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Aus dem Forschungsinstitut für die Biologie landwirtschaftlicher Nutztiere Dummerstorf
und dem Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zum Einfluss von Calcium Ionophor A23187 während der In-vitro-Fertilisation boviner Eizellen auf die präimplantative
Embryonalentwicklung
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Adriane Haenisch Woehl
aus Guarapuava (Paraná, Brasilien)
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: VR PD Dr. habil. W. Kanitz
Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. B. Meinecke 2. Gutachter: Prof. Dr. H. Niemann Tag der mündlichen Prüfung: 03.06.2003
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...........................................................................................................7
2 Literatur ..............................................................................................................8
2.1 Oozytenreifung............................................................................................8
2.1.1 Oozytenreifung in vivo..........................................................................8
2.1.2 Oozytenreifung in vitro .......................................................................13
2.2 Fertilisation................................................................................................24
2.2.1 Fertilisation in vivo .............................................................................24
2.2.2 Fertilisation in vitro .............................................................................29
2.3 In-vitro-Kultur der Embryonen ...................................................................38
2.4 Eizellaktivierung ........................................................................................42
2.4.1 Spontane Aktivierung in vitro .............................................................42
2.4.2 Künstliche Aktivierung........................................................................44
2.5 Bedeutung von Calcium für den Zellstoffwechsel .....................................56
2.5.1 Ca2+-Ionen und Signalübertragung in Zellen......................................57
2.5.2 Ca2+-Ionen im Rahmen der Befruchtung und Aktivierung in Eizellen.63
2.5.3 Ca-Ionophor A23187..........................................................................69
3 Material und Methoden ....................................................................................72
3.1 Untersuchungsmaterial .............................................................................72
3.1.1 Gewinnung der Ovarien .....................................................................72
3.1.2 Gewinnung der Cumulus-Oozyten-Komplexe....................................72
3.1.3 Klassifizierung der Oozyten/COK.......................................................73
3.2 In-vitro-Maturation .....................................................................................74
3.3 In-vitro-Fertilisation....................................................................................74
3.3.1 Aufbereitung der Spermien ................................................................74
3.3.2 Befruchtung .......................................................................................75
3.3.3 Entfernung des Cumulus oophorus vor der IVF.................................76
3.4 Behandlung der Oozyten/COK mit Ca-Ionophor A23187..........................76
3.5 In-vitro-Kultivierung ...................................................................................77
3.6 Beurteilung der Teilungs- und Entwicklungsstadien..................................77
3.7 Übersicht über den Versuchsaufbau.........................................................78
3.8 Fixation .....................................................................................................81
3.9 Färbung und zytologische Untersuchung..................................................83
3.10 Statistische Auswertung............................................................................84
4 Ergebnisse .......................................................................................................85
4.1 Experiment l.: Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf von
Spermienpenetration und Vorkernbildung in in vitro gereiften Rinderoozyten .....85
4.1.1 Bestimmung der Befruchtung von Rinderoozyten zu verschiedenen
Zeitpunkten nach IVF .......................................................................................85
4.1.2 Vorkernbildung...................................................................................89
4.1.3 Bestimmung der Zellkernstadien .......................................................98
4.2 Experiment II.: Teilungs- und Entwicklungsraten von Oozyten bzw. COK
nach IVF in Abhängigkeit von einer Behandlung mit Ca-Ionophor A23187.......107
4.2.1 Teilungsrate .....................................................................................107
4.2.2 Blastozystenrate ..............................................................................111
4.3 Experiment III: Bestimmung der parthenogenetischen Entwicklung nach
Aktivierung von Oozyten bzw. COK mit Ca-Ionophor ........................................114
5 Diskussion......................................................................................................117
6 Zusammenfassung.........................................................................................127
7 Summary........................................................................................................129
8 Anhang...........................................................................................................131
8.1 Verwendete Medien ................................................................................131
8.2 Medienzusätze ........................................................................................133
8.3 Verwendete Medien zur Aktivierung........................................................136
8.4 Farbstofflösung .......................................................................................137
8.5 Ergebnistabellen .....................................................................................138
9. Literaturverzeichnis ........................................................................................142
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ..........................................................169
Danksagung ..........................................................................................................171
Einleitung
7
1 Einleitung
In den zurückliegenden Jahren hat eine neue Reproduktionstechnik, die In-vitro-
Erzeugung von Embryonen, Eingang in die praktische Rinderzucht gewonnen. Seit
den ersten Geburten lebender Kälber nach Transfer von in vitro erzeugten
Embryonen besteht ein großes wissenschaftliches Interesse an der
Weiterentwicklung der Technologie und an einem vertieften Verständnis der
biologischen Prozesse, welche der Technologie zu Grunde liegen. Obwohl in vitro
ein hoher Anteil Oozyten reift und befruchtet werden kann, erreicht nur ein relativ
kleiner Prozentsatz davon das Entwicklungsstadium der Blastozyste (LEIBFRIED-
RUTLEDGE, 1999). Dieses Phänomen gibt Anlass zu zahlreichen Untersuchungen,
die das Ziel verfolgen, die Ursachen dafür aufzuklären und/oder die Effizienz des
Verfahrens durch Modifizierung der Verfahrensschritte zu verbessern.
Im Rahmen der In-vitro-Embryonenerzeugung kommt es mit der erfolgreichen
Befruchtung von Oozyten zur Entwicklung von Zygoten. Diese Entwicklung erfordert
die Initialisierung mehrerer Prozesse. Bioaktive Elemente innerhalb der Oozyte und
des Spermiums dienen dazu, Komponenten dieser Initialisierungsprozesse, welche
auch als Aktivierung bezeichnet werden, zu stimulieren (TANG et al., 2000;
PERRINGTON, 2001). Im Zusammenhang damit ist bekannt, dass Calcium
zahlreiche Zellsignale aktiviert (MISSIAEN et al., 2000) und physiologische
Ereignisse der Befruchtung und frühen Embryonalentwicklung vermittelt (HOMA,
1995; ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001).
In vorangegangenen Experimenten wurden Oozyten nach ihrer Reifung in vitro Ca-
Ionophor ausgesetzt (STEINHARDT et al., 1974; AOYAGI et al., 1992; HOSHI et al.,
1992), um den Einfluss der Behandlung auf die frühe Embryonalentwicklung zu
untersuchen. Mit der vorliegenden Arbeit sollte der Effekt einer Erhöhung des
intrazellulären Calciumgehaltes durch Behandlung mit Ca-Ionophor A23187 während
der In-vitro-Fertilisation untersucht werden. Dabei wurde zunächst der zeitliche
Ablauf von Penetration und Vorkernbildung bei der In-vitro-Fertilisation in vitro
maturierter Rinderoozyten ohne zusätzliche Beeinflussung bestimmt, um dann, von
diesen Erkenntnissen ausgehend, im zweiten Teil der Arbeit zu versuchen, durch
eine Behandlung von Oozyten und Spermien mit Ca-Ionophor während der
gemeinsamen Inkubation zur Befruchtung die präimplantative Embryonalentwicklung
Literatur
8
beim Rind zu verbessern und den Anteil transfertauglicher, in vitro produzierter
Embryonen zu erhöhen.
Das Spektrum der dafür notwendigen experimentellen Techniken umfasste die In-
vitro-Maturation und –Fertilisation boviner Oozyten, die In-vitro-Kultur der erzeugten
Embryonen, die Behandlung von Oozyten mit Ca-Ionophor, Methoden zur Fixation
und Färbung von Zellen sowie mikroskopische Techniken für die morphologische
und zytologische Beurteilung von Eizellen und Embryonen.
2 Literatur
Die In-vitro-Produktion von Rinderembryonen besteht im wesentlichen aus drei
Schritten: der In-vitro-Maturation (IVM) der Cumulus-Oozyten-Komplexe (COK), der
In-vitro-Fertilisation (IVF) und schließlich der In-vitro-Kultivierung der Embryonen
(IVK). Durch das bessere Verständnis der biologischen Prozesse bei der IVM
konnten die Ergebnisse der IVF und IVK verbessert werden. Im Folgenden soll ein
Überblick über die bisherigen Erkenntnisse auf diesem Gebiet gegeben werden.
2.1 Oozytenreifung
2.1.1 Oozytenreifung in vivo
Es ist bekannt, dass für die Oozytenreifung nicht nur ihre einfache Aktivierung nötig
ist, sondern eine lange Serie vorbereitender Prozesse (HYTTEL et al., 1997). Die
Reifungsphase der Oozyten entspricht nur einem kurzen Teil ihrer Lebenszeit, in der
sie eine Serie komplexer intra- und extragonadaler Differenzierungsprozesse
durchlaufen. Das Ziel der Oozytenreifung ist die Bildung einer haploiden
Sekundäroozyte, die mit allem ausgerüstet ist, was für ihre folgende Fertilisation und
weitere Embryonalentwicklung benötigt wird (HYTTEL et al., 1997). Follikuläre
Oozyten sind in der Prophase der ersten meiotischen Teilung arretiert (SIRARD et
al., 1989; FAIR et al., 1995; EPPIG et al., 1996), spezifisch in der G2-Phase des
Zellzyklus, nachdem sie während der Fetalentwicklung die G1- und S-Phase passiert
haben. In der S-Phase wird die DNA verdoppelt. Gleichzeitig werden Proteine
erzeugt, die für die Aktivierung des maturation promoting factor (MPF) verantwortlich
sind (NIEMANN u. MEINECKE, 1993). Die Endreifung der Oozyten erfolgt im
Anschluss an die präovulatorische, hypophysäre Freisetzung des luteinisierenden
Literatur
9
Hormons (LH), parallel zur Reifung des präovulatorischen Follikels (TSAFRIRI et al.,
1982; SIRARD et al., 1992; HYTTEL et al., 1997; BEVERS et al., 1997). Während
dieser Endreifung werden zwei zelluläre Programme vollendet: a) die Kernreifung,
d.h. die Fortsetzung der Meiose vom Keimbläschenstadium (germinal vesicle, GV)
zum Stadium der Bildung der zweiten Metaphaseplatte (M-II), und b) die
zytoplasmatische Reifung, in deren Verlauf die Oozyten durch molekulare und
strukturelle Veränderungen ihre vollständige Befruchtungs- und
Embryonalentwicklungsfähigkeit erhalten (HYTTEL et al., 1997; BEVERS et al.,
1997; HEGELE-HARTUNG et al., 1999).
Kernreifung
Die erste Arretierung der meiotischen Teilung ereignet sich nach der verlängerten
Prophase der ersten Reifeteilung bis zum späteren Diplotän und der Diakinese
(TSAFRIRI et al., 1982; SIRARD et al., 1989; KASTROP et al., 1991). Unter dem
Einfluss von follikelstimulierendem Hormon (FSH) und LH wird die meiotische
Teilung fortgesetzt. Die Ausbildung der meiotischen Kompetenz erfolgt stufenweise.
Zunächst erlangt die Oozyte die Fähigkeit, die Prophase abzuschließen und die
Kernmembran aufzulösen. Dieser Vorgang wird als germinal vesicle breakdown
(GVBD) bezeichnet (KRUIP et al., 1983; HYTTEL et al., 1997). Die Chromosomen
werden in der Metaphase der ersten Reifeteilung in der Äquatorialplatte angeordnet
und durchlaufen schließlich die Ana- und Telophase I, an deren Ende dann, im
Gegensatz zur mitotischen Teilung, zwei Zellen mit einem haploiden
Chromosomensatz entstehen (SIRARD et al., 1989; HYTTEL et al., 1997).
Nach kurzer Interkinese, während der keine identische Reproduktion der
Chromosomen wie in der Interphase der Mitose erfolgt, wird der Zellzyklus mit dem
Erreichen des Metaphasenstadiums der zweiten Reifeteilung erneut arretiert. Ana-
und Telophase-II laufen erst im Anschluss an die Penetration durch das Spermium
ab (DOMINKO u. FIRST, 1997; NEBREDA u. FERBY, 2000).
Granulosa- und Cumuluszellen
Das Oozytenwachstum hat die unmittelbare Verbindung zwischen Oozyte und
Follikelzellen als Voraussetzung (BUCCIONE et al., 1990). Hochspezialisierte
Membranverbindungen, sogenannte gap junctions, erlauben den Transport von
Stoffen und regulatorischen Substanzen zwischen den Zellen (BROWER u.
SCHULTZ, 1982; COLONNA u. MANGIA, 1983; HAGHIGHAT u. VAN WINKLE,
Literatur
10
1990). Über diesen Weg gelangen energiereiche Substrate, Nukleotide und
Aminosäuren in die Oozyte (MOOR et al., 1980; COLONNA et al., 1983).
Für die Arretierung der Meiose im Diplotänstadium sind ebenfalls Granulosa- und
Cumuluszellen (CZ) verantwortlich. Als intrazelluläre Inhibitoren der Meiose werden
bei verschiedenen Spezies zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), zyklisches
Guanosinmonophosphat, Purine, oocyte maturation inhibitor (OMI), �-Endorphin und
Mullerian inhibiting substance diskutiert (DOWNS u. EPPIG, 1986; DOWNS et al.,
1986; SIRARD u. BILODEAU, 1990a; FULKA et al., 1991; EPPIG, 1991; DOWNS,
1993). Von besonderem Interesse ist der Umstand, dass das progressive
Follikelwachstum bis zum präovulatorischen Stadium durch eine intensive mitotische
Aktivität von Granulosazellen gekennzeichnet ist, wohingegen die gleichen, mitotisch
aktiven Zellen die Meiose der Oozyte arretieren.
cAMP
Wichtigster Inhibitor der Meiose scheint cAMP zu sein, welches seine Wirkung über
Proteinkinasen entfaltet (AKTAS et al., 1995). Das cAMP kann in der Oozyte gebildet
werden. Aufgrund hoher Phosphodiesteraseaktivität in der Oozyte, verbunden mit
der Degradierung von cAMP, muss es jedoch zusätzlich aus Granulosa- und
Cumuluszellen in die Oozyte transportiert werden. Auch dafür werden die gap
junctions genutzt. Unterstützt wird die Meiosearretierung durch Hypoxanthin, welches
die Phosphodiesterase hemmt, und durch Adenosin, welches die cAMP-Bildung
anregt.
Für die Induktion der Meiose ist der präovulatorische LH-Gipfel das entscheidende
Signal. Da auf der Oozyte keine LH-Rezeptoren vorhanden sind, ist auch die
Meioseinduktion an die Informationsübertragung von somatischen in germinative
Zellen gekoppelt. Voraussetzung für die Wirksamkeit des LH ist das Vorhandensein
von entsprechenden Rezeptorquantitäten und -qualitäten auf den Granulosa- und
Cumuluszellen. Funktionell bewirkt der LH-Gipfel einen drastischen Anstieg von
cAMP in den somatischen Zellen. Das cAMP wird in die Oozyte transportiert, so dass
die Konzentration der Verbindung in der Oozyte deutlich ansteigt. Dem cAMP-
Anstieg folgt ein verstärkter cAMP-Abbau, der durch den ebenfalls LH-bedingten
Einstrom von Ca2+-Ionen und der damit verbundenen Aktivierung der
Phosphodiesterase bewirkt wird. Der cAMP-Anstieg in der Oozyte und sein
Literatur
11
nachfolgender Abfall scheinen wichtige Prozesse für den Übergang vom GV- zum
GVBD-Stadium der Meiose zu sein (BILODEAU et al., 1993).
Maturation Promoting Factor (MPF)
Die Prozesse der präovulatorischen Oozytenreifung sind aber nicht nur Ausdruck
des Verschwindens von meioseinhibierenden Substanzen. Vielmehr ist die Induktion
der Reifung ein aktiver Prozess, in dem der MPF eine Schlüsselfunktion einnimmt
(MASUI u. MARKERT, 1971; FULKA, JR. et al., 1986; MOTLIK u. KUBELKA, 1990).
Der MPF stellt eine als p34cdc2 bezeichnete Proteinkinase dar (NURSE, 1990).
Der Grad der Phosphorylierung dieser Kinase ist vom Zellzyklusstadium abhängig. In
der G2-Phase des Zellzyklus sind Threonin und Tyrosin an den Positionen 14’ und
15’ des Moleküls phosphoryliert. Die Phosphorylierung erfolgt in der Adenosin 5’-
triphosphat (ATP)-bindenden Domäne des Moleküls und unterdrückt die
Kinaseaktivität durch eine Blockierung der ATP-Bindung. Bei allen Spezies, die
untersucht wurden, findet unmittelbar vor dem Übergang von der G2- zur Metaphase
eine Dephosphorylierung des p34cdc2-Moleküls statt. Für die Dephosphorylierung ist
das Enzym Protein-Tyrosin-Phosphatase (GOREN u. DEKEL, 1994) bedeutsam.
Nach der M-I-Phase sinkt die Aktivität der Proteinkinase p34cdc2 ab. Ein zweiter
Aktivitätsanstieg des Enzyms findet beim Übergang von der Telophase zur M-II statt
(DEKEL, 1996).
Die Aktivierung der Proteinkinase p34cdc2 setzt ihre Verbindung mit Molekülen einer
weiteren Proteinfamilie, den Cyclinen, voraus (LEVESQUE u. SIRARD, 1996).
Cycline bewirken, in das Zytoplasma von Oozyten injiziert, den Übergang von der
G2- in die Metaphase der Meiose. Aktiver MPF ist ein Proteinkinase-Cyclin-Komplex,
dessen Aktivität über Phosphorylierungen modifiziert wird und der seine Wirkung
ebenfalls über Phosphorylierungen von Targetmolekülen entfaltet (HUNT, 1989). Als
ein solches Targetmolekül kann die Histon-1-Kinase angesehen werden. In
Übereinstimmung mit den MPF-Aktivitätsveränderungen finden Histon-1-Kinase-
Aktivitätsveränderungen statt, die durch Phosphorylierungen des Enzyms
hervorgerufen werden (COLLAS et al., 1993b).
Zytoplasmatische Reifung
Die Prozesse der Kernreifung sind eng gekoppelt mit Prozessen der
zytoplasmatischen Reifung. Auch diese wird wiederum durch die Interaktion von
Oozyte und somatischen Zellen beeinflusst. So verhindert die Entfernung
Literatur
12
somatischer Zellen von der Oozyte das zeitgerechte Auftreten des aktiven MPF
(MATTIOLI et al., 1991). Zytoplasmatische Zellorganellen der Oozyte realisieren vor
dem Auftreten des aktiven MPF eine intensive Proteinbiosynthese.
Proteinsyntheseinhibitoren sind in der Lage, die MPF-Aktivierung zu verhindern
(MOOR u. CROSBY, 1986; HUNTER u. MOOR, 1987; KUBELKA et al., 1988). Nach
dem GVBD findet eine Vermischung von Zyto- und Karyoplasma statt, dessen
Bedeutung noch nicht ausreichend bekannt ist. Die sich anschließende
Redistribution der Zellorganellen hat zur Folge, dass sich die Mitochondrien
perinuklear anordnen, die kortikale Granula sich hingegen nur wenige Nanometer
von der Zytoplasmamembran entfernt konzentriert. Die kortikale Anordnung ist
funktionell für die Verhinderung der Polyspermie verantwortlich (YANAGIMACHI,
1994).
In-vivo-Reifung versus In-vitro-Reifung
Vergleiche zwischen in vivo und in vitro gereiften Rinderoozyten zeigten in mehreren
Untersuchungen, dass die Entwicklungsfähigkeit der in vivo gereiften Eizellen besser
war, als die der in vitro maturierten (SIRARD u. BLONDIN, 1996; VAN DE LEEMPUT
et al., 1999). Dieser Unterschied kann durch den bei der IVM fehlenden Einfluss des
dominanten Follikels bedingt sein. Er fördert physiologischerweise die
Entwicklungskompetenz der in ihm enthaltenen Oozyte, unterdrückt diese jedoch
gleichzeitig bei den Oozyten in ihm untergeordneten Follikeln. Damit begrenzt er in
vivo die Anzahl befruchtungsfähiger Eizellen bzw. die Zahl auszutragender Feten
(BRACKETT et al., 1982; SIRARD u. LAMBERT, 1986). Der Prozess der
Kernreifung (KING et al., 1986) und Blastozystenbildung (VAN DE LEEMPUT et al.,
1999) läuft bei in vivo gereiften Oozyten langsamer ab als bei in vitro gereiften
(Tabelle 2.1). Oozyten aus IVM zeigten in den Versuchen von GREVE et al. (1987)
eine höhere Penetrations- und Teilungsrate, aber nach der Übertragung dieser
Embryonen war die Trächtigkeitsrate vermindert.
Die Kernreifung sowie die strukturellen Reifungsvorgänge des Ooplasmas verlaufen
in vivo und in vitro ähnlich (HYTTEL et al., 1986b; GREVE et al., 1989; KASTROP et
al., 1991). Dennoch sind morphologische Abweichungen zwischen in vivo und in vitro
maturierten Oozyten feststellbar (DE LOOS et al., 1992). Diese zeigen sich
insbesondere bei Oozyten der Qualitätsklasse IV (voll expandierter Cumulus
oophorus, CZ verstreut in dunklen Klumpen in der Matrix, Ooplasma irregulär mit
Literatur
13
dunklen Einschlüssen, COC insgesamt dunkel und ungleichmäßig) in Form von
Vakuolen, einer Abflachung der CZ und der Abwesenheit der kortikalen Granula. In
einer Studie mit in vivo maturierten Oozyten fanden KASTROP et al. (1991), dass
Änderungen bei der Proteinsynthese und Phosphorylierung hauptsächlich den
Zeitpunkt des GVBD, aber auch die Entwicklung danach betreffen. Diese
Unterschiede bezüglich der Proteinsynthese wurden am Ende der Reifungszeit
offensichtlich. Unterschiede wurden auch bei der Verteilung der kortikalen Granula
längs des Oolemms gefunden (HYTTEL et al., 1986b).
2.1.2 Oozytenreifung in vitro
Die bisherigen Erkenntnisse über die IVM machen deutlich, dass die Oozytenreifung
wesentlich mehr umfasst als die Fortsetzung der Meiose (SIRARD et al., 1992;
HYTTEL et al., 1997) und für eine erfolgreiche IVF nicht nur die Kernreifung,
sondern auch die zytoplasmatische Reifung erforderlich sind (SÜSS et al., 1988; DE
LOOS et al., 1992; NIEMANN u. MEINECKE, 1993; FAIR et al., 1995; SOSNOWSKI
J. et al., 1995; HEGELE-HARTUNG et al., 1999; MERMILLOD et al., 1999; CETICA
et al., 1999a; CETICA et al., 1999b).
Wenn unreife Oozyten aus einem Follikel isoliert werden, erfolgt die Fortsetzung der
meiotischen Teilung von dem arretierten Diplotän spontan (PINCUS G. u.
ENZMANN, 1935; SÜSS et al., 1988; SIRARD et al., 1992; SOSNOWSKI J. et al.,
1995; SIRARD et al., 1998). Dieses Phänomen hat die Verwendung in vitro gereifter
Oozyten für die In-vitro-Produktion von Embryonen beim Säugetier sehr erleichtert.
Die IVM unterscheidet sich in zwei wichtigen Punkten von der In-vivo-Reifung.
Erstens werden die COK nicht mehr durch das follikuläre Mikromilieu, insbesondere
die Follikelflüssigkeit, beeinflusst, und zweitens ist der Zellkontakt zu den
Granulosazellen der Follikelwand unterbrochen. Die interzellulären Verbindungen
(gap junctions) werden im Verlauf der Reifung zurückgebildet. Biochemische und
biophysikalische Stimulationen der Oozyten führen zur Kondensation des
Chromatins (SÜSS et al., 1988; SIRARD et al., 1992). Der GVBD wird
abgeschlossen und der Zellzyklus in der M-II zum zweiten mal arretiert (EPPIG et al.,
1996). Mit diesen Änderungen wird die Synthese der Desoxy- und Ribonukleinsäure
eingestellt (SIRARD et al., 1992).
Tabelle 2.1: Kriterien der zytoplasmatischen Reifung boviner Oozyten in vivo und in vitro in Abhängigkeit von der Reifungszeit
In vivo
(Zeit nach den LH-Peak)
In vitro
(Kulturzeit)
Autoren
Stimulierte Färsen nicht stimulierte Färsen
Vergrößerung des perivitellinen Spaltraumes abwesend oder schmal (b)
½ - 5 ½ h (c)
0 - 12 h (c)
0 - 3 h(b)
0 - 30 h(e)
GVBD 6 - 14 h (g) (c) 4 - 8 h (a); 12 h (f) 3 - 12 h(b); 6 - 12 h(d) (e)
Unterbrechung der gap junctions zwischen CZ und
Oozyten-Oolem
9 -12 h (b)
3 - 12 h(b)
Expansion der CZ - - 12 - 18 h(b)
Metaphase I 15 h (g) 15 h (f) -
Wanderung der Mitochondrien von einer peripheren zu
einer "spatialen" Stellung
15 h (f) (c) 19 h (f) 12 - 18 h(b)
Verminderung des Golgikomplexes 21 - 22 h (f) 8 - 19 h (a); 19 h (f) 12 - 18 h(b)
Vesikel in zentraler Position - 19 -25 h (a) 18 h(b)
Zusammenballungen des endoplasmatischen
Retikulums in der Nähe der Mitochondrien
21 - 22 h (f) 8 - 19 h (a)
19 h (f)
18 h(b)
Erster Polkörper 20 h (f); 19 h(c) 19 h (f) 18-21 h(b); 15-24 h(e) (h)
Metaphase II 24 h (g) 19 h (f) 18-24 h(d)
Verteilung der kortikalen Granula längs des Oolemms 21 -22 h (f) (c) 19 -25 h (a); 19 h (f) 24 - 40 h(b)
Vermindung des perivitellinen Spaltraumes, Entartung
des Polkörpers u. Zerstreuung der kortikale Granula
21 - 22 h (c) - 40 - 48 h(b)
30 - 48 h(e)
Fragmentierung - - 48 h(b)
(a) KRUIP et al. (1983)
(b) HYTTEL et al.
(1986b)
(c) HYTTEL et al.
(1986a)
(d) KING et al. (1986)
(e) XU et al. (1986)
(f) HYTTEL et al. (1989)
(g) HYTTEL et al. (1997)
(h) DOMINKO und FIRST
(1997)
Literatur
15
Oozytenqualität
Einige Autoren vermuten, dass die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten in vitro vom
Stadium des Brunstzyklus und der Anwesenheit eines dominanten Follikels bzw.
seiner Flüssigkeit abhängig ist. Dabei werden sowohl positive (SIRARD u. BLONDIN,
1996; SALAMONE et al., 1999) als auch negative Effekte (VARISANGA et al., 1998;
HAGEMANN, 1999) eines dominanten Follikels auf die Entwicklungskompetenz von
COK beschrieben. Im Gegensatz dazu schlussfolgern SMITH et al. (1996) aus ihren
Untersuchungen, dass die Anwesenheit eines dominanten Follikels die
Oozytenqualität der ihm untergeordneten Follikel nicht beeinflussen kann. Die
Fähigkeit der Oozyten, in vitro zu maturieren, ist auch von ihrer Größe abhängig. Erst
�������������� ������������� ���� ����ähig, die M-II zu erreichen (FAIR et al.,
1995; HYTTEL et al., 1997).
Die Daten von MERMILLOD et al. (1999), SALAMONE et al. (1999) und DE WIT et
al. (2000) stützen die Hypothese, dass untergeordnete Follikel späterer
Entwicklungsstadien (Atresie oder Regressionsphase) Oozyten mit höherer
Entwicklungskompetenz enthalten, als Follikel in der Wachstumsphase. Oozyten, die
aus apoptotischen Follikeln isoliert werden, verlieren die Fähigkeit sich weiter zu
entwickeln (JEWGENOW et al., 1999). Die letztgenannten Autoren haben die
Hypothese aufgestellt, dass die reduzierte Entwicklungskompetenz der Oozyten eng
mit der Apoptose der Follikelzellen korreliert.
Während einige Autoren keine signifikante Abhängigkeit der Oozytenqualität und
-anzahl vom Brunstzyklus und der Follikelgröße feststellen konnten (LEIBFRIED u.
FIRST, 1979a; DE WIT et al., 2000), fanden andere eine diesbezügliche
Beeinflussung durch den Brunstzyklus des Spendertieres (GANDOLFI, 1997;
VARISANGA et al., 1998). Nach LEIBFRIED und FIRST (1979a) sind der Zustand
des Cumuluszellverbandes und des Ooplasmas zuverlässige morphologische
Kriterien für die Entwicklungskompetenz der Oozyten.
Cumuluszellen und cAMP
Von in vitro gereiften Oozyten mit vollständigem Cumulus erreicht ein größerer
Prozentsatz die M-II (HYTTEL et al., 1989; CETICA et al., 1999a) als von solchen,
die partiell oder vollständig denudiert sind (SÜSS et al., 1988). Oozyten ohne CZ
zeigen Anzeichen von Degeneration sowie Abnormitäten nach der Befruchtung und
benötigen mehr Zeit für die Kernreifung (XU et al., 1986). SIRARD et al. (1992),
Literatur
16
BEVERS et al. (1997) und YAMAMOTO et al. (1999) stellten fest, dass die
Follikelflüssigkeit und die Verbindung der Eizelle mit den Granulosa- und
Cumuluszellen über gap junctions wesentlich für die Arretierung der Kernreifung ist.
Über die gap junctions zwischen den Granulosa- und Cumuluszellen wird cAMP vom
Follikularraum oder durch eine direkte Verlagerung aus den Cumuluszellvorräten zu
den COK transportiert (SÜSS et al., 1988; SIRARD et al., 1992). Ein stabiles cAMP-
Niveau in der Oozyte blockiert deren Reifung, aber eine plötzliche Veränderung des
Niveaus nach oben oder unten führt zur Fortsetzung der Meiose (SIRARD et al.,
1992). AKTAS et al. (1995) kommen zu ähnlichen Schlussfolgerungen. Die Dynamik
des cAMP-Effektes kann durch die Anwesenheit eines follikulären Kofaktors mit
kurzer Halbwertszeit oder eine Erhöhung der Phosphodiesterase im Kulturmedium
bedingt sein (SIRARD, 1990). Wenn die Phosphodiesteraseaktivität eine natürliche
Möglichkeit ist, um die Meiose zu kontrollieren, sollten Substanzen wie Hypoxanthin
(DOWNS et al., 1989; YAMAMOTO et al., 1999), cAMP-Analoga (DOWNS u.
HUNZICKER-DUNN, 1995), Isobutylmethylxanthin (IBMX) (EPPIG u. WARD-
BAILEY, 1982; BUCCIONE et al., 1990; SIRARD et al., 1992) und Adenosin
(DOWNS et al., 1989) durch einen bisher nicht erklärten Mechanismus, bei dem
aber vermutlich cAMP und cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) beteiligt sind
(DOWNS et al., 1989), in der Lage sein, das GV-Stadium effektiv zu arretieren
(SIRARD et al., 1989). Die genannten Substanzen bewirken in Abhängigkeit von der
verwendeten Substanz, dem Zeitpunkt ihres Zusatzes zu den kultivierten Oozyten,
deren Cumuluszellbesatz und den Kulturbedingungen (z.B. Anwesenheit von
Gonadotropinen) einen verzögerten GVBD mit normaler weiterer Reifung oder eine
Arretierung der Kernreifung in der ersten Metaphase (DOWNS et al., 1988; DOWNS
et al., 1989; SIRARD et al., 1992; DOWNS u. HUNZICKER-DUNN, 1995).
Zur Abnahme von cAMP kann es dann durch die Aktivierung der Phosphodiesterase
oder durch Rückbildung der gap junctions zwischen Granulosa- und Cumuluszellen
infolge der Expansion der CZ nach vorangegangener Erhöhung des cAMP kommen
(SIRARD et al., 1992).
Gleichzeitig mit der Oozytenreifung expandieren die CZ (HYTTEL et al., 1989;
SALUSTRI et al., 1989). Der Zeitpunkt dieses Ereignisses ist in der Tabelle 2.1
(S. 12) dargestellt. Die Aufgaben der CZ umfassen die Ernährung der Oozyten
während ihrer Wachstumsphase, die Beteiligung an der Bildung der Zona pellucida
Literatur
17
(ZP), die Synthese der Proteinmatrix und Hyaluronsäure, die Vermeidung der
Polyspermie, die Verbesserung der Befruchtungsfähigkeit der Spermien (BEDFORD
u. KIM, 1993) sowie die Teilnahme an glykolytischen Aktivitäten (ZUELKE u.
BRACKETT, 1992). Die deutliche höhere Aktivität der Lactatdehydrogenase in COK
im Vergleich zu denudierten Oozyten zeigt, dass in den CZ der größere Teil der
enzymatischen Aktivitäten stattfindet (CETICA et al., 1999b). Gonadotropine
stimulieren die CZ über cAMP die Hyaluronsäure zu produzieren und die Expansion
fortzusetzen (SALUSTRI et al., 1989; BUCCIONE et al., 1990; EPPIG et al., 1996;
PICTON et al., 1998). Bei der IVM ist die Expansion der CZ nicht für die normale
Kernreifung (SIRARD u. BILODEAU, 1990b; CETICA et al., 1999a) und für die
Unterbrechung der Verbindungen zwischen CZ und Oozyten nötig (EPPIG u. WARD-
BAILEY, 1982). Nach 24-stündiger IVM reichen die Mikrofortsätze der CZ noch bis in
den perivitellinen Spaltraum oder sind noch in Verbindung mit der Plasmamembran.
Sie sind also nicht, wie bei der In-vivo-Maturation, vollständig zurückgezogen (DE
LOOS et al., 1992). Die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten nach IVM ist aber vom
richtigen Ablauf der Unterbrechung der Kontakte zwischen CZ und Oozyten in der
Endreifung abhängig (MATTIOLI et al., 1988). Der direkte Kontakt zwischen CZ und
Oozyte ist für die Expansion der CZ und die metabolische Kopplung nicht nötig (DE
LOOS et al., 1991), hat aber eine große Bedeutung für die Entwicklungsfähigkeit der
Oozyten (HASHIMOTO et al., 1998). Die Anwesenheit von CZ im Kulturmedium ist
wesentlich für das Oozytenwachstum und die Kontrolle der meiotischen Reifung
(TSAFRIRI et al., 1982; ZHANG et al., 1995; EPPIG et al., 1996). Eine intakte
Corona radiata um die Oozyten unmittelbar vor oder nach der Befruchtung scheint
die Embryonalentwicklung positiv zu beeinflussen (BRACKETT et al., 1989), ist aber
ab 20 h nach der IVF nicht mehr essentiell (ZHANG et al., 1995).
EPPIG und WARD-BAILEY (1982) fanden, dass zwei Faktoren für die vollständige
Unterbrechung der Verbindungsstellen zwischen CZ und Oozyten verantwortlich
sind. Dabei ist ein Faktor abhängig von der Wirkung der Gonadotropine auf die
Funktion der CZ und der zweite Faktor scheint eine Funktion der Oozyten zu sein,
weil die vollständige Unterbrechung nur möglich ist, wenn das GVBD-Stadium
erreicht wurde (DE LOOS et al., 1991). Die Unterbrechung der Cumulus- und
Granulosazellverbindungen hat keine große Bedeutung für die Proteinsynthese der
Oozyten vor und unmittelbar nach dem GVBD (KASTROP et al., 1991).
Literatur
18
Eine spezifische Rolle der Oozyten bei der Regulation der Funktion der CZ in vitro
wurde von BUCCIONE et al. (1990) nachgewiesen. Die Expansion der CZ einiger
Spezies hängt von einem Faktor ab, der von den Oozyten produziert wird und die
Expansion als Reaktion auf verschiedene stimulierende Faktoren wie FSH
(BUCCIONE et al., 1990), Dibutyryl-cAMP oder EGF (VANDERHYDEN, 1993)
ermöglicht (SALUSTRI et al., 1989).
Granulosazellen
So wie CZ können auch Granulosazellen Faktoren produzieren, die die Meiose
arretieren (HASSAN-HAUSER et al., 1990). Eine Kokultivierung von Oozyten mit
präinkubierten Granulosazellen führt zu einer Verzögerung der Kernreifung (ALM et
al., 1990), verbessert jedoch die Entwicklungsfähigkeit der Embryonen bei der IVK
(FUKUI u. ONO, 1989; ALM et al., 1990). In einer Studie von DURNFORD et al.
(1994) waren Granulosazellen, wenn sie allein in dem Medium verwendet wurden,
nicht fähig den GVBD zu inhibieren, jedoch trat der GVBD im Vergleich zu den
Kontrollgruppen verzögert ein. Wurden Thecazellen dem Reifungsmedium
zugesetzt, wurde der GVBD vollständig inhibiert (KOTSUJI et al., 1994). Dieser
hemmende Effekt ist von der Menge der Granulosazellen im Reifungsmedium
abhängig. Er wird durch die Anwesenheit von Serum östrischer Kühe (estrous cow
serum, ECS) oder Gonadotropinen beeinflusst.
Seren
In vivo stellt das maternale Blut eine Quelle für die Synthese von vielen, für die
Oozytenentwicklung wichtigen, Molekülen dar. Zur Imitierung dieses Zustandes
werden bei der IVM oft Seren den Reifungsmedien zugesetzt (SANBUISSHO u.
THRELFALL, 1985). Werden COK in Abwesenheit von fetalem Kälberserum (fetal
calf serum, FCS) mit FSH stimuliert, ist die Hyaluronsäuresynthese gleich oder höher
als bei einer Stimulation in Anwesenheit von FCS. Die synthetisierte Hyaluronsäure
akkumuliert jedoch nicht in der COK-Matrix, sondern im Medium, so dass diese COK
keine Expansion zeigen. Um das zu vermeiden, ist ebenfalls ein Zusatz von Serum
nötig (SALUSTRI et al., 1989).
LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. (1989) beobachteten, dass der Effekt von FCS auf die
IVM von der Konzentration abhängig ist. Die Expansion der CZ wurde jedoch mit
allen verwendeten FCS-Konzentrationen erreicht. Der Effekt von bovinem Serum auf
die IVM hängt von der Phase des Brunstzyklus ab, in der das Serum gewonnen
Literatur
19
wurde. Die Befruchtungsraten sind höher, wenn die Oozyten mit Serum aus der
Östrus- und Proöstrusphase gereift werden. Die besseren Fertilisationsergebnisse
mit proöstrischem gegenüber östrischem Serum können durch höhere
Konzentrationen an LH und Prolaktin bedingt sein (YOUNIS et al., 1989). XU et al.
(1987) zeigten, dass ECS im Reifungsmedium die Expansion der CZ einschließlich
der Zellen der Corona radiata fördert. Wenn eine hohe ECS-Konzentration genutzt
wurde (CONLEY et al., 1994) war der Anteil Oozyten mit diploider M-II erhöht
(OCANA-QUERO et al., 1999). KUZMINA et al. (1999) beobachteten einen höheren
Anteil von Oozyten mit degenerierter Chromatinkonfiguration, wenn sie bei der IVM
das FCS durch BSA ersetzten. Die Seren können die Permeabilität der ZP
verändern, was zu unterschiedlichen IVF-Ergebnissen führt (YOUNIS et al., 1989).
