescent indicator
!
Rf =Sx
S f
Selektivität und Trennleistung
Wahl des Laufmittels (Rein oder Gemisch)
für HPLC und Reaktionsablauf
HS 2008 Xiangyang Zhang 14
Elektrophorese (EP): Apparatur
•! L: 10-100 cm
•! ID 10-100 !m
Probenaufgabe (1-10 nl) durch •! Hydrostatische Injektion (Siphoneffekt)
•! Druck/Vakuum Injektion (Druckdifferenz)
•! Elektrokinetische Injektion (!EOF, !EP)
•! UV – 10–6 mol/L
•! Fluoreszenz – Attomol
•! Kopplung an MS
On-column (durchsichtlich)
Fused silica mit
Polyimidbeschichtung
bis 30 kV
HS 2008 Xiangyang Zhang 15
Grundlage zur Elektrophorese
!
!
N =µ "V
2 "D
!
µ = µEP
± µEOF
!
µEO
=" # $
4% #&
!
µEP =vi
E=
zi " e06# "$ " r
=q
6# "$ " r
Elektrophoretische Mobilität
Elektroosmotische Mobilität
+ – N
Kapillare
Kathode
–
Stempelförmig
elektrochemische
Doppelschicht
Totalmobilität:
HS 2008 Xiangyang Zhang 16
Elektrophoretische Trennverfahren
"! keine oder geringe Bandenverbreiterung (flaches EOF Strömungsprofil)
"! keine feste stationäre Phase, extrem wenig Lösungsmittelverbrauch
"! nur kleine Probenmengen nötig schnelles Verfahren (10 - 20 Minuten)
"! hohe Trennleistung
HS 2008 Xiangyang Zhang 17
Zusammenfassung
Zusammenfassung
HS 2008 Xiangyang Zhang 18
GC LC EP
MP He, H2, N2 LM (elutionsmittel) Pufferlösung
SP Film-df/Polarität NP, RP, IC, SEC, … –––––(Mizelle/RP)
Säule (Kapillar) ID, L, Kapizität ID, L, df (kompakt) ID, L
Parameters Flussrate (u), T Flussrate (u) pH, Spannung (V)
Gradient- T- Elutions-, (T-) pH-, V-
Prinzip G/L Verteilung L/L Verteilung EP und EOF
Detektor FID (ECD) / MS UV, RI, ELSD / MS UV, Fl / MS
Anwendungen Klein, neutral, thermostabil, nicht-zu-polare
Alle (auch polare bei RP, Polymere bei SEC)
Ionische (auch Neutrale bei MEKC)
HS 2008 Xiangyang Zhang 19
Aufgabe der Analytischen Chemie
Die Art (qualitativ) und Anzahl (quantitativ) der Atome allein
(Elementanalytik) oder zusammen mit ihrer Anordnung oder
Verbindung untereinander als Molekül (Molekülanalytik) im 3-
dimensionalen Raum (Strukturanalytik), die alle die Eigenschaften
eines Stoffes bestimmen"
Was liegt vor?"
Wieviel davon liegt vor?"
Welche Anordnung oder Form liegt vor?"
Wo befindet sich der Analyt?" Verteilungs- oder "
Oberflächenanalyse"
Qualitative Analyse!
Quantitative Analyse!
Strukturanalyse"
HS 2008 Xiangyang Zhang 20
Trennstrategie
Qualitativ Quantitativ
Strukturaufklärung Identifizierung mit
Bekanntem Stoff
Kalibrieren Kopplung mit IR,
UV/Vis, NMR, MS
Peakzuordnung
Fragmentierung
Spektrendatenbank
Retentionszeiten
Retentionsindizes
Selektiv Detektor
mit externem Standard
mit internem Standard
Standardaddition
Mengenbestimmung
Analysenzweck
Frage-
stellung
Probe-
nahme
Probe-
Vorbe-
reitung
Aus-
wertung Statistik Report Messung
HS 2008 Xiangyang Zhang 21
Probenaufbereitung
Feststoff
Aerosol
Emulsion
Suspension
Flüssigkeitstropfen
feste Teilchen
Gas
Flüssigkeit
(unlöslich Feststoff)
Homo- und Heterogenes Stoffgemisch
(2 unmischbar Flüssigkeiten)
LLE, SPE,
SPM, SPME
Extraktion
Batch-E
Soxhlet-E Soxtec-E
Ultraschall-E MAE, ASE
SPE, SWE
Adsorption
Filtration GC
HPLC EP
mit
MS NMR
IR UV
Löslich oder unlöslich
Aufkonzentrierung
Aufreinigung Vortrennung und Anreicherung Probenarten
Messung
HS 2008 Xiangyang Zhang 22
Analytmoleküle
!! Analysenzweck: Qualitativ / Quantitativ
!! Kleine, neutral, und thermostabil => GC
!! Kleine, ionische => IC und EP
!! GC nicht-geeignet => HPLC
!! Thermoempfindlich
!! zu polar und zu hohe Siedpunkt (wenig flüchtig)
"! derivatisieren
!! Grosse Biopolymere: HPLC, EP und IC
!! Polymere: SEC
HS 2008 Xiangyang Zhang 23
Auswahl einer Flüssig-chromatographie
$! Polarität
$! Löslichkeit
$! Ionenisch
$! Molekulare Masse
NP RP
Ausschluss
•! Geeignet für Sehr polare und
thermisch labile Substanzen
•! Geeignet für Ionische
Verbindungen, Biopolymere
und Polymere
•! Analytische, Präparative und
Produktive
•! Grosse Auswahl und Hohe
Trennleistung Selektivität
HS 2008 Xiangyang Zhang 24
Optimierungsfaktoren
•! System – Säule (stationäre Phase) und mobile Phase (Polarität)
•! Analyteneigenschaften •! Operationsbedingungen (Fliessrate, Temperatur und LM-Gradientenelution)
!
" =K
B
KA
!
k = KVs
VM !
N =L
H
!
H = A +B
u+ C " uSP und Analyten
Ideal: k = 5 - 10
Analyten
SP und MP
Temperatur
Säulenlänge
Bodenhöhe
stark beinflusst
durch u, D, df
und dp
!
R =" #1
"
$
% &
'
( ) *
k2
1+ k2
*N
4
!
tR
=16R
S
2H
u"
#
# $1
%
& '
(
) * "1+ k
2( )3
k2
2
Kurze Retentionszeit tR’ genuge Auflösung R
idealer Peakform (schmal wb und symmetrisch)
HS 2008 Xiangyang Zhang 25
Derivatisierung
$! Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker für selektive und empfindliche Detektion )
$! Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer
$! Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP
-NH2 (Amine, Aminosäuren) ! "5-(N,N-Dimethylamino)- "
! ! ! ! naphthalin-1-sulphonylchlorid "
! ! ! ! 2,4-dinitrofluorbenzol "
-OH (Alkohole) ! ! !3,5-Dinitrobenzochlorid "
! ! ! ! Silylierungsreagenzien "
-CHO (Aldehyde) ! ! !2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) "
-C(O)R (Ketone) ! ! !4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan "
-COOH (Säuren) ! ! !4-Brommethyl-7-methoxycoumarin "
-SH (Thiole) ! ! !Dansylaziridin !