Blastozysten aus COK, die mit ECS gereift wurden, hatten eine höhere Zellzahl als
die aus COK, welche ohne ECS gereift wurden (FUKUI u. ONO, 1989; DURNFORD
et al., 1994). In serumfreiem Reifungsmedium konnte eine normale Befruchtung und
Entwicklung bis zum Blastozystenstadium beobachtet werden, wenn Gonadotropine
und Estradiol zugesetzt waren (SAEKI et al., 1991). Die Autoren schlussfolgern
daraus, dass diese Hormone eine wichtige Rolle für die Kern- und zytoplasmatische
Reifung spielen. Die Effekte von verschiedenen Seren, die für die IVM verwendet
werden, sind in Tabelle 2.2 zusammengefasst.
Tabelle 2.2: Effekte verschiedener Seren bei der IVM
BSA FCS ECS Autoren
Reifungsrate - a) g) ++ a) c); + d) + c) b); ++ d)
Expansion der CZ - a) + a) d) ++ d)
Befruchtungsrate ++ c); + d)
- e) f)
++ d); + c) b)
Polyspermie ++ c)
Beginn der Embryogenese
+ d); - e) f) ++ d)
a)LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. (1986) b)SANBUISSHO und THRELFALL (1985) c)FUKUI und ONO (1989) d)YOUNIS et al. (1989) e)COSKUN et al. (1991) f)SAEKI et al. (1991) g)KUZMINA et al. (1999)
- kein Effekt; + positiver Effekt; ++ signifikant positiver Effekt; BSA - bovine serum albumine; FCS - fetal calf serum; ECS – estrous cow serum
Literatur
20
Hormone und Wachstumsfaktoren
Die spontane Reifung wird damit erklärt, dass der Follikel Faktoren produziert,
welche die Fortsetzung und die Arretierung der meiotischen Teilung steuern
(PINCUS G. u. ENZMANN, 1935; TSAFRIRI et al., 1982; SIRARD et al., 1992;
SIRARD et al., 1998).
Die Sensibilität der Oozyten gegenüber Inhibitoren der Reifung wird während der
Follikulogenese moduliert, sodass die gleiche Konzentration eines aktiven
Modulators, in verschiedenen Follikelstadien angewendet, zu unterschiedlichen
Reaktionen führen kann (SIRARD et al., 1992).
Die Bedeutung der in der Follikelflüssigkeit enthaltenen Gonadotropine, Steroide
(TSAFRIRI et al., 1982) und Wachstumshormone für die Reifung der Oozyten und
ihre nachfolgende Befruchtung ist immer noch unzureichend geklärt. So schwankt
zum Beispiel die Konzentration des Prolaktins in der Follikelflüssigkeit nach dem LH-
Gipfel (BEVERS et al., 1997). Die Autoren vermuten deshalb eine regulierende Rolle
dieses Hormons auf die Reifung boviner Oozyten. Dieser Effekt des Prolaktins ist
jedoch auch vom verwendeten Kultursystem, insbesondere von der Anwesenheit
anderer Hormone abhängig (KUZMINA et al., 1999). Wachstumsfaktoren, wie der
epidermal growth factor (EGF), sind fähig, die Expansion der CZ und die Kernreifung
zu induzieren (DOWNS et al., 1988; COSKUN et al., 1991; BEVERS et al., 1997;
PARK K.W. et al., 1997).
Während aus früheren Untersuchungen bekannt ist, dass der Zusatz von Hormonen
für eine erfolgreiche IVM nicht unbedingt erforderlich ist (EPPIG u. WARD-BAILEY,
1982), zeigen spätere Untersuchungen, dass Hormonzusätze die Effizienz signifikant
verbessern können (YOUNIS et al., 1989; SAEKI et al., 1991). SIRARD und
COENEN (1995) wiesen nach, dass nicht nur Gonadotropine sondern auch Steroide
die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten beeinflussen können.
Vergleichende Untersuchungen zur In-vitro-Reifung in Abhängigkeit von der
Anwesenheit von FSH in serumfreien Medien ergaben, dass bei Abwesenheit von
FSH die Diakinese früher erreicht wurde (SÜSS et al., 1988). In Anwesenheit von
FSH war der Prozess der Kondensation des Chromatins verlängert und die M-II
wurde später beobachtet. FSH induzierte eine Verzögerung des GVBD, wenn COK
mit Granulosa- und Thecazellen kultiviert wurden (KOTSUJI et al., 1994). Diese
Verzögerung wird mit einer Erhöhung des cAMP-Niveaus erklärt (SALUSTRI et al.,
Literatur
21
1985) und verursacht möglicherweise eine temporäre Arretierung der meiotischen
Reifung (SÜSS et al., 1988). Die Anwesenheit von FSH im Reifungsmedium trug
auch zur Expansion der CZ bei (SÜSS et al., 1988; SALUSTRI et al., 1989;
BUCCIONE et al., 1990). FSH und EGF wirken offenbar nur auf die CZ, weil diese
Hormone keinen Effekt auf denudierte Oozyten zeigten (SALUSTRI et al., 1985;
DOWNS et al., 1988; LU et al., 2000). Es wird vermutet, dass der FSH-Effekt durch
cAMP (DOWNS et al., 1988; SALUSTRI et al., 1989), cAMP-Proteinkinase A
(DOWNS u. HUNZICKER-DUNN, 1995), Diacylglycerol, Proteinkinase C (PKC) und
Inositoltriphosphat (HOMA, 1991) vermittelt wird.
PARK et al. (1997) reiften in ihren Versuchen Oozyten mit und ohne Zusatz von
EGF. Sie stellten fest, dass die zytoplasmatische Reifung mit EGF besser war und
dass EGF allein, in Abwesenheit von Gonadotropinen oder FCS, die
zytoplasmatische Reifung bei COK stimulieren kann.
LH wirkt bei der IVM nicht direkt auf die Oozyten. Sein Effekt wird vielmehr durch die
CZ vermittelt (TSAFRIRI et al., 1982; BRACKETT et al., 1989). Der Zusatz von LH
zum Reifungsmedium beeinflusst nicht die Fortsetzung der Meiose, verbessert aber
in vitro die Befruchtung und normale Entwicklung oviner Oozyten (MOOR u.
TROUNSON, 1977). BRACKETT et al. (1989) konnten zeigen, dass eine höhere
Konzentration von LH im Reifungsmedium die zytoplasmatische Reifung und weitere
Entwicklung der produzierten Embryonen verbessert. ZUELKE und BRACKETT
(1992) vermuten, dass dieser Effekt bei bovinen COK durch eine Erhöhung der
glykolytischen Aktivität und mitochondrialen Glukoseoxidation bedingt wird.
DOMINKO und FIRST (1997) fanden, dass LH im Vergleich zu FSH die
Geschwindigkeit der Kernreifung erhöht. Der Zusatz von Estradiol zu
Reifungsmedien war dann nicht nötig, wenn Serum als Additiv verwendet wurde
(BRACKETT et al., 1989).
Maturation Promoting Factor
Die Oozytenreifung und die Arretierung der meiotische Teilung in der M-II werden
durch Änderungen der Aktivität des MPF im Ooplasma reguliert (WU et al., 1997;
PICTON et al., 1998). Obwohl die Kinetik der Oozytenmaturation speziesabhängig
variiert, ist die Aktivität des MPF in Oozyten der untersuchten Spezies im GV-
Stadium sehr niedrig, erhöht sich während des GVBD und ist sehr hoch in der M-I
und -II (WU et al., 1997; PICTON et al., 1998; NEBREDA u. FERBY, 2000). Nach
Literatur
22
40-stündiger IVM zeigten bovine Oozyten die geringste Aktivität des MPF. Das
erklärt, warum sich die spontane Aktivierung am häufigsten bei "alten" Oozyten
ereignet (NAGAI, 1987).
Der Zusatz verschiedener Substanzen zum Reifungsmedium kann die Fortsetzung
der Meiose regulieren und/oder die Befruchtungs- und Blastozystenrate beeinflussen
(Tabelle 2.3).
Eine wesentliche Voraussetzung für den GVBD in Rinderoozyten ist eine
funktionierende Proteinsynthese. Die Aktivität des MPF ist von ihr abhängig. Die CZ
sind, unabhängig von der Proteinsynthese der Oozyten, ergänzend für die
Regulation der Kondensation des Chromatins im GV-Stadium verantwortlich
(TATEMOTO et al., 1994). Die Oozyten der Nutztiere Schwein, Schaf und Rind
führen die Meiose nicht durch, wenn Inhibitoren der Proteinsynthese anwesend sind
(MOOR u. CROSBY, 1986).
Nach Aufhebung einer künstlichen Arretierung, z.B. mit Cycloheximid (CHX), können
Oozyten normal maturiert, fertilisiert und die Befruchtungsprodukte anschließend bis
zu Blastozysten kultiviert werden (SAEKI et al., 1997). Eine Schlüsselrolle bei der
Fortsetzung der Meiose könnte Cyclin B, ein Bestandteil des aktiven MPF-Moleküls,
spielen (SIRARD et al., 1998). Der GVBD kann durch PKA gehemmt werden.
PICTON et al. (1998) vermuten, dass intrazelluläres cAMP infolge der LH-
Freisetzung und der Unterbrechung der gap junctions die Aktivität der PKA
reduzieren und auf diesem Weg die Aktion von Cyclin B ermöglichen kann. Die PKA
selbst wirkt wahrscheinlich bei bovinen Oozyten so, dass ihre regulierende
Untereinheit die Transkription in den CZ moduliert und ihre katalytische Untereinheit
die meiotische Arretierung durch Phosphorylierung der Schlüsselproteine aufrecht
erhält (ROSE-HELLEKANT u. BAVISTER, 1996).
Tabelle 2.3: Überblick über Substanzen, welche die Fortsetzung der Meiose in Oozyten beeinflussen
Substanz Effekt auf die meiotische Reifung Autoren
Okadaic acid (m) Beschleunigt die Fortsetzung der Meiose (GVBD)
Cycloheximid (d)(f)(m)(o)(r), Neomycin (k), Mangan
(1mM) (s), Linolsäure (l)(i), Granulosazell-Faktor (a), OMI (c), IBMX (b)(g), Adenylatcyclase (aus
Bordetella pertussis) (p)
Verhindert die Fortsetzung der Meiose (GVBD)
Puromycin u. Puromycin Analoga (6-DMAP) (h)(m)(j)(r)
Verhindert die Fortsetzung der Meiose (GVBD)
Adenosin Analoga
5,6-Dichloro-1-ß-d-ribofuranosyl-benzimidazol (n)
Verhindert die Fortsetzung der Meiose (GVBD) bei
COK
ATP (s) Reduziert die meiotische Reifung
(WKDQRO �ELV ���� 9HSUDPLO ���0��
3DUDDPLQREHQ]DPLGLQ� 4XHUFLWLQ ����J�PO��
EDTA u. Steroide (s), Midkine (v)
Kein Effekt
Hypoxanthin (e), Forskolin (u) Verhindert die Fortsetzung der Meiose (GVBD)
cAMP Analoga (q)
Typ I PKA bindend: verhindert die Fortsetzung der
Meiose
Typ II PKA bindend: Fortsetzung der Meiose
Ca 2+- und Mg 2+ -Ionen (t)
Meiosis-Activating Sterol aus Follikelflüssigkeit
(FF-MAS)(u)
Fortsetzung der Meiose (GVBD)
(a) MEINECKE und MEINECKE-TILLMANN (1981) (Schwein)
(b) EPPIG und WARD-BAILEY (1982) (Rind)
(c) TSAFRIRI et al. (1982) (Rind)
(d) MOOR und CROSBY (1986) (Schaf)
(e) DOWNS et al. (1989) (Maus)
(f) SIRARD et al. (1989) (Rind)
(g) BUCCIONE et al. (1990) (Rind)
(h) MOTLIK et al. (1990) (Rind)
(i) SIRARD und BILODEAU (1990a; 1990b) (Rind)
(j) FULKA et al. (1991) (Rind)
(k) HOMA (1991) (Rind)
(l) HOMA und BROWN (1992) (Rind)
(m) KALOUS et al. (1993) (Rind)
(n) FARIN und YANG (1994) (Rind)
(o) TATEMOTO et al. (1994) (Rind)
(p) AKTAS et al. (1995) (Rind)
(q) DOWNS und HUNZICKER-DUNN (1995) (Rind)
(r) SAEKI et al. (1997) (Rind)
(s) SIRARD et al. (1998) (Rind)
(t) LEIBFRIED und FIRST (1979b) (Rind)
(u) HEGELE-HARTUNG et al. (1999) (Maus)
(v) IKEDA et al. (2000) (Rind)
Literatur
24
Ca2+- und Mg2+-Ionen
In Hinblick auf die Anwesenheit von Ca2+- und Mg2+-Ionen im Reifungsmedium ist
bekannt, dass eine Verminderung der extrazellulären Konzentration beider Ionen
(Cae, Mge) bei Rinderoozyten Störungen der Fortsetzung der Meiose verursacht.
Eine alleinige Verminderung des Cae hat keinen Effekt auf die Fortsetzung der
Meiose und die Vollendung der ersten meiotischen Teilung. Im Gegensatz dazu führt
eine alleinige Reduzierung des Mge, obwohl kein Effekt auf die Fortsetzung der
Meiose beobachtet werden kann, dazu, dass die erste Reifungsteilung nicht beendet
wird. Das führt zur Arretierung der Meiose zwischen dem GVBD und der Bildung der
M-I-Platte (LEIBFRIED u. FIRST, 1979b).
Um die komplexe Interaktion von Hormonen, Wachstumsfaktoren und interzellulärer
Kommunikation, die zur Formation entwicklungskompetenter Oozyten führt, zu
verstehen, ist eine weitere Verbesserung des experimentellen Aufbaus der In-vitro-
Versuche notwendig. Mit Hilfe von Studien der In-vitro-Entwicklung von Oozyten
könnten spezifische Moleküle identifiziert werden, die essentiell für die normale
Embryogenese sind und deren Synthesestörungen zu Fruchtbarkeitsstörungen oder
Störungen der Embryonalentwicklung führen (EPPIG et al., 1996).
Die Literaturangaben über die mit verschiedenen IVM-Systemen zu erzielenden
Maturationsraten (M-II) reichen von ca. 58 bis 88% (ECKERT u. NIEMANN, 1996;
PARK et al., 1997; HASHIMOTO et al., 1998; KUZMINA et al., 1999).
2.2 Fertilisation
2.2.1 Fertilisation in vivo
Kapazitation
Spermien in der Epididymis zeigen volle Motilität, haben aber noch nicht die
Befruchtungsfähigkeit erreicht (YANAGIMACHI, 1994). Nach der Ejakulation müssen
Spermien im weiblichen Genitaltrakt einen Reifungsprozess durchmachen, der als
Kapazitation bezeichnet wird (TÖPFER-PETERSEN et al., 1996). Lokalisation,
Induktion und Ablauf der Kapazitation sind noch nicht ganz geklärt (PARRISH et al.,
1989b). Der Kapazitationsprozess ist von einer Reihe endogener Vorgänge begleitet,
wie beispielsweise der Veränderung der intrazellulären Ionenkonzentration, des
Metabolismus und der Tyrosinphosphorylierung von Spermienmembranproteinen,
Literatur
25
die insgesamt Voraussetzung für die ZP-induzierte Akrosomreaktion, die
Zonapenetration und die Fusion mit der Oozyte sind (TÖPFER-PETERSEN et al.,
1996). Im Verlaufe der Kapazitation verändert sich die Membran des Spermiums
durch die Eliminierung bestimmter Membranbestandteile (z. B. Cholesterol), was zur
regional begrenzten Änderung ihrer biophysikalischen Eigenschaften führt. Diese
biochemischen und biophysikalischen Veränderungen umfassen im einzelnen:
Modifikation der Lektinbindungsfähigkeit, Vermindung der negativen
Oberflächenladung, Veränderungen der Verteilung intramembranöser Partikel,
Veränderungen von Membranfluidität, Lipidkomposition, Protein-komposition,
Antikörperbindungseigenschaften sowie der Begrenzungskräfte, welche die
Domänenbildung von Membrankomponenten regulieren (NIEMANN u. MEINECKE,
1993; TÖPFER-PETERSEN et al., 1996). In Anbetracht der langen Zeit, die die
Spermien präovulatorisch im Isthmus verbleiben (18-20 h beim Rind) ereignet sich
wahrscheinlich ein großer Teil der Kapazitation im Oviduct (HUNTER u. WILMUT,
1984). Während dieser Zeit haben die Spermien Kontakt mit der extrazellulären
Matrix der Epithelialzellen des Oviducts (HANDROW et al., 1989). Ein weiteres
Schlüsselereignis der Kapazitation ist der Influx von Ca2+-Ionen (YANAGIMACHI,
1994; TÖPFER-PETERSEN et al., 1996).
Der Kern eines gereiften Spermiums hat eine sehr stabile Struktur, die während der
Kapazitation erhalten wird (YANAGIMACHI, 1994).
Akrosomreaktion
Mit Abschluss der Kapazitation erlangen die Plasmamembran sowie die äußere
Akrosommembran einen fusiogenen Zustand, der sie für die anschließende
Akrosomreaktion (AR) vorbereitet. In Bezug auf den Beginn der AR kann das Ende
der Kapazitation nicht festgestellt werden (NIEMANN u. MEINECKE, 1993).
An der ZP spielt sich die weitgehend speziesspezifische Erkennung beider Gameten
ab. Nach Bindung des Spermiums an die Oozyte kommt es zur AR, zur Aktivierung
und Freisetzung der Enzyme, mit deren Hilfe ein hyperaktiviertes Spermium die ZP
penetrieren und schließlich mit dem Oolemm fusionieren kann (TÖPFER-
PETERSEN et al., 1996). Die Herkunft und die Wirkungsweise der Faktoren, die die
AR in vivo auslösen, sind noch nicht ganz bekannt. Die AR ist nach
vorangegangener Akrosomschwellung mit dem Erscheinen kleiner Vesikel im
Akrosom abgeschlossen. Während der nachfolgenden Gametenfusion verbinden
Literatur
26
sich die Mikrofortsätze der Oozyte mit dem Äquatorialsegment des Spermienkopfes
und der Akrosombereich verschmilzt mit dem Ooplasma. Kurz vor bzw. während
dieses Prozesses beginnt die Freisetzung des Inhaltes der kortikalen Granula
(HYTTEL et al., 1989). Sowohl in vivo als auch in vitro wird bei der Maturation von
Oozyten eine frühzeitige Freisetzung der kortikalen Granula beobachtet
(DUCIBELLA et al., 1990). Die aus ihr freigesetzten exozytotischen Enzyme
verhindern durch die Veränderung der ZP-Proteine eine Polyspermie (PICTON et al.,
1998). Der frühestmögliche Zeitpunkt der Gameteninteraktion liegt zwischen zwei
und drei Stunden post inseminationem (HYTTEL et al., 1989).
Die Spermien, die sich der Oozyte nähern, aber keinen Kontakt mit der ZP haben,
führen keine AR durch. In Gegensatz dazu tritt die AR bei allen Spermien auf,
welche die ZP penetrieren. Die vesikulierten Produkte der AR befinden sich bei
penetrierten Rinderoozyten an der ZP-Oberfläche und es ist zu vermuten, dass bei
dieser Spezies die AR an der ZP-Oberfläche stattfindet (CROZET, 1984). Bei der
Maus, vielleicht auch bei anderen Säugetieren, verbindet sich das Zonaglycoprotein
3 (ZP3) mit den Spermienrezeptoren und löst die Kettenreaktion aus, die zur AR
führt (YANAGIMACHI, 1994).
Vorkernbildung
Unmittelbar nach der Penetration in das Ooplasma dekondensiert das Chromatin
des penetrierenden Spermienkopfes und die Kernhülle verschwindet völlig. Das
weibliche Chromatin ist zu diesem Zeitpunkt immer noch kompakt. Danach beginnt
die Bildung der weiblichen Vorkernmembran aus dem endoplasmatischen Retikulum
(CROZET, 1984; HYTTEL et al., 1987; HYTTEL et al., 1988a). Es besteht eine
leichte Asynchronität bei der Bildung der weiblichen und männlichen
Vorkernmembran (CROZET, 1984). Darüber hinaus wird angenommen, dass dieser
Prozess in vivo besser synchronisiert ist (HYTTEL et al., 1988a, 1989; LAURINCIK
et al., 1996). Nach der Vorkernschwellung ist die strukturelle Morphologie beider
Vorkerne gleich. Das endoplasmatische Retikulum ist der Kernmembran angefügt
und die Golgi-Komplexe sind in der Nähe des Vorkernes lokalisiert (CROZET, 1984;
HYTTEL et al., 1989). Durch die Gametenfusion wird das weibliche Chromatin
aktiviert, die Metaphasenform verlassen und die Abschnürung des zweiten
Polkörperchens beginnt (HYTTEL et al., 1987).
Literatur
27
Die Vorkernbildung beinhaltet die Änderung spezifisch konditionierten Chromatins
von beiden Gameten, die vom Übergang sogenannter protamine-like nuclear
proteins zu histone-type somatic nuclear proteins, der Vorkernmembranbildung und
der nachfolgenden Replikation der Desoxyribonukleinsäure (DNA) während der S-
Phase des ersten Embryonalzellzyklus begleitet ist (LAURINCIK et al., 1996).
Cumuluszellen
In vivo verlieren Oozyten während der Migration durch das Oviduct partiell ihre CZ
(BEDFORD u. KIM, 1993). Die Corona radiata bleibt jedoch vorhanden (CROZET,
1984). Wenn die Zellen der Corona radiata anwesend waren, wurden alle Zonae
pellucidae von mehreren Spermien penetriert. Während dies bei Abwesenheit der
CZ nicht zu beobachten war. Auf der Basis dieser Ergebnisse kann davon
ausgegangen werden, dass die CZ zwar eine chemotaktische Anziehung auf die
Spermien ausüben, aber in jedem Fall die extrapenetrierenden Spermien von der ZP
aufgehalten werden. Die Aufgaben der CZ umfassen weiterhin die Erleichterung des
Transportes der Oozyten durch das Oviduct, die Orientierung des Spermiums in
Richtung der Eizelle (BEDFORD u. KIM, 1993) und die Förderung der Kapazitation
(BAVISTER, 1992) sowie der AR (BOATMAN u. ROBBINS, 1991). Der Cumulus
oophorus kapselt sich ab und bringt die Spermien, welche die Ampulla zum
Zeitpunkt oder kurz nach der Ovulation erreichen, in unmittelbare Nähe der Oozyten
und fördert so eine frühe Fertilisation (BEDFORD u. KIM, 1993). In Tabelle 2.4 sind
einige Ereignisse der in vivo und in vitro Fertilisation und deren zeitlicher Ablauf
zusammengefasst.
Tabelle 2.4: Aspekte des Ablaufs der Fertilisation in vivo und in vitro beim Rind
Ereignis in vivo
(Stunden post ovulationem)
in vitro
(Stunden post inseminationem)
Autoren
Freisetzung der kortikalen Granula, Zuwachs der Golgi-Komplexe, Veränderung des endoplasmatischen Retikulums
2 – 3 h(a)(b)(c) 2 -3 h nach der Gametenfusion (f)
Beginn der Vorkernbildung 4 h (a)(b) 8 h (g)(h)
Vorkernbildung und –Schwellung 5 – 7 h (a)(b)(c) 8 h (f)
8 - 14 h (h)
9 - 12 h (i)
Ausschleusen des zweiten Polkörperchens 5 - 8 h (e)
Erscheinen die Annulatae lamellae 7 h (a)(b)(c) -
G1-Phase: Inhalt der kortikalen Granula wird im perivitellinen Spaltraumes verstreut
11 h (a)(d) -
Beginn der Vorkernmembranbildung mit verstreutem Chromatin 11 h (d) -
Beginn des S-Phase: Zuwachs der Golgi-Komplexe und Verminderung des endoplasmatischen Retikulums.
11 -13 h (a) -
Vorkernmembranbildung vollständig kondensiertes Chromatin, der nucleolus-precursor bodie erscheint (G-Phase).
7 h (b)
13 h (d)
-
Beginn der Vorkernvereinigung (S-Phase) 17h (d) 20 h (f)
Ende der S-Phase, deutliche Golgi-Komplexe in der Nähe der Vorkerne 19 - 20 h (a) -
Vorkernvereinigung und folgende Synkaryose. 19 -21 h (a)(b)(c)(d) -
Zytokinese vollständig (entspricht dem 2-Zell-Stadium) 23 h (a)(b)
24 h ©
28 h (g)
40 h (f)
(a) HYTTEL et al. (1988c)
(b) HYTTEL et al. (1987)
(c) HYTTEL et al. (1989)
(d) LAURINCIK et al. (1996)
(e) HYTTEL et al. (1988a)
(f) HYTTEL et al. (1988b)
(g) XU und GREVE (1988)
(h) DOMINKO und FIRST (1997)
(i) FUKUI (1990)
Literatur
29
2.2.2 Fertilisation in vitro
Bei der IVF ist genau wie bei der In-vivo-Fertilisation die Kapazitation der Spermien
notwendig, damit sie ihre Befruchtungsfähigkeit erreichen. Um diesen Prozess in
vitro erfolgreich zu simulieren, wurden in den vergangenen Jahren viele
Untersuchungen durchgeführt, die zu verschiedenen Verfahren geführt haben. Die
molekularen Mechanismen der Kapazitation sind jedoch noch nicht vollständig
aufgeklärt (PARRISH et al., 1999).
Kapazitation
Eine erfolglose IVF bedeutet nicht, dass die Spermien nicht kapazitiert waren, weil
die Kapazitation nicht die einzige Voraussetzung für eine erfolgreiche IVF ist. Um
Oozyten befruchten zu können, müssen Spermien eine hohe Motilität besitzen, die
AR durchführen, durch die ZP penetrieren und mit der Oozyte fusionieren können. In
vitro sterben auch bei besten Kulturbedingungen viele Spermien bereits vor der
Kapazitation. Die In-vitro-Kapazitation des Spermiums ist von der Temperatur, der
Zusammensetzung des Mediums und der Dauer der Kultur abhängig und variiert je
nach Spezies. Nicht alle Spermien aus dem gleichen Ejakulat können synchron
kapazitiert werden. Es gibt Spezies deren Spermien die Anwesenheit von Spermien-
Motilitäts-Faktoren für die Kapazitation benötigen. Beispiele für solche Faktoren sind
Taurin und Hypotaurin (YANAGIMACHI, 1994). Die AR kann als ein Indikator der
Kapazitation angesehen werden, wobei aber bestimmte Reagenzien in der Lage
sind, die AR auch bei nicht kapazitierten Spermien zu induzieren.
PARRISH et al. (1985; 1986; 1988) konnten in ihren Untersuchungen zeigen, dass
Glycosaminoglycane und Heparin die In-vitro-Kapazitation von Rindspermatozoen
beeinflussen. Die Kapazitation mit Heparin verlangt eine mindestens vier-stündige
Inkubation, was vermuten lässt, dass es zu einer Veränderung der Plasmamembran
kommt, bevor die AR festgestellt werden kann (PARRISH et al., 1988; PARRISH et
al., 1989a). Der Heparineffekt ist spezies- und konzentrationsabhängig (PARRISH et
al., 1988). Beim Bullen, aber auch beim Eber, kann die Phosphorylierung der
Spermienproteine durch Heparin verstärkt werden (TÖPFER-PETERSEN et al.,
1996). Der Heparineffekt wird durch heparinbindende, oberflächenassoziierte
Proteine vermittelt (UGUZ et al., 1994). Dabei kommt es nicht nur zur Erhöhung des
Cai (TÖPFER-PETERSEN et al., 1995) und des pH (VREDENBURGH-WILBERG u.
Literatur
30
PARRISH, 1995), sondern auch zur Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels
(UGUZ et al., 1994; PARRISH et al., 1994; TÖPFER-PETERSEN et al., 1995;
VREDENBURGH-WILBERG u. PARRISH, 1995). Die Aktivierung der PKA und die
Phosphorylierung der Spermienproteine spielen eine wichtige Rolle für die
Aufrechterhaltung der Spermienmotilität. Es gibt Hinweise darauf, dass sich durch
die Phosphorylierung die Adenylatcyclase-Aktivität während der Kapazitation erhöht,
sowie über die Verfügbarkeit des cAMP die PKA stimuliert und die Struktur der
Spermienproteine verändert werden kann (YANAGIMACHI, 1994).
Die Eileiterflüssigkeit aus der Östrusphase enthält einen kapazitierenden Faktor mit
physiologischen und biochemischen Merkmalen wie ein heparinähnliches
Glycosaminoglycan (PARRISH et al., 1989b). LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. (1986)
stellten fest, dass die IVF beim Rind mit FCS-haltigem Medium durchgeführt werden
kann, weil das FCS die Heparinkonzentration im System erhöht. Wird FCS als
supplementäres Protein im Fertilisationsmedium verwendet, ist die Polyspermierate
ohne erkennbaren Grund höher. Der Zusatz von Xanthin-Xanthinoxidase-Catalase
zum Befruchtungsmedium induziert die Kapazitation signifikant (O'FLAHERTY et al.,
1999). Die Kapazitation mit Heparin so wie mit Eileiterflüssigkeit aus der
Östrusphase (PARRISH et al., 1989b) kann durch Zusatz von Glucose blockiert
werden (PARRISH et al., 1985; HANDROW et al., 1989; PARRISH et al., 1989a;
MAHMOUD u. PARRISH, 1996). Auch zyklisches Rp-Adenosin-3'5'-
Monophosphorothioat, ein cAMP-Antagonist (UGUZ et al., 1994), und
Superoxiddismutase (O'FLAHERTY et al., 1999) hemmen die heparininduzierte
Kapazitation. Der Hemmeffekt der Glucose kann durch eine verspätete Erhöhung
des intrazellulären pH (pHi) (PARRISH et al., 1989a) bedingt sein und in
dosisabhängiger Weise durch 8-Bromo-cAMP, Isobutylmethylxantin oder Koffein
verhindert werden (HANDROW et al., 1989; PARRISH et al., 1994). Während einer
vier-stündigen Inkubation der Spermien mit Heparin und Glucose sinkt der
extrazelluläre pH (pHe) von 7,4 auf 7,2. Der Abfall des pHe hat keinen Effekt auf die
Kapazitation. Negative Folgen auf die Kapazitation sind erst bei einem pHe < 7,02 zu
erwarten (PARRISH et al., 1989a). Im Gegensatz dazu steigt der pHi des Spermiums
während der Kapazitation an (VREDENBURGH-WILBERG u. PARRISH, 1995).
Diese Steigerung ist nicht mit der Erhöhung des cAMP und der Phosphorylierung der
Proteine während der Kapazitation assoziiert (UGUZ et al., 1994). Inositol-1’,4’,5’-
Literatur
31
triphosphat (IP3) induziert möglicherweise die Ca2+-Freisetzung, insbesondere bei
einem alkalischen pHe (CRAN u. ESPER, 1990; PARRISH et al., 1999). Während
der AR kann sich der pHi auf mehr als 7,4 erhöhen (FLORMAN et al., 1989;
FLORMAN et al., 1992).
Ca2+-Ionen und Kapazitation
In einer Studie von HANDROW et al. (1989) stieg der Prozentsatz kapazitierter
Spermien während der Inkubation mit Heparin exponential, wenn die Zeit der
Exposition zu 2mM Ca2+ gesteigert wurde. Unabhängig von den ursächlichen
Faktoren, die zur Membranfusion führen, hat man bei allen bisher untersuchten
Tierarten die Anwesenheit von Cae als wesentliche Voraussetzung für die AR
(WASSARMAN, 1987) und der Steigerung der Motilität experimentell belegen
können (NIEMANN u. MEINECKE, 1993). Deshalb wird vermutet, dass zahlreiche
Ereignisse während der Kapazitation durch Cai reguliert werden.
PARRISH et al. (1999) berichten, dass bei der heparininduzierten Kapazitation der
Einfluss von Ca2+-Ionen auf die Spermien während der ersten zwei Stunden der
Inkubation am kritischsten ist. Dies ist die Phase der Kapazitation, während der das
Cai noch nicht erhöht ist. Die Autoren vermuten, dass zu Beginn der Kapazitation
Cae in die Spermien einströmt und die Ca2+-Vorräte auffüllt. Diese sind im
Spermienkopf (HANDROW et al., 1989) und im Akrosom (PARRISH et al., 1999)
lokalisiert. Außerdem können Ca2+-Ionen noch in den Mitochondrien und
calciumbindenden Proteinen (YANAGIMACHI, 1994) bzw. im Spermienkern
eingelagert werden (PARRISH et al., 1999). Die Änderung der Konzentration des Cai
hat eine Erhöhung der cAMP, des pHi und die Phosphorylierung von Tyrosin zur
Folge, die als wesentliche Faktoren für die Kapazitation angesehen werden (UGUZ
et al., 1994; PARRISH et al., 1994; VREDENBURGH-WILBERG u. PARRISH,
1995).
Aufgetautes kryokonserviertes Sperma reteniert schneller Cae als Frischsperma.
Ursache hierfür sind Schädigungen der Plasmamembran während des
Gefrierprozesses. So können Sequenzen der Kapazitation früher stattfinden
(BAILEY u. BUHR, 1993; O'FLAHERTY et al., 1999). Die verkürzte Inkubationszeit
kann aber zum Frühtot der Spermien führen, bevor diese die Oozyten erreichen
(FLORMAN, 1994). Die Bedeutung der Ca2+-Ionen während der Fertilisation wird im
Kapitel 2.5 dargestellt.
Literatur
32
Cumuluszellen und Kapazitation
Von vielen untersuchten Spezies ist bekannt, dass Oozyten mit intakten CZ in vitro
besser befruchtet werden, als völlig oder teilweise denudierte (BEDFORD u. KIM,
1993). Die Ursachen für diesen fertilisationsfördernden Effekt der CZ sind nicht völlig
geklärt. Mögliche Erklärungen sind die, dass die CZ die Kapazitation der
Bullenspermien unterstützen, die AR induzieren (FUKUI, 1990) bzw. die Penetration
des Spemiums und die Befruchtung durch die Verhinderung einer Härtung der ZP
erleichtern (MATTIOLI et al., 1988). Diese Fähigkeiten führen zu einer höheren
Befruchtungs-, Teilungs- und Entwicklungsrate nach der Fertilisation (FUKUI, 1990).
HYTTEL et al. (1988c) fanden, dass die CZ eine große Anzahl an Spermien
phagozytieren. Bei Vergleichen der Befruchtungsfähigkeit von in vitro maturierten
COK und denudierten Oozyten fand FUKUI (1990), dass denudierte Oozyten fähig
sind, die AR auszulösen, ihre Entwicklungsfähigkeit war jedoch im Vergleich zu COK
erniedrigt. COX et al. (1993) bewiesen, dass der Effekt der CZ während der
Fertilisation nur gegeben ist, wenn ein direkter Kontakt zwischen dem CZ-Verband
und den Oozyten besteht. Das Tempo der Penetration der Spermien wird durch die
CZ nicht verändert. Die Autoren vermuten, dass die CZ neben der Förderung der
Kapazitation auch die Interaktion zwischen kapazitierenden Spermien und der
Oberfläche der ZP erleichtern. Die durch CZ induzierte Verbesserung der
Fertilisationsrate ist nicht durch einen direkten Effekt auf die Integrität des Akrosoms
vermittelt, sondern durch Veränderungen der Proportionen des kapazitierten
Spemiums, das dadurch befähigt wird, die ZP zu kontaktieren und penetrieren. Des
weiteren ist bekannt, dass Granulosazellen fähig sind, heparinähnliche
Glycosaminoglycane zu produzieren (COX et al., 1993).
O'FLAHERTY et al. (1999) schlussfolgern aus ihren Untersuchungen, dass
Sauerstoff für den Prozess der Kapazitation erforderlich ist und dass Wasserstoff-
peroxyd als ein Induktionsfaktor der AR bei kryokonserviertem Rindsperma
angesehen werden kann. Die Anwesenheit freier Sauerstoffradikale in der IVK wirkt
jedoch zytotoxisch auf die Gameten (KIM et al., 1999; IWATA et al., 1999).
Bovine Eileiterepithelzellen (BOEC) sowie Hypotaurin und Epinephrin zeigen in
Kulturmedien antioxydative Effekte. In diesem Zusammenhang bestätigen MILLER
et al. (1994), dass der Zusatz von BOEC oder Epinephrin zum Befruchtungsmedium
die Fertilisationsrate verbessert und in Kombination die Teilungsrate erhöht, was auf
einen synergistischen Effekt hinweist. LEIBFRIED und BAVISTER (1982) vermuten,
Literatur
33
dass Epinephrin und Hypotaurin unabhängig voneinander die Befruchtungsfähigkeit
in vitro stimulieren. Die biochemischen Veränderungen während der Kapazitation
führen zu einer nachhaltigen Erhöhung der Motilität der Spermatozoen, die als
Hyperaktivierung bezeichnet wird (YANAGIMACHI, 1994).
Akrosomreaktion
Während der Kapazitation ereignen sich intrazellulär und an der Spermienmembran
Veränderungen, denen schließlich die sogenannte AR als ein exozytotisches
Ereignis folgt (YANAGIMACHI, 1994; O'FLAHERTY et al., 1999). Die AR kann etwa
6 h nach Fertilisationsbeginn beobachtet werden und ist durch eine Fenestration der
Spermienkopfmembran im Bereich des Akrosoms gekennzeichnet (FLECHON u.
PAVLOK, 1986; HYTTEL et al., 1988b). Die AR des Spermiums und die Fusion des
Spermienkopfes mit der Oozyte sind wesentlich für den Beginn des
Fertilisationsprozesses (HYTTEL et al., 1988a). Während der AR strömen mittels
einer ATP-abhängigen Pumpe Na2+- und Ca2+-Ionen ein und H+-Ionen aus dem
Spermienkopf aus, was zur Erhöhung des pHi führt. Dazu muss Cae, aber auch ein
Ca2+-bindendes Protein, das Calmodulin, zwischen der Plasma- und
Akrosommembrane des Spermienkopfes vorhanden sein (CRAN u. ESPER, 1990).
Ionophor A23187, ein Antibiotikum, dass die Integrität der Plasmamembran
gegenüber Ca2+-Ionen aufhebt, erhöht auf diese Weise die intrazytoplasmatische
Ca2+-Ionenkonzentration und induziert so die AR (WASSARMAN, 1987).
Auch Bestandteile der ZP spielen bei der Induktion der AR eine Rolle. Wenn murine
(WASSARMAN, 1987) oder humane (CROSS et al., 1988) Spermien mit gelösten
ZP in Kontakt kommen, führen diese die AR durch. ZP3 ist eines von drei
verschiedenen Glycoproteinen, die an der Bildung der ZP beteiligt sind (CRAN u.
ESPER, 1990). Bei Säugetieren kann gereinigtes ZP3 in ein-molarer Konzentration
in vitro die AR genau so induzieren wie Ionophor A23187 (WASSARMAN, 1987).
Während Thapsigarin, ein Antagonist der Ca2+-ATPase des Akrosoms, bei
kapazitierten Spermien die AR induzieren kann (PARRISH et al., 1999), benötigt das
Lysophosphatidylcholin dafür zusätzlich Heparin (PARRISH et al., 1988; PARRISH
et al., 1989a). Von YANAGIMACHI (1994) werden weiterhin Elektroporation,
Lysolecithin und Progesteron als AR-induzierende Faktoren erwähnt. Die
Proteinkinase C, ein regulatorisches Schlüsselenzym der Phosphorylierung, ist
Literatur
34
ebenfalls für die AR und die Regulierung des Cai bei Rinderspermien von Bedeutung
(BREITBART et al., 1992; BREITBART u. NAOR, 1999).
CROZET (1984) identifizierte sogenannte sperm binding sites (Spermarezeptoren) in
der ZP von Säugetieren. Die Bindung des Spermiums an die ZP ist durch
speziesspezifische egg binding proteins der Plasmamembran des Spemiums
vermittelt. Die Spermarezeptoren in der ZP werden nach der Fertilisation inaktiviert
(WASSARMAN, 1987). Die Aktivierung der Rezeptoren in der ZP und die folgende
Membranfusion sind nur ein Teil der AR. Wenn die Konzentration der intrazellulären
Ca2+- und H+-Ionen einen bestimmten Grenzwert erreicht, kann es zum Start der AR
kommen, ohne das die Aktivierung der Rezeptoren stattgefunden hat
(YANAGIMACHI, 1994). Die AR ereignet sich auf der Oberfläche der ZP, aber
bereits während der Passage der Spermien durch die CZ ist eine Schwellung der
Akrosomen zu beobachten (CUMMINS u. YANAGIMACHI, 1986; HYTTEL et al.,
1988c).
Kortikalreaktion, Zonareaktion und Polyspermieblock
Im Verlauf der Fertilisation wird die Kortikalreaktion induziert, welcher die
Zonareaktion folgt. Die Kortikalreaktion beinhaltet die Fusion der Membran der
kortikalen Granula mit der Plasmamembran der Oozyte, und die Zonareaktion führt
zu einer generellen Härtung der ZP sowie der Deaktivierung der Spermarezeptoren.
Diese Änderungen bewirken eine "langsame" Blockierung der Spermienpenetration
(WASSARMAN, 1987; CRAN, 1989; DUCIBELLA et al., 1990). Man nennt dieses
Phänomen den Polyspermieblock. Die Spermien können zwar noch in die äußeren
Zonaschichten eindringen, aber normalerweise die innere Lage nicht passieren
(MEINECKE-TILLMANN u. MEINECKE, 1980).
Sobald sich ein Spermium an die ZP gebunden und die AR stattgefunden hat,
penetriert es die ZP, um die Plasmamembran der Oozyte zu erreichen und mit ihr zu
fusionieren. Dieser Vorgang wird durch die Proteolyse der ZP limitiert. Eine
trypsinähnliche Proteinase, das Acrosin, aber auch andere Spermaproteinasen
steuern diesen Prozess. Die Spermienmotilität, welche zum Zeitpunkt der Fusion
aufhört, ist nicht für die Penetration in die Oozyte erforderlich (WASSARMAN, 1987).
Die Zeit, die ein Spermium für die Penetration benötigt, hängt nicht von der Qualität
der Oozyte ab (DOMINKO u. FIRST, 1997). Die ersten Penetrationen wurden fünf
Literatur
35
bis sechs Stunden nach der Insemination in vitro beobachtet (XU u. GREVE, 1988;
TAJIK et al., 1994).
Die Fusion der Membran der kortikalen Granula mit der Oozytenmembran verläuft
wie eine Welle, die am Fusionspunkt beginnt und sich über die Oozytenoberfläche
ausbreitet. WASSARMAN (1987) vermutete, dass die Freisetzung von Ca2+-Ionen
aus den intrazellulären Vorräten für die Verbreitung dieser Welle verantwortlich ist.
Durch die Exozytose der kortikalen Granula während der Fertilisation von
Mausoozyten wird das Zonaglycoprotein 2 zu Zonaglycoprotein 2f umgewandelt und
der Polyspermieblock wirksam (CRAN, 1989; DUCIBELLA et al., 1990). Wenn
Oozyten in Medien ohne Serum gereift werden, ereignet sich diese Umwandlung des
Zonaglycoproteins 2 früher, die ZP härtet früher und der Anteil befruchteter Oozyten
sinkt (HYTTEL et al., 1988c; HYTTEL et al., 1989; DUCIBELLA et al., 1990). Bei
ihren Untersuchungen stellten CROZET (1984) und HYTTEL et al. (1988c) fest, dass
ungefähr ein Drittel der unbefruchteten Oozyten durch Fehler bei der Maturation
bedingt sind. Die Anwesenheit von Serum kann einen verfrühten Polyspermieblock
verhindern (DUCIBELLA et al., 1990). RAZ et al. (1998b) berichteten, dass auch
eine partielle Kortikalreaktion über eine Cai-Zunahme oder PKC-Aktivierung
ausreichend war, um einen Polyspermieblock in Oozyten von Ratten auszulösen.
HYTTEL et al. (1988c) fanden in einigen Fällen mehrere Spermienköpfe im
Ooplasma zusammen mit zwei Vorkernen, die nur geringgradig oder gar nicht
dekondensiert waren. Später beobachteten sie eine asynchrone Teilung bzw.
Fragmentierung, die zur Bildung von Embryonen mit drei Blastomeren führte. In
diesen Fällen war die Polyspermie durch abnormale Freisetzung und Zerstreuung
des Inhaltes der kortikalen Granula bedingt. Diese Störungen können unter IVF-
Bedingungen auftreten und sind mit der Calcium-Konzentration im Medium
assoziiert. Wahrscheinlich scheitert bei extranumerischen Vorkernen die
Dekondensation der Chromosomen (HYTTEL et al., 1989). SLAVIK und FULKA
(1999) vermuten, dass sich diese Sperre bei in vitro maturierten Oozyten, im
Gegensatz zum speziesspezifischen Polyspermieblock während der In-vivo-
Fertilisation, nicht vollständig entwickeln kann, weil der Kontakt mit dem östrischen
Sekret des Eileiters fehlt.
Die mit der IVF assoziierten zytoplasmatischen Veränderungen gleichen
grundsätzlich denen in vivo, weichen aber etwas von diesen ab. Die Evidenz des
Golgi-Komplexes und das verteilte endoplasmatische Retikulum ließen HYTTEL et
Literatur
36
al. (1988b) eine Veränderung der Zellorganellen hin zu einer aktiveren und
verstreuten Form vermuten, was von den Autoren als Hinweis auf eine erhöhte
metabolische Aktivität der Oozyte während der IVF gewertet wurde.
Penetration und Vorkernbildung
Sobald ein Spermium das Ooplasma penetriert, wird das weibliche Chromatin
aktiviert (XU u. GREVE, 1988). Die Kinetik der Veränderung des weiblichen
Chromatins ist vom Alter der Oozyte zum Zeitpunkt der Arretierung in der M-II, sowie
vom Zeitpunkt der Insemination abhängig. Die Dekondensation des Chromatins des
penetrierenden Spermienkopfes wird durch eine höhere Aktivität des MPF
ermöglicht. Anderseits ist die Deaktivierung des MPF nach der Befruchtung
erforderlich, damit der Zellzyklus von der Metaphase zur ersten Embryonalinterphase
voranschreiten kann. Die für die Vorkernbildung verantwortlichen Faktoren werden
stufenweise nach der M-II-Arretierung synthetisiert bzw. aktiviert (DOMINKO u.
FIRST, 1997).
Die anfängliche Embryonalentwicklung ist größtenteils von den mütterlichen
makromolekularen Informationsvorräten abhängig. Die väterlichen Bestandteile der
Embryonen dürfen aber nicht unterschätzt werden. Das befruchtende Spermium
bringt Proteine und zelluläre Organellen mit, welche große Bedeutung für den ersten
Zellzyklus der Embryonen haben. Einige Autoren vermuten, dass die paternalen,
nichtgenetischen Komponenten das maternale Programm der Embryonalentwicklung
modulieren können (BORDIGNON u. SMITH, 1999; LEIBFRIED-RUTLEDGE, 1999).
Beim Rind entwickeln sich während der Progression des ersten embryonalen
Zellzyklus verschiedene Strukturen im Inneren des Kerns (LAURINCIK et al., 1996).
Die Tatsache, dass die Prophase der ersten mitotischen Teilung vor und während
der Auflösung der Kernhülle beginnt, lässt den Schluss zu, dass die väterlichen
Chromosomen während der Synkariose nicht vermischt werden (HYTTEL et al.,
1988b). Die gleichen Autoren beschreiben den Ablauf der Vorkernbildung in drei
verschiedenen Stadien: I. Stadium - das dekondensierte Chromatin legt sich
stufenweise an die Vorkernhülle; II. Stadium - die Bildung der Vorkernhülle wird
beendet und ein Vorkern erscheint im Spermienkopf; und III. Stadium – der Vorkern
schwillt an, vergrößert sich und nimmt eine Kugelform an. Im I. und II. Stadium
erscheint das Chromatin nur locker dekondensiert und das Mittelteil des Spermiums
ist streng mit dem gebildeten Vorkern assoziiert (HYTTEL et al., 1988b). Die Dauer
Literatur
37
der ersten mitotischen Teilung ist von der Temperatur abhängig (KAUFMAN, 1973).
Die Annulatae lamellae entwickeln sich gleichzeitig mit der Schwellung der Vorkerne
und in Beziehung zur Vorkernmembranbildung (HYTTEL et al., 1988b). Die
Vorkernmembran hat Poren und charakteristische "blebs", die zwischen innerer und
äußerer Vorkernmembran gebildet werden (CROZET, 1984). DIRNFELD et al.
(1999) fanden, dass in Bezug zur Qualität der Embryonen und der Anwachsrate
nach Übertragung der Embryonen beim Menschen, eine kurze Inkubation (1h) der
Oozyten mit den Spermien vorteilhafter war, als eine Standardinkubation von 16 bis
24h. Dies betraf jedoch nicht die Befruchtungsrate, die Teilungsrate und den Anteil
der Embryonen. PARRISH et al. (1985) gaben an, dass beim Rind eine 18-stündige
Inkubation der Oozyten mit den Spermien zu optimalen Fertilisationsraten führt.
Die häufigsten Abweichungen bei der Kernreifung in vitro maturierter Oozyten sind
die ausgeprägtere asynchrone Entwicklung der Vorkerne und die Präaktivierung der
Zytokinese. Abnormalitäten bei der Vorkernbildung, wie Fehler bei der
Dekondensation des Chromatins und Spätentwicklung des Vorkerns, ereignen sich
meistens bei den männlichen Vorkernen. Fehler bei der Reifung der weiblichen
Vorkerne finden seltener statt (XU u. GREVE, 1988). DOMINKO u. FIRST (1997)
schlossen aus ihren Untersuchungsergebnissen, dass eine ungewöhnliche
Konfiguration des mütterlichen Chromatins nicht die Folge einer verfrühten Reifung,
sondern die der Aktivierung von Oozyten mit unreifer Metaphasenspindel ist. Ihre
Beobachtungen lassen vermuten, dass die Fähigkeit der Oozyten, auf die
Aktivierung durch die Spemienpenetration zu antworten, vom Alter der
Polkörperchenbildung abhängig ist. KING et al. (1985) beobachteten in ihren
Untersuchungen, dass die Vorkerne durch Unterschiede der Größe während die
Interphase und eine asynchrone Dekondensation des Chromatins während die
Prometa- und Metaphase charakterisiert waren.
Die Dauer der ersten mitotischen Teilung beträgt bei Mäusen etwa 2 Stunden
(KAUFMAN, 1973). Im Vergleich zur schnellen Embryonalentwicklung bei Fischen
und Amphibien ist der erste Zellzyklus beim Rind lang (BORDIGNON u. SMITH,
1999).
Nach LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. (1986) werden Oozyten als penetriert
klassifiziert, wenn sie 1) ein Spermium im Zytoplasma ohne eine
Vorkernentwicklung, 2) einen Vorkern und einen Spermienkopf im Zytoplasma oder
3) zwei Vorkerne mit oder ohne Rest eines Spermienschwanzes aufweisen. Der
Literatur
38
Anteil penetrierter Oozyten 18 bis 22 h post inseminationem lag in verschiedenen
Untersuchungen zwischen 53% und 100% (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al., 1986;
GREVE et al.,1987; PARK et al., 1997; HASHIMOTO et al., 1998). Zum gleichen
Zeitpunkt wurden anhand der Oozyten mit einem männlichen und einem weiblichen
Vorkern Befruchtungsraten zwischen 16% und 100% festgestellt (LEIBFRIED-
RUTLEDGE et al., 1986; ECKERT u. NIEMANN, 1996; PARK et al., 1997;
HASHIMOTO et al., 1998).
2.3 In-vitro-Kultur der Embryonen
Eine In-vitro-Produktion von Rinderembryonen für die Tierzucht erfordert, dass die
Kultursysteme und ihre Komponenten frei von spezifischen Krankheitserregern sind
und wiederholbare, gute Ergebnisse gewährleisten. LEIBFRIED-RUTLEDGE (1999)
stellte fest, dass das Wissen über die Implantation und Erhaltung der Trächtigkeit
nach Transfer in vitro produzierter Embryonen auf Empfängertiere noch nicht
ausreicht, um die Analyse der Ursachen einer verminderten Vitalität solcher
Embryonen bzw. der mit der In-vitro-Produktion verbundenen Probleme bei den
Kälbern allein auf die Entwicklungskompetenz der Gameten oder die genutzten
Kultursysteme zu beschränken.
Kulturmedien, Supplemente und Kokultur
In den vergangenen Jahren sind eine Vielzahl Medien und Supplemente geprüft
worden, um effektive Kultursysteme für Embryonen verschiedener Spezies zu
entwickeln (KESKINTEPE u. BRACKETT, 1996; LIM et al., 1996; IWATA et al.,
1999; HOLM et al., 1999; IWASAKI et al., 1999). Den Kulturmedien für Embryonen
der Nutztiere werden häufig verschiedene Seren dieser Tiere zugesetzt, z.B. FCS,
BSA oder OCS. Diese Seren enthalten jedoch verschiedene, biologisch aktive
Komponenten wie Proteine, Aminosäuren, Kohlenhydrate, Spurenelemente,
Hormone, Wachstumsfaktoren usw. (IWASAKI et al., 1999), welche nur die
Herstellung undefinierter Medien gestatten. Das gleiche Problem stellt sich, wenn
Zellen als Kokultur dem Kulturmedium zugesetzt werden (HOLM et al., 1999). Serum
oder Bestandteile davon können einen Hemmeffekt auf spezifische
Entwicklungsstadien der Embryonen ausüben, insbesondere während der ersten
Zellteilungen. Später, im Blastozystenstadium, hat das Serum jedoch einen
Literatur
39
stimulierenden Effekt (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER, 1991), der häufig zu einer
Erhöhung des Blastozystenrate führt (LIM et al., 1996; FERGUSON u. LEESE,
1999). So konnten LIM u. HANSEL (2000) aus 8-Zellstadien einen höheren Anteil
Blastozysten produzieren, wenn das Medium FKS anstatt BSA enthielt. JACOBSEN
et al. (2000) fanden in ihren Untersuchungen, dass die IVK von Rinderembryonen in
Anwesenheit von Serum und BOEC das Geburtsgewicht der Kälber erhöht. Im Alter
von einer Woche waren aber die Organgewichte und die Körperdimensionen im
Vergleich zur Kontrollgruppe nicht verändert.
Auf Grund der unerwünschten Nebenwirkungen von Serumproteinen auf in vitro
produzierte Rinderembryonen bzw. Kälber, wurde schon sehr bald und erfolgreich
versucht, ohne Serumzusatz bei der In Vitro-Produktion auszukommen (ECKERT u.
NIEMANN, 1995). KESKINTEPE und BRACKETT (1996) fanden bei Verwendung
eines serum- und BSA-freien IVK-Systems keine Unterschiede bezüglich Zellzahl
und Morphologie zwischen in vitro und in vivo produzierten Embryonen. Lediglich die
Entwicklungsgeschwindigkeit war in vitro etwas verlangsamt. Dagegen konnten
HOLM et al. (1999) zeigen, dass Oozyten in definiertem Medium ohne Serum oder
BSA zwar maturiert, fertilisiert und bis zur Blastozyste kultiviert werden können, die
Befruchtungsrate und präimplantative Entwicklung aber vermindert ist.
Verschiedene Substanzen wurden hinsichtlich ihrer Eignung untersucht, Serum oder
BSA im Kulturmedium zu ersetzen. KESKINTEPE und BRACKETT (1996) erzielten
bessere Teilungs- und Blastozystenraten, wenn BSA durch Polyvinylalkohol ersetzt
wurde. BAVISTER und McKIERNAN (1993) vermuteten, dass während der IVK
Aminosäuren eine wichtige Rolle bei der Regulation des pHi spielen. Außerdem
haben Aminosäuren positive Effekte auf die Embryonalentwicklung in vitro und die
Implantation nach Transfer auf die Empfängertiere (ZHANG u. ARMSTRONG,
1990).
Polyvinylpyrrolidon (IWASAKI et al., 1999) so wie HEPES und/oder NaHCO3 (TAJIK
et al., 1994; KESKINTEPE et al., 1995) werden bei der IVK eingesetzt, um den pH
des Mediums zu stabilisieren. Rinderembryonen reagieren sehr empfindlich auf
Veränderungen des pHi über 7,2. Der Na+/H+-Puffer spielt für die Regulation des pHi
die wichtigste Rolle, während die Aktivitäten des HCO3-/Cl--Puffers sehr langsam
ablaufen und unter Kulturbedingungen nicht als regulierender Mechanismus des pHi
bei Rinderembryonen angesehen werden kann. Bei Embryonen von Nagern werden
Literatur
40
beide Puffersysteme zumindest partiell durch Calcium-Wellen aktiviert (LANE u.
BAVISTER, 1999).
Glucose kann die Embryonalentwicklung vor der Kompaktierung (KOBAYASHI et al.,
1994) bzw. vor dem Blastozystenstadium beim Rind (IWATA et al., 1999)
dosisabhängig hemmen (PINYOPUMMINTR u. BAVISTER, 1991; IWATA et al.,
1998). Dem gegenüber fanden LIM et al. (1996) in einem Kokultursystem nach
Zusatz von Glucose in einer Konzentration von 0 bis 5,56 mM, 18 und 120 Stunden
nach Insemination, keine stimulierenden oder hemmenden Effekte auf die
präimplantative Entwicklung. Die Ergebnisse von FERGUSON und LEESE (1999)
zeigen, dass Triglyzeride als Energiequelle während der IVM und IVF von
Rinderoozyten verwendet werden können. Die gleichzeitige Anwesenheit von Serum
kann jedoch zu einer übermäßigen Akkumulation der Triglyzeride zu Beginn der IVK
führen.
Durch Kokultur mit BOEC sind in vitro gute Teilungs- und Blastozystenraten zu
erzielen (FUKUI, 1990). LIM et al. (1996) haben gezeigt, dass ein serumfreies
Medium, mit BSA supplementiert, erfolgreich für ein Kokultursystem mit CZ für
Rinderembryonen eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse von LIM et al. (1999)
lassen vermuten, dass der Zusatz von Hämoglobin zu einem Kokultursystem mit CZ
die Synthese von Stickoxid in den Cumulus- und Granulosazellen hemmt und so die
Embryonalentwicklung verbessert. Die Anwesenheit von Stickoxid in den
Kultursystemen blockiert das Schlüpfen der Blastozysten. In vivo kann Stickoxid am
embryonalen Frühtod durch eine mütterliche Immunreaktion sowie Störungen bei der
Aufrechterhaltung der Trächtigkeit beteiligt sein (LIM et al., 1996).
Der Zusatz von CZ zu einem serumfreien Kulturmedium verbessert die
Embryonalentwicklung, so dass eine serumunabhängige embryotrophe Wirkung der
CZ vermutet werden kann. Die Entfernung der CZ vor Kulturbeginn kann die
Embryonalentwicklung verhindern. Serumfreie Medien beeinflussen die Proliferation
der CZ ohne die Embryonalentwicklung zu verändern (LIM et al., 1996).
Einflussfaktoren
Freie Sauerstoffradikale reagieren mit Zellproteinen, Lipiden und anderen
Zellsubstraten, was die Deaktivierung von Enzymen, die Peroxidation der
Lipidmembranen und Störungen der DNA zur Folge haben kann (YU, 1994). Die
Produktion freier Sauerstoffradikale hängt partiell von den Kulturbedingungen ab, wie
Literatur
41
z.B. dem Sauerstoffpartialdruck oder der Glucosekonzentration (IWATA et al., 1998).
Die genauen Ursachen der Bildung solcher Radikale unter In-vitro-Bedingungen ist
aber noch nicht ganz geklärt (IWATA et al., 1999). Die letztgenannten Autoren
vermuteten, dass die Reaktion der Xanthinoxidase mit Hypoxanthin an diesem
Prozess beteiligt ist, da der Zusatz von Allopurinol, einem Antagonisten der
Xanthinoxidase, in Kultursystemen mit hohem Sauerstoffpartialdruck eine
Embryonalentwicklung ermöglicht. Der positive Effekt der Verwendung von
Antioxidantien oder eines niedrigeren Sauerstoffpartialdruckes in den
Kultursystemen wurde jedoch nur beobachtet, wenn frühe Embryonalstadien in m-
SOF kultiviert wurden (IWATA et al., 1998). LUVONI et al. (1996) beschreiben eine
antioxydative Wirkung von Glutathion für Gameten und Embryonen.
Die Supplementierung des Kulturmediums mit 30 oder 100 µM Coenzym Q10, einer
wesentlichen Komponente des Transportsystems von Ionen durch die
Plasmamembran und von Elektronen in die innere Membran der Mitochondrien,
kann die Teilungsrate, die Schlupfrate, die innere Zellmasse und die Zellzahl des
Trophectoderms bei Rinderembryonen erhöhen (STOJKOVIC et al., 1999). Wenn
1,0 µg/ml Zink dem Kulturmedium zugesetzt wurde, beobachteten STEPHENSON
und BRACKETT (1999) eine Hemmung der 2- bis 4-Zellstadien. HOLM et al. (1999)
berichten über embryotrophe Effekte von Zitrat. Es kann die Fettsäuresynthese
stimulieren und bindet Metall-Ionen (z.B. Ca2+). Außerdem wird die
Embryonalentwicklung bis zur Blastozyste durch PDGF (platelet-derived growth
faktor) (ECKERT u. NIEMANN, 1996), Arachnoidonsäure, Gluthation, FGF (fibroblast
growth faktor), Insulin, Transferrin und Selen stadiumsspezifisch reguliert (LIM u.
HANSEL, 2000).
Unabhängig vom verwendeten Kulturmedium ereignet sich eine Hemmung der
embryonalen Entwicklung meistens beim Übergang von 8- zum 16-Zellstadium,
(WRIGHT, JR. u. BONDIOLI, 1981).
In vitro produzierte Embryonen können Abweichungen hinsichtlich der Zahl der
Chromosomen und Störungen bei der Aktivierung der Gene zeigen. Die genaue
Bedeutung dieser Störungen für die Entwicklungskompetenz des Fetus und die
Trächtigkeit ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Einen Überblick über diese
Problematik geben HYTTEL et al. (2000). LIM et al. (1999) haben eine
jahreszeitliche Abhängigkeit der Blastozystenbildung beobachtet.
Literatur
42
In Abhängigkeit vom verwendeten IVK-System lassen sich Blastozystenraten
erzielen, die etwa zwischen 20 und 43 % liegen (BEVERS et al., 1997; PARK et al.,
1997; HASHIMOTO et al., 1998; IWATA et al., 1998; HOLM et al., 1999; MERTON
et al., 2003).
2.4 Eizellaktivierung
Im Verlauf der In-vivo- als auch der In-vitro-Fertilisation finden in den durch die
Spermienpenetration aktivierten Oozyten eine Reihe wesentlicher morphologischer
und biochemischer Veränderungen statt (ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001), die zur
Befruchtung und zur Entwicklung eines neuen Individuums führen (WHITTINGHAM,
1980; HYTTEL et al., 1989). Unter Aktivierung versteht man bei Oozyten die
Wiederaufnahme der Meiose mit der Abschnürung des zweiten Polkörperchens und
die Freisetzung der kortikalen Granula, die als wesentliche Ereignisse für die
normale Embryonalentwicklung angesehen werden. Die Aktivierung kann jedoch
auch spontan erfolgen oder durch einen künstlichen Stimulus hervorgerufen werden,
ohne dass die Oozyte Kontakt mit Spermien gehabt hat. Die Aktivierung einer
Oozyte ohne Eindringen eines Spermiums führt zum Phänomen der
Parthenogenese. Das folgende Kapitel gibt einen Überblick über die mit der
Aktivierung assoziierten Prozesse.
2.4.1 Spontane Aktivierung in vitro
Bei der IVP von Embryonen werden die Oozyten maturiert, damit sie die erste
Reifungsteilung durchlaufen und das Stadium der M-II erreichen. Danach werden die
Oozyten durch die Penetration der Spermien aktiviert und beginnen mit der
Embryonalentwicklung (KUBIAK, 1989). Unter experimentellen Bedingungen kann
neben der Aktivierung durch Fertilisation auch eine spontane parthenogenetische
Aktivierung beobachtet werden (KING et al., 1988; MARTINI et al., 2000). In beiden
Fällen steigt die Aktivierungsrate zeitabhängig an (WARE et al., 1989; KUBIAK,
1989; PLANTE u. KING, 1996; SUZUKI et al., 1999; MARTINI et al., 2000).
In den Experimenten von KING et al. (1988) ergaben chromosomale Analysen, dass
von den aktivierten Oozyten die Mehrheit (74,4 %) haploid war. Daraus
Literatur
43
schlussfolgerten die Autoren, dass die Aktivierung während oder nach der
Vollendung der M-II stattfindet.
Die Ergebnisse von MARTINI et al. (2000) lassen vermuten, dass die Anfälligkeit der
Oozyten für eine spontane parthenogenetische Aktivierung durch die Anwesenheit
von CZ bzw. die Corona radiata beeinflusst wird. Wenn bei der IVM von
Mausoozyten Medien mit geringem Ca2+/Mg2+- oder Ca2+-Gehalt verwendet wurden,
resultierte aus der zweiten meiotische Teilung ein signifikant höherer Anteil Oozyten
mit nicht abgeschnürtem Polkörperchen. War dagegen nur der Mg2+-Gehalt im
Medium niedrig, so war der Anteil an Oozyten mit normal abgeschnürtem
Polkörperchen erhöht. Die Ursache für diese Beobachtungen ist nicht bekannt.
Änderungen des Niveaus von Cae und Mge könnten einen Effekt auf die Struktur des
Zytoskeletts und die Funktion der Oozyten haben (AZIM et al., 1977; WANG et al.,
1999). Mineralöl erhöht die Parthenogeneserate nach 22-stündiger Inkubation
(MARTINI et al., 2000).
WARE et al. (1989) konnten nachweisen, dass es durch die artifizielle Denudierung
zur spontanen Aktivierung der Oozyten kommen kann. In ihren Versuchen wurde der
höchste Anteil an Aktivierung wie in den Kontrollgruppen nach ca. 26 Stunden
Alterung der Oozyten erreicht.
Die Tabelle 2.5 gibt einen Überblick über Untersuchungsergebnisse zur spontanen
Aktivierung bei unterschiedlichen Reifungszeiten und Spezies.
Literatur
44
Tabelle 2.5: Ergebnisse zur spontanen Aktivierung unbehandelter Oozyten
Spezies IVM (+ Alterung) in h aktiviert (%) Autoren
Schwein 48 (+ 18) 0,0 DIDION et al. (1990)
48 13,1 SAITO et al., (1993)
Maus 18 (+ 6 bis 8) 0,0 DIDION et al. (1990)
16 bis 17 6,0 ONODERA und TSUNODA (1989)
Kaninchen 16 bis 17 0,0 ONODERA und TSUNODA (1989)
Rind 24 (+ 28 bis 29) 44,0 COLLAS und BARNES (1992)
24 0,0 KONO et al. (1989)
24 0,0 NAGAI (1987)
23 bis 24 4,0 YANG et al. (1994)
30 21,0 WARE et al. (1989)
30 5,0 AOYAGI et al. (1992)
40 58,0 SUZUKI et al. (1999)
40 57,0 PRESICCE und YANG (1994a)
2.4.2 Künstliche Aktivierung Die Fertilisation ist der physiologische Stimulus, um die in der M-II arretierten
Oozyten in die Interphase zu überführen. Aber unter bestimmten Umständen können
in der M-II arretierte Oozyten auch ohne Fertilisation diese Phase beginnen
(MCCONNELL et al., 1995). Oozyten erreichen ihre Aktivierungsfähigkeit als einen
der letzten Schritte im Prozess der Maturation (WARE et al., 1989). Die Alterung der
Oozyten scheint für die parthenogenetische Aktivierung von follikulären
Rinderoozyten in vitro nötig zu sein (NAGAI, 1987; WARE et al., 1989; KUBIAK,
1989; FUKUI et al., 1992; MINAMIHASHI et al., 1993; SUZUKI et al., 1999). Die
alterungsabhängigen ultrastrukturellen Veränderungen der Oozytenoberfläche
korrelieren stark mit der alterungsabhängigen Aktivierung (SUZUKI et al., 1999).
Literatur
45
GRAHAM (1974) meinte, dass das Wesen der Aktivierung darin besteht, die
Oozyten zu schädigen, ohne sie zu töten. Die parthenogenetische Aktivierung von
unbefruchteten Oozyten kann durch elektrische Impulse (WARE et al., 1989;
ONODERA u. TSUNODA, 1989; COLLAS et al., 1989; COLLAS et al., 1993a;
SUZUKI et al., 1999), Ca-Ionophor (WARE et al., 1989; LIU et al., 1998a; YAMANO
et al., 2000), Phorbolester Anästhetika und Alkohol (CUTHBERTSON, 1983;
KUBIAK, 1989), Ca2+/Mg2+-freie Medien, sowie durch Hitze-/Kälteschock
(KAUFMAN, 1983) erreicht werden. Es ist schwierig, in der Vielfalt der Faktoren, die
zur Aktivierung führen, eine spezifische Gemeinsamkeit zu entdecken
(WHITTINGHAM, 1980). Definitionsgemäß werden Oozyten, die in ihrer Entwicklung
bis zur Telophase oder Vorkernbildung vorangeschritten sind, als aktiviert betrachtet
(WARE et al., 1989). Oozyten können durch Stoffe aktiviert werden, die eine
Erhöhung des Cai bewirken (BEMENT, 1992). Diese Erhöhung erfolgt entweder
durch Influx von Cae nach Behandlung mit Ethanol oder elektrischen Impulsen, oder
durch spezifische Ionophore, die das Calcium aus intrazellulären Vorräten freisetzen
(LIU et al., 1998b). Eine einzelne, kurzzeitige Erhöhung des Cai kann die frühen
Aktivierungsereignisse induzieren, welche durch die Wiederaufnahme der Meiose
und die Arretierung in der Metaphase-III (M-III, Metaphasenstadium mit 2
Polkörperchen), die Kortikalreaktion und die Änderungen der Glycoproteine der ZP
charakterisiert sind. Sie kann aber nicht spätere Ereignisse, wie die Vorkernbildung,
die DNA-Synthese und die Zellteilung induzieren (SOLOY et al., 1997). Bei einem zu
niedrigem Cai-Niveau durchlaufen zwar die meisten Oozyten die Meta- und
Anaphase, erreichen aber nach Abschnürung des zweiten Polkörperchens nicht die
Interphase und werden so in der M-III arretiert (VINCENT et al., 1992). Diese
Arretierung ähnelt der in der M-II und kann durch eine erneute Aktivierung
aufgehoben werden (KUBIAK, 1989).
Ablauf der Aktivierung
Verschiedene Mechanismen sind an den sehr frühen Stadien der
parthenogenetischen und normalen Embryonalentwicklung beteiligt. Ihnen
gemeinsam ist die Deaktivierung des MPF (MCCONNELL et al., 1995), welche die
Voraussetzung zur Vorkernbildung und weiteren embryonalen Entwicklung ist (LIU et
al., 1998b). Diese Deaktivierung des MPF erfolgt durch eine Erhöhung des Cai und
Literatur
46
die Aktivierung der PKC, welche mit dem Wiederbeginn des Zellzyklus und der
Kortikalreaktion korrelieren (RAZ et al., 1998a).
COLLAS et al. (1993b) vermuten, dass die Abnahme der Aktivität der Histon-1-
Kinase, die vermutlich MPF-Aktivität besitzt, an der Einleitung der Aktivierung der
Oozyten beteiligt ist. Bei der Beendigung der M-II, also während der Abnahme der
Aktivität der mitogen activating proteinkinase (MAPK) (SAGATA, 1996), korrelliert sie
mit der Dekondensierung der Chromosomen und dem Beginn der Vorkernbildung.
Die Deaktivierung des MPF und der MAPK erfolgt wahrscheinlich über zwei
unabhängige Prozesse. Eine erhöhte Aktivität der MAPK kann zur Stabilisierung des
Spindelapparates beitragen, und die Inaktivierung ist mit der Bildung des
mikrotubulären Netzes im Zytoplasma assoziiert (LIU et al., 1998a).
HUNT (1989) vermutete einen oder mehrere zytoplasmatische Faktoren, die eine
zytostatische Funktion besitzen und während der meiotischen Reifung in M-II-
arretierten Oozyten anwesend sind. Dieser zytostatic factor (CSF) kann vermutlich
die Oozyten in der Metaphase halten und den Übergang zur Interphase verhindern.
In voll aktivierten Oozyten (definiert durch die Vorkernbildung) findet eine schnelle
Deaktivierung des MPF statt und die Deaktivierung der MAPK geht dieser voraus. Im
Gegensatz dazu bleibt in Oozyten, die nur teilweise aktiviert wurden (definiert durch
den Abschluss der M-II ohne Vorkernbildung), die Aktivität der MAPK hoch, obwohl
der MPF deaktiviert ist (LIU et al., 1998a). Die Beobachtungen der letztgenannten
Autoren lassen vermuten, dass die MAPK eine enge Beziehung zum CSF oder zur c-
mos proto-oncogene kinase (c-Mos), einer Schlüsselkomponente des CSF, hat und
dass die MAPK nicht die Kinase ist, die den MPF stabilisiert. MAPK kann nicht in der
ersten mitotischen Teilung aktiv sein (LIU et al., 1998a).
Die Aktivierung der PKC ist ein ausreichendes und notwendiges Signal, um die
Wiederaufnahme des Zellzyklus und die Bildung des zweiten Polkörperchens
(COLONNA et al., 1989), unabhängig von der Aktivität des Calciums zu veranlassen
(BEMENT, 1992). COLONNA et al. (1997) schlussfolgern aus ihren Ergebnissen,
dass bei Mausoozyten der Mechanismus, mit dem ein vorübergehender Ca-Anstieg
die Inaktivierung des MPF auslöst, von der PKC abhängig ist. Wenn die PKC
gehemmt wird, bleibt die Zunahme des Cai und damit die Inaktivierung des MPF aus
und die Oozyten verbleiben in der M-II.
Literatur
47
Eine einzelne Calciumstimulation kann den MPF vorübergehend inaktivieren, aber
weitere Stimulationen mit Calcium sind notwendig, um neu synthetisiertes Cyclin und
verwandte Proteine zu zerstören und damit den inaktivierten Zustand des MPF
aufrechtzuerhalten (COLLAS et al., 1993b). Möglicherweise kann eine einzelne
Calciumstimulation, gefolgt von einer Behandlung mit einem Proteinsyntheseblocker,
ebenfalls die vollständige Aktivierung "kurz" gereifter Oozyten bewirken (SOLOY et
al., 1997; LIU et al., 1998b).
KUBIAK et al. (1993) fanden in aktivierten Rinderoozyten zwei Proteine, die
vermutlich mit den Mikrotubuli assoziiert und entscheidend für die Organisation oder
Stabilisierung des Spindelapparates sind. Sie sind nur in der Metaphase vorhanden
und ihr Verschwinden kann eine Voraussetzung für die Vorkernbildung sein. Ein
intakter Spindelapparat ist ihrer Meinung nach für die Zerstörung des Cyclin B und
die Inaktivierung des MPF erforderlich. Die von oben genannten Autoren
beschriebenen Proteine sind nach LIU et al. (1998b) auch an der Inaktivierung des
MPF beteiligt. In den Versuchen von LIU et al. (1998a) führte die Behandlung von
Oozyten mit 6-Dimethylaminopurine (6-DMAP), einem Inhibitor der Proteinsynthese,
zur sofortigen Zerstörung des Spindelapparates.
Einflussfaktoren
In den Versuchen von CHIAN und SIRARD (1995) unterschied sich die Protein-
synthese nach der Aktivierung in Oozyten mit intaktem Cumulus gegenüber der in
denudierten Eizellen. So wurden bestimmte Proteine nur bei den Oozyten mit
intaktem Cumulus synthetisiert, die mit der Bildung des männlichen Vorkernes
korrelieren könnten.
Die Zeit bis zur Auslösung der Aktivierungsprozesse hängt von der Art der
Aktivierung ab. So ist sie beispielsweise kürzer in Reaktion auf die Penetration eines
Spermiums als in Reaktion auf eine parthenogenetische Aktivierung mit Ethanol
(KUBIAK, 1989). Aktivierte Oozyten treten nicht alle gleichzeitig in die S-Phase ein.
Andererseits reflektiert der Anteil der Oozyten in der S-Phase den Anteil Eizellen, der
einen vollständigen Vorkern entwickelt hat. Nur solche Vorkerne können DNA
synthetisieren (SOLOY et al., 1997).
LANE und BAVISTER (1998) berichteten, dass Rinderoozyten, wenngleich auch auf
einem niedrigeren Niveau als 2-8-Zell-Embryonen, fähig sind, den pHi mittels
Austausch von Na+- und H+-Ionen zu regulieren (Na+ /H+ antiport activity).
Literatur
48
RUDDOCK et al. (2000b) konnten während der parthenogenetischen Aktivierung
porciner Oozyten mit 7 % Ethanol oder mit 50 µM bzw. 100 µM Ca-Ionophor A23187
signifikante Änderungen des pHi beobachten. Bei bovinen Oozyten kam es nur bei
einer Aktivierung mit 50 oder 100 µM A23187 zu einer Erhöhung des pHi. Da bei
murinen Oozyten ähnliche Beobachtungen gemacht wurden, schlussfolgern die
Autoren, dass Säugeroozyten den antiport-Mechanismus einsetzen können, um
während der Aktivierung den pHi zu erhöhen. Die von RUDDOCK et al. (2000a)
publizierten Untersuchungsergebnisse zur Aktivierung porciner Oozyten mit
Thimerosal bzw. Ca-Ionophor lassen den Schluss zu, dass der Na+/H+ Antiport-
Mechanismus und der Austausch von HCO3-/Cl--Ionen keine Rolle bei der
Veränderung des pHi spielen. Die Zunahme des pHi, die während einer Behandlung
mit 7 % Ethanol beobachtet werden konnte, führen die Autoren auf den Ausfluss von
Natrium und/oder Bikarbonat zurück.
Die Studie von RAZ et al. (1998b) zeigt die Existenz heller und dunkler kortikaler
Granula, die sich hinsichtlich ihrer Anzahl, Verteilung in der Oozytenkortex und
Sensibilität gegenüber parthenogenetisch wirkender Agenzien unterscheiden.
Spermienpenetrationen oder hohe Konzentrationen von Aktivatoren führen zur
Freisetzung sowohl der hellen als auch der dunklen kortikalen Granula und somit zu
einer kompletten Kortikalreaktion. Niedrige Konzentrationen von Aktivatoren
verändern die Dichte der Granula und das Verhältnis von dunkler zu heller kortikaler
Granula. Darüber hinaus bewirken sie eine partielle Kortikalreaktion, die ausreicht,
um einen Polyspermieblock zu verursachen. Die Autoren stellen die Hypothese auf,
dass es einen Unterschied in der Dispersion des Exsudates der kortikalen Granula
nach Fertilisation im Vergleich zu der nach parthenogenetischer Aktivierung gibt und
dafür unterschiedliche Membranpermeabilitäten verantwortlich sein könnten.
In vitro maturierte Rinderoozyten haben eine unterschiedliche parthenogenetische
Aktivierungsfähigkeit, die von der An- bzw. Abwesenheit von CZ und dem Zusatz von
FSH zum Maturationsmedium abhängig ist (CHIAN u. SIRARD, 1995). Verschiedene
zytoplasmatische Faktoren können die Antwort der Oozyten auf Aktivierungsreize
beeinflussen. TAO et al. (2000) vertraten die Ansicht, dass Oozyten, die in
definierten Medien gereifte wurden, auf Grund einer besseren zytoplasmatischen
Reifung eine bessere Aktivierungsfähigkeit besitzen.
FUKUI et al. (1992) untersuchten den Effekt der An- oder Abwesenheit von CZ zum
Zeitpunkt der künstlichen Aktivierung mit Ethanol und Cytochalasin B. Sie konnten
Literatur
49
keine Beeinflussung der Teilung und der Entwicklung bis zum Blastozystenstadium
feststellen. Im Gegensatz dazu beobachteten SHAW und TROUNSON (1989), dass
nach 6-stündiger IVK signifikant weniger Oozyten degenerierten, wenn die CZ vor
der Aktivierung entfernt wurden. LIU et al. (1998b) stellten fest, dass Behandlungs-
und Inkubationsmedien ebenfalls wichtige Faktoren für den Prozess der Aktivierung
darstellen.
Elektrische Stimulation
Im Vergleich zu Mausoozyten scheint die Toleranz boviner Oozyten gegenüber einer
elektrischen Stimulation wesentlich geringer zu sein, da ihre weitere Entwicklung
verringert ist (KONO et al., 1989). Die Wirksamkeit dieser Methode hängt aber u.a.
auch von der Qualität der Elektroporation, dem Medium, der optimalen Kombination
der Feldstärke mit der Pulsdauer, der richtigen Lokalisation der Oozyten zwischen
den Elektroden und der Größe der genutzte Kammer ab (COLLAS et al., 1989;
ESCRIBA u. GARCIA-XIMENEZ, 1999). Die Aktivierungsrate steigt mit der Dauer
der Impulse (OZIL, 1990) und ihrem zeitlichen Abstand (COLLAS et al., 1989). Die
Aktivierung durch elektrische Impulse funktioniert wahrscheinlich dadurch, dass sie
die Membranpermeabilität verändern (ZIMMERMANN u. VIENKEN, 1982) und eine
schnelle und komplette Kortikalreaktion, ähnlich wie bei der Fertilisation, induziert
wird (ZAMBONI et al., 1976). Die elektrische Aktivierung führt zur Depolarisation der
vitellinen Membran sowie zu einem reversiblen Bruch der Plasmamembran.
Außerdem werden Poren erzeugt, was gemeinsam mit der Depolarisation dazu führt,
dass sich das Cai verändert (WHITTINGHAM, 1980). Die alleinige Umsetzung der
COK aus dem Kultur- in das Aktivierungsmedium (Mannitol) führte in den Versuchen
von COLLAS et al. (1993a) zu einer wiederholbaren Erhöhung des Cai und zu einer
Aktivierung von 70 % der Oozyten.
KONO et al. (1989) behandelten Oozyten mit Cytochalasin B, um die Abschnürung
des zweiten Polkörperchens zu unterdrücken. Deren elektrische Stimulation führte
bei 80 % der Oozyten zur Aktivierung, wobei die meisten aktivierten Oozyten zwei
weibliche Vorkerne hatten. YANG et al. (1994) konnten die Aktivierungsrate von
Oozyten, welche 24 Stunden lang gereift wurden, durch elektrische Stimulation
deutlich erhöhen, wenn diese anschließend Ethanol ausgesetzt wurden.
Literatur
50
Ca-Ionophor A23187
Das Ca-Ionophor A23187 aktiviert Oozyten einer großen Anzahl Spezies durch
Induktion einer intrazellulären Ca2+-Freisetzung, welche eine Kaskade von
Ereignissen die mit der Fertilisation assoziiert sind (STEINHARDT et al., 1974;
WASSARMAN, 1987), auslöst. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Ca-Ionophor
eine einzelne Erhöhung des Cai in M-II-Oozyten verursachen kann, und dass dies
zur Aktivierung mehrerer Ca-abhängiger proteolytischer Reaktionsmechanismen, zur
Zerstörung von Cyclin B (MCCONNELL et al., 1995), zur Reduktion der MPF-
Aktivität und zur Wiederaufnahme der Meiose führt (LIU et al., 1998a). GOTO et al.
(1990) fanden, dass hohe Konzentrationen (100 µM) von Ca-Ionophor A23187 die
Entwicklung der Embryonen aus spermainjizierten Rinderoozyten im 6 bis 12-
Zellstadium hemmen. JILEK et al. (2000) beobachteten eine Hemmung der
Embryonalentwicklung vor dem Morula- und Blastozystenstadium, wenn 50 µM für
die Aktivierung benutzt wurden. Wenn die verwendete Konzentration niedrig ist,
scheint die Substanz nicht zytotoxisch für Oozyten zu sein (TESARIK u. SOUSA,
1995). Gealterte Oozyten (40 h IVM) führen den Prozess der Aktivierung nach
Behandlung mit A23187 (LIU et al., 1998a) bzw. 7 % Ethanol gefolgt von CHX
(PRESICCE u. YANG, 1994a) schneller durch, als 24 h gereifte Oozyten. Zusätzlich
ist die Kernreifung fortgeschrittener (PRESICCE u. YANG, 1994a).
Oozyten, mit oder ohne CZ während der Kultur, begannen in den Versuchen von
CHIAN u. SIRARD (1995) 5 h nach Aktivierung einen Vorkern zu bilden. Der Start
der DNA-Synthese wurde nur geringfügig und nicht signifikant vom Reifungsalter der
Oozyten beeinflusst (SOLOY et al., 1997). Die Behandlung der Oozyten mit Ca-
Ionophor A23187 zur parthenogenetischen Aktivierung ist in Hinblick auf die
Stimulation der DNA-Synthese effektiver als eine elektrische Stimulation (SOLOY et
al., 1997; BODÓ et al., 1998).
Die Versuche von MCCONNELL et al. (1995) haben gezeigt, dass nur Oozyten im
M-II-Stadium auf Ca-Ionophor reagieren können. Eine optimale parthenogenetische
Entwicklung von kurz gereiften Oozyten wird durch Behandlung mit Ca-Ionophor
nach Inkubation mit 6-DMAP, CHX (GROCHOLOVA et al., 1997) oder CHX plus
Cytochalasin (LIU et al., 1998b) erreicht. Die Behandlung mit Ca-Ionophor A23187
plus 6-DMAP führt zur Hemmung der Abschnürung des zweitens Polkörperchens
sowohl bei jungen als auch bei gealterten Oozyten. Folglich scheint dieses
Literatur
51
Phänomen weniger mit dem Reifungsalter als vielmehr mit der Wirkung 6-DMAP-
abhängiger Kinasen assoziiert zu sein (LIU et al., 1998a). Die Fähigkeit von Oozyten
durch Ca-Ionophor aktiviert werden zu können, ist unabhängig von ihrer
chromosomalen Maturation und hängt von der Entwicklung einer/s
zytoplasmatischen Komponente oder Komplexes ab, welche/r fähig ist, die Zeit ab
der Einleitung des GVBD zu kontrollieren (DUCIBELLA et al., 1990; MCCONNELL et
al., 1995).
Bei unbehandelten Kontrolloozyten sinkt die Aktivität der Histon-1-Kinase zwar
allmählich ab, bleibt aber im Vergleich zu aktivierten Oozyten auf einem höheren
Niveau (LIU et al., 1998a). Das Phänomen, dass die gealterten Oozyten, nicht aber
die jungen durch eine Behandlung mit A23187 vollständig aktiviert werden konnten
(Entwicklung eines Vorkernes), erklärten die Autoren wenigstens teilweise mit der
niedrigen Histone-1-Kinase- und MAPK-Aktivität in den alten Oozyten nach deren
Behandlung.
Der von Ca-Ionophor verursachte Einstrom von Ca2+-Ionen inaktiviert vermutlich den
MPF über die calmodulinabhängige Kinase II (CaMKII) und spielt eine wichtige Rolle
bei der Abschnürung des zweiten Polkörperchens (YAMANO et al., 2000).
Die Behandlung von Oozyten, welche 24 h gereiften wurden, mit A23187 führt zur
Abschnürung des zweiten Polkörperchens und Arretierung einer als M-III
bezeichneten Metaphase (KUBIAK, 1989). In den Untersuchungen von LIU et al.
(1998a) begann die Bildung des Vorkerns und des mikrotubulären Netzes bereits 3 h
nach einer gleichen Behandlung. Die mitotische Metaphase bzw. Anaphase wurde
nach 15 h bei 45 % der Oozyten beobachtet. In den Versuchen von SOLOY et al.
(1997) hatte die überwiegende Mehrheit (97 %) der aktivierten Oozyten ein zweites
Polkörperchen abgeschnürt und einen einzelnen Vorkern gebildet.
Wenn unbefruchtete Oozyten von einem Spermium penetriert und mit einer
Kombination von Ca-Ionophor und Puromycin aktiviert werden, können sich, ähnlich
wie bei normal befruchteten Oozyten, zwei Vorkerne - ein weiblicher und ein
männlicher – bilden und ein zweites Polkörperchen abgeschnürt werden (YAMANO
et al., 2000), obwohl Puromycin die Bildung eines männlichen Vorkerns hemmen
kann (NAKAGAWA et al., 2001). Zu ähnlichen Ergebnissen kamen CHUNG et al.
(2000), die penetrierte Rinderoozyten mit A23187 und 6-DMAP behandelten. Die
Behandlung mit Puromycin ohne Ca-Ionophor resultiert in Parthenoten mit zwei
haploiden Vorkernen oder einem diploiden Vorkern ohne Abschnürung des zweiten
Literatur
52
Polkörperchens. Es ist unbekannt, warum die Kombination von Ca-Ionophor und
Puromycin zur Abschnürung des zweiten Polkörperchens führt (YAMANO et al.,
2000).
Weitere aktivierende Substanzen
Eine IVK Ionophor-behandelter Oozyten mit Okadaicsäure, einem Blocker der
Proteinphosphatasen 1 und 2A, verhindert deren Aktivierung. Die gleiche Wirkung
hat Okadaicsäure bei aktivierten Oozyten, die anschließend mit CHX kultiviert
werden. GROCHOLOVA et al. (1997) schlussfolgern aus diesen Beobachtungen,
dass die Proteinphosphatasen 1 und 2A eine wichtige Rolle während des Übergangs
von der M-II zur Interphase nach der Aktivierung spielt.
Der Zusatz von Cytochalasin D, einem zytoskelettalen Blocker, bei einer
kombinierten Behandlung mit Ca-Ionophor und CHX kann die Teilungsrate und die
Blastozystenentwicklung verbessern. Erfolgt die Behandlung ohne CHX, tritt dieser
Effekt nicht auf (LIU et al., 1998b). Die Behandlung mit CHX nach einer Aktivierung
mit Ca-Ionophor A23187 kann auch die Aktivierungsrate verbessern (JILEK et al.,
2000).
Die Bedeutung der Reduktion der Proteinsynthese für den Übergang zur Interphase
nach der Aktivierung wurde für porcine (GROCHOLOVA et al., 1997) und bovine
Oozyten (YANG et al., 1994) nachgewiesen. Die funktionelle Aktivität des MPF hängt
von bestimmten im Zytoplasma synthetisierten Proteinen kurz maturierter Oozyten
ab (YANG et al., 1994; BODÓ et al., 1998). Deshalb erreichen junge bovine Oozyten
das gleiche Aktivierungsniveau wie gealterte Oozyten, wenn sie nach der Stimulation
mit einem Inhibitor der Proteinsynthese kultiviert werden (YANG et al., 1994). Das
CHX führt nicht nur zu einer Dezimierung der Proteine, welche die MPF-Aktivität
erhalten (BODÓ et al., 1998), sondern kann auch die Translation von
zytoplasmatischen Proteinen verhindern und auf diese Weise den Beginn der DNA-
Replikation kontrollieren. Die Inhibition der DNA-Synthese durch Blockierung der
Translation befähigt CHX auf diese Weise, den Vorkern und den zytoplasmatischen
Anteil der Oozyte zu synchronisieren (SOLOY et al., 1997).
Die Ergebnisse von BODART et al. (2001) zeigen, dass 6-DMAP eine Erhöhung des
Cai auslöst. Die Vorkernbildung wird durch 6-DMAP und Puromycin beschleunigt,
entweder direkt durch Hemmung der Phosphorylierung der Lamin-Proteine oder
indirekt durch Deaktivierung der MAPK, welche eine Komponente des CSF in
Literatur
53
Rinderoozyten ist (LIU et al., 1998a). SAGATA (1996) berichtete, dass die MAPK
wahrscheinlich Stimulatoren des MPF (z.B. cdc25) aktivieren oder Inhibitoren (z.B.
Proteinphosphatase 2A) hemmen kann. Der Autor stellte deshalb die Hypothese auf,
dass Puromycin die Aktivität des MPF über die Inaktivierung der MAPK verringert,
woraus die Bildung eines Vorkernes resultiert.
PRESICCE und YANG (1994a) gingen davon aus, dass CSF ständig in jungen, nicht
aber in gealterten Oozyten synthetisiert wird, so dass nur letztere unmittelbar durch
eine einzelne Ca2+-Erhöhung aktiviert werden können. Die jungen Oozyten können
sowohl über präsynthetisierten als auch ständig neu synthetisierten CSF verfügen.
Der neu synthetisierte CSF kann durch eine einzelne Ca2+-Erhöhung nicht
beeinflusst werden, was die schwache Reaktion junger Oozyten auf die Behandlung
mit Ethanol erklären könnte. Die Ergebnisse von COLLAS et al. (1989) stützen die
Hypothese, dass gereifte Oozyten ständig eine Gruppe empfindlicher Proteine mit
kurzer Halbwertzeit synthetisieren, wie zum Beispiel CSF oder c-Mos, welche die
Funktion des MPF aufrechterhalten. Weil die Behandlung der Oozyten mit Ethanol
eine Welle von Cai freisetzt, werden diese empfindlichen Proteine inaktiviert.
Zusätzlich verhinderte der Proteinsyntheseblocker CHX die Neusynthese von
Proteinen, was zum Abbau von Cyclin B und folglich zur Deaktivierung des MPF
führt (YANG et al., 1994).
Cytochalasin B hemmt die Abschnürung des Polkörperchens und kann die
Blastozystenentwicklung signifikant verbessern (LIU et al., 1998b). Die
Untersuchungen von WARE et al. (1989) zeigten, dass Cytochalasin B bei
Rinderoozyten nicht ihre Reaktion auf eine Aktivierung (z.B. durch Elektroschock)
verändert.
Hyaluronidase hat nur eine geringe oder keine Fähigkeit in vitro gereifte
Rinderoozyten zu aktivieren (NAGAI, 1987; JOHNSON et al., 1990).
Cyclopiazonsäure, ein sehr wirksamer Blocker der endogenen Ca-abhängigen
ATPase, kann direkt Calcium aus intrazellulären Vorräten freisetzen und ist in der
Lage, in vitro porcine Oozyten parthenogenetisch zu aktivieren. Diese Aktivierung ist
jedoch sehr unvollständig, da die Exozytose der kortikalen Granula und die Fähigkeit
zur frühen Embryonalentwicklung bei mit Cyclopiazonsäure behandelten Oozyten
sehr gering ausgeprägt ist (PETR et al., 2000).
ALBERIO et al. (2000) konnten in vitro gereifte Oozyten durch Behandlung mit
Bohemine, einem synthetischen Blocker Cyclin-abhängiger Kinasen, erfolgreich
Literatur
54
aktivieren. Diese Wirkung konnte durch Kombination mit Ionomycin verbessert
werden.
LIU et al. (1998b) konnten beweisen, dass Wirkstoffe, die das Cai erhöhen, oder
Inhibitoren, welche die Proteinsynthese bzw. -phosphorylierung hemmen, niedrige
Teilungs- und Entwicklungsraten bewirken. Andere Autoren (PRESICCE u. YANG,
1994b; TATENO u. KAMIGUCHI, 1997; BODÓ et al., 1998) fanden in ihren
Untersuchungen, dass die kombinierte Behandlung zur Aktivierung von Oozyten die
wirksamste Methode ist. Auch BODÓ et al. (1998) konnten zeigen, dass eine
zusätzliche elektrische Stimulation zu einer chemischen Behandlungen mit CHX,
wahrscheinlich auf Grund einer synergistischen Wirkung, förderlich für die
Aktivierungsrate und folgende Entwicklung ist.
In Tabelle 2.6 sind Angaben und Ergebnisse zur Aktivierung von Oozyten
verschiedener Spezies mit verschiedenen Stimuli zusammengefasst.
Literatur
55
Tabelle 2.6: Angaben und Ergebnisse zur Aktivierung von Oozyten verschiedener
Spezies mit verschiedenen Stimuli
Spezies Behandlungsart Aktivierungsrate (%)
Autoren
Maus Elektrische Stimulation 30,0(g); 61,0(d); 78,0(b)
7 % Ethanol 22,0(g)
8 % Ethanol 88,4(e)
OAG 80,0(o)
Ca-Ionophor + 6-DMAP 46,2(y)
Ca-Ionophor + Puromycin
90,0(y)
Schwein Elektrische Stimulation 14,0(g); 67,0(j)
7 % Ethanol 7,0(g); 47,0(j)
Ethanol + Elektrische Stimulation
16,0(g)
Cyclopiazonsäure 64,0(z)
Ca-Ionophor A23187 52,0(j); 67,0(p)
Ca-Ionophor + 6-DMAP 88,0(bb)
Kaninchen Elektrische Stimulation 77,0(b); 100,0 (v)
Schaf Elektrische Stimulation 67,0(u)
Mensch Elektrische Stimulation
Ca-Ionophor + 6-DMAP
70,0(w)
75,0(t)
Ca-Ionophor + Puromycin
84,9(x); 90,0(t)
Rind Elektrische Stimulation 59,0(s); 90,0(i)(c); 84,0-88,0(f)(h)(k)
7 % Ethanol 36,0(l); 78,0-89,0(a)(cc)
Ca-Ionophor A23187 83,0(g); 91,0-97,0(c)(i)(m)(n)
7 % Ethanol + CHX 33,0-47,0(r); 94,0(l)
Ca-Ionophor + 6-DMAP 100,0(q)
Ca-Ionophor + CHX 100,0(q)(aa)
Ca-Ionophor + CHX + CD
100,0(q)
Ionomycin + Bohemine 87,5(dd)
(a) NAGAI (1987) (b) ONODERA und TSUNODA (1989) (c) WARE et al. (1989) (d) COLLAS et al. (1989) (e) KUBIAK (1989) (f) KONO et al. (1989) (g) DIDION et al. (1990) (h) COLLAS und BARNES (1992) (i) AOYAGI et al. (1992) (j) SAITO et al., (1993) (k) COLLAS et al. (1993a) (l) YANG et al. (1994) (m) CHIAN und SIRARD (1995) (n) SOLOY et al. (1997) (o) COLONNA et al. (1997) (p) GROCHOLOVA et al. (1997) (q) LIU et al. (1998b) (r) BODÓ et al. (1998) (s) SUZUKI et al. (1999) (t) YAMANO et al. (2000) (u) PUGH et al. (1991) (v) ESCRIBA und GARCIA-XIMENEZ (1999) (w) ZHANG et al. (1999) (x) NAKAGAWA et al. (2001) (y) NAKASAKA et al. (2000) (z) PETR et al. (2000) (aa) SHI et al. (1993) (bb) JILEK et al. (2000) (cc) MINAMIHASHI et al. (1993) (dd) ALBERIO et al. (2000)
Literatur
56
2.5 Bedeutung von Calcium für den Zellstoffwechsel
Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration stellen einen der zentralen
Signaltransduktionsmechanismen dar, die von lebenden Zellen zur Steuerung ihres
Stoffwechsels verwendet werden (PARRINGTON, 2001). Ca2+-Ionen aktivieren
zahlreiche Zielsysteme und vermitteln physiologische Effekte in Zellen (PETR et al.,
2000). Die meisten Zellen haben verschiedene Mechanismen entwickelt, um die
Konzentration von freiem Cai zu regulieren. Im Zusammenhang damit hat sich ein
System Ca-abhängiger Enzyme und Zellproteine entwickelt, das zahlreiche zelluläre
Funktionen beeinflussen kann (CAPCO, 2001). Da eine über längere Zeit erhöhte
intrazelluläre Calciumkonzentration zytotoxisch ist, kommt deren wirkungsvoller
Pufferung große Bedeutung zu (CLAPHAM, 1995; MISSIAEN et al., 2000).
In Säugetieroozyten wird Calcium sowohl mit spontaner als auch hormoninduzierter
meiotischer Maturation assoziiert (ZUELKE et al., 1991; HOMA, 1995). Oszillationen
des Cai könnten eine Rolle für das Zellwachstum spielen, da regelmäßige Cai-Gipfel
nach der Fertilisation von Säugetieroozyten beobachtet worden sind (MIYAZAKI et
al., 1993). Sie sind für die Eizellaktivierung zum Zeitpunkt der Fertilisation
verantwortlich (STEINHARDT et al., 1974; LOHKA u. MASUI, 1984; PARRINGTON,
2001). Das Spermium ist fähig, den autokatalytischen Prozess auszulösen, der zur
Ausbreitung eines starken Calcium-Signals in der Oozyte führt (YANAGIDA et al.,
2000). Darüber hinaus beeinflussen wiederholte Calcium-Wellen spätere Ereignisse,
wie zum Beispiel die Kompaktierung und Blastozystenbildung (OZIL, 1990).
Die Ergebnisse von RAZ et al. (1998a; 1998b) belegen einen mannigfaltigen Effekt
von Ca-Oszillationen und Aktivierung der PKC auf die Exozytose.
Der Einstrom von Ca2+-Ionen ist beim Säugetier für die Akrosomreaktion erforderlich
(SPUNGIN u. BREITBART, 1996; DRAGILEVA et al., 1999). Das Akrosom ist ein
potentieller Ca2+-Speicher (PARRISH et al., 1999; ROSSATO et al., 2001). Eine
intrazelluläre Calcium-Pumpe ist während der Kapazitation aktiv und reguliert das
Cai während der Akrosomreaktion (DRAGILEVA et al., 1999).
Es ist bekannt, dass Änderungen der intrazellulären Ca2+-Ionenkonzentration die
Genexpression in verschiedenen Zelltypen stimulieren (CLAPHAM et al., 1993;
NICOTERA et al., 1994; ROCHE u. PRENTKI, 1994; PUTNEY, JR. u. RIBEIRO,
2000) sowie an Prozessen wie Kontraktion, Übertragung von Nervensignalen
Literatur
57
(BERRIDGE, 1993), Sekretion und Apoptose (PUTNEY, JR. u. RIBEIRO, 2000)
beteiligt sind.
2.5.1 Ca2+-Ionen und Signalübertragung in Zellen
Calcium-Signale sind sowohl im Verhältnis von Zeit und Raum als auch von
Frequenz und Amplitude organisiert (ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Durch ihre
Lokalisation und integrierte Konzentration im Zytosol speichern Ca2+-Ionen
spezifische, temporäre Informationen (MISSIAEN et al., 2000). Wenn Zellen aktiviert
werden, besonders über Rezeptoren, die den Phosphoinositol-Signalpfad
verwenden, schwingt der Cai-Spiegel in einer Frequenz, die sich im Einklang mit der
Konzentration des Agonisten verändert. Solche frequenzcodierten Calciumpulse
können zur Übertragung von Informationen ins Zellinnere benutzt werden. Ein
regeneratives System, in dem Calcium seine eigene Freisetzung veranlasst
(MIYAZAKI, 1995), ermöglicht es dabei jedem Calciumpuls, sich im Zytosol in Form
einer Welle auszubreiten (JAFFE, 1993).
Ca-Oszillationen
Um die wellenförmige Ausbreitung von Ca2+-Ionen im Zytosol zu erklären, werden
verschiedene Hypothesen diskutiert. Bevorzugtes Modell ist hierbei die
calciuminduzierte Calciumfreisetzung (calcium induced calcium release, CICR)
(JAFFE, 1993). Dabei verteilen sich die Ca2+-Ionen vom Ursprung des Impulses weg,
bis sie auf den nächsten Calciumspeicher treffen und diesen anregen. Dieser
Speicher stellt dann die Ionen zur Verfügung, die für die weitere Ausbreitung der
Welle benötigt werden (BERRIDGE u. DUPONT, 1994).
Ca-Oszillationen entstehen durch periodisches Öffnen der Ca-Kanäle, entweder in
der Plasmamembran oder an den zytosolischen Ca-Vorräten (BERRIDGE u.
DUPONT, 1994; FOURNIER et al., 1994; MISSIAEN et al., 2000). Die Mehrheit der
Zellen verfügt über zytosolische Oszillatoren (BERRIDGE u. DUPONT, 1994).
Klassische membranständige Oszillatoren funktionieren durch periodisches Öffnen
spannungsabhängiger Ca-Kanäle (voltage-opened calcium-channels, VOCCs) im
Zusammenspiel mit Kalium-Kanälen (PAREKH et al., 1993; FOURNIER et al., 1994).
In einigen Zelltypen arbeitet dieser Oszillationstyp unabhängig von den Ca-Vorräten
im Zellinneren (BYRON u. TAYLOR, 1993). In anderen Zelltypen spielen aber solche
Literatur
58
Vorräte eine kritische Rolle bei der Aktivierung membranständiger Oszillatoren, die
auf einem kapazitativen Ca-Einstrom basieren. Dieser, durch Ca-Freisetzung
aktivierte Kanal (calcium release activated channel, CRAC), wird durch die
Entleerung der Cai-Vorräte geöffnet, wobei möglicherweise ein diffusibler Botenstoff
involviert ist (PAREKH et al., 1993). Die CRAC reflektieren eine dynamische
Wechselwirkung zwischen endoplasmatischem Retikulum, Mitochondrien und
Plasmamembran (GILABERT u. PAREKH, 2000). Eine Besonderheit von CRAC ist
seine Hemmung durch zytosolisches Calcium. Dieser negative Feedback könnte für
die periodische Öffnung und Schließung dieser Plasmamembrankanäle
verantwortlich sein (BERRIDGE u. DUPONT, 1994; FOURNIER et al., 1994).
Zytosolische Oszillatoren sind durch die periodische Freisetzung des Calciums aus
intrazellulären Vorräten charakterisiert. In dem komplizierten Muster der Ca-
Freisetzung können sinusförmige Gipfel (peaks) und ein Grundniveau (baseline)
unterschieden werden. Diese sinusförmigen Oszillationen können durch
entsprechende Schwankungen des IP3-Spiegels bedingt sein, was sich aus dem
Diacylglycerol / PKC Signalweg ergibt (BEMENT, 1992) und auf diese Weise einen
negativen Feedback bilden, um periodisch die agonistabhängige Synthese von IP3
zu hemmen (BIRD et al., 1993).
Die Spitzen (spikes) im Grundniveau, die in vielen Zelltypen gefunden wurden, sind
durch periodische Zacken charakterisiert, die sich über eine Grundlinie erheben,
welche für den ruhenden Ca-Spiegel gehalten wird. In vielen Zellen ist die Frequenz
solcher Grundniveauspitzen sowohl empfindlich gegenüber Veränderungen des
Agonisten als auch der Cae-Konzentration. Anders ausgedrückt, sind Ca-Wellen das
räumliche Gegenstück von Ca-Spikes. Diese haben oft eine präzise räumliche
Organisation, indem sie in einem Gebiet auftreten und sich dann nach außen durch
die Zelle als eine regenerative Ca-Welle ausbreiten, um den Rest der Zelle zu
erfassen (YAO u. PARKER, 1992; BERRIDGE u. DUPONT, 1994).
Regulation der Ca-Kanäle
Die intrazellulären Strukturen, die für die Freigabe des gespeicherten Calciums
verantwortlich sind, sind die IP3- und die Ryanodin-Rezeptoren (BERRIDGE u.
DUPONT, 1994; PETR et al., 2000; MISSIAEN et al., 2000). Beide sind sehr
dynamische Strukturen mit integrativen und regenerativen Eigenschaften, die
notwendig sind, um spontan Ca-Spikes zu generieren. Ihre beachtliche Homologie
Literatur
59
wird durch Ähnlichkeiten hinsichtlich der physiologischen Funktion unterstrichen. Das
trifft besonders auf den Prozess der CICR zu (BERRIDGE u. DUPONT, 1994).
Die beiden intrazellulären Ca-Kanäle werden von zwei verschiedenen Agonisten
kontrolliert, welche in einem Co-Mechanismus zusammenwirken (BERRIDGE u.
DUPONT, 1994). Für beide Rezeptortypen ist einer der Agonisten das Calcium (YAO
u. PARKER, 1992; CALLAMARAS u. PARKER, 1994). Die regenerativen
Eigenschaften von Ca-Spikes und die Ausbreitung der Ca-Wellen scheinen vom
Prozess der CICR abhängig zu sein. Ob die CICR stattfindet, wird von anderen
Agonisten kontrolliert, die spezifisch für jeden Rezeptor sind: IP3 für den IP3-
Rezeptor (BERRIDGE u. DUPONT, 1994) und zyklische ADP-Ribose (cADPR) für
den Ryanodin-Rezeptor (BERRIDGE u. DUPONT, 1994; FLUCK et al., 1999). IP3
und cADPR funktionieren durch Umwandlung des Zytosols in ein "reizbares
Medium", wobei dieses fähig wird, überschwellige Reize zu verstärken und dadurch
eine Tendenz zum Schwingen erhält (BERRIDGE u. DUPONT, 1994). IP3 und Ca2+-
Ionen fungieren sowohl als Co-Aktivatoren als auch als Co-Blocker des IP3-Rezeptor
/ Ca-Kanals (CALLAMARAS u. PARKER, 1994; MIYAZAKI, 1995).
Ca-Wellen beginnen nicht immer an der Stelle der Anregung über äußerliche
Rezeptoren. Wahrscheinlich tritt das auf, weil die Verteilung bzw. Sensitivität der IP3-
Rezeptoren einer Zelle gegenüber IP3 nicht immer homogen ist (MIYAZAKI, 1995).
Bei Säugetieroozyten, die ansonsten eine einheitliche Sensitivität zu besitzen
scheinen, ist eine Einleitungsstelle der Fusionspunkt des Spermiums mit der Oozyte
(MIYAZAKI et al., 1993). Die intrazellulären Strukturen für die Ca-Freisetzung sind
nicht homogen und unterschiedlich sensitiv. Wenn diese Vorräte mit veränderlichen
Sensitivitäten gleichmäßig auf die Zelle verteilt werden, entstehen die Ca-Spikes
homogen im ganzen Zytosol (BERRIDGE u. DUPONT, 1994).
Das Anhäufen von Calcium im Lumen des endoplasmatischen Retikulums kann die
Sensitivität des IP3-Rezeptors erhöhen (MISSIAEN et al., 1992; OLDERSHAW u.
TAYLOR, 1993). Während der Auffüllung des endoplasmatischen Retikulums mit
Calcium nimmt dessen Pufferkapazität ab, und dies kann die langsame Erhöhung
des zytosolischen Calciums erklären, welche oft einer regenerativen Antwort
vorausgeht (FRIEL u. TSIEN, 1992; MCDOUGALL u. SARDET, 1995). Das
endoplasmatische Retikulum enthält einen Ca-Vorrat, der entweder durch CICR oder
durch den diffusiblen Botenstoff IP3 mobilisiert werden kann (PUTNEY, JR. u.
RIBEIRO, 2000). Das Auffüllen der intrazellulären Vorräte mit Ca wird von Ca-
Literatur
60
abhängigen ATPasen bewirkt, welche als intrazelluläre sarco(endo)plasmatische Ca-
Pumpen (SERCA-Typ Calcium Pumpen) fungieren (CLAPHAM, 1995).
Ca-Zustrom
Es ist davon auszugehen, dass der Extrazellularraum dazu dient, die entleerten Ca-
Speicher wieder aufzufüllen (MIYAZAKI, 1995). Der Ca2+-Zufluss beeinflusst die
Geschwindigkeit der Ca-Wellen (FRIEL u. TSIEN, 1992; GIRARD u. CLAPHAM,
1993) und trägt auch zur Einleitung von Ca-Oszillationen bei (BERRIDGE, 1994;
MOHRI et al., 2001). Einer anfänglichen kurzzeitigen Freisetzung von Ca2+ aus
intrazellulären Vorräten folgt eine Phase des Zuflusses von Ca2+-Ionen. Dieser
Zufluss ist gewöhnlich von den Vorräten abhängig (PAREKH et al., 1993; GILABERT
u. PAREKH, 2000).
In Hinblick auf die Größe des Ca2+-Zustroms hat der kapazitative Ca2+-Zufluss, der
durch die Erschöpfung der Vorräte aktiviert wird, die größte Bedeutung (KASTROP
et al., 1991; PAREKH et al., 1993; PUTNEY, JR. u. RIBEIRO, 2000; MOHRI et al.,
2001). Ein kleines Molekül, bestehend aus Hydroxyl- und Aminogruppen, die mit
Carbongruppen und einer Phosphatgruppe verbunden sind (M < 500) und das
wahrscheinlich von den Ca-Vorräten freigegeben wird, konnte von
RANDRIAMAMPITA u. TSIEN (1993) als ein mutmaßlicher Ca2+-Zuflussfaktor (CIF)
identifiziert werden. Der Mechanismus des Ca2+-Zuflusses ist ungewöhnlich selektiv,
indem er wirksamer gegenüber Ca2+-Ionen als gegenüber anderen bivalenten
Kationen (Ba2+, Sr2+ oder Mn2+) (PAREKH et al., 1993) ist. BODE und GOKE (1994)
konnten zeigen, dass der kapazitative Ca2+-Zustrom durch PKC aktiviert wird und
sich durch den Serin/Threonin-Phosphatase-Blocker Okadaicsäure erhöht (PAREKH
et al., 1993). In bestimmten Zelltypen kann die PKC den kapazitativen Ca2+-Zustrom
jedoch hemmen (PUTNEY, JR. u. RIBEIRO, 2000). Die Wiederauffüllung der IP3-
sensitiven Ca2+-Vorräte hängt nicht nur von deren Entleerung, sondern auch von
einem ständigen Ca2+-Zustrom ab (LO u. THAYER, 1993; BERRIDGE, 1994).
Kapazitativer und IP4-aktivierter Ca2+-Zufluss scheinen sich nicht gegenseitig
auszuschließen. Das Verhältnis zueinander ist vom Zellsystem abhängig (MIYAZAKI,
1995). Wenn die IP3-Rezeptor / Ca2+- und IP4-Rezeptor/ Ca2+-Kanäle voneinander
getrennt werden, kann ein Ca2+-Zufluss stattfinden. Das erfolgt entweder, wenn
sowohl IP3 als auch Inositol-1’,3’,4’,5’-tetrabisphosphat (IP4) an ihre Rezeptoren
gebunden sind und das endoplasmatische Retikulum aufgefüllt ist, oder wenn beide
Literatur
61
Rezeptoren frei sind und das endoplasmatische Retikulum leer ist (IRVINE, 1992).
Hohe zytoplasmatische Ca2+-Konzentrationen können eine Umstrukturierung und
Zerstörung der Membranen des endoplasmatischen Retikulums verursachen. Die
Aktivierung der PKC schützt das endoplasmatische Retikulum vor den strukturellen
Wirkungen zu hoher zytoplasmatischer Ca2+-Konzentrationen (PUTNEY, JR. u.
RIBEIRO, 2000).
Mitochondrien
Es ist bekannt, dass die Mitochondrien an der Generation von Ca-Signalen in der
Zelle beteiligt sind (JOUAVILLE et al., 1995; GILABERT u. PAREKH, 2000) und die
Stoffwechseltätigkeit der Mitochondrien von Ca2+-Ionen beeinflusst wird
(HAJNOCZKY et al., 1995). Die Aufnahme von Ca2+-Ionen in die Mitochondrien ist
essentiell für die normale Funktion des vorratsgesteuerten Ca-Stromes unter
physiologischen Bedingungen einer ungenügenden intrazellulären Ca-Pufferung. Die
Ca-Aufnahme konkurriert dabei effektiv mit der Wiederauffüllung der Ca-Vorräte
durch SERCA-Pumpen und kann auch die Ca2+-Inaktivierung von IP3-Rezeptoren
verringern (GILABERT u. PAREKH, 2000). Wenn HeLa-Zellen von Agonisten
stimuliert werden, die IP3 erzeugen, ist das Vorhandensein von Mikrodomänen mit
hoher Cai-Konzentration im Zytoplasma mit einem Ca-Anstieg in den benachbarten
Mitochondrien assoziiert (RIZZUTO et al., 1993). Der Ca-Anstieg in den
Mitochondrien wird auch durch Zusatz von IP3 zu permeabilisierten Zellen induziert,
aber nicht durch Perfusion von Zellen mit Ca2+-Ionen in einer Konzentration, die der
von Ca-Mikrodomänen in intakten Zellen ähnelt (MIYAZAKI, 1995). Es ist möglich,
dass das zytosolische Ca-Signal vom IP3-sensitiven endoplasmatischen Retikulum
zu den benachbarten Mitochondrien durch eine funktionale Kopplung zwischen ihnen
übermittelt wird. Die Ca-Mikrodomänen können ein effizienter Weg für die
Akkumulation von Ca2+-Ionen innerhalb der mitochondrialen Matrix sein, um
Schlüsselenzyme zu regulieren (RIZZUTO et al., 1993). Die Ca-abhängige langsame
Deaktivierung des Ca-Zustromes, ein bekanntes aber schlecht verstandenes
Phänomen, wird von mitochondrialen Puffern des zytosolischen Calciums reguliert
(GILABERT u. PAREKH, 2000).
Kleine Erhöhungen des Cai-Niveaus können die IP3-induzierte Ca-Freisetzung
potenzieren (YAO u. PARKER, 1992). Im Falle des IP3-Rezeptors stimuliert das Ca
im Bereich von 100 - 300 nM diesen, was das Auftreten von Ca-Spikes fördert. Eine
Literatur
62
weitere Anhebung des Cai-Spiegels wirkt hemmend und führt dazu, dass der
Rezeptor desensibilisiert wird (KASAI et al., 1993; FLUCK et al., 1999).
Nukleoplasmatisches Ca
Die zytosolischen Ca-Wellen breiten sich auch in Zellkerne aus (NICOTERA et al.,
1994; HIMPENS et al., 1994). Die Erhöhung der Konzentration des
nukleoplasmatischen Ca (Can) beeinflusst wichtige Kernfunktionen, wie z.B. die
Regulation des Zellzyklus über Ca2+/Calmodulin-abhängige Kinasen (BACHS et al.,
1994), die schnelle Transkription von Genen (ROCHE u. PRENTKI, 1994), oder die
Induktion der Apoptose (NICOTERA et al., 1994; PUTNEY, JR. u. RIBEIRO, 2000).
Das Can befindet sich wahrscheinlich wegen des großen Durchmessers der
Kernporen in einem annähernden Gleichgewicht zu Cai. Die Kernhülle dient
wahrscheinlich als Ca-Vorrat, da sie an das endoplasmatische Retikulum grenzt und
sich IP3-Rezeptoren auf ihrer äußeren Membran befinden (OTSU et al., 1990).
MALVIYA (1994) berichtete, dass auch hochspezifische IP4-Rezeptoren auf der
äußeren Kernmembran lokalisiert sind und diese den Ca-Zufluss in den Kern
vermitteln. Seiner Meinung nach diffundiert das Calcium aus der Kernhülle und dem
umgebenden endoplasmatischen Retikulum in den Nukleus (MIYAZAKI, 1995).
Andererseits beobachteten HIMPENS et al. (1994), dass der Anstieg des Can vom
Anstieg des Cai in verschiedenen Zelltypen abweicht. Es gibt Hinweise für eine Ca-
Freisetzung von der Kernhülle direkt in das Nukleoplasma, welche durch die
Lokalisierung von IP3-Rezeptoren auf der inneren Kernmembran unterstützt werden
(MALVIYA, 1994). NICOTERA et al. (1994) kommen zu dem Schluss, dass die
Durchlässigkeit der Kernporen reguliert werden kann und dass Ionen-
Transportsysteme und ionenspezifische Kanäle in der Kernmembran existieren, die
durch intranukleare Prozesse gesteuert werden.
BERRIDGE und DUPONT (1994) vermuten zwei getrennte Mechanismen für die
interzelluläre Übertragung der Ca-Wellen. Erstens verteilt sich ein Messenger, wie
z.B. Ca2+ und IP3, über die gap junctions, um angrenzende Zellen anzuregen.
Zweitens können aktivierte Zellen einen Messenger freigeben, welcher dann verteilt
wird, um angrenzende Zellen anzuregen.
Literatur
63
2.5.2 Ca2+-Ionen im Rahmen der Befruchtung und Aktivierung in Eizellen
Es wird allgemein anerkannt, dass das grundlegende, von der Spermium-Oozyten-
Einheit eingeleitete Signal, ein vorübergehender Anstieg des Cai ist (BEMENT, 1992;
YANAGIMACHI, 1994), dem Ca-Oszillationen folgen (CAPCO, 2001). Der Anstieg
des Cai, der sich aus der Fertilisation oder Oozytenaktivierung ergibt, wirkt am
Anfang einer Serie paralleler und interaktiver Mechanismen, die dadurch initiiert
werden. Diese Mechanismen leiten eine Reihe von Änderungen auf strukturellem
und funktionellem Niveau ein (CAPCO, 2001).
Während der frühen Follikelentwicklung finden wichtige Veränderungen des
Calciumsignal-Mechanismus statt (SENDTNER et al., 1996; GOMES et al., 1999;
CAPCO, 2001). So besitzen unreife Oozyten intrazelluläre Vorräte von verfügbarem
Ca in ähnlicher Größe wie gereifte Oozyten. Diese sind aber gegenüber IP3 weniger
sensitiv (MEHLMANN u. KLINE, 1994). Präovulatorische Oozyten sind aufgrund ihrer
mangelhaften Fähigkeit, auf eine Steigerung des Cai zu antworten, nicht zur
Exozytose der kortikalen Granula fähig (ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Interessant
ist, dass in späteren Stadien der Oozytenreifung der anfängliche Ca-Zufluss, welcher
wahrscheinlich durch Öffnung von VOCCs durch eine verübergehende
Depolarisation ausgelöst wird (DUBE, 1988), unmittelbar zur Aktivierung der Ca-
sensitiven PKC führt (BERRIDGE u. IRVINE, 1984). Die durch Ca2+-Ionen aktivierte
PKC kann den Na+ / H+ -Antiporter aktivieren, den pHi erhöhen und schließlich durch
weitere PKC-sensitive Ereignisse den GVBD auslösen (DUBE, 1988; HOMA, 1995).
PALEOS und POWERS (1981) sind zu dem Schluss gekommen, dass Cae für den
GVBD nicht erforderlich ist. Zur Vollendung der ersten meiotischen Teilung wird
dieses jedoch benötigt (BAE u. CHANNING, 1985; RACOWSKY, 1986).
Bei Säugern können die Ca-Oszillationen von 2 bis 6 Stunden nach der Fusion des
Spermiums mit der Oozyte andauern. Mit Vollendung der Syngamie scheinen sie
aufzuhören (JONES et al., 1995). Die wiederholten Ca-Oszillationen stimulieren die
Oozytenaktivierung mittels Ca-abhängiger Effektoren, wie z.B. Calmodulin,
Proteinkinasen und spezifische Proteine, die in die Exozytose involviert sind. Die Ca-
abhängigen Proteine umfassen PKC, Calmodulin, CaMKII, Synaptotagmin und
Rabphilin-3A (ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Derzeit sind drei verschiedene
Kinasen identifiziert, die von Calcium beeinflusst werden. Zwei von diesen Kinasen,
Literatur
64
PKC und CaMKII, werden durch Ca aktiviert. Die dritte, MPF, wird deaktiviert
(CAPCO, 2001).
Calmodulin und CaMKII
CaMKII ist ein multifunktionaler Effektor, der zahlreiche Proteine phosphorylieren
kann (CAPCO, 2001). Zur Zeit gibt es jedoch keinen eindeutigen Beweis für eine
physiologische Rolle der CaMKII bei der Exozytose der kortikalen Granula während
der Fertilisation (ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Die aktivierte CaMKII induziert
wahrscheinlich den Abbau von Cyclin B und bewirkt so die Trennung der Schwester-
Chromatiden (SAGATA, 1996; CAPCO, 2001). Mehrere Untersuchungen lassen den
Schluss zu, dass die Aktivierung von CaMKII eng mit der Funktion des meiotischen
Spindelapparates verbunden ist (CAPCO, 2001). Sie fördert die Aktivität der MAPK
und verhindert eine zu frühe Bildung des Vorkerns in der Zygote (HATCH u. CAPCO,
2001).
Calmodulin spielt in verschiedenen Zielsystemen eine wichtige Rolle bei der
calciumabhängigen Regelung des Zellzyklus (MEANS, 1994; TAKUWA et al., 1995;
ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). PETR et al. (2000) kommen auf Grund ihrer
Untersuchungen an Schweineoozyten zu der Aussage, dass das Calcium-Signal als
zweiter Botenstoff durch Calmodulin vermittelt wird.
PKC
Die Vorstellung, dass eine Stimulierung durch PKC das Phänomen der Aktivierung
auslöst, ist keineswegs ein klarer Beweis dafür, dass die PKC ein Vermittler
(downstream transducer) des Calcium-Signals während der Fertilisation ist
(BEMENT, 1992; RAZ et al., 1998a). Obwohl die PKC fähig ist, die Zellsekretion zu
regulieren, zeigen Untersuchungsergebnisse, dass sie nicht der alleinige Faktor ist,
um während der Fertilisation die Exozytose der kortikalen Granula auszulösen
(ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Die Aktivierung der PKC kann das Calcium-Signal
abschalten (CHANG et al., 1999). Das bedeutet, dass der anfängliche Anstieg des
Cai-Spiegels die PKC aktiviert und sich anschließend an einer Feedback-Schleife
beteiligt, welche freies Calcium in Speicher verlagert, die unempfindlich gegenüber
dem ursprünglichen Stimulus sind (BEMENT, 1992). Die Aktivierung des Zellzyklus
ist calciumabhängig, aber PKC-unabhängig (RAZ et al., 1998a).
Literatur
65
Inositol-1',4',5'-triphosphat
Gegenwärtig ist noch nicht völlig geklärt, wie das Signal der Fertilisation die
Steigerung des Cai bewirkt (PARRINGTON et al., 1996). Die Ergebnisse von
FISSORE et al. (1995) lassen vermuten, dass beim Rind die IP3-Rezeptor-vermittelte
Ca-Freisetzung eine wichtige Rolle bei der Generation von Cai-Oszillationen und der
Eizellaktivierung spielt. Die Daten weisen auch auf die Beteiligung eines G-Protein-
Wirkungsmechanismus hin. Durch die Wechselwirkung von Spermium und Oozyte
wird ein GTP-bindendes Protein (G-Protein) aktiviert, welches die Produktion von IP3
stimuliert. Dieses verursacht die ersten zwei Ca-Freisetzungen aus zytosolischen
Vorräten. Außerdem wird eine Erhöhung der Permeabilität der Plasmamembran für
Ca2+-Ionen induziert und dadurch eine wiederholte Ca-Freisetzung unterstützt
(MIYAZAKI, 1988). G-Protein- und Tyrosinkinase-gekoppelte Rezeptoren, die durch
externe Signale oder durch Injektion eines löslichen Spermaproteins aktiviert
werden, stimulieren die Phospholipase C (HEYERS et al., 2000). Diese bewirkt die
Hydrolyse von Phosphatidylionositol-4’,5’-biphosphat in die Teilungsprodukte IP3 und
Diacylglycerol (PARRINGTON, 2001). IP3 führt zur Freisetzung von Calcium aus
intrazellulären Vorräten, während Diacylglycerol die PKC aktiviert (MIYAZAKI et al.,
1993; BERRIDGE, 1993). Während es bei Seeigel und Starfisch Beweise dafür gibt,
dass die Phospholipase C der Oozyte eine wichtige Rolle für die Fertilisation spielt,
stehen diese bei Säugetieren noch aus (PARRINGTON, 2001).
Spermienfaktoren
Weitere wichtige Faktoren bei der Fertilisation sind die sogenannten
Spermienfaktoren (DALE et al., 1985; WU et al., 2001), die bis zum zweiten
Zellzyklus aktiv bleiben und vor dem Ende des 2-Zellstadiums deaktiviert werden
(ZERNICKA-GOETZ et al., 1995). Die Erhöhung des Cai-Spiegels beginnt in der
Nähe der Spermiumbindungsstelle (MIYAZAKI et al., 1986). Die Randzone der
Oozyte ist gegenüber den Spermienfaktoren sensitiver als andere Zellbereiche
(SATO et al., 1999), und die Ca-Wellen breiten sich vorzugsweise in der Randzone
der Oozyten aus (MCDOUGALL u. SARDET, 1995). TANG et al. (2000) konnten
nachweisen, dass die Ca-Oszillationen, die von Spermienfaktoren induziert werden,
einen maternalen Mechanismus benötigen. Dieser ist auch für die Stetigkeit der Ca-
Oszillationen verantwortlich. Die Deaktivierung dieses Mechanismus erfolgt durch
paternale Komponenten, jedoch nicht durch parthenogenetische Aktivierung.
Literatur
66
Die Untersuchungsergebnisse von YANAGIDA et al. (2000) sowie WU et al. (2001)
weisen auf die Existenz verschiedener Schwellen hin, ab denen die
Spermienfaktoren die Aktivierung der Oozyte und die Ca-Oszillationen veranlassen
(ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Ein Spermiumfaktor, das sogenannte Oscillin
(PARRINGTON et al., 1996) gelangt nicht über Spermienrezeptoren sondern direkt
in das Ooplasma (FLAHERTY et al., 1998). Die Calcium-Freisetzung und
Vorkernbildung erfordert mehrere Faktoren aus dem Spermiumzytosol (HEYERS et
al., 2000). WU et al. (2001) beobachteten, dass die Spermienfaktoren und
wahrscheinlich das Spermium selbst, einen Anstieg des Cai durch fortdauernde
Stimulation der Produktion von IP3 und damit einer dauerhaften Sensibilisierung der
CICR bewirken. Ob Phospholipase C selbst ein Spermienfaktor ist, oder ob es als
Mediator im Feedback wirkt, muss noch geklärt werden.
Ca-Oszillationen und AKtivierung
Das Niveau der Stimulation von Calcium beeinflusst die Aktivierung und die
Entwicklung der Oozyten. Eine unzureichende oder übermäßige Calcium-
Freisetzung verschlechtert die nachfolgende Entwicklung (MINAMIHASHI et al.,
1993). Experimente mit Lysaten von Oozyten haben weiterhin gezeigt, dass die
Aufrechterhaltung eines niedrigen Cai die Dekondensation des Chromatins und den
Wiederzusammenbau der Kernhülle verhindern (LOHKA u. MASUI, 1984).
Die Erhöhung des Cai während der Fertilisation oder der parthenogenetischen
Aktivierung kann die Arretierung der M-II aufheben (MIYAZAKI et al., 1993;
PARRINGTON et al., 1996; LIU et al., 1998b; ABBOTT u. DUCIBELLA, 2001). Diese
Aufhebung erfolgt wahrscheinlich durch die calciumabhängige Deaktivierung von
CSF (ZERNICKA-GOETZ et al., 1995) über die Zerstörung des c-Mos Produktes
(WATANABE et al., 1989; WEBER et al., 1991) und der folgenden Deaktivierung
des Cyclin B-p34cdc2 Komplexes (COLLAS et al., 1995). Die Calcium-Stimulation
führt zu einer abrupten Inaktivierung der Histon-1-Kinase. Diese Inaktivierung ist von
Cae abhängig und die Aktivität der Histon-1-Kinase wird von der Anzahl der Calcium-
Stimulationen geregelt (COLLAS et al., 1993b).
Das kortikale endoplasmatische Retikulum ist nicht die einzige Komponente, welche
die Konzentration von freiem Calcium im kortikalen Zytoplasma regeln kann
(CHARBONNEAU u. GREY, 1984). In Schweineoozyten, welche in vitro bis zur M-II
gereift wurden, wurde Cai in Vakuolen, Mitochondrien, auf der Oberfläche von
Literatur
67
Granula und im Ooplasma beobachtet (PETR et al., 2000). Das kortikale
endoplasmatische Retikulum könnte über die Regulierung der Ca2+-Ionen eine Rolle
bei der Kortikalreaktion spielen.
Während der Fertilisation von Mausoozyten, nicht aber während ihrer künstlichen
Aktivierung, geht dem Anstieg des Cai eine Serie von Ca-Oszillationen voraus
(CUTHBERTSON et al., 1981). In den Untersuchungen von SATO et al. (1999)
wurde 25 - 30 Minuten nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion die erste
Calcium-Antwort generiert. Der Anstieg des Cai erfolgte synchron über das
Ooplasma, erreichte nach 40 - 70 Sekunden einen Gipfel und dauerte 5 - 7 Minuten.
Die nachfolgenden Calcium-Antworten fanden in Abständen von 20 - 30 Minuten
statt und waren mit einer höheren Geschwindigkeit und einer kürzeren Dauer der
Cai-Anstiege assoziiert. Die Induktion eines einzelnen Anstiegs des Cai durch Ca-
Ionophor leitet sowohl die frühen als auch die späten Ereignisse der
Oozytenaktivierung ein, während beide Ereignisse gehemmt wurden, wenn ein Ca2+-
Chelator verwendet wurde (VINCENT et al., 1992). Die Hemmung der Calcium-
Freisetzung durch einen spezifischen Antikörper des IP3-Rezeptor hemmt ebenfalls
die Aktivierung vollständig (XU et al., 1994). Die Mikroinjektion von IP3 hat eine
Kortikalreaktion zur Folge, führt aber nicht zur Wiederaufnahme des Zellzyklus
(TATONE et al., 1994). Außerdem verursacht sie dosisabhängig einen
vorübergehenden Anstieg des Cai (NAKADA u. MIZUNO, 1998). Eine mögliche
Interpretation dieser Ergebnisse ist, dass die frühen und späten Ereignisse der
Aktivierung durch verschiedene Basiskonzentrationen des Cai oder durch die Anzahl
vorübergehender Ca-Oszillationen induziert werden. Gleichzeitig ist es möglich, dass
die Penetration des Spermiums mehr als einen der biochemischen Mechanismen
aktiviert, die wesentlich für die Vollendung der Oozytenaktivierung sind (RAZ et al.,
1998a). Die Ergebnisse von FUJIMOTO et al. (1994) lassen den Schluss zu, dass
die Konzentration von Cae einen wichtigen Effekt auf den Fortschritt der Ereignisse
der Fertilisation hat, die auf die Adhäsion des Spermiums an die
Ooplasmamembrane folgen.
Calcium in den Spermatozoen
In ihrer Übersicht beschreiben FLORMAN et al. (1998) den Mechanismus, durch den
Säugetierspermien das Cai während der Stimulierung mit ZP3 erhöhen sowie die Art
und Weise, wie diese Signalübertragung während der Kapazitation reguliert wird. Die
Literatur
68
Steuerung der Ionenkanäle des Spermiums erklärt ihrer Meinung nach zumindest
teilweise den genauen Ablauf der AR und die Minimierung des Anteils an spontanen
AR. Das ZP3 aktiviert ein dreiteiliges G-Protein (FLORMAN et al., 1989; FLORMAN,
1994) sowie die Phospholipase C und verursacht einen temporären Calcium-Influx in
das Spermium (LEIBFRIED u. FIRST, 1979a; FUKAMI et al., 2001). Diese Reaktion
fördert einen zweiten Mechanismus des Calcium-Zuflusses (BREITBART u. NAOR,
1999), der eine längerfristige Erhöhung der Cai-Konzentration gewährleistet, die zur
AR führt (LEIBFRIED u. FIRST, 1979a). Die Erschöpfung der Cai-Vorräte kann zur
Öffnung von Ca-Kanälen der Spermiumplasmamembrane führen, was die Existenz
eines kapazitativen Calcium-Zuflusses in diesen spezialisierten Zellen zeigt
(SPUNGIN u. BREITBART, 1996; ROSSATO et al., 2001). BREITBART et al. (1992)
fanden erstmalig PKC in ovinem und bovinem Sperma und bewiesen die Beteiligung
der PKC am Mechanismus der AR. Calmodulin spielt eine wichtige Rolle bei der
Kapazitation von Mausspermien sowie bei der agonistinduzierten AR durch
Regulierung von Komponenten der Spermienmembran (BENDAHMANE et al.,
2001).
Calcium und Membranfusion
Bezüglich der Mechanismen der Membranfusion gibt es evidente Hinweise, welche
die sogenannte SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive faktor attachment
protein receptor) -Hypothese stützen (SOLLNER et al., 1993). In diesem Modell
wirken SNARE-Proteine, die sich in sekretorischen Bläschen (v-SNARES) und auf
den Zielmembranen befinden (t-SNARES), z.B. Plasmamembranen, aufeinander ein
und führen zur Fusion der Membranen. In diesen Prozess einbezogen sind Calcium-
Sensoren und zusätzliche regulatorische Proteine, z.B. Syntaxin und Synaptobrevin,
die auch in Säugetierspermien gefunden wurden. Die SNARE-Hypothese ist somit
auf die Ereignisse der Membranfusion während der Fertilisation übertragbar.
Wahrscheinlich bindet der Calcium-Sensor Synaptotagmin das Syntaxin und
vermittelt die Fusion der Membran. Nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion
könnten Spermien-SNARE-Proteine zusammen mit anderen Spermienkomponenten
für die asynchrone Dekondensation der männlichen DNA verantwortlich sein, was
bei physiologischen Wechselwirkungen zwischen Spermien und Oozyten nicht
vorkommt (RAMALHO-SANTOS et al., 2000).
Literatur
69
2.5.3 Ca-Ionophor A23187
Ionophor-Antibiotika sind lipidlösliche Moleküle, die alkalische Kationen binden und
sie über verschieden Membranen transportieren (PRESSMAN, 1976).
Das Ca-Ionophor A23187 ist ein kohlensaures Antibiotikum, das aus Streptomyces
chartreusensis gewonnen wird und als freie Säure kristallisiert. Die freie Säure hat
ein Molekulargewicht von 523,6 und die Summenformel C29H37N3O6 (Abbildung 1).
O
O
O
N
O
N
O
O
N
Abbildung 1: Calcium Ionophor A23187
Das Ionophor A23187 fungiert als mobiler Träger in der Lipiddoppelschicht der
Membran und transportiert Ca2+- und Mg2+-Ionen zwischen benachbarten
Kompartimenten bis zum Konzentrationsausgleich. A23187 hat eine höhere
Selektivität für bivalente (Mn2+ >> Ca2+ > Mg2+ >> Sr2+ > Ba2+) als für monovalente
(Li+ > Na+ > K+) Kationen (PFEIFFER et al., 1974). Bei einem pH-Wert von 7,4
bindet A23187 nur bivalente Kationen (REED u. LARDY, 1972). Bei diesem
genannten pH-Wert beobachteten die Autoren einen Calcium- und Magnesium-,
aber keinen Kalium-Transport. In vitro reagieren Oozyten auf A23187 mit einem
erhöhten Eingangswiderstand und lysieren während oder nach Behandlung (EUSEBI
u. SIRACUSA, 1983).
Ca-Ionophor kann Oozyten vieler Spezies aktivieren. Diese Aktivierung ist
unabhängig von Cae (STEINHARDT et al., 1974; YAO u. PARKER, 1992). Die
genannte Erhöhung des zytosolischen Ca-Spiegels ist vermutlich auf die Freisetzung
Literatur
70
von Calcium aus intrazellulären Vorräten zurückzuführen. Unabhängig von der
Anwesenheit von Calcium im Medium wurden in Oozyten, welche mit A23187
behandelten wurden, in Abhängigkeit von dessen Konzentration ein erhöhter pHi, die
Exozytose der kortikalen Granula (Kortikalreaktion) und die Vorkernbildung
beobachtet (WANG et al., 1998).
Eine ununterbrochene Behandlung mit einer hohen Konzentration (10 – 20 µM) von
A23187 war in den Versuchen o.g. Autoren schädlich für Mausoozyten und führte
zur Auflösung des Zytoplasmas. Die Behandlung mit einer niedrigen Konzentration
(3 µM) aktivierte die Oozyten, wobei die Aktivierung in Ca2+/Mg2+-freien Medien
besser als in vollständigen Medien erfolgte. Die Kortikalreaktion und
Vorkernentwicklung waren in Ca2+/Mg2+-freiem Medium mit der in
spermiumaktivierten Oozyten vergleichbar. Der Umfang der Kortikalreaktion war
jedoch in Oozyten, die mit A23187 aktivierten wurden, geringer. Die Aktivierung der
Zellkerne war in vollständigem Medium verlangsamt. Dies könnte durch die
verringerte Löslichkeit des Ionophores in Anwesenheit von bivalenten Kationen
bedingt sein (STEINHARDT et al., 1974). Die Ergebnisse von WANG et al. (1999)
zeigen, dass A23187 die Aktivierung von porcinen Oozyten in calciumfreien Medium
ohne die typische Erhöhung des Cai induzieren kann.
Durch Vergleich verschiedener Behandlungslängen fanden WANG et al. (1999),
dass mit einer Behandlung für 2 min die beste Aktivierungsrate erzielt wurde. Eine
Behandlung für 5 min in calciumfreiem Medium führte zwar zur Kondensation des
Chromatins in einigen Oozyten, aber Mikrotubuli wurden in diesen Oozyten nicht
gefunden.
Die Western Blot-Analyse von cdk1, Cyclin B2, und c-Mos in Xenopus-Oozyten
zeigte, dass eine einstündige Behandlung der Oozyten mit A23187 diese Proteine
nicht beeinflusste (BODART et al., 2001).
Die Behandlung porciner Oozyten mit Ca-Ionophor führt zu einer Erhöhung des pHi
(WANG et al., 1999). Das Ergebnis war unabhängig von externem Natrium oder
Bikarbonat, aber an eine anfängliche Erhöhung des freien Cai gebunden
(RUDDOCK et al., 2000a).
Die Behandlung von Hamstereizellen mit A23187 vor einer intrazytoplasmatischen
Spermieninjektion verbesserte nicht die Fertilisation aktivierter Oozyten, aber sie
Literatur
71
erhöhte indirekt ihre Entwicklungskompetenz zum Vorkernstadium durch
Verbesserung des Wirkungsgrades der Oozytenaktivierung (HOSHI et al., 1992).
EUSEBI und SIRACUSA (1983) fanden, dass Hamsteroozyten in der M-II auf Ca-
Ionophor mit einem hyperpolarisierten Potenzial reagieren können, welches
Ähnlichkeiten mit dem Potenzial während der Fertilisation zeigt. Die gesamte
Reaktion auf Ca-Ionophor zeigte aber ein komplexeres Muster, als die elektrischen
Veränderungen, welche die Fertilisation begleiten. Der Hyperpolarisation folgte nicht
unbedingt eine Oozytenaktivierung (EUSEBI u. SIRACUSA, 1983).
Eine zytologische Analyse zeigte, dass die ein-stündige Anwendung von Ca-
Ionophor A23187 während des GVBD-Stadiums die Fortsetzung der Meiose in
Xenopus-Oozyten nicht beeinflusst hatte (BODART et al., 2001). Mikrotubuli und
kondensierte Chromosomen, die nach dem GVBD nicht beobachtet werden konnten,
wurden eine Stunde später entweder im Zytoplasma oder in der subkortikalen
Schicht, wo sich die Spindeln organisieren, entdeckt. Die Behandlung von jungen
Oozyten mit A23187 führte zur Trennung der Chromosomen und Ausschleusung des
zweiten Polkörpers, jedoch nicht zu Vorkernentwicklung. Die Mehrheit der Oozyten
wurde in einem Übergangsstadium der M-III arretiert. Demgegenüber entwickelten
sich die meisten der gealterten Oozyten, die mit A23187 behandelt wurden, bis zum
Vorkernstadium. Die Behandlung mit Ca-Ionophor A23187 allein verursacht eine
langsamere Abnahme der Histon-1-Kinase-Aktivität und keine offensichtlichen
Veränderungen der MAPK in jungem Oozyten. Im Gegensatz dazu verminderten
sich die Aktivitäten beider Kinasen in gealterten Oozyten nach eine Behandlung mit
A23187 (COLLAS et al., 1993a).
A23187 kann auch verwendet werden, um die AR von Spermien (ROLDAN u.
HARRISON, 1989; LIU u. BAKER, 1996) durch eine Erhöhung des Cai zu induzieren
(BAILEY u. BUHR, 1993). Eine solche Behandlung führte zu einer vollständigen
Zerlegung von Phosphatidylinositol-4’,5’-bisphosphat und Phosphatidylinositol-4’-
phosphat innerhalb von 3 Minuten (ROLDAN u. HARRISON, 1989).
Material und Methoden
72
3 Material und Methoden
3.1 Untersuchungsmaterial
3.1.1 Gewinnung der Ovarien
Die Gewinnung der Ovarien erfolgte auf einem Schlachthof. Bei den Schlachttieren
handelte sich hauptsächlich um Kühe und Jungrinder der Rasse Deutsches
Fleckvieh. Unmittelbar nach der Öffnung der Bauchhöhle gesunder Schlachttiere
wurden die Ovarien aus dem Tierkörper entnommen und in einem Gefäß mit
physiologischer Kochsalzlösung bei einer Temperatur von 20 – 25 °C gelagert. Der
Transport der Organe zum Labor erfolgte innerhalb von drei Stunden nach der
Schlachtung.
3.1.2 Gewinnung der Cumulus-Oozyten-Komplexe
Die Gewinnung der COK begann ca. vier Stunden nach der Entnahme der ersten
Ovarien aus den Schlachttieren mit der sogenannten Slicing- Methode. In einer
Petrischale, welche mit etwa 30 °C warmer modifizierter phosphatgepufferter
Salzlösung nach Dulbecco (D-PBS, Fa. Biochrom, Berlin) gefüllt war, wurde die
Oberfläche der Ovarien mit einem Mehrfachmesser, bestehend aus 6 - 8
Rasierklingen (ROMI, Solingen) im Abstand von 0,15 mm, angeschnitten und
danach mittels einer Spritzflasche mit modifizierter D-PBS-Lösung gewaschen. Die
modifizierte D-PBS-Lösung wurde jeweils am Abend vor Versuchsbeginn herstellt,
bei einer Temperatur von 6 °C bis zum nächsten Tag gelagert und vor der
Gewinnung der Ovarien in einem Wasserbad auf 34 °C erwärmt.
Um grobe Gewebsstücke aus der Spülflüssigkeit zu entfernen, wurde diese durch
ein Metallsieb in ein Becherglas (Volumen 600 ml) gegossen. Aus diesem
Becherglas wurde die Spülflüssigkeit durch ein Prüfsieb mit einem Durchmesser von
100 mm und einer Maschenweite von 75 µm (Fa. Jürgens, Hannover) gegossen. Der
Überstand wurde solange mit modifizierter D-PBS-Lösung gewaschen, bis er klar
war. Anschließend wurde der Überstand in gerasterte Petrischalen mit einem
Durchmesser von 90 mm (Fa. Greiner, Frickenhausen) gegeben.
Die Such- und Sammelschalen wurden auf einer Wärmeplatte gelagert. Mit Hilfe
eines Stereomikroskops (Fa. Nikon, Düsseldorf) wurden die COK bei 15-facher
Material und Methoden
73
Vergrößerung aus den Petrischalen herausgenommen und in eine kleinere (30 mm
Ø), mit modifizierter D-PBS-Lösung gefüllte Petrischale (Fa. Greiner, Frickenhausen)
übertragen. Das Umsetzen der COK erfolgte mit einem Pipettierhelfer in einer 20 µl
Mikropipette (Fa. Brand, Wertheim).
3.1.3 Klassifizierung der Oozyten/COK
Nach ihrer Gewinnung wurden die COK aufgrund der morphologischen
Beschaffenheit von Cumulus und Zytoplasma bei 45-facher Vergrößerung unter dem
Stereomikroskop klassifiziert. Grundlage für diese Qualitätsbeurteilung bildeten die
von LEIBFRIED und FIRST (1979a) aufgestellten Kriterien:
Klasse 1 Oozyten mit dunklem, homogenem Zytoplasma mit einem
kompakten, mindestens fünflagigem Cumulus oophorus
Klasse 2 Oozyten mit dunklem, homogenem Zytoplasma mit einem
kompakten Cumulus oophorus, der stellenweise weniger als
fünf Lagen aufweist
Klasse 3 Oozyten mit dunklem, homogenem Zytoplasma mit einem
kompakten, mehrlagigem Cumulus oophorus mit leichter
Zellexpansion
Klasse 4 Oozyten mit einem voll expandierten Cumulus oophorus,
schwarze Klümpchen im Zytoplasma der Oozyten
Klasse 5 Oozyten mit dunklem oder degeneriertem Plasma, mit
geringem oder keinem Cumulus oophorus und denudierte
Oozyten
Für alle Versuche wurden nur COK der Klassen 1 bis 3 genutzt.
Material und Methoden
74
3.2 In-vitro-Maturation
Die Reifungsschalen für die IVM (Fa. Nunc, Wiesbaden, Biedrick) wurden ca. 12 –
14 h vor Reifungsbeginn vorbereitet. Als Reifungsmedium diente das Grundmedium
mit FSH (s. Anhang S. 128 u. 130). In jede Vertiefung der 4-Well-Multischalen
wurden 400 µl dieses Mediums und 15 µl FSH-Lösung (0,88 mg/ml) gegeben. Pro
Ansatz wurden zwei 4-Well-Multischalen vorbereitet. Eine Schale diente dem
Waschen der COK nach deren Gewinnung, die zweite der IVM. Das Medium in den
������������� ����� ��� ��� �� �������öl (Fa. Sigma, Taufkirchen) überschichtet.
Beide Schalen wurden im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2 und feuchtigkeits-
gesättigter Atmosphäre zur Einstellung von pH-Wert und Temperatur äquilibriert.
Im Anschluss an die Klassifizierung wurden die COK zweimal in ca. 2 ml
Grundmedium und ein drittes Mal in Reifungsmedium gewaschen. Nach dem dritten
Waschen wurden die COK in Gruppen von ca. 25 Stück je Vertiefung in die
Reifungsschalen umgesetzt. Die Reifungsdauer betrug je nach Versuchsansatz 24
bzw. 30 h. Gereift wurde im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2 und maximaler
Luftfeuchtigkeit.
3.3 In-vitro-Fertilisation
Für die IVF wurden zwei Medien verwendet. Die Spermienkapazitation und
-aufbereitung erfolgte mit modifizierter Tyrode-Laktat-Lösung (PARRISH et al.,
1986), nachfolgend als Sperm-TALP bezeichnet und die Fertilisation in modi-
fiziertem Tyrode-Laktat-Medium (BAVISTER u. YANAGIMACHI, 1977), nachfolgend
als Fert-TALP bezeichnet.
3.3.1 Aufbereitung der Spermien
Für das Swim-up-Verfahren (PARRISH et al., 1986) wurde das Kapazitationsmedium
verwendet. Für die Fertilisation von 100 Oozyten wurde eine Samenportion (0,25 ml
Paillette, 15 x 106 Spermien) des Bullen „Brahm“ (Ch.-Nr. 10299) bei 35 °C für ca. 10
Sekunden aufgetaut.
Material und Methoden
75
Zwei sterile Kryoröhrchen (1,8 ml, Fa. Nunc, Wiesbaden-Biebrick) wurden mit je 1 ml
Kapazitationsmedium gefüllt, in einem Winkel von 45° gelagert und mit je 125 µl
Sperma unterschichtet. Danach wurden die Kryoröhrchen eine Stunde im
Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden aus jedem Kryoröhrchen 800 ��
Kapazitationsmedium mit einer Pipette (100 - ���� ��� ��� ���������� �������� ��
ein vorgewärmtes und beschriftetes Zentrifugenröhrchen überführt und für 10
Minuten mit 350 x g zentrifugiert (EBA 3S, Fa. A. Hettich, Tuttlingen). Der über dem
Spermienpellet entstandene Überstand wurde abgesaugt und verworfen. Das Pellet
wurde erneut in 1 ml Kapazitationsmedium resuspendiert und abermals mit 350 x g
zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes wurde das Pellet in 40 ��
Befruchtungsmedium resuspendiert. Um eine Spermienzahl von ca. 100.000
Spermien pro Befruchtungstropfen (60 µl) zu erhalten, wurde die
Spermienkonzentration der Suspension in einer Bürker-Kammer bestimmt.
3.3.2 Befruchtung
Die Koinkubation von Spermien und gereiften COK bzw. Oozyten wurde in
Befruchtungstropfen durchgeführt. Dazu wurden zunächst vier 15 �� ������
Befruchtungsmedium in eine Petrischale (Ø 30 mm, Fa. Greiner, Frickenhausen)
pipettiert und mit Mineralöl (Fa. Sigma, Taufkirchen) überschichtet. Dann wurde
��� !����� "�� �# �� $��������������� ��� ������ ��� %������ ��� ������
��� &� �� ��öht. Die Befruchtungstropfen wurden mindestens vier Stunden im
Brutschrank äquilibriert, bevor Oozyten und Samenzellen eingesetzt wurden.
Nach 24 bzw. 30 h wurden die COK aus der Maturationsschale entnommen,
������������ �� '� (�� �� $��������������� ������� ��� �� die
Befruchtungstropfen umgesetzt. Von der vorbereiteten Spermasuspension wurde
nun, je nach Konzentration, eine entsprechende Menge in die Befruchtungstropfen
gegeben.
Um denudierte Oozyten befruchten zu können, wurden COK aus der
Maturationsschale entnommen und entsprechend Kapitel 3.3.3 behandelt. Die
Koinkubationszeit von Spermien mit Oozyten bzw. COK betrug 18 bis 22 Stunden.
Material und Methoden
76
3.3.3 Entfernung des Cumulus oophorus vor der IVF
Drei Vertiefungen einer 4-Well-��������� ������ ��� ��� �� )���������� ���üllt
und im Brutschrank unter Reifungsbedingungen äquilibriert. Eine Portion
Hyaluronidase-Lösung (400 ��* ��� +� ����� ���������� ��� ��������������
erwärmt und in die letzte Vertiefung der 4-Well-Multischale pipettiert. Anschließend
wurden die COK aus der Reifungsschale entnommen und in Vertiefung 1 umgesetzt.
Durch mehrmaliges Pipettieren wurden die Mehrzahl der CZ von den Oozyten
entfernt. Danach wurden die COK in die zweite, mit Hyaluronidase-Lösung gefüllte
Vertiefung umgesetzt und pipettiert, bis alle CZ vollständige entfernt waren.
Anschließend, wurden die Oozyten zweimal im Grundmedium gewaschen, um die
Wirkung der Hyaluronidase zu inhibieren.
3.4 Behandlung der Oozyten/COK mit Ca-Ionophor A23187
Die Aktivierung der befruchteten Oozyten bzw. COK erfolgte auf der Grundlage der
Arbeiten von WARE et al. (1989) sowie CHIAN und SIRARD (1995) mit einer 20 µM
Ca-Ionophor-Lösung (C7522, Fa. Sigma, Taufkichen) in PBS (Fa. Biochrom, Berlin)
mit bzw. ohne Ca2+/Mg2+-Ionen (Fa. Sigma, Taufkirchen) für 5 Minuten bei Raum-
temperatur. Die Ca-Ionophor A23187-Gebrauchslösung wurde aus einer 100-fach
konzentrierten Stock-Lösung angefertigt.
Eine Vertiefung von einer 4-Well-Multischale wurde mit 400 µl Lösung 1 (s. Kap. 8.3)
mit bzw. ohne Ca2+/Mg2+ gefüllt. In zwei weitere Vertiefungen wurden je 400 µl der
Stammlösung Sperm-TALP gegeben und im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2 und
maximaler Luftfeuchtigkeit inkubiert. Vor der Benutzung wurde die vierte Vertiefung
mit 400 µl Lösung 2 (s. Kap. 8.3) gefüllt.
Die Aktivierung wurde 6, 8 bzw. 12 h nach Beginn der Befruchtung durchgeführt
(Abbildung 3). Dazu wurden die Oozyten/COK aus den Befruchtungstropfen
entnommen und einmal in Lösung 1 gewaschen. Danach wurden sie in der
Gebrauchslösung (Lösung 2) bei Raumtemperatur für die Dauer von 5 Minuten
inkubiert. Anschließend wurden die Oozyten/COK in Stammlösung Sperm-TALP
zweimal gewaschen, um die Wirkung von Ca-Ionophor A23187 aufzuheben.
Material und Methoden
77
Danach wurden die aktivierten, befruchteten Oozyten bzw. COK in neue
Befruchtungstropfen umgesetzt, um die Standard-Fertilisationszeit von 18 bis 22 h
einzuhalten. Die Inkubation erfolgte im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2 und
maximaler Luftfeuchtigkeit. Die neuen Befruchtungstropfen wurden mindestens 4 h
im Brutschrank äquilibriert, bevor die aktivierten befruchteten Oozyten bzw. COK
eingesetzt wurden.
3.5 In-vitro-Kultivierung
Zur IVK wurde das Grundmedium verwendet. Jede Vertiefung von den 4-Well-
Multischalen wurde mit 400 µl Kultivierungsmedium gefüllt und mit Mineralöl (Fa.
Sigma, Taufkirchen) überschichtet. Die Kultivierungsschalen wurden am Vorabend
vorbereitet und über Nacht im Brutschrank gelagert.
Nach Ablauf der Fertilisationszeit wurden die befruchteten Oozyten/COK aus den
Befruchtungstropfen entnommen und unter Beibehaltung der Gruppen zweimal in
200 µl Grundmedium gewaschen. Danach wurden die Oozyten/COK direkt in die
Kultivierungsschalen umgesetzt und 9 Tage im Brutschrank bei 39 °C, 5 % CO2 und
maximaler Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am vierten und sechsten Tag wurde pro
Vertiefung 200 µl Grundmedium mit 25 % ECS zugegeben.
3.6 Beurteilung der Teilungs- und Entwicklungsstadien
Die Teilungs- und Entwicklungsstadien wurden während der Kultivierung beurteilt.
Am dritten Tag der Kultivierung wurde die Teilungsrate (Anteil der Embryonen mit
mindestens zwei Zellen) unter einem Stereomikroskop bei 15-facher Vergrößerung
bestimmt. Embryonen, die gleichmäßige Blastomeren aufwiesen, wurden als geteilt
eingestuft. An den Tagen 7 und 8 der IVK wurde die Blastozystenrate bestimmt.
Material und Methoden
78
3.7 Übersicht über den Versuchsaufbau
Die Experimente I bis III wurden hintereinander im Zeitraum von Mai bis November
2000 ohne Berücksichtigung eventueller jahreszeitlicher Effekte durchgeführt.
Experiment l: Untersuchung zum zeitlichen Verlauf von Spermienpenetration und
Vorkernbildung bei in vitro gereiften Rinderoozyten.
Das Ziel des ersten Untersuchungsabschnittes bestand in der Bestimmung des
zeitlichen Verlaufs von Spermienpenetration und Vorkernbildung bei in vitro gereiften
Oozyten des Rindes in Abhängigkeit von der Reifungsdauer und dem
Cumuluszellbesatz der Oozyten. Mit den Untersuchungen wurde der Zeitpunkt
ermittelt, zu dem im zweiten Abschnitt mit Ca-Ionophor aktiviert werden sollte. Die
IVM der COK erfolgte über 24 h bzw. 30 h und die IVF der Oozyten mit bzw. ohne
die umgebenden CZ. Für jeden Zeitpunkt der IVF wurden 3 Wiederholungen
ausgewertet (Abbildung 2).
Abbildung 2: Versuchsaufbau Experiment I.
IVM
24 h 30 h
COK Oozyten COK Oozyten
IVF über 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 Stunden
Fixation, Färbung und zytologische Auswertung der Präparate
Bestimmung der Befruchtungsrate zu allen Zeitpunkten und der
Zellkernstadien 6, 9 bzw. 12 Stunden nach Spermienzugabe
Material und Methoden
79
Experiment II: Bestimmung der Teilungs- und Entwicklungskompetenz von Oozyten
bzw. COK nach IVF in Abhängigkeit von einer Behandlung mit Ca-Ionophor A23187.
Abbildung 3: Versuchsaufbau Experiment II
Im zweiten Untersuchungsabschnitt ging es um die gezielte Beeinflussung in vitro
fertilisierter Oozyten/COK mit Ca-Ionophor A23187. Die Behandlung der
befruchteten Oozyten/COK mit Ca-Ionophor erfolgte jeweils zu drei verschiedenen
Zeitpunkten: 6, 8 bzw. 12 h nach Fertilisationsbeginn. Dabei wurden sowohl Oozyten
IVM
24 h 30 h
COK Oozyten COK Oozyten
Fertilisation in IVF-Medium über 6, 8 bzw. 12 Stunden
Behandlung mit Ca-Ionophor in PBS mit bzw. ohne Ca2+/Mg2+
Kultivierung in Befruchtungstropfen (18 - 22 h)
COK30 mit
Ca2+/Mg2+
IVK über 8 Tage mit Bestimmung der Teilungsrate am d 3
Fixation / Färbung / zytologische Auswertung
Oozyten24 mit
Ca2+/Mg2+
COK24 mit
Ca2+/Mg2+
COK24 ohne
Ca2+/Mg2+
Oozyten24 ohne
Ca2+/Mg2+
COK30 ohne
Ca2+/Mg2+
Oozyten30 ohne
Ca2+/Mg2+
Oozyten30 mit
Ca2+/Mg2+
Material und Methoden
80
als auch Spermien einer Behandlung mit A23187 unterzogen. Die Reifung der COK
über 24 bzw. 30 h und die Fertilisation der Oozyten bzw. COK erfolgte mit der
beschriebenen Standardmethode des IVF-Labors beim Besamungsverein
Neustadt/Aisch. Die Behandlung befruchteter Oozyten/COK mit Ca-Ionophor A23187
wurde in PBS mit oder ohne Ca2+/Mg2+-Ionen durchgeführt (Abbildung 3). Als
Kontrollen dienten 24 bzw. 30 h maturierte COK, die mit Ausnahme des Ca-
Ionophors analog behandelt wurden. Für jeden Zeitpunkt der Aktivierung wurden 3
Wiederholungen ausgewertet.
Experiment III: Bestimmung der parthenogenetischen Blastozystenrate am d 8 der
IVK nach Aktivierung von Oozyten bzw. COK mit Ca-Ionophor 8 oder 12 h nach IVM.
Ziel des dritten Experimentes war es, die möglicherweise parthenogenetisch
bedingte Blastozystenrate unter den im Experiment II gewählten Bedingungen zu
untersuchen. Die IVM der COK/Oozyten erfolgte über 24 bzw. 30 h. Im Anschluss an
die Reifung wurde keine IVF durchgeführt. Die Blastozystenrate wurde nach acht
Tagen IVK mikroskopisch bestimmt. Als Kontrollen dienten 24 bzw. 30 h maturierte
COK, die mit Ausnahme des Ca-Ionophors analog behandelt wurden. Für jeden
Zeitpunkt der Aktivierung wurden 2 Wiederholungen ausgewertet (Abbildung 4).
Material und Methoden
81
Abbildung 4: Versuchsaufbau Experiment III
3.8 Fixation
Um die Chromatinkonfiguration, die Vorkernbildung und die Anzahl der Zellkerne
beurteilen zu können, wurden alle COK, Oozyten bzw. Embryonen in einem Ethanol-
Eisessig-Gemisch (3:1) fixiert, mit Aceto-Orcein gefärbt und anschließend
zytologisch untersucht.
Die verbliebenen Zellen des Cumulus oophorus wurde für die Fixation durch
mehrmaliges Pipettieren entfernt. Für die Fixation wurden etwa fünf Oozyten oder
IVM der COK
24 h 30 h
COK Oozyten COK Oozyten
Kultivierung in IVF-Medium über 8 bzw. 12 Stunden
Behandlung mit Ca-Ionophor in PBS mit bzw. ohne Ca2+/Mg2+
Kultivierung in IVF Medium (18 - 22 h)
IVK über 8 Tage
mikroskopische Bestimmung der Blastozystenrate
COK24 mit Ca2+/Mg2+
Oozyten24 mit Ca2+/Mg2+
Oozyten30 mit Ca2+/Mg2+
COK30 mit Ca2+/Mg2+
COK24 ohne Ca2+/Mg2+
Oozyten24 ohne Ca2+/Mg2+
COK30 ohne Ca2+/Mg2+
Oozyten30 ohne Ca2+/Mg2+
Material und Methoden
82
����,���� �� �� � �� --PBS auf einem Objektträger (76 x 26 mm, Fa. Heiland,
Gallin) platziert. Der Tropfen mit den darin befindlichen Objekten befand sich etwa
mittig zwischen zwei dünnen Siliconstreifen (Baysilone-Paste, Fa. Bayer,
Leverkusen) die im Abstand von etwa 16 mm auf den Objektträger aufgebracht
wurden. Über den Silikonstreifen und den Medientropfen mit Oozyten oder
Embryonen wurde nun ein Deckglas (Fa. Heiland, Gallin) mit 18 mm Kantenlänge
vorsichtig so platziert, dass die Objekte leicht festgedrückt wurden, ohne zu
zerplatzen. Anschließend wurde ein Tropfen Fixationsgemisch am Rand des
Deckglases so abgesetzt, dass es aufgrund der Kapillarwirkung den gesamten
Zwischenraum zwischen Deckglas und Objektträger durchfließen konnte und die
Objekte vollständig umgab. Das Deckglas wurde nun erneut leicht festgedrückt, um
ein Wegschwimmen der Objekte zu verhindern. Auf jedem Objektträger wurden zwei
Deckgläser platziert. Die Anordnung der biologischen Objekten auf dem Objektträger
unter dem Deckglas ist in der Abbildung 5 dargestellt.
Die Lagerung der Objektträger erfolgte aufrecht in Küvetten, die soweit mit
Fixationsflüssigkeit gefüllt waren, dass der untere Deckglasrand in die Flüssigkeit
eintauchte. So war gewährleistet, dass aufgrund der Kapillarwirkung die Objekte
ständig von Fixationsflüssigkeit umgeben waren. Die Küvetten wurden mit
Leukoplast-S® und Parafilm® luftdicht verschlossen und im Kühlschrank bis zur
Färbung und zytologischen Untersuchung gelagert.
Objektträger Silicon Objekte Deckglas
Abbildung 5: Objektträger mit Deckgläser auf Siliconstreifen
Material und Methoden
83
3.9 Färbung und zytologische Untersuchung
Die Objektträger wurden aus den Küvetten entnommen und mit einem Zellstofftuch
abgetupft. Mit einem 5 µl - Transferpettor wurde dann eine 2 %ige Aceto-Orcein-
Lösung direkt an den oberen Deckglasrand getropft, so dass sie durch die
Kapillarkraft unter das Deckglas gesogen wurde. Die Farbstofflösung wurde mittels
Filterpapierstreifen durch den Raum zwischen Deckglas und Objektträger gesogen.
Die gefärbten Objektträger wurden dann 10 bis 15 Minuten gelagert, um die
Farbstofflösung einwirken zu lassen. Anschließend wurde ein Tropfen 30 %ige
Essigsäure am unteren Deckglasrand abgesetzt. Die Essigsäure wurde solange
eingesogen, bis der Zwischenraum völlig klar war. Die Objektträger wurden bis zur
Auswertung in einer feuchten Kammer gelagert.
Die so gefärbten Oozyten bzw. Embryonen wurden unter einem
Phasenkontrastmikroskop (Fa. Zeiss, Göttingen) bei 100- bis 400-facher
Vergrößerung untersucht, um die Zellkernstadien, die Befruchtungs- und die
Blastozystenrate zu bestimmen.
Die Zellkernstadien wurden nach HOMA (1988) und SÜSS et al. (1988) wie folgt
klassifiziert: Metaphase-II intakt; Metaphase-II degeneriert; Anaphase-II intakt;
Anaphase-II degeneriert; Telophase-II intakt; Telophase-II degeneriert;
dekondensierter Zellkern; Vorkerne; Syngamie. Dabei bezog sich die Zuordnung des
jeweiligen Zellkernstadiums zu „intakt“ oder „degeneriert“ auf den Zustand des
Zytoplasmas. Als Zeichen der Degeneration wurden wabig-schollige
Fragmentierungen, Aufhellungen und/oder eine Vakuolisierung des Zytoplasmas
gewertet.
Für die Beurteilung der Vorkernbildung wurden nur die Präparate ausgewertet, bei
denen männliche und weibliche Vorkerne anhand folgender Kriterien unterschieden
werden konnten: a) bei Oozyten mit zwei oder drei Vorkernen war ein
Spermienschwanz in direkter räumlicher Beziehung zu einem Vorkern feststellbar
oder b) es war ein dekondensierter Spermienkopf in Anwesenheit eines Vorkerns
vorhanden. In letzterem Fall wurde der Vorkern als weiblich betrachtet.
Material und Methoden
84
3.10 Statistische Auswertung
Die statistischen Auswertungen erfolgten mit SAS für Windows (Release 8.02).
Elementare statistische Berechnungen (Frequenztabellen mit absoluten und
relativen Häufigkeiten) erfolgten mit der Prozedur FREQ der SAS/BASE Software.
Die Verteilungen der Stufen der Zustände wurden auf die Einflussgrößen Gruppe,
Reifungszeit, Zeitpunkt und die entsprechenden Wechselwirkungen (Experiment 1)
sowie Gruppe, Reifungszeit, Aktivierungsmedium, Aktivierungszeit und die
entsprechenden Wechselwirkungen (Experimente 2 und 3) global mit der Prozedur
GENMOD der SAS/STAT Software geprüft, unter Verwendung der Optionen dist =
multinomial und link = cumlogit im Model Statement.
Die Einzelzustände (binomial verteilt mit Response 1 für das Auftreten eines
Zustandes und sonst 0) wurden hinsichtlich der Einflussgrößen Gruppe,
Reifungszeit, Zeitpunkt und den entsprechenden Wechselwirkungen (Experiment 1)
sowie Gruppe, Reifungszeit, Aktivierungsmedium, Aktivierungszeit und den
entsprechenden Wechselwirkungen (Experimente 2 und 3) mit der Prozedur
CATMOD der SAS/STAT Software untersucht. Die CADMOD-Prozedur enthält eine
Vielzahl von Analysemethoden für kategoriale Merkmale, die Verallgemeinerungen
von Verfahren kontinuierlicher Datenanalysen sind, wie die hier angewendete
Analyse der Response Funktionen (response = mean) und die entsprechende
Aufteilung der Variation unter diesen Funktionen als verallgemeinerte
Varianzanalyse (Analyse der Mittel der abhängigen Variablen einschließlich aller
Haupteffekte und Wechselwirkungen im Modell). Neben dem globalen Test der
Einflussfaktoren wurden auch interessierende Kontraste zwischen einzelnen Stufen
der Einflussfaktoren geprüft.
Ergebnisse
85
4 Ergebnisse
4.1 Experiment l.: Untersuchungen zum zeitlichen Verlauf von
Spermienpenetration und Vorkernbildung in in vitro gereiften
Rinderoozyten
In diesem Versuch wurde die Befruchtungsrate unter Verwendung von 2484 COK
bzw. Oozyten bestimmt sowie der zeitlichen Verlauf der Vorkernbildung bei 1343
COK bzw. Oozyten untersucht. Je Untersuchungszeitpunkt wurden ca. 70 Oozyten
bzw. COK in zwei oder drei Wiederholungen eingesetzt. Bei der Darstellung der
Ergebnisse sind unter den Bezeichnungen „Zeitpunkt 3h, 6h, 9h“ usw. die
Beobachtungen zu den jeweiligen Stunden nach Beginn des In-vitro-
Fertilisationsansatzes zu verstehen. Eine tabellarische Zusammenfassung der zu
den jeweiligen Abbildungen gehörenden Messwerte ist, mit Ausnahme der von den
Abbildungen 6 und 12, im Anhang zu finden.
4.1.1 Bestimmung der Befruchtung von Rinderoozyten zu verschiedenen
Zeitpunkten nach IVF
Die Oozyten bzw. COK wurden als fertilisiert klassifiziert, wenn sie im Zytoplasma
einen Spermienkopf in verschiedenen Dekondensationsstadien hatten und zusätzlich
einen weiblichen Vorkern oder verschiedene Aktivierungsstadien aufwiesen.
.� ����� /������� 0���,�� 1�2-Test) war zu erkennen, dass es in allen Gruppen einen
signifikanten Anstieg (p<0,001) der Befruchtungsrate vom Zeitpunkt 0h zu 3h gab.
Die Befruchtungsrate stieg weiterhin in allen Gruppen vom Zeitpunkt 3h zu 6h und,
mit Ausnahme der Gruppe COK30 von 6h zu 9h signifikant an (p<0,01). In den
Gruppen mit 24-stündiger Reifungszeit wurde das Maximum in Bezug auf die
Befruchtungsrate nach 15 h beobachtet. Wurden COK bzw. Oozyten über 30 h
gereift, so wurde das Maximum in Bezug auf den Anteil befruchteter Eizellen 18 h
bzw. 15 h nach Fertilisationsbeginn erreicht.
Die Befruchtungsrate war in der Gruppe Oozyten24 zu den Zeitpunkten 3h sowie 6h
signifikant (p<0,01) höher als in der Gruppe Oozyten30 zu den analogen Zeitpunkten.
Die Befruchtungsraten von COK, welche 24 h oder 30 h gereift wurden, waren zu
Ergebnisse
86
den verschiedenen Zeitpunkten statistisch nicht signifikant verschieden. Tendenziell
stieg jedoch die Befruchtungsrate in der Gruppe COK24 zwischen den Zeitpunkten
3h, 6h und 9h an.
Bei einer Reifungszeit von 24 h war die Befruchtungsrate der COK zum Zeitpunkt 3h
im Vergleich zu den Oozyten signifikant höher (p<0,01). Zum Zeitpunkt 6h war dieser
signifikante Unterschied nicht mehr nachweisbar. Ähnliche Ergebnisse wurden bei
den Gruppen COK30 und Oozyten30 beobachtet. Die Befruchtungsrate zum Zeitpunkt
3h und 6h war bei Verwendung von COK signifikant höher (p<0,01). Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 4.1 enthalten. Sie werden in der Abbildung 6 dargestellt.
0
20
40
60
80
100
Bef
ruch
tun
gsr
ate
(%)
0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h
Zeit n ach F ertilisa tio n sb eg in n
C OK Oozyten C OK Oozyten24 24 30 30
A A A A
a B
bB
cB
cB
d C
f C
e C
e C
D D D
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppe signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant;
A:B (p<0,001); B:C, C:D (p<0,01); a:b, b:c, d:e, d:f (p<0,01); a:c (p<0,001)
Abbildung 6: Befruchtungsrate von COK bzw. Oozyten in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Tabelle 4.1.: Befruchtung von COK bzw. Oozyten in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Zeit nach Fertilisationsbeginn
Anzahl und Anteil befruchteter COK / Oozyten
Gruppen
nach
Reifungszeit 0 h
n/N
(%)
3 h
n/N
(%)
6 h
n/N
(%)
9 h
n/N
(%)
12 h
n/N
(%)
15 h
n/N
(%)
18 h
n/N
(%)
21 h
n/N
(%)
24 h
n/N
(%)
Oozyten24 0/69
(0,0)A
15/70
(21,4)b,B
46/69
(66,7)e,C
52/62
(83,9)D
72/101
(71,3)
58/59
(98,3)
60/61
(98,4)
76/80
(95,0)
82/96
(85,4)
COK24 0/65
(0,0)A
34/67
(50,7)c,B
70/96
(72,9)e,C
72/82
(87,8)D
63/83
(75,9)
62/67
(92,5)
65/72
(90,3)
30/34
(88,2)
81/90
(90,0)
Oozyten30 0/83
(0,0)A
4/79
(5,1)a,B
20/56
(35,7)d,C
60/73
(82,2)D
53/68
(77,9)
65/76
(85,5)
61/65
(93,8)
50/50
(100,0)
49/61
(80,3)
COK30 0/61
(0,0)A
28/67
(41,8)c,B
49/80
(61,3)f,C
36/55
(65,5)
66/82
(80,5)
37/42
(88,1)
60/71
(84,5)
41/56
(73,2)
29/36
(80,5)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant;
A:B (p<0,001); B:C, C:D (p<0,01) a:b, b:c, d:e, d:f (p<0,01); a:c (p<0,001)
Ergebnisse
89
4.1.2 Vorkernbildung
Zunächst werden die Anteile Oozyten bzw. COK, welche überhaupt Vorkerne oder
Syngamie im Zytoplasma zeigten, zusammenfassend dargestellt (Abb.7). Die
folgenden Abbildungen enthalten die Beobachtungsergebnisse bezüglich der
Oozyten bzw. COK mit 1) einem weiblichen Vorkern und einem dekondensiertem
Spermienkopf (Abb. 8), 2) einem männlichen Vorkern, definiert durch die
Anwesenheit eines Spermienschwanzes in dessen unmittelbarer Nähe, und
maternalem Chromatin in verschiedenen Aktivierungsstadien vor der Formation des
Vorkernes (Abb. 9), 3) zwei Vorkernen (Abb. 10), 4) drei Vorkernen (Abb. 11) und 5)
Syngamie (Abb. 12).
Die Untersuchungen zur Vorkernbildung nach IVF ergaben, dass Vorkerne
frühestens 6 h nach Fertilisationsbeginn beobachtet wurden. Der Anteil Eizellen mit
Vorkern nahm in den Gruppen COK24 und Oozyten24 jeweils signifikant (p<0,01)
zwischen den Zeitpunkten 6h und 9h, 9h und 12h sowie 12h und 15h zu. In den
Gruppen COK30 und Oozyten30 wurde eine signifikante (p<0,001) Zunahme der
Oozyten mit Vorkern erst zwischen 9h und 12h beobachtet. Zum Zeitpunkt 15h
wurden keine Oozyten mehr ohne Vorkern festgestellt.
In den Gruppen COK24 bzw. Oozyten24 war zum Zeitpunkt 9h der Anteil der Eizellen
mit einem Vorkern signifikant (p<0,001) höher als in den Gruppen mit einer
Reifungszeit von 30 h. In der Gruppe Oozyten30 wurde 12 h nach Fertilisations-
beginn im Vergleich zur Gruppe COK30 zum selben Zeitpunkt ein signifikant
(p<0,001) höherer Anteil an Eizellen mit einem Vorkern beobachtet (Abb. 7).
Ergebnisse
90
0
20
40
60
80
100
120A
nte
ile C
OK
bzw
. Oo
zyte
n (
%)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
A A A A
b B
D D H
c G
c C
d F
b B
a E
a E
c C
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppe signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant;
A:B, C:D, E:F, E:G, G:H (p<0,001); B:C (p<0,01); a:b, c:d (p<0,001)
Abbildung 7: Anteile befruchteter COK bzw. Oozyten mit Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Ergebnisse
91
0
5
10
15
20
25
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
A A
B B
Hinsichtlich der Nachweisbarkeit von weiblichen Vorkernen zeigten alle Gruppen
einen Abfall zwischen 18 und 21 h nach Fertilisationsbeginn. In den Gruppen
Oozyten24 und COK30 war dieser Abfall signifikant (p<0,05). Zwischen den Gruppen
konnten keine statistisch gesicherten Unterschiede nachgewiesen werden (Abb. 8).
A:B (p<0,05)
Abbildung 8: Anteile COK bzw. Oozyten mit weiblichem Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
In den Gruppen Oozyten24 und COK24 wurde bezüglich des Auftretens männlicher
Vorkerne ein signifikanter Anstieg (p<0.01) zwischen Zeitpunkt 6h und 9h sowie ein
signifikanter Abfall (p<0.01) zwischen 9h und 12h beobachtet. In der Gruppe COK24
wurde zwischen 12h und 15h ein erneuter signifikanter (p<0,05) Anstieg und ein
Abfall (p<0,01) zwischen 15h und 18h festgestellt. In der Gruppe COK30 gab es
einen Anstieg des Anteiles COK mit männlichem Vorkern zwischen 21h und 24h
(p<0,01). Die Häufigkeit des Auftretens männlicher Vorkerne unterschied sich bei
den COK in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit signifikant (p<0,01) zu den
Ergebnisse
92
0
10
20
30
40
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten 24 24 30 30
A A
a a
b B
b B
C
d
D
E
F
f G
e
g
g
c C
Zeitpunkten 9h, 12h und 24h. Das Gleiche wurde bei den Oozyten 9 h nach
Fertilisationsbeginn beobachtet (p<0,01). Zum Zeitpunkt 24h war in der Gruppe
COK30 der Anteil Oozyten mit männlichem Vorkern signifikant (p<0,001) höher als in
den Gruppen COK24 und Oozyten24 (Abb. 9).
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppe signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant;
A:B, B:C, D:E, F:G (p<0,01); C:D (p<0,05)
e:f, e:g (p<0,001); a:b, c:d (p<0,01)
Abbildung 9: Anteile COK bzw. Oozyten mit männlichem Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Ergebnisse
93
Zwei Vorkerne wurden deutlich früher (zum Zeitpunkt 6h) in den Gruppen COK24 und
Oozyten24 festgestellt als in den Gruppen, die 30 h gereift wurden. Ein signifikanter
Anstieg (p<0,05) wurde zwischen 6h und 9h sowie 9h und 12h für die beiden
Gruppen COK24 und Oozyten24 beobachtet. Der weitere Anstieg (p<0,05) erfolgte in
der Gruppe Oozyten24 zwischen 12h und 15h, und in der Gruppe COK24 etwas
später zwischen 15 h und 18 h nach Fertilisationsbeginn (p<0,05). Wenn die IVM
über 30 h erfolgte, trat der signifikante Anstieg bei beiden Gruppen erst zwischen 9h
und 12h auf (p<0.001). Ein weiterer signifikanter Anstieg wurde in der Gruppe COK30
zwischen Zeitpunkt 12h und 15h (p < 0,001) registriert. Zu einer signifikanten
Absenkung des Anteiles an Eizellen mit zwei Vorkernen kam es in der Gruppe
COK30 zwischen den Zeitpunkten 18h und 21h (p < 0,01).
Die COK unterschieden sich hinsichtlich des Auftretens zweier Vorkerne signifikant
(p<0,01) zum Zeitpunkt 9h bzw. 15h in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit (24 h
bzw. 30 h). Bei den Oozyten beeinflusste die Reifungszeit (24 h bzw. 30 h) den
Anteil der Stadien mit zwei Vorkernen signifikant (p<0,05) zu den Zeitpunkten 9h,
12h, 15h, 18h und 21h.
Beim Vergleich der Gruppen COK24 und Oozyten24 gab es keinen signifikanten
Unterschied bezüglich des zeitlichen Auftretens der Vorkerne. Wenn jedoch die
Reifung über 30 h erfolgte, wurden signifikant mehr Eizellen mit Vorkern in der
Gruppe Oozyten30 zum Zeitpunkt 12h (p<0,001) und 21h (p<0,01) als in der Gruppe
COK30 beobachtet (Abb. 10).
Ergebnisse
94
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90A
nte
ile C
OK
bzw
. Oo
zyte
n (
%)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
A A
a B
a B
b G
b G
c L
d C
C m H
f E
h D
e I
g
i k J
j
F
l K
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppe signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant;
A:B, B:C, C:D, E:F (p<0,05); J:K (p<0,01); G:H, H:I, G:L (p<0,001)
g:h (p<0,05); a:b, e:f, c:d, i:j, k:l (p<0,01); c:m (p<0,001)
Abbildung 10: Anteile COK bzw. Oozyten mit zwei Vorkernen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Eine signifikante (p<0,05) Erhöhung des Anteils der Eizellen mit drei Vorkernen
wurde nur in der Gruppe COK24 zwischen den Zeitpunkten 9h und 12h sowie dessen
Absenkung zwischen 15h und 18h beobachtet (p<0,05).
In Abhängigkeit von der Reifungszeit wurde diesbezüglich nur zwischen den
Gruppen COK24 und COK30 zum Zeitpunkt 15h ein signifikanter Unterschied (p<0,01)
festgestellt (Abb. 11).
Ergebnisse
95
0
5
10
15
20A
nte
ile C
OK
bzw
. Oo
zyte
n (
%)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten
A
B
D
a C
b
24 24 30 30
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb einer Gruppe signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen signifikant;
A:B, C:D (p<0,05); a:b (p<0,01)
Abbildung 11: Anteile COK bzw. Oozyten mit drei Vorkernen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
In Abbildung 12 sind die statistisch gesicherten Unterschiede hinsichtlich der
Syngamie bei den einzelnen Gruppen in Abhängigkeit von der Reifungszeit und dem
Untersuchungszeitpunkt dargestellt. Syngamie wurde am frühesten bei der Gruppe
COK24 beobachtet. Bei dieser Gruppe konnte ein signifikanter Anstieg (p<0,01) der
Syngamie zwischen 9 h und 12 h nach Fertilisationsbeginn festgestellt werden. Bei
der Gruppe COK30 wurde die Syngamie erst ab Zeitpunkt 18h beobachtet. Der Anteil
Oozyten mit Syngamie stieg signifikant (p<0,001) bis zum Zeitpunkt 21h an.
Zwischen 21h und 24h fiel dieser Parameter signifikant ab (p<0,05). Sowohl bei den
24 h als auch bei den 30 h maturierten Oozyten stieg der Anteil Oozyten mit
Syngamie zwischen den Zeitpunkten 15h und 18h signifikant (p<0,05) an. Lediglich
Ergebnisse
96
0
10
20
30
40
50
60
An
teile
Co
k b
zw. O
ozy
ten
(%
)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
A
B
F
J
G
K
C
D
H
I
E
in der Gruppe Oozyten24 trat eine signifikante Abnahme (p<0,05) des Anteils
Oozyten mit Syngamie zwischen 21h und 24h auf.
A:B (p < 0,01); C:D (p < 0,001); D:E, F:G, H:I; J:K (p < 0,05)
Abbildung 12: Anteile COK bzw. Oozyten mit Syngamie in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
In der Tabelle 4.8 sind die Daten aus den Untersuchungen zur Syngamie
zusammengefasst. Zu den Zeitpunkten 12h, 15h, 18h und 24h war der Anteil
Oozyten mit Syngymie in der Gruppe COK24 signifikant (p<0,05) höher als in der
Gruppe COK30. Eine Beeinflussung der Syngamierate durch die Reifungszeit wurde
auch bei den Oozyten zu den Zeitpunkten 18h und 21h beobachtet. Hier war die
Rate bei der Gruppe Oozyten24 im Vergleich zur Gruppe Oozyten30 signifikant
(p<0,05) höher.
Der Besatz mit CZ hatte einen signifikant (p<0,05) positiven Effekt auf die
Syngamierate. Sie lag in der Gruppe COK24 zu den Zeitpunkten 12h, 15h und 21h
Ergebnisse
97
über der in der Gruppe Oozyten24. Bei den 30 h gereiften Eizellen wurde der gleiche
Effekt zum Zeitpunkt 18h und 21h beobachtet (p<0,05).
Tabelle 4.7: Anzahl und Anteil COK bzw. Oozyten mit Syngamie in den Gruppen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppe
Zeit nach IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0) 0/70 (0,0) 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 0/51 (0,0) 0/72 (0,0) 0/60 (0,0) 0/36 (0,0)
12 h 6/49 (12,2) a, A 1/63 (1,6) B 0/53 (0,0) b 0/13 (0,0)
15 h 13/48 (27,1) e, C 2/29 (6,9) D 0/38 (0,0) f 0/21 (0,0)
18 h 12/57 (21,0) g 15/49 (30,6) k 0/45 (0,0) h, G 5/46 (10,9) l, H
21 h 16/60 (26,7) E 11/21 (52,4) c, F 17/44 (38,6) I 6/37 (16,2) d, J
24 h 23/70 (32,9) i 14/60 (23,3) 5/33 (15,1) j 7/24 (29,2)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
e:f, g:h (p < 0,001); a:b, c:d (p < 0,01); i:j, k:l (p < 0,05) in Abhängigkeit von der Reifungszeit;
A:B, C:D, E:F, G:H, I:J (p < 0,05) in Abhängigkeit vom Besatz mit CZ
Ergebnisse
98
4.1.3 Bestimmung der Zellkernstadien
Die Zellkernstadien wurden 6 h, 9 h und 12 h nach Fertilisationsbeginn bei 872 COK
bzw. Oozyten bestimmt.
Tabelle 4.8: Zellkernstadien bei befruchteten COK bzw. Oozyten in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Stadien Zeit nach
IVF
COK24
n (%)
Oozyte24
n (%)
COK30
n (%)
Oozyte30
n (%)
6 h 42 (61,7) 73 (76,0) 49 (87,5) 60 (75,0)
9 h 23 (37,7) 42 (51,2) 46 (63,0) 33 (60,0)
Metaphase-II
intakt
12 h 23 (32,4) 30 (36,6) 34 (50,0) 53 (66,2)
6 h 6 (8,8) 6 (6,2) 0 (0,0) 2 (2,5)
9 h 4 (6,6) 5 (6,1) 1 (1,4) 0 (0,0)
Metaphase-II
degeneriert
12 h 14 (19,7) 5 (6,1) 1 (1,5) 1 (1,2)
6 h 0 (0,0) 4 (4,2) 0 (0,0) 0 (0,0)
9 h 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Anaphase-II
intakt
12 h 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
6 h 17 (25,0) 12 (12,5) 6 (10,7) 17 (21,2)
9 h 15 (24,6) 17 (20,7) 24 (32,9) 17 (30,9)
Telophase-II
intakt
12 h 1 (1,4) 0 (0,0) 10 (14,7) 4 (5,0)
6 h 1 (1,5) 1 (1,0) 1 (1,8) 0 (0,0)
9 h 3 (4,9) 6 (7,3) 0 (0,0) 0 (0,0)
Telophase-II
degeneriert
12 h 1 (1,4) 4 (4,9) 0 (0,0) 1 (1,2)
6 h 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (1,2)
9 h 6 (9,8) 0 (0,0) 2 (2,7) 5 (9,1)
dekondensierter
Zellkern
12 h 9 (12,7) 12 (14,6) 7 (77,8) 10 (12,5)
6 h 2 (2,9) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
9 h 10 (16,4) 12 (14,6) 0 (0,0) 0 (0,0)
Vorkern
12 h 23 (32,4) 31 (37,8) 16 (23,5) 11 (13,7)
gesamt (N) 6 h 68 96 56 80
9 h 61 82 73 55
12 h 71 82 68 80
Ergebnisse
99
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
6 h 9 h 12 h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
a A
C
b E
c B
D
d F
e g
f
h
Eine signifikante Abnahme (p<0,01) des Anteils Oozyten im M-II-Stadium wurde bei
allen Gruppen, mit Ausnahme der Gruppe Oozyten30, zwischen den Zeitpunkten 6h
und 9h beobachtet.
Ein signifikanter Einfluss (p<0,05) der Reifungszeit wurde bei den Gruppen der COK
zu allen drei Untersuchungszeitpunkten festgesellt. Der höchste Anteil M-II-Stadien
wurde in der Gruppe COK30 gefunden. Bei den Gruppen der Oozyten wurde ein
signifikanter Einfluss (p<0,001) der Reifungszeit nur zum Zeitpunkt 12h beobachtet.
Auch hier war der Anteil Oozyten im M-II-Stadium bei den länger gereiften Oozyten
höher.
Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) zwischen den Gruppen COK und Oozyten war
diesbezüglich nur zum Zeitpunkt 12h zu erkennen, wenn sie über 30 h gereift waren.
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppen;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B, C:D, E:F (p < 0,01); e:f; f:h (p < 0,05); a:b, c:d (p< 0,01); g:h (p < 0,001)
Abbildung 13: Anteile COK bzw. Oozyten im M-II-Stadium in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Ergebnisse
100
0
10
20
30
40
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
6 h 9 h 12 h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten24 24 30 30
e
g f I
A
C
E G
a B c
D
b F
d H
In allen Gruppen nahm der Anteil Eizellen in der Telophase II signifikant (p<0,001)
zwischen den Zeitpunkten 9h und 12h ab. Nur bei der Gruppe COK30 kam es
zwischen den Zeitpunkten 6h und 9h zu einer signifikanten Zunahme der Telophase-
II-Stadien (p<0,01).
Ein signifikanter Einfluss (p<0,05) der Reifungszeit auf das Auftreten des Telophase-
II-Stadiums wurde bei den COK und bei den Oozyten zum Zeitpunkt 12h, und bei
den COK zusätzlich zum Zeitpunkt 6h nachgewiesen.
Ein diesbezüglicher signifikanter Einfluss (p<0,05) der CZ wurde zwischen den
Gruppen Oozyten24 und COK24 zum Zeitpunkt 6h, und zwischen den Gruppen
Oozyten30 und COK30 zum Zeitpunkt 12h beobachtet.
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppen;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B, C:D, E:F, G:H (p<0,001); I:E (p<0,01)
a:b (p<0,01); e:f, c:d, e:g, b:d (p<0,05)
Abbildung 14: Anteile COK bzw. Oozyten in der Telophase II in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Ergebnisse
101
0
5
10
15
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
6 h 9 h 12 h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten 24 24 30 30
A
a B
b C
c
D
Ein signifikanter Anstieg (p<0,01) des Anteils der Eizellen mit dekondensiertem
Zellkern wurde zuerst in der Gruppe COK24 und zwar zwischen den Zeitpunkten 6h
und 9h registriert. In der Gruppe Oozyten24 erfolgte der signifikante Anstieg (p<0,01)
zwischen 9 h und 12 h nach Fertilisationsbeginn. Bei den anderen Gruppen konnte
der Anstieg statistisch nicht abgesichert werden.
Zum Zeitpunkt 9h wurde ein signifikanter Einfluss (p<0,05) der Reifungszeit auf die
Dekondensation des Zellkernes nur bei den Oozyten beobachtet.
Einen signifikanten Unterschied (p<0,01) zwischen den Eizellen in Abhängigkeit von
ihrem Besatz mit CZ konnte nur zum Zeitpunkt 9h und nur bei einer
Maturationsdauer von 24 h festgestellt werden.
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppen;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B, C:D (p<0,01); a:b (p<0,01); b:c (p<0,05)
Abbildung 15: Anteile COK bzw. Oozyten mit dekondensiertem Zellkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungs-zeitpunkt
Ergebnisse
102
0
10
20
30
40
An
teile
CO
K b
zw. O
ozy
ten
(%
)
6 h 9 h 12 h
Zeit nach Fertilisationsbeginn
COK Oozyten COK Oozyten
A
C
E
a B c
D
b F
d I
e G
f J
H
Der Anteil COK24 bzw. Oozyten24 mit einem Vorkern erhöhte sich signifikant (p<0,05)
zwischen den Zeitpunkten 6h und 9h sowie 9h und 12h. Wenn die Reifung über 30 h
erfolgte, wurde ein signifikanter Anstieg (p<0,001) bei Oozyten und COK zwischen
den Zeitpunkten 9h und 12h beobachtet.
Bei den COK war ein signifikanter Einfluss (p<0,01) der Reifungszeit auf das
Auftreten eines Vorkernes zum Zeitpunkt 9h und bei den Oozyten zu den
Zeitpunkten 9h und 12h festzustellen.
Der CZ-Besatz der Eizellen beeinflusste das Auftreten eines Zellkernes nicht
signifikant.
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppen;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B, C:D, D:G (p<0,01); B:E (p<0,05); F:H, I:J (p<0,001)
a:b, c:d, e:f (p<0,01)
Abbildung 16: Anteile COK bzw. Oozyten mit einem Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Ergebnisse
103
Die Abbildungen 17 bis 23 zeigen Beispiele von Eizellen in verschiedenen Stadien
der Meiose.
Abb. 17: M-II mit Polkörperchen (Gruppe Oozyten30 zum Zeitpunkt 0h) x 325
Ergebnisse
104
Abb. 18: Telophase II (Gruppe Oozyten24 zum Zeitpunkt 6h) x 819
Abb. 19: zwei Pronuklei (Gruppe Oozyten30 zum Zeitpunkt 21h) x 325
Ergebnisse
105
Abb. 20: 2 benachbarte Pronuklei (Gruppe Oozyten24 zum Zeitpunkt 15h) x 819
Abb. 21: Syngamie (Gruppe COK24 zum Zeitpunkt 18h) x 325
Ergebnisse
106
Abb. 22: Syngamie (Gruppe COK24 zum Zeitpunkt 21h) x 325
Abb. 23: drei Pronuklei (Gruppe COK24 zum Zeitpunkt 21h) x 325
Ergebnisse
107
4.2 Experiment II.: Teilungs- und Entwicklungsraten von Oozyten bzw. COK nach IVF in Abhängigkeit von einer Behandlung mit Ca-Ionophor A23187
In diesem Versuch wurden die Teilungs- und Entwicklungsraten von insgesamt 4119
(3435 behandelte und 684 unbehandelte) COK bzw. Oozyten untersucht. Bei der
Darstellung der Ergebnisse sind unter den Bezeichnungen „Aktivierungszeitpunkt 6h,
8h bzw. 12h“ die Behandlungen mit Ca-Ionophor zu den jeweiligen Stunden nach
Fertilisationsbeginn zu verstehen.
4.2.1 Teilungsrate
In Abbildung 24 sind die Teilungsraten der COK bzw. Oozyten in den einzelnen
Gruppen in Abhängigkeit vom Aktivierungszeitpunkt dargestellt.
In der Gruppe COK24 war die Teilungsrate signifikant (p<0,05) verschieden zwischen
den Aktivierungszeitpunkten 6h und 12h. Das Ergebnis war unabhängig vom Gehalt
des Aktivierungsmediums an Ca2+- und Mg2+-Ionen. Zwischen den Aktivierungs-
zeitpunkten 8h und 12h gab es in dieser Gruppe einen signifikanten Unterschied
(p<0,05), wenn keine Ca2+- und Mg2+-Ionen im Aktivierungsmedium waren.
Bei der Gruppe COK30 wurden zwischen den Aktivierungszeitpunkten 6h und 8h
sowie 8h und 12h signifikant (p<0,01) unterschiedliche Teilungsraten beobachtet,
wenn keine Ca2+- und Mg2+-Ionen anwesend waren. Bei der Gruppe Oozyten24 gab
es in Anwesenheit von Ca2+- und Mg2+-Ionen signifikante Unterschiede (p<005)
zwischen den Aktivierungszeitpunkten 8h und 12h bzw. 6h und 12h.
Ergebnisse
108
0
10
20
30
40
50
60
70
80T
eilu
ng
srat
e (%
)
6 h 8 h 12 h
Aktivierungszeitpunkt
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
Oozyte mit Ca/Mg
Oozyte ohne Ca/Mg
Oozyte mit Ca/Mg
Oozyte ohne Ca/Mg
A
B
C
D
E
K
F
G I
HJ
24
24
30
30
24
24
30
30
A:B, E:D, I:J, K:J (p<0,05); C:D, F:G, G:H (p<0,01)
Abbildung 24: Teilungsraten von COK bzw. Oozyten in Abhängigkeit von ihrem Aktivierungszeitpunkt
In Tabelle 4.9 sind die Teilungsraten der COK bzw. Oozyten in den einzelnen
Gruppen in Abhängigkeit von ihrer Reifungsdauer und dem Gehalt an Ca2+- und
Mg2+-Ionen im Aktivierungsmedium dargestellt. In den COK-Gruppen führte eine
Aktivierung 8 h nach Beginn der IVF zu signifikant unterschiedlichen Teilungsraten.
Unabhängig von Ca2+/Mg2+-Gehalt des Aktivierungsmediums war die Teilungsrate in
den Gruppen COK24 signifikant (p<0,05) höher als in den Gruppen COK30. Wurde
12 h nach IVF aktiviert, so wurde ein signifikanter Einfluss (p<0,01) der Reifungszeit
nur bei Oozyten beobachtet, die in Ca2+ und Mg2+-haltigem Medium aktivierten
wurden. Zum Aktivierungszeitpunkt 6h war in keiner Gruppe ein signifikanter Einfluss
der Reifungszeit auf die Teilungsrate nachweisbar.
Eine signifikante Beeinflussung der Teilungsrate (p<0,01) durch die An- bzw.
Abwesenheit von CZ bei einer 24-stündigen Reifung wurde dann beobachtet, wenn
8 h nach IVF aktiviert wurde. Dieses Ergebnis war unabhängig von Ca2+- und Mg2+-
Ionen im Aktivierungsmedium. Bei gleicher Reifungszeit, aber einer Aktivierung 12 h
nach Fertilisationsbeginn, konnte der Einfluss der CZ nur bei Abwesenheit von Ca2+-
und Mg2+-Ionen im Aktivierungsmedium nachgewiesen werden (p<0,001).
Ergebnisse
109
In den Gruppen mit einer 30-stündigen Reifungszeit wurde eine Beeinflussung der
Teilungsrate durch die CZ bei Verwendung von Aktivierungsmedium mit Ca2+ und
Mg2+-Ionen zum Aktivierungszeitpunkt 6h und 12h (p<0,01) und bei Verwendung von
Aktivierungsmedium ohne Ca2+ und Mg2+-Ionen zum Aktivierungszeitpunkt 12h
(p<0,05) festgestellt.
Tabelle 4.9: Teilungsraten von COK bzw. Oozyten in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem verwendeten Aktivierungsmedium
Aktivierungszeitpunkt
6h 8h 12h
Gruppe
n/N (%) n/N (%) n/N (%)
COK24 mit Ca/Mg 85/137 (62,0) 105/146 (71,9)A, a 91/124 (73,4)
COK24 ohne Ca/Mg 83/141 (58,9) 84/127 (66,1)C, c 106/133 (79,7)e
COK30 mit Ca/Mg 119/171 (69,6)g 82/136 (60,3)B 94/136 (69,1)i
COK30 ohne Ca/Mg 126/189 (66,7)k 68/132 (51,5)D 82/117 (70,1)m
Oozyte24 mit Ca/Mg 74/144 (51,4) 56/114 (49,1)b 90/140 (64,3)E
Oozyte24 ohne Ca/Mg 73/132 (55,3) 59/128 (46,1)d 82/144 (56,9)f
Oozyte30 mit Ca/Mg 115/215 (53,5)h 75/142 (52,8) 64/137 (46,7)F, j
Oozyte30 ohne Ca/Mg 99/183 (54,1)l 78/143 (54,5) 71/124 (57,3)n
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant:
a:b, e:f, i:j (p<0,001); c:d, g:h, k:l (p<0,01); m:n (p<0,05) in Abhängigkeit von ihrem CZ-Besatz,
A:B, C:D (p<0,05); E:F (p<0,01) in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit
In den Kontrollgruppen erhöhte sich die Teilungsrate in Abhängigkeit vom
Aktivierungszeitpunkt (Abb. 25 und Tab. 4.10). Die unterschiedlichen Teilungsraten
zu den Aktivierungszeitpunkten 6h und 12h in der Kontrollgruppe COKK30 waren
signifikant (p<0,05).
Eine signifikante Beeinflussung (p<0,01) der Teilungsrate durch die Reifungszeit
wurde in den Kontrollgruppen nur zum Aktivierungszeitpunkt 12h beobachtet.
Ergebnisse
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(%)
6 h 8 h 12 h
Aktivierungszeitpunkt
COK
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
COK
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
K24
K30
24
24
30
30
A e
b B
f a
c
d
Die Teilungsrate war bei der Gruppe COK24 im Vergleich zur Kontrollgruppe COKK24
höher, wenn die Aktivierung 12 h nach Fertilisationsbeginn erfolgte. Dieser
Unterschied war signifikant und unabhängig davon, ob das Aktivierungsmedium
Ca2+- und Mg2+-Ionen enthielt (p<0,01) oder nicht (p<0,001).
Wenn die Gruppen 8 h nach IVF-Beginn ohne Ca2+- und Mg2+-Ionen aktiviert wurden,
war die Teilungsrate der Kontrolle COKK30 gegenüber der Gruppe COK30 signifikant
höher (p<0,05).
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppe;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B (p<0,05)
e:f (p<0,05); a:b, a:c (p<0,01); a:d (p<0,001)
Abbildung 25: Teilungsraten von COK im Vergleich zu Kontrollgruppen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit, dem verwendeten Aktivierungsmedium und des Aktivierungszeitpunktes
Ergebnisse
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6h 8h 12h
Aktivierungszeitpunkt
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
COK mit Ca/Mg
COK ohne Ca/Mg
Oozyte mit Ca/Mg
Oozyte ohne Ca/Mg
Oozyte mit Ca/Mg
Oozyte ohne Ca/Mg
A
B
C
D
E
F
H
G I
J
K
24
24
30
30
24
24
30
30
L
M
N
4.2.2 Blastozystenrate
In Abbildung 26 sind die Blastozystenraten bezogen auf die geteilten Eizellen in
Abhängigkeit von ihrer Reifungsdauer, ihrem Besatz mit CZ, dem verwendeten
Aktivierungsmedium und dem Aktivierungszeitpunkt dargestellt. Betrachtet man die
Gruppen COK24, so wurde die höchste Blastozystenrate (53,3 %) dann erreicht,
wenn die Aktivierung 8 h nach Fertilisationsbeginn in Medium mit Ca2+- und Mg2+-
Ionen erfolgte. Bei den Gruppen COK30 gab es einen signifikanten Unterschied
(p<0,05) nur zwischen den Aktivierungszeitpunkten 6h und 12h in Abwesenheit von
Ca2+ und Mg2+. Die Blastozystenrate bei den Oozyten24 unterschied sich zwischen
den Aktivierungszeitpunkten 8h und 12h unabhängig von der Anwesenheit von Ca2+
und Mg2+ (p<0,01) und zwischen 6h und 12h, wenn keine Ca2+- und Mg2+-Ionen im
Aktivierungsmedium waren (p<0,05).
A:B, E:F, K:J, L:M (p < 0,05); C:D, G:H, I:J, L:N (p<0,01)
Abbildung 26: Blastozystenrate von COK bzw. Oozyten, bezogen auf die geteilten Eizellen in Abhängigkeit von Aktivierungszeitpunkt, Reifungsdauer und Aktivierungsmedium
Ergebnisse
112
Bei den Oozyten30-Gruppen wurden signifikant unterschiedliche Blastozystenraten
beobachtet, wenn keine Ca2+ und Mg2+-Ionen anwesend waren. Sie unterschieden
sich zwischen den Aktivierungszeitpunkten 6h und 8h bzw. 6h und 12h (p<0,05 bzw.
p<0,01).
In Tabelle 4.11 sind die Blastozystenraten bezogen auf die geteilten Eizellen in
Abhängigkeit von ihrer Reifungsdauer, dem verwendeten Aktivierungsmedium und
dem Aktivierungszeitpunkt zusammengefasst. Aus den Angaben in dieser Tabelle
geht hervor, dass die Blastozystenrate in der Gruppe der COK, die über 24 h gereift
wurden, von der Zusammensetzung des Mediums abhängig war. Erfolgte die
Aktivierung solcher COK 8 h nach Beginn der IVF, so wurde die Blastozystenrate
signifikant (p<0,05) positiv durch Ca2+ und Mg2+-Ionen im Aktivierungsmedium
beeinflusst. Der Einfluss der CZ war während der Fertilisation und Behandlung mit
Ca-Ionophor für alle Aktivierungszeitpunkte und Reifungszeiten signifikant (p<0,001).
Tabelle 4.11: Blastozystenraten von COK bzw. Oozyten, bezogen auf die geteilten Eizellen in Abhängigkeit von Reifungsdauer, Aktivierungsmedium und Aktivierungszeitpunkt
Aktivierungszeitpunkt 6h 8h 12h Gruppe
n/N (%) n/N (%) n/N (%)
COK24 mit Ca/Mg 33/85 (38,8)a 56/105 (53,3)A, .,a 37/91 (40,6)a
COK24 ohne Ca/Mg 21/83 (25,3)c 31/84 (36,9)�,c 47/106 (44,3)c
COK30 mit Ca/Mg 34/119 (28,6)e 30/82 (36,6)B,e 38/94 (40,4)e
COK30 ohne Ca/Mg 30/126 (23,8)g 17/68 (25,0)g 32/82 (39,0)g
Oozyte24 mit Ca/Mg 6/74 (8,1)b 1/56 (1,8)b 12/90 (13,3)b
Oozyte24 ohne Ca/Mg 5/73 (6,8)d 2/59 (3,4)d 16/82 (19,5)d
Oozyte30 mit Ca/Mg 2/115 (1,7)f 5/75 (6,7)f 4/64 (6,2)f
Oozyte30 ohne Ca/Mg 1/99 (1,0)h 6/78 (7,7)h 10/71 (14,1)h
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant:
a:b, c:d, e:f, g:h (p<0,001) in Abhängigkeit von ihrem CZ-Besatz; .:� (p<0,05) in Abhängigkeit vom Aktivierungsmedium; A:B (p<0,05) in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit;
Ergebnisse
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6 h 8 h 12 h
Aktivierungszeitpunkt
COK
COK mit Ca u.Mg
COK ohne Ca u. Mg
COK
COK mit Ca u. Mg
COK ohne Ca u. Mg
K24
K30
24
24
30
30
a
b A
g
c
d B
e
f
C
Zwischen den Kontrollgruppen unterschied sich die Blastozystenrate signifikant bei
COKK30 zwischen Aktivierungszeitpunkt 6h und 8h bzw. 6h und 12h (p<0,001 bzw.
p<0,01).
Ein signifikanter Einfluss (p<0,05) der Reifungszeit auf die Blastozystenrate war bei
beiden Kontrollgruppen zum Aktivierungszeitpunkt 6h und 8h nachweisbar.
Die Blastozystenrate war bei der Gruppe COK24 im Vergleich zur Gruppe COKK24
signifikant erhöht (p<0,05), wenn die Aktivierung 12 h nach Fertilisationsbeginn ohne
Ca2+ und Mg2+ erfolgte. Fand die Aktivierung zum Zeitpunkt 6h statt, war die
Blastozystenrate bei COK30 signifikant höher (p<0,001) als bei COKK30 und zwar
unabhängig von der Anwesenheit beider Ionen im Aktivierungsmedium (Abb. 27).
Säulen mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Gruppen;
Säulen mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich zwischen den Gruppen;
A:B (p<0,001); A:C (p<0,01);
a:b, c:d, e:f (p<0,05); b:g, b:h (p<0,001)
Abbildung 27: Blastozystenrate bezogen auf die geteilten COK in Abhängigkeit von Reifungsdauer, Aktivierungsmedium und Aktivierungs-zeitpunkt im Vergleich zu den Kontrollgruppen
Ergebnisse
114
4.3 Experiment III: Bestimmung der parthenogenetischen Entwicklung nach Aktivierung von Oozyten bzw. COK mit Ca-Ionophor
Im Experiment III wurde die parthenogenetische Entwicklung von in vitro maturierten
COK bzw. Oozyten nach Aktivierung mit Ca-Ionophor A23187 untersucht, um die
Ergebnisse des Experiments II besser bewerten zu können. Die in dem Experiment
beobachteten Teilungsraten, als Ausdruck einer stattgefundenen Aktivierung, sind in
Tabelle 4.13 zusammengefasst.
Tabelle 4.13: Teilungsraten von COK bzw. Oozyten nach Aktivierung mit Ca-Ionophor A23187
Teilungsrate Aktivierungszeitpunkt 8h Aktivierungszeitpunkt 12h
Gruppe n/N (%) n/N (%)
COK24 mit Ca/Mg 33/121 (27,3)A 12/94 (12,8)α,B,c
COK24 ohne Ca/Mg 41/116 (35,3)C 13/105 (12,4)D,e
COK30 mit Ca/Mg 30/121 (24,8)a,A 24/97 (24,7)β,B
COK30 ohne Ca/Mg 40/127 (31,5)E 18/100 (18,0)F,g
Oozyten24 mit Ca/Mg 44/130 (33,8) 40/114 (35,1)d
Oozyten24 ohne Ca/Mg 34/118 (28,8) 28/114 (24,6)χ,f
Oozyten30 mit Ca/Mg 53/140 (37,8)b 35/113 (31,0)
Oozyten30 ohne Ca/Mg 42/157 (26,7)E 45/112 (40,2)δ,F,h
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant;
A:B (p<0,01); C:D (p<0,001); E:F (p<0,05) bezüglich des Aktivierungszeitpunktes
α:β, χ:δ (p<0,05) bezüglich der Reifungszeit
a:b, e:f (p<0,05); c:d, g:h (p<0,001) bezüglich des CZ-Besatzes
Ein signifikanter Einfluss des Aktivierungszeitpunktes auf die parthenogenetische
Teilungsrate wurde in allen COK-Gruppen und in der Gruppe Oozyten30, die ohne
Ergebnisse
115
Ca/Mg behandelt wurden, festgestellt. Dabei war die Teilungsrate bei einer späteren
Aktivierung, mit Ausnahme bei der letztgenannten Gruppe, gegenüber der bei einer
früheren Aktivierung (8 h) niedriger.
Die Reifungszeit hatte zum Aktivierungszeitpunkt 12h in den COK-Gruppen (mit
Ca/Mg) und Oozyten-Gruppen (ohne Ca/Mg) einen signifikanten Einfluss (p<0,05)
auf die Aktivierung.
Der Gehalt an Ca- und Mg-Ionen beeinflusste die Ergebnisse der Aktivierung nicht
signifikant. Lediglich die Gruppe Oozyten30 macht hiervon eine Ausnahme (p<0,05),
wenn die Aktivierung 8 h nach Beginn der IVF erfolgte.
Ein Einfluss der CZ auf die Teilungsrate konnte sowohl zum Aktivierungszeitpunkt 8h
als auch 12h, unabhängig von der Maturationsdauer der COK bzw. Oozyten und
auch davon, ob Ca/Mg-Ionen im Aktivierungsmedium vorhanden waren,
nachgewiesen werden. Denudierte Oozyten hatten eine deutliche höhere
Teilungsrate als die COK. Dieser Unterschied war in 4 Gruppen signifikant (p<0,05).
In Tabelle 4.14 sind die Teilungsraten der aktivierten COK denen der nicht
aktivierten Kontrollgruppen gegenübergestellt.
Tabelle 4.14: Teilungsraten von COK nach Aktivierung mit Ca-Ionophor A23187 im Vergleich zu Kontrollgruppen
Teilungsrate Aktivierungszeitpunkt 8h Aktivierungszeitpunkt 12h
Gruppe
n/N (%) n/N (%)
COK24 mit Ca/Mg 33/121 (27,3)a 12/94 (12,8)e
COK24 ohne Ca/Mg 41/116 (35,3)a 13/105 (12,4)e
COK30 mit Ca/Mg 30/121 (24,8) 24/97 (24,7)
COK30 ohne Ca/Mg 40/127 (31,5)c 18/100 (18,0)
COKK24 12/109 (11,0)b,A 4/118 (3,4)f,B
COKK30 22/136 (16,2)d 14/101 (13,8)
Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant;
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
a:b (p<0,001); c:d (p<0,01); e:f (p<0,05); A:B (p<0,05)
Ergebnisse
116
Die Teilungsraten in den Kontrollgruppen waren im Vergleich zu denen in den
aktivierten Gruppen signifikant niedriger. Sie war bei einer frühen (8h) chemischen
(durch Ca-Ionophor) bzw. „spontanen“ (mechanisch, durch Umsetzen der COK)
Aktivierung, überwiegend signifikant höher, als wenn dies zu einem späteren
Zeitpunkt (12h) erfolgte.
Obwohl in den Versuchs- und Kontrollgruppen parthenogenetisch bedingte
Teilungen beobachtet wurden, fand in keiner der Gruppen eine embryonale
Entwicklung bis zur Blastozyste statt. Die Eizellen wurden nicht histologisch
untersucht, weil die aktivierten Oozyten bzw. COK nach 8 Tagen IVK dafür zu stark
degeneriert bzw. fragmentiert waren.
Diskussion
117
5 Diskussion
In der vorliegenden Studie wurde zunächst (Experiment 1) der zeitliche Verlauf der
In-vitro-Fertilisation (IVF) untersucht, um danach in einem zweiten Experiment
Oozyten bzw. COK im Zeitraum zwischen der Penetration des Spermiums und der
Syngamie gezielt mit Ca-Ionophor A23187 zu behandeln. In einem dritten
Experiment wurde untersucht, ob die Behandlung von Oozyten bzw. COK mit Ca-
Ionophor A23187 zu einer parthenogenetischen Entwicklung führt und ob dabei das
Stadium der Blastozyste erreicht wird.
Experiment 1:
Unabhängig von der verwendeten Reifungszeit wurden befruchtete Oozyten bzw.
COK frühestens ab der dritten Stunde nach Insemination im IVF-System beobachtet.
Dieses Ergebnis stimmt mit den Beobachtungen von XU und GREVE (1988) sowie
anderer Autoren (FUKUI, 1990; TAJIK et al., 1994; DOMINKO u. FIRST, 1997)
überein, welche in vitro die ersten Penetrationen zwischen drei und sechs Stunden
nach der Insemination registrierten. In den eigenen Experimenten wurde die
maximale Befruchtungsrate zwischen 15 h und 18 h nach IVF-Beginn erreicht, was
die Ergebnisse von PARRISH et al., (1985) bestätigt, wonach eine 18-stündige
Inkubation der Rinderoozyten mit den Spermien zu optimalen Fertilisationsraten
führt.
Die Anwesenheit eines Vorkerns oder wurde ab 6 h nach Insemination beobachtet.
Zwischen 6 h und 12 h nach IVF-Beginn stieg der Anteil der Oozyten bzw. COK mit
einem Vorkern signifikant an und zum Zeitpunkt 15h hatten alle untersuchten COK
bzw. Oozyten mindestens einen Vorkern gebildet. In den Experimenten von XU und
GREVE (1988) sowie DOMINKO und FIRST (1997) wurden Vorkerne erst 8 h nach
Insemination gesehen. Dieser Unterschied ist wahrscheinlich durch die spezifischen
Kulturbedingungen, die diese Autoren in ihren Experimenten benutzten, bedingt.
Die männlichen Vorkerne bildeten sich früher als die weiblichen (22,2 % männliche
bzw 4,2 % weibliche Vorkerne zum Zeitpunkt 9h). Diese Beobachtungen stimmen mit
den Untersuchungsergebnissen von XU und GREVE (1988), CROZET (1984) und
HYTTEL et al. (1988b) überein. Die genannten Autoren sind der Ansicht, dass sich,
obgleich das weibliche Chromatin aktiviert wird, sobald ein Spermium das Ooplasma
penetriert, der weibliche Vorkern langsamer entwickelt als der männliche. Unter In-
Diskussion
118
vivo-Bedingungen ist dieser Prozess besser synchronisiert (HYTTEL et al., 1989;
LAURINCIK et al., 1996).
Die signifikante Abnahme des Anteiles Oozyten bzw. COK mit einem weiblichen
Vorkern zwischen den Zeitpunkten 18h und 21h ist durch die Syngamie bedingt.
Diese erreicht während dieser Zeit ihr Maximum. Auch der Anteil Oozyten bzw. COK
mit männlichem und noch nicht formiertem weiblichen Vorkern sank in diesem
Zeitraum ab. Die Abnahme des Anteils Oozyten mit männlichem und noch nicht
formiertem weiblichen Vorkern zwischen den Zeitpunkten 9h und 12h ist mit der
beginnenden Bildung der weiblichen Vorkerne und der Zunahme des Anteils der
Oozyten mit zwei Vorkernen zu erklären.
Zwei Vorkerne wurden ab dem Zeitpunkt 6h (bei 24 h IVM) bzw. 9h (bei 30 h IVM)
festgestellt. Bedingt durch die fortschreitende Syngamie verschwanden diese im
Verlauf der IVF. KING et al. (1988) und MARTINI et al. (2000) wiesen die Möglichkeit
einer spontanen Aktivierung unter experimentellen Bedingungen nach. HYTTEL et
al. (1989) vermuteten, dass bei extranumerischen Vorkernen wahrscheinlich die
Dekondensation der Chromosomen gestört wurde und dieses Phänomen mit der
Calcium-Konzentration im Medium assoziiert sein kann. HYTTEL et al. (1988c)
fanden in ihren Experimenten extranumerische Spermien mit Akrosomreaktion (AR)
im perivitellinen Spaltraum und Spermien mit verschiedenen Vorkernstadien im
Ooplasma. Diese Ergebnisse erklären zumindest teilweise das Auftreten von COK
bzw. Oozyten mit drei Vorkernen ab dem Zeitpunkt 9h. In der eigenen Arbeit wurde
jedoch nicht die Konzentration von Calcium im Befruchtungsmedium berücksichtigt.
Es kann auch keine Aussage darüber getroffen werden, ob die beobachteten
extranumerischen Vorkerne aus der Eizelle oder aus extrapenetrierten Spermien
resultierten.
Die Zellkernstadien der befruchteten Oozyten bzw. COK wurden zum Zeitpunkt 6h,
9h und 12h untersucht, weil in diesem Zeitraum die meisten Vorkerne beobachtet
wurden. XU und GREVE (1988) stellten fest, dass Abnormalitäten bei der
Vorkernbildung, wie Fehler bei der Dekondensation des Chromatins und verzögerte
Entwicklung des Vorkerns, sich meistens bei den männlichen Vorkernen ereignen.
Fehler bei der Reifung der weiblichen Vorkerne treten nach Aussage o.g. Autoren
seltener auf. Zum Zeitpunkt 6h waren die meisten befruchteten COK bzw. Oozyten
noch in der Metaphase-II (M-II). Die Telophase-II wurde am häufigsten zum
Zeitpunkt 9h beobachtet und dekondensierte Vorkerne wurden ab Zeitpunkt 9h
Diskussion
119
gefunden. Die weibliche Vorkernbildung begann bei befruchteten COK bzw. Oozyten
ab 9 h nach der Insemination und die meisten der untersuchten befruchteten
Oozyten hatten zum Zeitpunkt 12h einen vollständigen Vorkern gebildet. Das steht
im Einklang mit den Ergebnissen anderer Autoren, die die Vorkernbildung zwischen
8 und 14 h nach Insemination beobachteten (XU u. GREVE, 1988; HYTTEL et al.,
1988c; FUKUI, 1990; DOMINKO u. FIRST, 1997).
Bei Anwesenheit von Cumuluszellen (CZ) an den Oozyten während der IVF wurden
im Zeitraum von 0h zu 3h eher Ereignisse der Befruchtung beobachtet, als nach
Verwendung denudierter Oozyten. Erst ab 9 h nach Insemination war die
Befruchtungsrate zwischen allen Gruppen ausgeglichen. COX et al. (1993)
berichteten, dass das Tempo der Penetration der Spermien durch die CZ nicht
beeinflusst wird. Anderseits war CROZET (1984) der Meinung, dass die CZ zwar
eine chemotaktische Anziehung auf die Spermien ausüben, aber in jedem Fall die
extrapenetrierenden Spermien von der ZP aufgehalten werden. Die Aufgaben der
CZ umfassen u.a. die Orientierung des Spermiums in Richtung der Eizelle
(BEDFORD u. KIM, 1993) und die Förderung der Kapazitation (BAVISTER, 1992)
sowie der AR (BOATMAN u. ROBBINS, 1991). MATTIOLI et al. (1988) stellten fest,
dass CZ die Penetration des Spemiums und die Befruchtung durch die Verhinderung
einer Verhärtung der ZP erleichtern. Die prinzipielle Fähigkeit von denudierten
Oozyten zur Fertilisation wurde von FUKUI (1990) demonstriert. Er konnte zeigen,
dass denudierte Oozyten fähig sind, eine AR auszulösen und auch fertilisiert zu
werden. Ihre Entwicklungsfähigkeit war jedoch im Vergleich zu COK sehr vermindert.
Insgesamt befinden sich die eigenen Ergebnisse im Einklang mit den Erkenntnissen
der o.g. Autoren.
Die CZ hatten auch einen positiven Effekt auf die Syngamierate im Zeitraum von 12
bis 21 h nach Insemination. Es konnte zwar kein signifikanter Einfluss der CZ auf
das Auftreten eines Vorkernes festgestellt werden, aber tendenziell gab es einen
höheren Anteil Oozyten mit einem Vorkern in den COK-Gruppen. MATTIOLI et al.
(1988) konnten zeigen, dass die Anwesenheit von CZ während der Fertilisation
wichtig für die Dekondensation der Spermien und für die Bildung des männlichen
Vorkerns ist. Andere Autoren (BRACKETT et al., 1989) stellten fest, dass ein intakter
Cumuluszellverband um die Oozyten unmittelbar vor oder nach der Befruchtung die
Embryonalentwicklung positiv beeinflusst, aber ab 20 h nach der IVF nicht essentiell
hierfür ist (ZHANG et al., 1995). Nach einer 24-stündigen IVM reichen die
Diskussion
120
Mikrofortsätze der CZ noch bis in den perivitellinen Spaltraum oder sind noch in
Verbindung mit der Plasmamembran. Sie sind also nicht, wie bei der In-vivo-
Maturation, vollständig zurückgezogen (DE LOOS et al., 1992). Die CZ sind durch
die Übertragung von cAMP in die Eizelle an der Fortsetzung des Zellzyklus beteiligt
(SIRARD et al., 1992; AKTAS et al., 1995). Die Unterbrechung der Verbindungen
zwischen CZ und Oozyten während der Endreifung (MATTIOLI et al., 1988; DE
LOOS et al., 1991) beeinflusst die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten nach IVM
durch einen Mechanismus, welcher die Reduktion des cAMP in ihrem Inneren, die
Deaktivierung der PKA und die Inhibition der Purine umfasst (PICTON et al., 1998).
Im Experiment I wurde ein Einfluss der Reifungsdauer (24 h bzw. 30 h) auf die
Befruchtungsrate zum Zeitpunkt 3h und 6h festgestellt. Ursache hierfür könnten
diploide Oozyten sein, die nach zu langer Maturation signifikant häufiger auftreten
(OCANA-QUERO et al., 1999) und so die Befruchtungsrate negativ beeinflussten.
Für die Dekondensation des Chromatins des penetrierenden Spermienkopfes ist
eine höhere Aktivität des MPF erforderlich (DOMINKO u. FIRST, 1997). WU et al.
(1997) sowie WEHREND und MEINECKE (2001) fanden, dass der MPF während
der Maturation zwischen 20 und 24 h, also während der M-II, ein Aktivitätsplateau
erreicht. Diese hohe Aktivität des MPF bleibt für einige Stunden erhalten und nimmt
ab 30 Stunden stufenweise ab (WU et al., 1997). Im Fall der 30-stündigen Reifung
könnten die penetrierenden Spermien nicht mehr genügend aktiven MPF für eine
vollständige Dekondensation des Chromatins besitzen. Dies könnte die bessere
Befruchtungsrate bei den 24 h maturierten COK bzw. Oozyten erklären. Anderseits
ist die Deaktivierung des MPF nach der Befruchtung erforderlich, damit der
Zellzyklus von der Metaphase zur ersten Embryonalinterphase voranschreiten kann
(DOMINKO u. FIRST, 1997).
Das Erscheinen eines Vorkerns wurde ebenfalls von der Reifungsdauer beeinflusst.
Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass der Anteil COK bzw. Oozyten mit einem
Vorkern im Zeitraum von 6 – 9 h nach dem Beginn der IVF dann erhöht war, wenn
eine vergleichsweise kurze Reifungszeit (24 h) gewählt wurde. Der gleiche Effekt
wurde auch bei der Bildung eines weiblichen Vorkerns bei COK bzw. Oozyten
beobachtet, die nachgewiesenermaßen befruchtet waren. Hier wurde der höchste
Anteil Oozyten bzw. COK im M-II-Stadium bei 30-stündiger IVM gefunden. Die 24 h
gereiften COK wurden schneller aktiviert. Das konnte durch das schnellere Erreichen
der Telophase-II bei diesen Gruppen festgestellt werden und ist vielleicht durch die
Diskussion
121
oben erwähnte Absenkung der MPF-Aktivität nach 30 h IVM bedingt. Nach WARE et
al. (1989) werden die Oozyten als aktiviert betrachtet, die in ihrer Entwicklung bis zur
Telophase oder Vorkernbildung vorangeschritten sind.
Wenn man die Frage nach einer stattgefundenen Fertilisation unberücksichtigt lässt
und nicht zwischen parthenogenetisch und spermiuminduzierter Aktivierung bei den
untersuchten Oozyten bzw. COK unterscheidet, dann hatte die Reifungsdauer
keinen signifikanten Einfluss auf den Anteil Oozyten mit einem weiblichen Vorkern.
Demgegenüber hatte die Reifungsdauer aber einen deutlichen Einfluss auf das
Auftreten von männlichen Vorkernen zwischen den Zeitpunkten 6h und 9h. Der
Anteil COK24 mit männlichem Vorkern war niedriger als bei den COK30, d.h. bei den
COK30 wurden die weiblichen Vorkerne später oder langsamer gebildet.
Experiment 2:
Die Penetration eines Spermiums leitet in Oozyten einen vorübergehenden Anstieg
des Cai ein, dem Ca-Ozillationen folgen (BEMENT, 1992; YANAGIMACHI, 1994;
CAPCO, 2001). Oozyten können aber auch durch Stoffe aktiviert werden, die eine
Erhöhung des Cai bewirken (BEMENT, 1992). Diese Anstieg des Cai initiiert eine
Reihe struktureller und funktioneller Änderungen, die letztendlich zur
Embryonalentwicklung führen.
Das Ca-Ionophor A23187 kann Rinderoozyten durch Induktion einer intrazellulären
Freisetzung von Ca2+-Ionen aktivieren (STEINHARDT et al., 1974). Durch
Behandlung penetrierter Oozyten mit Ca-Ionophor A23187 vor der Syngamie sollte
der Cai-Spiegel erhöht werden, um eine mögliche Wirkung der Ionen auf die Bildung
weiblicher und männlicher Vorkerne und die anschließende Embryonalentwicklung
zu untersuchen.
Eine Behandlung befruchteter COK bzw. Oozyten 6 h nach Insemination hatte
keinen Effekt auf die Teilungs- und Blastozystenrate. JONES et al. (1995) stellen
fest, dass bei Säugetieren die Ca-Oszillationen nach der Fusion des Spermiums mit
der Oozyte 2 bis 6 h lang andauern können. Mit Vollendung der Syngamie scheinen
sie nicht mehr aufzutreten. Wie die Ergebnisse des ersten Experimentes gezeigt
haben, wurden zum Zeitpunkt 6h noch keine vollständigen Vorkerne beobachtet. Die
Vorkernbildung erfolgte erst ab 6 Stunden nach Insemination. Da zwischen den
Zeitpunkten 3h und 6h die ersten Penetrationen beobachtet wurden und der Cai-
Spiegel wahrscheinlich auf einem sehr hohen Niveau war, hatte die zusätzliche
Diskussion
122
Erhöhung des Cai offensichtlich keine Wirkung. Weil die meisten Oozyten zum
diesem Zeitpunkt noch in der M-II waren (Experiment I) und daher eine hohe MPF-
Aktivität hatten, ist es aber auch denkbar, dass eine zusätzliche Erhöhung des Cai
eine zu schnelle und zu frühe Deaktivierung des MPF zur Folge hat. Dies würde die
anschließende Dekondensation des männlichen Chromatins und folglich die weitere
Entwicklung hemmen.
Die Teilungsrate schien generell besser zu sein, wenn die Behandlung mit Ca-
Ionophor 12 h nach Insemination erfolgte, aber nur, wenn während der Behandlung
CZ anwesend waren. So war im Vergleich der COK- zu den Kontrollgruppen die
Teilungsrate bei den behandelten Gruppen zu diesem Aktivierungszeitpunkt höher.
Zum Zeitpunkt 9h konnten im Experiment I männliche und weibliche Vorkerne in
verschiedenen Entwicklungsstadien gefunden werden. Bei den COK24 fing zu
diesem Zeitpunkt bereits die Syngamie an. Es ist deshalb anzunehmen, dass die
Behandlung zum Zeitpunkt 12h einen Einfluss auf die Vorkernbildung, die Vorkerne
und die Syngamie hat. Ein zu niedriger Cai kann beispielsweise die Rekonstruktion
der Kernhülle verhindern (LOHKA u. MASUI, 1984). Obwohl in der Literatur keine
Hinweise darauf zu finden waren, dass bei der IVF während dieser Phase die Cai-
Konzentration eventuell zu niedrig ist, belegen die Ergebnisse der eigenen
Experimente einen positiven Effekt der Behandlung zu diesem Zeitpunkt auf die
Entwicklung bis zum Blastozystenstadium.
OZIL (1990) stellte bei Kaninchenoozyten fest, dass spätere Ereignisse wie die
Kompaktierung und Blastozystenbildung, durch wiederholte Calcium-Wellen
beeinflusst werden können. Demgegenüber schlussfolgerten YAZAWA et al. (2001)
aus ihren Untersuchungen bei der Maus, dass ein normales Muster von Ca-
Oszillationen nicht wesentlich für eine normale Fertilisation und
Embryonalentwicklung ist. Die mögliche Wirkungsweise einer Behandlung mit Ca-
Ionophor A23187 während der Syngamie ist aktuell noch nicht ausreichend geklärt.
Da bisher lediglich ein Einfluss des Cai auf die Fusion der Membranen während der
Befruchtung nachgewiesen wurde (WASSARMAN, 1987), kann angenommen
werden, dass ein positiver Einfluss der Behandlung auf die Fusion der
Vorkernmembranen während der Syngamie in den eigenen Experimenten
wahrscheinlich ist.
Von den untersuchten Parametern scheint die Anwesenheit von CZ der wichtigste
Faktor zu sein, um eine signifikante Wirkung durch die Behandlung mit Ca-Ionophor
Diskussion
123
während der IVF zu ermöglichen. Die Behandlung von denudierten Oozyten mit Ca-
Ionophor hatte keinen Effekt auf die Teilungsrate. Ein Effekt der CZ war auch
bezüglich der Blastozystenrate in den behandelten Gruppen zu allen
Aktivierungszeitpunkten nachweisbar. Im Vergleich zur Kontrolle war die
Blastozystenrate bei behandelten COK zum Aktivierungszeitpunkt 12h generell
höher und zum Aktivierungszeitpunkt 8h bei den COK, die in Anwesenheit von Ca2+
und Mg2+ aktiviert wurden. Eine Signifikanz war aber nur bei der Gruppe COK24, die
12 Stunden nach Insemination in Medium ohne Ca2+ und Mg2+ aktiviert wurden,
nachweisbar. Der positive Einfluss der Anwesenheit von CZ während der IVF kann
zum Teil durch die von CHIAN und SIRARD (1995) gefundene unterschiedliche
Proteinsynthese nach der Aktivierung in Oozyten mit intaktem CZ-Verband
gegenüber der in denudierten Oozyten erklärt werden. So wurden bestimmte
Proteine, die mit der Bildung des männlichen Vorkerns korrelieren könnten, nur bei
den Oozyten mit intaktem Cumulus synthetisiert. Es ist zu vermuten, dass die
Wirkung der Behandlung mit Ca-Ionophor in dieser Phase von der Synthese
bestimmter Proteine abhängig ist.
Im Gegensatz zu den CZ hatte die Reifungsdauer der Eizellen in Experiment II
keinen signifikanten Einfluss auf die Teilungsrate. Sie war tendenziell besser bei
einer 24-stündigen In-vitro-Reifung. Ein signifikanter Einfluss der Reifungszeit auf die
Blastozystenrate wurde nur bei COK beobachtet, wenn die Behandlung 8 h nach
Insemination und die Aktivierung in Anwesenheit von Ca- und Mg-Ionen erfolgte. Der
Erfolg bei den 24 h gereiften Eizellen ist durch die bessere Maturations- und
Fertilisationsrate bei dieser Reifungsdauer (Experiment I) erklärbar. Warum nur beim
Aktivierungszeitpunkt 8h ein signifikanter Einfluss der Reifungsdauer gefunden
wurde, kann nicht ausreichend erklärt werden. Es kann jedoch mit dem bereits
diskutierten Fakt zusammenhängen, dass bei 30 h gereiften bzw. gealterten COK die
Befruchtungsrate vermindert ist, weil der MPF zu diesem Zeitpunkt schon deaktiviert
ist und infolge dessen die Dekondensation des Chromatins des Spermiums bzw. die
Bildung des männlichen Vorkerns verhindert wird.
Ein signifikanter Einfluss der Anwesenheit von Ca2+- und Mg2+-Ionen im
Aktivierungsmedium auf die Teilungsrate konnte zu keinem Aktivierungszeitpunkt
nachgewiesen werden. Dies steht im Einklang mit den Untersuchungsergebnissen
von SHAW und TROUNSON (1989) sowie YAO und PARKER (1992), die für eine
vom Cae unabhängige Aktivierung mit Ca-Ionophor sprechen. In der Studie von
Diskussion
124
SHAW und TROUNSON (1989) war die Aktivierung der Zellkerne in einem
vollständigen Medium verlangsamt. Dies könnte durch die verringerte Löslichkeit des
Ionophores in Anwesenheit von bivalenten Kationen bedingt sein. WANG et al.
(1998) konnten zeigen, dass bei einer niedrigen Konzentration von Ca-Ionophor
(3 µM), die Aktivierung in Ca2+/Mg2+-freien Medien besser als in vollständigen Medien
erfolgte. AZIM et al. (1977) und WANG et al. (1999) vermuten, dass Änderungen des
Niveaus von Cae und Mge einen Effekt auf die Struktur des Zytoskeletts und die
Funktion der Oozyten haben könnten. Wie bereits erwähnt, hatte die Anwesenheit
dieser Ionen im Aktivierungsmedium nur in der Gruppe COK24 zum
Aktivierungszeitpunkt 8h einen signifikanten Effekt auf die Blastozystenrate. Sie war
deutlich höher bei den Gruppen, die in einem Medium mit Ca2+- und Mg2+-Ionen
aktiviert wurden.
Das Ca-Ionophor A23187 wirkt durch die Freisetzung von Calcium aus den Cai-
Vorräten. Die calcium release activated channels werden durch die Entleerung der
Cai-Vorräte geöffnet (PAREKH et al., 1993). Anderseits können die CRAC durch
zytosolisches Calcium gehemmt werden und dieser negative Feedback könnte für
die periodische Öffnung und Schließung von Plasmamembrankanälen verantwortlich
sein (BERRIDGE u. DUPONT, 1994). Durch eine zusätzliche Erhöhung des Cai mit
Ca-Ionophor könnten sich diese Plasmamembrankanäle schließen und ein
vollständiges Medium würde dann keinen Effekt haben.
Experiment 3:
Um die Ergebnisse von Experiment II zu verifizieren, wurde das Experiment III
durchgeführt. Die COK bzw. Oozyten, die sich in Experiment III geteilt bzw. sich bis
zu Mehrzellstadien entwickeln hatten, wurden als parthenogenetisch aktiviert
betrachtet. Die Teilung der Eizellen in den Kontrollgruppen des Experimentes III
erklärt sich durch ihre bekannte Fähigkeit zur spontanen parthenogenetischen
Aktivierung (KING et al., 1988; MARTINI et al., 2000). Bei den mit Ca-Ionophor
behandelten COK und den Kontrollgruppen war die Teilungsrate sowohl bei einer
chemischen (Ca-Ionophor) als auch einer spontanen Aktivierung (mechanisch)
höher, wenn diese früh erfolgte (8 h bzw. 12 h). Dies steht im Widerspruch zu den
Ergebnissen von WARE et al. (1989), die feststellten, dass die parthenogenetische
Aktivierungsrate zeitabhängig ansteigt.
Diskussion
125
NAGAI (1987) fand in seinen Experimenten, dass sich die spontane Aktivierung am
häufigsten bei „alten“ Oozyten ereignet, weil sie nach einer längeren Reifung eine
geringere Aktivität des MPF aufweisen. Dies wird durch die tendenziell höhere
Aktivierungsrate bei den Gruppen Oozyten30 in den eigenen Experimenten bestätigt.
Im Gegensatz dazu war sowohl die induzierte als auch die spontane Aktivierung der
COK nach einer Reifung über 30 h unabhängig von der möglichen Alterung der
Eizellen. Da außerdem denudierte Oozyten eine deutlich höhere Aktivierungsrate als
COK aufwiesen, lässt dies die Schlussfolgerung zu, dass CZ einen positiven Effekt
bezüglich der Hemmung parthenogenetischer Aktivierung ausüben. Damit werden
die Untersuchungsergebnisse von MARTINI et al. (2000) hinsichtlich der Rolle der
CZ sowie von WARE et al. (1989) hinsichtlich der Rolle der artifiziellen Denudierung
bei der Aktivierung bestätigt.
Auf Grund dieser Ergebnisse muss einerseits davon ausgegangen werden, dass ein
Teil der geteilten COK bzw. Oozyten im Experiment II Parthenoten waren.
Andererseits erscheinen die durch die Behandlung mit Ca-Ionophor angestiegenen
Blastozystenraten real, also nicht auf einer Parthenogenese basierend, weil im
Experiment III keine parthenogenetische Embryonalentwicklung bis zum
Blastozystenstadium beobachtet wurde.
Schlussfolgerungen
Die Untersuchungsergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, dass unter in
vitro Bedingungen die Wirkung einer Behandlung von Eizellen mit Ca-Ionophor
A23187 auf die frühe Embryonalentwicklung von deren Reifungsdauer, ihrem Besatz
mit Cumuluszellen während der Befruchtung und dem Zeitpunkt der Behandlung
abhängt. Die Cumuluszellen scheinen dabei der wichtigste Faktor zu sein, da ein
signifikant positiver Effekt der Behandlung nur bei COK, nicht jedoch bei denudierten
Oozyten beobachtet werden konnte, wenn die Behandlung 12 h nach Fertilisations-
beginn erfolgte. Dieser positive Effekt wurde auch bei einer Aktivierung zum
Zeitpunkt 8h erzielt, was zeitlich mit dem Erscheinen der Vorkerne und der Syngamie
zusammenfällt. Das lässt die Schlussfolgerung zu, dass beim Rind durch
Behandlung der Eizellen mit Ca-Ionophor A23187 und die damit verbundene
Erhöhung des intrazellulären Ca-Gehaltes die Blastozystenrate in vitro nur dann
signifikant positiv beeinflusst werden kann, wenn gleichzeitig durch die
Diskussion
126
Cumuluszellen die Synthese von bestimmten Faktoren, welche für die
Vorkernbildung, Syngamie und präimplantative Embryonalentwicklung erforderlich
sind, gewährleistet ist. Der Gehalt des Aktivierungsmediums an Ca2+- und Mg2+-
Ionen scheint dabei unwichtig zu sein.
Das hier dargestellte Verfahren stellt nur einen Ansatz zur Optimierung der In-vitro-
Produktion von Embryonen dar. Für deren weitere Annäherung an die in vivo
Verhältnisse und ein besseres Verständnis der präimplantativen
Embryonalentwicklung sind weitere Untersuchungen erforderlich, insbesondere zum
Aspekt der Interaktion zwischen intrazellulärem Calcium und den Cumuluszellen.
Zusammenfassung
127
6 Zusammenfassung
Adriane Haenisch Woehl Untersuchungen zum Einfluss von Calcium Ionophor A23187 während der In-vitro-
Fertilisation boviner Eizellen auf die präimplantative Embryonalentwicklung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den möglichen Einfluss einer Behandlung
von Cumulus-Oozyten-Komplexen bzw. Oozyten mit Ca-Ionophor zu bestimmten
Zeitpunkten nach ihrer In-vitro-Fertilisation auf die frühe Embryonalentwicklung zu
untersuchen. Der erste Untersuchungsabschnitt bestand in der Bestimmung des
zeitlichen Verlaufs von Spermienpenetration und Vorkernbildung bei in vitro gereiften
Oozyten des Rindes in Abhängigkeit von der Reifungsdauer und dem
Cumuluszellbesatz der Oozyten. Mit diesen Untersuchungen wurden die Zeitpunkte
ermittelt, zu denen im zweiten Abschnitt der Arbeit mit Ca-Ionophor aktiviert werden
sollte. Ziel des dritten Experimentes war es, die möglicherweise parthenogenetisch
bedingte Blastozystenrate unter den im Experiment II gewählten Bedingungen zu
untersuchen.
Befruchtete Oozyten bzw. COK wurden, unabhängig von ihrer Reifungsdauer, ab
drei Stunden nach Insemination beobachtet. Die Anwesenheit eines Vorkern wurde
ab sechs Stunden nach Insemination nachgewiesen. Die männlichen Vorkerne
bildeten sich früher als die weiblichen. Der Anteil Oozyten bzw. COK mit Syngamie
erreichte sein Maximum zwischen 18 und 21 Stunden nach Insemination.
Die Anwesenheit von Cumuluszellen an den Oozyten während der IVF beschleunigte
die Ereignisse der Befruchtung im Zeitraum von 0 bis 3 Stunden nach Insemination
und erhöhte die Syngamierate. Es konnte zwar kein signifikanter Einfluss der CZ auf
das Auftreten eines Vorkernes festgestellt werden, aber tendenziell gab es einen
höheren Anteil Oozyten mit einem Vorkern in den COK-Gruppen.
Eine vergleichsweise kürzere Reifungszeit (24 h) hat eine bessere Befruchtungsrate
und zu Beginn der IVF (6 – 9 h nach Insemination) einen höheren Anteil COK bzw.
Oozyten mit Vorkern zur Folge. Der gleiche Effekt wurde auch bei der Bildung eines
weiblichen Vorkerns bei COK bzw. Oozyten beobachtet, die nachgewiesenermaßen
befruchtet waren. Die 24 h gereiften COK wurden gegenüber den 30 h gereiften
auch schneller aktiviert.
Zusammenfassung
128
Eine Behandlung befruchteter COK bzw. Oozyten 6 h nach Insemination mit Ca-
Ionophor hatte keinen Effekt auf die Teilungs- und Blastozystenrate. Der positive
Effekt einer Behandlung mit Ca-Ionophor 12 h nach Insemination auf die
Teilungsrate wurde nur in Anwesenheit von CZ beobachtet. Ein Effekt der CZ war
auch bezüglich der Blastozystenrate in den behandelten Gruppen zu allen
Aktivierungszeitpunkten nachweisbar. Von den untersuchten Parametern scheint die
Anwesenheit von CZ der wichtigste Faktor zu sein, um eine signifikante Wirkung
durch die Behandlung mit Ca-Ionophor während der IVF zu ermöglichen.
Ein signifikanter Einfluss der Reifungszeit auf die Blastozystenrate wurde nur bei
COK beobachtet, wenn die Behandlung 8 h nach Insemination und die Aktivierung in
Anwesenheit von Ca- und Mg-Ionen erfolgte.
Ein signifikanter Einfluss der Anwesenheit von Ca2+- und Mg2+-Ionen im
Aktivierungsmedium auf die Teilungsrate konnte zu keinem Aktivierungszeitpunkt
nachgewiesen werden. Die Anwesenheit dieser Ionen im Aktivierungsmedium hatte
nur in der Gruppe COK24 zum Aktivierungszeitpunkt 8h einen signifikanten Effekt auf
die Blastozystenrate. Sie war deutlich höher bei den Gruppen, die in Medien mit Ca-
und Mg-Ionen aktiviert wurden.
Cumuluszellen haben einen positiven Effekt bezüglich der Hemmung der
parthenogenetischer Aktivierung. Obwohl ein Teil der geteilten COK bzw. Oozyten im
Experiment II Parthenoten waren, wurde im Experiment III keine parthenogenetische
Embryonalentwicklung bis zum Blastozystenstadium beobachtet.
Summary
129
7 Summary
Adriane Haenich Woehl Investigation of the influence of Ca-ionophore A23187 during the in vitro fertilization
of bovine oocytes to the early embryonic development
The aim of this study was to investigate whether the activation of cumulus oocyte
complexes (COC) and denuded oocytes with Calcium Ionophor A23187 in the period
between penetration of the spermatozoon and syngamy, has a positive effect on the
subsequent early embryonic development. The experiments were devided in three
parts: the first experimental extension concerned the investigation of the temporal
progress of the in vitro fertilization dependent on the duration of maturation and the
presence of cumulus cells around the oocytes. In the second part, the fertilized
COC/oocytes were treated at different times with calcium-ionophore to investigate
the possible effect of the treatment on cleavage and early embryonic development.
In the third part the possibility of parthenogenetic development was examined under
the conditions selected in the experiment II. This was done for a better interpretation
of the results obtained in the second part.
Fertilized oocytes and/or COCs were observed independent of its time of maturation
first at three hours after insemination and the presence of pronuclei was observed at
the earliest six hours after insemination. The male pronucleus was observed earlier
than the female. The highest syngamy rates of oocytes and/or COC were reached
between 18 and 21 hours after insemination.
The presence of cumulus cells around the oocytes during the IVF accelerated the
events of the fertilization in the period from 0 h to 3 h after insemination and
increased the syngamy rate. There was no significant influence of the cumulus cells
on the formation of a pronucleus, but there was a tendency for a higher rate of
oocytes with a pronucleus in the COC-groups.
A relatively shorter maturation time (24 h) had better fertilization advice and at the
beginning of the IVF (6 – 9 h after insemination) a higher portion of COCs and/or
oocytes with pronucleus were observed. The same effect was also observed in the
development of a female pronucleus in COCs and/or oocytes that were fertilized.
Summary
130
COCs for 24 h matured were also more quickly activated than COCs matured for
30 h.
A treatment of fertilized COCs and/or oocytes 6 h after insemination with Ca-
ionophore had no effect on the cleavage and blastocyst rate. The positive effect of a
treatment with Ca-ionophore 12 h after insemination on the cleavage rate was
observed only in the precence of cumulus cells. An effect of the cumulus cells
regarding the blastocyst rate was shown in all treated groups at all activation times.
Of the examined parameters, the presence of cumulus cells seems to be the most
important factor, in order to enable a significant effect through the treatment with Ca-
ionophor during the IVF.
A significant influence of the time of maturation on the blastocyst rate was observed
only in COCs when they were treated 8 h after Insemination in presence of Ca2+- and
Mg2+-ions. There was no significant influence of the presence of Ca2+ and Mg2+-ions
in the activation medium on the cleavage rate at all other examined activation times.
The presence of these ions in the activation mediums had a significant effect on the
blastocyst rate in the group COK24 when they were activated at 8 h post
insemination.
The presence of cumulus cells has exercised a positive effect regarding the inhibition
of parthenogenetic activation. Although a part of the divided COCs and/or oocytes in
the experiment II were parthenotes, in the experiment III no parthenogenetic
embryonic development to the stage of blastocyst was observed.
In conclusion, we found that through the treatment of in vitro matured COC with Ca-
Ionophor 9 or 12 h after insemination, an increase of the development rate to
blastocyst stage is possible when the time of maturation and the presence of the
cumulus cells are considered.
Anhang
131
8 Anhang
8.1 Verwendete Medien
Modifizierte phosphatgepufferte Salzlösung nach Dulbecco (D-PBS)
500 mg Glucose (Fa. Merck, Darmstadt)
18 mg Na-Pyruvat (Fa. Serva, Heidelberg)
10 mg Penicillin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
20 mg Streptomycin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
5,6 mg Heparin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
150 mg BSA (Fa. Sigma, Taufkirchen)
500 ml PBS-Dulbecco mit Ca2+/Mg2+ (Fa. Biochrom, Berlin)
Grundmedium
Als Grundmedium für die IVM und IVK wurde TCM-199 (tissue culture medium;
hepes modification) mit L-Glutamin und 25 mM Hepes verwendet. Es wurde alle 14
Tage vorbereitet, sterilfiltriert (Rotrandfilter, Fa. Clinico, Bad Hersfeld), auf pH 7,4
eingestellt und bei 6 °C gelagert. Dem Grundmedium wurde vor der Verwendung
10 % ECS der gleichen Charge (SANBUISSHO u. THRELFALL, 1985) zugesetzt.
Zusammensetzung des Grundmediums:
1510 mg TCM-199 Hepes Modification (Fa. Sigma, Taufkirchen)
5 mg Gentamycinsulfat (Fa. Sigma, Taufkirchen)
2,2 mg Na-Pyruvat (Fa. Serva, Heidelberg)
229 mg NaHCO3 (Fa. Serva, Heidelberg) extra gelöst
100 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg)
Anhang
132
Stammlösung Sperm-TALP
Die Stammlösung wurde spätestens alle vier Wochen neu hergestellt, auf pH 7,4
eingestellt, sterilfiltriert und bei 6 °C gelagert.
Zusammensetzung der Stammlösung Sperm-TALP:
1450 mg NaCl (Fa. Serva, Heidelberg)
57,5 mg KCl (Fa. Serva, Heidelberg)
522,5 mg NaHCO3(Fa. Serva, Heidelberg)
9 mg NaH2PO4 (Fa. Serva, Heidelberg)
������ Na-Laktat-Sirup 60 % (Fa. Sigma, Taufkirchen)
72 mg CaCl2 (Fa. Serva, Heidelberg)
77,5 mg MgCl2*6H2O (Fa. Serva, Heidelberg)
595 mg TCM 199 Hepes Modification (Fa. Sigma, Taufkirchen)
2,5 mg Phenolrot (Fa. Merck, Darmstadt)
250 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg)
Am Abend vor der Fertilisation wurde die Gebrauchslösung des
Kapazitationsmediums hergestellt und über Nacht im Brutschrank äquilibriert:
60 mg BSA (Fa. Sigma, Taufkirchen)
2,2 mg Na-Pyruvat (Fa. Serva, Heidelberg)
10 ml Stammlösung Sperm-TALP
Stammlösung Fert-TALP
Diese Stammlösung wurde alle zwei Wochen neu hergestellt, auf pH7,4 eingestellt,
sterilfiltriert und bei 6 °C gelagert.
Anhang
133
Zusammensetzung der Stammlösung Fert-TALP:
666 mg NaCl (Fa. Serva, Heidelberg)
23,5 mg KCl (Fa. Serva, Heidelberg)
210 mg NaHCO3(Fa. Serva, Heidelberg)
4 mg NaH2PO4 (Fa. Serva, Heidelberg)
������ Na-Laktat-Sirup 60 % (Fa. Sigma, Taufkirchen)
30 mg CaCl2 (Fa. Serva, Heidelberg)
10 mg MgCl2*6H2O (Fa. Serva, Heidelberg)
1 mg Phenolrot (Fa. Merck, Darmstadt,)
100 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg)
Am Abend vor der Fertilisation wurde die Gebrauchslösung des
Fertilisationsmediums hergestellt und über Nacht im Brutschrank äquilibriert.
60 mg BSA (Fa. Sigma, Taufkirchen)
2,2 mg Na-Pyruvat (Fa. Serva, Heidelberg)
10 ml Stammlösung Fert-TALP
Aus der Lösung Fert-TALP wurde am Tag der IVF durch Zugabe von 100 ���
Gentamycin-� ���� ��� �� ���-� ���� ���� ��� ���� ����-Epinephrin-Lösung das
Befruchtungsmedium hergestellt. Dieses wurde sterilfiltriert.
8.2 Medienzusätze
FSH-Lösung
Die FSH-Lösung (Ovagen®, Ch.-Nr. 2383/00-02, Fa. Bondico, Altmaar, Holland)
wurde alle drei Monate entsprechend der Herstellerangaben in einer Konzentration
Anhang
134
von 0,88 mg/ml hergestellt, in 1,5 ml Plastikröhrchen (Eppendorf, Hamburg) abgefüllt
und bei –20 °C gelagert.
estrus cow serum
Für die Herstellung von ECS wurde etwa alle sechs Monate von brünstigen Färsen
oder Kühen Blut gewonnen, dass etwa eine Stunde bei Raumtemperatur gelagert
wurde. Danach wurde es für 20 Minuten zentrifugiert. Der Serumüberstand wurde
abgesaugt, gepoolt und erneut zentrifugiert. Anschließend wurde das Serum eine
Stunde bei 56 °C im Wasserbad erhitzt, um das Komplementsystem zu inaktivieren.
Dann wurde das Serum portioniert. Es wurde immer 1 ml Serum in 1,5 ml
Plastikröhrchen (Eppendorf, Hamburg) bei –20 °C tiefgefroren.
Gentamycin-Lösung
Zusammensetzung der Gentamycin-Lösung:
12,5 mg Gentamycinsulfat (Fa. Sigma, Taufkirchen)
5 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg)
Heparin-Lösung
Zusammensetzung der Heparin-Lösung:
5 mg Heparin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
5 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad Homburg)
Die Herstellung dieser Lösungen erfolgte etwa alle drei Monate. Sie wurden
���������������� ���� ��� ���� ��� ���������� ��� ��� ��� �� �����öhrchen (Fa. Eppendorf,
Hamburg) bei –22 °C gelagert.
Anhang
135
Hypotaurin-Epinephrin-Lösung
Zusammensetzung der Hypotaurin-Epinephrin-Lösung:
Lösung 1:
20 ml 0,9 % NaCl-Lösung (Fa. Fresenius, Bad Homburg)
2,19 mg Hypotaurin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
Lösung 2:
50 ml Aqua (Ampuwa®, Fa. Fresenius)
50 mg Na-Metabisulfit (Fa. Sigma, Taufkirchen)
������ Na-Laktat-Sirup 60 % (Fa. Sigma, Taufkirchen)
����� HCl 37 % (Fa. Merck, Darmstadt)
Lösung 3:
40 ml Lösung 2
1,83 mg Epinephrin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
Endlösung:
10 ml Lösung 1
4 ml Lösung 3
16 ml 0,9 % NaCl-Lösung (Fa. Fresenius)
Diese Lösung wurde einmal jährlich hergestellt����������������� ���������� ������������
in 1,5 ml Plastikröhrchen (Fa. Eppendorf, Hamburg) portioniert und bei -22 °C
gelagert.
Anhang
136
Hyaluronidase-Lösung 0,1 %
Zusammensetzung der Hyaluronidase-Lösung:
1 mg Hyaluronidase (Fa.Sigma, Taufkirchen)
1 ml PBS-Dulbecco mit Ca2+/Mg2+ (Fa. Biochrom, Berlin).
Diese Lösung wurde mit Einzelvolumina von 400 ��� ��� �������� �����öhrchen (Fa.
Eppendorf, Hamburg) portioniert und bei -22 °C gelagert.
8.3 Verwendete Medien zur Aktivierung
Stock-Lösung Ca-Ionophor A23187
1mg Ca-Ionphor A23187 (Fa. Sigma, Taufkirchen)
1ml Dimethylsulfoxide (DMSO, D2650,Fa. Sigma, Taufkirchen)
Lösung 1 (WARE et al., 1989):
500 mg Glucose (Fa. Merck, Darmstadt)
18 mg Na-Pyruvat (Fa. Serva, Heidelberg)
10 mg Penicillin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
20 mg Streptomycin (Fa. Sigma, Taufkirchen)
500 ml PBS-Lösung mit (Fa. Biochrom, Berlin) bzw. ohne Ca2+/Mg2+ (Fa.
Sigma, Taufkirchen)
Diese Lösung wurde alle zwei Wochen neu hergestellt und bei einer Temperatur von
6 °C gelagert.
Anhang
137
Lösung 2 (CHIAN u. SIRARD, 1995)
Gebrauchslösung zur Aktivierung:
25 µl Stock-Lösung Ca-Ionophor A23187
2,475 ml Lösung 1
Diese Lösung wurde kurz vor der Benutzung vorbereitet.
8.4 Farbstofflösung
Aceto-Orcein Lösung
Ansatz der Farblösung:
2 g Orcein (Fa. Serva, Heidelberg)
100 ml 60 %ige Essigsäure (Lösungsmittel) (Fa. Roth, Karlsruhe)
Das Orcein wurde in einem Teil der Essigsäure (ca. 90 ml) gelöst und erwärmt bis es
fast kochte. Danach wurde es auf ca. 20 °C abgekühlt und mit dem restlichen
Lösungsmittel auf 100 ml aufgefüllt. Dann wurde die fertige Farbstofflösung durch
Filterpapier filtriert und bei einer Temperatur von 6 °C gelagert. Vor jeder Benutzung
wurde die Farbstofflösung erneut filtriert.
Anhang
138
8.5 Ergebnistabellen
Tabelle 4.2: COK bzw. Oozyten mit Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppen Zeit nach
IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0)A 0/70 (0,0)A 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 19/51 (37,3)b, B 28/72 (38,9)b, B 3/60 (5,0)a, E 2/36 (5,6)a, E
12 h 30/49 (61,2)c, C 37/63 (58,7)c, C 24/53 (45,3)c, e, G 13/13 (100,0)d, f, F
15 h 48/48 (100,0)D 29/29 (100,0)D 38/38 (100,0)H 21/21 (100,0)
18 h 57/57 (100,0) 49/49 (100,0) 45/45 (100,0) 46/46 (100,0)
21 h 60/60 (100,0) 21/21 (100,0) 44/44 (100,0) 37/37 (100,0)
24 h 70/70 (100,0) 60/60 (100,0) 33/33 (100,0) 24/24 (100,0)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
A:B, C:D, E:F, E:G, G:H (p < 0,001); B:C (p < 0,01) bezüglich des Untersuchungszeitpunktes; a:b, c:d (p < 0,001) bezüglich ihrer Reifungszeit; e:f (p < 0,001) bezüglich ihre CZ-Besatzes
Tabelle 4.3: COK bzw. Oozyten mit weiblichem Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppe Zeit nach IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0) 0/70 (0,0) 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 2/51 (3,9) 3/72 (4,2) 0/60 (0,0) 0/36 (0,0)
12 h 3/49 (6,1) 6/63 (9,5) 3/53 (5,7) 1/13 (7,7)
15 h 3/48 (6,2) 5/29 (17,2) 5/38 (13,1) 2/21 (9,5)
18 h 8/57 (14,0) 10/49 (20,4)A 9/45 (20,0)A 3/46 (6,5)
21 h 6/60 (10,0) 1/21 (4,8)B 2/44 (4,5)B 0/37 (0,0)
24 h 3/70 (4,3) 4/60 (6,7) 0/33 (0,0) 2/24 (8,3)
Werte mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant: A:B (p < 0,05)
Anhang
139
Tabelle 4.4: COK bzw. Oozyten mit männlichem Vorkern in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppe Zeit nach IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0)A 0/70 (0,0)A 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 10/51 (19,6)b, B 16/72 (22,2)b, B 3/60 (5,0)a 2/36 (5,5)a
12 h 1/49 (2,0)c, C 5/63 (7,9)C 7/53 (13,2)d 2/13 (15,4)
15 h 6/48 (12,5)D 2/29 (6,9) 5/38 (13,1) 1/21 (4,8)
18 h 0/57 (0,0)E 0/49 (0,0) 1/45 (2,2) 1/46 (2,2)
21 h 3/60 (5,0) 0/21 (0,0) 1/44 (2,3)F 1/37 (82,7)
24 h 1/70 (14,3)e 0/60 (0,0)g 11/33 (33,3)f, G 0/24 (0,0)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant;
A:B, B:C, D:E, F:G (p < 0,01), C:D (p < 0,05) bezüglich des Untersuchungszeitpunktes; e:f (p < 0,001), a:b, c:d (p < 0,01) bezüglich ihrer Reifungszeit; e:g (p < 0,001) bezüglich ihres CZ-Besatzes
Tabelle 4.5: COK bzw. Oozyten mit zwei Vorkernen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppe
Zeit nach IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0)A 0/70 (0,0)A 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 7/51 (13,7)a, B 9/72 (12,5)a, B 0/60 (0,0)b, G 0/36 (0,0)b, G
12 h 15/49 (30,6)C 22/63 (34,9)d, C 12/53 (22,6)m, H 10/13 (76,9)c, n, L
15 h 18/48 (37,5)f, E 17/29 (58,6)h, D 28/38 (73,7)e, I 18/21 (85,7)g
18 h 35/57 (61,4)F 24/49 (49,0)j 33/45 (73,3)J 36/46 (78,3)i
21 h 34/60 (56,7) 9/21 (42,8)l 19/44 (43,2)p, K 29/37 (78,4)k, o
24 h 41/70 (58,6) 39/60 (65,0) 16/33 (48,5) 15/24 (62,5)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant;
A:B, B:C, C:D, E:F (p < 0,05); J:K (p < 0,01); G:H, H:I, G:L (p < 0,001) bezüglich des Untersuchungszeitpunktes; g:h (p < 0,05); a:b, e:f, c:d, i:j, k:l (p < 0,01) bezüglich ihrer Reifungszeit; m:n (p < 0,001); o:p (p < 0,01) bezüglich ihres CZ-Besatzes
Anhang
140
Tabelle 4.6: COK bzw. Oozyten mit drei Vorkernen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit und dem Untersuchungszeitpunkt
Gruppe Zeit nach IVF
COK24
n/N (%)
Oozyten24
n/N (%)
COK30
n/N (%)
Oozyten30
n/N (%)
3 h 0/15 (0,0) 0/34 (0,0) 0/4 (0,0) 0/28 (0,0)
6 h 0/44 (0,0) 0/70 (0,0) 0/20 (0,0) 0/49 (0,0)
9 h 0/51 (0,0)A 0/72 (0,0) 0/60 (0,0) 0/36 (0,0)
12 h 5/49 (10,2)B 3/63 (4,7) 2/53 (3,8) 0/13 (0,0)
15 h 8/48 (16,7)a, C 3/29 (10,3) 0/38 (0,0)b 0/21 (0,0)
18 h 2/57 (3,5)D 0/49 (0,0) 2/45 (4,4) 1/46 (2,2)
21 h 1/60 (1,7) 0/21 (0,0) 5/44 (11,4) 1/37 (2,7)
24 h 2/70 (2,8) 3/60 (5,0) 1/33 (3,0) 0/24 (0,0)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
A:B, C:D (p < 0,05) bezüglich des Untersuchungszeitpunktes; a:b (p < 0,01) bezüglich ihrer Reifungszeit
Tabelle 4.10: Teilung von COK im Vergleich zu Kontrollgruppen in Abhängigkeit von ihrer Reifungszeit, dem verwendeten Aktivierungsmedium und des Aktivierungszeitpunktes
Gruppe
COKK24 COK24 mit Ca/Mg
COK24 ohne Ca/Mg
COKK30 COK30 mit Ca/Mg
COK30 ohne Ca/Mg
AK
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
6h 63/99
(63,6)
85/137
(62,0)
83/141
(58,9)
170/264
(64,4)A
119/171
(69,6)
126/189
(66,7)
8h 52/75
(69,3)
105/146
(71,9)
84/127
(66,1)
53/80
(66,2)d
82/136
(60,3)
68/132
(51,5)e
12h 47/86
(54,6).,a
91/124
(73,4)b
106/133
(69,8)c
61/80
(76,2)�,B
94/136
(69,1)
82/117
(70,1)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
A:B (p < 0,05) bezüglich des Aktivierungszeitpunktes; .�� �p < 0,01) bezüglich der Reifungszeit; d:e (p < 0,05); a:b (p < 0,01); a:c (p < 0,001) bezüglich des Aktivierungsmediums
Anhang
141
Tabelle 4.12: Blastozysten bezogen auf die geteilten COK in Abhängigkeit von Reifungsdauer, verwendetem Aktivierungsmedium und Aktivierungszeitpunkt im Vergleich zu den Kontrollgruppen
Gruppe
COKK24 COK24 mit Ca/Mg
COK24 ohne Ca/Mg
COKK30 COK30 mit Ca/Mg
COK30 ohne Ca/Mg
AK
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
n/N (%)
6h 24/63
(38,1)α
33/85
(38,8)
21/83
(25,3)
91/170
(53,5)β,A,c
34/119
(28,6)d
30/126
(23,8)e
8h 20/52
(38,5)χ
56/105
(53,3)
31/84
(36,9)
11/53
(20,7)δ,B
30/82
(36,6)
17/68
(25,0)
12h 12/47
(25,5)a
37/91
(40,6)
47/106
(44,3)b
19/61
(31,1)C
38/94
(40,4)
32/82
(39,0)
Werte mit unterschiedlichen Großbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Spalten signifikant; Werte mit unterschiedlichen Kleinbuchstaben unterscheiden sich innerhalb der Zeilen signifikant;
A:B (p < 0,001); A:C (p < 0,01) bezüglich des Aktivierungszeitpunktes; α:β, χ:δ (p < 0,05) bezüglich der Reifungszeit; a:b (p < 0,05); c:d, c:e (p < 0,001) bezüglich des Aktivierungszeitpunktes
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Abkürzungsverzeichnisverzeichnis
169
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
6-DMAP 6-Dimethylaminopurin
AR Akrosomreaktion
ATP Adenosin 5'-triphosphat
BOEC bovine ovidutal epithelial cells, bovine Eileiterepithelzellen
BSA bovines Serumalbumin
cADPR zyklische Adenosinphosphat-Ribose
Cae extrazelluläres Calcium (ionisiert)
Cai intrazelluläres Calcium (ionisiert)
CaMKII Calmodulinabhängige Kinase II
cAMP zyklisches 3', 5'-Adenosinmonophosphat
Can nucleoplasmatisches Calcium (ionisiert)
CHX Cycloheximide
CICR calcium induced calcium release, Ca-induzierte Calciumfreisetzung
c-Mos c-mos proto-oncogene kinase
COK Cumulus-Oozyten-Komplex(e)
COK24 24 Stunden gereifte Cumulus-Oozyten-Komplex(e)
COK30 30 Stunden gereifte Cumulus-Oozyten-Komplex(e)
CRAC calcium release activated channel
CSF cytostatic faktor
CZ Cumuluszellen
DNA Desoxyribonukleinsäure
ECS estrous cow serum
EGF epidermal growth factor
FCS fetal calf serum
FSH follikelstimulierendes Hormon
GV germinal vesicle, Keimbläschen
GVBD germinal vesicle breakdown
IBMX Isobutylmethylxantin
IP3 Inositol-1',4',5'-triphosphat
IP4 Inositol-1',3',4',5'-tetrabisphosphat
IVF In-vitro Fertilisation
IVK In-vitro-Kultur
Abkürzungsverzeichnis
170
IVM In-vitro-Maturation
LH luteinisierendes Hormon
MAPK mitogen activating protein kinase
Mge extrazelluläres Magnesium (ionisiert)
Mgi intrazelluläres Magnesium (ionisiert)
M-I erste Metaphase
M-II zweite Metaphase
M-III „dritte Metaphase“
MPF maturation promoting factor
m-SOF modified synthetic oviduct fluid
OMI oocyte maturation inhibitor
Oozyten24 24 Stunden gereifte Oozyten
Oozyten30 30 Stunden gereifte Oozyten
pHi intrazellulärer pH
PKA cAMP-abhängige Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
SERCA intrazelluläre sarco(endo)plasmatische Ca2+-Pumpen
SNARE soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor
VOCCs voltage-operated calcium channels
ZP Zona pellucida
ZP3 Zonaglycoprotein 3
Danksagung
Herrn Prof. Dr. B. Meinecke möchte ich ganz herzlich für die Überlassung des
Themas und für die Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit danken.
Das große persönliche Engagement von Herrn VR PD Dr. habil. W. Kanitz hat ganz
wesentlich zum Gelingen dieser Dissertation beigetragen. Für seine von Vertrauen
und Sympathie getragene Betreuung bin ich ihm sehr dankbar.
Mein herzlicher Dank gilt auch Frau Dr. A-R. Fischer und Frau Fabiana de Andrade
Melo Sterza für ihre kollegiale Hilfe und Unterstützung.
Ganz besonderes möchte ich Herrn Dr. C. Leiding für die Möglichkeit der
Durchführung der in vitro Versuche an der Besammungsstation Neustadt/Aisch
danken. Mit seiner freundschaftlichen Unterstützung und Hilfsbereitschaft hat er mich
auf vielfältige Weise während meiner Zeit in Neustadt/Aisch gefördert.
Herrn Dr. A. Tuchscherer möchte ich für die qualifizierte Unterstützung bei der
statistischen Auswertung danken.
Besonderer Dank gilt Herrn Dr. H. Wenigerkind für seine gewissenhafte Korrektur
des Manuskriptes, sowie dafür, dass er als Diskussionspartner immer zur Verfügung
stand.
Bei Frau Dr. C. Vaessen, Frau Fabiana de Melo Sterza und Herrn Renato Sterza
möchte ich mich für ihre Freundschaft und das mir entgegengebrachte Verständnis
als Mitbewohnerin herzlich bedanken.
Beim ET-Team und allen Mitarbeitern der Besamungsstation Neustadt/Aisch möchte
ich mich für die Hilfsbereitschaft während meiner Arbeit an der Besamungsstation
bedanken.
Für die Gewährung eines Stipendiums und die finanzielle Unterstützung der
experimentellen Untersuchungen bin ich der Dr. Dr. h.c. Karl Eibl-Stiftung
(Neustadt/Aisch) zu Dank verpflichtet.
